Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление генов дифференциально экспрессирующихся при регенерации планарий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богданова, Екатерина Андреевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.ШЕМЯКИНА И Ю.ОВЧИННИКОВА

Богданова Екатерина Андреевна

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ПРИ

РЕГЕНЕРАЦИИ ПЛАНАРИЙ.

специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель академик РАН Свердлов Е.Д.

Москва, 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 4

1.1. Типы репаративной регенерации 4

1.2. Планарии как модельный объект при иссследованиях регенерации 5

1.2.1. Морфологические и функциональные особенности пресноводных 5 планарий

1.2.2. Общие аспекты регенерации планарии 6

1.3. Молекулярно- биологические иследования регенерации (Методы 9 идентификации регуляторных генов и их применение к исследованию регнерации)

1.3.1. Методы, основанные на мутационном анализе 9

1.3.2. Поиск генов с использованием их эволюционного-.консерватизма 11

1.3.3. Ограничения методов поиска генов, основанных на их эволюционном 20 консерватизме

1.3.4. Методы прямого поиска дифференциально экспрессируюгцихся генов 23

1.4. Заключение 27

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 28

2.1. Модельный эксперимент 29

2.2. Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями 30 специфически экспрессирующимися в ходе регенерации различной полярности

2.2.1. Стратегия вычитающей гибридизации 31

2.2.2. Получение образцов амплифицированной кДНК из регенерационных 33 бластем планарии

2.2.3. Приготовление образцов кДНК трейсера и драйвера 34

2.2.4. Вычитающая гибридизация 34

2.3. Дифференциальный скрининг 35

2.3.1. Описание метода in vitro клонирования 35

2.3.2. Применение клонирования in vitro для анализа образцов кДНК, 35 обогащенных последоватльностями специфическими для регенерации различной полярности

2.4. Структура выделенных фрагментов 37

2.4.1. Нозерн-блот гибридизация 38

2.4.2. Выявление полной кодирующей последовательности кДНК гена scarf 39

2.4.3. Анализ структуры гена scarf 39

2.4.4. Scarf - представитель новой группы лектинов С-типа 42

2.5. Анализ экспрессии генов scarf и collar в теле нерегенерирующих 43 планарии

2.5.1. Whole mount in situ гибридизация 43

2.5.2. Анализ распределения мРНК выделенных генов вдоль дорсо- 45 вентральной оси

2.5.3. RT-ПЦР анализ 46

2.6. Анализ экспрессии генов scarf и collar в ходе регенерации 47 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 52

3.1. Оборудование и материалы 52

3.2. Методы исследования 56 ВЫВОДЫ 66 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 67 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 68

ВВЕДЕНИЕ

Одно из важнейших свойств живых существ - способность восстанавливать целостность организма после ранения или утраты части тела. Это свойство может быть обнаружено у самых разных животных - от простейших до высших млекопитающих. В отличиии от большинства систематических групп животных, являющихся модельными объектами биологии развития, пресноводные планарии обладают способностью к восстановлению утраченного паттерна даже из небольших фрагментов тела и являются удобным объектом для изучения генетических основ репаративной регенерации.

Одним из наиболее эффективных подходов к пониманию механизмов регенерационных процессов является исследование генов, контролирующих эти процессы.

Целью представляемой работы была идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся в ходе регенерации различной полярности (восстановление головной или хвостовой недостающей части тела) и могущих служить генетическими маркерами при изучении процесса восстановления нового паттерна. Для решения этой задачи мы применили стратегию вычитающей гибридизации. В результате нами были сконструированы библиотеки кДНК, обогащенные последовательностями, специфичными для регенерационных почек различной полярности. В ходе дифференциального скрининга этих библиотек было выявлено два гена (названные нами scarf и collar ), специфических для постериорной регенерации. Анализ структуры идентифицированных генов показал, что последовательность гена scarf соответствует белковому продукту, относящемуся к новому семейству лектинов С-типа. Были проведены исследования экспрессии выявленных генов в интактных и регенерирующих планариях.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Типы репаративной регенерации

Способность восстанавливать целостность организма после ранения или утраты ткани является фундаментальным свойством живых существ. Она может быть обнаружена во всех разветвлениях филогенетического древа - от простейших до высших млекопитающих - и в ходе всего онтогенеза - от раннего дробящегося эмбриона до самых старших представителей популяции. Являясь одной из защитных реакций организма на повреждающее действие среды, репаративная регенерация может быть хорошо выражена, если она важна для выживания вида, слабой, если ее значение невелико, или полностью отсутствовать, если она неэффеективна, или у вида имеется другой более действенный способ избежать повреждений [1].

Уже в XVIII веке, в период первоначального расцвета экспериментальной биологии, регенерация привлекла внимание исследователей [2]. Открытие и описание восстановления конечности речного рака Реомюром (1712 г.) и регенерации гидры Трамбле (1742 г.) поставили регенерацию в фарватер научной мысли того времени. В XIX веке интерес к регенерации несколько упал и возник вновь лишь в начале нашего столетия. Изучение регенерации стало разделяться на два основных направления, одно из них имело медицинский уклон и касалось вопросов репаративной регенерации в поврежденных тканях млекопитающих, другое представляло собой исследование фундаментальных основ восстановительных процессов с широким выбором модельных объектов, включая регенерацию у низших позвоночных и беспозвоночных животных.

Начиная с работ Т.Моргана [3], принято различать два способа регенерации: эпиморфоз и морфолаксис. Под эпиморфозом понимается регенерация путем образования регенерационной почки (бластемы), из материала которой в дальнейшем формируется недостающая часть животного. Второй способ регенерации - морфолаксис - предполагает перестройку оставшейся после повреждения части тела и формирование новой организации. В настоящее время считается, что регенерация, происходящая путем эпиморфоза, сопровождается и морфолаксисом, а при морфолаксисе частично имеет место и эпиморфная регенерация [4]. Большинство регенерационных процессов, таких как восстановление придатков (конечностей, хвоста, плавников) у низших

позвоночных, а так же головного и/или хвостового отделов у беспозвоночных животных, способных к репаративной регенерации, протекает через образование регенерационной бластемы. Сразу после ампутации происходит сокращение тканей в области раны и миграция эпидермальных клеток с края раны на раневую поверхность с образованием раневого эпидермиса. Под раневым эпидермисом скапливаются недифференцированные клетки, которые пролиферируют и образуют регенерационную бластему. В дальнейшем происходит рост бластемы и деффиренцировка ее клеток с образованием утраченных тканей и структур. Сформированный регенерат имеет меньшие размеры, чем исходная ампутированная часть, но через некоторое время достигает размеров исходного органа.

Морфолаксис, заключающийся в реорганизации оставшейся части животного в целый организм, обнаружен у ряда беспозвоночных - планарий, некоторых гидроидов, полихет [5-7].

1.2. Планарии как модельный объект при исследованиях регенерации

Одним из классических модельных объектов при изучении регенерации стали пресноводные планарии (Р1а1уЬе1т1п1е5, ТигЬеПапа, Тпс1асНс1а), уже более двухсот лет привлекающие исследователей своей исключительной способностью к восстановлению утраченного паттерна практически из любых участков тела как путем эпиморфоза так и морфолаксиса [8].

1.2.1. Морфологические и функциональные особенности пресноводных планарий

Пресноводные планарии являются бесполостными трехслойными билатеральносимметричными организмами с передне-задней полярностью и централизованной нервной системой, представленной мозговым ганглием, продольными нервными стволами и органами чувств. Пищеварительная система состоит из глотки и слепо заканчивающегося трехветвистого кишечника. Паренхима, заполняющая пространство между однослойным ресничным эпидермисом и кишкой и окружающая внутренние органы, состоит из нескольких типов дифференцированных

непролиферирующих клеток (около 75-80% всех клеток), которые постепенно замещаются в течение жизни особи [9], и особого класса недифференцированных делящихся мультипотентных стволовых клеток, именуемых необластами (приблизительно 20-30% от общего числа клеток) [10,11]. Популяция необластов поддерживается путем пролиферации и дает начало дифференцированным клеткам всех типов [12-15].

1.2.2. Общие аспекты регенерации планарии

Эпитализация раны и начало восстановительных процессов

После ампутации части тела планарии вокруг раны быстро стягиваются (вследствие сокращения подлежащих кольцевых и продольных мышц), и начинается эпителизация раны. Эпидермальные клетки уплощаются, мигрируют с края раны на раневую поверхность, и рана оказывается закрыта слоем растянувшегося старого эпидермиса [8]. На этой стадии происходят эпителиально-мезенхимные взаимодействия, которые, по мнению ряда авторов, могут играть значительную роль в регуляции восстановительных процессов [9]. Предполагается, что раневой эпидермис важен для поддержания клеточной пролиферации и запуска начальных стадий формирования паттерна. В свою очередь мезодерма, по-видимому, поддерживает целостность эпидермиса. По некоторым данным [16], покрытие разреза раневым эпидермисом происходит ассиметрично в случае регенерации различной полярности (дорсальный эпителий затягивает рану при регенерации передних структур, вентральный - при регенерации задних), что позволяет предположить участие раневого эпидермиса в поддержании передне-задней полярности. Роль эпителиально-мезенхимных взаимодействий в регенерации планарии до сих пор, однако, не доказана. Использование потенциальных ингибиторов таких взаимодействий (цитохалазин В, конканавалин А) и индукция лишних структур с помощью барьерных прокладок не дали ясного ответа [9].

Формирование бластемы

Под раневым эпидермисом скапливаются недифференцированные клетки, число которых увеличивается за счет клеточных делений в подлежащей паренхиме. На вторые сутки регенерации это скопление - регенерационная бластема - становится внешне заметным благодаря своей непигментированности. В последующие дни бластема экспоненциально растет в размере и количестве клеток, причем клетки самой бластемы не делятся. С помощью флюоресцентных маркеров было показано, что рост бластемы обеспечивается иммиграцией клеток, образованных в результате клеточных делений в прилежащих старых тканях (постбластеме) в пределах 500 мкм от уровня разреза [17].

Вопрос о происхождении и механизмах формирования бластемы в ходе регенерации планарий вызвал в свое время многочисленные споры и до сих пор далек от своего разрешения. Существует ряд гипотез о клеточных источниках формирования бластемы:

Наиболее и распространенным является представление о происхождении регенерирующих тканей планарий из необластов [18]. По мнению ряда авторов [19], необласты являются единственным типом клеток планарии, обладающим способностью к митотическим делениям и никакие другие клетки планарии не способны к делению. Последователями этой точки зрения предлагаются два возможных механизма формирования бластемы [9,11]:

По теории миграции необластов [20,21] клетки, формирующие бластему первого дня регенерации, - это необласты мигрирующие из удаленных от раны районов. Необласты скапливаются у раневой поверхности, начинают делиться и формируют бластему. Авторы утверждают, что в первые 24 часа регенерации пролиферация необластов в районах прилегающих к раневой поверхности практически отсутствует.

Наблюдения Betchaky [22] необластов in vitro позволили предположить, что одной миграции необластов недостаточно для формирования ранней бластемы к концу первых суток регенерации и бластема формируется, в основном, за счет необластов, пролиферирующих около раны. Используя новую методику для окраски и подсчета

делящихся клеток, Е^ипа [23,24] обнаружил увеличение митотической активности необластов в районе раны уже через один час после операции. Е^ипа считает, что обнаруженная им ранняя локальная пролиферация необластов является достаточно интенсивной для формирования бластемы к концу первых суток регенерации.

Ряд авторов ставит существование необластов под сомнение. По их мнению [2528], бластема формируется за счет локальной клеточной дедифференцировки прилежащих к раневой поверхности специализированных клеток. В процессе дедифференцировки специализированные клетки теряют свои специфические черты, включаются в состав бластемы, и в последующем редифференцируются в различные клеточные типы [28-30]. По данным этих авторов к дедифференцировке в теле планарии способны, например, железистые клетки кишечника [25,26] и гаметогонии [30]. Например, описаны переходные формы железистых клеток, выходящие из кишечной стенки в паренхиму, но связанные с кишечником цитоплазматическим отростком, напоминающем "ножку" [25,26]. По мнению авторов, эти клетки обеспечивают пополнение популяции недифференцированных клеток как у интактных планарий, так и вблизи от раневой поверхности.

Согласно еще одной теории, бластема формируется частично за счет необластов, частично - за счет дедифференцировки клеток [31,32]. Предполагается, что дедифференцированные клетки мигрируют вместе с необластами к раневой поверхности и принимают участие в формировании бластемы.

Организация и рост бластемы. Дифференцировка новых структур и возникновение нового паттерна

Ранняя регенерационная бластема планарий состоит преимущественно из мелких недифференцированных клеток. В течение 1-2 дня регенерации клетки бластемы расположены компактно и упорядоченно [33]. В ходе восстановительных процессов клетки бластемы дифференцируются в различные типы специализированных клеток. Так на 2-4 день после операции начинается регенерация эпидермиса из мигрирующих паренхимных клеток-рабдитов. Эти клетки пересекают базальную мембрану и встраиваются между старыми эпидермальными клетками [9]. На клеточном уровне подробно описаны так же процессы дифференцировки клеток бластемы в

мышечные [14,33], нервные [12,34] и соединительнотканные клетки (фиксированные клетки паренхимы) [35].

Параллельно с процессами дифференцировки клеток бластемы, в области бластемы и постбластемы формируются новые структуры. Таким образом, восстанавливается утраченный морфологический паттерн.

1.3. Молекулярно - биологические иследования регенерации. Методы идентификации регуляторных генов и их применение к исследованию регнерации

С помощью световой и электронной микроскопии, хирургических операций и т.д. восстановительные процессы были подробно исследованы на морфологическом, гистологическом и цитологическом уровне, биохимические исследования выявили ряд факторов, оказывающих активирующее или подавляющее влияние на ход регенерации у различных систематических групп животных, но ответить на вопрос о механизмах этих процессов с помощью методов классической биологии развития оказалось затруднительно [2].

В настоящее время, одним из самых эффективных путей к пониманию механизмов биологических процессов является путь выявления и изучения генов, вовлеченных в регуляцию этих процессов.

Для идентификации генов, обладающих регуляторными функциями, в настоящее время применяется ряд методов, которые можно условно подразделить на две группы: 1) анализ функций генов путем изучения природных мутаций и создания различных мутантов с инактивированными генами; 2) поиск молекулярных детерминант, отличающих различные функциональные состояния клетки.

1.3.1. Методы, основанные на мутационном анализе

Методы, основанные на мутационном анализе, позволили достичь наибольшего прогресса при исследованиях развития плодовой мушки ОгозоркИа melanogaster. В геноме дрозофилы был выявлен ряд генных семейств, ответственных за различные этапы эмбрионального развития. Успех этих исследований во многом определился

благодаря наличию многочисленных подробно охарактеризованных мутантных линий дрозофилы, включая мутации, специфически нарушающие ранний эмбриогенез [36-38].

В литературе описано несколько мутаций, затрагивающих регенерационные процессы. Это, прежде всего, мутация Short toes (короткие пальцы) аксолотля, нарушающая развитие конечности. Показано, что у мутантных животных после ампутации конечности формируется регенерационная бластема, но полного восстановления органа не происходит, тогда как удаленный хвост вос