Выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila мelanogaster

Рощина, Наталья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila мelanogaster
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila мelanogaster"

На правах рукописи

РОЩИНА Наталья Викторовна

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В КОНТРОЛЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ йКОБОРШЫ МЕЫЫОСЛБТЕК

Специальность 03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических нау

Москва 2008 год

003446843

Работа выполнена в Лаборатории геномной изменчивости Отдела молекулярной генетики клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

ПАСЮКОВА Елена Генриховна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор МИТРОФАНОВ Владимир Григорьевич

доктор биологических наук АЛЕКСАНДРОВ Игорь Донатович

Ведущая организация:

Кафедра генетики Биологического факультета Московского Государственного Университета им МВ Ломоносова

Защита состоится « / »о fc Т9 £ РЛ 2008 г в Ц часов на заседании диссертационного совета Д 002 238 01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им Н К Кольцова РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им Н К Кольцова РАН

Автореферат разослан « РР» А/К Рч С т А 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Абрамова Е Б

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Продолжительность жизни является одним из наиболее биологически и социально значимых количественных признаков организма Ограниченность продолжительности жизни и старение представляют собой универсальные явления Продолжительность жизни определяется взаимодействием генетических факторов и факторов внешней среды и может сильно отличаться в разных популяциях и у разных особей одного вида Изучение генетических факторов, лежащих в основе такой вариабельности, представляет большой интерес для понимания причин и условий, обеспечивающих высокую продолжительность жизни

В настоящее время очевидно, что генетический контроль продолжительности жизни эволюционно консервативен, что делает целесообразным проведение исследований па модельных объектах, в том числе на дрозофиле, большинство генов которой имеет ортологи у других высших эукариот Локусы, аналогичные выявленным у дрозофилы, могут играть роль в контроле продолжительности жизни и у других организмов, в том числе у человека, и анализ их может пролить свет на общие закономерности контроля продолжительности жизни у многоклеточных

В течение последних лет достигнут большой прогресс в понимании генетического контроля продолжительности жизни, в частности, благодаря тому, что выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, у одного из модельных организмов влекло за собой исследование роли этих и других, взаимодействующих с ними генов у других организмов Несмотря на очевидные достоинства такого подхода, он ограничивает спектр исследуемых генов В связи с этим по-прежнему остается актуальным поиск новых генов, не связанных с уже открытыми, но играющих важную роль в контроле продолжительности жизни Один из возможных подходов заключается в индукции случайных мутаций, другой - в индуцированном изменении экспрессии случайных генов, с последующим тестированием возникающих эффектов Однако эти методы основаны на выявлении искусственных изменений, часто -повреждений работы генов, приводящих к изменению продолжительности жизни В Лаборатории геномной изменчивости Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН разработан и используется метод, основанный на генетическом картировании и позволяющий, во-первых, искать любые новые гены по всему геному, а во-вторых, находить те из них, которые контролируют небольшие различия по исследуемому признаку, лежащие в основе изменчивости продолжительности жизни в естественных условиях (ЫигЪскп е1 а1, 1997, Раэуикоуа ег а!, 2000) Этот метод был использован и в данной работе, в

результате чего начатое ранее картирование удалось довести до выявления отдельных генов и генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни и определяющих ее изменчивость у Drosophila melanogaster дикого типа

Цель и задачи работы. Целыо работы был поиск новых генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster Работа включала несколько этапов Прежде всего, необходимо было уточнить границы некоторых из ранее выявленных протяженных районов предполагаемой локализации генов, определяющих различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа (Nuzhdin et al, 1997, Vieira et al, 2000, Pasyukova et al, 2000), до небольших участков протяженностью не более нескольких подсекций по карте политенных хромосом Далее среди генов, локализованных в этих и некоторых других из ранее картированных участков, предполагалось выявить гены-кандидаты, участвующие в контроле продолжительности жизни Наконец, следовало получить строгое доказательство участия в контроле продолжительности жизни наиболее интересных и перспективных генов-кандидатов В ходе работы предполагалось также изучить особенности влияния на продолжительность жизни мутаций по этим генам

В работе были поставлены следующие задачи 1 Провести тесты на комплементацию с делениями, перекрывающими ранее выявленные протяженные районы хромосом, в которых предположительно локализованы гены, определяющие различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа 2 Провести тесты на комплементацию с мутациями наиболее интересных генов-кандидатов 3 Подобрать во всемирной коллекции линий дрозофилы линии с мутациями, вызванными встройкой векторных конструкций в район наиболее интересных генов-кандидатов, и получить линии с реверсиями этих мутаций 4 Охарактеризовать продолжительность жизни в линиях с подобранными инсерционными мутациями и сравнить ее с продолжительностью жизни в исходных линиях без мутаций и в линиях-ревертантах.

Научная новизна работы. Для картирования генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, в работе впервые использован метод количественной комплементации с мутациями в генах-кандидатах Применение этого метода позволило выявить 7 новых генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни Роль одного из этих генов, shuttle craft, в контроле продолжительности жизни была доказана в опытах по изучению продолжительности жизни в линии с мутацией, вызванной встройкой векторной конструкции P{SUPor-P} в 5'-нетранслируемую область гена shuttle craft, и в пяти независимо полученных линиях с реверсий этой мутации Прямые доказательства участия в контроле продолжительности жизш! впервые были получены еще для

двух генов, escargot и crooked legs Описаны мутации, приводящие к увеличению продолжительности жизни

В итоге проведенной работы описаны две группы генов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни Первая группа представлена генами, кодирующими белки, необходимые для биосинтеза катехоламинов и передачи нервного импульса в нейронах {Catecholamines up, Dopa decarboxylase, Diphenol oxidase A2), вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития и функционирования мотонейронов (shuttle ci aft, tail up, Lim3, crooked legs, escargot)

Практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы при чтении курсов лекций по генетике и геронтологии в высших учебных заведениях, а также в биомедицинских исследованиях, при изучении генетического контроля продолжительности жизни и ряда болезней человека, включая неврологические, когда причиной патологии являются нарушения развития клеток нервной системы

Апробация работы. Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных семинарах и конференциях на американских ежегодных конференциях по генетике дрозофилы (Сан-Диего, США, 2002, 2008), на 4-ом съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), 20-ом международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008), на конкурсах работ молодых ученых на соискание стипендий фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, Россия, 2005, 2007)

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы в международных реферируемых изданиях

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и включает следующие главы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы. Диссертация содержит 20 таблиц, 18 рисунков и 182 литературные ссылки

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа состоит из двух частей. 1) поиск новых генов, контролирующих продолжительность жизни, 2) выбор наиболее интересных из найденных генов, окончательное доказательство их участия в контроле продолжительности жизни, а также исследование характера их влияния на изучаемый признак

Выявление новых генов, участвующих в контроле продолжительности

жизни

Первая часть работы заключалась в поиске генов, аллели которых в двух изогенных лабораторных линиях дрозофилы дикого типа (2Ь и Oregon) по-разному влияют на продолжительность жизни Ранее рекомбинационное картирование позволило выявить 5 крупных фрагментов генома, потенциально содержащих гены, различные аллели которых обусловливают разную продолжительность жизни (Nuzhdm et al, 1997, Vieira et al, 2000, Leips, Mackay, 2000, 2002) Далее, для уточнения локализации генов, влияющих на продолжительность жизни, до сравнительно небольших районов генома были использованы количественные комплементационные тесты с перекрывающимися делениями, расположенными внутри районов, выявленных с помощью рекомбинационного картирования Делеционное картирование было начато ранее (Pasyukova et al, 2000) и продолжено в ходе выполнения данной работы Наконец, для выявления генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни, в данной работе были проведены количественные комплементационные тесты с мутациями ряда генов, локализованных в выявленных с помощью делеционного картирования небольших районах генома

Суть количественных комплементационных тестов с делециямии и мутациями заключается в следующем Мы исследовали небольшие различия в продолжительности жизни, обусловленные тем, что в линиях 2Ь и Oregon присутствуют различные аллели генов-кандидатов, контролирующих этот признак Следовательно, нас интересовали те случаи, когда фенотипическая разница между аллелями гена-кандидата в двух исследуемых линиях заметна на фоне делеции (Di), захватывающей район его локализации, или мутантного аплеля (mut) , но незаметна на фоне хромосомы без делеции и на фоне аллеля дикого типа Каждая использованная в работе делеция и мутация поддерживалась в линии на фоне хромосомы-балансера (Bal), не содержащей делеций и мутаций генов-кандидатов Таким образом, в комплементационном тесте с делециями нас интересовали те случаи, когда (mut2b/Df - mut0res°7Df) f (mut2b/Bal - mut0rcgon/Bal), а в комплементационном тесте с мутациями - (mut2b/mut - mut0regon/mut) Ф (mut2b/Bal -mut°reg07Bal)

Для проведения комплементационных тестов с делециямии (мутациями) мы скрещивали мух из линий Ore и 2b с мухами из линий с делениями (мутациями) В потомстве каждого скрещивания в течение дня отбирали по 20 девственных особей каждого пола и генотипа (mut2b/Df, mut0re8°7Df, mut2b/Bal и mutOreg07Bal) и помещали в пробирки по 5 штук, самок и самцов отдельно, на стандартный корм для измерения продолжительности жизни Делеции одного района и мутации одного гена исследовали одновременно Количество живых мух в пробирке регистрировали каждый день Продолжительность жизни определяли как число прожитых данной особью дней Оставшихся в живых мух пересаживали на свежий корм каждые 5-7 дней Все культуры и скрещивания вели при 25°С

Для анализа данных о продолжительности жизни самцов (самок) четырех генотипов, появляющихся в потомстве от скрещивания 2Ь и Oregon с каждой из линий с делецией или мутацией, мы использовали двухфакторный дисперсионный анализ, рассматривая в качестве фиксированных главных факторов Линию (Л, 2Ь или Oregon) и Генотип (Г, делеция Df, мутация mut или балансер Bal) Достоверность взаимодействия двух факторов, Л*Г, то есть справедливость неравенств (mut2b/Df - mut0rego7Df) ф (mut2b/Bal - mut0rego7Bal) и (mut2b/mut -mut0reê°7mut) ф (mut2b/Bal - mut^^/Bal) служила указанием на некомплементарность, то есть на то, что ген, мутация в котором используется в опыте, имеет в линиях 2Ь и Oregon аллели, по-разному влияющие на продолжительность жизни Однако, с учетом неоднородности генетического фона в наших опытах, достоверность Л*Г может быть объяснена не только аллельными, но и эпистатическими взаимодействиями В связи с этим дополнительным критерием для отбора случаев аллельного взаимодействия служило соблюдение неравенства mut2b/Df - mutOreg07Df ф 0 при mut2b/Bal - mut0rego7Bal = 0 и соблюдение неравенства mut2b/mut - mut0re8°7mut ф 0 при mut2b/Bal - mutOrc807Bal = 0. В этом случае аллели гена-кандидата, присутствующие в линиях 2Ь и Oregon, демонстрировали достоверные различия по продолжительности жизни на фоне делеции или мутантного аллеля этого гена и отсутствие этих различий на фоне хромосомы и аллеля дикого типа Линии 2Ь и Oregon не отличаются по продолжительности жизни, поэтому мы рассматривали достоверность фактора Л как указание на некомплементарность, при условии соблюдения дополнительного критерия, описанного выше В тех случаях, когда в работе были использованы несколько мутаций одного гена, трехфакторный дисперсионный анализ, отдельно для самцов и самок, проводили также для всей совокупности данных, касающихся этого гена, рассматривая в качестве главных фиксированных факторов Линию, Генотип и Мутацию Достоверность факторов Л и Л*Г рассматривали как указание на некомплементарность, при условии соблюдения дополнительного критерия Во

всех случаях в качестве стандартного значения порога достоверности использовали Р<0,05

Мы провели делеционное картирование двух районов, 36В,38В и 6E,10D, используя линии с делециями, полученные из коллекционного центра культур дрозофилы в Блумингтоне (США) и из европейского центра культур дрозофилы в Умее (Швеция)

Мы использовали 10 делеций, перекрывающих район 36В,38В, еще 3 делеции этого района были исследованы ранее (рисунок 1) Делеции Df(2L)Sd37 и Df(2L)TW9 оказались комплементарными аллелям искомых генов в линиях 2Ь и Oregon, таким образом, левая точка разрыва делеции Df(2L)Sd37 определила правую границу значимого района, 37D2 Левую границу значимого района в подсекции 36Е4 определила левая точка разрыва Df(2L)TW50, для которой ранее также была выявлена комплементарность Таким образом, значимый район находится между 36Е4 и 37D2 Правая точка разрыва Df(2L)TW137 находится в 37В9-С1, а левая точка разрыва Df(2L)VA17 находится в 37С1-4, то есть эти делеции, возможно, не перекрываются Таким образом, по крайней мере один район локализации генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, находится между 36Е4 и 37С1, и по крайней мере еще один - между 37С1 и 37D2

В целом картина комплементации оказалась сложной. Учитывая характер перекрывания делеций, наличие или отсутствие комплементации, а также то, что часть делеций имеет эффекты у самцов, часть - у самок, а часть - и у самцов, и у самок, мы предполагаем, в качестве наиболее общей гипотезы, что гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и отвечающие за изменчивость по этому признаку, локализуются в районах 36Е4,37С1 и 37C1.37D2, причем для объяснения всех полученных результатов необходимо допустить, что в каждом районе существуют два или более генов, связанных с изучаемым признаком

Мы использовали 15 делеций, перекрывающих район 6E,10D (рисунок 1) Только одна делеция Df(l)Sxl-ra, перекрывающая участок хромосомы 6F5,7B3 по цитологической карте политенных хромосом продемонстрировала некомплементарность Эта делеция перекрывается с двумя соседними комплементарными делециями, которые ограничивают значимый район в сайте 7А6 с дистальной стороны и в сайте 7В2 с проксимальной Таким образом, локализация генов, предположительно участвующих в контроле продолжительности жизни и отвечающих за изменчивость по этому признаку, была уточнена до цитологического района 7А6,7В2

Рисунок 1. Делеиионное картирование генов, контролирующих продолжительность жизни. Показаны политенные хромосомы: X и II (плечо 2Ь), арабскими цифрами обозначены секции хромосом, пунктирными рамками показаны районы генома, выявленные ранее с помощью рекомбинационного картирования. Делеции показаны горизонтальными линиями; значимые делеции - толстыми горизонтальными линиями. В красные рамки заключены делеции, использовавшиеся в данной работе. Серым цветом обозначены выявленные ранее и в данной работе районы генома, содержащие гены-кандидаты, участвующие в контроле продолжительность жизни. (1) (2) ОД1)8х1-га/РМ7с\ (3) 0/(1)а4 Ъ1/РМ7с\ (4)

Щ1)С128/РМ7с\ (5) 0/(1)КА2/РМ7с\ (6) 0/(1)КА14/РМ7с; (7) 0/(1)1г-90Ь24/РМ7с; (8) й/(1)9а4-5/РМ7с\ (9) £>№)С52/РМ7с; (10) Щ1)у-Ы5/РМ7с; (11) Ц/(])/1Ш/РМ7с; (12) ЦГ(1)у-12/РМ7с; (13) й/(1)ЯА37/РМ7с; (14) Щ\)СА\\2/РМ7с\ (15) 0/(1)НА85/РМ7с, (16) Щ21)РН/СуО\ (17) 0/(2Ь)/пЗО/СуО; (18) 0/(2Ь)б4]/Су0; (19) 0/(2Е)/Ь7/Су0; (20) Щ2Ь)А37б/СуО; (21) I В/(2Ь)А263/СуО- (22) 0/(2Ь)А217Пп(21.ЩС1а\ (23) ЦГ(2Ь)/п5/СуО; (24) Щ2Ь)/п1/СуО; (25) 0/(2Щ245/Су0; (26) 0/(2Ь)ТЕ35ВС-8/Су0; (27) ОД2Ь^р29/СуО\ (28) Щ21)ТЕ35ВС-34/СуО\ 1 (29) 0/(2ЦТЕ35ВС-24/СуО; (30) 0/(21)ТЕ35ВС-3/Су0; (31) 0/(2Ь)Т1У137/Су0; (32) 0/(21.)УА18/Су0; (33) 0/(21)Ш50/Су0- (34) 0/(2Ь)Т№158/СуО; (35) 0/(2Ь)рг-А16/Су0; (36) В](21)УА23/СуО\ (37) й((2ЦТ\У 130/Су0\ (38) 0/(2ЦУА17/Су0\ (39) О((2ЦУА12/Су0-, (40) 0/(2Ь)УА19/СуО\ (41) 6}(2ЦЫ77/СуО\ (42) ¿¡(21Щ37/5ЬА5\ (43) Щ21)Т№9/СуО\ (44) ОД21)Т\¥161/СуО\ (45) Ъ}П1)ОШСуО.

Всего, с учетом ранее полученных результатов, было выявлено по крайней мере 14 районов хромосом, в которых локализуются гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и отвечающие за изменчивость по этому

признаку Размер выявленных районов и количество локализованных в них генов довольно сильно варьировали

В секции 35 политенных хромосом ранее было выявлено два района локализации генов, предположительно участвующих в контроле продолжительности жизни, 35B9,35C3 и 35D5.35E1 Их суммарный размер составляет около 418 тысяч пар оснований, однако количество известных и предсказанных генов невелико (31), причем только для четырех генов в коллекционных центрах культур дрозофилы можно было найти линии с мутациями, которые необходимы для количественных комплементационных тестов Было решено довести исследование районов 35B9,35C3 и 35D5.35E1 до конца и протестировать все доступные для анализа мутации расположенных в них генов shuttle craft (stc), кодирует транскрипционный фактор РНК-полимеразы II, четыре мутации, reduced (rd), функция неизвестна, одна мутация, guftagu {gft), кодирует белок, связывающий убиквитин-протеин лигазу, одна мутация, male sterile (2)35Ci (ms(2)35Ci), функция неизвестна, одна мутация

Мутации генов rd и gft оказались комплементарными аллелям этих генов в линиях 2Ь и Oregon как у самцов, так и у самок Следовательно, гены rd и gft не связаны с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях

Мутации в гене ms(2)35Ci оказалась некомплементарной аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon у самцов, но не у самок Полученные результаты указывают на то, что ген ms(2)35Ci играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а его аллели в линиях 2Ь и Oregon различны

Суммарный анализ четырех мутаций гена stc выявил достоверные различия между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни как самцов, так и самок В связи с этим целесообразно было провести анализ эффектов каждой мутации по отдельности Оказалось, что две мутации, stc6 и stck""2, некомплементарны аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon у самок Две другие мутации, stc3 и stc0544', оказались комплементарными Полученные результаты указывают на то, что ген stc играет роль в контроле продолжительности жизни у самок дрозофилы, а его аллели в линиях 2Ь и Oregon различны, однако действие stc на продолжительность жизни является аллель-специфическим Отмеггим, что исходя из ранее проведенного делеционного картирования, мы ожидали, что в районе 35B9.35C3 находятся гены, влияние которых на продолжительность жизни проявляется именно у самок

Ген stc показался нам весьма интересным и перспективным для дальнейшего исследования Отметим, что в проведенных опытах генетическое окружение исследованных мутаций было случайным Очевидно, что эпистатические взаимодействия генов могут существенно влиять на изучаемые эффекты, поскольку продолжительность жизни представляет собой сложный признак,

определяемый многими генами Статистический анализ количественного теста на комплементацию таков, что позволяет учесть эффекты генетического окружения Тем не менее, чтобы подтвердить участие гена stc в контроле продолжительности жизни, мы решили экспериментально оценить вклад генетического окружения в получаемые в комплементационном тесте результаты Для этого тесты провели в разном генетическом окружении в первом, уже описанном случае генетический фон был случайным, во втором случае вторая хромосома с мутацией stc находилась в окружении первой и третьей хромосомы изогенной линии дикого типа Samarkand (Sam, mut/Bal, Sarn, линии были получены из лаборатории Труди Маккей, Государственный университет Северной Каролины, США) Для этого опыта были также использованы специально полученные в Государственном университете Северной Каролины линии, в которых вторая хромосома линий Oregon и 2Ь находилась в окружении первой и третьей хромосомы линии Samarkand (Sam, Ore; Sam и Sam, 2b,Sam)

Полученные результаты показали, что действие мутаций stc6, stck""2, stc0544' и stc3 по-разному проявляется в разном генетическом окружении и зависит от характера мутаций

В случайном генетическом окружении эффект мутации stc6 был специфичен для самок, при этом Iblstc6 самки жили дольше, чем Ordstc6 самки В гомозиготном Sam окружении мутация stc6 также продемонстрировала некомплементарность у самок, однако продолжительность жизни Or dstc6 самок была больше, чем продолжительность жизни Iblstc6 самок В целом некомплементарность данной мутации аллелям гена stc в линиях Oregon и 2Ь была подтверждена результатами тестов в различном генетическом окружении Влияния stc6 на продолжительность жизни самцов не было обнаружено ни в одном из вариантов теста В целом полученные данные согласуются с выводом о специфичном для самок влиянии stc6 на продолжительность жизни, сила и направление которого зависят от генетического фона.

Специфичный для самок эффект мутации stck""2, наблюдавшийся в случайном генетическом окружении, не удалось статистически значимо воспроизвести в гомозиготном Sam окружении, так как размеры выборки как для Ore/Bal и 2b/Bal генотипов были сильно уменьшены в этом эксперименте, что привело к значительным потерям в силе статистического анализа Следует заметить, однако, что разница в средней продолжительности жизни между Ordstck""2 и 2blstck""2 самками была очень большой (30 дней) и достоверной В случайном генетическом окружении продолжительность жизни самок Ordstck""2 была больше, чем продолжительность жизни самок 2b /stck""2, в гомозиготном Sam окружении направление эффекта было противоположным Влияния stck""2 на продолжительность жизни самцов не было обнаружено ни в одном из

вариантов теста В целом полученные данные согласуются с выводом о специфичном для самок влиянии stck""2 на продолжительность жизни, сила и направление которого зависят от генетического фона

Значимый эффект stc3 и sic05441 на продолжительность жизни самок не был выявлен ни в случайном, ни в гомозиготном Sam окружении Значимого эффекта stc3 и Sic0544' не наблюдалось также и у самцов в случайном окружении Тем не менее, в гомозиготном Sam окружении, то есть выровненном генетическом фоне, обе мутации продемонстрировали некомплементарность аллелям гена stc в линиях 2Ь и Oregon у самцов Направление комплементационного эффекта для самцов в гомозиготном Sam окружении было одинаковым для обеих мутаций, при этом продолжительность жизни Iblstc была больше, чем продолжительность жизни Or e/stc.

Таким образом, проведенные опыты подтвердили, что stc является геном-кандидатом, участвующим в контроле продолжительности жизни, но подчеркнули, что результаты тестов на комплементацию зависят от пола особей, используемого мутантного аллеля и генетического окружения У дрозофилы stc экспрессируется в эмбрионах, у личинок, куколок и взрослых самцов и самок Экспрессия в центральной нервной системе эмбрионов необходима для нормального развития мотонейронов и роста аксонов и, как следствие, иннервации мышечных клеток (Stroumbakis et al, 1996)

Согласно современным представлениям нервная система является ключевой тканью в контроле продолжительности жизни В частности, мотонейроны либо представляют собой клетки, лимитирующие продолжительность жизни целого организма, либо регулируют продолжительность жизни, благодаря системному воздействию на другие клетки и ткани (Parkes et al, 1999) Все вышесказанное делает ген stc интересным геном-кандидатом, участвующим в контроле продолжительности жизни

В выявленных нами районах 36Е4,37С1 и 37C1,37D2 второй хромосомы также локализуются гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, связанные с развитием и функционированием нервной системы Для проведения дальнейшего мутационного картирования мы выбрали мутации трех таких генов, tup, Lim3 и Fas3

Суммарный анализ двух мутаций гена tup у самцов продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность Различия между действием разных мутаций на продолжительность жизни обнаружены не были У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген tup играет

роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2Ь и Oregon различны

Суммарный анализ двух мутаций гена Lim3 у самцов продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность Различия между действием разных мутации на продолжительность жизни обнаружены не были У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген ЬгтЗ играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2Ь и Oregon различны

Исследованная мутация гена Fas3 оказалась комплементарной аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon как у самцов, так и у самок Следовательно, ген Fas3 не связан с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях

Гены tup и Lim3 кодируют транскрипционные факторы, вовлеченные в определение идентичности серотониновых и дофаминовых нейронов Предполагается, что дифференциальная экспрессия этих генов в разных нейронах образует код, определяющий пути их узкой специализации (Thor, Thomas, 1997) Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что, кроме stc, еще два гена, tup и Lim3, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II и регулирующие развитие нервной системы, и в частности, мотонейронов, являются кандидатами на участие в контроле продолжительности жизни дрозофилы

Всего в выявленных в результате делеционного картирования районах находится несколько сотен генов-капдидатов, которые потенциально могут участвовать в контроле продолжительности жизни Для дальнейшего исследования мы выбрали гены-кандидаты, также связанные с развитием и функционированием нервной системы

Два выявленных в данной работе района, 36Е4,37С1 и 37C1.37D2, расположены вплотную друг к другу, имеют суммарный размер около 920 тысяч пар оснований и содержат около 120 генов и предсказанных генов, для 43 из которых существуют мутации, необходимые для дальнейших комплементационных тестов Мы обратили внимание на то, что в этом районе расположен так называемый Dde-кластер, в котором локализуется около 20 генов, участвующих в биосинтезе катехоламинов Катехоламины принимают участие в передаче нервного импульса, а также необходимы для правильного отвердевания и окрашивания кутикулы у мух Они влияют на плодовитость и поведение при скрещивании, циркадные ритмы, эндокринную секрецию, агрессивность, способность к обучению и память (Blenau, Baumann, 2001)

По три мутации четырех наиболее интересных генов, входящих в Ddc-кластер, были использованы для постановки количественных комплементационных тестов, позволяющих понять, участвуют ли эти гены в контроле продолжительности жизни В число исследуемых генов вошли Catecholamines up (Catsup, регулирует активность тирозингидроксилазы, катализирующей первую реакцию в цепи биосинтеза катехоламинов, превращение тирозина в ДОФА), Dopa decarboxylase (Dde, кодирует дофадекарбоксилазу, катализирующую вторую реакцию в цепи биосинтеза катехоламинов, превращение ДОФА в дофамин, основной катехоламин, участвующий в передаче нервного импульса), Diphenol oxidase А2 (Dox-A2, кодирует фенолоксидазу, катализирующую превращение дофамина в ДОФА хинон, необходимый для образования пигмента) и alpha metil dopa-resistant (amd, катализирует превращение дофамина в некоторые производные, необходимые для отвердевания кутикулы)

Суммарный анализ трех мутаций гена Catsup продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon у самцов Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность При этом достоверных различий между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни выявлено не было У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось Полученные результаты указывают на то, что ген Catsup играет роль в контроле продолжительности жизни самцов дрозофилы, а его аллели в линиях 2Ь и Oregon различны

Суммарный анализ трех мутаций гена Dox-A2 продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon у самцов Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность И в этом случае формально мутации не отличались между собой У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген Dox-A2 играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2Ь и Oregon различны.

Суммарный анализ трех мутаций гена Dde продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon и у самцов, и у самок Однако при этом достоверные различия между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни были выявлены как у самцов, так и у самок Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил некомплементарность мутаций Dde27 и Dde1"' у самцов и мутации Dde43 у самок Полученные результаты указывают на то, что ген Dde играет роль в контроле продолжительности жизни дрозофилы, а его аллели в линиях 2Ь и Oregon различны, причем действие Dde на продолжительность жизни зависит от аллеля гена и пола особей

Все три мутации гена amd, проанализированных как вместе, так и по отдельности, продемонстрировали комплементарность аллелям этого гена в линиях 2Ь и Oregon и у самцов, и у самок Следовательно, ген amd не связан с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях

Исслсдовашге молекулярного полиморфизма двух из выявленных нами генов, Dde и Catsup, в природной популяции мух Raleigh, проведенное в Государственном университете Северной Каролины, подтвердило, что эти два гена определяют изменчивость продолжительности жизни, по крайней мере, в этой популяции (De Luca et al, 2003, Carbone et al, 2006) Примечательно то, что один из значимых полиморфизмов в гене Dde затрагивает экзон, характерный для фермента, функционирующего исключительно в нервной системе

Мы обратили внимание, что в цитологическом районах 7А6,7В2, выяленном в данной работе, и в цитологическом районе 64С,65С, выявленном с помощью делеционного картирования ранее, расположены гены inactive (iav) и pale (pie), соответственно Эти гены влияют на уровень катехоламинов у дрозофилы Единственная найденная в коллекционных центрах культур дрозофилы мутация каждого из этих генов была использована для постановки теста на комплементацию Полученные результаты мутационного картирования свидетельствуют о комплементарности мутаций генов iav и pie аллелям соответствующих генов в линиях 2Ь и Oregon Следовательно, гены iav и pie не связаны с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях Можно предположить, что в районах 7А6,В2 и 64С,65С локализуются другие контролирующие продолжительность жизни гены, аллели которых различны в линиях 2Ь и Oregon

В итоге проведенной работы мы описали две группы генов-кандидатов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни Первая группа представлена генами, участвующими в биосинтезе катехоламинов и передаче нервного импульса в нейронах (Catsup, Dde, Dox-A2), вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы П, которые участвуют в контроле развития и функционирования нервной системы, в частности, мотонейронов (stc, tup, Lim3)

Доказательство участия генов ste, crol и esg в контроле продолжительности

жизни

Эксперименты по картированию позволили нам выявить гены, которые предположительно играют роль в контроле продолжительности жизни дрозофилы, так называемые гены-кандидаты Доказательство реальной вовлеченности выявленных нами генов-кандидатов в контроль продолжительности жизни представляет собой важную самостоятельную задачу, имеющую существенное

значение для пополнения наших знаний о молекулярно-генетических основах изменчивости такого важного признака как продолжительность жизни

Один из способов прямого доказательства участия какого-либо гена в контроле какого-либо признака заключается в исследовании влияния на этот признак инсерционных мутаций данного гена, вызванных встройкой в него специальных векторных конструкций, и их реверсий Считается, что если инсерция приводит к изменению изучаемого признака, а чистое вырезание вектора к реверсии по этому признаку, то ген участвует в контроле данного признака Главное преимущество этого подхода заключается в том, что выводы о влиянии на признак изменений в каком-либо гене основываются на сравнении линий, отличающихся только аллельным состоянием данного гена при полной идентичности генетического окружения

Большинство векторных конструкций имеют в своем составе маркерный ген - нормальный аллель гена white (w) Исходная линия без инсерций содержит мутацию этого гена, приводящую к белоглазости, встройка векторной конструкции детектируется по изменению цвета глаз на красный Особенностью векторных конструкций является то, что встройка их в геном остается стабильной Однако использование стандартных скрещиваний позволяет мобилизовать векторную конструкцию и вырезать ее из места встройки, что фенотипически может быть детектировано по восстановлению белоглазости и формально должно привести к реверсии инсерционной мутации Известно, однако, что вырезание может произойти неточно, так что часть гена окажется делегированной или же, наоборот, в месте встройки сохраниться часть конструкции, не содержащая маркерный ген В принципе возможна также встройка части конструкция в какой-либо другой район генома

Мы начали работу с гена stc Из коллекционного центра культур дрозофилы в Блумингтоне (США) были выписаны две линии исходная контрольная линия и линия с инсерцией векторной конструкции P{SUPor-P} в 5'-нетранслируемую область гена stc Мухи, несущие эту инсерционную мутацию в гомозиготном состояний, были жизнеспособны, что является необходимым условием использования мутации в опытах, доказывающих участие гена в контроле продолжительности жизни Из этой линии, используя стандартные скрещивания, позволяющие мобилизовать векторную конструкцию, мы получили 5 линий с реверсией маркерного фенотипа. Данные молекулярного анализа этих линий, полученные А В Симоненко и Е В Ершовой, свидетельствуют о том, что во всех 5 линиях произошло точное вырезание векторной конструкции из сайта встройки

В контрольной и мутантной линиях, а также в линиях с реверсиями, мы измерили продолжительность жизни 300 девственных самцов и 300 девственных самок Отбор мух и измерение продолжительности жизни проводили так же, как в

опытах по делеционному и мутационному картированию. Для сравнения средних значений продолжительности жизни использовали критерий Стьюдента. Было показано, что инсерция вектора не влияет на продолжительность жизни самцов, но приводит к достоверному увеличению средней продолжительности жизни самок (рисунок 2). Поскольку в результате инсерции фенотип менялся только у самок, результат реверсии тоже можно было обнаружить только у самок. Во всех линиях с чистым вырезанием вектора средняя продолжительность жизни самок достоверно отличалась от средней продолжительности жизни самок мутантной линии и не отличалась от контроля (рисунок 2). Этот вывод подтверждает и анализ выживания самок (рисунок 3). На рисунке ЗА приведены кривые выживания контрольных и мутантных самок с указанием стандартных ошибок (GraphPad Prism 4, GraphPad Software, San Diego, California, USA), масштаб которых характерен для всех полученных в работе кривых выживания. В связи с этим во всех остальных случаях кривые выживания будут приведены без указания ошибок, чтобы не загромождать рисунки. Кривая выживания мутантных самок достоверно отличается как от кривой выживания контрольных самок (Р<0,0001; тест Каплана-Мейера), так и от кривых выживания самок-ревертантов (Р<0,0001 во всех случаях), в то время как различия между контрольными самками и I самками-ревертантами недостоверны (Р=0.4784; Р=0.7472; Р=0.6234; Р=0.5789; Р=0.7496).

■ Контроль

□ Мутант

□ Ревертант 1

□ Ревертант 2

□ Ревертант 3

□ Ревертант 4

□ Ревертант 5

Рисунок 2. Средняя продолжительность жизни девственных самок контрольной линии, линии w""; sic ' ' ' и линий с реверсиями.

—♦— Контроль « Мутант Ревертант 1 Ревертант 3 —*— Ревертант 4 Ревертант 5

Рисунок 3. Кривые выживания девственных самок контрольной линии, линии w"'"; stcKC"123(1 и линий с реверсиями. А. Сравнение контрольной и мутантной линии. Б. Сравнение контрольной и мутантной линий с ревертантами.

В результате мобилизации векторных конструкций довольно редко удается добиться чистого их вырезания. Как правило, для доказательства участия гена в контроле признака приходится ограничиваться анализом одного истинного ревертанта. Получение пяти истинных реверсий мутации ^сАТ'0Ш" является

большой редкостью, и это позволило нам проанализировать связь между состоянием гена и характером признака в пяти независимых случаях По признаку «средняя продолжительность жизни самок» реверсия мутации на молекулярном уровне в пяти независимых случаях сопровождалась реверсией фенотипа Проведенный дополнительно анализ продолжительности жизни скрещивавшихся самок контрольной и мутантной линий, а также линий с реверсиями в целом подтвердил полученные выводы Направление эффекта мутации stcKGn,m в данном случае оказалось противоположным продолжительность жизни самок в линии с мутацией была ниже продолжительности жизни самок в контрольной линии и в линиях с реверсиями В одной линии с реверсией продолжительность жизни скрещивавшихся самок не вернулась к контрольному уровню Причины этого непонятны и заслуживают дальнейшего исследования В целом, несмотря на это исключение, мы считаем, что причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры гена stc и изменениями продолжительности жизни хорошо доказана Таким образом, ген stc действительно участвует в контроле продолжительности жизни

Наши коллеги из Государственного университета Северной Каролины проводили поиск линий, в которых встройка различных векторных конструкций на основе Р-элемента в случайные районы генома привела к увеличению продолжительности жизни мух В одной из найденных линий встройка векторной конструкции на расстоянии 100 пар оснований от начала структурной части гена crooked legs (crol) привела к увеличению средней продолжительности жизни самцов В другой линии встройка на расстоянии 600 пар нуклеотидов от конца структурной части гена escargot (esg) также привела к увеличению средней продолжительности жизни самцов И в том, и в другом случае мухи, несущие эту инсерционную мутацию в гомозиготном состояний, были жизнеспособны

Ген crol кодирует транскрипционный фактор РНК полимеразы II, экспрессия которого в центральной нервной системе, ножных имагинапьных дисках и слюнных железах индуцируется экдизоном (D'Avino, Thummel, 1998) В настоящее время остается, правда, неясным, какую именно роль этот ген играет в развитии и функционировании нервной системы Ген esg кодирует транскрипционный фактор РНК полимеразы II, который принимает участие в регуляции асимметричных делений нейробластов во время развития нервной системы, клеточной спецификации и формирования поведенческих реакций (Cai et al, 2001, Yagi et al, 1998) Таким образом, эти два гена так же, как гены stc, tup и L¡m3 кодируют транскрипционные факторы, участвующие в регуляции развития и функционирования нервной системы Мы решили исследовать эти гены более подробно и доказать их участие в контроле продолжительности жизни дрозофилы.

Поскольку первичная характеристика продолжительности жизни в контрольных линиях и в линиях с инсерцией векторной конструкции в районы генов crol и esg были известны, мы начали работу с получения линий-ревертантов. Из линии с инсерцией векторной конструкции в район гена crol мы получили три линии с реверсией маркерного фенотипа, а из линии с инсерцией векторной конструкции в район гена esg - семь линий. Данные, полученные A.B. Симоненко, свидетельствуют о том, что для каждого из этих генов только в одной линии произошло точное вырезание векторной конструкции из места встройки.

Мы измерили продолжительность жизни 200 девственных самцов и 200 девственных самок контрольных линий и линий с инсерцией в районы генов crol и esg. Отбор мух и измерение продолжительности жизни проводили так же, как в опытах по делеционному и мутационному картированию. Было показано, что инсерция векторной конструкции в районы генов crol и esg не повлияла на среднюю продолжительность жизни самок, но привела к достоверному увеличению средней продолжительности жизни самцов. Поскольку продолжительность жизни контрольных самок и самок с инсерционной мутацией не отличалась, эффект реверсии у мух этого пола наблюдать было невозможно. Чтобы оценить фенотипический эффект реверсии, мы сравнили продолжительность жизни 200 самцов контрольных, мутантных линии и самцов каждой из линий-ревертантов, в которых произошло чистое вырезание вектора (рисунок 4).

Контроль □ Мутант Ревертант

esg

crol

Рисунок 4. Средняя продолжительность жизни самцов контрольной линии, линий с инсерциями PÍGT1Í в районы генов ese и eroI и линий-ревертантов с чистым вырезанием.

Рисунок 5. Кривые выживания самцов контрольной линии, линий с ннсерцией векторной конструкции P1GTII в районы генов ess (А) и его/ (Б) и соответствующих линий-ревертантов с чистым вырезанием.

Средняя продолжительность жизни самцов линий-ревертантов была достоверно ниже средней продолжительности жизни самцов мутантных линий. Очевидно, что точное вырезание векторной конструкции из районов генов сто/ и esg, то есть реверсия мутаций на молекулярном уровне, сопровождалось и

реверсиями фенотипа - возвращением средней продолжительности жизни к существенно более низкому уровню, характерному для контрольных линий Этот вывод подтверждают и кривые выживания (рисунок 5), которые не отличаются у самцов исходной линии и самцов-ревертантов (Р=0,8713 для crol, Р=0,6524 для esg), в то время как кривые выживания мутантных самцов и по одному, и по другому гену достоверно отличаются от кривых выживания контрольных самцов и соответствующих самцов-ревертантов (Р<0,0001 для всех сравнений)

В целом, мы считаем, что причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры района, прилежащего к 5'-концу структурной части гена crol, а также района, прилежащего З'-концу структурной части гена esg, и изменениями продолжительности жизни хорошо доказана Встройки векторных конструкций произошли в непосредственной близости от генов, и это позволяет нам с большой долей вероятности говорить о том, что именно гены crol и esg, участвуют в контроле продолжительности жизни

В целом группа генов и генов-кандидатов, кодирующих транскрипционные факторы РНК-полимеразы И, которые участвуют в контроле развития и функционирования нервной системы (shuttle craft, tail up, Lim3, crooked legs, escargot) представляется нам весьма интересной в связи с той ролью, которую нервная система, видимо, играет в контроле продолжительности жизни

выводы

1. Комплементационные количественные тесты с делениями позволили выявить три района хромосом, 7А6,7В2, 36Е4,37С1, и 37C1,37D2, в которых находятся гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и определяющие ее изменчивость в лабораторных линиях Drosophila melanogaster дикого типа

2. Комплементационные количественные тесты с 26 мутациями 13 генов позволили выявить семь генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни и определяющих ее изменчивость в лабораторных линиях Drosophila melanogaster дикого типа: shuttle craft, tail up, Lim3, Catecholamines up, Dopa decarboxylase, Diphenol oxidase A2, male sterile (2)35Ci

3. Характер изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции P{SUPor-P} в 5'-нетранслируемую область гена shuttle craft, и в результате четырех независимо полученных реверсий этой мутации свидетельствует о том, что ген shuttle craft участвует в контроле продолжительности жизни Влияние мутаций гена shuttle craft на продолжительность жизни зависит от пола и физиологического статуса особей, а также от эпистатических взаимодействий

4. Анализ изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции PfGTl} в 3'-окружение гена escargot, и в результате полученной реверсии этой мутации доказал, что существует причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры района, прилежащего к 3'-концу структурной части гена escargot, и изменениями продолжительности жизни самцов

5. Анализ изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции P{GT1} в 5'-окружение гена crooked legs, и в результате полученной реверсии этой мутации доказал, что существует причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры района, прилежащего к 5'-концу структурной части гена crooked legs, и изменениями продолжительности жизни самцов

6. В результате проделанной работы описаны две группы генов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни Первая группа представлена генами, кодирующими белки, необходимые для биосинтеза катехоламинов и передачи нервного импульса, вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития нервной системы Drosophila melanogaster

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 De Luca М, Roshina N.Y., Geiger-Thornsberry G L, Lyman R F , Pasyukova E G, Mackay T F С Dopa decarboxylase (Ddc) affects variation in Drosophila longevity //NatureGenetics 2003 34 429-433

2. Pasyukova E G,, Roshina N.V., Mackay T F С Shuttle craft a candidate quantitative trait gene for Drosophila lifespan //AgmgCell 2004 3 297-307

3 Mackay T F С , Roshina N V., Leips J W, Pasyukova E G Complex genetic architecture of Drosophila longevity // Handbook of the Biology of Aging, Ed Masoro E, Austad S 2005 P 181-216

4 Рощина H.B., Пасюкова E Г Гены, регулирующие развитие и функционирование нервной системы, определяют продолжительность жизни Drosophilamelanogaster //Генетика 2007 43 356-362

Тезисы

1 Pasyukova Е G, Roshina N.V., Mackay Т F С Quantitative trait genes affecting longevity in Drosophila melanogaster II 43 Drosophila Research Conference San-Diego USA 2002

2 Roshina N.V., Symonenko A V, Tcybulko E A , Ershova E V, Pasyukova E G The shuttle craft locus controlling motoneuron axon guidance proves to affect Drosophila melanogaster lifespan // Diosophila Research Conference San-Diego USA 2008

3 Рощина H.B., Симоненко А В, Пасюкова E Г Ген shuttle craft, регулирующий развитие мотонейронов, участвует в контроле продолжительности жизни дрозофилы // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск Россия 2008

4 Roshina N.V., Symonenko А V, Tcybulko Е А, Ershova Е V, Pasyukova Е G The shuttle craft gene controlling axon guidance proves to affect Drosophila melanogaster lifespan // XX International Congress of Genetics Berlin Germany 2008

Подписано в печать 22 08 2008 г Печать на ризографе Тираж 120 экз Заказ № 1217 Объем 1,3 п л Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН 7718532212, г Москва, ул Маросейка, д 6/8, стр 1, т 623-08-10, \vw\v а1ГауП:2000 ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рощина, Наталья Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Drosophila melanogaster как модельный организм для изучения продолжительности жизни.

2. Негенетические факторы, влияющие на продолжительность жизни дрозофилы.

3. Генетические факторы, влияющие на продолжительность жизни дрозофилы.

3.1 Инсулин-зависимый каскад.

3.2 Деацетилирование гистонов.

3.3 JNK каскад и белки теплового шока.

3.4 Белки антиоксидантной защиты.

3.5 Экдизоновый каскад.

3.6 Гены, выявленные методом поиска случайных изменений генома, в контроле продолжительности жизни.

4. Генетический контроль развития нервной системы дрозофилы.

4.1 Структурирование брюшного нервного тяжа.

4.2 Образование нейробластов: achaete-scute гены против сигнального пути Notch.

4.3 Спецификация нейробластов.

4.4 Ассиметричные деления нейробластов.

4.5 Спецификация судьбы ганглиальной материнской клетки: временная генная сеть.

4.6 Ассиметричные деления ганглиальной материнской клетки.

4.7 Спецификация нейронов и глии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1 Линии дрозофилы.

5.2 Получение реверсий инсерционных мутаций в генах-кандидатах.

5.3 Измерение продолжительности жизни.

5.4 Статистический анализ данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

6. Стратегия исследования генетического контроля продолжительности жизни в лаборатории геномной изменчивости ИМГ РАН.

7. Выявление новых генов, участвующих в контроле продолжительности жизни.

7.1 Количественный тест на комплементацию.

7.2 Картирование генов, контролирующих продолжительность жизни, во второй хромосоме.

7.2.1 Количественные комплементационные тесты с делециями.

7.2.2 Количественные комплементационные тесты с мутациями в районах 35B9;35C3 и 35D5;35E1.

7.2.3 Количественные комплементационные тесты с мутациями в районе 36E4;37D2.

7.3 Картирование генов, контролирующих продолжительность жизни, в Х-хромосоме и третьей хромосоме.

7.3.1 Количественные комплементационные тесты с делециями.

7.3.2 Количественные комплементационные тесты с мутациями.

8. Доказательство участия генов stc, crol и esg в контроле продолжительности жизни.

8.1 Исследование инсерционных мутаций и их реверсий как способ доказательства участия гена в контроле признака.

8.2 Доказательство участия гена stc в контроле продолжительности жизни.

8.3 Доказательство участия генов crol и esg в контроле продолжительности жизни.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila мelanogaster"

Актуальность темы

Продолжительность жизни является одним из наиболее биологически и социально значимых количественных признаков организма. Ограниченность продолжительности жизни и старение представляют собой универсальные явления. Продолжительность жизни определяется взаимодействием генетических факторов и факторов внешней среды и может сильно отличаться в разных популяциях и у разных особей одного вида. Изучение генетических факторов, лежащих в основе такой вариабельности, представляет большой интерес для понимания причин и условий, обеспечивающих высокую продолжительность жизни.

В настоящее время очевидно, что генетический контроль продолжительности жизни высоко консервативен, что делает целесообразным проведение исследований на модельных объектах, в том числе на дрозофиле, большинство генов которой имеет ортологи у других высших эукариот. Локусы, аналогичные выявленным у дрозофилы, могут играть роль в контроле продолжительности жизни и у других организмов, в том числе у человека, и анализ их может пролить свет на общие закономерности контроля продолжительности жизни у многоклеточных.

В течение последних лет достигнут большой прогресс в понимании генетического контроля продолжительности жизни, в частности, благодаря тому, что выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, у одного из модельных организмов влекло за собой исследование роли этих и других, взаимодействующих с ними генов у других организмов. Несмотря на очевидные преимущества такого подхода, он ограничивает спектр исследуемых генов. В связи с этим по-прежнему остается актуальным поиск новых генов, не связанных с уже открытыми, но играющих важную роль в контроле продолжительности жизни. Один из возможных подходов заключается в индукции случайных мутаций, другой — в индуцированном изменении экспрессии случайных генов, с последующим тестированием возникающих эффектов. Однако эти методы основаны на выявлении искусственных изменений, часто - повреждений работы генов, приводящих к изменению продолжительности жизни. В Лаборатории геномной изменчивости Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН развивается метод, основанный на генетическом картировании и позволяющий, во-первых, искать любые новые гены по всему геному, а во-вторых, находить те из них, которые контролируют небольшие различия по исследуемому признаку, лежащие в основе изменчивости продолжительности жизни в естественных условиях (Nuzhdin et al., 1997; Pasyukova et al., 2000). Этот метод был использован и в данной работе, в результате чего начатое ранее картирование удалось довести до выявления отдельных генов и генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни и определяющих ее изменчивость у Drosophila melanogaster дикого типа.

Цель и задачи работы.

Целью работы был поиск новых генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster. Работа включала несколько этапов. Прежде всего, необходимо было уточнить границы некоторых ранее выявленных протяженных районов предполагаемой локализации генов, определяющих различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа (Nuzhdin et al., 1997; Vieira et al., 2000; Pasyukova et al., 2000), до небольших участков протяженностью не более нескольких подсекций по карте политенных хромосом. Далее среди генов, локализованных в этих и некоторых из ранее картированных участков, предполагалось выявить гены-кандидаты, участвующие в контроле продолжительности жизни. Наконец, следовало получить строгое доказательство участия в контроле продолжительности жизни наиболее интересных и перспективных генов-кандидатов. В ходе работы предполагалось также изучить особенности влияния на продолжительность жизни мутаций по этим генам.

В работе были поставлены следующие задачи: 1. Провести тесты на комплементацию с делециями, перекрывающими ранее выявленные протяженные районы хромосом, в которых предположительно локализованы гены, определяющие различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа. 2. Провести тесты на комплементацию с мутациями наиболее интересных генов-кандидатов. 3. Подобрать во всемирной коллекции линий дрозофилы линии с мутациями, вызванными встройкой векторных конструкций в район наиболее интересных генов-кандидатов, и получить линии с реверсиями этих мутаций. 4. Охарактеризовать продолжительность жизни в линиях с подобранными инсерционными мутациями и сравнить ее с продолжительностью жизни в исходных линиях без мутаций и в линиях-ревертантах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рощина, Наталья Викторовна

выводы

1. Комплементационные количественные тесты с делециями позволили выявить три района хромосом, 7А6;7В2, 36Е4;37С1, и 37C1;37D2, в которых находятся гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и определяющие ее изменчивость в лабораторных линиях Drosophila melanogaster дикого типа.

3. Характер изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции P{SUPor-PJ в 5'-нетранслируемую область гена shuttle craft, и в результате четырех независимо полученных реверсий этой мутации свидетельствует о том, что ген shuttle craft участвует в контроле продолжительности жизни. Влияние мутаций гена shuttle craft на продолжительность жизни зависит от пола и физиологического статуса особей, а также от эпистатических взаимодействий.

4. Анализ изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции P{GT1} в 3'-окружение гена escargot, и в результате полученной реверсии этой мутации доказал, что существует причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры района, прилежащего к 3'-концу структурной части гена escargot, и изменениями продолжительности жизни самцов.

6. В результате проделанной работы описаны две группы генов и генов-кандидатов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни. Первая группа представлена генами, участвующими в биосинтезе катехоламинов и передаче нервного импульса, вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития нервной системы Drosophila melanogaster.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В течение последних лет достигнут большой прогресс в понимании генетического контроля продолжительности жизни. Это обусловлено использование ряда подходов, которые обеспечивают возможность эффективного получения новых фактов и быстрого расширения и углубления знаний в этой области. Прежде всего, выявление каких либо генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, у одного из модельных организмов влекло за собой исследование роли этих генов у других организмов. Кроме того, уже имеющиеся из не связанных с изучением продолжительности жизни работ сведения о взаимодействии выявленных генов с разными другими генами позволяло исследовать роль последних в контроле продолжительности жизни и, таким образом, описывать значение целых генетических каскадов в определении данного признака. Именно таков был ход исследования роли генов, кодирующих белки-антиоксиданты (Parkes et al., 1998) и белки теплового шока (Morrow et al., 2000), генов инсулин-зависимого каскада (Clancy et al., 2001; Tatar et al., 2001), деацетилирования гистонов (Rogina, Helfand, 2004). Несмотря на очевидные преимущества этих подходов, они ограничивают спектр исследуемых генов. В связи с этим сохраняется актуальность поиска новых генов, не связанных очевидным образом с уже открытыми, но играющих важную роль в контроле продолжительности жизни. Поиск таких генов предполагает использование определенного метода, позволяющего протестировать весь геном или значительную его часть. Один из классических подходов заключается в индукции случайных мутаций и последующем их тестировании в отношении влияния на признак. В качестве мутагена могут быть использованы химические вещества, но в последнее время основной метод получения мутаций связан с инсерционным мутагенезом, основанным на встройке в случайные сайты генома векторных конструкций на основе мобильного Рэлемента (Ford, Tower, 2005). Другой подход заключается в изучении влияния на продолжительность жизни измененной экспрессии случайного гена. Такое изменение экспрессии также достигается в результате встройки в случайные районы генома специальных векторных конструкций, содержащих последовательности, активация которых ведет к активации и лежащих рядом генов (Ford, Tower, 2005). Все эти методы основаны, однако, на выявлении искусственных изменений, а часто — повреждений в работе генов, приводящих к изменению продолжительности жизни. Метод экспрессионных чипов позволяет находить гены, экспрессия которых различна у особей, существенно различающихся по продолжительности жизни. Однако чувствительность и избирательность этого метода пока оставляют желать лучшего. В данной работе использован метод генетического картирования, который позволяет, во-первых, искать любые новые гены по всему геному, а во-вторых, находить те из них, которые контролируют небольшие, но реально существующие и определяющие естественную изменчивость различия в продолжительности жизни (Nuzhdin et al., 1997; Pasyukova et al., 2000). Генетическое картирование как метод поиска новых генов, влияющих на продолжительность жизни (не учитывая работ, опубликованных соавторами статьи Nuzhdin et al., 1997), было использовано лишь в единственном известном нам случае (Curtsinger, Khazaeli, 2002), однако достигнутая точность картирования была низкой, и об индивидуальных генах говорить не было возможности.

В данной работе начатое ранее картирование удалось довести до выявления отдельных генов и генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни и определяющих ее изменчивость у Drosophila melanogaster дикого типа. В частности, доказано участие в контроле продолжительности жизни трех генов, shuttle craft, crooked legs и escargot. В целом группа генов и генов-кандидатов, кодирующих транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития и функционирования нервной системы (shuttle craft, tail up, Lim3, crooked legs, escargot) представляется нам весьма интересной для дальнейшего исследования в связи с той ролью, которую нервная система, видимо, играет в контроле продолжительности жизни.

Выявленные нами гены участвуют в регуляции развития нервной системы на разных его этапах. Ген esg, определяющий асимметричность деления нейробластов и ганглиальных материнских клеток, необходим на наиболее ранних стадиях формирования нервной системы. Гены tup и ЫтЗ вступают в действие тогда, когда начинается специализация уже образовавшихся нейронов. Ген stc, видимо, регулирует развитие нейронов примерно в это же время. Остается пока неясным конкретное участие в формировании нервной системы гена crol, однако можно с уверенностью предположить, что он является наиболее поздним геном, поскольку его экспрессия обнаружена не в эмбрионах, а у личинок третьего возраста. На каждом этапе нормальное развитие нервной системы определяется множеством генов, с теми или иными из них взаимодействуют esg, crol, tup, ЫтЗ и stc. Для того, чтобы разобраться в генетических механизмах контроля продолжительности жизни, важно было бы понять, какие из этого множества генов также влияют на данный признак. Далеко не все они могли быть выявлены в результате проведенного картирования. Во-первых, картирование большинства районов не было доведено до конца. Во-вторых, чувствительность количественных тестов на комплементацию могла быть недостаточной, учитывая низкую наследуемость изучаемого признака. В-третьих, проведенное картирование позволяло выявить влияние на продолжительность жизни только тех генов, аллели которых в линиях Oregon и 2Ь отличались друг от друга по влиянию на данный признак.

Исследование генетического контроля различных процессов у дрозофилы в значительной степени было сосредоточено на анализе эмбрионального развития. В результате относительно многое известно о роли отдельных генов и генных каскадов в становлении тех или иных тканей и органов, в том числе ЦНС, и относительно мало — о роли тех же генов в функционировании этих тканей и органов у взрослых особей. Это в значительной степени справедливо и для интересующих нас генов, и поэтому невозможно сказать, что именно - их роль в развитии или в последующем функционировании нервной системы — определяет их влияние на продолжительность жизни. Связь между характером работы гена в течение жизни взрослой особи и продолжительностью жизни этой особи кажется более понятной, однако нельзя исключить, что именно свойства, заложенные во время развития нервной системы, определяют продолжительность жизни.

Наконец, отметим, что гены esg, crol, tup, ЫтЗ и stc являются плейотропнами и влияют на различные процессы жизнедеятельности дрозофилы; их первичные эффекты могут не ограничиваться нервной системой. Видимо, в наибольшей степени это относится к гену crol, про который известно, что он участвует в контроле развития имагинальных дисков и метаморфоза. Метамофоз у дрозофилы регулируется гормоном экдизоном, а роль экдизонового каскада в контроле продолжительности жизни уже продемонстрирована (Simon et al., 2003). Мы не можем утверждать, что предполагаемое или доказанное участие генов esg, crol, tup, ЫтЗ и stc в контроле продолжительности жизни связано исключительно с их влиянием на нервную систему. Например, инсерционная мутация гена stc, исследованная в данной работе, жизнеспособна и, следовательно, не нарущает развитие аксонов. Каков ее первичный эффект, приводящий к изменению продолжительности жизни, пока остается загадкой. Однако и этот вопрос, и проблема взаимосвязи между нервной системой и продолжительностью жизни кажутся нам весьма интересными и заслуживающими дальнейшего изучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рощина, Наталья Викторовна, Москва

1. Кайданов Л. 3. Генетические последствия отбора по адаптивно важным признакам (в экспериментах с дрозофилой). // Дисс: на соискание уч. степени докт. биол. наук. 1982.

2. Пасюкова Е.Г., Нуждин С.В. Мобилизация ретротранспозона copia в геноме Drosophila melanogaster. II Генетика. 1992. Т. 28(4): 5-18.

3. Akam М. The molecular basis for metameric pattern in the Drosophila embryo.//Development. 1987. V. 101: 1-22.

4. Alpatov W.W., Pearl R. Experimental studies on the duration of life. XII. Influence of temperature during the larval period and adult life on the duration of the life of the imago of Drosophila melanogaster. II Am. Nat. 1929. V. 63: 37-67.

5. Anderson S.O. Enzymatic activities involved in incorporation of N-acetyl dopamine into insect cuticle during sclerotization. // Insect Biochem. 1989. V. 19: 375-382.t I?

6. Arking R. Biology of Aging: Observations and Principles. // NewYork. Prentice-Hall. 1991.

7. Arking R., Woodruff R.C. Using Drosophila in experimental aging research. // Methods in aging research, 2nd Edition edited by Yu B.P. Boca Raton, FL., CRC Press. 1999. P.145-165 .

8. Arnini C.E. Using Drosophila to teach genetics. // Genetics in the 21st centure: destiny, chance or choice. Yale-New Haven Teachers Institute. 1996. V.5.

9. Ashraf S.I., Ни X., Rote J., Ip Y.T. The mesoderm determinant Snail collaborates with related zinc-finger proteins to control Drosophila neurogenesis. // EMBO J. 1999. V.18: 6426-6438.

10. Bauer J.H., Chang C., Morris S.N.S., Hozier S., Andersen S., Waitzman J.S., Helfand S.L. Expression of dominant-negative Dmp53 in the adult fly brain inhibits insulin signaling. //PNAS. 2007. V. 104(33): 13355-13360.

11. Berdnik D., Тбгбк Т., Gonzalez-Gaitan M., Knoblich J.A. The endocytic protein alpha-Adaptin is required for numb-mediated asymmetric cell division in Drosophila. //Dev. Cell. 2002. V. 3(2): 221-231.

12. Betschinger J., Mechtler K., Knoblich J.A. The Par complex directs asymmetric cell division by phosphorylating the cytoskeletal protein Lgl. // Nature. 2003. V. 422: 326-330.

13. Birman S., Morgan В., Anzivino M., Hirsh J. A novel and major isoform of tyrosine hydroxylase in Drosophila is generated by alternative RNA processing. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269 : 26559-26567.

14. Blenau W., Baumann A. Molecular and pharmacological properties of insect bioamine receptors: lessons from Drosophila melanogaster and Apis mellifera. II Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 2001. V. 48: 13-38.

15. Bozuck A.N. DNA synthesis in the absence of somatic cell division associated with ageing in Drosophila subobscura. II Exp. Gerontol. 1972. V. 7: 147-156.

16. Brody Т., Odenwald W.F. Cellular diversity in the developing nervous system: a temporal view from Drosophila. // Development. 2002. V. 129: 37633770.

17. Buescher M., Chia W. Mutations in lottchen cause cell fate transformations in both neuroblast and glioblast lineages in the Drosophila embryonic central nervous system. //Development. 1997. V. 124 (3): 673-681.

18. Cai Y., Chia W., Yang X. A family of snail-related zinc finger proteins regulates two distinct and parallel mechanisms that mediate Drosophila neuroblast asymmetric divisions. // EMBO J. 2001. V.20: 1704-1714.

19. Chapman Т., Liddle L. F., Kalb J. M., Wolftier M. F., Partridge L. Cost of mating in Drosophila melanogaster females is mediated by male accessory gland products. //Nature (London). 1995. V. 373: 241-244.

20. Cheng J., Macon K.J., Volanakis J.E. cDNA cloning and characterization of the protein encoded by RD, a gene located in the class III region of the major histocompatibility complex. // Biochem. J. 1993. V. 294: 589-593.

21. Chu-LaGraff Q., Doe C. Neuroblast specification and formation regulated by wingless in the Drosophila CNS. // Science. 1993. V. 261: 1594-1597.

22. Clancy D.J., Gems D., Harshman L.G., Oldham S., Stocker H., Hafen E., Leevers S.J., Partridge L. Extension of life-span by loss of CHICO, a Drosophila insulin receptor substrate protein. // Science. 2001. V. 292: 104-106.

23. Clancy D.J., Gems D., Hafen E., Leevers S.J., Partridge L. Dietary restriction in long-lived dwarf flies. // Science. 2002. V. 296: 319

24. Cooper J.A., Esch F.S., Taylor S.S., Hunter T. Phosphorylation sites in enolase and lactate dehydrogenase utilized by protein kinases in vivo and in vitro. // J. Biol. Chem. 1984. V. 259: 7835-7841.

25. Cubas P., de Celis J.F., Campuzano S., Modolell J. Proneural clusters of achaete-scute expression and the generation of sensory organs in the Drosophila imaginal wing disc. // Genes Dev. 1991. V.5(6): 996-1008.

26. Curtsinger J.W., Khazaeli A.A. Lifespan, age-specificity, and pleiotropy in Drosophila. // Mechanisms of Aging and Development. 2002. V. 123: 82-93.

27. D'Avino P.P., Thummel S.C. crooked legs encodes a family of zinc finger proteins required for leg morphogenesis and ecdysone-regulated gene expression during Drosophila metamorphosis. // Development. 1998. V. 125: 1733-1745.

28. De Luca M., Rose G., Bonafe M., Garasto S., Greco V., et al. Sex-specific longevity associations defined by Tyrosine Hydroxylase-Insulin-Insulin Growth Factor 2 haplotypes on the lip 15.5 chromosomal region. // Exp. Gerontol. 2001. V. 36: 1663-1671.

29. De Luca M., Roshina N.V., Geiger-Thornsberry G.L., Lyman R.F., Pasyukova E.G., Mackay T.F.C. Dopa-decarboxylase affects variations in Drosophila longevity. // Nature Genetics. 2003. V. 34: 429-433.

30. Dingwall C., Laskey R.A. Nuclear targeting sequence a consensus? // Trends Biochem. Sci. 1991. V. 16: 478-481.

31. Doe C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. // Development. 1992. V. 116: 855863.

32. Doe C.Q., Fuerstenberg S.5 Peng C.Y. Neural stem cells: from fly to vertebrates. // J: Neurobiol. 1998. V. 36: 111-127. ■

33. Eveleth D.D., Marsh J.L. Evidence for evolutionary duplication of genes in the DOPA decarboxylase region of Drosophila. //Genetics. 1986. V. 114: 469-483.

34. Finch C.E., Ruvkun G. The genetics of aging. // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001. V. 2: 435-462.

35. Finch C.E., Tanzi R.E. Genetics of aging. // Science. 1997. V. 278: 407-411.

36. Finkel Т., Holbrook N.J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. //Nature. 2000. V. 408: 239-247.

37. Ford D., Tower J. Genetic manipulation of life span in Drosophila melanogaster. II Handbook of the Biology of Aging (6). 2005. Eds. Masoro E. J. and Austad S. N., Elsevier, Burlington. P.400-412.

38. Fowler K., Partridge L. A cost of mating in female fruitflies. // Nature. 1989. V. 338:760-761.

39. Fridell С. Y. W., Sanchez-Bianco A., Silvia B.A., Helfand S.L. Targeted expression of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) to adult neurons extends life span in the fly. // Cell Metabolism. 2005. V. 1: 145-152.

40. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. // Annu. Rev. Biochem 1995. V. 64: 97-112.

41. Garcia-Bellido A., Santamaria P. Developmental analysis of the achaete-scute system of Drosophila melanogaster. I I Genetics. 1978. V. 88: 469-486.

42. Giannakou M.E., Goss M., Junger M.A., Hafen E., Leevers S J., Partridge L. Long-lived Drosophila with overexpressed dFOXO in adult fat body. // Science. 2004. V. 305: 361.

43. Good T.P., Tatar M. Age-specific mortality and reproduction respond to adult dietary restriction in Drosophila melanogaster. II J. Insect Physiol. 2001. V. 47: 1467-1473.

44. Goodman C.S. The likeness of being: phylogenetically conserved molecular mechanisms of growth cone guidance. // Cell. 1994. V. 78: 353-356.

45. Granderath S, Klambt C. Glia development in the embryonic CNS of Drosophila. // Curr. Opin. Neurobiol. 1999. V. 9(5): 531-536.

46. Grenningloh G., Rehm E.J., Goodman C.S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. //Cell. 1991.V. 67: 45-57.

47. Griswold C.M., Matthews A.L., Bewley K.E., Mahaffey J.W. Molecular characterization of rescue of acatalesemic mutants of Drosophila melanogaster. II Genetics. 1993. V. 134: 731-788.

48. Harshman L.G. Investigation of the endocrine system in extended longevity lines of Drosophila melanogaster. II Exp. Gerontol. 1999. V. 34: 997- 1006.

49. Heitzler P., Simpson P. The choice of cell fate in the epidermis of Drosophila. // Cell. 1991. V. 64(6): 1083-1092.

50. Helfand S.L., Rogina B. From genes to aging in the Drosophila. // Advances in Genetics edited by J.C. Hall, J.C. Dunlap, T. Friedmann. Academic, San Diego. 2003. V. 49: 67-109

51. Helfand S.L. Rogina B. Genetics of aging in the fruit fly, Drosophila melanogaster. //Annu. Rev. Genet. 2003. V. 37: 329-348.

52. Helfand S.L., Rogina B. Molecular genetics of aging in the fly: Is this the end of the beginning?// BioEssays. 2003. V. 25: 134-141.

53. Hirata J., Nakagoshi H., Nabeshima Y., Matsuzaki F. Asymmetric segregation of the homeodomain protein Prospero during Drosophila development. //Nature. 1995. V. 377: 627-630.

54. Hopkins T.L., Kramer K.J. Insect cuticle sclerotization. // Annu. Rev. Entomol. 1992. V. 24: 127-222.

55. Jimenez F., Campos-Ortega J.A. Defective neuroblast commitment in mutant of the achaete-scute complex and adjacent genes of D. melanogaster. II Neuron. 1990. V. 5: 81-89.

56. Johnson Т., Lithgow G., Murakami S. Hypothesis: interventions that increase the response to stress offer the potential for effective life prolongation and increased health. //J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 1996. V. 6: 392-395.

57. Kapahi P., Zid B.M., Harper Т., Koslover D., Sapin V., Benzer S. Regulation of lifespan in Drosophila by modulation of genes in the TOR signaling pathway. // Curr. Biol. 2004. V. 14: 885-890.

58. Karpen G.H., Spradling A.C. Analysis of subtelomeric heterochromatin in the Drosophila mini chromosome Dp 1187 by single P element insertional mutagenesis. // Genetics. 1992. V.132: 737-753.

59. Kenyon C., Chang J., Gensch A., Rudner A., Tabtiang R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. // Nature. 1993. V. 366: 461-464.

60. Klass M.R. A method for the isolation of longevity mutants in the nematode Caenorhabditis elegans and initial results. // Mechanisms of Ageing and Development. 1983. V. 22(3-4): 279-286.

61. Knauf F., Rogina В., Zhang Z., Aronson P.S., Helfand S.L. Functional characterization and immunolocalization of the transporter encoded by life-extended gene Indy. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99: 14315-14319.

62. Konrad K.D., Wang D., Marsh J.L Vitelline membrane biogenesis in Drosophila requires the activity of the alpha-methyl dopa hypersensitive gene 1(2) amd in both the germline and follicle cells. // Insect Mol. Biol. 1993. V. 1: 179187.

63. Kopan R., Goate A. Aph-2/Nicastrin: an essential component of gamma-secretase and regulator of Notch signaling and Presenilin localization. // Neuron.2002. V. 33(3): 321-324.

64. Koubova J., Guarente L. How does calorie restriction work? // Genes Dev.2003. V. 17: 313-321.

65. Mackay W.J., Bewley G.C. The genetics of catalase in Drosophila melanogaster: isolation and characterization of acatalasemic mutants. // Genetics. 1989. V. 122(3):643-652.

66. Marden J.H., Rogina В., Montooth K.L., Helfand S.L. Conditional tradeoffs between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. // Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2003. V. 100: 3369-3373.

67. Martin-Bermudo M.D., Martinez C., Rodriguez A., Jimenez F. Distribution and function of the lethal of scute gene product during early neurogenesis in Drosophila. // Development. 1991. V. 113(2): 445^154.

68. Micchelli C.A., Perrimon N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. // Nature. 2006. V. 439(7075): 475-479.

69. Min K.J., Yamamoto R., Buch S., Pankratz M., Tatar M. Drosophila lifespan control by dietary restriction independent of insulin-like signaling. // Aging Cell. 2008. V. 7(2): 199-206.

70. Minois N., Khazaeli A.A., Curtsinger J.W. Locomotor activity as a function of age and life span in Drosophila melanogaster overexpressing hsp70. II Exp. Gerontol. 2001. V. 36: 1137-1153.

71. Miquel J., Lundgren P.R., Bensch K.G., Atlan H. Effects of temperature of the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. I I Mech. Ageing Dev. 1976. V. 5: 347-370.

72. Mockett R.J., Orr W.C., Rahmandar J.J., Benes J. J., Radyuk S.N. et al. Overexpression of Mn-containing superoxide dismutase in transgenic Drosophila melanogaster. //Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 371: 260-269.

73. Mockett R.J., Radyuk S.N., Benes J.J., Orr W.C., Sohal R.S. Phenotypic effects of familial amyotrophic lateral sclerosis mutant Sod alleles in transgenic Drosophila. // PNAS. 2003. V. 100(1): 301-306.

74. Morrow G., Inaguma Y., Kato K., Tanguay R.M. The small heat shock protein Hsp22 of Drosophila melanogaster is a mitochondrial protein displaying oligomeric organization. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275 : 31204-31210.

75. Morrow G., Samson M., Michaud S., Tanguay R.M. Overexpression of the small mitochondrial Hsp22 extends Drosophila life span and increases resistance to oxidative stress. // The FASEB Journal. 2004. V. 18: 598-599.

76. Mourikis P., Hurlbut G.D., Artavanis-Tsakonas S. Enigma, a mitochondrial protein affecting lifespan and oxidative stress response in Drosophila. // PNAS. 2006. V. 103(5): 1307-1312.

77. Neckameyer W.S., Quinn W.C. Isolation and characterization of the gene for Drosophila tyrosine hydroxylase. // Neuron . 1989 V. 2: 1167-1175.

78. Neckameyer W.S., White K. Drosophila tyrosine hydroxylase is encoded by the pale locus. // J. Neurogenet. 1993. V. 8: 189-199.

79. Nuzhdin S.V., Pasyukova E.G., Dilda C.L., Zeng Z.B., Mackay T.F.C. Sex-specific quantitative trait loci affecting longevity in Drosophila melanogaster. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94: 9734-9739.

80. Oikawa S., Nakozato H., Kozaki G. Primary structure of human carcinoemryonic antigen (CEA) deduced from cDNA sequence. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 142: 511-518.

81. Orr W.C., Mockett R.J., Benes J.J., Sohal R.S. Effects of overexpression of Cu-Zn and Mn superoxide dismutases, catalase and thioredoxin reductase genes on longevity in Drosophila melanogaster II J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (29): 26418-26422.

82. Pasyukova E.G., Vieira C., Mackay T.F.C. Deficiency mapping of quantitative trait loci affecting longevity in Drosophila melanogaster. II Genetics. 2000. V. 156: 1129-1146.

83. Pasyukova E.G., Roshina N.V., Mackay T.F.C. Shuttle craft: a candidate quantitative trait gene for Drosophila lifespan. // Aging Cell. 2004. V.3: 297-307.

84. Parkes T.L., Elia A.J., Dickson D., Hilliker A.J., Phillips J.P., Boulianne G.L. Extention of Drosophila lifespan by overexpression of human sodl in motoneurons.//Nature Genetics. 1998. V. 19: 171-174.

85. Parkes T.L., Hilliker A.J., Phillips J.P. Motoneurons, reactive oxygen, and life span in Drosophila. // Neurobiology of Aging. 1999. V. 20: 531-535.

86. Partridge L., Farquhar M. Sexual activity reduces lifespan of male fruitflies. //Nature. 1981. V. 294: 580-582.

87. Partridge L., Fowler K. Non-mating costs of exposure to males in female Drosophila melanogaster. II J. Insect Physiology. 1990. V. 36: 419-425.

88. Partridge L., Fowler K., Trevitt S., Sharp W. An examination of the effects of males on the survival and egg-production rates of female Drosophila melanogaster. II J. Insect Physiol. 1986. V. 32: 925-929.

89. Paul A., Belton A., Naq S., Martin I., Grotewiel M.S., Duttaroy A. Reduced mitochondrial SOD displays mortality characteristics reminiscent of natural aging. //Mech. Ageing Dev. 2007. V. 128 (11-12): 706-716.

90. Pearl R., Parker S.L. Experimental studies on the duration of life I. Introductory discussion of the duration of life in Drosophila. // Am. Nat. 1921. V. 60:481-509.

91. Pearl R., Parker S.L. Experimental studies on the duration of life. II. Hereditary differences in duration of life in line-breed strains of Drosophila. // Am. Nat. 1922. V. 56: 174-187.

92. Pearl R., Parker S.L., Gonzalez B.M. Experimental studies on the duration of life. VII. The Mendelian inheritance of duration of life in crosses of wild type and quintuple stocks of Drosophila melanogaster. II Am. Nat. 1923. V. 57: 153-192.

93. Pearl R. The rate of living being an account of some experimental studies on the biology of life duration. // Univ. London Press, London. 1928.

94. Phillips J.P., Campbell S.D., Michaud D., Charbonneau M., Hilliker A.J. A null mutation of cSOD in Drosophila confers hypersensitivity to paraquat and reduced longevity. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86: 2761-2765.

95. Phillips J.P., Parkes T.L, Hilliker AJ. Targeted neuronal gene expression and longevity in Drosophila. // Experimental Gerontology. 2000. V. 35: 11571164.

96. Restifo L.L., White K. Molecular and genetic approaches to neurotransmitter and neuromodulator systems in Drosophila. // Adv. Insect Physiol. 1990. V. 22: 116-219.

97. Rezende L.J., Cordeiro M. N., Oliveira E. В., Diniz C.R. Isolation of neurotoxic peptides from the venom of the 'armed' spider Phoneutria nigriventer. II Toxicon. 1991. V. 29: 1225-1233.

98. Rice W. R. Sexually antagonistic male adaptation triggered by experimental arrest of female evolution. //Nature (London). 1996. V. 381: 232-234.

99. Rogina В., Helfand S.L. Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction. // PNAS. 2004. V. 101(45): 15998-16003.

100. Rogina В., Helfand S.L., Frankel S. Longevity regulation by Drosophila Rpd3 deacetylase and caloric restriction. // Science. 2002. V. 298 (5599): 1745

101. Rogina В., Reenan R.A., Nilsen S.P., et al. Extended life-span conferred by cotransporter gene mutations in Drosophila. // Science. 2000. V. 290: 2137-2140.

102. Rolls M.M., Albertson R., Shih H.P., Lee C.Y., Doe C.Q. Drosophila aPKC regulates cell polarity and cell proliferation in neuroblasts and epithelia. // J. Cell Biol. 2003. V. 163: 1089-1098.

103. Rose M. Laboratory evolution of postponed senescence in Drosophila melanogaster. //Evolution. 1984. V. 38:1004-1009.

104. Rose M., Charlesworth B. A test of evolutionary theories of senescence. 11 Nature. 1980. V. 287: 141-142.

105. Rose M., Charlesworth B. Genetics of life history in Drosophila melanogaster. II. Exploratory selection experiments. // Genetics. 1981. V. 97:187196.

106. Ruan H., Tang X.D., Chen M.L., Joiner M.L., Sun G., Brot N. High-quality life extension by the enzyme peptide methionine sulfoxide reductase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99: 2748-2753.

107. Safrany G., Perry R.P. Transcription factor RFX1 helps control the promoter of the mouse ribosomal protein-encoding gene rpL30 by binding to it's a-element. // Gene. 1993. V. 132: 279-283.

108. Schmid A., Chiba A., Doe C.Q. Clonal analysis of Drosophila embryonic neuroblasts: neural cell types, axon projections and muscle targets. // Development. 1999. V. 126: 4653-4689.

109. Seong K.H., Matsuo Т., Fuyama Y., Aigaki T. Neural-specific overexpression of Drosophila plenty of sh3s (dposh) extends the longevity of adult flies. //Biogerontology. 2001. V. 2: 271-281.

110. Service P. M., Vossbrink R.E. Genetic variation in "first" male effects on egg laying and remating by female Drosophila melanogaster. II Behav. Genet. 1996. V.26: 39-48.

111. Shen C.P., Jan L.Y., Jan Y.N. Miranda is required for the asymmetric localization of Prospero during mitosis in Drosophila. // Cell. 1997. V. 90: 449458.

112. Siddique Т., Nijhawan D., Hentati A. Molecular genetic basis of familial ALS. // Neurology. 1996. V 47: 527-534.

113. Siegrist S.E., Doe C.Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. // Development. 2006. V.133: 529-536.

114. Simon A.F., Shih C., Mack A., Benzer S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. II Science. 2003. V. 299 (5611): 1407-1410.

115. Simonsen A., Cumming R.C., Brech A., Isakson P., Schubert D. R., Finley K. D. Promoting basal levels of autophagy in the nervous system enhances longevity and oxidant resistance in adult Drosophila. // Autophagy. 2008. V. 4:176-184.

116. Skeath J.B., Carroll S.B. Regulation of proneural gene expression and cell fate during neuroblast segregation in the Drosophila embryo.// Development. 1992. V. 114(4): 939-946.

117. Skeath J.B., Panganiban G.F., Carroll S.B. The ventral nervous system defecetive gene controls proneural gene expression at two distinct steps during neuroblast formation in Drosophila.//Development. 1994. V. 120(6): 1517-1524.

118. Skeath J.B., Thor S. Genetic control of Drosophila nerve cord development. // Curr. Opin. Neurobiol. 2003. V. 13: 8-15.

119. Smeets W.J.A.J., Reiner A. Phylogeny and development of catecholamine systems in the central nervous system of vertebrates. // New York. Cambridge University Press. 1994.

120. Smith J.M. The effects of temperature and of egg laying on the longevity of Drosophila subobscura. II J. Exp. Biol. 1958. V. 35: 832-842.

121. Smith J.M. The causes of ageing. I I Proc. R. Soc. London. Ser.B. 1962. V. 157: 115-127.

122. Sohal R.S. The rate of living theory: a contemporary interpretation. // Insect Aging: Strategies and Mechanisms edited by Collatz K.G, Sohal R.S. Berlin. Springer-Verlag. 1986.

123. Sohal R.S., Buchan P.B. Relationship between physical activity and life span in the adult housefly, Musca domestica. //Exp. Gerontol. 1981.V. 16: 157-162.

124. Sohal R.S., Weindruch R. Oxidative stress, caloric restriction, and aging. // Science. 1996. V. 273:59-63.

125. Spana E.P., Doe C.Q. Numb antagonizes Notch signaling to specify sibling neuron cell fates. //Neuron. 1996. V. 17: 21-26.

126. Spencer C.C., Howell C.E., Wright A.R., Promislow D.E.L. Testing an 'aging gene' in long-lived Drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. // Aging Cell. 2003. V. 2: 123-130.

127. Stathakis D.G., Pentz E.S., Freeman M.E., Kullman J., Hankins G.R., et al. The genetic and molecular organization of the Dopa decarboxylase gene cluster of Drosophila melanogaster. II Genetics. 1995. V. 141: 629-655.

128. Stroumbakis N.D., Li Z., Tolias P.P. A homolog of human transcription factor NF-X1 encoded by Drosophila shuttle craft gene is required in the embryonic central nervous system. // Molecular and Cellular Biology. 1996. V.16: 192-201.

129. Sun J., Folk D., Bradley T.J., Tower J. Induced overexpression of mitochondrial Mn-superoxide dismutase extends the life-span of adult Drosophila melanogaster. II Genetics. 2002. V.161(2): 661-672.

130. Sun J., Molitor J., Tower J. Effects of simultaneous over-expression of Cu/ZnSOD and MnSOD on Drosophila melanogaster life span. // Mechanisms of Ageing and Development. 2004. V. 125: 341-349.

131. Sun J., Tower J. FLP recombinase-mediated induction of Cu/Zn-superoxide dismutase transgene expression can extend the life span of adult Drosophila melanogaster flies. //Molecular Cell Biology. 1999. V. 19(1): 216-228.

132. Symphorien S., Woodruff R.C. Effect of DNA repair on aging of transgenic Drosophila melanogaster: I. mei-41 locus. // The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 2003. V. 58: 782-787.

133. Sze J.Y., Victor M., Loer C., Shi Y., Ruvkun G. Food and metabolic signaling efects in Caenorhabditis elegans serotonin synthesis mutant. // Nature. 2000. V. 403: 560-564.

134. Tatar M., Khazaeli A.A., Curtsinger J.W. Chaperoning extended life. // Nature. 1997. V. 390: 30.

135. Tatar M., Kopelman A., Epstein D., Tu M.P., Yin C.M., Garofalo R.S. A mutant Drosophila insulin receptor homolog that extends life-span and impairs neuroendocrine function. // Science. 2001. V. 292:107-110.

136. Tatar M., Yin C.M. Slow aging during insect reproductive diapause: Why butterflies, grasshoppers and flies are like worms. // Exp. Gerontol. 2001. V.36: 723-738.

137. Thor S. Thomas J.B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. //Neuron. 1997. V.18: 397-409.

138. Thor S., Thomas J. B. Motor neuron specification in worms, flies and mice: conserved and "lost" mechanisms // Curr. Opinion Gen Dev. 2002. V. 12. P. 558564.

139. Thor S., Andersson S. G. E., Tomlinson A., Thomas J. B. A LIM-homeodomain combinatorial code for motor neuron pathway selection // Nature. 1999. V. 397. P. 76-80.

140. Tolias P.P., Stroumbakis N.D. The Drosophila zygotic lethal gene shuttle craft is required maternally for proper embryonic development. // Dev. Genes Evol. 1998. V. 208:274-282.

141. Trout W.E., Kaplan W.D. A relation between longevity, metabolic rate, and activity in Shaker mutants of Drosophila melanogaster. //Exp. Gerontol. 1970. V. 5: 83-92.

142. Van Vactor D., Sink H., Fambrough D., Tsoo R., Goodman C.S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. // Cell. 1993. V. 73: 1137-1153.

143. Vie A., Cigna M., Toci R., Birman S. Differential regulation of Drosophila tyrosine hydroxylase isoforms by dopamine binding and cAMP-dependent phosphorylation. //J.Biol. Chem. 1999. V. 274(24): 16788

144. Vieira C., Pasyukova E.G., Zeng Z.B., Hackett J.B., Lyman R.F., Mackay T.F.C. Genotype-environment interaction for quantitative trait loci affecting life span in Drosophila melanogaster. II Genetics. 2000. V. 154: 213-227.

145. Villares R., Cabrera C.Y. The achaete-scute gene complex of D. melanogaster: conserved domains in a subset of genes required for neurogenesis and their homology to туе. II Cell. 1987. V. 50(3): 415-424.

146. Walker G.A., Lithgow G.J. Lifespan extension in C. elegans by a molecular chaperone dependent upon insulin-like signals. // Ageing Cell. 2003. V. 2: 131139.

147. Walker D.W., Hajek P., Muffat J., Knoepfle D., Cornelison S., Attardi G., Benzer S. Hypersensitivity to oxygen and shortened lifespan in a Drosophila mitochondrial complex II mutant. // PNAS. 2006. V. 103 (44): 16382-16387.

148. Wang M.C., Bohmann D., Jasper H. JNK signaling confers tolerance to oxidative stress and extends lifespan in Drosophila. // Developmental Cell. 2003. V. 5(5): 811-816.

149. Wang M.C., Bohmann D., Jasper H. INK extends life span and limits growth by antagonizing cellular and organism-wide responses to insulin signaling. // Cell. 2005. V. 121: 115-125.

150. Wang X.Z., Grammatikakis N, Siganou A., Stevenson M.A., Calderwood S.K. Interactions between Extracellular Signal-regulated Protein Kinase 1, 14-3-3, and Heat Shock Factor 1 during Stress. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279: 4946049469.

151. Watson S., Arkinstall S. The G-protein linked receptor facts book. // London. Academic Press. 1994.

152. West A.P., Llamas L.L., Snow P.M., Benzer S., Bjorkman P.J. Crystal structure of the ectodomain of Methuselah, a Drosophila G protein-coupled receptor associated with extended lifespan. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98: 3744-3749.

153. Wodarz A., Ramrath A., Grimm A., Knust E. Drosophila atypical protein kinase С associates with Bazooka and controls polarity of epithelia and neuroblasts.//J. Cell Biol. 2000. V. 150: 1361-1374.

154. Wright T.R.F. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization and melanization in Drosophila melanogaster. II Adv. Genet. 1987. V. 24:127-222.

155. Wright T.R.F. Phenotypic analysis of the Dopa decarboxylase gene cluster mutants in Drosophila melanogaster. II J. Hered. 1996. V. 87: 175-190.

156. Yagi Y., Suzuki Т., Hayashi S. Interaction between Drosophila EGF receptor and vnd determines three dorsoventral domains of the neuroectoderm. // Development. 1998. V. 125(18): 3625-3633.

Информация о работе

Рощина, Наталья Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila мelanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы