Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, свойства и регуляция активности oGMP-зависимых фосфодиэстераз циклических кунлеотидов лимфоидных клеток

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, свойства и регуляция активности oGMP-зависимых фосфодиэстераз циклических кунлеотидов лимфоидных клеток"

ть

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

АЛАЕВА. ЕЛЕНА ВЛАДИСЛАВОВНА

. УДК 577.152.3

ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА 1-Г НТУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ сеМР-ЗАВИСИШХ ФОСФОДИЭСТЕРАЗ ЩШИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ жвдщшх КЛЕТОК.

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА- 1987

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии All СССР

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, ■ профессор Е.С.Северин

доктор химических наук, профессор М.Я.Карпейский

доктор биологических наук В.А.Ткачук

.Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Защита диссертации состоится пеЯ$ " 198^г.

в /¿Т&часов на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу 117984, Москва В-334, ул. Вавилова, 32, ИМБ АН СССР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР

Автореферат разослан

1987 г.

Ученый секретарь Совета, кандидат химических наук

А.М.Крвдын

Актуальность проблемы. Циклические нуклеотиды, будучи вто-ичными мессендзёрами, играют ваянейшую роль в процессах диффе-енцИровки, созревания и функционирования иммунокомпетентных кле-ок. Одним из ключевых ферментов метаболизма циклических нуклео-идов является фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, лринжа-щая участие в поддержании уровня сАМР и сШР в клетке. Известно, по этот фермент существует в разных формах, отличающихся по ло-ализащш, физико-химическим и кинетическим свойствам, субстрат-юй специфичности и способам регуляции. Регуляция активности фос-зодиэстераз монет осуществляться при участш систем других вторичных мессендаеров (например, ионов Са^+).

Изучение фосфодиэстеразного состава различных лшг.оидных меток, а такне свойств и способов регуляции их фосфодиэстераз 1редставляет большой интерес для понимания роли циклических ну-Еслеотидов я процессов взаимодействия различных систем вторичных иессендяеров в биохимических механизмах шатунного ответа.

Цель работы состояла в изучении свойстз и путей регуляции активности одного из известных типов фосфодиэстераз циклических нуклеотцдов - с8МР-зависимой фосфодиэстеразы, обнаруженной в лимфоцитах мыши и в клетках лимробластош человека &0S.

Научная новизна. В настоящей работе сШР-зав^сЕмая фосфодиэстераза впервые была обнаружена в цитоплазматическои фракции двух типов лимфоидных клеток и очищена до состояния гомогенности. Было показано, что ферменты из двух источников обладают близкими физико-химическими и кинетическими свойствами. с©.1Р-зависи-мая фосфодиэстераза представляет собой олигомер а йолекулярной массой 800 кДа, состоящий из субъединиц, имеющих мол. массу около 90 кДа. Продемонстрировано, что сбМР-зависимая фосфодиэстераза

принимает участие в биохимических механизмах иммунного ответа.

со'

Принятые обозначения: Bc^cAMP -/V ,0 -дибутирил сА1!Р, Bi^cGMP -/\Г,02-дибутирил сШР.

Фермент обладает способностью гидролизозать как сАМР, гак и сомр, причем гидролиз этих субстратов характеризуется полоаи-тельной кооперативноетью. Фосфодиэстераза активируется циклическим сыр, при активации кооперативные эффекты пропадают.

Изучено действие двух ингибиторов (Ви2с.щр и Вц^саш ) на активность фосфодиэстеразы. Обнаружено, что Ви2ссггр обладает значительно более выраженным ингабяруздим действием, чем Ъи2сшв

Впервые показано, что полило активация ссглР, доссуодаэстераза данного типа может регулироваться путем Са^-фосфодипнд-зависи-мого фосфорилирования. В результате фосфорилирования фермент теряет способность к активации ссагр.

Практическая ценность работы заключается в возможности использование экзимологическиш лаборатория:,и разработанных методов дая ввделения сомр-зависимой фосфодиэстеразы из лшфовдных тканей. Исследование ингибиругацего действия аналогов субстратов открывает возможность для более эффективного фармакологического воздействия на фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов. Результаты работы углубляют представлены о гязханазмах функционировала соир-зависшой фосфодаэстеразы и ее участия в процессах пролиферации и иммунного ответа.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 16 ло* ференции Федерации европейских биохимических обществ (.Москва, 1984), на У Всесоюзном симпозиуме по циклическим нуклеотидам (Рязань, 1985), на X Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы "Фундаментальные достижения кейрохимпи - медицине" (горз кий, 1987), на IX Объединенном сльшозиуые биохимических обществ ГаР и СССР "Регуляция метаболизма на клеточном и молекулярном уровне" (ГдР, ;1ена, 1987,).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных

работ.

ОбЬем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, полученных результатов их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (154 источника). Работа изложена на № сто. машинописного текста, содержит 4 таблиц и 35 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Участие сбМР-зависшнх фос&одшэстетаэ в процессах

иммунного ответа В лимфоцитах селезенка мыши более 95$ фосфодиэстеразной активности сосредоточено в супернатанте, полученном после центрифугирования гсмогената клеток при 40 COOg . Оказалось, что фосфо-диэстераза в этих клетках способна гидролизовать сАМР и cSMP с близкими по величине К;» Кроме того, гидролиз сАМР активируется микрсмолярными концентрациями cGMP, т.е. в лимфоцитах присутствует сбМР-зависимая фосфодиэстераза циклических нуклэотидов.

• Было установлено, что после иммунизации мышей белковым кал-

сулькнм антигеном Yersinia pesti3 (фракция ), в лимфоцитах

селезенки .тавотных яаблзщалось значительное увеличение активности

фосфодиэстэразн циклических нуклеотидов.' На третий день после

иммунизации активность фермента в экстрактах клеток составляла

152$, а на 7-1 день - 325$ по сравнению со 100$ активности у кон-

Степень активации гидролиза с AMP ми-

Рас. I. Активность фосфодиэсте-.5007. разы в лимфоцитах селезенки мышей: А - в день иммунизации, .гоо/. 3 - на 3-й день после иммунизации, С - на 7-й день после имму-•i00% К2заи£а- Незаитрихованные стол-., бикя - контрольные животные, . заштрихованные - аивотныв, ишу-А & С. низированнке антигеном

трольных яивотных (рис.1). ? г 1600

* i »4«

.&00

ft

n

V/

кромолярными концентрациями сбМР при этом не изменяется и составляет 1,6 раза, т.е. изменение активности происходит за счет сШР-зааисимой фосфодиэстеразы. При исследовании кинетических свойств фосфодиэстераз изучаемого объекта было установлено, что зависимость скорости гидролиза сШР от его концентрации носит нвгипер-болическии характер. Гидролиз сАМР фосфодиэстеразами экстракта лимфоцитов характеризуется к координатах Лайнуивера-Бэрка нелинейной зависимостью гГ^ от э"1. Анализ этих данных в координатах Хилла показывает, что в области концентраций субстрата 0,10 -1ф мкМ коэффициент Хвлла равен 0,84, а в области концентрации субстрата 10 - 100 мкМ он равен 2. Наличие участка с ъ = 2 говорит о том, что в системе присутствует фермент, кинетика которого характеризуется псяонитедьной кооперативностыз. При активации фосфодиэстеразы циклическим &£Р эффект кооперативноети пропадает, и коэффициент Хилла становится близким к I во всем исследованном диапазоне концентраций.

7 иммунизированных животных кинетические' свойства фосфодиэстераз в экстрактах лимфоцитов не изменялись - по сравнению с контрольными.

П. Оосаодиэстетэаза циклических нуклеотидов в клетках

лимфобластомы человека доз Поскольку известно, что циклические нуклеотиды принимают участие в процессах регуляции деления клеток, и в быстро пролифе-рирувдих клетках уровень сАМР обычно понижен, представлялось интересным сравнить активность фосфодиэстераз з быстроделшихся лимфоидных клетках и в нормальных, непродиферируодих лимфоцитах. 3 качестве модели цролиферирупцих лимфоидных клеток была взята линия 405 лимфобластош человека.

Результаты сравнения фосфодиэстеразной активности е экстрактах клеток 405 и лимфоцитов селезенки мыши приведены в Табл.1.

Таблица I. Сравнительная активность фосфодиэстераз в лимфоцитах селезанки мыши и в клетках лпкфоблвстокы '^03

Источник

Активность фосфодаэстаразы,

нмоль

мин «шн клеток

гидролиз сАМР, ьс:М гидролиз сАМР б присутствии

I мкИ семр. мкМ

0,2

50

0,2

50

1ш.коциты

селезенки мыши 9,0 190,0 Клетки 50Б 15,0 550,0

22,1 54,0

238,5 610,0

Из таблицы видно, что в экстрактах• клеток лцмфсбластокы активность фосфодиэстеразы в 2-3 раза выше, чем з л&йфоцитах сате-зенки мыши.

Изучение кинетических свойств фосфодиэстераз в цитоплазмати-ческой фракции клеток 505 показало, что они аналогичны свойстзам фосфодиэстераз из лимфоцитов. В случае неактивирозанного сШР фермента на графике Хилла имеет место наличие участков с ь = 0,8 (при концентрации сЖР 0,2 - 10 мкМ) и с ь = 1,6 (при концентрации сАГЛР 10-100 мюЛ). В присутствии I мкМ сйЛР график зависимости У от Б приобретает линейный характер, и кооперативные эффект ты пропадают (коэффициент Хилла близок I). Гидролиз сйЛ? фосфоди-эстераз&ми клеток <203 характеризуется слабой лслоиительной коопе-ративностью (ъ. = 1,14).

Ш. Выделение сбМР-зазисимой фосаодизстеиазы из клеток

лимаобластош чоз С целью дальнейшего изучения свойств сЯЛР-зазисимой фосфодиэстеразы была проведена очистка фермента из клеток чоз . Дитоплаз-матаческую фракцию клеток зоэ разделяли с помощью хроматографии на коленке с беае -целлюлозой. На рис.2 приведен профиль элщяд

ш фрахт

Рис.2. Разделение цитодлазматичес-кой фракции лимфобластов ЗОБ на колонка с целлюлозой № 52: I -гидролиз сА'ЛР, 2 - гидролиз сйМ?, 3 - гидролиз с^ШР в присутствии I мкг.1 сбИР, 4 - поглощение при 280 нм. Концентрации субстратов равна I мкМ.

фосфодиэстеразы с колонки с НЕ 52-целлшозой градиентсд! 0,1 - 0,5 М ЕзС!.. Из рисунка видно, что фосфодиэстераз-ная активность сосредоточена в одном симметричном пике, причем профили, соответствующе гидролизу сАь!Р и сбМР, а также гидролизу сАМР в присутствии I мнМ сЗЛР, полностью совладают, фракции, содержащие сйЛР-зависимув фосфодаэс-теразу, объединяли и подвергали дальнейшей очистке с помощью гель - фильтрации на колонке с тзк-ш 65 гелем. Как

I

а 12

& . А

Г

I »

г

■■ О

а 53

й.й

Мои

1И0СВ,

*

400

М Ццм-чп

55 56 88 А фрвпщ

Рис.3. А. Профиль элшции фосфодиэстеразы из лищюбластов Ч03 с колонки с тэк-нет 65 гелем. I - гидролиз сАМР, 2 - гидролиз сАМР в присутствии I мкМ сбМР. В. Электрофореграымы фракций 55; 56, 58, 61. Электрофорез проводили в 12% ПААГ.'

звдао аз рис.3, црсфдль элеции содеркит гри лика фаофздтастеразноЗ активности. Фермент с максимальными актав^остьа и стеиеньв актчза-ции cSMP имеет молекулярную массу 800 нДа. Саыдузздае два пика, значительно меньше по актизности, соответствует Мм около 400 г 200 кДа. Электрофорез в присутствии SDS фракции, соответствующей Мм 800 кДа, указываэт на наличие в препарате двух белковых полсс ' с Мм 8S и 93 кДа. Эти два паюсы присутствуют и зо фракциях с Мм 400 я 200 кДа, тапке содержащих: фосфсдкэстеразную активность (рис.3). Сопостаалзниэ полученных результатов позволяет предположить, что исследуемая фссфодиэстераза представляет собой олитомер-ннй белок большого молекулярного веса, состоящий из двух типов субъединиц. Возмоано, что наличие полосы 89 кДа обусловлено частичным протэслизок 93 дДа субьединицы. В Табл. 2 приведены данные по активности на разных стадиях очистки сбУР-завасзмой фосфодрэс-теразы.

Таблица "2. Удельная активность сбМР-зависаиоЗ фссфодизстеразь* в процессе очистки

Стадия очистки Концентрация Удельная активность Очистка, белка, мг/мл фссфодиэстаразы, раз

М

мин-мг белка

Гомогенат .4,25 0,0106-Ю-6 I

ЗЕ -52-целлшоза 0,16 0,042-Ю-4 400

Гель-фальтрация

на Т£К-ОТ65 0,01 0,22-Ю"4 " 2100

1У. Выделение сй/Р-зависимой. аосаюдзостеоазы из лдягоштов

селезенки и аз селезенки мкш Выделение сШР-зависиыой фосфодизстеразы из изолированных лимфоцитов селезенки мкти проводила аналогично вкдатэниэ аз 'клеток 0.0В. Поскольку процесс выделения большого количества лимфоца-

хов из селезенки-мыши связан со значительными методическими трудностям;!, была разработана методика выделения с®ЛР-зависимои фос-фодаэстзразы из цельных селезенок, что дало возможность значительно увеличить количество получаемого фермента. Супернатант, полученный после центрифугирования гомогената органов, разделяли с помощью ионообменной хроматографы па колонке с £>2АЕ Тоуореаг1 650 Ы. Профиль злюции фосфсдиэстераз градиентом ДаС1 представлен на рис.4. Как видно из рисунка, на этом профиле можно идентифицировать три различные формы фосдодиэстеразы. При ионной силе, соответствующей 0,14-0,15 М НаС1 элаируаася фермент, который гидролизует преимущественно сй»1Р. Гидролиз сМР при концентрации I практически отсутствует. Далзв, при 0,175-0,19 М НаСх элшруется фермент, обладающий способностью гидролизовать как сАМР, так и с&ЛР, причем гидролиз сЖР активируется микромолярны-

Рис.4. Разделение надосадочной фракции гомогсната селезенки мыши на колонке с DEA-E Toyopearl 650 М: I -гидролиз сАМР, 2 - гидролиз сШР, 3 - гидролиз сАМР в присутствии I мкМ cff.IP. Концентрации субстратов

Fhc.5. Злектрошоре-грамла фосйодиэстера-зы из селезенки мыши. Электрофорез проводили в 11$ ПААГ.~

равны I мйЛ.

ш концентрациями сбМР. Наконец, третий тип фосфодизстьразы, который элаируется при 0,£1-0,22 И НаС1, гч*црсШ1зует преимуяествзн-но сАМ? и не активируется се®. Препарат фармента, элшрунщегося зо.втором пике, далее дванды хроматографировали на колонке с -Ж нябз гелем, и окончательно дочищали ка аффинной с®ЛР-23К колонке. Злзктрсфорзграмка выделенной фосфодизстеразы приведена ка рис.5. Из рисунка видно, что в препарате з основном представлена батко-зая полосе, с 'М 93 ¡'¿а. Молекулярная масса фэрканта по данннм гзль-Хилырздии составляет оксло ВОС кда.

У. Диетические свойства очищенной с^ЛР-завксимсй

сзосзодиэстетэазы Сависимссть скорости гадролиза СА1.1Р от концентрации субстрата з очищенном препарате фосфодизстеразы яз селезенки мтдля представлена на рис.6 в координата-: Лайнулверэ-Езрка. График алеет

Рис.6. Зависимость скорости гидролиза сА:-|1Р фосиюдиэстеразкой из селезенки мили от концентрации субстрата: а - в отсутствие сйЛР, 3 - в присутствии 2 акМ

сЗ£Р.

Рис.7. Зависимость скорости гидролиаа сАМР фосфодизстэразой из селегенки мшли от концентрации субстрата в координатах Хзлла: а - з отсутствие сбУР, б - з присутствии 2 мк'Л cS.JP

ввд вогнутой к оси х гиперболы (рис.6а), характерный для ферментов с положительной неоперативностью. Действительно, при рассмотрении этих данных, представленных в координатах Халда, видно, что на графике в области концентрации 10 мкМ - I имеется участок с Ь = 1,6 (рис. 7а).

Характер зависимости скорости гидролиза сйЛР от его концентрации в очищенном препарате по сравнению с гомогекатами существенно не меняется, и характеризуется слабой положительной коопе-ративностью 1рис.8,9).

Таким образом, выделенная фосфодиэстераза характеризуется положительной кооперативноетью по отношению к сАЧ? и сЭЛР, а также способностью к активации микромолярными концентрациями с(3<1Р. Цри активации зависимость скорости гидролиза сАМР от его концентрации приобретает в обратных координатах линейных характер, и кооперативные эффекты пропадают, ь. становится рашым I. Зависимость скорости гидролиза с(2ЛР от его концентрации представлена

2,5

2.0.

1.5

1.0-

0.5-

С.

I

2

3

Рис.8. Зависимость скорости гидролиза сбМР фосфодиэстера-зой из селезенки мыш от концентрации субстрата.

Рис.9. Зависимость скорости гидрализа сСлЛР фосфодизсте-разой из селезенки мыли от

концентрации субстрата. Данные

предртавлены в координатах Хидла.

на рас.8 з координатах Даинуизера-Бэрка и на рис.9 в координатах Килла. сАЫР в концентрациях 0,01 мкМ - I мкМ практически не оказывает влияния на гидролиз сЗЛ?. Кшреакций гидролиза сДМР и сИР составляют, соответственно, 18+2 мкМ и 28+2 мкМ, максимальные

скорости реакций разны, соответственно, 0,1+0,03 и 0,18+

ГЛ ¡лкмоль

Iй мин-мг Оадка *

оЗМР-зазисамая фосфодпзстераза, зыдадэнная из клеток лимфо-бластомы 405 по свои:«! кинетическим свойствам очень близка к ферменту из селезенки. Гидролиз сАгл? активированной фосфодиэстера-

зой из лпмфоолаетов характеризуется К = 62 мкш,1^ =0,4

-ОД мкмоль ~ глин-мг оелка *

71. Влияние структурных аналогов САГ-.1Р и сбМР на кинетические

свойстзз сбМР-зазиозмзй оосфодиэстедазк Представлялось интересным изучить, способны ли какие-либо структурные аналоги сЗ-аР активировать сЯ>Е?-зашсимуа фосзодизстз-разу циклических нухлеотидов. 3 Табл.3 приведены результаты такого исследования, выполненного на фосаод^эстеразе из клеток лим^облзстомы

Таблица 3. Влияние структурных аналогов с£МР на гидролиз сАМР фосфодиэстеразой из лимфоидных клеток 403

Аналог Ю-6 Концентрация, Ю~5 Ю"4 м ю-3

Активация, % от максимальной

сСМР ¿0 1С0 40 0

оВСР 0 40 55 0

2',3' о(2!Р 0 0 0 0

5' <2£Р 0 0 0 0

йТР 0 0 0 0

8-Вг сАЖВ 0 а 0 с

Из исследованных-веществ только сШР обладает способностью активировать фосфодкэстеразу, причем в меньшей степени, чем с£.1Л Зто говорит о том, что все элементы структуры молекулы активатора являются существенно важными: необходимым требованием является наличие 3•,5'-циклофосфатной группировки, и даяе замена гуани-нозого гетерсцикла на его блиаайшй структурный аналог гипоксан-тан приводит к заметному ухудшению актизаторных свойств.

Кривые зависимости скорости гидролиза СШР от концентраций сбМР и сШР приведены на рис. 10. Характер кривой активации фос-л фодиэстэразы циклическим 8КР говорит о том, что при низких концентрациях сбМР' его•действие проявляется в активации фермента вследствие преимущественного связывания в высокоа^финном регуля-торном центре. Зто подтверждается тем, что Кт^. т.е. концентрация активатора, необходимая для полумаксимальной активации, составляет около 0,5 1ЛИ.1, что значительно низе соответствующей Ка(62мкМ).

дальнейшее изучение кинетических' свойств сй.1Р-зависЕмой фосфсдиэстераза проводилось с использованием двух других структурных аналогов субстратов - н6, 02'-дабутирил САМР (В^сЖО и ы2,02'-дибутирил

сШР (В^сШР). Оба аналога являются ингибиторами фосфо-диэстераз циклических нукяео-твдов.

• Бьио исследовано влияние ингибиторов на зависимости

йлхо

Рис.10. Зависимость скорости гидролиза сАМР фосфодиэстара-зой из лимфойластов ЧОБ от концентраций активаторов: свМР (I) и сЖР (2).

I .

0.5

-7

-6

-5

скоростей гидролиза сАМР и сШР от концентраций субстратов, а также на кривые активации (т.е. зависимости V от концентрации сйЛР при постоянной концентрации субстрата - сАМР). На рис. II представлен график зависимости скорости гидролиза с®П? з присутствии различных концентраций ви2ссир. зи2сй1р з концентрации 50 мгсМ (а такяэ Ви2сАШ? з концентрации 5С0 мкЮ вызывает более, чем 4-х кратное увеличение Ки реакции, практически не оказывая влияния на Т/д . Анализ данных по шгибарезаниа гидролиза сСМР в координатах Диксона (рас.12) дает значения констант ингиблровандя, равных 220 мкМ для Зи2сАШ? и 24 для Ви2снл:р.

Рис.11. Зависимость скорости гидролиза сйЛР фосфодизстаразой из селезенки мппи от концентрации субстрата: в отсутствие ингибитора (I); в присутствии 10 мкМ (2) и 50 мкМ (3) Ви^сСЮ?. Данные

иг /

40 Ч

I

га -

» '

представлены в координатах Яа2-нуивера-Бэрка.

ч«М

Рис.12. Определение методом Диксона констант икгибиронания фос-фодиэстеразн Зи0сам? (А) и Еи2ссагр, (В) .1220£<0и*И,

к^гпчикм.

График зависит,гос.тз скорости гидролиза с ALP от концентрации активатора в присутствии разных концентрацийЪилбНРприведен на рис.13. При ингибировании не наблвдается изменение величин 2 Ее

Рис.13,. Зависимость скорости гдцроишаа сАЫР от концентрация активатора (сбМР): в отсутствие ингибитора (I), а присутствии I (2), 10 (3) и ICC (4) мхМ BugC&IP. Концентрация сА'ЛР разна I мкЛ.

%/2 = - ^^

^feCWj CD

цроисходит смещение положения максимумов кривых. Эти данные говорят о том, что как Ви сОЛР, так и БалсАШ1, по-вндамому, практи-2 с

чески не связываются с регуляторннм участка! ферменте, и не оказывают влияния на процесс активации фосфодиэстеразы.

Полученные результаты позволяют заключить, что сЗЫР-зависи-ыке фосфодиэстеразы из двух типов лимфоидных клеток (лиьйсбласто-мы чоэ и лимфоцитов селезенки мыши) обладают двумя типами центров связывания циклических нуклеотидов. Это каталитические центры с близким сродством к сАМР и сЩР и высокоаффинные сйЛР-сеязкбсИЬ щие регуляторные центры.

УП. Регуляция активности сОМР-активир.уемой фосфодиэстеразы путем Са-фосфолшшд-зазисимого фосфооилироЕания

Данный раздел посвящен изучению возможности участия процессов . белкового фосфорилирования в регуляции активности сСЛР-завЕ-симой фосфодиэстеразы из лимфоидных клеток.

Было обнаружено, что при разделении гомогенатоа клеток

с помощью ионообменной хроматографии на НЕДЕ-тоуорааг! 650 Ы

неяоторыо фракции обладают лротоинкшазной активностью. Оказалось, что ¿ротеинкиназз, присутствующая в этих фракциях имеет низкую базальную активность и способна активироваться фосфати-далсерином в присутствии ионов кальция. Этот тип протеинкиназы известен в литературе под названием сротеинкинази С. Препарат киназы С, добавленный шесте с АТР, фосфолипидом к ионами Са^+ в реакционную смесь для определения фосфодиэстеразной активности, обладал способностью ингибировать фосфодизстеразу из лимфоблас-тов, активированную сШР.

Дальнейшие исследования проводили с фзсфодазстеразой из селезенки шзш и частично очищенным препаратом гротэзнкиназы С из мезга крысы.

На рис.14. приведены графики зависимости активности фосфоди-эстеразы от вромена цреиннубации с препаратов киказы С. Зазальная активность фермента (т.е. гидролиз еАМ? в отсутствие cGMP) практически не зависит от времени прешкуоацип кап з контроле, так и в присутствии фосфатидалсерина и иснов Са^+, Способность же фос-фодзэстеразы к активации зависит от времени фосфорялирозания, и через 2,5 часа фермент теряет способность активироваться сШР, его активность в присутствии 2 мкгЛ с(М? приближается к базатьной. В контроле способность фермента к активации сохраняется.

Рис.14. Зависимость активности фосфодиэстэразы из селезенки от зремени прекнкубэцзш с препаратом протеинхиназы С: в контроле (1,2) и з присутствии фосфатидал-серина и ионов Са2+ (3,4). 2,4 -базальная активность фосфодиэсте-' разы; 1,3 - активность в присутствии 2 мкЫ cO/IP.

о

1

1.Т0

I

О

Z , ЧЕС 3

При авторадяографии электрофсреграммы препарата фосфсдизстз-разы, инкубированного с протеинкиназой С е присутствии фосфатп-дилсерша и ионов Са2+, было обнаруноно включение ¿'[Р^^-^осфата АТР в белкоьую полосу с молекулярной массой около 90 ада, которая соответствует одной из двух субьеднннц фосфодаэстеразы. При проведении фосфорилирования без фосфолипида включения У-!р®^1-фосфата в соответствующую белковую полосу не наблвдалось.

Кроме того, было исследовано, каким образом изменяется при фосфорилировании кривая зависимости активности фосфодиэстеразы > от концентрации активатора - сбМР. Из рис.15 видно, что после 30 минут инкубации в присутствии прстеинкиназы С, фосфатидиясе-рина и ионов Са2+ константа активации фосфодиэстеразы увеличивается более, чем в 4 раза по сравнению с контролем.

Рис.15. Изменение кривой активации фосфодиэстеразы после фосфорилирования протеинкиназой С. I - зависимость скорости гидролиза I мнМ сЖР от концентрации активатора (сбМР) в контроле после инкубации фосфодиэстеразы с протеинкиназой С в отсутствие фосфатидшгсери-на и ионов Са +; 2 - та же зависимость после преинкубацни фосфодиэстеразы с протеинкиназой С в присутствии фосфатидалсерина и ионов Са2+. К^ = 0,15+0,05 мкМ, К1/2 = 0.74+0,05 мкМ.

Полученные результаты позволяют предлояить еще один воз-мозный механизм регуляции активности сШР-зависимей фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов путем кальций-^осфолипид-заэисимого фосфорилирования.

^сбМР,«!

выводы

1. Впервые продемонстрировано, что сйЛР-зазисямая фосфода-эстераза присутствует в питодлазматической фракции двух типов иммунококпетентных клеток - лимфоцитах селезенки мыши и з клетках лимфобластомы человека QOS-

2. Показано, что в црслиферирушдих клетках лимфобластомы qos,a такзе в лимфоцитах селезенки иммунизированных мышей активность с®1Р-зависимой фосфодиэстеразы в несколько раз выше, чем

в нормальных лимфоцитах селезенки мыши.

3. Выделены сбМР-зазисимые фосфодиэстеразы из двух источников: лимфоцитов селезенки мыши и лимфобластов qos в состоянии, близком к гомогенному. Показано, что ферменты из этих источников близки по своим свойствам и являются олигомеааш с молекулярной массой около 8С0 кДа и молекулярной массой субъединиц около

90 кда.

4. Изучены кинетические свойства с®2Р-зависи«;ой фосфодиэстеразы лимфоидных клеток. Показано, что этот фермент способен гидролиз сзать как cAIvtP, так и сбМР с близкими Гидролиз обоих субстратов характеризуется негиперболической зависимостью скорости реакции от концентрации субстрата.

5. На основании изучения кинетических свойств cSMP-зависимой фосфодиэстеразы в присутствии нескольких структурных аналогов cAWP и сШР сделан вывод о существовании у фермента двух типов центров связывания циклических нуклеотидов - каталитических центров с близким" сродством к сАМР и cSvIP и высоксспецифических сШР-связывагацих регулятсрных центров.

6. Впервые продемонстрировано, что для сбир-зависимой фосфодиэстеразы, помимо активации сGMP,. существует еще один возможный способ регуляции ее активности - Са^+-фосфолшщц-занисимое фос-

форилирование. Показано," что в результате фосфорилирования сШР-зависиыая фосфодиэстераза теряет способн зсть к активации cGMP.

Материалы диссертации опубликованы в слврттх работах;

1,- А.Д.Кондратьев, В.А.Мовсесян, Е.В.Свешникова. Механизм регуляции катаболизма циклических нуклеотидов в линии лимфобластовд-ных клеток.-Тезисы докладов 16-й конференции Федерации евродей-сккхбиохшических обществ. Москва, 1984, стр.167.

2. Е.В.Свешникова, С.В.Луценко, И.Д.Бобрускин. Роль фосфодиэсте-* разы~циклических нуклеотидов в регуляции действия гормонов.-Тезисы докладов симпозиума "Химия и биохимия пептцдно-белковых гормонов". Суздаль, 1985, стр. 26-27.

3.3.Ю.Алахов, Е.В.Свешникова. Факторы регуляции метаболизма . . сАМР.-Тезисы докладов У Всесоюзного симпозиума "Циклические нук-леотиды и система регуляции ферментативных реакций". Рязань, 1985, стр. 3-4.

4. Е.В.Свешникова. Свойства и механизм регуляции фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов, активируемой cfflP.-Тезисы докладов У Всесоюзного симпозиума "Циклические нуклеотицы и система регуляции ферментативных реакций". Рязань, 1985, стр. 174.

5. Ажаева Е.В., Товмасян Е.К., Северин С.Е.(мл.}. Кальций-чоосфо-липид-завксимое фосфорилирование сбМР-активируемой фосфодиэстеразы из селезенки мыши.-Биологические мембраны, 1987, т.4, й 9, .стр. 980-983.

6. Акаева Е.В., Северин Е.С. Кинетические свойства и регуляция фосфодиэстераз циклических нуклеотидов лимфовдных клеток.-Биоор: химия, 1987, т. 13, 16 9, стр.П57-П63.

7. Е.В.Ажаева, Е.К.Товмасян. Регуляция активности цШВ-зависимо фосфодиэстеразы протеинкиназой С.-Тезисы докладов X Всесоюзной

конференции по биохимии нервной системы "Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине". Гооький, 1987, стр. 94» ■Sesencn S.&fit)

8. Azhayevt» 3.V. , Krascvakaya O.L. "oGIuP-depe:":dent phosphodiesterase frcai ii.ouse spleen lymphocytes". -12 Joint symposium of the bichemical societies of th% C-D3. and USSR "Metabolic regulation

at the cellular and .noleoui^r level'1. Jena, ¿DR, -<937 , p. 15-16.

9. Ажаева I.E., Северин С.Б.(мл.), Кондратьев А.Д. с5Ы?-зависи-мая фосфодиэстзраза циклических нуклеотпдов лад^оидных клеток человека.-Биохимия, Iе37, т.52, вьш.11 , стр. 1781 4786.

Т-т17Со,подп.к пзч.30/Х-С7Г оак.;* 10i;,?;г;,IВО,ОРТ," '.;П