Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, очистка и характеристика хлорпероксидазы из бактериального штамма Serratia marcescens W250

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение, очистка и характеристика хлорпероксидазы из бактериального штамма Serratia marcescens W250"

, - г 1 iJ

.. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

1 3 ; S 1 ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Н.БАХА

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ХЛОРПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА Serratia marcescens W250

03.00.04

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —

1996

Работа выполнена в Гродненском государственном университете им. Я.Купалы, кафедра биохимии и биотехники

доктор биол. наук, профессор

A.И. Воскобоев, кандидат хим. наук

B.Н.Бурдь

доктор биол. наук, профессор

З.Г.Евстигнеева,

доктор биол. наук, профессор

В.И.Муронец

Институт микробиологии РАН

Защита диссертации состоится " ¿8 " _1996 г.

в_часов на заседании Диссертационного Совета

(К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (117071 Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан 29 апреля 1996 года.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

М. И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Галогенирующие ферменты являются в последнее время объектом интенсивного изучения и представляют собой достаточно перспективный класс ферментов. На их основе возможна разработка новых путей модификации ряда полезных галогенсодержащих соединений и, в первую очередь, биоактивных препаратов (т.к. введение в молекулу галогена или нитрогруппы, как правило, сильно увеличивает ее биологическую активность). Галогенирующие ферменты могут использоваться в качестве биодобавки к синтетическим моющим средствам, а также в текстильной промышленности (обработка ферментом волокон позволит увеличить их гидрофильность, что приведет к лучшей смачиваемости и окра-шиваемости волокон). Кроме того, исследование галогенирующих ферментов важно для создания методами генной инженерии высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, продуцентов антибиотиков.

При использовании метода ферментативного катализа открываются перспективы создания экологически чистых, исключающих применение свободных галогенов, технологий.

Этот класс ферментов интересен и с научной точки зрения. Анализ имеющейся информации по проблеме галогенирующих ферментов показывает, что наиболее хорошо изучены гемсодержащие галоперокси-дазы (далее ГП), (так они были названы из-за способности окислять ионы галогенов только в присутствии пероксида водорода), выделенные, в основном, из эукариотических источников. Интенсивное изучение про-кариотических ГП, в частности, бактериальных, началось сравнительно недавно. Наибольший интерес при этом представляют бактериальные гемнесодержащие ГП как наименее изученные. При этом общеизвестно, что бактерии являются более удобными объектами для работы как в лабораторных, так и в промышленных условиях. Необходимость изучения гемнесодержащих бактериальных ГП обуславливается также их чрезвычайно высокой активностью и стабильностью.

Механизм галогенирования для гемнесодержащих ГП еще не изучен. До сих пор не установлено, подобны ли промежуточные механизмы гемсодержащих и гемнесодержащих ГП, являются ли сходными механизмы галогенирования у различных представителей гемнесодержащих ГП и какие металлы играют роль при катализе.

Существенно, что кроме галогенирования, рассматриваемая группа ферментов при определенных условиях катализирует также и реакции окисления. В частности, ГП окисляют серу и ее соединения. Способность ГП окислять аминогруппы органических соединений в нитрогруппы делает перспективным использование их в тонком органическом синтезе.

Таким образом, исходя из открывающихся перспектив использования бактериальных гемнесодержащих ГП в различных отраслях промышленности, особенно при производстве медицинских препаратов, а также из-за высокой активности и стабильности, и ввиду малой изучен-

ности их свойств, исследование данных ферментов в наши дни особенно актуально.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключается в выделении и очистке до гомогенного состояния хлорпероксидазы (ХП) из штамма бактерий Serratia marcescens W250, изучении ее физико-химических свойств и определении молекулярных и кинетических параметров фермента.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

- изучить динамику роста культуры S. marcescens и определить время максимального накопления фермента в клетках;

- разработать способ получения гомогенного препарата ХП из S. marcescens;

- изучить физико-химические свойства фермента;

- получить кинетические характеристики ХП;

- изучить влияние различных веществ на аетивность фермента;

- провести исследования по выяснению механизма галогенирова-ния ХП;

Научная новизна полученных результатов.

ХП из бактерий S. marcescens - абсолютно неизученный фермент, никаких сведений о нем помимо наших исследований в литературных источниках не имеется.

В данной работе нами впервые предложен метод получения гомогенного препарата ХП из бактерий S. marcescens. Этот метод выделения ХП является простым и позволяет получать значительные количества фермента. Из 150 г клеток (сырая биомасса) получается 5,5 мгХП с удельной активностью 430 цмоль/мин-мг белка, со степенью очистки 1750.

Изучены свойства этого фермента, а также влияние различных неорганических ионов и некоторых органических веществ на активность ХП.

В данной работе впервые был предложен механизм бромирования монохлордимедона (МХД) изучаемым ферментом.

Проведено сравнение иммунологических свойств ХП с уже изученными подобными гемнесодержащими ГП.

Практическая значимость полученных результатов.

В данной работе были предложены оптимальные технологические параметры культивирования бактерий S. marcescens, разработан способ получения гомогенного ферментного препарата ХП. Было установлено, что полученный препарат стабилен и не теряет своей активности в течение нескольких месяцев (при t=-4'C), работа с препаратом не требует пониженных температур ввиду высокой термоустойчивости фермента. Разработанная нами схема выделения и очистки позволила получить препарат с высоким выходом. Проведенные исследования свойств фермента существенно дополнили современные данные о свойствах гем-

несодержащих бактериальных ГП, а также позволили сделать шаг вперед в выяснении механизма галогенирования этими ферментами.

Основные результаты.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены:

- на 7-й Гродненской областной конференции молодых ученых и специалистов, Гродно, 1991;

- ежегодно с 1991 года по 1995 год на Апрельской научной конференции биологического факультета Гродненского госуниверситета;

- на 7-ом Европейском конгрессе Биотехнологии (Италия, 1992)

- на 23-й конференции РЕВЭ'Эб (Швейцария, Базель, 1995).

Опубликованность результатов. Результаты исследований опубликованы в 6 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитированной литературы.

Работа изложена на 97 страницах машинописного текста иллюстрирована 27 рисунками и 7 таблицами. Список цитированной литературы включает 93 наименования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект и методы исследования. В качестве объекта исследований был взят дикий штамм культуры бактерий S. marcescens W250, выделенный в Институте микробиологии Хоэнхаэмского университета ( ФРГ) и любезно предоставленный нам профессором этого университета К.-Х. ван Пее.

Питательные среды и условия культивирования. Культура поддерживалась на мясо-пептонном агаре и хранилась при t= +5'С, пересев производили каждые 1,5-2 месяца. Среда для выращивания имела следующий состав (г/л): глюкоза - 10; пептон - 10; хлорид натрия - 5; рН среды 7,2. Стерилизацию среды проводили при 0,5 атм в течение 30 мин.

Получение бесклеточного экстракта. Бесклеточный экстракт получали разрушением клеток на ультразвуковом дезинтеграторе (USD-5, Polland) в течение 20 минут (30*30 сек) при 4"С в пятом ультразвуковом диапазоне. Полученный гомогенат центрифугировали 20 минут при 18000 об/мин. Выделяемый фермент содержался в надосадочной жидкости.

Определение активности фермента. Активность фермента определялась по скорости бромирования МХД. Скорость убывания субстрата измерялась на спектрофотометре СФ-46 при 290нм. Инкубационная смесь содержала следующие компоненты: МХД (44цМ), пероксид водорода (7,2мМ), бромид натрия (82мМ), азид натрия (8,9мМ). Используемая буферная система - натрийацетатная (NaAc), (рН=5,5; 1 М). За единицу активности ХП (U) принималось такое количество фермента, которое катализирует бромирование 1цмоля МХД в минуту. Удельная активность ХП рассчитывалась как число единиц активности на 1 мг белка.

Определение концентрации белка. Количество белка в пробах, находили двумя способами: спектрофотометрически (Layne, 1957) и по методу Бредфорда (Bradford, 1976).

Голубую сефарозу синтезировали согласно методу Дина и Уотсо-на (Dean, Watson, 1979).

Молекулярную массу нативной ХП определяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-100 (Andrews, 1965).

Количество полипептидных цепей и их молекулярную массу определяли методом диск-электрофореза денатурированного белка в по-лиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (Wittman-Liebold, 1986).

Гомогенность препарата ХП оценивали электрофорезом в 7,5% ПААГ при рН=8,9.

Кинетические исследования ХП проводили на спектрофотометре СФ-46. Для расчета скорости ферментативной реакции использовали стационарные участки кинетических кривых.

Данные экспериментов были обработаны статистически с помощью ЭВМ. Графики прямолинейных зависимостей были построены по экспериментальным точкам с использованием метода наименьших квадратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ХП из бактерий З.тагсеэсепэ по международной номенклатуре ферментов относится к классу пероксидаз, действующих на водород как акцептор и осуществляющих хлорирование ряда органических молекул с образованием С-С1 связей (ЕС 1.11.1.10 хлорид-пероксидаза или хлорид: водород-пероксид оксидоредуктаза). Наряду с хлор-ионом, может также использовать бромид и иодид. Суммарная реакция катализа выглядит следующим образом:

2ЯН + 2СГ + Н202 —^ 2ЯС1 + 2НгО;

По структуре молекулы данный класс ферментов делится на гемсо-держащие и гемнесодержащие ГП. к^амбольшее количество гемсодер-жащих ГП выделено из эукариотических источников. В качестве просте-тической группы они содержат протопорфирин IX. Механизм действия гемсодержащих ГП, в основном, изучен. Гемнесодержащие ГП можно разделить на две группы: ванадий-содержащие и несодержащие металлов бактериальные ГП. Последние наименее изучены: неизвестен механизм гапогенирования этими ферментами, не выяснено, играют ли какую-нибудь роль металлы в этом механизме.

В зависимости от типа окисляемого иона все ГП классифицируются следующим образом:. ХП (окисляют ионы СГ, Вг~, Г), бромпероксидазы (БП) (окисляют ионы Вг~, Г), иодпероксидазы (ИП) (окисляют только ионы Г). По отношению к органическим субстратам ХП и БП проявляют различную специфичность. Как оказалось, по отношению к бромирова-нию, все ГП обладают очень низкой субстратной специфичностью, хлорирование же более специфично. Поэтому для обнаружения галогени-

рующей активности исследователи пользуются энзим-тестом Хагера, в котором протекает реакция бромирования МХД в 1 М NaAc, при рН = 5,5, температуре 25'С и соответствующем количестве ГП (Рис. 1):

За единицу ГП-активности принимают количество фермента, которое катализирует бромирование 1цмоля МХД в единицу времени.

Как уже было сказано выше, хлорирование для ГП более специфично, именно поэтому некоторые из них были выделены как БП из-за их неспособности хлорировать МХД и лишь позднее были найдены другие субстраты, например, индол, производные фенилпиррола, которые хлорировались ими. Так, исследуемый нами фермент также был первоначально выделен и исследовался как БП, что видно из опубликованных нами работ. И лишь в конце 1994 года было успешно проведено ферментативное хлорирование индола с участием этого фермента (Бурдь, 1995) и он соответственно перешел в разряд ХП.

Наша работа посвящена разработке метода выделения и очистки, а также изучению физико-химических и каталитических свойств ХП из бактериального штамма Э. тагсевсепв \Л/250.

Выделение и очистка ХП из клеток Б. тагсевсепв. Для выделения фермента использовали, как правило, свежевыращенную биомассу клеток. Длительное (свыше месяца) хранение биомассы в замороженном состоянии при -15'С не приводит к существенному изменению активности в бесклеточном экстракте. Для разрушения клеток и выделения из них фермента применялся метод ультразвуковой дезинтеграции.

Был установлен оптимальный режим разрушения клеток на ультразвуковом дезинтеграторе: 20 мин с периодичностью 30*30 сек в ультразвуковом диапазоне №5. Дальнейшее увеличение продолжительности обработки ультразвуком не приводило к увеличению ГП-активности в сыром экстракте.

На рис. 2 представлена кривая роста культуры и накопления фермента в клетках, из которой следует, что для получения максимального количества ХП достаточно брать 2-х суточную культуру. Концентрация биомассы определялась спекгрофотометрически по мутности раствора при длине волны 590 нм.

Фракционирование сульфатом аммония. В качестве первой стадии очистки был использован метод фракционирования сульфатом аммония. Было установлено, что осаждение фермента происходит в интервале концентраций 55 - 85% насыщения. Выход активности на этой стадии составил 43%, степень очистки равнялась 7.

Рис. 1. Реакция, протекающая в МХД-тесте по Хагеру

9 18 27 36 45 54 63 время, ^

час

Рис. 2. Кривая роста культуры и накопления ХП в клетках

Ионообменная хроматография на ОЕАЕ-8ерЬасе1. В предварительных опытах были подобраны условия сорбции и десорбции ХП на ОЕЛЕ-БерИасе!. Было установлено, что фермент полностью сорбируется на носителе при рН=6,2. При элюировании фермента градиентом концентраций хлорида натрия в 0,01 М ЫаАс буфере десорбция ХП происходит при концентрации соли в районе 0,9 моль/л. При этом общая активность очищаемого препарата увеличилась в 6,4 раза, а количество белка уменьшилось только в 2,3 раза. Такое значительное увеличение активности препарата может быть объяснено удалением в процессе хроматографии неизвестного ингибитора, поскольку добавление в реакционную смесь небольшого количества (20 \и\) препарата, полученного после сульфатной очистки, привело к заметному торможению скорости бромирования МХД.

Гель-хроматография на сефадексе в-100. В процессе очистки методом гель-хроматографии общая активность препарата увеличилась незначительно (в 1,2 раза), а количество белка уменьшилось в 7,5 раз. При этом удельная активность препарата составила 234 и/мг белка. Фактор очистки равнялся 943.

Эффективность очистки на этой стадии можно повысить удлинением хроматографической колонки. Так, оказалось, что при увеличении ее длины в .3 раза удельная активность выходящих из колонки фракций возрастает в 2,5 раза. Возможно, в данном случае становится возможным удаление белковых ингибиторов, имеющих близкий с исследуемым ферментом молекулярный вес.

Хроматография на голубой сефарозе - заключительный этап очистки. ГП не связывается с носителем в используемых нами условиях. В данном случае имеет место связывание примесных белков на носителе.

В результате очистки мы получили белок со степенью очистки 1750 и с выходом активности 208%. Такой необычный выход объясняется тем, что на стадиях ионообменной хроматографии и гель-хроматографии происходит удаление сильных ингибиторов, что сразу же сказывается на

активности фермента. Обработанные статистически результаты пяти аналогичных опытов по выделению ГП представлены в таблице 1.

Одинаковая удельная активность каждой из полученных на последней стадии очистки фракций свидетельствует об их гомогенности. Этот вывод подтверждается данными нативного электрофореза в 7,5% ПААГ. В этих условиях выявляется одна белковая полоса, которая обладает ГП-активностью.

Активные фракции объединялись и хранились при -20"С. При изучении стабильности частично очищенного (после стадии гель-хроматографии на сефадексе в-ЮО) и гомогенного препарата оказалось, что частично очищенный фермент не теряет своей активности при комнатной температуре по крайней мере три недели. Гомогенный препарат в аналогичных условиях теряет 50% своей активности уже на третьи сутки. В замороженном состоянии (-20"С) активность частично очищенного фермента сохраняется в течение двух лет. Гомогенный препарат и в замороженном состоянии менее стоек. Через год хранения фермент теряет около 50% своей активности.

Предложенный метод выделения и очистки ХП позволяет получить около 5 мг гомогенного препарата с удельной активностью 430 цмоль/ мин-мг белка со степенью очистки 1750 из 150 г клеток (сырая биомасса)

Таблица 1. Очистка ХП из Э. тагсезсепз 41250

Стадия очистки Кол-во белка, мг Общая активность, и Удельная активность, и/мг Выход по активности, % Степень очистки

1. Бесклеточный экстракт 228,0 56,4 0,248 100 1

2. 55-85% высаливание (NN4)2504 14,3 24,6 1,720 44 7

3. ОЕАЕ-ЗерИасе! хроматография 6,2 157,3 26,0 279 103

4. Гель-фильтрация на ЭерИадех 0-100 0,82 191,8 234,0 339 943

5. Хроматография на голубой сефарозе 0,27 117,1 430,0 208 1750

Свойства ХП

Спектр поглощения ХП в области длин волн 200-700 нм имеет два максимума поглощения при 220 и 280 нм, что обусловлено электронными переходами в пептидных связях и группировках ароматических аминокислот. На остальной части УФ спектра пиков не наблюдается. Молекула белка не содержит никаких хромофорных группировок. Данные спектра поглощения ХП указывают на то, что исследуемый нами фермент -гемнесодержащая ГП.

Определение молекулярной массы фермента методом гельхро-матографии на колонке с сефадексом в-100 дало следующую величину: 58 кДа (Рис. За).

При электрофорезе препарата ГП в ПААГ в присутствии додецил-сульфата натрия (БОЭ) выявилась только одна белковая полоска, соответствующая величине 29 кДа (Рис. 36).

Таким образом, исследуемая ХП - белок с молекулярной массой 58 кДа, состоящий из двух идентичных субъединиц по 29 кДа каждая. Эти данные согласуются с величинами молекулярных масс субъединиц подобных ГП, число субъединиц которых варьирует в пределах от 2 до 4.

Нами был проведен подбор оптимальных условий для определения активности ХП (рис. 4).

Зависимость скорости реакции от времени носит стационарный характер в период времени от 60 до 150 сек (рис. 4а).

На рис. 46 представлена графическая зависимость скорости реакции от концентрации ХП. График имеет линейный вид в пределах концентраций фермента от 0,002 до 0,016 мг/мл. При более высоких концентрациях белка наблюдается отклонение от линейной зависимости. При определении активности ХП методом Хагера концентрация его в инкубационной среде 0,01 мг/мл. Для получения достоверных значений скоростей бромирования МХД, при объеме вносимого в реакционную смесь фермента 50 цл, изменение оптической плотности смеси (ДЕ) не должно превышать -0,100.

Исследование влияния рН реакционной среды на ХП из Э. тагсев-сеп5 показало, что фермент активен в довольно широком диапазоне рН и оптимум лежит в интервале от 4,1 до 5,8 единиц рН (рис. 4в). Метод Хагера предусматривает измерение галогенирующей активности при рН=5,5, что входит в диапазон оптимальных значений для ХП.

Влияние температуры на активность ХП. При изучении термостабильности фермента было установлено, что активность ХП не изменяется

ю~3мг I ' ЧШФ1 1

Рис. 3. Определение молекулярной массы ХП методом гель-фильтрации (а) и молекулярной массы субъединиц методом электрофореза в ПААГ в присутствии БББ (б).

после прединкубации препарата в течение 15 мин при температуре до 60"С, при более высокой температуре активность ХП постепенно снижается и при прединкубации при 80"С составляет 30-35% от начальной (Рис. 5а). Была изучена также зависимость скорости протекания реакции бро-мирования МХД в зависимости от температуры. Как видно из графика зависимости \/0=1(Т) (рис. 56), с увеличением температуры скорость реакции возрастает в пределах от 5"С до 55*С. Дальнейшее увеличение температуры невозможно, так как один из компонентов реакционной смеси -пероксид водорода - разлагается при более высоких температурах. Температурная зависимость скорости реакции исследовалась в условиях насыщения фермента субстратом, вследствие чего мы можем говорить о справедливости использования уравнения Аррениуса для определения энергии активации исследуемого фермента в реакции бромирования МХД. Построенный в координатах Аррениуса график имеет линейный вид (рис. 5в). Численное значение энергии активации, рассчитанное из рис. 5в,

составляет 10,7 кДж/моль. В проработанных нами литературных источниках нет никаких сведений об энергиях активации галогенирующих ферментов. Таким образом, нами впервые были проведены исследования в данной области для ХП из Б. тагсеБсепв. Исходя из вышесказанного, мы видим, что ХП - удивительно термостабильный фермент, и работа с ним может проводиться даже при комнатных температурах.

Для выяснения влияния природы буфера на активность фермента исследовался ряд буферных систем, наиболее употребляемых при работе с ферментами и работающих в диапазоне оптимальных для ХП рН (Табл. 2).

Концентрации всех систем были одинаковы и равнялись 1 моль/л. ХП проявляла активность только в ацетатных буферных системах. Вероятно, ацетат-ион каким-то образом принимает участие в ферментативной реакции. Чтобы убедиться в верности этого предположения, мы исследовали активность

ХП в вышеназванных системах в присутствии ацетат-ионов. Добавление ацетат-ионов в инкубационную среду приводит к появлению активности во всех буферных системах, однако она сильно снижена. Очевидно, используемые в вышеперечисленных системах ионы оказывают некоторое ингибирующее действие на фермент. Исходя из полученных результатов, приходим к выводу, что ни одна из исследованных буферных систем неприменима для работы с ХП. Так как данные эксперимента указывают на необходимость наличия в реакционной среде ацетат-ионов, можем считать ионы уксусной кислоты еще одним субстратом для реакции гапогенирования.

Влияние концентрации На Ас буфера на скорость бромирова-ния МХД. Зависимость активности фермента от концентрации буфера определяли в диапазоне концентраций МаАс буфера (рН=5,5) от 0,01 до 2М. Максимальную активность ХП проявляет при концентрации буфера от 1М (рис. 6).

Таким образом, все оптимальные параметры, установленные для ХП из Э. тагсеэсепв, совпадают с условиями определения галогенирующей активности по методу Хагера.

Таблица 2. Влияние природы буфера на активность ХП

Буферная система рН Концентрация буфера, М Активность ХП, % Активность на фоне 1М ЫаАС буфера, %

Натрийацетатная 4,4 1 100 100

Натрийцитратная 4,4 1 — 2

Калийфосфатная 5,5 1 — 55

Калийацетатная 4,4 1 95 100

Натрийлактатная 4,4 1 — 5

Натрийформиатная 4,4 1 — 38

Аммонийная 5,5 1 — 15

Натрийсукцинатная 4,4 1 — 40

Рис. 5. Влияние температуры на активность ХП:

Рис. 5а. Исследование термостабильности ХП (изменение активности

препарата после инкубации его в течение 15 минут при различных температурах).

Рис. 56. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. Рис. 5в. определение энергии активации в координатах Аррениуса

Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов. Для пероксида водорода и бромид-ионов были определены значения Км. Они составили 3,0 • 10"2 и 6,9 • 10"2 М соответственно (Рис. 7). Эти величины соизмеримы со значениями Км для ряда гемнесодержа-щих ГП.

рН-зависимости от Км, начальной и максимальной скоростей по бромид-иону, построенные согласно Диксону и Уэббу, показывают, что константа ионизации аминокислоты, находящейся в активном центре фермента, равна 5,8 и соответствует значению константы ионизации серина (рис. 8).

Изучение влияния различных веществ на активность фермента. Так как до сих пор неизвестно, какую роль в механизме галогениро-вания играют металлы, представляется интересным выяснить, как повлияют на активность исследуемого фермента добавки различных ионов металлов. Оказалось, что лишь ионы меди ингибируют ферментативную активность ХП. Остальные из исследованных ионов, такие как Нд2+, Ад+,

А, %

100 80 60 40 20

/

: /

/

J_I_I_L

J_L

Рис. 6. Зависимость активности ХП от ■в— концентрации NaAc

Концентрация NaAc

0,5

1,0

1.5

2,0

Zn2+, Мп2+, ионы щелочных и щелочноземельных металлов, не влияют на активность исследуемого фермента.

Ингибирование ферментативной активности фторидом натрия.

В ряде работ, посвященных ГП, показано, что фтор-ион ингибирует гемнесодержащие ГП. Так как фториды являются галоген-ионами, оказалось интересным выяснить, каково влияние их на активность ХП. Как видно из рисунка 9, ингибирование активности гемнесодержащей ХП из S. marcescens фторидом, как и в случае с гемнесодержащими ГП из Corallina pilulifera и Slreptomyces aureofaciens (К.-Н. van Pee', 1987), носит неконкурентный характер.

Влияние спиртов на активность ХП исследовалось на примере метанола, этанола, 2-пропанола, 2-метоксиэтанола. Спирты с большим числом углерода в скелете молекулы образуют двухфазные системы, изучение которых требует специальных условий проведения экспери-

А, %

250 Концентрация тМ

Рис. 7. Зависимость скорости реакции от концентрации пероксида водорода (а) и бромида натрия (б) в прямых и обратных координатах

-30 -20 -10

10 20 30 40

рКт -5

Рис. 8. Влияние рН на

(Л>> Гтах " начальную скорость реакции (В)

рН

мента. Как видно из рисунка 10, все исследуемые спирты оказывают ингибирующее действие на фермент, причем очевидно, что с увеличением углеродного скелета ингибирование усиливается. Появление ме-токсигруппы в молекуле этанола также усиливает ингибирующий эффект (Рис. 10).

Таким образом, нами было установлено, что исследуемая ГП не устойчива к действию спиртов, поэтому следует избегать их применение в качестве растворителей органических субстратов, а в случае необходимости, можно допустить их присутстствие в низких концентрациях, когда ингибирующий эффект минимален.

При изучении влияния диэтилпирокарбоната (ДЭПК) и фенил-метилсульфонилфторида (ФМСФ) на активность ХП выяснилось, что ДЭПК не оказывает ингибирующего действия на фермент, что указывает на отсутствие в активном центре ХП ответственных за проявление галогенирующей активности остатков гистидина (рис. 11).

При инкубации фермента с 2 мМ ФМСФ в течение 4-х суток фермент полностью инактивируется (рис. 12). После удаления ингибитора диализом активность фермента восстанавливается только на 10%. Возможно,

Рис. 9. Ингибирование активности ХП фторидом натрия в двойных обратных координатах

100 80

cNaF-ММ

60

1

1000

40 20

3

500

100 10

0

10 20 30 40 50 60

Рис. 10. Влияние спиртов на активность ХП: 1 — метанола, 2— этанола, 3 — 2-пропанола, 4 — 2-метоксиэтанола

частичное восстановление активности объясняется удалением из реакционной смеси растворителя. Поскольку ФМСФ является специфическим модификатором ОН-групп серина активного центра ферментов, необратимое ингибирование активности ХП этим модификатором указывает на присутствие в активном центре молекулы ХП ОН-групп серина.

В заключительную часть работы вошли результаты иммунологического исследования ХП и анализ N-концевой аминокислотной последовательности фермента. Эти исследования проводились в лаборатории профессора К.-Х. ван Пее и были бы невозможны без его участия, в связи с чем мы приносим ему искреннюю благодарность.

Для сравнения N-концевых аминокислотных последовательностей гемнесодержащих ГП были взяты 6 представителей этой группы, обладающих наиболее сходными свойствами. Оказалось, что исследуемый нами фермент имеет наибольшее сходство с БП из Streptomyces lividans ТК64 и ХП из Pseudomonas pyrrocinia. У него наблюдалось совпадение последовательности аминокислот в 11 позициях из 20. Эти данные позволяют предположить сходную природу этих трех ферментов. Однако, иммуно-диффузионный эксперимент не подтвердил это предположение.

А, %

60

80

Рис. 11. Влияние ДЭПК и ФМСФ на активность ХП.

1—1 мМ ДЭПК в 2-пропаноле

2—1 мМ ДЭПК в этаноле

3—2 мМ ФМСФ в этаноле

4—2 мМ ФМСФ в 2-пропаноле

40

20

1 сут

2 сут 3 сут <9, Т

Механизм реакции

Исходя из полученных нами данных о том, что ацетат-ионы могут рассматриваться как еще один субстрат для реакции галогенирования, активный центр фермента содержит реакционноспособные ОН-группы серина, а также, что в реакции не принимают участия металлы, мы можем предложить следующую схему протекания реакции галогенирования: уксусная кислота, взаимодействуя с ОН-группами активного центра, образует сложноэфирную связь с ферментом. Далее пероксид водорода восстанавливает ОН-группу фермента, а в реакционную среду выделяется надуксусная кислота, которая, являясь сильнейшим окислителем, вводит в молекулу органического субстрата галоген.

В подтверждение данной гипотезы совсем недавно, в 1995 году, было обнаружено появление в зоне реакции надуксусной кислоты. Это соединение существовало доли секунды. Из данного факта можно заключить, что надуксусная кислота - промежуточный продукт при галогени-ровании гемнесодержащими ГП (К.-Х. ван Пее, неопубликованные результаты).

Протекание реакции можно представить следующим образом:

Е /Р Е ОНО Е ,.0

I +н-о-< — ¿-с^ ^ 1+сн3-< он сн3 ^сн3 он о-он

^о сн

СН,-С' „,.> Б-На1 + СНз-С' + Н,0

3 \ На1 з ч 2

Мы видим, что данный процесс протекает в два этапа: первый -ферментативный катализ с участием ХП и ацетат-ионов и образованием фермент-субстратного комплекса Е-Э, далее распад его под действием пероксида водорода с образованием в качестве продукта ферментативного катализа надуксусной кислоты; второй - обычное химическое взаимодействие ионов галогена, органического субстрата и надуксусной кислоты с получением галогенированного продукта.

Таким образом, процесс галогенирования гемнесодержащей ХП из Э. тагсеБсепэ происходит в два этапа и пока неясно, какой из этих этапов является определяющим при регуляции ферментативной активности. Для выяснения данного вопроса необходимы дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ

1. При выращивании бактериального штамма Э. тагсевсепв \/\/250 на глюкозо-пептонном бульоне при 1=30'С максимальное накопление ХП в клетках наблюдается на 2-е сутки.

2. Нами разработан метод выделения и очистки ХП, который позволяет получать гомогенный фермент с высоким выходом.

3. Установлено, что ХП из бактерий S. marcescens - гемнесодержа-щий белок с молекулярной массой 58 «Да, состоящий из двух идентичных субъединиц по 29 «Да каждая. Определены основные кинетические характеристики ХП: Км(Н202)= 3,0* 10"2 и КМ(ВГ)= 6,9'10"2М. Энергия активации фермента составила 10,7 кДж/моль. Удельная активность полученного гомогенного препарата - 430 ц/мг белка.

4. Оптимум pH фермента лежит в пределах 4,1-5,8. Установлено, что ацетат-ион является еще одним субстратом для ферментативной реакции. Константа ионизации аминокислоты, ответственной за проявление каталитических свойств ХП, соответствует константе ионизации серина.

5. Ингибиторами фермента являются фторид-ион, ионы меди, ФМСФ. Фторид-ион - неконкурентный ингибитор, ФМСФ - необратимый ингибитор. Ингибирующий эффект спиртов усиливается в ряду: метанол -этанол - метоксиэтанол - 2-пропанол.

6. Исследование аминокислотной последовательности первых двадцати N-концевых аминокислот молекулы ХП показало сходство с некоторыми уже изученными гемнесодержащими бактериальными ГП в 11 позициях при смещении на одну позицию вправо. Однако гель-диффузионный эксперимент не подтвердил наше предположение о сходстве иммунных свойств данных ферментов.

7. Впервые, на основе полученных результатов, нами был предложен механизм галогенирования ГП с участием ацетат-ионов.

Основное содержание диссертации отражают следующие работы:

1. Бурдь В.Н., Юркевич О.В. [в наст. вр. Васильева], Ильенко С.Н., Каминская A.C. Выделение и очистка гапопероксидазы из штамма Serratia marcescens // Мат. Гродн. областной конф. молодых ученых. - 1991. -С. 26.

2. V.N.Burd, O.V.Yourkevich, A.I.Voskoboev. Bromoperoxidase from Serratia marcescens: Purification and some characteristics» // Bioengeneering. -

1993.-P. 87-89.

3. V.N.Burd, O.V.Yourkevich, A.I.Voskoboev. Purification ana characterisation of Bromoperoxidase from Serratia marcescens»// Papers of ECB6 1992.

4. V.N.Burd, O.V.Yourkevich, A.I.Voskoboev, K.-H. van Pee'. Studies or the activity of Bromperoxidase from Serratia marcescens»// Bioengeneering. -

1994. -№3. - P. 116.

5. V.N.Burd, O.V.Yourkevich, AA.Voskoboev, K.-H. van Pee'. Purificatior and properties of a non-haem chloroperoxidase from Serratia marcescens /, FEMS Microbiology Letters. - 1995. - Vol. 129. - P. 255-260.

6. V.N.Burd, O.V.Yourkevich, A.I.Voskoboev, K.-H. van Pee'. Chlorope roxidase from Serratia marcescens // 23rd Meeting of the FEBS, Basel. -

1995. - P. 289.