Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и изучение механизма действия новых химических ингибиторов переноса электрона в фотосистеме-2 растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выявление и изучение механизма действия новых химических ингибиторов переноса электрона в фотосистеме-2 растений"

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ-АКАДЕМИЯ НОТ "

ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах рукописи УДК 577.355.3 +581.132

ЖАРМУХАМЕДОВ СЕРГЕЙ КУШТАЕВИЧ

"ВЫЯВЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ НОВЫХ ХИМИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА В Ф0Т0СИСТЕМЕ-2 РАСТЕШИ"

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО 1993

Работа выполнена в лаборатории фотосинтетического окисления вода Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук В.В. Климов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.В. Карапетян, доктор биологических наук E.H. Музафаров.

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится _1993 г. в_часов на заседании

Специализированного совета по биохимии Д.200.29.01 при Институте почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук * по адресу: 142292, г. Пущино, Московской обл., Институт почвоведения и фотосинтеза РАН, БОН, большой конференцзал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Автореферат разослан "_"_1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Б.Н. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Большинство известных в настоящее время гербицидов действуют на фэтосинтетическую цепь переноса электрона (Федтке, 1989). Более половины из них являются ингибиторами переноса электрона в фотосистеме 2 (ФС-2), осуществляющей ключевой процесс фотосинтеза - окисление вода и выделение кислорода. Одним из важнейших требований, предъявляемых к новым гербицидам, ЯЕЛяет-ся их экологическая безопасность. Основная трудность в решении этой проблемы состоит в том, что химические агенты, подавляющие ключевые метаболические реакции растений, действуют и на подобные процессы в организме животных и человека вследствие общности основных этапов метаболизма для всего живого мира. Единственным энергетическим процессом, строго специфичным только для растений, яляется уникальный процесс фотосинтетического окисления воды и выделения кислорода. Этот процесс осуществляется благодаря генерации в хлоропластах чрезвычайно высокого окислительно-воестановительно-го потенциала (+1 и В), не достижимого во всех остальных биологических системах. Следовательно, можно надеяться, что химические ингибиторы, препятствующие фотогенерации такого потенциала, будут строго специфичны для растений и нейтральны по отношению к метаболизму животного мира.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление новых химических ингибиторов переноса электрона в ФС-2 растений и изучение механизма их действия. При этом решались следующие задачи: 1) провести скрининг вновь синтезированных химических соединений по их способности ингибировать перенос электрона в ФС-2; 2) выяснить механизм ингибирущего действия выявленных соединений в сравнении с известными ингибиторами ФС-2; 3) исследовать связывание выявленных ингибиторов с компонентами ФС-2; 4) исследовать связь между эффективностью ингибирущего действия выявленных ингибиторов и особенностями их физико-химических свойств.

Научная новизна работы. Выявлены и выстроены в ряд по эффективности их действия новые химические ингибиторы фотосинтеза растений (более 25 соединений) - производные перфторизопропилдинитро-бензола (1ШЩЩБ), механизм действия которых основан на окислительно-восстановительном взаимодействии с компонентами реакционного центра (РЦ) ФС-2 и формировании циклического переноса электронов, приводящего к обращению фоторазделения зарядов в ФС-2. с помощью фотоаффинных (азидных) аналогов ШИПДНБ и ШАГ- электрофореза установлено их связывание на полипептиде с м.м. 32 кДа, входящем в состав РЦ ФС-2 (вероятно, Д^-белок). Установлено, что окислительно-восстановительный потенциал выявленных соединений лежит в

области -зоо -500 мВ и является (наряду с "липофильностью"} существенным фактором для определения эффективности их ингибирующего действия. Предложен механизм действия производных ПФИЩЩБ, принципиально отличающийся от механизма действия ингибиторов дауронового и триазинового типов. Показано, что окислительно-восстановительное взаимодействие с компонентами РЦ ФС-2 и образование циклического переноса электрона также вносит вклад в ингибирущее действие фе-нольного гербицида - диносеба, хотя и не является определяющим.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах воздействия на транспорт электрона при фотосинтезе и могут найти применение в области исседований по физиологии растений, могут иметь прикладное значение при разработке и создании искусственных биоэлектронных устройств. Выявленные химические ингибиторы могут быть использованы в качестве инструмента исследования структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата, а также могут быть основой для создания новых высокоэффективных и экологически безопасных средств защиты растений.

Апробация работы. Основные результаты, работы были доложены на ряде всесоюзных и международных совещаний по биофизике, биохимии, биоэнергетике фотосинтеза (см. список публикаций).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (методы и объекты исследования), шести глав, представляющих основные результаты работы и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста, содержит рисунков и таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературных данных составляет первую часть работы. В нем изложены современные представления о структурно-функциональной организации фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) растений, сделан обзор данных по механизму действия ингибиторов транспорта электронов на уровне ФС-2.

Объекты и методы исследования. Работу проводили на хлороплас-тах гороха, на субхлоропластных препаратах, обогащенных ФС-2 (ДТ-20), црепаратах светособщзающего пигмент-белкового комплекса, выделенных как ранее (Whatley and Anion, 1963; Бекина и Красновский, 1968; Щутилова с соавт., 1975; 1976), на ^Л^.цит.ъ^д-комплексах РЦ ФС-2 (Nanba and Satoh, 1987). Фотоиняуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла (ДФ) с Ъ660 нм, связанные с фотовосстановлением акцепторов электронов ФС-2 - Q, и феофитина (Фф), а

также изменения поглощения (ДА), связанные с фотовосстановлением Фф, фотоокислением П6д0 в"ФС~2~и-с-фотовосстановлевдем эндогенных акцепторов электрона, измеряли с помощью фосфороскопической уста-"" новки (Климов и др.,1975), подобной описанной ранее (Карапетян и Климов, 1971). Измерения проводили в среде, содержащей 20 мМ трис-НС1 буфер (рН 7,8), 35 мМ NaCl, 2 мМ . Полное (более 95%)

удаление мп и суммы водорастворимых белков с М.м. 18, 24 и 33 кДа из частиц ДТ-20 проводили с помощью 1 М трис-HCl (рН 8.0) и 0.5 М MgCl2 как ранее (Klimov et al.,198?). Скорость фотовыделения кислорода измеряли, используя электрод Кларка, покрытого тефлоно-вой мембраной. Анаэробные условия создавали с помощью системы: глюкоза (10 мМ), глюкозооксидаза 50 ед/м.л) и катадаза (~Ю00 ед/мл). Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре Hitachi 850. Измерения кинетики затухания флуоресценции с временным разрешением бо шкосекунд на канал проводили в совместной работе с В.З. Пащенко на установке, описанной ранее (Пащенко, 1986). Сигналы ЭПР измеряли на ЭПР-спектрометре ЭПР-РЭ-1306. Определение окислительно-восстановительных потенциалов проводили на полярографическом анализаторе GWP-673 как ранее (Kisselev et al., 1989). Синтез производных ПФЭДДНБ проводился в лаборатории проф. Ю.А. Баскакова (Константинова с соавт., 1990). В качестве характерного примера в диссертации описан синтез и приведены характеристики некоторых предлагаемых соединений - наиболее эффективных ингибиторов. Фотоаффинное связывание азвдопроизводного исследуемых ингибиторов (K15-N3) проводили как описано ранее (Pfister et al., 19S1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Производные перфторизопропилдинитроОензола - новые химические ингибиторы переноса электрона в ФС-2 растений.

Первичный скрининг ингибиторов переноса электрона ФС-2. Из целого ряда вновь синтезированных и уже имеющихся соединений отби рались вещества, способные оказывать влияние на кинетику фотоинду-дарованных АФ, связанных с фотовосстановлением первичного акцептора электрона ФС-2 - од. Среди отобранных таким образом веществ были выделены соединения, способные подавлять АФ, среди которых, в свою очередь, были выбраны только достаточно эффективные ингибиторы (порядка 30 соединений) которые были выстроены в ряд по эффек-Структурные формулы соединений К15 и К23:

рз? /СН, о рз?

CH„OC'S

\0>-KHN=c( J (К15) С,Н,.СО-C-<S>-NHNH, (К23)

F3C NOa ЧН5 F3¿ H02

Таблица 1. Значения величины 150 (концентрация ингибитора, которая вызывает подавление фотоиндуцированных ДФ субхлоропластных препаратов ФС-2 (ЯГ—20) на 50Я5), полученные для исследованных ПФИЩЩБ. Концентрация хлорофилла - 10 мкг/ш.

N пп обозначение мкМ

1 18 0,09

2 К15 0,10

3 К11 0,10

4 К12 0,26

5 К10 0,36

6 23 0,40

7 33а 0,70

Ю

11

12

13

14

обозначение

33

юз

трф

К14

50"

мкМ

0,80

0,9

1,0

2,0

2,5

3,0

3.5

Ы ПП обозначение 150* мкМ

18 1 8,0

19 17 10,0

20 К9 30,0

21 17 40,0

22 30 80,0

23 19 90,0

24 2а 200

N ПП обозначение ^0' мкМ

15 го 5,0

16 Г1 6,0

17 32 7,00

25 9 400

26 За 500

8

и НАДФ (5 мг/мл); Б - по фотоиндуцированным изменениям выхода флуоресценции хлорофилла ФС-2, связанным с фотовосстановлением о, (ДФ). (1) - контроль (измерения в отсутствие соединения,К15). Д,-включение измерительного света (Л.=490 нм; 0,15 Джхм ^х хсек '), возбуждающего флуоресценцию хлорофилла (ЯавбО шл); включение и выключение действующего света (А.>600 нм; ю Джхм ). Концентрация хлорофилла - юо мкг/мл., 20° С._

тивности их действия (таблица 1). Далее были исследованы наиболее

эф$ективные из этих соединений (вещества К15 и К23), было изучено

их действие на транспорт электрона в хлоропластах и на компоненты

ЭТЦ в препаратах ФС-2, а затем все основные эффекты были подтверж-

дены и для остальных представленных выданной работе, соединений.

Действие производных ПФЩДНБ на фотосинтетический транспорт " электрона в хлоропласта*. Подавление фотовыделения 02 и фотовосстановления НАДФ+ при добавлении к хлоропластам вещества К15 (рис.1) свидетельствует о способности данных соединений нарушать транспорт электрона от воды к НАДФ+. Сохранение же фотовосстановления НАДФ+ фотосистемой 1 (ФС-1) в присутствии К15 в условиях, когда в-эту реакцию вовлечена только ФС-1, указывает на то, что место действия лантал соедиззгптй находится на уровне ФС-2. В пользу этого предположения свидетельствует тгкгэ ппгяоировашй соединением К15 фото-индуцированных ДФ ФС-2 у хлоропластов (.риеи) и у субхлороиластпих препаратов ФС-2 (рис.3). Кроме того, эти данные свидетельс^' «)т о том, что в основе подавления электроннного транспорта, измер 1Г0 по фотовыделению 02, и в основе подавления ДФ ФС-2 лежит, ве^.ят-но, один и тот же процесс ингибирования, на что указывает совпадение зависимостей этих эффектов от концентрации К15 (рис.1, 2).

Анализ ингибируыцего действия производных ПФВДДНБ на фотохимическую активность ОС-2.

Подавление ¿5, связанных с Фстовосстпясвлением 0,. На рис.2 показала результаты исследования ингкбиругезго действия соединения К15 на флуоресценцию (ф) и фотоиядуцированные ДФ субхлорспластннх частиц 4С-2 (ДТ-2.0) с использовании света наснщатаей интенсивности. Уже з концентрации 18 Ш (кривая 3) К15 вызывает уменьшение максимального уровня Ф (Окакс . равного сумме Ф + ДФ) за счет уменьшения величины ДФ на 15 % по отношению к контролю. В концентрации 80 нМ и 360 кМ К15 уменьшает фотоиндуцированные ДФ соответственно на 57 % я 86 % (кривые 4, 5). Концентрация ингибитора, вызывающая 50Я-ое подавление АФ (Х50), для К15 составляет 70 нм. отсутствие эффекта ускорения те*.«новой релаксации ДФ, связанных с фотовосстановлением <зд> указывает на то, что акцептированием электронов веществом К15 от а", вероятно, нельзя объяснить подавление ДФ и понижение общего уровня Ф. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что ингибирующее действие на АФ полностью сохраняется при длительном (>5 мин.) освещении действующим светом даже при использовании очень малых концентраций ингибитора. С другой стороны, уменьшение Ф^^ за счет подавления ДФ в присутствии К15> вероятно, не связано с блокированием переноса электронов на донорной стороне ФС- 2, как Зто имеет место, например, при инактивации донорного участка ФС-2 в результате полного удаления Мп (кривая 8). В этом случае добавление экзогенных доноров электрона ФС-2 восстанавливает АФ практически до исходного значения (кривая 8'), что неоднократно отмечалось и ранее (китот et а!.. 1982). В

-б-

45л н и

о § §

п о

За

"I §

о н о е

0.1 1.0 10.0 100 юоо КОНЦЕНТРАЦИЯ ИНГИБИТОРА (мкМ)

Рис.2 Зависимость фотохимической активности хлоропластов гороха, измеренной по скорости выделения 0 в присутствии экзогенных акцепторов электрона - системы : ферредоксин, ферредоксин-НАДФ -ре-дуктаза и НДДФ - (1,3) и по фотоиндуцированным АФ хлорофилла ФС-2, связанным с фотовосстановлением а (2,4), от концентрации соединения К15 (1.2) и диносеба (3,4). концентрация хлорофилла - юо мкг/мл., 20 С. Условия измерения см. в подписи к рис.1.

40

30 20 Ю 0

О-

* 115

I I I I

Г

¿1 _ _

Д й Д с, & л /5Й

30 с1

Рис.з Величина темнового уровня флуоресценции (Ф) и кинетика фото-индуцированных изменений Ф (ДФ), связанных с фотовосстановлением акцептора 0. в ФС-2, в аэробных условиях у исходных субхлоропласт-них частиц ДТ-20 (1-7, 9 сплошные линии) без добавок (1) и после добавления: диурона в концентрации 0,5 мкМ (2); соединения К15 в концентрации 20 нМ (3), ЮО нм (4) и 800 нМ (5) в отсутствие других добавок и после добавления к (5) 0,8 мг/мл дитионита (9); диносеба в концентрации 1 мкМ (6) и,5 м$М (7) и у частиц ДТ-20 после полного удаления Мп (8). Кривые 5 и 8 показанные штриховой линией - то же самое, что и кривые 5 и 8 соответственно, но после добавления 20 мМ МпС]_ . Условия измерения и обозначения см. в подписи под риси. Концентрация хлорофилла - ю мкг/мл., 20° С.

то же время, после_подавлешя фотоиндуцированных АФ ФС-2 с помощью К15 они не реактивируются при последующем добавлении Мпг+ и других доноров электрона независимо от последовательности внесения реагентов (рис.2, кривая 5').

В отличие от диурона (кривая 2) соединение К15 не вызывает ни увеличения уровня Фо (кривые 3-5), ни замедления темнового спада АФ, что свидетельствует об отсутствии блокирования переноса электронов на акцепторной стороне ФС-2. На это указывает также тот факт, что К15 (в отличие от диурона) не вызывает нарушения взаимодействия ФС-2 и ФС-1 через цепь переноса электрона, измеряемого по уменьшению флуоресценции ФС-2 вследствие окисления QJ при дополнительном возбуждении ФС-1 в хлоропластах как ранее (Карапетян, Климов, 1973).

Добавление дитионита (>0,8 мг/мл) полностью устраняет ингиби-рующее действие К15 на АФ ФС-2. Флуоресценция поднимается до уровня Фиакс , а включение действующего света вызывает уменьшение ЛФ (кривая 9), связанное, с фотовосстановлением Фф. Дитионит вызывает темновое восстанавление К15. о чем свидетельствует исчезновение характерных полос поглощения в области 200-500 нм с максимумом при

420 HM.

Подавление спектральных эффектов, связанных с фотовосстановлением промежуточного акцептора электрона ФС-2 - фэофитина. Известно (Kii-mov et ai., 1936), что фотовосстановление Фф до Фф~ в ФС-2 может наблюдаться и в отсутствие дитионита - при создании анаэробных условий. В этом случае Ф также достигает уровня Фмакс вследствие фотовосстановления QA до Q" слабым измерительным светом, а при освещении действующим светом наблюдается уменьшение флуоресценции (-ДФ) и изменения поглощения (АА), связанные с обратимым фотовосстановлением Фф (рис.4). Внесение К15 в концентрации 38 нМ приводит к резкому (более, чем в 15-20 раз) ускорению темповой релаксации соответствующих ДА и -ЛФ, свидетельствующему о возрастании скорости темнового окисления Фф~(рис.4А и 4Б). При увеличении концентрации К15 до 65 нМ и 360 нМ (рис.4) наблюдается значительное уменьшение фотоиндуцированных -АФ и ДА, а также уменьшение уровня Ф<акс . Следует отметить, что при этом освещение действующим светом не приводит к появлению фотоиндуцированного увеличения Ф, связанного с фэтовосстановлением Q . В то же время, в случае использования вместо К15 известных акцепторов электрона ФС-2, вызывающих темновое окисление Q", например 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ), подобное уменьшение Ф в анаэробных условиях сопровождается появлением фотоиндуцированного увеличения Ф (рис.4А, кривая в). Диу-рон в концентрации до 50-100 мкМ не изменяет ни кинетику, ни вели-

¿4« £3Э° Ш2а ¡8 о [V >И Тп 1 1 I Т А А х| 1 1 1 1 ( 1 1 » 1 » V \ * / \ • /. \ у * к А ч о ГТ,- V | г 1 \ "а \ ги А <1 > "А ( с

У 1 АА685 ЬзОс _ I-зн >1 г2 1 к 1/ * А * , X В N Л 3 е.' * I/1 \ /1 4 И1 \ N • *

Рис.4 Величина Ф и кинетика фотоиндуцированных -ДФ (А) и изменений поглощения при 685 нм (Б), связанных с фотовосстановлением феофи-.тина в фотосистеме 2, у частиц ДТ-20 в анаэробных условиях (после добавления ю мМ глюкозы, - 50 ед/мл глюкозооксидазы, ~ 1000 ед/мл каталазы, 5 мМ аскорОата ка и 1 мкМ СССР), в отсутствие других добавок (1) и после добавления: соединения К15 в концентрации 38 нМ (3), 65 нМ (4) и 360 нМ (5), 10 мкМ ДХФИФ (6) или 50 мкМ диурона (кривая 2, показана штрихами). На рис.ЗА слева штрих-пунктиром показана кинетика ДФ, связанных с фотовосстановлением.о , у такого же образца пв аэробных условиях. Концентрация хлорофилла - ю мкг/мл., 20 С. Обозначения - как на рис.1.

чину ДА и -ДФ, связанных с фотовосстановлением Фф, ни величину Фкакс В анаэро0®135- условиях.

В отдельных экспериментах было показано, что соединение К15 в концентрации до 100 мкМ не уменьшает Ф хлорофилла светособирающих пигмент-белковых комплексов, а также раствора хлорофилла в 1 %-ом тритоне Х-ЮО.

Резкое ускорение темновой релаксации спектральных эффектов, связанных с фотовосстановлением Зф в результате реакции Ш680 Фф]0~ -Ьх>[П680 Фф~] о", и как следствие этого - уменьшение величины этих эффектов (рис.з) - свидетельствуют в пользу того, что в присутствии соединений К15 значительно сокращается время нахождения Фф в восстановленном состоянии вследствие его быстрого реокис-

ления. Тогда"уменьяение-величиш-шложительшх ДФ в аэробных условиях и понижение уровня Фыакс в анаэробных условйях""мсгут'-быть— интерпретированы как результат ускорения распада пары Шбд0 ®£Л, индуцированного соединениями К15 вследствие окисления Фф~.

Можно предположить, что действие соединения К15 на окисли-тельно-восстановятельное состояние Фф обусловлено не прямым его участием в акцептировании электрона от ФфТ а например, вследствие увеличения доступа 0£ к Фф". Однако сохранение характерной эффективности ингибирувдего действия соединений К1& и в анаэробных ус-ловлях (р;тс.4) свидетельствует против такого предположения.

В то же время, ингийгругщее действие ссединелтй кчь нельзя объяснить только акцептированием электронов от Фф~. Ведь в таком случае должен был бы наблюдаться эффект истощения ингибирующего действия К15 при длительном освещении вследствие накопления ингибиторов в восстановленном состоянии, чего в действительности не происходит.

Влияние на фотовосстановление феофитина в восстановительных условиях. Скорость фотоиндуцированных ДФ, связанных с обратимым фото-восотаноьлекием -55, в присутствии дитионита на препаратах ФС-2, ли-хегош !.'п, возрастает в 1,5-2 раза при добавлении Иг.'-4 <К11в»у ** »1., 193"). Подобный зффект наблюдается и при добавлении К15 в кон-центраиян О;5 мкМ (рис.з). Скорость темпового окисления *Ф~ при этом ке изменяется. Ускорение реташ фотовосстанэвления 5ф при до-езшгекий К15 б присутствии дитиснита указывает на споссСность восстановленной дагионитом фермы К15 локировать аяектрокн на ГЦ -5С-2.

йпгзСмроьанис .ДА■ связанных с фотокислелием , и сигнала ЭП? окисленного вторичного донора электрона г. ДсЯйЕлекйе Х-* приводит к уменьшению величины фотоиндуцированных ДА при о?а км, свя-затлк- с фо^оокислением первичного донора электрона Пб80, в препаратах ;г:-2и, лишегсшх Мл, в присутствии $?рркци2йилй калия и мо-либдата ;фемаия (рис.6). ПоЖное уменьшение величины да при б?8 нм- наблюдается при добавлении к таким препаратам Мп2 + (0,1-3 мкМ), приводящем к реактивации донирования электрона на РЦ ФС-2. Соединение К15 подавляет также ДА при 820 нм, связанные с фотоокислением П680 при измерении этой фотореакции с микросекундным временным разрешением как в присутствуй, так и в отсутствие феррицианида калия и модибдата кремния. Авторы благодарят Б.А. Шувалова за содействие в проведении данных измерений. ПФЩДНБ подавляют также фотоиндуцированный ЭПР-сигнал II, связанный с фотоокислением вторичного донора электрона ъ.

Действие производных ПФИПДНБ на фотоперенос электрона в препаратах Д^Д^.ь^д РЦ ФС-2. Производные ПФИЩЩБ ингибируют перенос

« \Т V

ч \ . ♦

¿40 \ 1 • 1 гЛ 2 3

§30 \\ \ V

§20 Е £>10 чТ \ 1 л \\ 1 N. \ 1

т

0

А. Л Л

Рис.5 Кинетика фотоиндуцированного уменьшения Ф, связанного с фотовосстановлением феофитина в РЦ фотосистемы 2, у частиц ДТ-20, лишенных Мп, после внесения дитионита (0,8 мг/мл) в отсутствие других добавок (1) и после добавления 0,5 мкМ соединения К15 (2) или 0,1 мМ МпС1 (3); рН 8,5. Услов. изм. - рис.з, обозн. рис.1.

Рис.6 Кинетика фотоиндуцированных изменений поглощения при 678 нм, связанных с фотоокислением П, , у препаратов да-20 в присутствии 1 мМ феррицианида и 0,1 мМ кршший молибдата до (1) и после (2- 5) полного удаления Мп, при измерении в отсутствие других добавок (2) и после добавления 3 мкМ МпС1 (3) или соединения К15 в концентрации 22 нМ (4) и 80 нМ (5). Обозначения - как на рис.1.

----------------ii-

электрона в изолированных РЦ ФС-2, йзмере1шый--по-.-фотохимическому восстановлению молибдата кремния в присутствии дифенилкарбазида, и' фотоокислению хлорофилла П680 с эффективностью, сравнимой с таковой для субхлоропластных препаратов, обогащенных ФС-2.

Действие производных ПФЩДНБ на кинетику затухания флуоресценции хлорофилла ФС-2 растений. Производные ПФИЩЩБ вызывают резкое падение квантового выхода и уменьшение длительности медленной (на-носекундной) компоненты кинетики затухания Ф. Длительность и амплитуда быстрой (300 пс) компоненты Ф практически не изменяется, в присутствии дитионита ПФМШЩБ по влияют на SC-2, при этом длительность и относительный вклад квантового выхода медленной компоненты Ф принимают свои исходные значения, а кинетика затухания полностью, совпадает с контрольной. Эти данные указывают на увеличение скорости распада первичной ион-радикальной пары Ш6д0 Фф~] за счет взаимодействия ПФИЩЩБ с компонентами РЦ ФС-2.

Сравнение ингибирующего действия на различные реакции ФС-2.

Совпадение концентрационных зависимостей ингибирующего действия ПФИЩЩБ для всех рассмотренных выше фотореакций, а именно: 1) фо-тоиндуиировашшх ДФ, связанных с фотовосстановлением qa, 2) величины Ф хс в анаэробных и в аэробных условиях, 3) фотоиндуциро-ванных -АФ и ДА при 685 нм, связанных с фотовосстановлением Фф, а также 4) фотоиндуцированных ДА при 678 нм, связанных с фотсокисле нием хлорофилла Пбао (рис.?) свидетельствует об единой природе их ингибирования. Предполагается, что ПФИЩЩБ, принимая электрон от и передавая его на z+ (или непосредственно на П6д0), замыкают перенос электрона в ФС-2. Нэ исключено, что производные ГШЩЩБ, попадая в РЦ ФС-2, выполняют роль, подобную Q , или даже замещают cj . Окислительно-восстановительный потенциал ПЖЩЩБ лежит в области -400 мВ. Вследствие этого, принимая электрон от Фф", производные ПФИЩЩБ, (в отличие от QA, имеющего потенциал около -0,130 мВ), не способны задерживать era на достаточно длительное время, и он вновь возвращается на П^ или на z+, что и приводит к нарушению базального переноса электрона в ФС-2.

Исследование зависимости ингибирувдей эффективности в ряду ПФИЩЩБ от некоторых физико-химических свойств молекулы ингибитора. Вели-' чина 150 для подавления реакций ФС-2 в случае наиболее активных ПФИЩЩБ составляет 5*10-0 - 10"7 М, что соответствует примерно одной молекуле ингибитора на РЦ ФС-2. У менее активных соединений она достигает Ю-3 М, т.е. более 1000 молекул на РЦ ФС-2. Показана более высокая (в ~юо раз) ингибирующая активность в ряду исследованных ПФИЩЩБ у соединений, имеющих две нитрогруппы (N0e) в структуре молекулы по сравйению с соединениями с одной нитрогруппой.

о о

ы

а к

<!

Ю о

о Ю

о, к ю к и, X к

0,01

0,05

0,1

0,6

1.0

КОНЦЕНТРАЦИЯ К-15, мкМ Рис.7 Зависимость ингибирования (в Л): □ - фотоиндуцированных ДФ, связанных с фотовосстановлением первичного акцептора электрона ФС-2 шгастохинона - 0.; Л - величины Ф в аэробных условиях; I -величины Ф в анаэробных условиях? О и • - фотоиндуцированных -АФ и ДА п$йк§85 нм соотвественно, связанных с фотовосстановлением промежуточного акцептора электрона - феофитина в анаэробных условиях; н - фотоиндуцированных м при 678 нм, связанных с фотоокислением первичного донора электрона ФС-2 - хлорофилла ПейЛ; от кон-цен трации соединения К15. Концентрация хлорофилла - 10°икг/мл.

Этот факт свидетельствует в пользу того, что в окислительно-восстановительные превращения, ответственные за процесс подавления электронного транспорта в ФС-2, вовлечены, вероятно, нитрогруппы бензола.

Прослеживается положительная зависимость между повышением ин-гибирувдей эффективности и увеличением степени гидрофобности молекулы исследованных ПФИЩЩБ, а следовательно, степени доступности молекулы ингибитора к участку ее связывания, находящемуся, судя по функциональным данным, на уровне промежуточного акцептора электрона ФС-2 - феофитина, расположенного в гидрофобной области РЦ. Зависимость ингибирувдей активности от степени гидрофобности для известных гербицидов (в том числе и фенольного класса) отмечалась и ранее (Уегиааз et а1., 1990). С другой стороны, заместители боковой цепи ингибитора, вероятно, влияют на степень пространственного соответствия мевду структурой молекулы ингибитора и конфигурацией связывающей ниши.

Окислительно-восстановительные свойства производных ПФИПДНБ. В водных растворах в присутствии детергента при рН 8,0 большая часть исследованных ПФИЩЩБ принимает первый электрон при потенциалах -0,28 —0,41 В (НВЭ). Восстановление не обратимо, зависимость по-

-------------------------------------13-

тенциала восстановления от рН составляет 60 мВ/рН, что свидетельствует о протонировании восстановленных форм. Наибольший"интерес-------------

представляет поведение ингибиторов в неводных растворах, в ацро-тонной среде, поскольку вследствие своей липофильности они способны встраиваться в гидрофобные области фотосинтетических мембран. Показано, что в безводном диметалформамиде большинство исследованных ПФИЩЩВ способно к одноэлектронному обратимому восстановлению при потенциалах -0,30 -0,53 В. Эти результаты позволяют обосно-.вать предложенный выше механизм ингибирувдего действия ПФИЦДНБ, заключающийся в их окислительно-восстановительном взаимодействии с парой Шбд0 Фф~]. Значения редокс-потенциалов ингибиторов подтверждают их способность к перехвату электрона в реакционных центрах ФС-2 на уровне Фф~, а обратимость восстановления указывает на возможность быстрого возврата электрона от восстановленного ингибитора на подходящий акцептор, которым могут быть П6*0 или z+. Показана зависимость ингибирувдего действия от редокс-потенциала исследованных соединений.

Связывание производных ПФИПДНБ с полипептидами РЦ ФС-2.

Обратимость связывания производных ПФИГЩНФ с ФС-2. Для идентификации ПФИПДНБ использовали их способность испускать характерную Ф при 440-450 нм при возбуждении на длине волны 270 нм. Показано, что ПФШДНБ прочно связываются с ФС-2: только промыванием в присутствии детергента удается удалить К15 из препаратов ФС-2. Это свидетельствует в пользу высокой аффинности связывания ПФШШНБ в ФС-2 которое имеет, вероятно, нековалентную природу.

фотоаффинное связывание производных ПФИГШНФ с препаратами ФС-2. Методом фотоаффинного мечения с использованием азидсодерхащего аналога К15-N3 показано, что в препаратах ФС-2 до и после удаления суммы водорастворимых белков исследованными ПФИПДНБ интенсивно метится одна белковая полоса в области 30-34 кД (исходя из условий проведения ПААГ электрофореза - Д?-белок) и, в меньшей степени, -полоса в области 65-55 кДа (гетеродимер д1- и Д2~белков).

фотоаффинное связывание производных ПФИЩЩФ с препаратами

рЦ ФС-2. В препаратах РЦ ФС-2 в присутствии 6 М мочевины удается отчетливо разделить полосы Д,- и Д^-белков. В этих препаратах фотоаффинно связанные ПФИПДНБ метят только полосы 30 кДа и 55 кДа. Учитывая данные об аномальном изменении электрофоре-тической подвижности гербицид-хинон-связывающего белка Д в зависимости от концентрации мочевины в среде (Nakatani et al., 1983; Kyle et al., 1983; Satoh et al., 1983), сделан вывод о том, что местом связывания исследованных ПФИПДНФ, вероятно, является ^-белок.

-140 конкуренции за место связывания между производными ПФИЩЩФ и диуроном. Конкуренция ингибиторов друг с другом (Tischer and strot-mann, 1977 ). со вторичным акцептором электрона QB (Wraight, 1981 ; Velthuys, 1981) и с экзогенными пластохинонами (Vermaas et al., 19ЭЭ) служит свидетельством их общего места связывания.

Исследовали способность даурона "снимать" ингибирующее действие ПФИПДНБ. Регистрировали тушение уровня Фмакс хлорофилла ФС-2 (связанного с восстановлением q ) в анаэробных условиях, при добавлении соединения К15. Показано отсутствие конкуренции между ПФИГЩНБ и диуроном за место связывания РЦ ФС-2. Этот факт подтверждает предположение о том, что местом связывания ПФИЦЯНБ служит, вероятно, белок Д£, несущий на себе, как известно, акцептор Полученные результаты отклоняются от принятой схемы связывания гербицидов с ФС-2, но в то же время согласуются с результатами функциональных измерений, обосновывающими предполагаемый механизм ингибирувдего действия ПФИГЩНБ на ФС-2.

Окислительно-восстановительное взаимодействие фенольного гербицида - диносеба с парой [П^Фф""] в РЦ ФС-2 растений. Представлены экспериментальные результаты, свидетельствующие о том, что аналогичной способностью к окислительно-восстановительному взаимодействию с компонентами РЦ ФС-2, приводящему к- ускорению окисления Фф~ и восстановления П6д0 и, как следствие этого, к ускорению распада пары Фф~], обладает и диносеб. Но в случае диносеба ингиби-

рование электронного транспорта (измеряемого по фотовыделению 0£) происходит при меньших концентрациях чем, подавление ДФ и других, характерных реакций ФС-2 (рис.г). Вследствие этого был сделан вывод о том, что ингибирование фотохимической активности ФС-2 за счет образования циклического переноса электрона от Фф~ к П6д0 с участием диносеба может конкурировать с функциональными реакциями окисления Фф~ и восстановления П6д0 и делать существенный вклад в общий эффект ингибирования переноса электрона в ФС-2 лишь при относительно высоких концентрациях этого ингибитора. В значительно большей степени вероятность окислительно-восстановительного взаимодействия ФС-2 с диносебом возрастает в условиях, благоприятствующих фотонакоплению долгоживутцих состояний РЦ ФС-2 с окисленным П680 или с восстановленным Фф (например, в анаэробных условиях, при высоких интенсивностях света).

В случае же исследованных ПФШЩНВ окислительно-восстановительное взаимодействие с компонентами РЦ ФС-2, приводящее к образованию циклического переноса электрона, лежит, вероятно, в основе их ин-гибирующего действия. Важно также отметить, что эффективность ингибирущего действия К15 на активность ФС-^2 в -80-100 раз выше.

чем у диносеба (рис.1). При этом полное подавление - функции происходит при связывании примерно одной -молекулы ингибитора на РЦ ФС-2 Выявленные химические ингибиторы переноса электрона в ФС-2 могут быть использованы в качестве основы для создания новых высокоэффективных и экологически безопасных гербицидов, а также в качестве инструмента исследования структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата. Так, в недавних работах ингибитор К15 использовался для доказательства способности Фс-2 к фотовыделению Н? (M*itsev et al., 19аз) и к фотовосстановлению НАДФ+ (Allakhverdiev and Klimov, 1992) В анаэробных УСЛОВИЯХ, КОГД« Q, восстановлен и другие ингибиторы типа диурона или триазина не способны к подавлению характерных реакций ФС-2.

ВЫВОДЫ

и Выявлены и выстроены в ряд по эффективности их действия новые химические ингибиторы фотосинтеза растений (около зо соединений) производные перфторизопропилдинитробензола (ПФИЩЩБ), способные подавлять фотосинтетический транспорт электронов, г^ Показано, что по эффективности янгибирующего действия наиболее активные из них не уступают известным гербицидам - диурону ч атра-ii-шу, но принципиально отличаются по механизму действия. % „'стчяовлено. «то =ыяь.;,еннке ПФШДНБ эффективно ингаеируют кере-::сс олектссна на уровне фотосистемы 2 (ФС-Eï: инпкягоуют фотсвсг-. гановление Q,, подавляют фотовосстановление феофитина га счет у-•/.орения рескисления фотоокисление п1ДС и Z, вероятно, за счет ускорения их ревосстановления, вызывают резкое падение квантового выхода и уменьшение длительности наносекундной компоненты затухания флуоресценции хлорофилла ФС-2. Концентрационные зависимости ингибирсвания ПФЩЦНБ выделения кислорода и перечисленных выше реакций, связанных с фотопереносом электрона в РЦ ФС-2, совпадают.

С помощью фотоаффинных (азидшх) производных ингибиторов и электрофореза в полиакриламидном геле установлено их связывание на полипептиде с молекулярной массой 32 киллдальтона, входящем в состав реакционного центра (РЦ) ФС-2 (вероятно, Д2-белок). Показано отсутствие конкуренции между ПФИЩШБ и диуроном за место связывания в РЦ ФС-2.

Установлено, что окислительно-восстановительный потенциал исследованных ПФЩЦНБ лежит в области -эоо -500 мВ и является (наряду с "липофильностью") существенным для определения эффективности их ингибирующего действия.

б.Предложен механизм действия выявленных ингибиторов, принципиально отличающийся от механизма действия традиционных ингибиторов ди-уронового и триазинового типов и основанный на окислительно-

восстановительном взаимодействии ингибитора с компонентами реакционного центра и формировании циклического переноса электронов, приводящего к обращению фоторазделения зарядов в ФС-2. 7. Показано, что окислительно-восстановительное взаимодействие с компонентами РЦ ФС-2 и образование циклического переноса электрона также вносит вклад в ингибирующее действие известного фенольного гербицида - диносеба, хотя и не является определяющим; для ингибиторов диуронового и триазинового типа окислительно-восстановительного взаимодействия с РЦ фотосистемы 2 не выявлено.

Выявленные химические ингибиторы переноса электрона в ФС-2 могут быть использованы в качестве основы для создания новых высокоэффективных и экологически безопасных гербицидов, а также в качестве инструмента исследования структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации: ;кБаскаков Ю. А., Колобанова Л.П., Константинова-Н.П. Аллахвердиев С.И. Жармухамедов С.К., Ананьев Г.М., Климов В.В. Производные 4-(2-оксиперфторизопропил)-2,6-динитроанилина в качестве ингибиторов реакционного центра фотосистемы 2 растений. Авторское свидетельство N1573798, от 18.12.87.

2.Аллахвердиев С.И., Жармухамедов С.К., Климов В.В., Баскаков Ю.А., Колобанова Л.П., Константинова Н.П. Производные гидроксипер-фторизопропилдинитрофенилгидразина, ингибирующие реакционные центры фотосистемы 2 растений. Авторское свидетельство Н1617892, от 18.12.1987.

ЗкАллахвердиев С.И., Жармухамедов С.К., Ананьев Г.М., Климов В.В., Колобанова Л.П., Константинова Н.П., Баскаков Ю.А. О ингибирующем действии диносеба на перенос электрона в фотосистеме 2 растений. -Тезисы докл. Всес. конф. молодых ученых и специалистов. Пущино, 1987, с.216.

¿^Аллахвердиев С.И., Жармухамедов С.К., Ананьев Г.М., Климов В.В., Колобанова Л.П., Константинова Н.В., Баскаков Ю.А. Тезисы докл. Всес. совещ. по пестицидам. Черноголовка, 1988, с.138. S.Klimov V.V.,Allakhverdiev S.I..Zharmukhamedov Б.К. Mechanism of the inhibitory action of dinoseb on the light reactions of electron transfer in photosystem II. Abstr. of Inter. Syra. on "Regulation and Efficiency of Photosynthesis". Shanghai. China. 1988, 42. бЛСлимов B.B., Аллахвердиев С.И., Жармухамедов С.К. Окислительно-восстановительное взаимодействие фенольного гербицида диносеба с парой [n6g0®if] в реакционном" центре фотосистемы 2 растений. Физиология растений, 1989, 36, 4, 770-777.

Т^Аллахвердиев С.И., Жармухамедов С.К., Климов В.В., Васильев

С.С., Корватовский Б.Н."Пащенко "В.3.-Влияние диносеба..и. других фенольных соединений на кинетику затухания флуоресценции хлорофилла фотосистемы 2 высших растений. Биологические мембраны, 1989, б, 11 , 1147-1153.

8.Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Zharmukhamedov S.K. Inhibition of electron transfer in photosystem' II by dinoseb. Abstr.of 3th Inter. School Conf. of Young Scientists of Socialistist Countries "Physical and. chemical basis of biology; Biochemical and Biophysical Principles in the research for Biotechnology". GDR, 1989, 27.

9.Zharmukhamedov S.K., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V. Some derivatives of dinitrophenylhydraaine inhibit electron transfer in photosystem 2 of plants. Abstracts of Vth Inter. Youth Sym. on "Plant Metabolism requlation". Varna, Bulgaria, 1990, p.64. IQ.Kisselev B.A., Suponeva E.P., Zharmukhamedov S.K., Allakhverdiev S.I., Klimov V.V., Baskakov Ju.N. Polarography of some new inhibitors of electron trasfer in photosystem 2 of photosynthesis. Proc. of J.Heyrovsky Centennial Congr. on Polarography. II. Prague, 1990, p.Th-46.

11.Жармухамедов С.К., Аллахвердиев С.И., Климов В.В. Действие производных гидроксиперфторизопропилдинитрофенола на перенос электрона в фотосистеме 2 растений. Тезисы докл. междунар. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология". Пущино, 1991, с.50.

12.Klimov Y.V., Zharmukhamedov S.K., Allakhverdiev S.I. Hew phenolic inhibitors of electron transfer in photosystem II. Abstr. of 7th European Bioenergetics conf. (EBEC), Helsinki, Biochem. et Biophys. Acta., 1992, 7, 13.

13.Климов В.В., Жармухамедов С,К., Аллахвердиев С.И., Колобанова Л.П., Баскаков Ю.А. Новые фенольные ингибиторы переноса электрона в фотосистеме 2 растений. Биологические мембраны, 1992, 9, 6, 565575.

14.Климов В.В., Жармухамедов С.К., Аллахвердиев С.И., Колобанова Л.П., Баскаков Ю.А. Новая группа ингибиторов переноса электрона в фотосистеме 2. Химическая структура и эффективность ингибирования. Биологические мембраны, 1992, (в печати).

1_5Л(исилев Б.А., Супонева Е.П., Жармухамедов С.К., Климов В.В. Новая груша ингибиторов переноса электрона в фотосистеме 2. Окисли-тельно-восстановитльные свойства производных перфторизопропилдини-тробензола и их связь с эффективностью ингибирования. Биологические мембраны, 1992, (в печати).