Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная характеристика формирования клеточных стенок в растительных тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика формирования клеточных стенок в растительных тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы"
На правах рукописи
Сальников Вадим Владимирович
Структурно-функциональная характеристика
формирования клеточных стенок в растительных тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы.
Специальность 03.00.12 - физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт - Петербург - 2005
Работа выполнена в Казанском институте биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии Наук и в лаборатории электронной микроскопии биологического факультета Техасского технического университета (США).
Научный консультант:
доктор биологических наук Горшкова Татьяна Анатольевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Сергей Семенович Медведев
Академик Национальной академии наук Беларуси, доктор биологических наук, профессор
Любовь Владимировна Хотылёва
доктор биологических наук, профессор Андрей Евгеньевич Васильев
Ведущая организация:
Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина
Защита состоится ' 2005 года в 14 часов на
заседании диссертационного совета Д 006.041.01 при Государственном научном центре РФ Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44; факс: (812) 318-47-70.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова.
Автореферат разослан "_2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор
Э.А. Гончарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Целлюлоза является основным по массе органическим веществом биосферы, широко используется во многих современных производствах (Тарчевский, Марченко, 1985). Как отмечается в ряде работ (Amor et al., 1995, Delmer, 1999, Haigler et al., 2001), нет другого такого процесса в растениях, который был бы столь важен и столь мало изучен на молекулярном уровне, как синтез целлюлозы.
Основное количество целлюлозы содержится в так называемых вторичных клеточных стенках растений. Вторичная клеточная стенка - это слой клеточной стенки, который формируется клетками, закончившими свой рост. Он характерен, в первую очередь, - для клеток тканей, выполняющих опорно-механическую и проводящую функции. Эти клетки обычно обладают рядом особенностей: значительная длина (до нескольких сантиметров), характер роста, индивидуальная динамика клеточных органелл, толстая клеточная стенка, состав клеточной стенки. Жизнедеятельность этих специализированных клеток в большой степени направлена на интенсивный синтез компонентов клеточной стенки, поэтому они являются удобным объектом для изучения собственно процесса формирования вторичной клеточной стенки и, в частности, процесса биосинтеза целлюлозы.
Синтез микрофибрилл целлюлозы в растениях является высоко скоординированным процессом, который происходит на поверхности плазматической мембраны (Delmer, 1982). Имеются основания полагать, что биосинтез целлюлозы обусловлен взаимодействием нескольких белков и участием ряда органелл (Delmer, Amor, 1995, Haigler et al., 2001), однако детали этого процесса и взаимодействия структур едва начинают поддаваться пониманию.
Незаменимым инструментом в исследовании механизмов синтеза целлюлозы и других структурных полисахаридов являются методы
электронной микроскопии. Однако их использование для клеток с вторичной клеточной стенкой сталкивается с рядом проблем. Так, достижение высокого качества химической фиксации материала для ультраструктурных исследований осложняется толщиной клеточной стенки, а также наличием крупной вакуоли и, как следствие, особой чувствительностью к изменениям осмотичности растворов-фиксаторов. Все эти факторы усиливали неизбежность тенденции к медленной химической фиксации, иммобилизирующей в итоге цитоплазму в состояние, когда она уже значительно нарушена в ходе приготовления образца (Mersey, McCully, 1978). Артефакты химической фиксации приносят особенный ущерб исследованиям синтеза целлюлозы, который организован в пределах клеточного кортекса и особенно чувствителен к манипуляциям в ходе приготовления образцов для электронной микроскопии. Появление новых методов фиксации, таких как замораживание - скалывание, замораживание-замещение и замораживание-замещение под высоким давлением открывает новые возможности. Однако к началу наших исследований они не были адаптированы для анализа клеток с толстой вторичной клеточной стенкой.
Цель и задачи исследования.
Целью нашей работы было изучение структурно-функциональных характеристик формирования клеточных стенок в тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы. Ее реализация связывалась с решением следующих задач:
1. Адаптировать современные методы анализа ультраструктуры растительных тканей для клеток, характеризующихся толстой клеточной стенкой с высоким содержанием целлюлозы.
2. Проанализировать динамику формирования клеточных стенок в различных тканях, формирующих вторичную клеточную стенку.
3. Охарактеризовать ультраструктуру разных типов клеток, специализированных на формировании вторичной клеточной стенки.
4. Определить локализацию ключевых структур и белков, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
5. Сопоставить структурно-функциональные характеристики формирования первичной и вторичной клеточной стенки.
Научная новизна работы.
В работе получили развитие представления о динамичности и мозаичности структуры клеточной стенки и механизмах формирования целлюлозных микрофибрилл. Показано, что механизмы синтеза целлюлозы первичной и вторичной клеточной стенки качественно различимы.
Проведено комплексное исследование динамики роста и формирования склеренхимных волокон с использованием методов световой флуоресцентной микроскопии, электронной микроскопии (сканирующая и трансмиссионная) и иммуноцитохимического анализа.
Впервые продемонстрированы особенности формирования вторичных клеточных стенок флоэмных волокон льна-долгунца. Выявлена постсинтетическая модификация вторичной клеточной стенки, связанная с метаболизмом {3-(1—>4)-0-галактана, доказана тканеспецифичность этого высокомолекулярного полимера. Впервые продемонстрирована мозаичность распределения лигнина и других фенольных соединений во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца.
Разработаны методы криогенной фиксации (замораживание-замещение) и особый режим проводки образцов с толстой клеточной стенкой через градиент эпоксидных смол. В результате этой фиксации описан ряд органелл волосков семян хлопчатника, включая структуры аппарата Гольджи, мультивезикулярные тельца и пропластиды.
Впервые на ультраструктурном уровне локализована особая форма сахарозосинтазы, связанная с плазматической мембраной. При анализе серийных ультратонких срезов впервые установлено взаиморасположение
отдельных клеточных структур, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
Основные положения, выносимые на защиту.
1). В формирующемся стебле льна-долгунца, в верхней его части существует специфический участок - «точка слома», где стебель меняет свои механические свойства, что связано с изменением стадии формирования флоэмных волокон.
2). Утолщение клеточной стенки флоэмных волокон льна-долгунца начинается на внешней периферии пучка и продолжается по направлению к центру стебля.
3). Обнаруженный во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца буферорастворимый галактан является ткане-специфичным, то есть присутствует только во флоэмных волокнах этих растений.
4). Вторичная клеточная стенка флоэмных волокон характеризуется мозаичностью распределения лигнина и других фенольных соединений.
5). Метод замораживания-замещения позволяет установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур-антигенов.
6). В клетках, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы, во время отложения вторичной клеточной стенки всегда присутствует особая форма сахарозосинтазы, которая локализована вплотную к плазматической мембране.
7). Актиновые микрофиламенты не являются обязательными участниками формирования вторичных клеточных стенок и обнаруживаются лишь при сложной пространственной организации этого процесса, например, при образовании локальных утолщений клеточных стенок в трахеальных элементах.
8). Каллоза существует в виде постоянного слоя в ходе формирования вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника и, вероятно,
выполняет роль невзаимодействующего матрикса, в котором происходит кристаллизация микрофибрилл целлюлозы.
Практическое значение работы.
Практическое значение данной работы во многом определяется тем, что объектами исследования были флоэмные волокна льна-долгунца (Ипит из11айзз1тит L) и волоски семян хлопчатника (Оовэ1р1ит ^¡¡гзиШт L) - ткани важнейших технических культур. Получены данные, позволяющие изменить представление об их формировании.
Проведен комплексный анализ формирования клеточной стенки волокон льна долгунца, что может послужить практическим руководством для изучения сходных по значению технических культур, таких, как конопля, рами и другие.
Детально разработаны приемы быстрой криогенной фиксации растительной ткани (замораживание-замещение), анализа серийных ультратонких срезов, современных методов иммуноцитохимии, что может быть использовано в работах, где необходимо установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур.
Личный вклад соискателя.
Представляемые в работе данные были получены в совместных исследованиях с коллегами из лаборатории Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН и в содружестве с лабораторией электронной микроскопии Техасского технического университета (США). В диссертацию включены и вынесены на защиту только те результаты, в которых автору принадлежит существенная или определяющая роль.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались автором на регулярных итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН, на трех Всесоюзных конференциях "Биосинтез целлюлозы" (Казань, 1980, 1985, 1990), на Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1982), на VI Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" (Чернигов,
1988), на регулярных международных конференциях по клеточной стенке (VI Cell Wall Meeting - Nijmegen, Голландия; 1992, VII - Santiago de Compostella, Испания, 1995; VIII - Norwich, Англия; 1998, IX - Toulouse, Франция; 2001; X - Sorrento, Италия, 2004), на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на V Съезде физиологов растений России (Пенза, 2004). Диссертационная работа в завершенном виде была представлена в виде устного доклада на семинарах в Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН и в Техасском техническом университете (Лаббок, США).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 40 научных работ. В список опубликованных работ входят две монографии, статьи в отечественных ("Доклады РАН", "Физиология растений", "Цитология", "Ботанический журнал") и зарубежных ("Plant Molecular Biology", "Phytochemistry", "Plant Physiology", "Protoplasma", "Annual Botany", "Natural Fiber", "Industrial Crops and Products") журналах, а также материалы, представленные на конференциях и изданные в научных сборниках.
Структура и объем работы.
Основной текст диссертации изложен на 272 страницах, состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 369 названий, из них 325 на иностранных языках. Текст диссертации включает 1 таблицу 2 схемы, 34 рисунка и 174 фотографии.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы.
1. Объекты.
Для наших исследований были выбраны несколько объектов, отличающихся по систематическому расположению, анатомии, а также по физиологии развития и функциональной роли в растительном организме:
флоэмные волокна льна-долгунца (волокна склеренхимы), волоски семян хлопчатника (трихомы) и культура клеток циннии, формирующая элементы проводящей системы в условиях in vitro. При выборе объекта нам пришлось балансировать между использованием наиболее известных и малоизученных объектов, а также учитывать доступность и эффективность работы антител, с которыми мы планировали проводить исследования.
Для работы использовали растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) сортов: Белинка, Викинг, Новоторжский, Торжокский, К-6, выращенные в открытом грунте на опытных делянках ВНИИЛ (г. Торжок) и КИББ КНЦ РАН (г. Казань), а также в климатических камерах Агротехнологическдго института, (г. Вагенинген, Голландия), где условия выращивания были максимально приближены к естественным. Большинство экспериментов проводили в период быстрого роста растений. Образцы фиксировали в соответствии со схемами, приведенными при изложении результатов.
Растения хлопчатника (Gossypium hirsutum L) выращивали в теплице (естественный свет, цикл дневных/ночных температур ~ 30/22°С). Для ультраструктурных исследований и иммуноцитохимических реакций использовали сорта Соkеr 312 и Paymaster HS-200. Развивающиеся волоски семян хлопчатника отбирали из маркированных коробочек на 10-ый и 24-30-ый день после цветения.
Культуру клеток, полученную из изолированных клеток мезофилла листьев (3 и 4 лист) проростков циннии {Zinnia elegans L), выращивали на упрощенной индуктивной среде (Roberts et al., 1992). В этих условиях клеточное деление подавлено, что обеспечивает наличие одного пика дифференциации трахеальных элементов (Roberts et al., 1992). Образцы отбирали через 68-72 часа после помещения выделенных клеток на среду культивирования.
2. Флуоресцентная микроскопия.
Для окрашивания полутонких срезов (40-100 мкм) использовали: 1) Cellufluor - (Polysciences, Inc., Washington, Pennsylvania) 0,1%, 1,25 мМ боратный буфер, рН 10, специфический краситель на целлюлозу (Baselski et al., 1990) и 2) Pectate hybridization probe - 0,001% раствор пробы РА7 в 50 мМ трис-буфере с добавлением 0,25 мМ EDTA - специфический краситель на пектиновые вещества (Vreeland, Laetsch, 1989, Vreeland et al., 1989). Срезы просматривали, используя флуоресцентный микроскоп Nikon Optiphot с фотонасадкой и набором светофильтров (Gorshkova et al., 2000).
3. Сканирующая электронная микроскопия.
Сканировали срезы и сломы живых и высушенных стеблей льна долгунца, приготовленные с помощью специальных микротомных лезвий (толщина среза - 40-100 мкм). Фиксацию материала в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия не производили. После обезвоживания срезов или столбиков ткани в спирте и ацетоне, образцы подвергали пассивной сушке с последующей термической обработкой при + 80° С и напылению на них золота или платины под вакуумом. Для просмотра объекта использовали сканирующий электронный микроскоп SCAN-25 (Jeol).
4. Электронная трансмиссионная микроскопия:
а) метод ультратонких срезов;
При химической фиксации материала лучшую сохранность образцов наблюдали при использовании в качестве фиксатора 2,5% глутаральдегида (Serva) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,3), 5 часов. Постфиксацию проводили в 1% растворе четырехокиси осмия {OSOA) на том же буфере с добавлением сахарозы (25 мг/мл) в течение ночи. Затем образцы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (от 30% до абсолютного спирта), ацетоне и окиси пропилена. Использовали метод длительной (несколько суток) инфильтрации образцов в смеси смола/окись пропилена. Для улучшения пропитки смолой (Эпон, Serva)
толстостенных клеток при каждом очередном повышении концентрации смолы образцы помещали в камеру под слабый вакуум в течение 15-20 минут. Смолу полимеризовали в термостате при 37, 45, 60°С в течение суток после каждого повышения температуры. С целью стабилизации белковых компонентов клетки, в частности, микротрубочек, и повышения контрастности мембранных структур, в некоторых случаях проводили фиксацию образцов с добавлением танниновой кислоты по методу Фудживары и Линка (Fujiwara, Link, 1982).
Фиксацию ткани методом замораживание-замещение (freeze -substitution) осуществляли при температуре жидкого пропана, охлажденного жидким азотом (-196° С), без какой-либо предварительной обработки ткани химическими реагентами. Для обеспечения короткого времени замораживания (0,1-1,0 мсек ) применяли специальное устройство, с помощью которого образец ткани "выстреливается" в жидкий пропан. Замещение воды производили ацетоном в течение нескольких суток при пониженных температурах (-80°С). Эти условия обеспечивали сохранность белков и их антигенность, что принципиально важно для проведения иммуноцитохимических исследований (Bachmann, Mayer, 1987, Echlin, 1992).
Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-8800 (LKB, Швеция). Контрастировали срезы насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдc (Reynolds, 1969). Препараты просматривали на электронных микроскопах ЭМ-200 и JEM-100ЕХ. В процессе работы было просмотрено более 100 негативов каждого варианта для повышения достоверности полученных результатов.
б) методы цитохимического анализа.
Фиксацию и заливку материала для цитохимических исследований проводили по вышеописанной методике для ТЭМ.
Применяли контрастирование срезов по методу Тьери (Thiery, 1967) с собственными модификациями (Сальников и др., 1993), что позволяет
выявлять полисахариды после окисления альдегидных групп периодатом серебра.
Для определения локализации лигнина и других фенольных соединений в клеточных стенках флоэмных волокон применяли метод фермент-золото (Benhanou, Lafontaine, 1995) с собственными модификациями (Gorshkova et al., 2000). В качестве фермента-субстрата использовали лакказу (ЕС 1.10.3.2, Sigma) - фермент, который участвует в образовании лигнина и других фенольных соединений.
в) иммуноэлектронная МИКРОСКОПИЯ:
Иммуноцитохимическую реакцию для определения локализации тканеспецифичного галактана проводили на ультратонких срезах, полученных после традиционной химической фиксации ткани для электронной микроскопии. Использовали первичное моноклональное антитело LM5, специфичное для 3-(1->4)-0-галактана (rat IgG, LM5, PLANTPROBES, Cat.No. PP-001, Vicre, 1998), в разведении 1:200. Для улучшения антигенности ткани в качестве смолы для пропитки растительных клеток использовали LR White (LR White Resin, Medium Grade Acrylyc Resin, TED PELLA).
Иммуноцитохимические реакции с антителами к сахарозосинтазе, каллозе и актину проводили по классической схеме с собственными модификациями (Salnikov et al., 2001, 2003) на ультратонких срезах клеток циннии и волосках семян хлопчатника, фиксированных методом замораживания-замещения. Использовали поликлональное антитело к рекомбинантной сахарозосинтазе, любезно предоставленные лабораторией D.Delmer (Univ CA-Davis). Разведение первичного антитела, специфичного к сахарозосинтазе, составляло 1:200 для препаратов из клеток циннии и 1:2000 для препаратов из волосков семян хлопчатника.
Моноклональное антитело (mouse IgG, Kappa light, Biosupplies Australia, Cat.No. 400-2), которые выявляют (1-»3)-ß-rniOKaH (каллозу), (Meikle et al., 1991) использовали в разведении 1:5. Иммуноцито-
химическую реакцию с антителами к каллозе проводили по отработанной нами методике (Salnikov et al., 2000).
Для локализации актина использовали: (а) моноклональное антитело к актину (mouse IgG, clone С4, Costa Mesa ICN, CA), которые узнают консервативный эпитоп в N-терминальной области всех актиновых мономеров (Lessard, 1988), в разведении 1:10; и (б) поликлональное антитело кролика к актину пыльцевых трубок кукурузы (Gibbon et al., 1999; предоставлен С. Staiger; Purdue University) в разведении 1:50.
Вторичные антитела, связанные с коллоидным золотом, были получены от корпорации Ted Pella. Образцы просматривали на электронном микроскопе модели JEOI 1200 ЕХ, работающем при 80 кВ.
Количественная оценка иммуномечения на срезах клеток проводилась по разработанным автором методикам с использованием уравнения полинома второго порядка для статистического анализа полученных результатов (Salnikov et al., 2001,2003).
Результаты и их обсуждение.
1. Волокна склеренхимы: флоэмные волокна льна-долгунца.
К специализированным клеткам, жизнедеятельность которых в большой степени направлена на формирование мощных целлюлозных слоев вторичной клеточной стенки, следует отнести клетки склеренхимы. Склеренхима - механическая ткань высших растений. Она встречается во всех органах: корнях, стеблях, листьях, плодах, цветках и характеризуется особым развитием в стеблях растений лубоволокнистых культур.
Классический пример склеренхимных волокон - флоэмные волокна льна-долгунца. Они принадлежат к числу наиболее- длинных растительных клеток: их размер достигает нескольких сантиметров при коэффициенте прозенхимности (соотношение между длиной и шириной клетки) более 1000. Клеточная стенка зрелых волокон имеет толщину
10 мкм, в то время как для большинства других растительных клеток эта величина обычно колеблется в пределах 0,1-1,0 мкм.
Известно, что стебель льна-долгунца содержит только первичные волокна, которые инициируются из прокамбия в апикальной части стебля (Esau, 1943, 1977, 1990), однако до настоящего времени понимание динамики последующих стадий формирования флоэмных волокон оставалось на неудовлетворительном уровне. Нами проведено комплексное исследование по изучению динамики роста и формирования лубяных волокон льна-долгунца различными методами микроскопии.
1.1. Флуоресцентная микроскопия.
Своеобразной точкой отсчета в наших исследованиях служила обнаруженная автором данной работы "^очка слома" (схема 1), в которой стебель резко меняет свои механические свойства (Gorshkova et al., 1996, Salnikov et al., 1998). Расстояние от вершины стебля до точки слома составляет 5-7 см, иногда до 15 см. Максимально удаленная от апекса точка, где стебель при растяжении разрывается при незначительном усилии, названа нами "точкой слома". По мере роста растений, точка слома перемещается вверх по стеблю. В фазу бутонизации точка слома постепенно исчезает (схема 1). Изменение механических свойств в районе точки слома позволило предположить, что в этом участке стебля могут происходить существенные изменения в развитии флоэмных волокон.
Классическим приемом для изучения динамики удлинения утолщения клеток является анализ срезов стебля. При этом продольные срезы позволяют характеризовать длину волокон только на ранних стадиях развития, поскольку через удлинившиеся волокна невозможно сделать продольный срез, по крайней мере, пока эта клетка находится в толще стебля. Однако динамику удлинения можно анализировать и на попереч -ных срезах, поскольку интрузивный рост должен приводить к увеличению на них числа волокон.
Схема 1. Схема роста растения льна-долгунца и положение точки слома (ТС) на стебле. Показаны фазы и периоды развития льна долгунца (дни после посева): всходы (5-10), елочка (10-25), быстрый рост (25-45), бутонизация (45-55), цветение (55-65), созревание (зеленая, ранняя желтая, желтая, полная спелость) (65-90). Сплошная кривая линия указывает положение точки слома в ходе онтогенеза растения. Звездочками обозначены участки на стебле, где были сделаны срезы для анализа динамики развития волокон. Т 1-Т 7 - участки на стебле, обсуждамые в тексте.
Обычно созревающие флоэмные волокна хорошо различимы на поперечных срезах из-за их толстых клеточных стенок, однако молодые волокна, имеющие тонкие клеточные стенки, могут плохо идентифицироваться. Для того, чтобы различить молодые волокна, использовали специальный-краситель - Cellufluor (Gorshkova et al., 1996; Salnikov et al., 1998), который под ультрафиолетовым светом дает голубую флуоресценцию полисахаридных оболочек в клетках, где идет интенсивный синтез целлюлозы.
Для того, чтобы проследить динамику формирования флоэмных волокон и пучков этих волокон по длине стебля, срезы для окрашивания специфическими красителями были взяты выше и ниже точки слома (Т1, Т2), в середине стебля на каждой рассматриваемой стадии и в точках стебля, анализ срезов которых дает полное представление о динамике развития волокон (схема 1).
Анализ с помощью флуоресцентных красителей позволил охарактеризовать динамику формирования флоэмных волокон льна-долгунца и предложить схему последовательного утолщения вторичной клеточной стенки в формирующемся пучке (рис. 1). Утолщение клеточной стенки во -
Рис. 1. Схема утолщения клеточных стенок флоэмных волокон в стебле льна-долгунца. Утолщение клеточных стенок, ведущее к уменьшению внутреннего пространства клеток, начинается на внешней периферии пучка и продолжается по направлению к его внутреннему краю. Слева показан поперечный срез стебля, окрашенный СеНиАиог. Видны флоэмные волокна с разной степенью утолщения клеточной стенки в пучке. Стрелки указывают на флоэмные волокна с тонкой (белые) и утолщенной (черные) клеточной стенкой. А-Е - последовательные стадии утолщения клеточной стенки в пучке. Пунктирной линией отмечен пучок флоэмных волокон. Масштаб: 50 мкм.
локон, ведущее к уменьшению внутреннего пространства клеток, начинается на внешней периферии пучка и продолжается по направлению к его внутреннему краю.
Для характеристики динамики удлинения волокон мы просчитали число волокон на поперечных срезах в ходе развития растений. Число флоэмных волокон оставалось постоянным, где бы ни был сделан срез, если отслеживать один и тот же уровень на стебле растения ниже точки слома (ОогэИкоуа в! а1., 2003). Отсутствие увеличения числа волокон на срезах, взятых на одинаковой высоте стебля ниже точки слома, означает, что интрузивный рост закончился выше точки слома (рис. 2).
Рис. 2. Поперечные срезы льна, окрашенные Cellufluor, взятые на различных стадиях развития растения. А - срез стебля в районе точки слома. Б - срез стебля на том же уровне, что и А, через шесть недель. В -схема, .иллюстрирующая, что интрузивный рост должен приводить к увеличению числа волокон в пучке на поперечном срезе. Г - схема взятия образцов. Клеточная стенка у флоэмных волокон на уровне точки слома тонкая (рис. 2 А). Утолщение клеточной стенки происходит на участке ниже точки слома (рис. 2 Б). Число волокон остается постоянным, если отслеживать один и тот же уровень на стебле растения начиная от уровня точки слома. Пунктирной линией отмечены пучки флоэмных волокон. Масштаб: 100 мкм.
На более поздних стадиях апикальная меристема перестраивается на формирование соцветий, точка слома исчезает, и в клетках флоэмных волокон происходят лишь процессы утолщения клеточных стенок и созревания волокон. Все характеристики качества урожая, которые зависят от количества клеток волокон и их длины, детерминируются уже на стадии быстрого роста и в дальнейшем не могут быть изменены.
1.3. Изучение строения флоэмных волокон и структуры клеточной стенки методом сканирующей электронной микроскопии. Сканирование срезов и поверхностей разорванных и согнутых стеблей на разных стадиях развития растений отчетливо продемонстрировало, что флоэмные волокна льна-долгунца имеют веретенообразную форму и залегают в толще стебля в виде пучков по его периметру. Волокна закручены вокруг друг друга в отдельно взятом пучке (фото 1 а). В клеточной стенке флоэмных волокон после специальной обработки можно наблюдать отделяющиеся слои клеточной стенки (фото 1 б) et al., 1998).
1.4. Изучение флоэмных волокон в ходе онтогенеза растений льна-долгунца методами электронной микроскопии.
1.4.1. Ультраструктура флоэмных волокон.
В ходе роста флоэмных волокон и формирования полисахаридной оболочки в ультраструктуре этих клеток наблюдается ярко выраженные процессы, характерные для клеток с интенсивно формирующейся клеточной стенкой: активизация аппарата Гольджи, пролиферация эндоплазматической сети, скопление микротрубочек под плазматической мембраной (Сальников и др., 1993).
Анализ срезов стебля льна-долгунца в период быстрого роста растений в точках Т2-Т5 (схема 1) в период, когда активность аппарата Гольджи наиболее выражена, показал наличие мелкогранулированного, электронно-плотного материала в многочисленных пузырьках аппарата Гольджи, мелких вакуолях, а также в периплазматическом пространстве
Фото 1. Ультраструктура флоэмных волокон льна-долгунца (сканирующий электронный микроскоп), а - скрученные флоэмные волокна (стрелки), б - участок отдельного флоэмного волокна. Видно бинто-образное расположение слоя микрофибрилл (стрелки).
флоэмных волокон. Некоторые пузырьки аппарата Гольджи сливались друг с другом, образуя более крупные вакуоли с электронно-плотным материалом. Наряду с пузырьками, содержащими электронно-плотный материал, в цитоплазме волокон встречаются пузырьки, плотность содержимого которых не определяется под электронным микроскопом. Максимальное количество пузырьков с электронно-плотным содержимым наблюдается в волокнах ниже точки слома до середины стебля. Количество пузырьков в цитоплазме с плотным содержимым резко уменьшается в нижних отделах стебля. Такая активность аппарата Гольджи, результатом которой является продуцирование большого количества пузырьков с электронно-плотным содержимым, наблюдается только во флоэмных волокнах стебля льна-долгунца. Контраст содержимого пузырьков усиливается (фото 2) при проведении цитохимической реакции по методу Тьери, выявляющий полисахариды 1967, Сальников и др., 1993).
Фото 2. Продольный срез флоэмного волокна после проведения цитохимической реакции на полисахариды по методу Тьери (Tniery, 1967). Отчетливо видны электронно-плотный осадок в везикулах аппарата Гольджи и исчерченность вторичной клеточной стенки флоэмных волокон. Масштаб: 1,0 мкм. АГ - аппарат Гольджи, В - вакуоль, ВГ- везикулы Гольджи, КС - клеточная стенка.
1.4.2. Цитохимический анализ флоэмных волокон в онтогенезе растения по методу Тьери.
Изучение ультраструктуры флоэмных волокон после цитохимического окрашивания срезов по методу Тьери (Thiery, 1967) отчетливо выявило в клеточной стенке два слоя, отличающихся по электронной плотности и структурной исчерченности: внутренний слой (на фото 3 обозначено "I"), где параллельно расположенные электронно-плотные участки чередуются со светлыми полосами,-и наружный электронно-светлый слой с тонкофибриллярной структурой ("II"). Интенсивно окрашивается срединная пластинка. На срезах видно, что, по мере созревания волокон, внутренний слой клеточной стенки равномерно уменьшается и в зрелом волокне практически отсутствует. Отношение величины электронно-плотного слоя к общей толщине клеточной стенки в период быстрого роста, на стадиях
Фото 3. Ультраструктура флоэмных волокон льна-долгунца на разных стадиях утолщения клеточной стенки после проведения цитохимической реакция на полисахариды по методу Тьери. А - сразу выше точки слома вторичная клеточная стенка имеет хорошо выраженную исчерченность (I). Б - 10 сантиметров ниже точки слома (схема 1, Т 4), период быстрого роста. Наблюдаются два слоя клеточной стенки, отличающиеся по своей структуре (I и II). В - середина стебля на стадии зеленой спелости (схема 1, Т 6). Для клеточной стенки флоэмного волокна характерна однородная структура (II). КС - клеточная стенка, СП -срединная пластинка, Ц - цитоплазма. Масштаб: 1мкм.
цветения и зеленой спелости составляет соответственно 50-70%, 30-50%, 14-20% (Сальников и др., 1993).
1.4.3.. Иммуноцитохимический анализ распределения галактана в тканях стебля льна-долгунца.
В стебле льна-долгунца был обнаружен уникальный полисахарид -водорастворимый Р-(1—>4)-0-галактан с молекулярной массой более, чем 2000 кДа (ОогэИкэта et а1., 1996). Активация синтеза этого полимера
происходит во флоэмных волокнах непосредственно под точкой слома. Полимер подвержен постсинтетической модификации и в зрелых растениях не обнаруживается (Gorshkova et al., 2004). Для установления тканевой и внутриклеточной локализации этого полимера использовали антитело LM5, которое выявляет линейные цепочки ß-(1—>4)-!й-галактана длиной не менее, чем 4 звена (Jones et al., 1997).
Иммуноцитохимическая реакция проявлялась только в клетках (в клеточных стенках) флоэмных волокон. Ни в одном другом типе тканей на срезах стебля льна-долгунца, ни на одной из стадий не было обнаружено метки на галактан, что говорит о тканеспецифичности полимера.
Первый ответ на иммуноцитохимическую реакцию, проведенную к ß-(1->4)-0-талактанам наблюдали на поперечных срезах стебля льна-долгунца, сделанных в середине отрезка между апексом и точкой слома. Было неоднократно показано, что периодически и закономерно повторяющееся распределение метки (частиц золота) в клеточной стенке появляется в шестом слое клеток, которые впоследствии становятся первым слоем с толстостенными флоэмными волокнами в пучке. На данном этапе роста растения первичная клеточная стенка флоэмных волокон визуально ничем не отличается от таковой других клеток окружающих тканей.
После проведения иммуноцитохимической реакции на срезах стебля, где волокна уже формируют вторичную клеточную стенку (сразу ниже точки слома), мы наблюдали, как и после окрашивания срезов по методу Тьери, разделение клеточной стенки на два слоя (фото 4). Количество частиц золота в темном слое в 5 раз превышало количество частиц в слое менее электронно-плотном (Gorshkova et al., 2004). По мере созревания волокон, соотношение слоев с разной электронной плотностью меняется в сторону уменьшения прилежащего к плазматической мембране более плотного слоя. На продольных срезах аналогичного участка стебля картина распределения метки на галактан остается сходной, если не счи -
Фото 4. Иммуноцитохимическая локализация галактана в клеточной стенке флоэмных волокон стебля льна-долгунца. Видно разделение клеточной стенки на два слоя (I и II), как и после окрашивания срезов по методу Тьери. Количество частиц золота в темном слое в 5 раз превышает количество частиц в слое менее электронно-плотном. КС -клеточная стенка, СП - срединная пластинка. Масштаб: 0,5 мкм.
тать изменение общего вида, который соответствует продольному срезу волокон.
Таким образом, наши данные наглядно продемонстрировали постсинтетическую модификацию клеточной стенки флоэмных волокон льна-долгунца. Такая модификация клеточной стенки сопряжена с метаболизмом тканеспецифичного р-"{1—>4)-0- галактана.
На основе данных электронной гистохимии и иммуноцитохимии предложена схема формирования клеточной стенки флоэмных волокон льна-долгунца, иллюстрирующая динамику ее нарастания и постсинтетической модификации (рис. 3).
Рис. 3. Динамика формирования клеточной стенки волокон льна.
А - первичная клеточная стенка (ПКС) и срединная пластинка (СП) Б - начало формирования вторичной клеточной стенки (ВКС), В -образование двух слоев вторичной клеточной стенки (1-1111111111111111. 11-1 I). Г-Ж - последующие стадии созревания - уменьшение толщины слоя I, АД - в период быстрого роста. На примере флоэмного волокна из средней части стебля показано его дальнейшее развитие в фазу зеленой (Е) и желтой (Ж) спелости. ТС - точка слома.
1.4.4 Определение локализации лигнина во флоэмных волоках и вторичной ксилемы методом цитохимического анализа фермент-золото (enzyme-gold).
Ткани стебля льна-долгунца резко отличаются по содержанию и составу фенольных соединений клеточной стенки, что выявляется на световом уровне при цитохимическом окрашивании по Мёлю (Strivastava, 1966) или при использовании флюроглюцина, а также при биохимическом анализе отдельных частей стебля.
Применение метода фермент-золото с использованием лакказы позволило на ультраструктурном уровне показать распределение лигнина и других фенольных соединений в клеточной стенке флоэмных волокон. Для этого проводили сопоставление характера распределения метки с результатами биохимического анализа ткани. Продемонстрирована мозаичность в локализации лигнина и оксикоричных кислот, создающая основу для пространственной регуляции протекающих в клеточной стенке процессов (Gorshkova et al., 2000).
2. Трихомы: волоски семян хлопчатника.
Клеточная стенка волосков семян хлопчатника является классическим объектом при изучении структуры оболочки растительной клетки и ее формирования (Berkley et al., 1948, Roelofsen, Houwink, 1953, Roland , Vian, 1979, Seagull, 1986, 1989, 1990, 1991, 1992 и др.). Динамика роста и развития этих трихом имеет определенные, четко установленные стадии формирования. Рассматривая динамику развития волосков семян хлопчатника, выделяют: 1) стадию удлинения клеток, в ходе которой формируется только первичная клеточная стенка - до 14 дня после цветения, 2) промежуточную стадию, когда продолжающееся удлинение сочетается с подготовкой клетки к началу следующего этапа (15-24 дня после цветения), что зависит от генотипа растения (Haigler et al., 2001) и 3) интенсивное образование вторичной клеточной стенки, которое лавинообразно начинается после завершения промежуточной стадии и
продолжается до полного созревания волокна (50-60 дней после цветения). Таким образом, до 14 дня после цветения формируется только первичная клеточная стенка, а после 24 - только вторичная. После того, как коробочка раскрывается, вторичная клеточная стенка заканчивает свое формирование (60-80 дней после цветения). Каждый этап формирования волосков семян хлопчатника имеет свои особенности, косвенно или напрямую связанные с формированием клеточной стенки, что привлекает исследователей к этому объекту.
2.1. Ультраструктура волосков семян хлопчатника.
Волоски семян хлопчатника являются достаточно сложным и не совсем удобным объектом для электронной микроскопии. Наличие клеточной стенки большой толщины (у зрелого волокна до 10 мкм) и плотной текстуры создает большие трудности для успешного завершения пропитки материла смолами, а также препятствует качественному замораживанию волокон на всю глубину клетки методом замораживания-замещения.
Автором разработан новый метод быстрой фиксации образцов, позволивший добиться хорошей сохранности цитоплазмы и стабильной воспроизводимости результатов при проведении иммуноцитохимической реакции для определения локализации растворимых белков (Эа^коу et а1., 2001). Основные отличия нашего метода заключалось в том, что 1) образцы ткани для фиксации брали непосредственно с живого растения, 2) использовали специальное устройство для быстрого замораживания (фото 5 Г). Вся процедура по фиксации образцов была перенесена непосредственно в теплицу. Выделение волосков семян хлопчатника производилось из коробочки непосредственно на растении, не отторгая последнюю от стебля (фото 5 А-В). От выделенного семени хлопчатника отсекали участок 2-3 мм с волосками и быстро замораживали. Время от момента нанесения надреза на коробочке до замораживания образца в пропане, охлажденном жидким азотом, составляло 1,5-2,0 минуты.
Фото 5. Этапы подготовки волосков семян хлопчатника для быстрого замораживания. А - В - выделение семени хлопчатника из коробочки. Г - установка для быстрого замораживания: в верхней части установки виден прикрепленный участок семени с волосками-трихомами (белая стрелка), приготовленный для "выстреливания" в камеру с жидким пропаном (черная стрелка), который охлажден жидким азотом. На рисунке видна воронка, через которую постоянно добавляется жидкий азот.
После криогенной фиксации (замораживание-замещение) наблюдали ряд ультраструктурных характеристик волосков семян хлопчатника, которые впервые представлены в данной работе. Незначительные разрушения в цитоплазме отмечены при формировании кристаллов льда в процессе замораживания только в тех случаях, когда замораживание проходило недостаточно быстро (> 1,0 мсек охлаждения до того момента, когда наступит полное замораживание объекта; БеИНп, 1992).
Волоски семян хлопчатника на стадии формирования вторичной клеточной стенки характеризуются крупной центральной вакуолью, ограничивающая мембрана которой (тонопласт) в некоторых участках волокна очень близко подходит к плазматической мембране. В почти идеально сохранившихся клетках были видны микротрубочки и органеллы, описанные ранее в химически фиксированных волосках на стадии вторичной клеточной стенки. При фиксации волосков семян хлопчатника замораживанием-замещением клеточные органеллы обнаруживали значительно чаще, и их структура выглядела более естественно. Например, микротрубочки были скорее прямыми, чем волнистыми, как в
случае химически фиксированных волокон, мембраны протопластид были отчетливыми, что позволяет убедительно идентифицировать эти органеллы. Многочисленные стопки аппарата Гольджи были ассоциированы с везикулами небольшого размера, как и ожидалось на этапе активной секреторной деятельности. Часто встречались аппараты Гольджи в виде кластеров. Наблюдали типичное сжатие цистерн и потемнение в направлении транс-полюса, что может быть связано с выделением секреторных молекул в везикулы, как показано ранее в работе Staehelin и др. (1991). Аппарат Гольджи часто ассоциировался с трансвезикулярной сетью секреторных мембран Гольджи. Криофиксация способствовала обнаружению этой сети, которая обычно коррелирует с активной деятельностью аппарата Гольджи, являясь конечным местом упаковки и сортировки белков (Staehelin et al., 1991).
В разных частях цитоплазмы криофиксированных волосках семян хлопчатника часто наблюдали мультивезикулярные тельца. Однако накопление расширенных стопок мембран и везикул с плотным содержимым непосредственно под плазматической мембраной, что было характерно для ультраструктуры флоэмных волокон стебля льна-долгунца, наблюдали очень редко.
Возможно, основная роль аппарата Гольджи в волосках семян хлопчатника, которые почти не содержат полисахаридов матрикса, заключается в доставке розеток, содержащих белки целлюлозосинтазы к плазматической мембране (Kimura et al., 1999). Размер везикул аппарата Гольджи на стадии отложения вторичной клеточной стенки такой же (~100 нм), как и у несущих розетки везикул Гольджи, наблюдавшихся на репликах в ходе отложения вторичной клеточной стенки дифференцирующихся трахеальных элементов (Haigler, Brown, 1986). Пластиды в волокнах на стадии вторичной клеточной стенки характеризуются простой системой внутренних мембран, типичной для пропластид, без явных агрегатов запасных молекул. Более зрелых форм пластид не отмечено.
Простые пластиды скорее всего вовлечены в синтез жирных кислот как предшественников мембранных фосфолипидов и кутикулы волокна (Buchanan et al., 2000). Сложные липиды, вероятно, синтезируются окончательно в гладком эндоплазматическом ретикулуме, который разветвляется по всей цитоплазме волокна. Для волосков семян хлопчатника характерно наличие больших пространств цитоплазмы без каких-либо цитоплазматических органелл.
После фиксации образцов замораживанием-замещением не наблюдали скопления плотных везикул вблизи плазматической мембран, что является характерным для ультраструктуры волосков семян хлопчатника после химической фиксации. Подобные структуры были названы ломасомами и плазмалеммасомами (Itoh, 1974; Westafter, Brown, 1976). Появление такого рода образований может быть результатом продолжительного стресса в ходе химической фиксации (Steponkus, 1991). 2.2. Иммуноцитохимическая локализация клеточных структур и белков, участвующих в формировании клеточной стенки. Формирование клеточной стенки растительной клетки - сложнейший процесс, в котором задействованы многочисленные структуры. Их список продолжает расширяться, однако многие вопросы, касающиеся их роли, остаются дискуссионными. Особую сложность в изучении этого процесса представляет лабильность функционирующих комплексов. Например, организованные белки розеток целлюлозосинтазы в плазматической мембране, видимые на репликах при использовании метода замораживания-скалывания (Kimura et al., 1999), легко исчезают в ходе манипуляций с клеткой (Emons, 1991).
В последнее время получены антитела на идентифицированные функциональные компоненты целлюлозосинтазного комплекса, которые были применены нами на криогенно-фиксированных волосках семян хлопчатника. Моментальное замораживание ткани предотвращает течение мембран, перемещение встроенных в нее интегральных, а также
периферических белков, контактирующих с плазмалеммой. Кроме того, при таком способе фиксации антигенность белков существенно возрастает, что в свою очередь обеспечивает воспроизводимую локализацию антигенов-белков.
2.2.1. Сахарозосинтаза.
Формирование микрофибрилл кристаллической целлюлозы в растениях является высоко скоординированным процессом, который происходит на плазматической мембране (Delmer, 1982, 1999). Одним из вероятных участников его является сахарозосинтаза (УДФ - глюкоза: D-фруктоза-2 глюкозил-трансфераза, Н.Ф.2.4.1.13). Предполагается, что, действуя гидролитически, сахарозосинтаза расщепляет сахарозу с подачей УДФ-глюкозы к целлюлозосинтазе (Павлинова, 1971, Курсанов, 1976, Amor е.а, 1995, Salnikov et al., 2001).
Для установления локализации сахарозосинтазы использовали поликлональное антитело к рекомбинантной • сахарозосинтазе хлопчатника, которое было выработано к мембраносвязанной фракции фермента и получено в лаборатории D. Delmer (Univ. CA-Davis, Amor et al., 1995).
Иммуноцитохимическая реакция на сахарозосинтазу, поставленная на удлиняющихся волосках семян хлопчатника, формирующих первичную клеточную стенку (10 дней после цветения), не выявила положительный ответ в каких-либо участках клеток.
В волокнах на стадии формирования вторичной клеточной стенки (2430 дня после цветения), наблюдали плотное распределение метки вблизи плазматической мембраны (фото 6). Аппарат Гольджи или какие-либо другие цитоплазматические структуры не метились. Большее увеличение несколько скошенных срезов показало, что сахарозосинтаза располагается преимущественно в зоне между кортикальными микротрубочками и плазмалеммой. Контрольные опыты с преиммунной сывороткой или без первичных антител показали чистые или рассеянно -
меченные срезы, что свидетельствует о низком уровне неспецифического связывания вторичных антител.
Фото 6. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы на срезах криофиксированных волосков семян хлопчатника на стадии формирования вторичной клеточной стенки (24 дня после цветения).
Звездочками указано распределение метки вблизи плазмалеммы. В -вакуоль, МТ - микротрубочки, КС - клеточная стенка, ПМ - плазмалемма. Масштаб: 0,1 мкм.
Иммуноцитохимическая реакция на сахарозосинтазу на срезах волосков семян хлопчатника показала, что этот фермент прочно связан с плазматической мембраной. Независимо от сохранности цитоплазмы и других структур, распределение метки на сахарозосинтазу характери-
зуется исключительной стабильностью и интенсивностью, что лишний раз подчеркивает качество используемого антитела.
2.2.2. Каллоза.
На стадии формирования вторичной клеточной стенки антитела к каллозе постоянно метили одну и ту же зону над плазматической мембраной (фото 7). Иммуноцитохимическая реакция характеризовалась удивительной воспроизводимостью распределения метки в примембран -ном слое вторичной клеточной стенки волокон. В удлиняющихся волосках семян хлопчатника, формирующих первичную клеточную стенку, метка на каллозу не обнаружена. Иммуномечение каллозы в криогенно-фиксированных волокнах поддерживает гипотезу о том, что биосинтез кал-
Фото 7. Иммуноцитохимическая локализация каллозы на срезах криофиксированных волосков семян хлопчатника на стадии формирования вторичной клеточной стенки (24 дня после цветения).
КС - клеточная стенка, МТ - микротрубочки. Масштаб: 0,2 мкм.
лозы не является ответом на стресс (Maltby et al., 1979, Waterkeyn, 1981). Слой каллозы может существовать в волосках семян хлопчатника в качестве невзаимодействующего матрикса, в котором могут кристаллизоваться микрофибриллы целлюлозы. Чтобы выяснить, входит ли целлюлоза в слой каллозы вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника, проводили цитохимическую реакцию с целлюлазой (высоко очищенная смесь целлюлазы из Trichoderma, Worthington, Freehold NJ)
конъюгированной с коллоидным золотом. После проведения реакции на срезах метилось все пространство вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника, включая тот слой, где локализована каллоза (Salnikov et al., 2003), что согласуется с представлениями о том, что целлюлоза смешана со слоем каллозы (Amor et al., 1995).
Интересно, что и флоэмные волокна льна-долгунца, и волоски семян хлопчатника содержат в приплазматических слоях клеточной стенки тканеспецифичные нейтральные полисахариды, которые отсутствуют на стадии удлинения клетки и исчезают на завершающих стадиях ее биогенеза. Возможно, что водорастворимый 3-(1->4)-0-галактан из флоэмных волокон стебля льна-долгунца и каллоза из волосков семян хлопчатника выполняют сходную функцию.
2.2.4. Актин.
Использование двух антител к актину (1 - моноклональное антитело к актину, узнающее консервативный эпитоп в N-терминальный области актиновых мономеров, 2 - поликлональное антитело к актину) показало сходную картину распределения метки. Актиновые микрофиламенты и, соответственно, метка в волосках семян хлопчатника на стадии формирования вторичной клеточной стенки были обнаружены только в глубине цитоплазмы. Особый интерес иммуномечение актина представляло в сочетании с одновременным мечением сахарозосинтазы, поскольку было высказано предположение что эти белки могут взаимодействовать между собой (Winter et al., 1998).
2.2.5. Двойное иммуномечение . ультратонких срезов:
сахарозосинтаза+актин.
Ряд данных (Winter et al., 1998, Winter H., Huber S, 2000) показывает, что сахарозосинтаза связывается с G- и F-актином (G - глобулярный; F -фибриллярный): 1) присутствие сахарозосинтазы в Тритон Х-100-нерастворимой фракции микросомальных мембран (например, грубая фракция цитоскелета); 2) ко-иммунопреципитация актина с
моноклональными антителами на сахарозосинтазу; 3) ассоциация сахарозосинтазы in situ с F-актиновыми филаментами, стабилизированными фаллоидином; 4) прямое связывание с F-актином, полимеризированным in vitro. Этими авторами было постулировано, что часть растворимой сахарозосинтазы в цитозоле может быть ассоциирована с актиновым цитоскелетом in vivo.
Ультраструктурное изучение волосков семян хлопчатника в ходе формироваия вторичной клеточной стенки и проведение иммуноцитохимических реакций с использованием различных антител к актину не обнаружило структурной и функциональной связи актиновых микрофиламентов с сахарозосинтазой (фото 8).
2.2.6. Двойное иммуномечение ультратонких срезов:
сахарозосинтаза + каллоза.
Зона мечения сахарозосинтазы и каллозы практически совпадали при использовании одновременно обоих антител на срезах, полученных с одного и того же образца. Нельзя исключать возможность того, что сахарозосинтаза вовлечена в синтез каллозы (Hong et al., 2001).
3. Трахеальные элементы: культивируемые клетки циннии (Zinnia elegans L).
Элементы проводящей системы характеризуются, как правило, утолщенной клеточной стенкой. При этом наибольший интерес для изучения представляют те клетки, в которых отложение вторичной клеточной стенки происходит локально, т.е. требует усложнения пространственной организации процесса. К таким клеткам относятся трахеальные элементы, в которых утолщение клеточной стенки происходит по спирали вдоль длинной оси клетки. Трахеальные элементы широко представлены в растениях. Особенное развитие они получили у представителей древесных. Уникальной экспериментальной системой для изучения диф-
Фото 8. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы и актина (двойное мечение) на срезах криофиксированных волосков семян хлопчатника на стадии формирования вторичной клеточной стенки (24 дня после цветения). Метка на сахарозосинтазу распределена вдоль плазматической мембраны. Микрофиламенты актина обнаружены в глубине цитоплазмы. Звездочками отмечена метка на микрофиламенте актина. КС - клеточная стенка, МТ - микротрубочки. Масштаб: 0,5 мкм.
ференциации ксилемы и формирования клеточной стенки являются культивируемые in vitro клетки циннии (Zinnia elegans L).
Система культивирования клеток циннии была разработана в 1975, с целью получить культуру, в которой клетки на определенной среде и условиях (гормональная стимуляция) были способны сформировать трахеальные элементы, сходные с таковыми из проводящей системы лис-
та (Kohlendach, Schmidt, 1975, Fukuda. Komamine, 1980). Формирующиеся трахеальные элементы характеризуются наличием периодически повторяющихся вторичных утолщений в клеточной стенке, которые в зре -лых клетках приобретают вид спирали или ступенчатого образования.
Культивируемые в определенной среде клетки, изолированные из ме -зофилла листьев циннии, способны преобразовываться в трахеальные элементы в течение 2-3 суток. На протяжении этого периода можно наблюдать весь процесс от его инициальных моментов - возникновение локальных утолщений вторичной клеточной стенки, проследить кульминацию - максимальную активность цитоплазматических структур, направленную, на формирование утолщенной полисахаридной оболочки, до самых последних, заключительных стадий, когда клетка достаточно резко завершает интенсивный процесс, связанный с формированием вторичных утолщений и становится практически мертвым сосудом с высоким содержанием целлюлозы в своей стенке.
Дифференциация трахеальных элементов в культуре предоставляет ряд экспериментальных преимуществ: 1) дифференциация трахеальных элементов отделена от других событий; 2) многие клетки находятся на одном этапе развития; 3) в жидкой среде клетки одинаково доступны действию ингибиторов; 4) отложение вторичной клеточной стенки хорошо выявляется с помощью светового микроскопа, что облегчает анализ связанных с ним биологических феноменов; 5) отдельные клетки доступны криогенному фиксированию, что позволяет получать хорошие результаты при электронном микроскопировании; 6) в изолированных клетках мезофилла можно стимулировать синтез только первичных клеточных стенок, что дает ценное сравнение с тр'ахеальными элементами, которые дифференцируются через отложение вторичной клеточной стенки. Например, если уровень цитокинина в среде снижен, то клетки мезофилла делятся и растягиваются, формируя типичную суспензионную культуру, но не трахеальные элементы. Наоборот, интенсивное растяжение путем
синтеза первичной клеточной стенки может быть индуцировано до дифференциации трахеальных элементов за счет стабилизации рН среды от 5,5 до 6,0.
3.1. Ультраструктура трахеальных элементов циннии.
Ультраструктура клеток на стадии 68-72 часа культивирования характеризуется следующими особенностями (фото 9). Клетки имеют продолговатую удлиненную форму (длина - 20-25 мкм, ширина - 4-8 мкм). Цитоплазма плотная: рибосомы, полисомы отчетливо видны. Структура ядра, митохондрий, липидных капель хорошо различима. Многочисленные цистерны аппарата Гольджи с большим количеством пузырьков скапливаются вблизи плазматической мембраны в области вторичных утолщений клеточной стенки. Ряды параллельных друг другу микротрубочек обнаруживали постоянно и непосредственно под плазмалеммой в области вторичных утолщений клеточной стенки. При определенном угле прохождения среза трехслойная структура плазматической мембраны хорошо просматривается. Клеточная стенка в области вторичных утолщений в большинстве случаев имела слабую исчерченность и слабую электронную плотность. Ширина клеточной стенки между утолщениями обычно не превышала 0,25 мкм. Размер вторичных утолщений варьировал в пределах 2,5 -5,0 мкм.
3.2. Электронно-микроскопическая иммунолокализация клеточных структур и белков, участвующих в формировании клеточной стенки.
После проведения иммуноцитохимической реакции метка на сахарозосинтазу скапливалась вблизи плазматической мембраны или непосредственно была с ней связана. В основном, метку отмечали в области вторичных утолщений (фото 10). У клеток, культивируемых на среде, инициирующей только удлинение клеток, не сопровождающееся утолщением клеточной стенки, метку не обнаруживали.
Фото 9. Ультраструктура клеток циннии после фиксации методом замораживание-замещение. Отчетливо видны вторичные утолщения клеточной стенки и цитоплазматические структуры. Пунктирной стрелкой показано направление прохождения поперечного среза.
Фото 10. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы на срезах криофиксированных трахеальных элементов циннии
(Zinnia elegans L). Звездочками отмечена метка на сахарозосинтазу, локализованную строго в области вторичных утолщений клеточной стенки. АГ - аппарат Гольджи, MX - митохондрии. Масштаб: 0,2 мкм.
В отличие от волосков семян хлопчатника, метку на актин после имму-ноцитохимической реакции обнаруживали близко к плазматической мембране вдоль кортекса дифференцирующихся трахеальных элементов (фото 11). Ее наблюдали как между, так и вблизи плазмалеммы со стороны цитоплазмы в утолщениях вторичной клеточной стенки. Глубоко в цитоплазме клеток также иногда обнаруживали мечение микрофиламентов.
вторичное удолщейие ^ вторичное утолщение
Фото 11. Иммуноцитохимическая локализация актина на срезах криофиксированных трахеальных элементах клеток циннии (Zinnia elegans L). Звездочками отмечена метка на актин, которая равномерно распределена вблизи плазматической мембраны. Масштаб: 1,0 мкм.
Проведена статистическая обработка результатов иммуноцитохимии для количественного анализа распределения частиц золота в зависимости от толщины клеточной стенки в исследуемых участках дифференцирующихся трахеальных элементов (рис. 4) На графике приведены данные, полученные только в результате подсчета метки (частиц золота) в клетках, где наблюдался достоверный иммунный ответ. Метка на сахарозосинтазу была плотнее распределена на плазмалемме в области вторичных утолщений, тогда как метка на актин была одинаково плотной на всей протяженности плазматической мембраны, независимо от толщины клеточной стенки.
* ."¿v.^v
клеточной стенки
Только замещение-замораживание (freeze-substitution) давало воспроизводимые результаты о локализации сахарозосинтазы. Иммуно-флуоресценция приводила к несопоставимым и артефактным результатам.
Рис. 4. График распределения метки (частиц золота) между
вторичными утолщениями клеточной стенки и в самих утолщениях. Количество метки на сахарозосинтазу увеличивается в зависимости от толщины вторичного утолщения, в то время как количество метки на актин не изменяется.
(Salnikov et al., 2001), по крайней мере, в силу нескольких причин. Альдегидные фиксаторы, которые обычно используются на первом этапе традиционной химической фиксации перекрестно связывают белки, но не липиды (Bozzola, Russell, 1999). Поэтому нестабильность в подвижности мембраны ведет к перемещению мембранных белков, в том числе сахарозосинтазы, к артефактным, не истинным местам локализации. Кроме того, альдегидные фиксаторы и буферы могут приводить к деградации филаментов актина, возможно, вызывая делокализацию сахарозосинтазы (Frost, Roberts, 1996). Кроме того, целлюлазы и/или
30
Z
Граница между первичной и вторичной _ сахарозо-
клеточными стенками.
1 I I I I [ 1 I—I I \ I I—I I 1 1 I I I ; I I
0 0.5 1 1.5 2
Толщина клеточной стенки (мкм)
пектиназы, которые делают клеточную стенку проницаемой для антител в иммунофлуоресцентном протоколе, могут нарушать связь клеточная стенка - цитоскелет, стабилизирующую локализованные домены в клеточной стенке и кортикальные органеллы (Fowler, Quatrano, 1997).
Подобные причины могут объяснить, почему электронно-микроскопическая иммунолокализация сахарозосинтазы в наших экспериментах показала равномерное распределение кортикального актина под плазмалеммой в дифференцирующихся трахеальных элементах, тогда как результаты на уровне светового микроскопа с применением флуоресцентной метки показали ее локализацию между утолщениями (Kobyashi et al., 1988). Представленные этими авторами результаты напоминают полученное нами распределение сахарозосинтазы во вторичных утолщениях на нижней половине клеток циннии. Следовательно, иммунофлуоресцентные процедуры могут нарушать и приводить к вторичной реорганизации (Frost, Roberts, 1996) специализированные филаменты актина (и связывать сахарозосинтазу), которые в норме располагаются под утолщениями.
3.3. Анализ взаиморасположения структур с использованием иммуноцитохимических реакций на ультратонких серийных срезах.
Для установления взаиморасположения структур, участвующих в биосинтезе целлюлозы, использовали двойное иммуномечение серийных ультратонких срезов. При этом частицы золота меньшего размера (10 нм) соответствовали сахарозосинтазе, а большего (20 нм) - актину. Анализ ультратонких срезов, сделанных по касательной к поверхности клетки (фото 12 А, Б, В), четко показал пространственную локализацию меченых антигенов, микротрубочек, плазматической мембраны и клеточной стенки. На снимках видна сеть кортикальных микротрубочек под вторичными утолщениями трахеальных элементов. Когда зона прохождения среза располагается внутри пучка микротрубочек, метка на сахарозосинтазу и
Фото 12. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы и актин (двойное мечение) на серийных срезах криофиксированных клеток циннии (Б и В). А - отчетливо видна конфигурация вторичных утолщений клеточной стенки (1-1, 2-2). Значительная часть метки на актин и сахарозосинтазу сконцентрирована в слое цитоплазмы над микротрубочками (стрелки - сахарозосинтаза, звездочки - актин, пунктирной линией отмечена зона серийного среза). Масштаб: 2,0,0,5,0,5 мкм соответственно.
актин практически отсутствует (фото 12 Б). Когда срезы пересекали область около плазматической мембраны между микротрубочками и клеточной стенкой, сахарозосинтаза и актин метились таким образом, что можно сделать вывод об их расположении непосредственно над микротрубочками. Актин метился несколько ближе к микротрубочкам, чем сахарозосинтаза, как показано на представленных микрофотографиях (фото 12 В). Плотность метки на актин была сопоставима с плотностью метки на сахарозосинтазу.
Заключение.
В настоящее время не возникает никаких сомнений относительно важной роли клеточной стенки в растительном организме любого уровня и систематического расположения. Кажущаяся простота в строении клеточной стенки при ее открытии оказалась обманчивой. Формирование клеточной стенки является одним из самых сложным и многоплановых процессов, протекающих в растительной клетке. Для его изучения в нашей работе использовали объекты, физиология, онтогенез, жизненный цикл которых, в большой степени, направлен на формирование клеток с толстой вторичной клеточной стенкой, основным компонентом которой является целлюлоза. Нами использованы методы световой и электронной микроскопии применительно к объектам с толстой клеточной стенкой. Некоторые из них были применены впервые, а многие усовершенствованы.
Проведено комплексное исследование по изучению динамики роста и формирования лубяных волокон. В ходе нашей работы было установлены особенности формирования флоэмных волокон льна-долгунца и их клеточной стенки. На стебле льна долгунца обнаружена точка слома, где стебель меняет свои механические свойства, что связано со сменой стадии развития волокон склеренхимы (ОогвИкста et а1., 1996., Эа^коу et а1., 1998). Показана динамика утолщения клеточной стенки флоэмных волокон.
Продемонстрирована мозаичность в локализации лигнина и других фенольных соединений клеточной стенки. Обнаружена двуслойность вторичной клеточной стенки флоэмных волокон (Сальников и др. 1993).
Прослежена ее динамика в ходе онтогенеза всего растения. Методом иммуноцитохимического анализа установлено, что постсинтетическая модификация клеточной стенки связана с метаболизмом нейтрального полисахарида - (3-(1—>4)-0 - галактаном, который специфичен только для флоэмных волокон стебля льна-долгунца (Gorshkova et al., 2004).
В какой-то степени аналогичная ситуация прослеживается при образовании другого нейтрального полисахарида при формировании вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника - каллозы. Методом электронно-микроскопической иммуноцйтохимии установлено, что каллоза распределена ввиде равномерного слоя над плазматической мембраной, который постоянно присутствует в период интенсивного синтеза целлюлозы во вторичной клеточной стенке волосков семян хлопчатника et al., 2001).
Впервые охарактеризована ультраструктура волосков семян хлопчатника и описаны ее особенности после фиксации методом замораживания-замещения.
Проведены исследования с применением целого ряда поликлональных и моноклональных антител к белкам, входящим в состав целлюлозосинтазного комплекса на плазматической мембране. Итоги исследования по локализации различных компонентов комплекса, синтезирующего целлюлозу, представлены на схеме 2, иллюстрирующей взаиморасположение различных структур с учетом их размеров.
Целлюлозосинтаза (1/6 её часть) изображена как интегральный белок плазматической мембраны. Идентификация этого фермента методом замораживания-скалывания (freeze-fracture) была произведена сравнительно недавно (Kimura et al., 1999). Его размер и форма предсказаны на основе уже известных молекулярных структур АТФаз
(Auer et al., 1988, Zang et al., 1998), которые имеют молекулярную массу и топологию, подобную таковым, известным или предсказанным для целлюлозосинтазы (Delmer, 1999). Примерный размер глобулярной саха -
Схема 2. Пространственная локализация цитоплазматичесиких органелл и ферментов в клетках циннии (Zinnia eiegans L.) и волосках семян хлопчатника {Gossypium hirsutum L.) в процессе формирования целлюлозных микрофибрилл вторичных клеточных стенок.
розосинтазы был определен из отношения ее молекулярной массы - 91 кДа у хлопчатника, к целлюлозосинтазе -110 кДа у хлопчатника (Kowagoe, Delmer, 1997). Щель позади целлюлозосинтазы показывает, что глюкановые цепи должны достигнуть пространства клеточной стенки, что может происходить через пору, образованную трансмембранными спиралями (Delmer, 1999) или путем агрегации множественных белков целлюлозосинтазы в розетки (Emons, 1991).
На схеме 2 показано, что сахарозосинтаза взаимодействует с плазматической мембраной как переферический мембранный белок через определенный гидрофобный участок, а с актином - через определенный актин-связывающий пептид (Winter, Huber, 2000). Так как мы не обладаем определенной информацией о том, как связываются сахарозосинтаза и целлюлозосинтаза, диаграмма показывает их только как прилегающие друг к другу; однако известно, что целлюлозосинтаза хлопчатника обладает доменом, который облегчает белок-белковые взаимодействия (Kawagoe, Delmer, 1997). Микротрубочки, в соответствии с нашими данными, располагаются ниже плазматической мембраны, но ближе к кортикальному актину. Знак вопроса, отмеченный на диаграмме, показывает, что другие возможные связи и/или места связывания для других взаимодействующих белков еще не идентифицированы.
Таким образом, в наших исследованиях продемонстрировано существование сложных многокомпонентных комплексов, обеспечивающих синтез целлюлозы. Эти комплексы существенно различаются при синтезе первичной и вторичной клеточной стенки. Наши результаты, совместно с данными об экспрессии разных CesA генов при синтезе первичной и вторичной клеточной стенки (Haigler et al., 2001, Doblin et al., 2002, Schieble, Pauly, 2004 и др.) свидетельствуют, что механизмы синтеза первичной и вторичной клеточной стенки качественно различны. Возможно, именно различие в способе формировать сложные взаимодействия с различными белками лежит в основе необходимости разных полипептидов целлюлозосинтазы для синтеза первичной и вторичной клеточной стенки. Необходимость взаимодействия многих белков может объяснить, почему так трудно воспроизвести синтез целлюлозы in vitro с высокой скоростью и в кристаллической форме (Blanton, Haigler, 1996). Лабильность целлюлозосинтезирующего комплекса может быть связана с эволюционным преимуществом тесного
контроля за синтезом целлюлозы потому, что этот процесс выводит из метаболизма существенную часть углерода (Иа1д1ег et а1., 2001).
Выводы:
1. С помощью различных методов микроскопии охарактеризовано формирование вторичных клеточных стенок в клетках, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы (флоэмные волокна льна, волоски семян хлопчатника, трахеальные элементы циннии). Развито представление о существовании многокомпонентных комплексов, обеспечивающих отложение целлюлозы, на ультраструктурном уровне локализованы их составляющие.
2. Модифицированы методы фиксации и инфильтрации растительного материала с целью адаптации их для анализа тканей с утолщенными клеточными стенками, в результате чего достигнута высокая сохранность внутриклеточного содержимого и стабильная воспроизводимость локализации исследуемых антигенов.
3. Охарактеризованы стадии формирования клеточных стенок флоэмных волокон льна-долгунца. Впервые выявлены постсинтетические изменения клеточной стенки, заключающиеся в модификации структуры отложенных слоев микрофибрилл.
4. Впервые показано распределение лигнина и других фенольных соединений в слоях клеточной стенки флоэмных волокон. Продемонстрирована мозаичность в локализации этих соединений, создающая основу для пространственной регуляции протекающих в клеточной стенке процессов.
5. Впервые доказана тканеспецифичность галактана в
стебле льна-долгунца. Продемонстрировано наличие его эпитопов только в клеточной стенке флоэмных волокон методами иммуноцитохимии.
Показана локализация тканеспецифичного галактана в слоях вторичной клеточной стенки флоэмных волокон, подвергающихся модификации.
6. Впервые на ультраструктурном уровне продемонстрировано, что в волосках семян хлопчатника синтез каллозы не является ответом на стресс. Показано, что каллоза существует в виде постоянного слоя в ходе формирования вторичной клеточной стенки и, вероятно, выполняет роль невзаимодействующего матрикса, в котором происходит кристаллизация микрофибрилл целлюлозы.
7. При проведении иммуноцитохимических реакций на серийных срезах впервые установлено взаиморасположение клеточных структур, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
8. Впервые на ультраструктурном уровне локализована особая форма сахарозосинтазы, связанная с плазматической мембраной.
9. Впервые выявлено различие в локализации сахарозосинтазы при формировании первичной и вторичной клеточной стенки. Продемонстрировано, что во время отложения вторичной клеточной стенки сахарозосинтаза всегда локализована вплотную к плазматической мембране.
10. Впервые показано, что микрофиламенты актина не являются обязательными участниками формирования вторичных клеточных стенок, а обнаруживаются лишь при сложной пространственной организации этого процесса, например, при образовании локальных утолщений клеточных стенок в трахеальных элементах.
Список основных публикаций по.теме диссертации.
Сальников В.В. Формирование полисахаридной оболочки у клеток высших и низших растений в схемах. 1987. I часть // Деп. ВИНИТИ 08.05.87, № 3336-В87. -101 С.
Тимофеева О.А., Агеева М.В., Сальников В.В., Лозовая В.В. 1987. Динамика синтеза полисахаридов клеточной стенки в тканях стебля растений льна-долгунца в ходе онтогенеза // Тез.докл. VII Всесоюзн.конф. "Химия и биохимия углеводов", Тбилиси, 1987. -С. 225.
Тарчевский И.Т., Лозовая В.В., Горшкова ТА, Райманов И.Т., Племенкова С.Ф., Сальников В.В., Хусаинов М.Б. Синтез структурных полисахаридов при регенерации клеточной стенки изолированными протопластами бобов // Физиология растений. -1988.-Т. 35. -№1. -С.129-135.
Сальников В.В. Изучение анатомии стебля льна- долгунца и морфологии формирующихся пучков луба из элементарных клеток-волокон методом сканирующей электронной микроскопии // В сб. Актуальные вопросы физико-химической биологии. Под ред. Б.М. Одинцова, Казанский филиал АН СССР, Казань, 1988. -С. 23-32.
Лозовая В.В., Сальников В.В., Юмашев Н.В. Формирование клеточных стенок в тканях стебля льна-долгунца // Монография. Научн. ред. акад. АН СССР ИАТарчевский. Казань, 1990. -171 С.
Сальников В.В., Агеева М.В. Ультраструктурные исследования луба и древесины стебля льна-долгунца в онтогенезе растения // Тез. докл. Ill Всесоюзн. конф. "Биосинтез целлюлозы и других структурных полисахаридов клеточной стенки". -Казань. -1990. -С. 91.
Тимофеева О.А., Гродзовская Т.С., Сальников В.В., Марапов И.Б., Малихов Р.Г. Влияние физиологически активных соединений на биосинтез клеточных стенок льна-долгунца // Тез. докл. Ill Всесоюзн. конф. " Биосинтез целлюлозы и других структурных компонентов клеточной стенки". -Казань. -1990. -С. 64.
Сальников В.В. Формирование полисахаридной оболочки у клеток низших и высших растений в схемах // Монография. Науч. ред. проф. Лозовая В.В. Казань. -1990. -170 С.
Salnikov V.V., Tymofeeva O.A., Zabotina O.A., Yumashev N.V., Lozovaya V.V. Monosaccharide composition of pectins and hemicelluloses of flax stem // Abstr. VI European symposium on carbohydrate chemistry, Edinburgh -1991. -P. 8-13.
Лозовая В.В., Тимофеева О.А., Заботина O.A., Марапов И.Б., Сальников В.В. Образование структурных полисахаридов в ходе развития растений // Физиология растений. -1992 -Т.36. -№ 5. -С. 11751186.
Salnikov V.V., Ageeva M.V., Yumashev N.V., Lozovaya V.V. Ultrastructural analysis of flax fiber // Abstr. VI Cell Wall Meeting, Nijmegen. -1992.-P. 48.
Сальников В.В., Агеева М.В., Юмашев Н.В., Лозовая В.В. Ультраструктурный анализ лубяных волокон в онтогенезе растений льна // Физиология растений. -1993. -Т. 40. -№ 3. -С. 458-464.
Salnikov V.V., van Dam J.E.G. The multi-approched study of the cell wall formation of the flax bast fibers // Abstr. 7th Cell Wall Meeting, Santiago de Compostella, Spain. -1995. -P. 16.
Gorshkova ТА, Wyatt S.E., Salnikov V.V., Gibeaut D.M., Ibragimov M.R., Lozovaya V.V., Carpita N.C. Cell wall polisaccharides of developing flax plants // Plant Physiol. -1996. -V. 110. -№ 3. -C. 721-729.
Gorshkova Т.Д., Chemikosova S.B., Salnikov V.V., Li-Mei Chen, Mc Cann M.C., Lozovaya V.V., Carpita N.C. Flax: a genetic and biochemical model to study primary and secondery wall biogenesis // In: 4th European Regional Workshop of Flax, Roen, France, 1996, September 25-28. -P. 457-463.
Salnikov V.V., van Dam J.E.G., van Hazendonk J.M., Lozovaya V.V. Microscopic studies of the cell wall formation of flax bast fibers // In: 4th European Regional Workshop of Flax, Roen, France, 1996, September 25-28. -P. 463-466.
Горшкова ТА, Карпита Н., Сальников В.В., ван Дам Я., Чемикосова СБ., Яблокова Е.В., Зернова О.В., Кожевников А.Ю., Чиков В.И., Лозовая В.В. Лен-долгунец как модель для изучения метаболизма клеточной стенки // В кн. Национальная коллекция русского льна. Торжок, ВНИИЛ, 1996. Под ред. Жученко АА -С. 53-83.
Gorshkova ТА, Chemikosova S.B., Salnikov V.V., Me Cann M.C., Lozovaya V.V., Carpita N. Flax: a genetic and biochemical model to study phloem fiber development // Proc. of the Plant Polysaccharides Symposium (P.Colonnaet. al., eds.), Nantes, France. -1996. -P. 160, Biophys.J. 84 {2, part 2). -P. 338a.
Salnikov, V.V., Van Dam, J.E.G., Lozovaya, V.V. Microscopy of cell wall formation in flax bast fiber// In. Natural Fiber. -1998. -V. 2. -P. 187-194.
Haigler C.H., Cai W.X., Gannaway J.G., Grimson M.J., Hequet E.F., Holiday SA, Huang J., Jaradan T.T., Jividen G.J., Krieg D.R., Martin K.L., Nagarur S., Salnikov V.V., Strauss R.E., Tummala J., Wan C.H., Wu C, Wyatt B.G., Zhang H. Optimazing Secondary Wall Synthesis in Cotton Fibers // In: Proceeding of Cotton Inc. Conference in Genetic Improvement of Cotton, Dec. 5-6. San-Antonio, TX. -2000. -P. 147-165.
Gorshkova T. A., Salnikov V. V., Pogodina N. M., Chemikosova S. В., Yablokova E. V., Ulanov A. V., Ageeva M. V., J. E. G. van Dam, Lozovaya V. V. Composition and distribution of cell wall phenolic compounds in the flax {Linum usitatissimum L.) stem tissues //Ann. Bot. -2000. -V.85. -P.477-486.
Salnikov, V.V., Grimson, M.J., Delmer, D.P., and Haigler, C.H. Sucrose synthase localizes to cellulose synthesis sites in tracherary elements // Phytochemistry. -2001. -V. 57. -P. 823-833.
Haigler, C.H., Ivanova-Datcheva, M., Hogan, P.S., Salnikov, V.V., Hwang, S., Martin L.K., Delmer D.P. Carbon partitioning to cellulose synthesis // Plant Molecular Biology. -2001. -V. 47. -P. 29-51.
Haigler C.H., Babb V.M., Hwang S., Salnikov V. Regulation of cellulose biosyntesis in developing xylem // In: Molecular Breeding of Woody Plants. -2001. -Eds.: N. Morohoshi, A. Komamine. -P. 1-9.
Gorshkova ТА, Salnikov V.V., Chemikosova S.B., Pavlencheva N.V., Stolle-smits Т., van Dam G.J.E. Developmentally regulated galactan at cell wall thickening stage of flax fiber formation // Abstr. of Workshop on plant biopolymer. Food and nonfood application, Nantes, France, 2001. -P. 81.
Salnikov V., Grimson M., Delmer D., Haigler C. The localozation of cellulose-synthesis associated sucrose synthase is changeable in cotton fibers // Abstr. of 9th International Cell Wall Meeting. Toulouse, France.-2001. -P. 53.
Pavlencheva N.. Gorshkova Т., Ageeva M., Salnikov V., Chemikosova S., van Lammeren A.A.M., van Dam J.f Emons A.M.C. Flax bast fiber as a model to study cell elongation and wall thickening in situ II Abstr. of 9th International Cell Wall Meeting, Toulouse, France. -2001. -P. 251.
Горшкова ТА, Агеева М.В., Павленчева Н.В., Сальников В.В., Чемикосова СБ. О характере роста лубяных волокон Linum usitatissimum L // Тез. II Международной конференции по анатомии и морфологии растений. 14-18 окт. Санкт-Петербург. -2002. -С. 226-227.
Salnikov V., Grimson M., Seagull R., Haigler C. The localisation of sucrose synthase and callose in freeze substitution secondary - wall stage cotton fibers // Protoplasma. -2003. -V. 221. -№ 3-4. -P. 175-184.
Gorshkova T.A., Salnikov V.V., Chemikosova S.B., Ageeva M.V., Pavlencheva N.V., van Dam J.E.G. Snap point: a transition point in Linum usitatissimun bast fiber development // Ind. Crops and Prod. -2003. -№18. -P. 213-221.
Т. А. Горшкова, М. В. Агеева, В. В. Сальников, Н. В. Павленчева, А. В. Снегирева, Т. Е. Чернова, С. Б. Чемикосова. Стадии формирования лубяных волокон Linum usitatissimum L // Бот. журн. -2003. -Т. 88. -№.12. -С.1-11.
Сальников В.В., Хайглер К.Х. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы при формировании вторичной клеточной стенки // Тез. докл. V Всероссийский съезд физиологов растений, Пенза. -2003. -С. 110.
Gorshkova T.A., Chemikosova S.B., Salnikov V.V., Pavlencheva N.V., О.Р. Gur'janov, Stolle-Smits Т., van Dam J.E.G. Occurrence of cell-specific galactan is coinciding with bast fibre developmentall transition in flax // Ind. Crops and Prod. -2004. -№ 19. -P. 217-224.
Pavlencheva N., Gurjanov O., Salnikov V., Ageeva M.f Chemikosova S., Chemova Т., van Dam J., Kabel M., Schols H., Gorshkova ТА Dynamic polysaccharide of the fiber cell wall // Abstr. X Cell Wall Meeting, Sorrento, Italy. -2004.-P. 126.
Ageeva M.V., Petrovska В., Kieft H., Salnikov V.V., Snegireva A.V., van Dam J.E.G., van Veenendaal W L.H., Emons A.M.C., Gorshkova ТА, Lammeren A.A.M. Intrusive growth of flax phloem fibers is of intercalary type // Planta. - 2005. - в печати.
Формат А5. Тираж 120 экз. Заказ № 17
- £52
Отпечатано
в Копировальном Центре
г. Казань, ул. Университетская 32, »' [
2 2 МАД 200^. \
\
5 Г
и *
У
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Сальников, Вадим Владимирович
Введение.
I. Обзор литературы.
1. Состав и структура клеточной стенки.
2. Биосинтез компонентов клеточной стенки.
3. Биосинтез целлюлозы.
3.1. Субстраты биосинтеза целлюлозы и пути их образования.
3.2. Каталитический центр. Терминальные комплексы, розетки. 28 3.3.Ориентация микрофибрилл. Участие цитоскелета в формировании клеточной стенки растений.
4. Первичная и вторичная клеточная стенка.
5. Использование методов микроскопии для изучения клеточной стенки растений.
II. Объекты и методы.
1. Общая характеристика объектов исследования.
1.1 .Флоэмные волокна стебля льна-долгунца
Linum usitatissimum L).
1.2. Волоски семян хлопчатника (Gossypium hirsutum L.).
1.3. Культура клеток циннии {Zinnia elegans L.), формирующая трахеальные элементы.
2. Подготовка растительного материала.
3. Флуоресцентная микроскопия.
3.1. Подготовка срезов стебля льна-долгунца.
3.2.Подготовка клеток циннии.
4. Сканирующая электронная микроскопия.
5. Трансмиссионная электронная микроскопия метод ультратонких срезов).
6. Цитохимический анализ.
7. Иммуноцитохимический анализ.
-37.1. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителом к ß-(l—>4)-D - галактанам на ультратонких срезах стебля льна.
7.2. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителами к сахарозосинтазе, актину и каллозе на ультратонких срезах волосков семян хлопчатника и трахеальных элементах циннии.
8. Статистическая обработка результатов.
8.1. Количественная оценка иммуноэлектронно-микроскопической метки на срезах флоэмных волокон льна-долгунца.
8.2. Количественная оценка иммуноэлектронно-микроскопической метки на срезах волосков семян хлопчатника.
8.3. Количественная оценка иммуноэлекроно-микроскопической метки на срезах трахеальных элементов циннии.
III. Результаты и обсуждение.
1. Волокна склеренхимы: флоэмные волокна льна-долгунца.
1.1. Флюоресцентная микроскопия.
1.1.1. Характеристика и использование точки слома
ТС) для планирования и проведения экспериментов.
1.1.2. Окрашивание срезов Cellufluor (СФ).
1.1.3. Окрашивание срезов специфическим красителем на пектиновые вещества (СКП).
1.1.4. Динамика формирования флоэмных волокон.
1.1.5. Аутофлуоресценция лигнина во флоэмных волокнах и сосудах ксилемы в стебле льна-долгунца.
1.1.6. Механическое разделение пучков флоэмных волокон луба) и слоя клеток вторичной ксилемы (древесины).
-41.2. Изучение строения флоэмных волокон и структуры клеточной стенки методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
1.2.1. Расслоение стебля льна-долгунца на последних стадиях созревания.
1.2.2. Поверхность флоэмных волокон.
Закрученность волокон.
1.3. Изучение флоэмных волокон в ходе онтогенеза растений льна-долгунца методами трансмиссионной электронной микроскопии.
1.3.1. Ультраструктура флоэмных волокон.
1.3.2. Цитохимический анализ флоэмных волокон. Результаты окрашивания срезов по методу Тьери. Двуслойность клеточной стенки волокон.
1.3.3. Иммуноцитохимический анализ распределения галактана в тканях стебля льна-долгунца.
1.3.4. Определение локализации лигнина во флоэмных волокон и вторичной ксилемы методом цитохимии-ческого анализа фермент-золото (enzyme-gold).
2. Трихомы: волоски семян хлопчатника.
2.1. Ультраструктура волосков семян хлопчатника.
2.2. Иммуноцитохимическая локализация клеточных структур, белков и полисахаридов, участвующих в формировании клеточной стенки и входящих в ее состав. 201 2.2.1. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы.
2.2.2. Иммуноцитохимическая локализация каллозы.
2.2.3. Двойное иммуномечение ультратонких срезов: сахарозосинтаза + каллоза.
-52.2.4. Иммуноцитохимическая локализация актина. 214 2.2.5. Двойное иммуномечение ультратонких срезов: сахарозосинтаза + актин.
3. Трахеальные элементы: культивируемые клетки циннии {Zinnia elegans L.).
3.1. Ультраструктура трахеальных элементов циннии.
3.2. Иммунофлуорусцентная микроскопия.
3.3. Электронно-микроскопическая иммунолокализация клеточных структур и белков, участвующих в формировании клеточной стенки трахеальных элементов циннии.
3.4. Анализ взаиморасположения структур с использованием иммуноцитохимических реакций на ультратонких серийных срезах.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная характеристика формирования клеточных стенок в растительных тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы"
Целлюлоза является основным по массе органическим веществом биосферы, широко используется во многих современных производствах (Тарчевский, Марченко, 1985). При этом, как отмечается в ряде работ (Amor et al., 1995, Delmer, 1999, Haigler et al., 2001), нет другого такого процесса в растениях, который был бы столь важен и столь мало изучен на молекулярном уровне, как синтез целлюлозы. Основное количество целлюлозы содержится в так называемых вторичных клеточных стенках растений. Вторичная клеточная стенка - это слой клеточной стенки, который формируется клетками, закончившими свой рост. Он характерен, в первую очередь, для клеток тканей, выполняющих опорно-механическую и проводящую функции. Эти клетки обычно обладают рядом особенностей: значительная длина (до нескольких сантиметров), особенности роста, индивидуальная динамика клеточных органелл, толстая клеточная стенка, состав клеточной стенки. Жизнедеятельность этих специализированных клеток в большой степени направлена на интенсивный синтез компонентов клеточной стенки, поэтому они являются удобным объектом для изучения процесса формирования вторичной клеточной стенки и, в частности, процесса биосинтеза целлюлозы.
Синтез микрофибрилл целлюлозы в растениях является высоко скоординированным процессом, который происходит на поверхности плазматической мембраны (Delmer, 1982). Имеются основания полагать, что биосинтез целлюлозы обусловлен взаимодействием нескольких белков и участием ряда органелл (Delmer, Amor, 1995, Haigler et al., 2001., Salnikov et al., 2001, 2003), однако детали этого процесса и взаимодействия структур едва начинают поддаваться пониманию.
Незаменимым инструментом в исследовании механизмов синтеза целлюлозы и других структурных полисахаридов являются методы электронной микроскопии. Однако их использование для клеток, имеющих вторичную клеточную стенку, сталкивается с рядом проблем. Так, достижение высокого качества химической фиксации материала для ультраструктурных исследований осложняется толщиной клеточной стенки, а также наличием крупной вакуоли и, как следствие, особой чувствительностью к изменениям осмотичности растворов-фиксаторов. Все эти факторы усиливают неизбежность тенденции к медленной химической фиксации, иммобилизирующей цитоплазму в состоянии, когда она уже значительно нарушена в ходе приготовления образца (Mersey, McCully, 1978). Артефакты химической фиксации приносят особенный ущерб исследованиям синтеза целлюлозы, который организован в пределах клеточного кортекса и особенно чувствителен к манипуляциям в ходе приготовления образцов для электронной микроскопии. Появление новых методов фиксации, таких как замораживание-скалывание, замораживание-замещение и замораживание-замещение под высоким давлением, открывают новые возможности для исследований растительных клеток и тканей. Однако к началу наших исследований они не были адаптированы для анализа клеток с толстой вторичной клеточной стенкой.
Цель и задачи исследования.
Целью нашей работы было изучение структурно-функциональных характеристик формирования клеточных стенок в тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы. Ее реализация связывалась с решением следующих задач:
1. Адаптировать современные методы анализа ультраструктуры растительных тканей для клеток, характеризующихся толстой клеточной стенкой с высоким содержанием целлюлозы.
2. Проанализировать динамику формирования клеточных стенок в различных тканях, формирующих вторичнюу клеточную стенку.
3. Охарактеризовать ультраструктуру разных типов клеток, специализированных на формировании вторичной клеточной стенки.
4. Определить локализацию ключевых структур и белков, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
-85. Сопоставить структурно-функциональные характеристики формирования первичной и вторичной клеточной стенки.
Научная новизна работы.
В работе получили развитие представления о динамичности и мозаичности структуры клеточной стенки и механизмах формирования целлюлозных микрофибрилл. Показано, что механизмы синтеза целлюлозы первичной и вторичной клеточной стенки качественно различимы.
Проведено комплексное исследование по изучению динамики роста и формирования склеренхимных волокон с использованием методов световой флуоресцентной микроскопии, электронной микроскопии (сканирующая и трансмиссионная) и иммуноцитохимического анализа. Впервые продемонстрированы особенности формирования вторичных клеточных стенок флоэмных волокон льна-долгунца. Выявлена постсинтетическая модификация р-(1—>4)-0-галактана во время утолщения клеточной стенки, доказана тканеспецифичность этого высокомолекулярного полимера. Впервые продемонстрирована мозаичность распределения лигнина и других фенольных соединений во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца.
Разработаны методы криогенной фиксации (замораживание-замещение) и особый режим проводки образцов через градиент эпоксидных смол. В результате такой фиксации появилась возможность описать ряд органелл волосков семян хлопчатника, включая структуры аппарата Гольджи, мультивезикулярные тельца и пропластиды.
Впервые на ультраструктурном уровне локализована особая форма сахарозосинтазы, связанная с плазматической мембраной. При анализе серийных ультратонких срезов впервые установлено взаиморасположение отдельных клеточных структур, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
Основные положения, выносимые на защиту.
1). В формирующемся стебле льна-долгунца, в верхней его части существует специфический участок - «точка слома», где стебель значительно меняет свои механические свойства, что связано с изменением стадии формирования флоэмных волокон.
2). Утолщение клеточной стенки флоэмных волокон льна-долгунца начинается на внешней периферии пучка и продолжается по направлению к центру стебля.
3). Обнаруженный во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца буферорастворимый галактан является тканеспецифичным, то есть присутствует только во флоэмных волокнах этих растений.
4). Вторичная клеточная стенка флоэмных волокон характеризуется мозаичностью распределения лигнина и других фенольных соединений.
5). Метод замораживания-замещения позволяет установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур-антигенов.
6). В клетках, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы, во время отложения вторичной клеточной стенки всегда присутствует особая форма сахарозосинтазы, которая локализована вплотную к плазматической мембране.
7). Актиновые микрофиламенты не являются обязательными участниками формирования вторичных клеточных стенок, а обнаруживаются лишь при сложной пространственной организации этого процесса, например, при образовании локальных утолщений клеточных стенок в трахеальных элементах.
8). Каллоза существует в виде постоянного слоя в ходе формирования вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника и, вероятно, выполняет роль невзаимодействующего матрикса, в котором происходит кристаллизация микрофибрилл целлюлозы.
Практическое значение работы.
Практическое значение данной работы во многом определяется тем, что объектами исследования были флоэмные волокна льна-долгунца {Цпит ш^а^тит Ь.) и волоски семян хлопчатника (Созягршт кшиШт Ь.) -ткани важнейших технических культур. Получены данные, позволяющие изменить представление об их формировании.
Проведен комплексный анализ формирования клеточной стенки волокон льна-долгунца, что может послужить практическим руководством для изучения сходных по значению технических культур таких, как конопля, рами и других.
Детально разработаны приемы быстрой криогенной фиксации растительной ткани (замораживание-замещение), анализа серийных ультратонких срезов, современных методов иммуноцитохимии, что может быть использовано в работах, где необходимо установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур.
Личный вклад соискателя.
Представляемые в работе данные были получены в совместных исследованиях с коллегами из лаборатории Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН и в лаборатории электронной микроскопии Техасского технического университета (США). В диссертацию включены и вынесены на защиту только те результаты, в которых автору принадлежит существенная или определяющая роль.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены автором на регулярных итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН, на трех Всесоюзных конференциях "Биосинтез целлюлозы" (Казань 1980, 1985, 1990), на Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1982), на VI Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" (Чернигов, 1988), на регулярных международных конференциях по клеточной стенке (VI Cell Wall Meeting -Nijmegen, Голландия, 1992, VII - Santiago de Compostella, Испания, 1995, VIII -Norwich, Англия, 1998, IX - Toulouse, Франция, 2001, X -Sorrento, Италия, 2004), на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на V Съезде физиологов растений России (Пенза, 2004). Диссертационная работа в завершенном виде была представлена в виде устного доклада на семинарах в Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН и в Техасском техническом университете (Лаббок, США).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано около 60 научных работ. В список опубликованных работ входят две монографии, статьи в отечественных ("Доклады РАН", "Физиология растений", "Цитология", "Ботанический журнал") и зарубежных ("Plant Molecular Biology", "Phytochemistry", "Plant cJb /
Physiology", "Protoplasma", "AnnuarBotany", "Natural Fiber", "Industrial Crops and Products") журналах, а также материалы, представленные на конференциях и изданные в научных сборниках. Структура и объем работы.
Основной текст диссертации изложен на 272 страницах, состоит из 3 глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 369 названий, из них 325 на иностранных языках. Текст диссертации в себя включает 1 тавлицу, 2 схемы, 34 рисунков и 174 фотографии.
Благодарности. Приношу свою благодарность профессору д. б. н. Лозовой В.В., под руководством которой в институте были заложены основы исследований физиологии растения льна-долгунца, коллегам, работавшим со мной в разные годы в КИБ КНЦ РАН., с.н.с., к.б.н. Агеевой М.М., с.н.с., к.б.н. Чемикосовой C.B., к.б.н. доценту кафедры физиологии и биотехнологии растений Казанского государственного университета O.A. Тимофеевой, сотрудникам ГНУ ВНИИЛ РАСХ (Торжок) д.б.н. A.A. Жученко и к.б.н Л.Н. Курчаковой, сотрудникам БелНИИЗ (Жодино) д.с.-х.н. М.И. Афонин), Е.Д.
Мироновой, Л.М. Кукреш, коллегам из Агротехнологического института (Вагенинген, Нидерланды), особенно Jan van Dam, коллегам Техасского технического университета (Лаббок, Техас, США) С.Н. Haigler, М. Grimson - за совместные экспериментальные работы и плодотворное обсуждение полученных данных. Неоценима роль заведующего нашей лабораторией механизмов роста растительных клеток КИББ КНЦ РАН, моего научного консультанта, превосходного руководителя Татьяны Анатольевны Горшковой, без всесторонней поддержки и помощи которой эта работа была бы осуществима с большими трудностями. Выражаю искреннюю признательность академику И. А.
Тарчевскому, по инициативе и усилиями которого в КИБ КНЦ РАН были организованы работы по изучению растительной клеточной стенки.
1. Обзор литературы.
Роберт Гук, впервые наблюдавший растительную клеточную стенку (Микрография, 1665), не мог предположить, что обнаруженная им "мертвая" структура окажется в будущих исследованиях биологов одним из самых интересных и загадочных компартментов растительной клетки. Р. Гук в самом деле наблюдал уже мертвое образование - срез коры пробкового дерева (рис. 1). Однако цепь событий, которые произошли и продолжают происходить па пути изучения клеточной стенки, потрясают своим драматизмом и без сомнения произвели бы огромное впечатление на первооткрывателя.
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Сальников, Вадим Владимирович
Выводы:
1. С помощью различных методов микроскопии охарактеризовано формирование вторичных клеточных стенок в клетках, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы (флоэмные волокна льна, волоски семян хлопчатника, трахеальные элементы циннии). Развито представление о существовании многокомпонентных комплексов, обеспечивающих отложение целлюлозы, на ультраструктурном уровне локализованы их составляющие.
2. Модифицированы методы фиксации и инфильтрации растительного материала с целью адаптации их для анализа тканей с утолщенными клеточными стенками, в результате чего достигнута высокая сохранность внутриклеточного содержимого и стабильная воспроизводимость локализации исследуемых антигенов.
3. Охарактеризованы стадии формирования клеточных стенок флоэмных волокон льна-долгунца. Впервые выявлены постсинтетические изменения клеточной стенки, заключающиеся в модификации структуры отложенных слоев микрофибрилл.
4. Впервые показано распределение лигнина и других фенольных соединений в слоях клеточной стенки флоэмных волокон. Продемонстрирована мозаичность в локализации этих соединений, создающая основу для пространственной регуляции протекающих в клеточной стенке процессов.
5. Впервые доказана тканеспецифичность В-(1—>4)-В-галактана в стебле льна-долгунца. Продемонстрировано наличие его эпитопов только в клеточной стенке флоэмных волокон методами иммуноцитохимии. Показана локализация тканеспецифичного галактана в слоях вторичной клеточной стенки флоэмных волокон, подвергающихся модификации.
-2386. Впервые на ультраструктурном уровне доказано, что в волосках семян хлопчатника синтез каллозы не является ответом на стресс. Показано, что каллоза существует в виде постоянного слоя в ходе формирования вторичной клеточной стенки и, вероятно, выполняет роль невзаимодействующего матрикса, в котором происходит кристаллизация микрофибрилл целлюлозы.
7. При проведении иммуноцитохимических реакций на серийных срезах впервые установлено взаиморасположение клеточных структур, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
8. Впервые на ультраструктурном уровне локализована особая форма сахарозосинтазы, связанная с плазматической мембраной.
9. Впервые выявлено различие в локализации сахарозосинтазы при формировании первичной и вторичной клеточной стенки. Продемонстрировано, что во время отложения вторичной клеточной стенки сахарозосинтаза всегда локализована вплотную к плазматической мембране.
10. Впервые показано, что микрофиламенты актина не являются обязательными участниками формирования вторичных клеточных стенок, а обнаруживаются лишь при сложной пространственной организации этого процесса, например, при образовании локальных утолщений клеточных стенок в трахеальных элементах.
Заключение.
В настоящее время не возникает никаких сомнений относительно важной роли клеточной стенки в растительном организме любого уровня и систематического расположения. Кажущаяся простота в строении клеточной стенки при ее открытии оказалась обманчивой. Формирование клеточной стенки является одним из самых сложным и многоплановых процессов, протекающих в растительной клетке. Для его изучения в нашей работе использовали объекты, физиология, онтогенез, жизненный цикл которых, в большой степени, направлен на формирование клеток с толстой вторичной клеточной стенкой, основным компонентом которой является целлюлоза. Нами использованы методы световой и электронной микроскопии применительно к объектам с толстой клеточной стенкой. Некоторые из них были применены впервые, а многие усовершенствованы.
Проведено комплексное исследование по изучению динамики роста и формирования лубяных волокон. В ходе нашей работы было установлены особенности формирования флоэмных волокон льна-долгунца и их клеточной стенки. На стебле льна долгунца обнаружена точка слома, где стебель меняет свои механические свойства, что связано со сменой стадии развития волокон склеренхимы (ОогБЬкоуа е1 а1., 1996., 8а1шкоу е1 а1., 1998). Показана динамика утолщения клеточной стенки флоэмных волокон.
Продемонстрирована мозаичность в локализации лигнина и других фенольных соединений клеточной стенки. Обнаружена двуслойность вторичной клеточной стенки флоэмных волокон (Сальников и др. 1993). Прослежена ее динамика в ходе онтогенеза всего растения. Методом иммуноцитохимического анализа установлено, что постсинтетическая модификация клеточной стенки связана с метаболизмом нейтрального полисахарида - Р-(1—>4)-0 - галактаном, который специфичен только для флоэмных волокон стебля льна-долгунца (ОогБЬкоуа е1 а!., 2004).
В какой-то степени аналогичная ситуация прослеживается при образовании другого нейтрального полисахарида при формировании вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника — каллозы. Методом электронно-микроскопической иммуноцитохимии установлено, что каллоза распределена ввиде равномерного слоя над плазматической мембраной, который постоянно присутствует в период интенсивного синтеза целлюлозы во вторичной клеточной стенке волосков семян хлопчатника (БаЫкоу е1 а1., 2001).
Впервые охарактеризована ультраструктура волосков семян хлопчатника и описаны ее особенности после фиксации методом замораживания-замещения.
Проведены исследования с применением целого ряда поликлопальных и моноклональных антител к белкам, входящим в состав целлюлозосинтазпого комплекса на плазматической мембране. Итоги исследования по локализации различных компонентов комплекса, синтезирующего целлюлозу, представлены на схеме 2, иллюстрирующей взаиморасположение различных структур с р-1,4- глюкамооая цепочка 1
ЦИННИЯ целлюлозо синтаза меллюподо—
CHHTJU
ХЛОПЧАТНИК
Схема 2. Пространственная локализация цитоплазма-тичесиких органелл и ферментов в клетках циннии (Zinnia etegans L.) и волосках семян хлопчатника (Gossypium hirsutum L.) в процессе формирования целлюлозных микрофибрилл вторичных клеточных стенок. учетом их размеров. Целлюлозосинтаза (1/6 её часть) изображена как интегральный белок плазматической мембраны. Идентификация этого фермента методом замораживания-скалывания (freeze-frac tu re) была произведена сравнительно недавно (Kimura et al., 1999). Его размер и форма предсказаны на основе уже известных молекулярных структур АТФаз (Auer et al., 1988, Zang et al., 1998), которые имеют молекулярную массу и топологию, подобную таковым, известным или предсказанным для целлюлозосинтазы (Delmer, 1999). Примерный размер глобулярной сахарозосинтазы был определен из отношения ее молекулярной массы - 91 кДа у хлопчатника, к целлюлозосинтазе - 110 кДа у хлопчатника ( Kowagoe, Delmer, 1997 ). Щель позади целлюлозосинтазы показывает, что глюкановые цепи должны достигнуть пространства клеточной стенки, что может происходить через пору, образованную трансмембранными спиралями (Delmer, 1999) или путем агрегации множественных белков целлюлозосинтазы в розетки (Emons, 1991).
На схеме 2 показано, что сахарозосинтаза взаимодействует с плазматической мембраной как переферический мембранный белок через определенный гидрофобный участок, а с актином - через определенный актии-связывающий пептид (Winter, Huber, 2000). Так как мы не обладаем определенной информацией о том, как связываются сахарозосинтаза и целлюлозосинтаза, диаграмма показывает их только как прилегающие показывает их только как прилегающие друг к другу; однако известно, что целлюлозосинтаза хлопчатника обладает доменом, который облегчает белок-белковые взаимодействия (Kawagoe, Delmer, 1997). Микротрубочки, в соответствии с нашими данными, располагаются ниже плазматической мембраны, но ближе к кортикальному актину. Знак вопроса, отмеченный на диаграмме, показывает, что другие возможные связи и/или места связывания для других взаимодействующих белков еще не идентифицированы.
Таким образом, в наших исследованиях продемонстрировано существование сложных многокомпонентных комплексов, обеспечивающих синтез целлюлозы. Эти комплексы существенно различаются при синтезе первичной и вторичной клеточной стенки. Наши результаты, совместно с данными об экспрессии разных CesA генов при синтезе первичной и вторичной клеточной стенки (Haigler et al., 2001, Doblin et al., 2002, Schieble, Pauly, 2004 и др.) свидетельствуют, что механизмы синтеза первичной и вторичной клеточной стенки качественно различны. Возможно, именно различие в способе формировать сложные взаимодействия с различными белками лежит в основе необходимости разных полипептидов целлюлозосинтазы для синтеза первичной и вторичной клеточной стенки. Необходимость взаимодействия многих белков может объяснить, почему так трудно воспроизвести синтез целлюлозы in vitro с высокой скоростью и в кристаллической форме (Blanton,
Haigler, 1996). Лабильность целлюлозосинтезирующего комплекса может быть связана с эволюционным преимуществом тесного контроля за синтезом целлюлозы потому, что этот процесс выводит из метаболизма существенную часть углерода (На1§1ег е1 а1., 2001).
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Сальников, Вадим Владимирович, Санкт-Петербург
1. Александров В. Г., Яковлев М. С. Опыт сравнительно-анатомической характеристики различных типов льна Linum usitatissimum L. // Труды но прикладной ботанике, генетике и селекции. -1934. -Сер. 1.I. -№ 4, -С. 49-74.
2. Васильев A.E. Опорные (механические) ткани. В кн.: Ультраструктура растительных тканей. Под ред. Даниловой М.Ф. и Козубова Г.М. -Петразоводск: Карелия. -1980. -С. 226-234.
3. Васильев А.Е. Строение и образование микрофибрилл клеточной оболочки // Ботан. журн. -1984. -Т. 69. -№ 9. -С. 1145-1158.
4. Васильев А.Е. Сравнительная структурно-функциональная характеристика цитоскелета животных и высших растений. -1996 а. -Журнал общей биологии. -Т. 57. -№ 3. -С. 293-325.
5. Васильев А.Е. Цитоскелет генеративной сферы высших растений.-1996 б. -Журнал общей биологии. -Т. 57. -№ 5. -С. 567-591.
6. Васильев А.Е. Цитоскелет водорослей. -1996 в. -Т. 38, -№ 11, -С. 11291144.
7. Гайер Г. Электронная гистохимия. М.: Мир. -1974. -С. 488.
8. Гамалей Ю.В. Цитологические основы дифференциации ксилемы // Л.: Наука.-1972.-С. 142.
9. Гамалей Ю.В. К вопросу о назначении плазмодесм. -Цитология. -1973.-Т. 15. -№ 11. -С. 1427-1429.
10. Горшкова Т.А., Карпита Н.К., Чемикосова С.Б., Кузмина Г.Г., Кожевников A.A., Лозовая В.В. Галактаны динамичный компонент клеточных стенок растений льна // Физиология растений.-1998. -Т. 45. -№ 2. -С. 276-282.
11. Горшкова Т.А., М. В. Агеева М.В., Сальников В.В., Павленчева Н.В., Снегирева A.B., Чернова Т.Е., Чемикосова С.Б. Стадии формирования флоэмных волокон Linum usitatissimum L. I ! Ботан. журн. -2003.- T. 88. -№ 12. -С. 1-11.
12. Горшкова Т.А., Чемикосова С.Б., Агеева М.В. Курчакова Л.Н., Жученко A.A. // Лен. В кн. Частная физиология полевых культур. -2004. -М.: КолосС.-С. 213-266.-24015. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. -М.: Мир. -1986.-Т.1. -С. 96-106.
13. Данилова М.Ф. Структурные основы поглощения веществ корнем // Л.: Наука.-1974. -С. 206.
14. Дженсен У. Ботаническая цитохимия // М.: Мир. -1965. -С. 377.
15. Запрометов М.Н., Ермакова С.А. Мембранные ферменты биосинтеза фенольных соединений //Биохимия. -1985.-Т. 50. -С. 1175.
16. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. -М.: Наука. -1993. -С.272.
17. Коммисарчик Я.Ю., Миронов A.A. Электронная микроскопия клеток и тканей. -Л.: Наука. -1990. -С.144.
18. Кошелева Л.Л. Физиология питания и продуктивность льна-долгунца. -Минск.: Наука и техника. -1980. -С. 200.
19. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении.- М.: Наука. -1976.-С. 646.
20. Лозовая В.В., Горшкова Т.А. Райманов И.Т. Сальников В.В. Хусаинов М.Б., Тарчевский И.А. Влияние освещения на синтез структурных полисахаридов в процессе регенерации клеточной стенки изолированными протопластами //ДАН. -1982. Т. 226. -№ 1. -С.220-232.
21. Лозовая В.В., Сальников В.В., Юмашев Н.В. Формирование клеточных стенок в тканях стебля льна-долгунца // Казань: КНЦ АН СССР. -1990.- С. 171.
22. Лозовая В.В., Тимофеева O.A., Заботина O.A., Сальников В.В. Образование структурных полисахаридов в ходе развития растений льна-долгунца// Физиология растений.- 1992.-Т. 36. -№ 5.-С. 1175-1186.
23. Ордина H.A. Структура лубоволокнистых растений и ее изменение в процессе переработки.-М.: Легкая индустрия.- 1978.- С. 128.
24. Павлинова O.A. Метаболизм сахарозы в свекловичном корне // Физиология растений. -1971. -Т.18. -Вып. 4. -С. 722-730.-24128. Робертис Э., Новицкий В., Саэс Ф. Биология клетки.- М.: Мир. -1967.-С. 473.
25. Сальников В.В., Лозовая В.В., Горшкова Т.А., Райманов И.Т. Участие клеточных органелл в регенерации клеточной стенки протопластами высших растений // Тез. докл. Всесоюзн. совещ. "Биология клеток в культуре". — Цитология. -1983. -Т. XXV. -№ 9. -С. 1093.
26. Сальников В.В. Изменение ультраструктуры протопластов в ходе регенерации клеточной стенки // Автореф. Канд. дисс. -1983. -С. 16.
27. Сальников В.В. Формирование полисахаридной оболочки у клеток низших и высших растений в схемах // Казань.- КНЦ АН СССР, 1990.-С. 168.
28. Сальников В.В., Агеева М.В., Юмашев Н.В., Лозовая В.В. Ультраструктурный анализ флоэмных волокон // Физиология растений. -1993. -Т. 40.-№. 3 -С. 458-464.
29. Сизов И. А. Лен // Москва-Ленинград.: Сельхозгиз. -1955. -С. 256.
30. Справочник льновода. Под ред. М.И.Афонина, Мн.: "Ураджай". -1972. -С.240.
31. Степаненко Б.Н., Морозова А.Б. Синтез целлюлозы из УДФГ-С14 in vivo препаратом фермента из проростков хлопчатника // Докл. АН СССР. -1969. -Т. 187.-С. 1425-1428.
32. Тарчевский И.А, Лозовая В.В., Маркова Р.Н. Влияние концентраций экзогенной глюкозы на интенсивность из нее целлюлозы в волосках семян хлопчатника//Докл. АН СССР. 1980 а.-Т. 255. -№2. -С. 510-512.
33. Тарчевский И.А, Лозовая В.В., Маркова Р.Н., Русева Л.Г. Обеспеченность синтеза хлопковой целлюлозы макроэргическими фосфатами // В кн.: Синтез целлюлозы и его регуляция: Тез. Докл. I Всесоюзн. Конф. Казань: Изд-во Казан. Ун-та. -1980 б. -С. 54.
34. Тутаюк В.Х. Анатомия и морфология растений.- М.: Высшая школа, 1980.-С.317.
35. Трухановец Н. JI., Рубан В. В., Ильченко В. П., Хотылева Л. В. Онтогенетическое развитие клеток волокна у разных генотипов льна-долгунца // Доклады Национальной академии наук Беларуси. -2001. -Т.45. -№ 2. -С. 86-88.
36. Труш М.М. Лен-долгунец//Л 44: Колос. -1976.-С. 352.
37. Хассид У. 3. Целлюлоза и ее производные // М: Наука: 1974. -Т. 2.
38. Эсау К. Анатомия растений // М: Мир. -1969. -С. 564.
39. Ageeva M.V., Petrovska В., ICieft Н., Salnikov V.V., Snegireva A.V., van Dam J.E.G., van Veenendaal W.L.H., Emons A.M.C., Gorshkova T.A., van Lammeren A.A.M. Intrusive growth of flax phloem fibers // 2004 in press.
40. Abe H., Ohtani J., Fukazawa K.A. A scanning electron microscopic study of changes in microtubule distribution secondary wall formation in tracheides. IAWA J. 1994b. -V. 15. -№ 2. -P. 185-189.
41. Aldaba V.C. The structure and development of the cell wall in plant. I. Bast fibers of Boehmeria and Linum // American Journal of Botany. -1927. -V.14. -№ 1. -P. 16-24.
42. Allenspach A. Ultrastructure of early chick embryo tissues after high pressure freezing and freeze substitution // Microsc. Res. Techn. 1993. -V. 24. -P. 369-384.
43. Allen D.M., Northcote D. N. The scales of Chrisochromulina II Protoplasma. -1975. -V. 83. -№ -2. -P. 389-412.
44. Anderson D.B. A microchemical study of the structure and development of flax fibers //Amer. J. of Bot. -1927. -V. 14. -№ 1. -P. 187-211.
45. Auer M., Scarborough G., Scarborough G., Kuhbrandt W. Three-dimensional map of the plasma memebrane H + ATPase in the open conformation // Nature. -1988. -V. 392. -P. 840-843.
46. Bachmann L., Mayer E. Physics of water and ice; implication for cryofixation. 1987. In: Cryotechniques in biological electron microscopy; R.A. Steinbrecht and K. Zierold, ed., Springer-Verlag, New York. -P. 3-12.
47. Barber G.A., Elbeen A.D., Hassid W.Z. The synthesis of cellulose by enzyme systems from higher plants // J. Biol. Chem. -1964. -V. 239. -№ 6. -P. 40564061.
48. Baselski V.S., Robinson M.K., Pifer L.W., Woods D.R. Rapid detection of Pneumocystis carinii in bronchoalveolar lavage sample by using Cellufluor staining // J. Clin. Microbiol.-1990- V.18.-№ i p. 393-394.
49. Basra A., Saha S. In: A.S. Basra (ed.) Cotton fibers: Development biology, Quality improvement, and Textile processing. Food Product Press, Binghamton, NY. -1999.-P. 47-63.
50. Bayliss C., Canny M.J., McCully M.E. Retantion in situ and spectral analysis of fluorescent vacuole components in section of plants tissues // Biotechn. Histochem. -1997. -V.72. -P. 123-128.
51. Benhamou N., Noel S., Grenier J., Asselin A. Microwave energy fixation of plant tissues: an alternative approach that provides exelent preservation of ultrastructure and antigenicity // J. Electron. Microsc. Tech. -1991. -V. 17. -P. 81-94.
52. Benhamou N., Lafontaine N. Ultrastructural and cytochemical characterization of elicitor- induced structural responses in tomato root tissues infected by Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici II Planta. -1995. -V. 197. -№ l.-P. 89-102.
53. Berkley E.E. Cotton-a versatile textile fiber // Textile Research Journal. -1948.-V. XYIII. -№2. -P. 71-88.
54. Blanton R.L., Haigler C.H. Cellulose biogenesis. In: Small-wood M., Knox J.P., Bowles D.J.(Eds.), Membranes: specialized functions in plants. Bios Scientific Pub, Oxford, UK. -1996. -P.57-76.
55. Boudet A.M., Lapierre C., Grima-Pettenati J. Biochemistry and molecular biology of lignification// New Physiol. -1995. -V. 129. -P. 203-236.
56. Bouquin T, Mattsson O, Naested H, Foster R, Mundy J. The Arabidopsis luel mutant defines a katanin p60 ortholog involved in hormonal control of microtubule orientation during cell growth // J. Cell Sci. -2003. -V. 116. -№ 5. -P. 791-801.
57. Bourett T.M., Czymmek K.J., and Howard R.J. Ultrastructure of chloroplast protuberances in rice leaves preserved by high-pressure freezing // Planta. -1999. -V.208.-P. 742-749.
58. Bozzola J.J., Russell L.D. Electron microscopy. 1999. Jones & Bartlett, Sudbuy, MA. -P.670.
59. Brett C., Waldron K. Physiology and biochemistry of plan cell wall // London. -UNWIN HYMAN. -P. 364.-24580. Brown R.M., Jr. Cellulose microfibril assembly and orientation: recent developments // J. Cell Biol. -1985. -V. 2. -P. 13-32.
60. Brown R.M., JR., Montezinos D. Cellulose microfibrils: visualization of biosynthetic and orienting complexes in association with the plasma membrane // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. -1976. -V. 73. -№ 2. -P. 143-247.
61. Brown R.M., Jr., Saxema I.M., Kudlicka K. Cellulose biosynthesis in higher plants // Trends in Plant Science. -1996. -V. 1. -№ 5. -P. 149-155.
62. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. Biochemistry and molecular biology of plants // 2000. -American Society of Plant Physiologist, RocKBille, Md, ISBN 0943088399.
63. Bulone V., Girard V., Fevre M. Separation and partial purification of 1,3-0-glucan and 1,4-p-glucan synthases from Saprolegnia II 1990. -Plant. Physiol. -V. 94. -P. 1748-1755.
64. Burk D.H., Ye Z.H. Alteration of oriented deposition of cellulose microfibrils by mutation of a katanin-like microtubule-severing protein // Plant Cell. -2002. V. 9.-P. 2145-60.
65. Burgess J., Watts J., Fleming E.N., King J.M. Plasmalemma fine structure in isolated tobacco mesophyll protoplasts // Planta. -1973. -V. 110. -№ 4. -P. 291301.
66. Burgess J., Linstead P.J. Ultrastructural studies of the binding of conconavalin A to the plasmalemma of higher plant protoplast // Planta. -1976. -V. 130. 2. -P. 73-79.
67. Burgess J., Linstead P.J., Hornden J.M. The interpretation of scanning electron micrograph//Micron. -1977. -V. 8. -P. 181-186.
68. Burgess J., Linstead P. In-vitro tracheary element formation: structural studies and the effect of tri-iodobensoic acid // Planta. -1984. -V. 160. -P. 481-489.
69. Carpita N., McCann M., Griffing L.R. The plant extracellular matrix: news from the cell's frontier// Plant Cell. -1996. -№. 9. -P. 1451-1463.
70. Carpita N.C., McCann M. The cell wall // Ed: Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. Biochemistry and molecular biology of plants. -2000. -American Society of Plant Physiologist, RocKBille, Md, ISBN 0943088399. -P. 52-108.
71. Church D.L., Galston A.W. 4- coumarate: coenzyme A ligase and isoperoxidase expression in Zinnia mesophyll cell induced to differentiate into tracheary elements // Plant Physiol. -1988. -V.88. P. 679-684.
72. Cotton fiber development and proceccing // Eds: Seagull R., Alspaugh P. -International Textile Centre. Texas Tech University. -2001. -P. 88.
73. Crooks D. M. Histological and regenerative studies on the flax seedlings // Bot. Gaz. -1933. -V. 95. -P. 209-239.
74. Dahl R., Staehelin L.A. High pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. // J. Electron. Microsc. Tech. -1989. -V. 13. -№ 1. -P. 107-117.
75. Darvill A., Mcneil M., Albersheim P., Delmer D.P. The primary cell walls of flowering plants. -In: The biochemistry of plant.-V. I.- Ed. Tolbert, Academic Press, London New York San Francisco. -1980. -P. 2-54.
76. Delmer D.P. Biosynthesis of cellulose // Adv.Carbon. Chem. And Biochem. -1983. -V. 41. -P. 105-153.
77. Delmer D. Cellulose Biosynthesis // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1999. -V. 50. -P. 245-276.
78. Delmer D.P., Alberschem P. The biosynthesis of sucrose and nucleoside diphosphate glucoses in Phaseolus aureus II Plant Physiol. 1970. -V. 45. № 6. -P. 782-786.
79. Delmer D.P., Amor Y. Cellulose biosynthesis // Plant Cell. -1995. -V. 7. -P. 987-1000.
80. Delmer D.P., Beasley C.A., Ordin L. Utilization of nucleoside diphosphate glucoses in developing cotton fibers // Plant Physiol. -1974. -V. 53. -№ 2.-P. 149-153.
81. Delmer D.P., Kulow C. Developmental and biochemical studies on the cotton fiber // Plant Research, MSU- ERDA, Plant Research Lab. Michigan State Univ.-USA. -1976. -P. 29-34.
82. De Mey. The preparation and use of gold probes. In: Immunocytochemistry (2nd edn) (ed. J.M. Polak and S. Van noorden) John Wright, Brisrol. -1983. -P.71-88.
83. Diaz M., Sancher Y., Bennet T., Sun S.R., Godoy C., Tamanol F., Duran A., Perez P. The Schizosaccharomyces pombe cw2+ gene codes for P-subunit of ageranylgeranyltransferase type I required for P-glucan synthesis // EMBO J. 1993.-V. 12.-P. 5245-5254.
84. Downward J. Rac and Rho in tune // Nature. -1992.-V. 359. -P. 273274.
85. Driouich A., Faye L., Staehelin A. The plant Golgi apparatus: a factory for complex polysaccharides and glycoproteins // Trends Biochem Sci. -1993. -V. 18 -P.210-214.
86. De Pétris S. Immunoelectron microscopy and immunofluorescence in membrane biology // In: Methods in membrane biology, (ed. E.D. Korn). Plenum press, New York. -1978. -Vol. 9. -P.l-201.
87. Driouich A., Faye L., Staehelin L.A. The plant Golgi. apparatus: a factory for complex polysaccharides and glycoproteins // Trends Biochem. Sci. -1993.-№ 6.-P. 210-214.
88. Durso N.A., Cyr R.J. A calmodulin-sensetive interaction between microtubules and higher plant homolog of elongation factor-la // Plant Cell. -1994. -V. 6.-P. 893-905.
89. Echlin P. Low-temperature microscopy and analysis. -1992. Plenum Publishing Corp., New York. Electron microscopic immunocytochemistry. -1992. Ed. by J.M Polak, J.V. Prestley, Oxford New York Tokyo. -P. 267.
90. Electron microscopy methods and protocol. -1999-. Ed. by M.A. nasser Hajibagheri, Humana Press. Totawa, New Jersey. -P. 283.
91. Emons A.M.S. Microtubules do not control microfibrill orientation in a hélicoïdal cell wall // Protoplasma. -1982. -V. 113. -№ 1. -P. 85-87.
92. Emons A.M.S. Plasma-membrane rosettes in root hairs of Equisetum hyemale//Planta. -1985. -V. 163. -№3. -P. 350-359.
93. Esau K. J. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. II. The procambium //Amer. J. Bot. -1942. -V. 29. -P. 738-747.
94. Esau K. J. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. II. The first phloem and xylem // Amer. J. Bot. -1943a. -V. 30. -P. 248-255.
95. Esau K. J. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. III. The origin of the bast fibers // Amer. J. Bot. -1943b. -V. 30. -P. 579-576.
96. Esau K. Plant Anatomy. -1953. -New York: Wiley. -P. 735.
97. Esau K. J. Fibers. In: Anatomy of Seed Plant. John Wiley and Sons. -1977.-P. 74-77.
98. Evert R.E., Miero^va R.J. The cell wall-plasmalemma interface in sieve tubules of barley//Planta. -1985. -V. 163. -№ 1. -P. 133-140.
99. Fahn A. Plant Anatomy // Pergamon Press. Oxford. -1990. -P. 587.
100. Falconer M. M., Seagull R.W. Immunofluorescent and Calcofluor white staining of developing tracheary elements in Zinnia elegans suspension culture // Protoplasma. -1985. -V.125. -№ 2. -P.190-198.
101. Farkas V, Maclachlan G. Fucosylation of exogenous xyloglucans by pea microsomal membranes //Arch. Biochem. Biophys. -1988. -V. 264. -№> 1. -P. 48-53.
102. Faulk W.P., Taylor G.M. An immunocolloidal method for the electron microscope // Immunocytochemistry. -1971. -V. 8. -P. 1081-1083.
103. Feldherr C.M., Marshall J.M. The use of colloidal gold for studies of intracellular exchange in amoeba Chaos chaos II J. Cell Biol. -1962. -V. 12. -№ 3. -P. 640-645.
104. Fowke L.C., Gamborg O.L. Application of protoplast to the study of plant cell//Int. Rev. Cytol. -1980. -V. -68. -№ l.-P. 8-51.
105. Frost A.O., Roberts A.W. Cortical actin filaments fragments and aggregate to form chloroplast-associated and free F-actin rings in mechanically isolated Zinnia mesophyll cells // Protoplasma. -1996. -V. 194. -№ 1. -P. 195-207.
106. Fry S.C. Primary cell wall metabolism // Oxford Surv. Plant mol. Cell Biol., e.d. B.J. Miflin. Oxford University Press. -1985. -V. 2. -P. 1-42.
107. Fry S.C. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis // Ed. M.Wilkins. John Wiley and Sons. New York. -1988. -P. 333.
108. Fry S.C., Smith R.C., Renwick K.F., Martin D.J., Hodge S.K., Matthews K.J. Xyloglucan endotransglycosylase, a new wall-loosening enzyme activity from plants//Biochem. J.-1992.-V. 282. -P. 821-828.
109. Fujiwara K., Linch Q.W. The use of tannic acid in microtubule research // Meth. Cell Biol. -1982. -V. 24. -P. 217-33.
110. Fukuda H. A change in tubulin synthesis in the process of tracheary elements differentiation and cell division of isolated Zinnia mesophyll cells // Plant Cell Physiol. -1987. -V. 28. -№ 3. -P. 517-528.
111. Fukuda H. Tracheary elements formation as a model system of cell differentiation //International Review of Cytology. -1992. -V. 136. -P. 289-332.
112. Fukuda H. Redifferentiation of single mesophyll cells into tracheary elements // Intern. J. Plant Sci. -1994 -V. 155. -№ 3. -P. 262-271.
113. Fukuda H. Tracheary elements differentiation // The Plant Cell. -1997. -V.9.-P. 1147-1156.
114. Fukuda H. Programmed cell death of tracheary elements as a paradigm in plants // Plant Mol. Biol. -2000. -V. 44. -N. 3. -P. 245-253.
115. Geigenberger P, Stitt M. Diurnal changes in sucrose, nucleotides, starch synthesis, and AGPS transcript in growing potato tubers that are suppressed by decreased expression of sucrose phosphate synthase // The Plant J. -1993. -V. 23. -P. 795-806.
116. Geiger J.P., Rio B., Nandris D., Nicole M. Laccase of Rigicloporus lignosus and Phellinus noxius L. I. Purification and some physicochemical properties // Appl. Biochem. Biotech.-1991.-V. 12.-№ l.-P. 121-133.
117. Geitmann A., Emons A.M.C. The cytoskeleton in plant and fungal cell tip growth//J. Microsc.-2000. -V. 198. -Pt3. -P. 218-245.
118. Ghosh P., Datta C. Scanning electron microscopic studies on some chemically modified bast fibres. Chapman and Hall Ltd. -1990. -P. 4415-4422.
119. Gibbon B.C., Kovar D.R., Staiger C J. Latrunculum B has different effects on pollengermination and tube groth // Plant Cell. -1999. -V. 11. -P. 23492364.
120. Giberson R.T. Demaree R.S. Jr. Microwave fixation: Undestanding the variables to achieve rapid reproducible results // Microsc. Res. Tech. -1995. —32. -P. 246-254.
121. Giddings T.H., Staehelin L.A. Spatial relationship between microtubules and plasma-membrane rosettes during deposition primary wall microfibrils in Closterium sp. // Planta. -1988. -V. 173. -№ 1. -P. 22-30.
122. Giddings T.H., Staehelin L.A. Microtubule-mediated control of microfibril deposition: re-examination of the hypothesis. In The Cytochemical Basisof Plant Growth and Development, C.W., Lloyd, ed (London: Academic Press). -P. 85-99, 1990.
123. Gilkey J.C., Staehelin L.A. Advances in ultrarapid freezing for preservation of celluar ultrastructure // J. Electr. Microsc. Tech. -1986. -V. 3. -P. 177210.
124. Gorshkova T.A., Wyatt S.E., Salnikov V.V., Gibeaut D.M., Ibragimov M.R., Lozovaya V.V., Carpita n.C. Cell wall polysaccharides of developing flax plant // Plant Physiol. -1996. -V. 110. -№ 3. -P. 721-729.
125. Gorshkova T.A., Chemikosova S.B., Lozovaya V.V., Carpita T.C. Turnover of galactans and other cell wall polysaccharides during development of flax plant // Plant Physiol. -1997. -V. 114. -P. 723-729.
126. Gorshkova T.A., Salnikov V.V., Chemikosova S.B., Ageeva M.V., Pavlencheva N.V., van Dam J.E.G. Snap point: a transition point in Linum usitatis-simun bast fiber development // Ind. Crops and Prod. -2003. -№ 18. -P. 213-221.
127. Gorshkova T.A., Chemikosova S.B., Salnikov V.V., Pavlencheva N.V., Stolle-Smits T., van Dam J.E.G. Occurrence of cell-specific galactan is coinciding with bast fibre developmentall transition in flax // Ind. Crops and Prod. -2004. -№ 19.-P. 217-224.
128. Haigler C.H., Rao N.R., Roberts E.M. Huang J.Y., Upchurh D.P., Trolinder N.L. Cultured cotton ovules as models for cotton fiber development under low temperatures // Plant Physiol. -1991. V. 95. -P. 88-96.
129. Harris N., Oparha K.I., Walter-Smith D.I. Plasma-tubulus: an alternative to transfer cells // Planta. -1992. -V. 156. -P. 461-465.
130. Haugland R.P. Fluorescein substitutes for microscopy and imaging. 1990. In: Optical microscopy for biology. Eds; Herman B. and Jacobson K., Wiley-Liss, New York,-P. 143-157.
131. Hayashi T. Xyloglucan in the primary cell wall // Annu. Rev. Plant Physiol/Plant Mol. Biol. -1989. -V. 40. -№ i.p. 139-168.
132. Hayat M.A. Colloidal gold: principles, methods and applications. 1989. Vols 1 and 2. Academic Press, Orlando, Florida. -P. 536.
133. Heath J.B. A unified hypothesis for the role of membrane bound enzyme complexes and microtubules in plant cell wall synthesis // J. Theor. Biol. -1974. -V. 48. -P. 445-449.
134. Hereward F.V. Rough membranes in Schizosaccharomyces pombe protoplasts // Exp. Cell Res. 1974. -V. 25. -P 309-362.
135. Herth W. Effect of 2,6-DCB on plasma membrane rosettes of wheat root cells //Naturwissenschaften. -1987. -V. 74. -P. 556-557.
136. Herth W., Meyer Y. Ultrastructural and chemical analysis of the wall fibrills synthsized by tobacco mesophyll protoplasts // Biol. Cellulaire. -1977. -V. 30. -P. 33-40.
137. Herth W., Weber G. Occurrence of the putative celulose synthesizing "rosettes" in the plasma membrane of Glicine max suspension culture cells // Naturwissenschaften. -1984. -V. 71. -P. 153-154.
138. Heumann H.-G. Microwave-stimulated glutaraldehyde and osmium tetroxide fixation of plant tissues: ultrastructural preservation in seconds // Histochem. -1992. -V. 97. № 1. -P. 241-347.
139. His I., Driouich A., Jauneau A. Distribution of the cell wall matrix polysaccharides in the epidermis of flax hypocotyl seedling: Calcium induced-acidification of pectins // Plant Physiol. Biochem. -1997. -V. 35. -№ 8. -P. 631-644.
140. Hock C.W. Microscopic structure of flax and related bast fibres // Journal of Reasearch of the national Bureau of Standarts. -1942. -V. 29. -P. 41-50.
141. Hodges G.M., Southgate J., Toulson E.C. Colloidal gold a powerful tool in SEM immunocytochemistry: an overview of bioaplications // Scanning Microsc. -1987. -V. 1. -P. 301-318.
142. Hodges G.M., Carr K.E. Colloidal gold immunocytochemistry using SEM // Microscopy and Analysis. -1990. -V. 18. -P. 29-32.
143. Hong Z., Delauney A.J., Verma D.P.S. A cell plate specific callose synthase and its interaction with phragmoplastin and UDP-glucose transferase // Plant Cell.-2001.-V. 13.-P. 755-768.
144. Hoson T., Nevins D. B-D glucan antibodies inhibit auxin induced cell elongation and changes in the cell wall of Zea coleoptile segments // Plant Physiol. -1989. V. 90. -P.1353-1358.
145. Immunocytochemical methods and protocols. 1999. Ed. By L.C. Javois, Humana Press, Totawa, New Jersey. -P. 465.
146. Inomata F., Takebe K., Saiki H. Cell wall formation of conifer traheid as revealed by rapid-freeze and substitution method // J. Electron Microsc. -1992. -V. 41.-P. 369-374.
147. Itoh T., Kimura S. Immunogold labelling of terminal cellulose-synthezing complexes. 9th International Cell Wall Meeting, 2-7 September 2001, Toulouse, France. -P. 24.
148. Jones L., Seymour G.B., Knox J.P. Localization of pcctic galactan in tomato cell wall using a monoclonal antibody specific to (l-4)-p-D-galactan. // Protoplasma. -1998. -V. 203. -№ 1. -P. 26-34.
149. Kandasamy M., Kappler U. Plasmatubulus on the pollen tubes of Nicotiana sylvestris//Planta. -1988. -V. 173. -№ 1. -P. 35-41.
150. Kasten F.H. The origin of modern fluorescence microscopy and fluorescence probes. 1989. In: Cell structure and function by microspectrofluorometry. Eds. Kohen E. and Haugland J.G., Academic, San Diego. -P. 3-50.
151. Kawagoe Y., Delmer D.P. Pathways and genes involved in cellulose biosynthesis // Genetic Engineering. -1997. -V. 19. -P. 295-303.
152. Kerr T. The outer wall of the cotton fiber and its influence on fiber properties // Text. Res. J. -1946. -June. -P. 249-254.
153. Kiermayer O., Sleytr U.B. Hexagonally ordered "rosettes" of particles in the plasma membrane of Micrasterias denticulata Breb. and their significance for microfibril formation and orientation 11 Protoplasma. -1979. -V. 101. -№ 1. -P. 133138.
154. Kimura S., Laosinchai W., Itoh T., Cui X., Linder R., Brown R.M. Jr. Immunogold labelling of rosette terminal cellulose-synthe^azing complexes in the vascular plant Vigna angularis II The Plant Cell. -1999. -V. 11. -P. 2075-2085.
155. King S.P., Lunn J.E., Furbunk R.T. Carbohydrate content and enzymes metabolism in developing Canola siliques II Plant. Physiol. -1997. -V. 114. -№ 1. -P. 153-160.
156. Knox J.P., Linstead P.J., King J., Cooper C., Roberts K. Pectin esterification is spatially regulated both within cell walls and between developing tissues of root apices // Planta. -1990. -181. -№ 2. -P. 512-521.
157. Kleczwkowski L.A. Glucose activation and metabolism through UDP-glucose pyrophosphorylase in plants // Phytochemistry. -1994. -V. 37. -P. 15071515.
158. Kobyashi H., Fukuda H., Schibaoka H. Reorganization of actin filaments assotiated with the differentiation of tracheary elements in Zinnia mesophyl cells // Protoplasma.-1987.-V. 138. № 1.-P.69-71.
159. Kobyashi H., Fukuda H., Schibaoka H. Interrelation between the spatial disposition off actin filaments and microtubules during the differentiation of tracheary elements in cultured Zinnia // Protoplasma. -1988. -V. 143. № 1. -P. 2937.
160. Kudlicka K., Wardrop A., Hoh T., Brown K.H. Further evidence from sectioned material in support of the existence of a linear terminal complex in cellulose synthesis//Protoplasma. -1987. -V. 136. -№ 1. -P. 96-103.
161. Kuga S., Brown R.M. Jr. Physical Structure of Cellulose Microfibrils: Implications for Biogenesis. In CHHAPJ Weimer, ed, Biosynthesis and Biodégradation of Cellulose. Marcel Dekker, Inc., New York. -1991. -P. 125-142.
162. Kundu B.C. The anatomy of two Indian fibre plants, Cannabis and Corehorus with special reference to the fibre distrbution and development // Indian Bot. Soc. Jour. -1942. -V. 21. -№ 1. -P. 93-108.
163. Kuriyama H., Fukuda H. Regulation of traheary elment differentiation. J. Plant Growth Regul. -2000. -V 20. -№. 1. -P. 35-51.
164. Lammeren A., Ageeva M., Kieft H., Lhissier F., Vos J., Gorshkova T., Emons A. Configuration of the microtubules cytoskeleton in elongating fibers of flax (Limim usitatissimum L.) // Cell Biol. Intern. -2003. -V. 27. -P. 225.
165. Lancelle S.A., Callaham D.A., Helper P.K. A method for rapid freeze-fixation of plant cells //Protoplasma. -1986. -V. 131. -№ l.-P. 153-165.
166. Lessard J.L.Two monoclonal antibodies to actin one muscle-selective and one generally reactive // Cell Motility and the Cytoskleton. -1988. -V. 10. -P. 349362.
167. Lewis, N.G., Yamamoto, E. Lignin: Occurrence, biogenesis and biodégradation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1990. -V. -41. -P. 455496.
168. Levy S., Staehelin L.A. Synthesis, assembly and function of plant cell wall macromolecules // Curr. Opin. Cell Biol. -1992. -№ 5. -P. 856-62.
169. Lloyd C.W. The plant cy to skeleton: impact of fluorescent microscopy // Ann. Rev. Plant Physiol. -1987. -V. 38. -№ 1. -P. 119-139.
170. Lloyd C.W. Probing the plant cytoskeleton // Nature. -1991. -V. 350. -№. 6315.-P. 189-190.
171. Lloyd C.W., Clayton L., Dawson P.J., Doonan J.H., Hulme J.S., Roberts I.n., Wells B. The cytoskeleton underlying side and cross walls in plants: molecules and macromolecules assemblies // J.Cell. Sci. -1985. -V. 78. -Suppl. № 2. -P. 143155.
172. Lloyd C.W., Pearce K.J., Rawlins D.J., Ridge R.W., Shaw H.J. Endoplasmic microtubules connect the advancing nucleus to the tip of legume root hairs, but F-actin is involved in basipetal migration // Cell Motil. Cytoskel. -1987. -V. 8. -№ 2. -P. 27-36.
173. Login G.R., Dvorak A.M. Microwave fixation provides excelent preservation of tissues, cells, and antigens for light and electron microscopy // Histochem. J. -1988. -V. 20. -P. 373-387.
174. Lonsdale J.E., McDonald K.L., Jones R.L. High pressure freezing and substitution reveal new aspect of fine structure and maintain protein antigenity in barley aleurone cells // The Plant J. -1999. -V. 17. -P. 221-229.
175. Lynch M.A., Staehelin L.A. Domain-specific and cell-type specific localization of to types of cell wall matrix polysaccharides in the clover root tip // J. Cell Biol. -1992. -V. 118. -P. 467-480.
176. Lynch M.A., Staehelin L.A. Immunocytochemical loclization of cell wall polysaccharides in root tip of Avena sativa // Protoplasma. —1995. -V. 188. -№ 1. -P. 115-127.
177. Matyus L. Fluorescence resonance energy transfer measurements on cell surfaces. A spectroscopic tool for determing protein interaction // J. Photochem. Photobiol. -1992. -V. 12. -P. 323-337.
178. Martin T., Smith A.M. Starch biosynthesis // Plant Cell. -1995. -V. 7. -P. 971-985.
179. McCann M., Roberts K. Mosaics and murals // J. Cell Sci. -1990. -V. 96. -P.323-334.
180. McCann M.C., Stacey N.J., Wilson R., Roberts K. Oirentation of cthe macromolecules in the walls of elongating carrot cells. J Cell Sci. -1993. -V. 106. -(Pt. 4): 1347-56.
181. McDonald K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabelling // Methods in Molecular Biology. Electron Microscopy Methods and Protocols. -1999. -V. 117. -P. 77-97.
182. McDougall G.J. Isolation and partial characterization of the non-cellulosic polysaccharides of flax fibre // Carbohydr.Res. -1993. -V. 241. -P. 227-236.
183. McDougall G.J., Morrison I.M., Stewart D., Weyers J.D.B., Hillman J.R. Plant fibres: botany, chemistry and processing for industrial use // J. Sci. Food Agric. 1993.-V. 62.-P. 1-20.
184. Metcalfe C.R., Chalk L. Anatomy of the cotyledones // Oxford, Charendon press. -1950 -V.2.
185. Mizuhira V., Hasegawa H., Notoya M. Fixation and imaging of biological elements: heavy metals, diffusible substance, iones, peptides and lipids // Prog. Histochem. Cytochem. -2000. -V. 35. -P. 67-183.
186. Mogami N., Nakamura S., Nakamura N. Immunolocalization of the cell wall components in Pinus densiflora pollen // Protoplasma. -1999. -V. 206. № 1. -P. 1-10.
187. Mol P.C., Park H.-M., Mullins J.T., Cabib E. AGTP-binding proteine regulates the activity of (1—»3)-(3-glucan synthase, an enzyme directly involved in yeast cell wall morphogenesis // J. Biol. Chem. -1994. -V. 269. -P. 31267-31274.
188. Mollenhauer H.H. Simple apparatus for plunge-freezing biological material: some design consideration // Micros. Res. Tech. -1999. -V. 44. -P. 195200.
189. Montezinos O., Brown R.M., Surface architecture of plant cell: biogenesis of cell wall with spatial emphasis on the role of the plasma membrane in cellulose biosinthesis // J. Sapramol. -1976. -V.5. -P. 277-290.
190. Montezinos O., Brown R.M. Cell wall biogenesis in Oocystis: experimental alteration of microfibril assembly and orientation // Cytobios. -1978. V. 23.-№90.-P. 119-139.
191. Morrow D.L. Lucas W.J. (l-3)-p-glucan synthase from sugar beer. I. Isolation and solubilization // Plant Physiol. -1986. -V. 81. -№ 1. -P. 171-176.
192. Morvan O., Quentin M., Jauneau A., Mareck A., Morvan C. Immunogold localization of pectin methylesterases in the cortical tissues of flax hypocotyl // Protoplasma. -1998. -V. 202.-№ l.-P. 175-184.
193. Morvan C., Andeme-Onzighi C., Girault R., Himmelsbach D.S., Driouich A., Akin D.E. Building flax fibers: more than one brick in the walls // Plant Physiol. Biochem. -2003. -V. 41. -P. 935-944.
194. Muhlethaler K. Ultrastructure and formation of plant cell walls // Annu. Rev. Plant. Physiol. -1967. -V. 18. -№ 1 -P. 1-24.
195. Muhlethaler K. The contribution of freeze-etching to membrane research //Acta Histochem Suppl.-1981.-V. 23. -№ l.-P. 117-122.
196. Mulber B.M., Emons A.M.C. A dynamical model for plant cell wall architecture formation // J. Math. Biol. -2001. -V. 42. -P. 261-289.
197. Mueller S.C., Brown R.M., Jr. Evidence for an intramembrane component associated with a cellulose microfibril synthsizing complex in higher plants // J. Cell Biol.-1980. -V. 84.-P. 315-325.
198. Nakashima J., Mizuno T., Takeda K., Fujita M., Saiki H. Direct visualization of lignifying secondary wall thickening in Zinnia elegans cells in culture // Plant Cell Physiol. -1997. -V. 38. -№ 7. -P. 818-827.
199. Nasland P., Vuong R., Chanzy H. Diffraction contrast transmission electron microscopy on flax fiber ultrathin cross section // Text. Res. J. -1988. -V. 58. -№. 7. -P. 414-417.
200. Nebenfuhr A., Staehelin L.A. Mobile factories: Golgi dynamics in plant cells //Trends Plants Sci. -2001. -V. 6. -№ 4. -p. 160-167.
201. Newcomb E.H. Plant microtubules // Annu. Rev. Plant Physiol. -1969. -V. 20. -№. 1.-P. 253-288.
202. Newman G.R., Hobot J.A. Resin microscopy and on-section immuno-cytochemistry // Springer-Verlag. New York.- 1993 -P. 221.
203. Nguyen-Quoc B., Krivitzky M., Huber S.C., Lecharny A. Sucrose synthase in developing maize leaves // Plant Physiol. -1990. -V. 94. -P. 516-523.
204. Nicolas T.N., Bassot J.M. Freeze substitution after fast-freeze fixation in preparation for immunocytochemistry // Microsc. Res. Techn. -1993. -V. 24. -P. 474-478.
205. Northcote D.H. Fine structure of cytoplasm in relation to synthesis and secretion in plant cells // Proc. R. Soc. -1969. -V. 173. -P. 21-30.
206. Notle K.D., Hendrix D.L., Radin J.W., Koch K.E. Sucrose synthase localization during initiation of seed development and trichome differentiation in cotton ovules // 1995. -Plant. Physiol. -V. 109. -P. 1285-1293.
207. Paiziev A.A., Krakhmalev V.A. Self-organization phenomena during developing of cotton fibers // Curr. Opin. Solid State Mat Sci. -2004. -V. 8. -P. 127133.
208. Pear J., Kawagoe Y., Schreckengost W., Delmer D.p., Stalker D. Higher plants contain homologs of the bacterial CelA genes encoding the catalic subunits ofthe cellulose synthase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. -V. 93. P. 1263712642.
209. Pease D.C. Histological techniques for electron microscopy. 1960. Acad. Press. New York London. -P. 164.
210. Preston R.D. Structural and mechanical aspects of plant cell walls with particular reference to synthesis and growth // 1964. -In: The role of wood in forest trees. Eds.: Zimermann N.N. New York, Academic Press. -P. 169-188.
211. Quader H., Deichgraber G., Schnepf E. The cytoskeleton of Cobaea seed hairs//Planta.-1986. -V. 168.-№ 1.-P. 1-10.
212. Quader H., Herth W., Ryser U., Schnepf E. Cytoskeletal elements in cotton seeds hair development in vitro: their possible regulatory role in cell wall organization // Protoplasma. -1987. -V. 137. -№ 1. .p. 56-62.
213. Quader H., Scnepf E. The cytoskeleton of plant cell: structural and functional aspects // Ber. Dtsch. Bot. Ges. -1988. -V. 99. -№ 3/4. -P. 297-306.
214. Quader H., Wagenbreth I, Robinson DG^Structure, synthesis and orientation of microfibrils. V. On the recovery of Oocystis solitaria from microtubule inhibitor treatment//Cytobiologie. -1978.-V. 18.№ l.-P. 39-51.
215. Ramsey J.C., Berlin J.D. Ultrastructural aspect of early stages in cotton fiber elongation // Am. J. Bot. -1976. -V. 63. -P. 868-876.
216. Reiss H-D., Schnepf E., Herth W. The plasma memebrane of the Funaria caulonema tip cell: morphology and distribution of particle rosettes, and the kinetics of cellulose synthesis // Planta. -1984. -V. 160. -P. 428-435.
217. Reymond O.L., Pickett-Heaps J.D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cell by light microscopy // Journal of Microscopy. -1983. -V. 130. P. 79-84.
218. Robenek H. Relationship between the endoplasmic reticulum and plasma membrane of protoplast of Skimmia japónica Thunb. during cell wall regeneration // Biol. ZBL -1980 b. -V. 99. -N. 1. -P. 13-23.
219. Robenek H., Peveling E. Ultrastructure of the cell wall regeneration of isolated protoplasts of Skimmia japónica Thunb // Planta. -1977. -V. 136. -№ 2. -P. 135-145.
220. Roberts A.W., Haigler C.H. Rise in chlorotetracycline fluorescence accompanies tracheary elements differentiation in suspension cultures of Zinnia II Protoplasma. -1989. V. 152. -№ 1. -P. 37-45.
221. Roberts A.W., Haigler C.H. Tracheary-elements differentiation in suspension-cultured cells of Zinnia requires uptake of extracellular Ca 2+ // Planta. -1990. -V. 180.-P. 502-509.
222. Roberts A.W., Haigler C.H. Methylxanthines reversibly inhibit tracheary-elements differentiation in suspension cultures of Zinnia elegans L // Planta. -1992. -V. 186. -P. 586-592.
223. Roberts A.W., Koonce T.L., Haigler C.H. A simplified medium for in vivo tracheary element differentiation in mesophyll suspension cultures from Zinnia elegans L. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1992. -V. 28. -P. 27-35.
224. Roberts A.W., Donovan S.G., Haigler C.H. A secreted factor induces cell expansion and formation of metaxylem-like tracheary elements in xylogenic suspension cultures of Zinnia II Plant Physiol. -1997. -V. 115. -P. 683-692.
225. Roberts A., Uhnak K. Tip growth in xylogenic suspension cultures of Zinnia elegans L.: implications for the relationship between cell shape and secondary-cell-wall pattern in tracheary elements // Protoplasma. -1998. -V. 204. -№ 103-113.
226. Roelofsen P.A., Houwink A.L. Architecture and growth of the primary cell wall in some plant hairs and the Phycomyces sporangiospores // Acta Bot. Neerl. -1953.-V. 2.-P. 218.
227. Roland, J. C., Vian B. The wall of the growing plant cell: Its three-dimensional organization // Int. Rev. Cytology. -1979. -V. 61. -P. 129-166.
228. Roland J.C., Reis D., Vian B. The cholesteric type of cell wall: nucleation of defects in structural order and its relation to spherical shape // Acta Bot. Neerl. -1993.-V. 42.-№2.-P. 91-98.
229. Roland J.-C., Mosiniak M., Roland D., Dynamique du positionnement de la cellulose dans les parois des fibres textiles du lin {Linum usitatissimum) // Acta Bot. Gallica. -1995. -V. 142. -P. 463-484.
230. Ross P., Mayer R., Benziman M. Cellulose biosynthesis and function in bacteria // Microbiol. Rev. // 1991. -V. -55. -P. 35-58.
231. Roth J. The colloidal gold marker system for light and electron microscopic cytochemistry. -1983. In: Immunocytochemistry, Vol. 2 (ed. G.R Bullock and P. Petrusz), Academic Press, London. -P. 217-284.
232. Ruel K., Joseleau J.P. Use of enzyme-gold complexes for the ultrastructural localization of hemicelluloses in the plant cell wall // Histochemistry. — 1984.-V. 81.-P. 573-580.
233. Ruel K, Joseleau JP. Use of an alpha-D-glucosidase for the specific cytochemical identification of lateral alpha-D-xylosyl end groups in plant xyloglucans // Histochemistry. -1990. -V. 93. -№ 5. -P. 469-71.
234. Ruel K., Faix O., Joseleau J.P. New immunogold probes for studing the distribution of the different lignin types during plant cell wall biogenesis // J. Tracc and Microprobes Techniques. -1994. -V. 12. -P. 247-265.
235. Ryser U. Cotton fiber initiation and histodifferentiation. In: Cotton Fibers Developmental biology, quality improvement, and textile proceccing. 2000, Ed. Basra A.-P. 1-45.
236. Salnikov V. V., van Dam J. E. G., Lozovaya V. V. Microscopy of cell wall formation in flax bast fibre // Natural Fibres. -1998. -V. 2. -P. 187-194.
237. Salnikov V.V., Grimson M.J., Delmer D.P., Haigler C.H. Sucrose synthase localazes to cellulose synthesis sites in tracheary elements // Phytochemistry. -2001. -V. 57. -P. 823-833.
238. Salnikov V., Grimson M., Seagull R., Haigler C. The localisation of Cellulose-synthesi-assotiated sucrose synthase is changeable in freeze substitution, secondary wall stage, cotton fibers // Protoplasma. -2003. -V. 221. № 3-4. -P. 175184.
239. Schlupmann H., Bacic A., Read S.M. Uridine diphosphate glucose metabolism and callóse synthesis in cultured pollen tibes of Nicotiana alata Link et Otto // Plant Physiol. -1994. -V. 105. -P. 659-670.
240. Scheible W.R., Eshed R., Rischmond T., Delmer D., Somerville C. Modifications of cellulose synthase confer resístanse to isoxaben and thazolidinone herbicides in Arabidopsis Ixrl mutant // Proc. Natl. Acad. Sci. -2001. -V. 98. -P. 10079-10084.
241. Scheible W.R., Pauly M. Glycotrasferases and cell wall biosynthesis: novel players and insights // Curr. Opin. Plant Biol. -2004. -V. 7. P. 285-295.
242. Schoch-Bodmer H., Huber P. Das Spitzewachstum der Fasern bei Linum perenne L // Experientia. -1945. -Vol. 1/9. -P. 327-328.
243. Seagull R.W. The plant cytoskeleton // CRC Rev.Plant Sci. -1989a. -V. 8. -P. 131-167.
244. Seagul R.W. The role of the cytoskeleton during oriented microfibril deposition. II. Microfibril deposition in cell with disrupted cytoskeletons. In: Cellulose and Wood: Chemistry and Technology, Schuerch, C., (ed). Wiley. -1989 b. -№ V.-P. 811-825.
245. Seagull R.W. Tip growth and transition to secondary wall synthesis in developing cotton hairs. In: Tip Growth in Plant and Fungial Cells, Heath, I.B., (ed). Academic, San Diego, CA. -1990a. -P. 261-284.
246. Seagull R.W. The effects of microtubules and microfilament disrupting agent on cytoskeletal arrays and wall deposition in developing cotton fibers // Protoplasma-1990b.-V. 159. -№ 1.-P. 44-59.
247. Seagull R.W. Role of the cytoskeletal elements in organized wall microfibrill deposition. In: Biosynthesis and Biodégradation of cellulose, Haigler, C.H. and Weimer, P.J, (eds). Marccl Dekker, New York. -1991. -P. 143-163.
248. Seagull R.W. A quantitative electron microscopic study of changes in microtubule arrays and wall microfibril orientftion during in vitro cotton fiber development//J. Cell Sci. -1992a.-V. 101.-P. 561-577.
249. Seagull R.W. Commentary: The gormonal regulation of cell elongationthough changes in microtubule orientation // Int. J. Plantt Sci. -1992b. -V. 153. -P. iii-iv.
250. Seagull R.W., Heath I. B. The organization of cortical microtubule arrays in the radish root hair // Protoplasma. -1980. -V. 103. -№ 1. -P. 205-229.
251. Silva M.T., Macedo P.M. Improved Tbieiy staining for the ultrastructural detection of polysaccharides // J.Submicrosc. Cytol. -1987. -V. 19. -№ 4.-P. 677-681.
252. Singer S.J. Preparation of an electron-dense antibody conjugate // Nature.-1959.-V. 183.-P. 1523-1524.
253. Smallwood M., Yates E.A., Willats W.G.T., Martin H., Knox J.P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabinogalactan-proteins in rice and carrot // Planta. -1996. -V. 198. -№ 1. -P.452-459.
254. Staehelin L.A., Moore I. The plant Golgi apparatus: structure, functional organization and trafficking mechanisms //Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mo.l Biol. -1995.-V.46. P. 261-288.
255. Smallwood M., Yates E., Willats W.G.T., Martin H., Knox P. Immunochemical comparison of membrane-associated and secreted arabimogalactan-proteines in rice and carrot // Planta -1996. -V. 198. -№ l.-P. 452-459.
256. Smith R.C., Fry S.C. Endotransglycosylation of xyloglucans in plant cell suspension cultures //Biochem. J. -1991. -V. 279. P. 529-535.
257. Stewart A., Deacon J.W. Vital fluorochromes as tracers for fungal growth studies // Biotech. Histochem. -1995. -V. 70. -№ 2. -P57-65.-269331. Strivastava L.M. Histochemical studies on lignin // 1966. -Tappi 49. -P. 173-183.
258. Suplin J.K., Robinson N.M., Wilhelmus K.R., Osato M.S. Improved detection of oculomycoses using induced fluorescence with cellufluor // Ophthahmology. -1986. -V. 93. -№ 3. -P. 416-417.
259. Sung S.S., Sheih W.J., Geiger D.R., Black C.C. Growth, sucrose synthase, and invertase activities of developing Phaseolus vulgaris L. fruits // Plant Cell Environ. -1994. -V. 17. P. 419-426.
260. Takabe K., Fukazawa K., Harada H. Deposition of cell wall components in conifer tracheides // In: Plant cell polymers: biogenesis and biodégradation. -1995. -ASC Symp. Ser. -P. 47-66.
261. Tammes T. Der Flachsstengel. Eine statistisch-anatomische. Monographie // Natuurk. Verhand. v.d. Holland Maattsch. d. Wetenschappen t. Haarlem. Derde Verzameling. Deel VI. Vierde Stuk. -1907. -P. 285.
262. Taylor J., Haigler C.H., Kilburn D.G., Blanton R.L. Detection of cellulose with improved specificity using laser-based instruments // Biotechnic & Histochemistry. -1996. -V. 71. -№ 5. P. 215-223.
263. Terashima N., Fukushima K. Heterogenity in formation of lignin. VII. An autoradiographic study of the heterogenous formation and structure of pine lignin // Wood Sci. Technol. -1988. -V. 22. -P. 269-270.
264. Tiwari S.C., Wilkins T.A. Cotton (Gossipium hirsutum) seed trichomes expand via diffuse growing mechanism // Can. J. Bot. -1995. -V. 73. -P. 746-757.
265. Van Genderen I.L., Van Meer G., Slot J.W., Geuze H.J., Voorhout W.F. Subcellular localization of Forssman glicolipid in epitelial MDCK cells by immuno-electronmicroscopy after freeze-substitution // J. Cell Biol. -1991. -V. 115. -P. 10091019.
266. Varner J., Taylor R. New ways to look at the architecture of plant cell walls // Plant Physiol. -1989. -V. 91. -P. 31-33.
267. Vian B., Roland J-C. Affinodetection of the sites of formation and of the further distribution of polygalacturonans and native cellulose in growing plant cells // Biol. Cell. -1991. -V. 71. -P. 43-55.
268. Vian B., Roland J.-C., Reis D. Primary cell wall texture and its relation to surface expansion // Internat. J. Plant Sci. -1993. -V. 154. -№ 1. -P. 1-9.
269. Viere M., Jauneau A., Knox J.P., Driouich A. Immunolocalization of P-(l->4) and |3-(1—>6)-D-galactan epitopes in cell wall and Golgi stacks of developing flax root tissues // Protoplasma. -1998. -V. 203. -P. 26-34.
270. Vos J.W., Hepler P.K. Calmodulin is uniformly distributed during cell division in living stamen hair cells of Tradescantia virginiana // Protoplasma. -1998. -V. 201.-P. 158-171.
271. Wada M., Staechelin L.A. Freeze-fracture observation on plasma membrane, the cell wall and the cuticle of growing protonemata of Adiantum capillus-veneris L. // Planta. -1981. -V. 151. -№ 3-4. -P. 462-468.
272. Wasteneys G.O. The cytoskeleton and growth polarity // Curr. Opin. Plant Biol. -2000.-V. 3. -P. 503-511.
273. Wasteneys G.O. Microtubules organization in the green kindom: chaos or self order? // J. Cell Sci. -2002. -V. 115. -P. 1345-1354.
274. Wasteneys G.O. Progress in understanding the role of microtubules in plant cells // Curr. Opin. Plant Biol. -2004. -V. 7. -P. 651-660.
275. Waterkeyn L. Cytochemical localization and function of the 3-linked glucan callose in the developing cotton fibre cell wall // Protoplasma. -1981. —V. 106. -№ l.-P. 49-67.
276. Westafer J.M., Brown R.M., Jr. Electron microscopy of the cotton fiber: new observation on wall formation//Cytobios.-1976.-V. 15.-P. 111-138.
277. Whetten R., Sederoff R. Lignin biosynthesis // The Plant Cell. -1995. V. 7.-P. 1001-1013.
278. Willemse M.T.M., Den Outer R.W. Stem anatomy and cell wall autofluorescence during growth of tree maize {Zea mays L.) cultivars // Acta Botanica Neerlandica. -1988. -V. 37. -P. 39-47.
279. Willemse M.T.M., Emons A.M.C. Autofluorescence and HPLC analysis of phenolic in Zea mays L. stem cell walls // Acta Botanica Neerlandica. -1991. -V. 40. -P. 115-124.
280. Willison J.H.M., Brown R.M., Jr. An examination of the development cotton fiber wall and plasmalemma // Protoplasma. -1977. -V. 92. -№ 1. -P. 21-41.
281. Winter H., Huber S.C. Regulation of sucrose metabolism in higher plants: localisation and regulation of activity of key enzymes // Critical Reviews in Plant Sciences. -2000 b. -V. 19. -№ 1. -P. 31-67.
282. Whitaker D. Cellulases. In: The enzymes // Ed: Boyer P. Academic Press, NY.-1971 -V. 5-P. 273.
283. Zang P., Toyoshima C., Yonekura K., Green n.M., Stokes D.L. Structure of the calcium pump from sarcoplasmic reticulum at 8 A resolution // Nature. -1998. -V. 392.-P. 835-839.
284. Zhu J.-K., Damsz B., Kononowisz A.K., Bressan R.A., Hasegawa P.M. A higher plant extracellular vitronectin-like adhesion protein is related to the transitional elongation factor-la// Plant Cell. -1994. -V. 6. -P. 393-404.
285. Zrenner R., Salanoudat M., Willmitzer L., Sonnewald U. Evidence of the crucial role of sucrose synthase for sink strength using trasgenic potato plants (Solanum Tuberosum L.) // Plant J. -1995. -V. 7. -P. 97-107.
-
Сальников, Вадим Владимирович
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2005
-
ВАК 03.00.12
- Метаболизм полисахаридов растительной клеточной стенки
- Тканеспецифичная галактозидаза растительных волокон, формирующих клеточную стенку желатинозного типа
- Особенности состава клеточных стенок каллусных культур гречихи с различным регенерационным потенциалом в процессе роста и морфогенеза
- Биотехнология бактериальной целлюлозы с использованием штамма - продуцента Gluconacetobacter hansenii GH - 1/2008
- Роль тканеспецифичного галактана в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки желатинозного типа
