Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и клонирование гена антигена вируса гепатита дельта. Разработка новых подходов к гено- и серодиагностике дельта инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и клонирование гена антигена вируса гепатита дельта. Разработка новых подходов к гено- и серодиагностике дельта инфекции"

л Г"-, - РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

на правах рукописи УДК 578.891 Д:578.74]-074

РЫЖОВА Елена Васильевна ВЫДЕЛЕНИЕ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА. РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПОДХОДОВ К ГЕНО- И СЕРОДИАГНОСТИКЕ ДЕЛЬТА

ИНФЕКЦИИ

(03.00.06 - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии Научно-Исследовательского Института гриппа РАМН.

Научные руководители:

доктор биологических наук Киселев О.И.

кандидат биологических наук Иванюшина В.А.

Ведущая организация: НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Хансон К.П., кандидат химических наук Ищенко A.M.

Защита диссертации состоится ..........1996г. на заседании спе-

циализированного совета Д.001.46.01. НИИ гриппа РАМН по адресу: ул. проф. Попова, д. 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ гриппа РАМН.

у S /у

Автореферат разослан ...fi..?.;..:./.•........1996г.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы

Вирус гепатита Дельта (ВГД) распространен во всем мире, и на сегодня известны нуклеотидные последовательности ряда изолятов ВГД, полученных из различных географических регионов, таких как: Западная Европа, Центральная и Южная Америки, Азия, Ближний Восток. В соответствии с классификацией, предложенной J.L.Casey, большинство изолятов принадлежат к первому типу ВГД, второй тип, наряду с первым, встречается в Японии, ВГД третьего типа циркулирует в Южной Америке. Последовательности, принадлежащие к одному типу, гомологичны примерно на 94%, дивергенция между последовательностями разных типов достигает 30%. Внутри ВГД первого типа выделяются два субтипа. Субтип IA представляет азиатский субтип и включает изоляты из Японии и Тайваня. Субтип IB объединяет изоляты из Северной Америки и Франции. Тип и нуклеотидная последовательность генома ВГД, циркулирующего в России, не известны.

Клинические проявления ВГД инфекции могут колебаться от фульминангных гепатитов до бессимптомного носительства. Имеются данные, что особенности течения заболевания могут быть обусловлены генотипическими вариациями ВГД. Так, ВГД третьего типа вызывает крайне тяжелое повреждение печени с характерными гистологическими изменениями, зачастую приводящее к смерти. "Предполагается, что исключительная патогенность этого вируса обусловлена измененным, по сравнению с ВГД типов I и II, сайтом редактирования РНК, что приводит к нарушению баланса между малой и большой формой антигена ВГД и накоплению цитотоксической малой формы (Casey J., 1993). С другой стороны, гепатит Дельта, вызванный ВГД типа II, характеризуется довольно легким течением, с крайне редким исходом в хроническую форму (Wu G., 1996), в отличии от ВГД типа I, который в случае суперинфекции приводит к хроническому гепатиту у 80% больных (Rizzetto М., 1995). Таким образом, определение генотипа возбудителя является важной предпосылкой прогноза течения гепатита Дельта (Д).

Разнообразие генотипов ВГД, документированное на глобальном уровне, с большой долей вероятности влечет за собой разнообразие антигенных свойств ВГД различных типов. Известно, что сыворотки крови больных гепатитом Дельта, находящихся на излечении в клиниках С.Петербурга, демонстрируют различную авидность по отношению к антигенам ВГД некоторых известных изолятов типа I (Родин В., 1996). Отсюда с неизбежностью следует вывод о предпочтительном использования для диагностики ВГД адекватных тест-систем, созданных на основе последовательности либо близкородственного, либо аутентичного изолята, что в свою очередь предполагает не-

обходимость определения нуклеотидной последовательности и генотипической принадлежности ВГД, циркулирующего в конкретной популяции.

■ Наряду с традиционными методами серодиагностики, все большее развитие получает метод генодиагностики, основанный на амплификации вирус-специфических последовательностей в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Благодаря высокой специфичности и уникальной чувствительности, ПЦР является на сегодня самым эффективным средством выявления вирусов в организме и может быть использована для быстрой и надежной констатации вирусной инфекции, в том числе в отсутствии серологических маркеров, как, например, на ранних стадиях заражения или у больных с имму-носупрессией. Кроме того, ПЦР позволяет осуществлять оперативный мониторинг эффективности действия терапевтических препаратов, обеспечивая достоверный контроль виремии. Несмотря на явные преимущества, ПЦР детекция ВГД в России не проводится.

Таким образом, определение нуклеотидных последовательностей генома ВГД, циркулирующего в Северо-западном регионе России, изоляция аутентичного антигена ВГД и развитие новых подходов к гено- и серодиагностике представляется безусловно важной задачей как для изучения молекулярной эпидемиологии ВГД, так и для клинической диагностики.

Пели и задачи исследования

Цель работы состояла в определении генотипа ВГД, изоляции гена антигена аутентичного изолята ВГД и развитие на основе полученных знаний и материалов новых подходов к гено- и серодиагностике Дельта инфекции.

В соответствии с целями исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать метод амплификации фрагментов генома ВГД из сыворотки крови инфицированных пациентов.

2. Применить разработанный метод амплификации к ПЦР-диагностике гепатита Дельта.

3. Используя отработанный метод амплификации, определить нуклеотидные последовательности фрагментов генома российских изолятов ВГД.

4. Провести компьютерный анализ полученных последовательностей, определить гено-типическую принадлежность российских изолятов.

5. Выделить и проклонировать полноразмерный геи антигена ВГД.

6. Создать бактериальные продуценты рекомбинантного антигена ВГД.

7. Изучить возможности получения бактериальных штаммов, экспрессирующих одновременно малую и большую формы антигена ВГД.

8. Разработать систему детекции антител к ВГД в крови пациентов методом имму-иоблота с использованием полученного рекомбинантного антигена.

Научная новизна работы

Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей четырех изолятов ВГД, циркулирующих в Северо-Западном регионе России. Установлено, что все российские изоляты 1) принадлежат к первому типу ВГД; 2) характеризуются высокой генетической однородностью, что, учитывая относительную стабильность ВГД по сравнению с другими РНК-содержащими вирусами, позволяет предположить однородность популяции ВГД в регионе; 3) близки к итальянскому изоляту и могут быть объединены с последним в еще один подтип.

Практическая значимость работы

В результате проведенного исследования разработан метод генодиагностики ВГД, основанный на амплификации фрагментов генома ВГД в РТ-ПЦР реакциях. Предложен новый способ получения РНК-матрицы для РТ-ПЦР детекции с использованием аффинной хроматографии сыворотки, который позволяет существенно экономить трудовые и временные затраты, связанные с этой стадией анализа, а также избежать использования вредных для здоровья реагентов, таких как фенол и хлороформ. Данный способ получения матрицы может быть легко автоматизирован и в перспективе использован при постановке полностью автоматизированного диагностического метода.

На основе полученных в работе бактериальных систем, одновременно продуцирующих малую и большую формы антигена аутентичного ВГД, разработан оригинальный подход к серодетекции Дельта инфекции. Принцип детекции антител к ВГД в данном анализе основан на визуализации на нитроцеллюлозном фильтре двух или даже четырех полос фиксированной локализации, что резко уменьшает вероятность ложно-положительного ответа. Кроме того, разработанная система может рассматриваться как модельная для создания комплексных диагностикумов, основанных на использовании НЦ фильтров с иммобилизованными различными антигенами какого-либо вируса или антигенами сразу нескольких вирусов. Такие диагностикумы позволят одномоментно получить полную серологическую картину для данного вируса или обнаружить наличие множественного инфицирования.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Отработка метода амплификации фрагментов генома ВГД из сыворотки крови инфицированных пациентов.-

2. Применение разработанного метода к генодиагностике Дельта инфекции.

3. Оптимизация стадии приготовления РНК-матрицы с применением аффинной хроматографии сыворотки.

4. Определение фрагментов нуклеотидной последовательности и генотипа российских изолятов ВГД.

5. Выделение и клонирование гена антигена аутентичного изолята ВГД.

6. Получение бактериальных систем, экспрессирующих одновременно малую и большую формы рекомбинантного антигена.

7. Разработка нового способа серодетекции Дельта инфекции, основанного на использовании обеих форм антигена ВГД.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на IV международной конференции "Current trends in chronically-evolving viral hepatitis", Перуджи, 1995, и на международном симпозиуме "IX triennial intrenational simposium on virai hepatitis and liver disease", Рим, 1996.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения; обзора литературы, включающего две главы; результатов собственных исследований, включающих разделы "Материалы и методы" и "Результаты и обсуждение", изложенные в 5 главах; выводов и списка литературы. Работа изложена наЙстраницах машинописного текста, содержит таблиц, ¿^рисунков; список литературы содержит ^наименований на русском и английском языках.

Собственные исследования.

Материалы и методы

Пациенты

В работе использовались сыворотки крови пациентов клиник С.Петербурга, в крови которых был обнаружен поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Антитела к антигену ВГД (анти-HD) класса M и тотальные анти-HD определяли с использованием тест-систем НПО "Вектор" (Новосибирск) и Labsystems (Финляндия), соответственно. Штаммы

В работе использовались штаммы E.coli XLl-Blue, DH5a и BL21 из коллекции лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН. Праймеры

Для проведения работы были синтезированы следующие праймеры:

A, прямой - 5'-gagatgccatgccgacccgaagag- 3' (883-906);

B, обратный - 5'-gaaggaaggccctcgagaacaaga-3' (1288-1265);

E, прямой - 5'-cGGATCCgagatgccatgccgacccgaagag-3'(883-906);

Barn HI

F, обратный - 5'-cGGATCCgAGATCTcgagatgagccggtccgactcgag-3' (1602-1579).

Bam HI Bgl II

Праймеры А и В использовали при проведении генодетекции ВГД и при получении фрагментов для определения нуклеотидной последовательности. Праймеры Е и F использовали при выделении гена антигена ВГД.

Выделение РНК методом экстракции в растворе гуанидин тиоционата. К 100 мкл сыворотки последовательно добавляли 1) 400мкл денатурирующего раствора, содержащего 4М гуанидин тиоционата, 25мМ цитрата натрия рН 7.0, 0.5% саркозила, 2) 50мкл ;2М ацетата натрия рН 4.0, 3) Змкл 2-меркаптоэтанола, 4) 1мкл тРНК (10мкг/мл). После добавления каждого реагента раствор тщательно перемешивали инвертированием. РНК экстрагировали фенол/хлороформной смесью. После осаждения и промывки 70% этанолом, РНК растворяли в 20мкл НгО, обработанной диэтилпирокар-бонатом.

Выделение РНК протеиназным методом

К ЮОмкл сыворотки последовательно добавляли 1) 125мкл лизирующего буфера (ЮОмМ Трис-HCl, рН 7.2, 0.4 М NaCl, 0.1М ЭДТА, 4.0% ДСН), 2) 25'мкл протеиназы К (20мг/мл), 3) 1мкл тРНК (10мкг/мл). Смесь инкубировали при 37°С в течении ночи, затем РНК экстрагировали фенол/хлороформом и прицепитировали изопропанолом. После осаждения и промывки 70% этанолом, РНК растворяли в 20мкл ШО, обработанной диэтилпирокарбонатом.

Синтез кДНК в реакции обратной транскрипции (РТ-реакция)

2мкл полученной РНК добавляли к 17мкл реакционной смеси, содержащей 4мкл 5хРТ-буфера (Promega), 1мкл (200тМ)'каждого dNTP, 1мкл (100 нг) случайных гексануклео-тидов, 0.5мкл (10 ед.) рекомбинантного ингибитора РНКаз (Promega). Содержащуюся в растворе РНК денатурировали нагреванием при 93° С в течении 3 мин с последующим быстрым охлаждением при 0 0 С. Затем к реакционной смеси добавляли 0.5мкл (10 ед.) ингибитора РНКаз и ¡мкл (10 ед.) AMV обратной транскриптазы (Promega), конечный объем смеси составлял 20мкл. Реакцию проводили при 37° С в течении 40 мин. Полимёразная цепная реакция (ПЦР)

По окончании реакции обратной транскрипции 10 мкл РТ- смеси использовали в ПЦР, которую проводили в 50 мкл реакционной смеси,'содержащей 20мМ Трис-HCl, рН 8.4, 2мМ MgCl'2, 50мМ КС1, 16.3mM(NH4)2S04, 0.01% нонидет Р40 - твин 20, 200мкМ каждого dNTP, 200' пМ каждого прямого и обратного праймеров, 2ед. Taq-полимеразы

("Биотех", Москва). Реакцию проводили в 40 циклов при термальном профиле: 93° С, 1 мин.; 57° С, 1мин.; 72° С, 1.2 мин. Амплифицированые фрагменты анализировали в 1% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Клонирование фрагментов генома ВГД

В работе были получены две серии векторов. К первой серии относятся вектора, несущие фрагмент генома ВГД с координатами 883-1288, ко второй - вектора, несущие фрагмент с координатами 883-1602 , который содержит полноразмерный ген антигена ВГД.

Для создания векторов первой серии тотальная РНК была выделена из сывороток крови четырех независимо инфицированных ВГД пациентов и амплифицирована в РТ-ПЦР с использованием праймеров А и В. Фрагменты длиной 406п,о. были элюированы из геля встроены в Sma I сайт вектора pBluescript II SK+. Штамм Е.соП XLl-Blue трансформировали лигазной смесыо; рекомбинантные клоны использовали для определения нуклеотидной последовательности вставки.

Для создания векторов второй серии была использована РНК из сыворотки крови одного из пациентов, у которых были определены генотип и фрагмент нуклеотидной последовательности генома вируса. Амплифицированный с помощью праймеров Е и F фрагмент длиной 800п.о., содержащий полноразмерный ген HDAg, был элюирован из геля, рестрицирован по Bam HI сайту и встроен в Bam HI сайт вектора pBluescript II SK+ с образованием промежуточной конструкции pBS-D. Ген антигена ВГД был вырезан из вектора pBS-D по Bg!II, Hindlll сайтам и встроен в Bam HI, HindHI сайты вектора pUC-18 с сохранением рамки считывания гена lac-z; полученная плазмида названа pUC-D. Далее, ген антигена ВГД был вырезан из pBS-D по Bglll, Smal сайтам и встроен по Bam HI, Smal сайтам в З'конец гена глутатион S-трансферазы (GST) вектора pGEX-1 с сохранением рамки считывания; полученная плазмида названа pGEX-D. Вектора pUC-D и pGEX-D были использованы для получения бактериальных штаммов, продуцирующих рекомбинантный антиген ВГД. Все этапы клонирования проводили стандартными методами генной инженерии (Sambrook J., 1989). Транскрипция РНК in vitro

Вектор pBS-D был линеаризован по Hind III сайту и добавлен в количестве 1 мкг в транскрипционную смесь, содержащую 40мМ Трис-HCl, рН 7.5, бмМ MgC12, 2мМ спермидина, 0.01% БСА, 0.5мМ каждого dNTP, 0.1 М ДТТ, 50ед ингибитора РНКаз (Promega), 25ед. Т7 РНК-полимеразы (Promega) в конечном объеме 50мкл. Реакцию проводили при 40°С в течении 1 часа. По окончании реакции смесь обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКаз (Promega). РНК осаждали этанолом, растворяли в ШО,

обработанной диэтилпирокарбонатом, концентрацию РНК в конечном препарате определяли спектрофотометрически. Гибридизация по Саузерну

Амплифицированные фрагменты были иммобилизованы на нейлоновом фильтре (Amersham) методом диффузного переноса. 32Р-меченный зонд был приготовлен с использованием вектора pBS-D и набора Multiprime DNA Labelling System (Amersham) в соответствии с рекомендациями фирмы. Последующая гибридизация была проведена по стандартному протоколу (Sambrook J., 1989). Получение матрицы для ПЦР с использованием аффинных колонок

В работе использовали капиллярные колонки (Abicap), содержащие 50мкл сефарозного сорбента с пришитыми антителами к HBsAg. ЮОмкл сыворотки разводили равным объемом физиологического раствора и наносили на колонку. Для удаления неспецифечески связавшегося материала колонку промывали 500мкл физ. раствора. Специфически связавшиеся частицы смывали с колонки 150мкл раствора следующего состава: 3.2М гуа-нидин тиоционата, 20мМ цитрата натрия рН 7.0, 0.4% саркозила. Элюат собирали в микропробирки, содержащие 20мкл 2М ацетата натрия рН 4.0, 2мкл 2-меркаптоэтанола, 1мкл (Юмкг) тРНК. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и осаждали 3 объемами этанола. Полученный после центрифугирования осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 20мкл НгО, обработанной диэтилпирокарбонатом; 2мкл раствора использовали в реакции обратной транскрипции. Определение нуклеотидной последовательности

Нуклеотидные последовательности клонированых фрагментов определяли методом Сэнгера (Sanger F., 1977) с модификациями, состоящими в использовании термостабильной ДНК полимеразы и проведении реакции в 5 циклов. Модификации были введены для уменьшения интерферирующего влияния GC-богатых участков, характерных для секвенируемого фрагмента. Анализ экспрессиирекомбинантного HDAg

Штаммы E.coli XL 1-Blue, DH5a и BL21 были трансформированы полученными плаз-мидами. Индуцированные клетки лизировали ультразвуком, цитоплазматическую и мембранную фракцию разделяли центрифугированием. Белки цитоплазматической и мембранной фракций анализировали в ПААГ электрофорезе по Laemmli. Иммунобло-тинг белков клеточного лизата проводили с использованием моноклональных антител к HDAg и белка А, коньюгированного с пероксидазой хрена. Детекция анти-HD в сыворотке

Индуцированные бактериальные клетки осаждали центрифугированием, лизировали ультразвуком и осветленный лизат наносили на форез из расчета 2 мкл исходной

культуры (OD6oo = 1) на дорожку. По окончании фореза белки переносили на НЦ фильтры. После инкубации в блокирующем буфере фильтры разрезали на полоски, высушивали при комнатной температуре и хранили при +4° С. Образцы сывороток разводили 1:100 в блокирующем буфере и инкубировали с НЦ фильтрами в течении ночи при комнатной температуре. Обработку фильтров белком А, коньюгированного с перокси-дазой хрена, и детекцию полос в присутствии диаминобензидина проводили стандартным методом (Sambrook J., 1989),

Результаты и обсуждение

1. Разработка метода амплификации фрагментов генома ВГД из сыворотки крови инфицированных пациентов

Амплификация фрагментов генома РНК-содержащих вирусов состоит из трех последовательных этапов: выделение РНК, синтез комплементарной ДНК в реакции обратной транскрипции (РТ) и амплификация кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР). С целью выбора оптимальных условий амплификации мы варьировали способы постановки каждого из трех этапов. Схема эксперимента приведена на рисунке 1.

Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) отрабатывали на контрольной ДНК-матрице, содержащей рекомби-нантный геном ВГД (матрица любезно предоставлена доктором J.L.Casey, Georgetown University). В работе использовали пары прай-

меров А-В, специфичных

Рисунок 1. Схема отработки метода амплификации фрагментов к консервативным „_„

генома ВГД из сьжоротки крови инфицированных пациентов.

участкам генома ВГД,

Известно, что температура отжига праймеров часто оказывается критическим условием специфической амплификации. В нашем случае праймеры направляли специфическую амплификацию при температурах отжига в интервале от 55° С до 60° С (впоследствии эти данные были подтверждены при работе с клиническими образцами). Существенным

Сыворотка крови, 100 мкл

Выделение РНК

ГТЦ метод Протеиназный метод

1/2 ^""[/10 1/50^ . 1/2

Синтез кДНК Синтез кДНК

Специфический праймер Случайные гексакуклеотиды Специфический Случайные праймер гексануклеотиды

I i I I I I I I I t ] !

ПЦР

A.l А.2 А.З Б.1 Б.2 Б.З B.l В.2 В.З Г.1 Г.2 Г.З

фактором при постановке ПЦР оказалась концентрация ионов Мд"+ в реакционной смеси. Специфическая амплификация фрагмента наблюдалась при использовании ионов М§++ в концентрации 2мМ; уменьшение концентрации до 1мМ, равно как и увеличение до бмМ, приводило к ослаблению синтеза фрагмента ожидаемой длины и появлению дополнительных фрагментов.

Тотальную РНК из 1 ООмкл сыворотки крови больного с диагнозом хронический гепатит Дельта выделяли двумя способами: протеиназным методом и гуанидин-тиоционатным методом (ГТЦ). Аликвоты, равные 1/2, 1/10 и 1/50 объема препаратов РНК, использовали в двух параллельных РТ-реакциях. В одном случае в качестве затравки синтеза кДНК использовали специфический к РНК ВГД праймер, в другом -случайные гексануклеотиды. Полученные 12 вариантов кДНК амплифицировали в ПЦР в соответствии с ранее подобранными условиями. Результаты ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В результате было выявлено, что наилучшая амплификация достигается при использовании кДНК, синтезированной от случайных гексануклеотидов на 1/10 части РНК-матрице, выделенной методом ГТЦ. Уменьшение или увеличение количества вносимого в РТ препарата матрицы приводит к ослаблению синтеза. На результатах амплификации отрицательно сказываются использование РНК, выделенной протеиназным методом, а также использование специфических праймеров в реакции ревертирования. При сочетании этих вариантов амплифицированные фрагменты не детектируются.

Таким образом, на основании проведенного эксперимента можно сделать несколько заключений, касающихся оптимизации условий проведения амплификации РНК ВГД.

1. Выделение РНК предпочтительно проводить методом ГТЦ. Гуанидин тиоционат относится к числу наиболее сильных денатураитов белков и, очевидно, в отсутствие специфических ингибиторов РНКаз способен предохранять РНК от деградации в большей степени, чем протеиназа К.

2. В РТ- реакции не следует использовать всю РНК, полученную из 100 мкл сыворотки. Известно, что сывороточные белки ингибируют активность обратной транскриптазы. Вероятно, даже после тщательной фенол/хлороформной экстракции, применяемой в обоих методах выделения, нежелательные примеси остаются в препаратах РНК и, привнесенные в достаточном количестве в РТ смесь, заметно подавляют реакцию.

3. Случайные гексануклеотиды направляют более эффективный синтез кДНК, чем специфические праймеры. Наблюдаемый факт может быть следствием по крайней мере двух причин: 1) температурный режим, оптимальный для активности АМУ транскриптазы (37° - 42° С), не является таковым для специфического отжига праймеров (55° - 60° С),

что приводит к уменьшению числа событий специфической инициации полимеризации; 2) случайные гексануклеотиды обеспечивают множественные сайты инициации, в результате чего, на фоне увеличения общего количества продуктов синтеза , вероятно, увеличивается также и количество кДНК, способной к взаимодействию с праймерами в последующей ПЦР.

В дальнейшей работе амплификация фрагментов генома ВГД проводилась в соответствии с подобранными оптимальными условиями.

2. ПЦР-диагностика Дельта инфекции

Настоящий раздел посвящен использованию метода амплификации для диагностики ВГД, а так же новым разработкам по оптимизации постановки ПЦР-анализа. 2.1. Приложение метода амплификации к диагностике гепатита Дельта

Очевидно, что разработанный метод амплификации фрагментов генома ВГД, полученного из сыворотки инфицированного пациента, может быть применен к ПЦР-детекции Дельта инфекции. Используя разработанный подход, мы проверили 43 сыворотки крови, содержащих тотальные антитела к антигену ВГД (анти-НБ), 13 сывороток исследуемой выборки содержали так же 1£М анти-НБ. Вирус-специфические нуклеиновые кислоты были обнаружены в 22 сыворотках. Причем, в 11 сыворотках были выявлены как фрагменты вирусной РНК, так и ^М анти-НБ; столько же сывороток оказались РНК" и ^М анти-НБ+; в одной сыворотке были выявлены только анти-НБ; 20 сывороток оказались отрицательными в отношении обоих маркеров. На основании полученного распределения мы определили коэффициент взаимной сопряженности маркеров. Построенная количественная характеристика (К = 503, %(1) = 10.8) значимо отлична от нуля, что указывает на существование связи между результатами детекции 1£М анти-НБ и РТ-ПЦР обследования. Поскольку РНК ВГД й ^М анти-НБ детектируются как при остром гепатите Д так и при хроническом и не детектируются на стадии ремиссии, эти маркеры можно рассматривать как признаки репликации вируса. Поэтому обнаружение положительной связи между ними в проведенном эксперименте свидетельствует об адекватности применения разработанного метода амплификации к РТ-ПЦР диагностике гепатита Д.

Специфичность .анализа- .подтверждалась гибридизацией - амплифицированных фрагментов с 32Р- меченой плазмидой, содержащей кДНК генома ВГД. В пределах исследуемой выборки не было выявлено ложно-позитивных результатов.

Чувствительность РТ-ПЦР детекции была определена с использованием РНК ВГД, синтезированной т \iitro. Ряд десятикратных разведений РНК с концентрацией, равной, в пересчете на вирусные частицы, 2х107-2х10 частиц в образце объемом Юмкл,

были использованы в РТ-ПЦР реакциях. Специфический фрагмент определялся в пробах, содержащих вплоть до 2х102 частиц. Таким образом, предельная концентрации вирусных частиц, выявляемая в данном анализе, составляет примерно 2x104 частиц в мл сыворотки.

Таким образом, показано, что разработанный метод амплификации фрагментов генома ВГД характеризуется надежной специфичностью и высокой чувствительностью и может быть использован в клинической практике для диагностики Дельта инфекции.

2.2. Использование аффинной хроматографии при постановке РТ-ПЦР анализа

Несмотря на очевидные преимущества, РТ-ПЦР относится к разряду трудоемких методов диагностики. Как обсуждалось в главе 1, критическим моментом постановки реакции является тщательная депротеинизация нуклеиновых кислот, что, как правило, сопряжено со значительными трудовыми и временными затратами, а также с использованием вредных для здоровья реагентов, таких как фенол и хлороформ. Для оптимизации этой стадии и увеличения фактической чувствительности детекции, мы разработали метод получения РНК-матрицы посредством концентрации, очистки и денатурации вирусных частиц на афинном сорбенте.

В работе использовались капиллярные колонки "АЫсар", содержащие сефароз-ный гель с иммобилизованными антителами к НВвАя и специфически сорбирующие ВГД и ВГВ частицы. На первом этапе работы мы подобрали условия проведения аффинной хроматографии с целью получения пригодной для РТ-ПЦР матрицы, используя РНК ВГД - позитивные сыворотки. Оказалось, что при использовании подобранных условий (подробно описаны в "Материалах и методах") материал смыва может быть амплифицирован в РТ-ПЦР без фенол/хлороформной экстракции.

На следующем этапе мы проверили относительную способность к амплификации РНК, полученной из сыворотки ГГЦ методом, и РНК, содержащейся в препарате смыва. В опыте использовали набор из 5 сывороток. В результате оказалось, что препараты РНК-матрицы, полученные как стандартным методом, так и при помощи колонок, ам-плифицируются примерно с одинаковой эффективностью.

При работе с колонками мы обнаружили, что очищенный из ЮОмкл сыворотки препарат может быть использован в РТ-ПЦР в"полном объеме. Причем, в этом случае не только не наблюдалось ингибированис реакции, как в случае РНК, выделенной стандартным методом (обсуждалось в главе I), но, более того, отмечалось некоторое увеличение выхода амплифицированного фрагмента. Однако амплификация ухудшалась при использовании в реакции препаратов матрицы, полученных из большего объема той же сыворотки. Очевидно, увеличение количества связавшихся частиц приводит

к соответствующему увеличению количества нежелательных белковых примесей во фракциях смыва. Основываясь на этих наблюдениях мы попытались увеличить фактическую чувствительность детекции, используя комбинацию аффинной хроматографии и фенол/хлороформной экстракции.

В эксперименте использовали 6 анти-1ГО позитивных сывороток в которых не удалось обнаружить РНК ВГД стандартным методом детекции. Вирусные частицы из 500мкл сыворотки были сорбированы на колонке и денатурированы ГТЦ раствором. Затем из фракции смыва была выделена вирусная РНК методом фенол/хлороформной экстракции. Вся полученная РНК была использована в РТ-ПЦР. В контрольном эксперименте сыворотки тестировались стандартным методом детекции. По результатам эксперимента вирус-специфические последовательности удалось обнаружить в 3 сыворотках из б, проанализированных с использованием комбинированного метода; в контрольном эксперименте видимые фрагменты не детектировались.

3. Определение фрагментов нуклеотидных последовательностей российских изолятов ВГД

Мы уже упоминали о том, что генотип и нуклеотидные последовательности ВГД, циркулирующих в России и, в частности, в ее Северо-Западном регионе, неизвестны. Используя отработанный метод амплификации, мы получили кДНК фрагментов генома четырех российских изолятов и определили их нуклеотидную последовательность.

Для характеристики штаммов ВГД, циркулирующих в Северо-Западном регионе России, мы выбрали относительно стабильный сегмент генома ВГД с координатами 901-1265, поскольку сравнение нуклеотидных последовательностей данного сегмента различных изолятов было положено в основу классификации ВГД. Фрагмент 901-1265 содержит сайт редактирования РНК (1012), сигнал полиаденилирования (949-954), З'концевую часть открытой рамки считывания антигена ВГД (954-1265) и фланкирован консервативными последовательностями домена антигеномного рибозимного расщепления и средней части гена НБ.А^, что обеспечивает возможность амплификации фрагмента у отдаленных изолятов с использованием одного набора праймеров.

В результате определения нуклеотидных последовательностей было установлено, что в пределах исследуемого фрагмента все российские изоляты характеризуются высокой степенью гомологии, оцениваемой в 99%. Принимая во внимание относительную стабильность ВГД по сравнению с другими РНК-содержащими вирусами, выявленная в настоящей работе высокая гомология между российскими изолятами позволяет предположить однородность популяции ВГД, циркулирующих в Северо-Западном регионе

России, хотя для окончательного заключения требуется, конечно, изучение более представительной выборки, включая исследования пациентов из других регионов страны.

При сравнении полученных нуклеогидных последовательностей и последовательностей изолятов, представляющих известные типы и подтипы ВГД, установлено, что все российские изоляты принадлежат к первому типу ВГД и наиболее близки к итальянскому изоляту (рис 2). По отношению к последнему российские изоляты не содержат делеций или инсерций, все наблюдаемые вариации последовательностей обусловлены точечными нуклеотидными заменами. Гомология российских изолятов с итальянским изолятом (ВГД типа 1) составляет 98.1 - 97.5% на нуклеотидном уровне и 97.1 -95.1% на аминокислотном; с изолятом ША-1 (тип I, подтип 1В)- 93.5 - 94% и 89.1 -88.8%, соответственно; с изолятом ,1арап-2 ( тип I, подтип 1А) - 91.7 - 91.3% и 85.3 -83.4%. Гомология с отдаленно родственными изолятами 1арап-1 (тип И) и Реги-1 (тип 1II) оценивается в 82.6 - 81.2% и 77.8 - 77.3% на уровне нуклеотидной последовательности и 71.6 - 69.6% и 64.8 - 62.8% на уровне аминокислотной последовательности.

В соответствии с классификации ВГД, основанной на построении и анализе филогенетического древа, тип I представлен наиболее многочисленной группой изолятов. Внутри первого типа выделяются два подтипа, 1А и 1В, каждый из которых объединяет изоляты с уровнем гомологии 97-98%. Штаммы, не отнесенные к выделенным подтипам, отличаются большей дивергенцией как между собой, так и по отношению к сгруппированным изолятам. Поскольку гомология между российскими и итальянским изолятами находится в пределах указанной величины, эти изоляты могут быть объединены в еще один подтип. В этой связи любопытно отметить данные по преимущественному реагированию ВГД- позитивных сывороток больных московских клиник с пептидами, синтезированными на основе последовательности итальянского изолята по сравнению с пептидами, синтезированными по последовательности штамма ША-!. Аналогичные результаты были получены другой группой исследователей при обследовании пациентов клиник С.Петербурга. Эти наблюдения можно отнести за счет близкого родства российских и итальянских штаммов, что согласуется с данными, полученными в настоящей работе.

901 911 921 931 941 951

Russia-1 GAAGAGGAAAGAAGGACGCGAGAC-GCAAACCTGTGAGTGGAAACCCG---CTTTATTC

Italy ........................-.......................---........

Usa-l ........................-..................................

Japan-2 ........................-A.-...............................

Japan-1 ..............A..T..-...-..G..-.C..........С. .T.АТС.....- . -

Peru-1 ...........G.....A. . - . . .GA. . . . - .С......-ТСТ.-ГТ.-СС.......-

961 971 981 9Э1 1001

Ruseia-l ACTGGGGTCG-ACAACTCTGGG---GAGAAA-A---GGGCG-GATCGGCTGGG-A-A-G

Italy ..........-..............................-...........-.-.-.

USA-1 ..........-................. .GG- .---. . .A. - ,G.........-.-.-.

Japan-2 ..........-............................A.-.....A....A-.-.-.

Japan-1 --.....A- . T. .-....-. A.---.. .TGG- .---A. .C.TTG.T. .GG . . . - .G.T .

Peru-1 -G.T....-.--.-..С.....ACCC..Т..T.CCC...-.-.G-A...G...T.-.--

1011 1021 1031 1041 1051

Russia-1 AG-TATATCCTATGGAAATC-CCTGGGTTCCCCTGATGTCCAGCCCCTC-CCCG-ATCC

Italy ..-............G....-..C..T......................-....-G...

USA-1 ...............G....-.....С.......T........Г.....-....-G...

Japan-2 ..-............G....-..A. .T.....G.C.C............-____-G...

Japan-1 G.C.-..-....C..G....-.......С..............T.....-..,-CG...

Peru-1 . . CCC. ..--......G..-.TG.........T.G......G.T......T....T-.-.

1061 1071 1061 1091 1101 1111

Russia-1 -GAGAGAAGGGGGACTCCGGGACTGCCTG-CA-GACTG-GGGACGAAGCCTCCCCCGGG

Italy -.......................С____-..-.....-...........G........

USA-1 -...ТА..................C.T. .-. .Т.-. . .-...........G........

Japan-2 Т.-.Г..................GC.T..-..T.-T..-........... G........

Japan-1 -..........A........A. ...... .C..T--T..A...........G. .A.....

Peru-1 -.G. .A..............A...C....-..-.G...-..C........C. .A.....

1121 1131 1141 1151 1161

Russia-1 CGCTCCCCTCGATC-CACC-T-TCGAGGGGGATCACACCCCCA-ACCGGCGGGCCGGCT

Italy ..............-....-.-.....................-...............

USA-1 ...........T. .-....-.-.........T...........-...T...........

Japan-2 ...........G..-....-. -.........T...........-...A...........

Japan-1 ...........GA.-.T..-.C.G..-....T.....T.....-...C...........

Peru-1 ...........G- .GGG. .G.C- .-.TT, . .T...........GGT-C...........

1171 1181 1191 1201 1211 1221

Russia-1 actcttctttcccttctctcgtcttcctc-ggtcaa-cctcctgagttcctcttcttct

Italy .............................-......-.....................С

USA-1 .T...........................-......-......A..............С

Japan-2 .............................-......... . .T.A...............

Japan-l ..........T....TC.........A..-.....GC.T.-.................С

Peru-1 GT.........T. . .TCG.....A...-.T..C..G-.....G...............С

1231 1241 1251 1261

Russia-1 tcctt-gctgaggttcttgcctcc-cgccgatagctgcttct-tc

Italy .....-..................-....................

USA-1 .....-............T.....-...............-.C..

Japan-2 .....-............С.....-...G.CC. .T......-C. .

Japan-l .....-.......A....T.....-. . .G. .G.............

Peru-1 .-...G........G...T..C..T.-.G.CC..T.......-..

Рисунок 2. Сравнение фрагментов нуклеотидных последовательностей некоторых изо-лятов ВГД, представляющих известные генотипы и подтипы. Генотипы изо-лятов описаны в тексте. Нумерации дана в соответствии с Wang K.S, 1987.

4. Выделение и клонирование гена антигена ВГД

Из результатов, полученных нами в предыдущем разделе, а так же других авторов, с неизбежностью следует вывод о предпочтительном использовании для серологической диагностики Дельта инфекции у лид российской популяции тест-систем, основанных на аутентичном антигене ВГД или, по крайней мере, на антигене итальянского изолята. Поскольку импортные тест-системы часто не доступны для широкого применения в отечественных клиниках, мы попытались получить рекомбинантньш антиген российского изолята и показать возможность его использования в диагностических целях.

4.1. Выделение гена антигена ВГД

Ген антигена ВГД (HDAg) был выделен из РНК сыворотки крови инфицированного пациента разработанным методом амплификации и клонирован в экспрессивные вектора E.coli, как описано в "Материалах и методах", с образованием результирующих плазмид pUC-D и pGEX-D. Схема клонирования приведена на рисунке 3. Вектор pUC-D содержит полноразмерный ген антигена ВГД вслед за дополнительными 18 кодонами, сформированными 5'концом гена lac-z и нуклеогидами полилинкера pUC-18. Клонированный ген находится под контролем lac промотора и индуцируется ИПТГ. Вектор pGEX-D содержит гибридный ген глутатион S-

трансферазы-антигена ВГД (GST- Рисунок 3. Схема конструирования векторов, на-HDAg) под контролем tac (tip-lac) правляопшх экспрессию рекомбинантного HDAg.

промотора. Экспрессия гибридного гена также индуцируется ИПТГ.

Lia

■*-1 ВмпЩ I

к ДНК HDAg тр,

®жш—

ПЦР

КЛОНИРОВАНИЕ в Bam HI cíkt вектора

pBluescrtpt IISK+

У Sua h!,sru 1.кы гз

4. 2. Экспрессия рекомбннантного антигена ВГД в E.coli

Экспрессия HDAg, направляемая плазмидами pUC-D и pGEX-D, изучалась в штамме E.coli BL21. По результатам ПААГ электрофореза установлено, что обе плаз-миды направляют эффективный синтез белков ожидаемых размеров; малой формы антигена ВГД молекулярной массой 25кДа и гибрида малой формы ■ антигена ВГД-глутатион S-трансферазы молекулярной массой 51 кДа. Экспрессия обоих протеинов была подтверждена иммуноблотингом с использованием моноклональных антител к антигену ВГД (рис. 4, дорожки 3,4).

Далее, мы попытались получить клетки E.coli, способные к одновременной экспрессии малой (HDAgS) и большой (HDAgL) форм антигена ВГД, каковая наблюдается при естественной инфекции. С этой целью для трансформации полученными конструкциями мы использовали штамм E.coli XLl-Blue, несущий Sup Е мутацию. В инфицированных гепатоцитах на поздней: стадии репликации генома ВГД терминирующий кодон трансляции малой формы аотигена UAG замещается на UGG кодон, который кодирует триптофан, что приводит к удлинению рамки считывания HDAgS и образованию HDAgL. Возникновение этой замены регулируется механизмом высоко специфического редактирования РНК. С другой стороны,' амбер супрессор E.coli Sup Е обеспечивает прочтение стоп кодона трансляции UAG как кодирующего глутамин кодона. Причем, супрессия именно этого кодона осуществляется весьма эффективно, и в присутствии супрессорных тРНК около половины терминирующих сигналов считываются как кодоны соответствующей аминокислоты. На основании этих предпосылок мы предположили, что в Sup Е штаммах, трансформированных нашими векторами, может осуществляться одновременный синтез обеих форм HDAg за счет супрессии стоп кодона и удлинения рамки считывания малой формы HDAg на 19 дополнительных триплетов вплоть до UGA терминирующего кодона гена большой формы HDAg.

По результатам ПААГ электрофореза, в штамме XLl-Blue, трансформированном вектором pUC-D (XLl-Blue/pUC-D), и в штамме, трансформированном pGEX-D (XL1-Blue/pGEX-D), наблюдался высокий уровень экспрессии рекомбннантного антигена как

12 3 4

Рисунок 4. Иммуноблотинг осветленных лизатов 5ирЕ+ и ЭирЕ- штаммов-продуцентов HDAg. 1 - штамм ХЬ1 -ВЫие/рОЕХ-О; 2-штаммХЕ1-В1ие/риС-0;;"^ ;- :

3 - штамм В^21/рСЕХ-0;

4 - штамм ВЬ2]/р1ТС-0.

Стрелками указаны положения малой формы HDAg и малой формы гибрида ОЗТ-НОА^

в нативном (25кДа), так и в гибридном (51кДа) варианте, соответственно. Однако, в результате иммуноблотинга, было обнаружено раздвоение видимых на электрофоре-грамме рекомбинантных белков (рис. 4, дорожки 1,2). В клетках XLl-Blue/pUC-D наблюдается экспрессия двух белков, специфически реагирующих с моноклональными антителами и соответствующих по размерам HDAgS (25кДа) и HDAgL (28кДа). В клетках XLl-Blue/pGEX-D детектируются белки, соответствующие по размерам GST-HDAgS (51кДа) и GST-HDAgL (54кДа). Аналогичные результаты по экспрессии малой и большой форм HDAg, а так же малой и большой форм гибрида GST-HDAg были получены для другого Sup Е+ штамма - DH5a.

Из полученных нами данных следует, что, действительно, рекомбинантные штаммы Sup Е+, имитируя процесс редактирования РНК в гепатоцитах, способны продуцировать одновременно малую и большую формы антигена ВГД, которые выявляются на иммуноблоте в виде сдвоенных полос. Имитация редактирования скорее всего происходит в соответствии с предполагаемым механизмом, поскольку в Sup Е- штамме BL21 наблюдается образование единственного белка, соответствующего малой форме HDAg, что свидетельствует о строгой терминации трансляции на UAG стоп кодоне в отсутствии амбер-супрессора.

5. Использование рскомбинантного антигена ВГД для детекции анти-HD в крови пациентов

Полученные рекомбинантные штаммы, продуцирующие обе формы HDAg, мы применили для детекции антител класса G к антигену ВГД (IgG анти-HD) в сыворотке крови пациентов, используя технику иммуноблотинга, как описано в "Материалах и методах". Поскольку на момент проведения исследования в ГИСКе им.Л.А. Тарасевича не было стандартной панели сывороток для ВГД, соотношение количества наносимого антигена и разведения сыворотки, которое обеспечивает отчетливый сигнал при отсутствии неспецифического связывания, было подобрано эмпирически с помощью анти-HD -позитивных и -негативных сывороток, проверенных на тест-системе Labsystem, Финляндия.

Детекция анти-HD в сыворотке проводилась на НЦ фильтрах, которые были получены после электропереноса лизата бактериальных клеток, продуцирующих обе формы HDAg (штамм XLl-Blue, трансформированный pUC-D). Инкубация НЦ фильтров с сыворотками инфицированных ВГД пациентов выявляет две специфические полосы, соответствующие малой и большой форме HDAg. Специфическое реагирование наблюдалось так же и при использовании НЦ фильтров с иммобилизованным лизатом клеток XLl-Blue, трансформированных pGEX-D.

Описанная система обнаружения ^О анти-НР отличается высокой специфичностью, так как предполагает связывание антител одновременно с двумя формами антигена, которые представлены в виде дискретных полос фиксированной локализации. Кроме того, мы показали возможность использования НЦ фильтров с иммобилизованным смешанным лизатом штаммов ХЫ-В1ие/риС-0 и ХЫ-Шие/рОЕХ-Б. В этом случае при связывании с анти-НЮ проявляются 4 полосы, соответствующие большой и малой формам GST-HDAg и большой и малой формам НПАе, Выявление одновременно 4 полос с известной подвижностью на одном фильтре резко уменьшает вероятность ложно-положительного ответа.

Таким образом, показано специфическое реагирование рекомбинантного антигена ВГД с сывороткой и разработана лабораторная методика выявления анти-1ГО в крови пациентов, основанная на одновременном использовании малой и большой форм антигена. Полученные в работе рекомбинантные штаммы и разработанные методы могут быть использованы при создании тест-системы повышенной специфичности для детекции анти-НБ. Кроме того, разработанная система может рассматриваться как модельная для создания комплексных диагностикумов, основанных на использовании НЦ фильтров с иммобилизованными различными антигенами какого-либо вируса или антигенами нескольких вирусов. Такие диагностикумы позволят одномоментно получать полную серологическую картину для данного вируса или выявлять наличие нескольких инфекций.

Выводы

1. Разработан метод генодиагностики Дельта инфекции, основанный на РТ-ПЦР амплификации фрагментов генома ВГД из сыворотки крови.

2. Разработан метод получения РНК-матрицы для РТ-ПЦР анализа с использованием аффинной хроматографии сывороток. Показано, что 1) аффинная хроматография сывороток может успешно заменять стадию фенол/хлороформной экстракции при получении матрицы для рутинного РТ-ПЦР анализа; 2) комбинированный метод получения матрицы, включающий аффинную хроматографию и последующую экстракцию фенол/хлороформом, может быть использован для анализа сывороток больных с низким уровнем виремии.

3. Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей изолятов ВГД, циркулирующих в Северо-Западном регионе России. Установлено, что все российские изоляты 1) принадлежат к первому типу ВГД; 2) характеризуются высокой генетической однородностью; 3) близки к итальянскому изоляту и могут быть объединены с последним в еще один подтип.

4. Выделен из сыворотки больного и проклонирован в вектора Е.соК полноразмерный ген антигена ВГД. Показана высокая экспрессия рекомбинантного белка в бактериальных клетках.

5. Впервые получена оригинальная бактериальная система, в которой осуществляется одновременный синтез малой и большой форм антигена ВГД по эукариотическому типу экспрессии.

6. Разработан новый подход к выявлению анти-НБ в крови пациентов методом имму-ноблота, основанный на одновременном использовании обеих форм антигена ВГД.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Иванюшина В.А., Рыжова Е.В., Грудинин М.П., Каторгина Л.Г., Никонова А.Н., Виноградова E.H., Яковлев A.A. Частота антител к Дельта вирусу у больных HBs-позитивным гепатитом. Вопросы вирусологии.-1996.-№4. - с.

2. Ryzhova E.V., Gultyaev А.Р., Grudinin М.Р., Kisseley ОЛ. The possible RNA packaging signals of-Ty-1 transposans: the structural analogies with viral origins of assembly. 1993. Inter. J. Genome Res.;, v.1, p.149-157.

3. Ryzhova E.V., lvaniushina V.A., Grudinin M.P., Ivanova O.Y. HDV prevalence in St. Petersburg. Progress in clinical Virology, joint meeting. Abstracts, p.363. Prague. 1995.

4. lvaniushina V.A., Ryzhova E.V., Grudinin M.P., Vinogradova E.N., Yakovlev A.A. Molecular approaches for HDV disease control in St. Petersburg. Current trends in chronically-evolving viral hepatitis, 4th international conference. Abstracts, p.46. Perugia. 1995.

5. Ryzhova E.V., lvaniushina V.A., Grudinin . M.P.,Vinogradova E.N. PCR detection, molecular cloning and genotype characterization of HDV in Russia. IX triennial intranational simposium on viral hepatitis and liver disease, Abstracts, p. 115. Rome. 1996.