Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Катаболизм фенольных соединений в связи с их функциями у некоторых высших растений

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Жанаева, Тамара Алексеевна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ СИБИРСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД

На правах рукописи

ЖАНАЕВА Тамара Алексеевна

КАТАБОЛИЗМ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СВЯЗИ С ИХ ФУНКЦИЯМИ У НЕКОТОРЫХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03.00.05 — Ботаника 03.00.12 — Физиология растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск 1997

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ........................................4

ГЛАВА 1. ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ ..............................8

1.1. Структура и свойства..........................8

1.2. Биосинтез флавоноидов........................15

1.3. Катаболизм флавоноидов................17

1.4. Функции флавоноидов в растениях ..............24

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .... 34

ГЛАВА 3. ГИДРОЛИЗ ФЛАВОНОЛ-З-ГЛИКОЗИДОВ

ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГЛИКОЗИДАЗ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ 55

3.1. Распространение ферментов, гидролизирующих

рутин, в высших растениях........... 57

3.2. Гидролиз флавонол-3-биозидов гликозидазой володушки золотистой (Bupleurum aureum Fisch.) 60

3.2.1. Идентификация продуктов гидролиза флавонол-3-биозидов гликозидазой володушки золотистой 60

3.2.2. Выделение и характеристика гликозидазы володушки золотистой, гидролизующей флавонол-3-биозиды 61

3.2.3. Использование гликозидазы володушки золотистой

для идентификации флавонол-3-биозидов ... 65

3.2.4. Накопление флавонолов и гликозидазная активность в различных органах володушки золотистой в процессе развития.......... 73

ГЛАВА 4. ПРЕВРАЩЕНИЕ И РАСЩЕПЛЕНИЕ СОБСТВЕННО

ФЛАВОНОИДНОЙ СТРУКТУРЫ .......... 93

4.1. Распространение пероксидаз, расщепляющих кверцетин, в высших растениях......... 93

4.2. Расщепление флавоноловых агликонов пероксидазой володушки золотистой (Bupleurum aureum Fisch.) 94

4.2.1. Продукты расщепления флавонолов (агликонов) пероксидазой володушки золотистой..... 94

4.2.2. Выделение и характеристика пероксидаз володушки золотистой........... 98

4.2.3. Пероксидазная активность в различных органах

вол о душ ки золотистой в процессе развития растений 102 4.3. Флавонолрасщепляющие ферменты гречихи

посевной (Fagopyrum esculentum Moench.).....104

4.3.1. Разделение и характеристика флавонолрасщеп-ляющих ферментов гречихи посевной.....105

4.3.2. Флавонолы и флавонолрасщепляющие ферменты в различных органах и тканях гречихи посевной

в процессе развития............109

ГЛАВА 5. РАСЩЕПЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКОГО КОЛЬЦА

ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ............137

5.1. Расщепление флороглюцинкарбоновой кислоты и флороглюцина бесклеточными экстрактами из листьев володушки многожильчатой

(Bupleurum multinerve DC.)...........137

5.2. Расщепление фенолкарбоновых кислот, образующихся из кольца В флавонолов, под действием пероксидазы володушки многожильчатой (Bupleurum multinerve DC.) 139

5.3. Расщепление кофейной кислоты ферментом

из листьев осины (Populus trémula L.)...... 141

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................150

ВЫВОДЫ..................... 158

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......159

ВВЕДЕНИЕ

Растения способны синтезировать огромное количество вторичных соединений, в число которых входят такие большие и разнообразные группы как фенольные соединения, изопреноиды и алкалоиды. Некоторые вторичные соединения могут проявляться только в единичных случаях, другие широко распространены в растительном мире, они могут быть специфичны на уровне различных таксономических групп (порядков, семейств, родов, видов). В пределах одного растения могут наблюдаться различия в составе вторичных соединений, органы и части органов могут различаться в проявлении их биосинтетического потенциала. В основе структурной и функциональной специализации клеток у высоко развитых организмов лежат биохимические и морфологические принципы. Образование вторичных соединений и образование морфологически специализированных клеток в многоклеточном организме является составной частью процесса дифференциации. Морфологическая и анатомическая дифференциация часто совпадает с экспрессией вторичного метаболизма. Особенно наглядно связь между экспрессией вторичного метаболизма и программой дифференциации организма показана в исследованиях с микроорганизмами (Лукнер, 1979).

Актуальность проблемы.

Фенольные соединения интенсивно изучались в течение трех последних десятилетий. Значительные успехи достигнуты в изучении химической структуры и биосинтеза многих классов фенольных соединений. Выделены и изучены ферменты, катализирующие различные стадии их образования в растениях (НагЬогпе, 1988; Запрометов, 1993).

Функции фенольных соединений в растениях важны и многообразны. Известно, что они участвуют в процессах биологического окисления, фотосинтеза, энергетического обмена, иммунитета, роста, репродукции и

др.. Тем не менее, имеющиеся на сегодняшний день данные о роли фе-нольных соединений в жизни растений остаются неполными и противоречивыми, что объясняется , в некоторой степени односторонней изученностью их метаболизма. Если вопросы биосинтеза фенольных соединений изучены достаточно подробно, то катаболический аспект до настоящего времени мало исследован. Функции фенольных соединений до сих пор рассматривают, главным образом, в связи с их образованием, не учитывая при этом различные пути расщепления.

В настоящее время способность высших растений к расщеплению фенольных соединений уже не вызывает сомнений. Однако, длительное время считалось, что растения способны только синтезировать фенольные соединения. Образование фенольных соединений рассматривали как механизм для удаления побочных продуктов метаболизма из основного обмена, а освобождение запасенной в них энергии приписывали исключительно микроорганизмам, которые используют эти продукты после отмирания растений (Тауэре, 1968).

Первоначальные предположения о превращении фенольных соединений в высших растениях были основаны на наблюдениях по накоплению этих соединений в молодых активно метаболизирующих тканях, снижению уровня или полному исчезновению в отдельных органах на некоторых стадиях роста и развития.

Первое экспериментальное доказательство способности высших растений к глубокому расщеплению флавоноидов вплоть до разрыва бензольных ядер А и В было получено М. Н. Запрометовым в 1959 г. при введении 14С меченых катехинов в чайное растение. Было установлено, что при катаболизме катехинов в чайном растении значительная часть метки включается во фракцию органических кислот, остальная радиоактивность распределяется между соединениями самой различной природы вплоть до С02. Это свидетельствует о том, что катехины, введенные в чайное растение, подвергаются глубокому

расщеплению и что продукты расщепления включаются в основной обмен. Позднее аналогичные данные были получены в работах С. В. Дур-мишидзе и сотр. (1968, 1973, 1974).

В. Барц и сотр., работая с культурами клеток ряда растений, пришли к выводу, что флавонолы могут расщепляться под действием пероксидаз. Среди продуктов расщепления флавонолов ферментами растений были обнаружены соответствующие им 2,3-диоксифлаваноны и оксибензойные кислоты, образующиеся из кольца В. Флороглюцин и флороглюцинкарбоновая кислота не были обнаружены в качестве фрагментов, образующихся из кольца А. На этом основании они предполагают, что флороглюцин и флорглюцинкарбоновая кислота сразу подвергаются дальнейшему расщеплению, хотя при введении этих субстратов извне в суспензии клеток не наблюдали их расщепления (Hösel, Barz, 1972; Hösel et al., 1975; Barz, Hösel, 1979). Разрушение бензольного ядра меченного 14С пирокатехина с образованием меченой углекислоты было показано в исследованиях С.Прасада и Б.Эллиса (Prasad, Ellis, 1978). Однако, многие катаболические аспекты метаболизма фенольных соединений остаются до сих пор недостаточно изученными.

Исходя из структуры, реакции расщепления флавонолгликози-дов можно условно разделить на три последовательные стадии, катализируемые соответствующими ферментами: 1) гидролиз глико-зидной связи; 2) превращение и разрушение флавоноидной структуры и 3) расщепление ароматического кольца.

Изучение ферментов, участвующих в этих процессах и продуктов, образующихся на разных стадиях расщепления, сделало бы более полной картину метаболизма фенольных соединений в растениях.

Выяснение биологического значения этих широко распространенных соединений предполагает также изучение их катаболизма на

разных уровнях организации — на уровне различных таксонов, организмов, а также в органах, частях органов и тканях в процессе развития растений.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение специфических ферментов, катализирующих различные стадии катаболизма фенольных соединений у высших растений, установление их локализации на разных уровнях организации растительных систем и выяснение механизма их участия в жизнедеятельности растений.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг на содержание ферментов, катализирующих расщепление фенольных соединений, различных таксономических групп (семейств, родов и видов) высших растений.

2. Дать характеристику ферментам, катализирующим различные этапы катаболизма фенольных соединений, у растений, с высокой их активностью и содержанием этих соединений; выделить и идентифицировать некоторые продукты ферментативных реакций.

3. Изучить распределение фенольных соединений и ферментов, катализирующих их расщепление, в индивидуальных растениях, органах и тканях в процессе их развития.

ГЛАВА 1

ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ

1.1. Структура и свойства

Фенольные соединения наряду с алкалоидами и изопреноидами представляют собой большую группу так называемых вторичных веществ. Реакции первичного обмена (образование и расщепление нуклеиновых кислот, белков и их предшественников, а также большинства углеводов, некоторых карбоновых кислот и т. д.) сходны для всех организмов, но существует огромное число метаболических путей, приводящих к образованию соединений, свойственных лишь некоторым видам. Эти реакции объединяются термином "вторичный обмен", а их продукты называются продуктами вторичного обмена или вторичными соединениями (Лукнер, 1979).

Фенольные соединения — это вещества, содержащие ароматическое кольцо, несущее гидроксильную группу, а также их производные. Фенольные соединения растительного происхождения можно разделить на несколько главных групп по числу атомов в углеродном скелете. Мы рассмотрим лишь некоторые основные группы, представители которых исследовались в настоящей работе в качестве субстратов, промежуточных и конечных продуктов или были обнаружены в исследованных растительных объектах.

Простые фенольные соединения (Сб-ряда)

он он он он

он он

Фенол Пирокатехин Резорцин Гидрохинон Флороглюцин

Простые фенольные соединения различаются по числу и расположению гидроксильных групп. Несмотря на то, что большинство сложных широко распространенных многоатомных фенольных соединений содержат в своей структуре остатки пирокатехина и флоро-глюцина, сами простые фенолы не столь распространены в растениях.

Оксибензойные кислоты (Сб-С^ряда)

r

.О

HOOC^^^R1

п-Оксибензойная Протокатеховая Ванилиновая Галловая

R = R' = Н) (R = OH, R' = Н) (R = ОСН3, R' = Н) (R = R1 = ОН)

Сиреневая Салициловая о-Пирокатеховая Гентизиновая

(R = R' = ОСН3) (R = R' = Н) (R = OH, R' = Н) (R1 = OH, R = Н)

Оксибензойные кислоты образуются при карбоксилировании соответствующих простых фенолов и также различаются по числу и расположению гидроксильных и метоксильных групп. Некоторые оксибензойные кислоты повсеместно распространены в растительном мире.

ноос-сн=1

Оксикоричные кислоты (С6-Сз-ряда)

п-Кумаровая (R = R' = H)

Кофейная (R = OH, R' = Н)

Феруловая (R = OCH3, R' = H)

Синаповая (R = R' = OCH3)

Оксикоричные кислоты встречаются в различных сочетаниях практически в каждом высшем растении (Molgaard, Ravn, 1988). Обычно оксикоричные кислоты встречаются в виде эфиров с различными спиртами, наиболее часто с сахарами, образуя moho-, ди- и трисахаридные эфиры. Эфиры двух гидроксилированных кислот называются депсидами, наиболее распространенные среди них — хло-

рогеновая и розмариновая кислоты. Обнаружены эфиры с аминокислотами, аминами, алифатическими спиртами и органическими кислотами.

Флавоноиды (С6-С3-Сб ряда) относятся к наиболее многочисленному классу природных фенольных соединений и содержат два ароматических ядра, соединенных пропановым фрагментом.

Трехуглеродный фрагмент в молекулах большинства флавонои-дов образует шестичленный гетероцикл и поэтому их рассматривают как производные флавана (I) или флавона (II).

3'

о

ii

В молекулах флавоноидов выделяют две структурные единицы, имеющие различное биосинтетическое происхождение: С6-С3 фрагмент, который состоит из колец В и С, и С6 фрагмент, представленный кольцом А. И хотя каждый из этих фрагментов в отдельности найден в природе во многих организмах от бактерий до высших растений, их сочетание в 15-углеродном скелете флавоноидов ограничивается, в основном, высшими растениями и папоротниками. Нумерация атомов в молекулах флавоноидов начинается с кислорода гетероцикла с переходом на кольцо А; а в халконах, отличающихся отсутствием гетероцикла, с углеродного атома, связанного с пропановым звеном; в кольце В нумерация отдельная и начинается с атома углерода, связанного с остальной частью молекулы.

При классификации флавоноидов учитывают степень окислен-ности (восстановленности) пропанового фрагмента, величину гете-

роцикла, положение бокового фенильного радикала и т. д. В зависимости от степени окисленности и величины гетероцикла флавоноиды делятся на 10 основных подгрупп (Запрометов, 1993) (рис. 1).

В пределах подгруппы флавоноиды различаются по числу и положению гидроксильных и метоксильных групп, а при наличии асимметрических атомов углерода — по конфигурации образуемых ими связей.

Флавоноиды встречаются в растениях преимущественно в виде гликозидов. Многообразие флавоноидных гликозидов обусловлено природой Сахаров, их присоединением в различных положениях, величиной окисных циклов, конфигурацией гликозидной связи и порядком присоединения Сахаров. Наибольшее распространение в растительном мире среди флавоноидных соединений имеют флавонолы. Из них чаще всего встречаются производные кемпферола, кверцети-на,изорамнетина и мирицетина.

Флавонолы часто встречаются в виде метиловых эфиров. Самый распространенный из них метиловый эфир кверцетина — изорамне-тин. Флавонолы находятся в растительных тканях обычно в виде гликозидов, которые отличаются друг от друга природой и положением Сахаров. Среди флавоноловых гликозидов наиболее часто встречаются 3-глюкозиды, 3-галактозиды, 3-рутинозиды и 3-софорозиды. Схема гликозилирования флавонолов в растениях имеет некоторые особенности: 1) обычно сахар находится в 3-ем положении. Если гли-козилируется другое положение, то это обычно 7-положение. Поэтому, как правило, распространены 3, 7-дигликозиды, а 3', 4'-дигли-козиды редки. Таким образом, гликозилирование гидроксильных групп флавонолов происходит в следующем порядке 3»7>4'>3'. 5-гидроксильная группа из-за близости карбонильной группы обычно не гликозилируется; 2) из встречающихся Сахаров глюкоза и рамноза (и их комбинация — рутиноза) являются самыми распространенными.

9 О

ю О

Рис. 1. Основные подгруппы флавоноидов:

1 — катехины; 2 — лейкоантоцианидины; 3 — дигидрохалконы; 4 — халконы; 5 — антоцианидины; 6 — флаваноны; 7 — флаванонолы; 8 — ауроны; 9 — флавоны и 10 — флавонолы

Известен ряд гликозидов, у которых к сахарам присоединены остатки коричных кислот. Ацилированные флавоноловые гликозиды найдены в Petunia, Pisum, Rosa и др. (Харборн, 1968). Ацильные фрагменты представлены чаще всего п-кумаровой, феруловой и кофейной кислотами.

Комплексы флавоноидов с другими классами соединений. Флавоноиды встречаются в растениях в виде комплексов с другими классами соединений. Известны комплексные соединения антоциа-нов с лигнином, найденные во мхах (Bendz et al., 1967). Халконы, флаваноны и флавоны, имеющие изопреноидные заместители, встречаются в семействах Rutaceae, Leguminosae, Moraceae (Merlini, 1973; Pinhey et al., 1973; Garcez et at., 1988; Пасешниченко, 1995). Из печеночника был выделен флавоноид-полисахаридный комплекс, где молекула флавона связана с остатками галактуроновой кислоты через гидроксильные группы в положении С7 и С4 (Markham, 1972). Обнаружены серосодержащие флавоноиды — сульфаты флавоноидов. Среди флавонолсульфатов встречаются гликозилированные и негликозилированные формы. Обычно сульфатный остаток присоединяется в положении С3 или С7 (Barron et al., 1988).

Свойства флавоноидов. Несмотря на большое разнообразие природных флавоноидных соединений, они обладают многими общими физическими и химическими свойствами, обусловленными наличием в них одинаковых структурных единиц. Ароматическое кольцо придает гидроксильной группе кислотные свойства вследствие взаимодействия электронов ядра с неподеленными парами электронов атома кислорода