Выделение и изучение сульфатредуцирующих бактерий из экосистем, подверженных влиянию металлургических предприятий

Франк, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и изучение сульфатредуцирующих бактерий из экосистем, подверженных влиянию металлургических предприятий
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение сульфатредуцирующих бактерий из экосистем, подверженных влиянию металлургических предприятий"

На правах рукописи

Франк Юлия Александровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ИЗ ЭКОСИСТЕМ, ПОДВЕРЖЕННЫХ ВЛИЯНИЮ МЕТАЛЛУРГИЧЕСКИХ ПРЕДПРИЯТИЙ

03.00.16 - Экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 2006

Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии ГОУ ВПО Томский государственный университет

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Ольга Викторовна Карначук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Евгений Васильевич Евдокимов

кандидат биологических наук, доцент Лидия Ивановна Сваровская

Ведущая организация: Томский Политехнический университет

Защита диссертации состоится «15» ноября 2006 г. в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 при Томском государственном университете по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 36

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета

Автореферат разослан «04» октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Ю. Просекина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В местах действующих и заброшенных шахт образуются кислые дренажные воды. Они содержат большое количество тяжелых металлов и сульфатов, а также имеют низкий pH, являющийся результатом окисления сульфидов металлов. В настоящее время широко распространены химические методы обезвреживания сульфат- и металлсодержащих сточных вод. Стоимость подобных процессов велика при не очень высокой эффективности удаления сульфата и металлов (Boonstra et al., 1999). Биологическая очистка вод, содержащих металлы, имеет несколько существенных преимуществ по сравнению с химическими методами, таких как сравнительно низкая стоимость, высокая эффективность удаления металлов и возможность повторного использования извлеченных металлов.

Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) привлекают внимание исследователей как потенциальные агенты очистки различных сред, загрязненных тяжелыми металлами и сульфатами. В ходе своей жизнедеятельности они восстанавливают сульфаты (White et al., 2000). Продукт сульфатредукции - сероводород - реагирует с ионами тяжелых металлов с образованием нерастворимых сульфидов металлов. Благоприятным фактором является редукция растворимых токсических металлов до менее токсичных или менее растворимых форм. Сульфатредукторы не только эффективно осаждают тяжелые металлы путем продукции сероводорода, но и естественным путем повышают щелочность среды, переводя серную кислоту в сульфид (Johnson, 2000).

Токсичность ионов металлов для микроорганизмов - одно из главных ограничений применения ремедиационных технологий (Johnson* 2000). Сульфатредуцирующие бактерии проявляют повышенную устойчивость к тяжелым металлам (Karnachuk et al., 2003; Karnachuk et al., 2005), однако, кинетика роста чистых культур сульфатредукторов и ингибирования их роста ионами меди (II) остается малоизученной. В условиях умеренного и бореального климата существует перспектива выделения и использования СРБ, устойчивых к низким температурам (Banks et at., 1997). В настоящее время применение микроорганизмов для очистки окружающей среды в период

с осени до весны ограничено из-за низких температур. Одним из путей преодоления данного ограничения может быть использование для бноремедиации психротолерантных микроорганизмов.

Актуальной задачей при изучении чистых культур и сообществ микроорганизмов - агентов природоохранных технологий - является также поиск эффективных и экономически выгодных субстратов для роста. Наличие органических веществ - доноров и акцепторов электронов для сульфатредукции - одно из важнейших условий обеспечения жизнедеятельности для большинства СРБ. Исследователи указывают на возможность стимуляции активности сульфатредукторов в биореакторных системах путем внесения определенных органических веществ (Какэопеп е1 а1., 2004), Нерастворимые природные фосфаты, например фосфориты, представляют собой более дешевые ростовые субстраты по сравнению с растворимыми. Способность к утилизации природных нерастворимых фосфатов — важный механизм, обеспечивающий конкурентоспособность СРБ при бноремедиации загрязненных водных экосистем, лимитированных по содержанию фосфора.

В последние годы возрос интерес к изучению возможностей стимулирования активности аборигенной микрофлоры в загрязненных местообитаниях. Целью подобных исследований является поиск новых путей развития биоремедиационных технологий. В связи с этим, данные о численности и разнообразии СРБ в низкотемпературных экосистемах, загрязненных стоками металлургических производств, представляют особую ценность.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось выделение и изучение СРБ, перспективных для использования в технологиях очистки вод от металлов, а также определение их численности и разнообразия в загрязненных экосистемах. Дня достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Определить численность СРБ в осадках влажных местообитаний, загрязненных стоками металлургических предприятий в Норильске и на Кольском полуострове;

2. Исследовать разнообразие и состав сообщества культивируемых СРБ в загрязненных влажных осадках;

3. Выделить чистые культуры СРБ из осадков, загрязненных стоками металлургических предприятий в Норильской промышленной зоне и на Кольском полуострове, изучить их фенотипические и филогенетические характеристики;

4. Изучить филогенетические характеристики чистых культур, выделенных ранее из сточных вод Челябинского металлургического

комбината, и определить оптимальные органические субстраты -доноры углерода и электронов для их роста;

5. Установить влияние температуры на рост чистых культур СРБ, выделенных из осадков влажных местообитаний Норильской промышленной зоны, и на образование ими сероводорода;

6. Изучить влияние ионов меди и других металлов на рост чистых культур СРБ и их разнообразие;

7. Исследовать возможность использования чистыми культурами СРБ нерастворимых природных фосфатов в качестве субстратов для роста.

Научная новизна работы. В ходе исследований впервые изучено разнообразие СРБ в низкотемпературных экосистемах, загрязненных стоками металлургических предприятий. Пять новых СРБ выделены в чистые культуры. Один из полученных штаммов предположительно принадлежит к новому, ранее неописанному виду рода Desuffomicrobium. Два изолята являются новыми представителями малоизученных сульфатредуцирующих клостридий. Впервые изучена кинетика роста СРБ с использованием сахарозы и крахмала. Показана возможность роста чистых культур СРБ с использованием природного фосфорита в качестве источника фосфора. Выявлена стимуляция роста СРБ небольшими концентрациями ионов меди (II).

Практическая значимость. Данные о численности и разнообразии СРБ в осадках влажных местообитаний Норильской промышленной зоны и промышленной зоны на Кольском полуострове могут быть использованы при разработке технологий ремедиации, основанных на стимуляции аборигенного сообщества микроорганизмов, способных к переводу растворенных металлов в нерастворимую форму.

ацидотолерантн остью, способностью к использованию дешевых органических веществ (этанола, Сахаров) и нерастворимых природных фосфоритов в качестве ростовых субстратов. Штаммы могут быть рекомендованы для тестирования в in situ и ex situ технологиях очистки вод от металлов. На основе результатов изучения физиологических свойств культур возможно определение технологических коридоров оптимума для их использования в экобиотехнолошях. В настоящее время чистые культуры, выделенные в ходе данной работы, проходят испытание в биореакторной установке в Институте инженерии окружающей среды и биотехнологии Технологического университета Тампере (Финляндия) в рамках проекта «Biotechnology for metal bearing material in Europe».

энвайронментальной, индустриальной и прикладной биотехнологии «BioMicroWorld2005» (Бадахос, Испания, 2005), на Российско-французском форуме «Актуальные проблемы экологии и природопользования Сибири в глобальном контексте» (Томск, 2006), а также на 11 Международном Симпозиуме по Экологической микробиологии «ISME-11» (Вена, Австрия, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 2 в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка использованных источников и литературы. Список использованных источников и литературы включает 256 наименований, 23 из которых на русском языке, а 233 — на иностранных языках. Работа изложена на 152 листах машинописного текста, включает 19 таблиц и 25 рисунков.

Список сокращений: ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; K¡ -константа ннгибирования; рРНК — рибосомальная рибонуклеиновая кислота; СРВ - сульфатредуцирующие бактерии; APS - персульфат аммония; DAPI - 4',6-диамидин-2-фенилиндол; DGGE — денатурирующий градиентный гель-электрофорез; FISH -флуоресцентная гибридизация in situ; PBS - фосфатно-солевой буфер; SDS - додецилсульфат натрия; ТАЕ - Трис-ацетат-ЭДТА-буфер; ТЕ -Трис-ЭДТА-буфер; TEMED — тетраметилэтилендиамин.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В данной работе использовали 6 штаммов СРБ: Desul/ovibrío spp. Al, А2, A4 (выделены A.A. Давыдовым из сточных вод Челябинского металлургического комбината); Desul/ovibrio sp. R2

(выделен С.Ю, Курочкиной из стоков объединения «POJ1TOM» (Курочкина, 2002)); Desulfovibrio desulfuricam АТСС 7757 (депонирован в Американской Типовой Коллекции Культур); Desuffomicrobium ¿/>.63 (выделен O.B. Карначук из придонных осадков Черного моря). В качестве источников для выделения новых чистых культур в ходе настоящей работы использовали осадки влажных местообитаний, загрязненных стоками металлургических комбинатов ОАО «ГМК «Норильский никель» на полуострове Таймыр (Заполярный филиал) и на Кольском полуострове (АО «Комбинат «Североникель»).

Культивирование СРБ. СРБ выращивали на стандартной пресноводной среде Видделя с соответствующими добавками (Widdel, Bäk, 1992). Растворы органических веществ — доноров углерода и электронов также готовили по методу Видделя и Бака (Widdel, Bäk, 1992). Культивирование проводили при температуре +28 °С. При изучении роста СРБ при различных температурах термостат настраивали на +4 °С, +10 °С, +12 °С, +23 °С, +25 °С, +35 °С, +36 °С. Устойчивость к ионам металлов изучали, используя растворы K2Cr207 CdCl2x2.5H20, CuS04x5H20, NiCI2 C0CI2X6H2O различных концентраций. Среду и добавки стерилизовали автоклавированием в течение 30 минут при +12ГС. Растворы витаминов, аминокислот и Сахаров стерилизовали фильтрованием (0.2 цм). Для удаления кислорода среду кипятили и быстро охлаждали непосредственно перед посевом. Культивирование проводили во флаконах емкостью 15, 100 и 500 мл. Для поддержания культуры в активном состоянии делали регулярные пересевы. Эксперименты по определению кинетических параметров роста. Кинетические параметры роста микроорганизмов (истинная удельная скорость роста без учета скорости отмирания (далее «удельная скорость роста») и время удвоения культуры) определяли графоаналитически, используя данные, полученные при измерении концентрации белка в разных временных точках в период фазы экспоненциального роста (Варфоломеев, Гуревич, 1999). При изучении влияния меди (II) на рост чистых культур константу ингибировання (К,) определяли графоаналитически в координатах Диксона на участке неконкурентного ингибировання. Температурную кинетику определяли

графоаналитически на восходящем участке кривой зависимости удельной скорости роста от температуры, где применимо уравнение Аррениуса.

Все ростовые эксперименты, не связанные с определением оптимальных доноров углерода и электронов, проводили на среде с лактатом. При изучении роста СРБ с использованием нерастворимых фосфатов в среду добавляли 0.5 % стерильного природного порошка фосфорита.

Определение численности СРБ. Численность СРБ определяли методом предельных разведений на жидкой пресноводной среде Видделя. Инкубировали в течение полугода при различных условиях pH и температуры: 7.2, +4 *С; 7.2, +28 *С; 3.5, +4 'С; 3.5, +28 В качестве доноров углерода и электронов в среду вносили лактат, этанол, глюкозу, ацетат и бензоат. Подсчет СРБ проводили ежедекадно. Численность определяли визуально по обесцвечиванию индикатора восстановленности среды (резазурина Na) и почернению среды вследствие образования сульфида железа. Использовали 3 ряда последовательных разведений. Наиболее вероятное число бактерий в образцах рассчитывали с использованием таблиц Мак-Креди (Koch, 1994).

Аналитические методы. Концентрацию сероводорода определяли спектрофотометрически по методу Пахмаейра (Pachmayr, 1960). Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) с использованием фенольного реактива Фолина. Ацетат определяли методом газовой хроматографии с подкислением щавелевой кислотой. В качестве внутреннего стандарта использовали пропионовую кислоту (Kaksonen et al., 2004). В качестве газа-носителя применяли гелий. Для определения использовали газовый хроматограф «Hewlett Packard 5890 Series И, Corvallis, OR», который был оборудован капиллярной колонкой 25-30 м х 0.32 мм, покрытой слоем полиэтиленгликоля толщиной 0.25 м («НР-INNOWax, Agilent, USA») и детектором ионизации пламени.

Выделение хромосомной ДНК и амплификация гена 16S рРНК. Для выделения хромосомной ДНК микроорганизмов собирали клетки центрифугированием при 5000g в течение 15 минут в конце экспоненциальной фазы и промывали ТЕ-буфером. Клетки лизировали щелочным раствором SDS. Лизат обрабатывали смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1) (рН=8), а затем - смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1). ДНК осаждали при -20°С ЗМ ацетатом натрия (1/10 от объема) и этанолом (2.5 объема). Осадок споласкивали 70 % этанолом, подсушивали и растворяли в ТЕ-буфере (рН=8). Для амплификации гена 16S рРНК использовали следующие праймеры: 27F (5 '-GTTTG ATCCTGGCTCAG-3') и 1492R (5 ACGG YTACCTTGTTACG АСТТ-3 *) (100 mM, "Oligomer"). Амплификацию проводили в автоматическом амплификаторе «MJ Research РТС-200 Peltier Thermal Cycler, DNA Engine». После начальной денатурации при 95 °С (15 минут) следовали 30 циклов: 1 минута при 94 °С, 2 минуты при 50 °С, 2 минуты при 72 °С. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1 % агарозном геле. Коммерческое

секвенирование последовательности гена 16S рРНК (~1500Ьр) осуществлялось в Университете Хельсинки (Финляндия).

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE). Для амплификации 16S рРНК применяли праймеры: прямой BacV3f (5*-CCTACGGGAGGCAGCAG -3*) и обратный 907R (5*- CCG TCAATTCMTTTGAGTTT -3*). DGGE проводили, используя систему «Dcode System (Biorad laboratories, Hercules, CA, U.S.)». Применяли 8 % полиакриламидный гель с денатурирующими градиентами от 30 % до 65 % (100 % денатурирующий раствор содержит 7 M мочевину и 40 % формам ид). Добавляли 10 % APS и TEMED в качестве полимеризующих агентов. Лунки промывали ТАЕ. Электрофорез проводили 16 часов в ТАЕ-буфере при 60 °С и 100 V. Гель окрашивали бромистым этидием (0.5 мг/л) в ТАЕ-буфере. Фотографировали под УФ лучами (320 нм) с помощью цифровой камеры. Анализ микробного сообщества осуществляли при помощи программы «GelCompar II» (Applied Maths, Gent, Belgium). Для секвенирования отдельные полосы вырезали в УФ лучах, инкубировали 12 часов в 20 мкл стерильной дистиллированной воды при + 4 °С. Далее проводили ПЦР с теми же праймерами (прямой Вас V3f (без GC-кластеров) и обратный 907R).

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Пробы для проведения FISH-анализа фиксировали 96 % этанолом (1:1) и хранили при +4 °С. Фиксированные клетки осаждали центрифугированием при 9000 об./мин в течение 2 минут и дважды промывали PBS-буфером (10 мМ Na-фосфат, 130 мМ NaCI, рН=7.2). Клетки ресуспендировали в PBS-буфере и наносили в лунки предметных стекол ("Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co". KG, Braunschweig, Germany"), предварительно покрытых желатином, К дегидратированным клеткам в гибридизационном буфере добавляли род- и группоспецифические олигонуклеотидные зонды "MedProbe Eurogentech", Seraing, Belgium, инкубировали 1.5 часа при +46 °С в камерах, насыщенных NaCI. Промывали и окрашивали DAPI. Хранили в темноте. Подсчет проводили не менее чем на 10 полях, общее число клеток составляло не менее 1000. Результаты корректировали с вычетом сигналов, наблюдаемых при использовании отрицательного контроля (зонд NON338).

Микроскопирование и микрофотосъемка. Чистые и накопительные культуры СРБ микроскопировали с использованием фазово-контрастного устройства, окуляра хЮ, объектива «Achroplan ЮОх/ 1.25 oil Ph3». При обработке результатов FISH микроскопирование проводили с использованием эпифлуоресцентного микроскопа «Axioskop 2 plus», (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany). Микрофотосъемку осуществляли при увеличении ЮООх, применяя

фотосистему «AxioCam MRc Zeiss» и компьютерную программу MR Grab.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Численность и разнообразие СРБ в осадках влажных местообитаний, загрязненных стоками металлургических комбинатов в Норильской промышленной зоне и на Кольском полуострове

Наиболее высокая численность СРБ в осадках Норильской промышленной зоны (Заполярный филиал ОАО «ГМК «Норильский никель» на полуострове Таймыр) обнаружена на среде с глюкозой, этанолом и лактатом; она составила 1.5x107 кл/мл, что сопоставимо с ранее опубликованными результатами исследования численности СРБ в низкотемпературных морских осадках (Knoblauch et al., 1999). В ряде случаев наиболее вероятное число СРБ при +4 °С и +28 °С было одного порядка. Максимальная численность СРБ в пробе осадков, загрязненных отходами металлургического предприятия АО «Комбинат «Североникель» на Кольском полуострове (К10), составила 2.5х105 кл/мл, что на два порядка ниже численности СРБ в подобных местообитаниях на полуострове Таймыр. Для идентификации культивируемых СРБ в накопительных культурах использовали метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Показано, что Desulfobulbus является доминирующей группой СРБ в исследуемых накопительных культурах. Ранее было показано, что Desulfobulbus spp. также доминируют в сообществах биопленок в сточных водах и в загрязненных осадках (Ito et al., 2002; Kleikemper et al., 2002). Группа Desulfosarcina-Desulfococcus была многочисленной в накопительных культурах с низким pH среды. Использование ДНК-зондов, специфичных для рода показало, что Desulfococcus spp. преобладают над Desulfosarcina spp. в большинстве накопительных культур.

Влияние ионов меди (II) на состав накопительных культур СРБ, наряду с методом FISH, изучали с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE) (рисунок 1). Методом FISH установлено, что с увеличением концентрации меди от 0.007 мг/л до 200 мг/л возрастало количество и разнообразие СРБ в накопительных культурах, что, вероятно, связано с повышенной устойчивостью бактерий этой группы к меди (II) по сравнению с другими группами микроорганизмов. При повышении концентрации меди (II) до 300 мг/л в культурах К10 методом DGGE обнаружено увеличение содержания представителей Desulfovibrio spp.

1В 2В -ЗВ»

2С

т -зо

1Е ' 2В ЗЕ

■ • I. ; 4

: ■: ■ .. ~ . - >...11С.

0Г

12 3

1В- КаЫота р1скеНп (100%) 1С - А<п(1<ш>гах с1еПиУн (95%) Ю - АдгоЬас1егшт ШшеГас\епБ (96%) 1Е - РезиМозрогозтиэ опепив (97%)

2В - ЯаЫоша ргскеиН (100%) 2С - Acidovorax (1еПиуП (95%) Ю — Agrobacterium ишеГасюпз (96%) 2Е — ОезиМозрогозтиБ опепПз (97%)

ЗВ - ЯаЫота рюкеПн (100%) ЗЭ - А§гоЬас1епит ЛтеГаЫепз (96%) ЗЕ - Оези^оэрогозтиэ опепНз (97%) 31- ОезиНЪу1Ьпо рЩеаНэ (99%) ЗК - ВеБи^спчЬпо гг^пе^сиз (98%)

Рисунок 1 - БООЕ-профили бактериального сообщества в накопительных культурах. Слева направо: стандартная смесь; 1 - К10, накопительная культура, выращенная с добавлением меди (II) в качестве микроэлемента (0.007 мг/л); 2 -К10, 200 мг/л меди (II); 3 - К10, 300 мг/л меди (II); стандартная смесь

2. Выделение и изучение сульфатредуцирующих бактерий из экосистем, подверженных влиянию стоков металлургических предприятий

Из осадков влажных местообитаний, загрязненных стоками комбинатов по добыче и переработке руд Заполярного филиала ОАО «ГМК «Норильский никель» на полуострове Таймыр и АО «Комбинат «Североникель» на Кольском полуострове, были получены накопительные культуры. Из накопительных культур были выделены пять чистых культур СРВ (рисунок 2), Филогенетическую принадлежность выделенных микроорганизмов определяли путем сравнительного анализа последовательностей гена 16Б рРНК, близких к полным (около 1500 пар оснований).

Из осадков Норильской промышленной зоны на полуострове Таймыр и из осадков, загрязненных стоками металлургического комбината на Кольском полуострове были выделены 2 чистые культуры СРБ, принадлежащих к роду Оезифозрогозтия — Ое5и1/о5рогозтиз. зр. ОТ2 и Пе$и1/о$рогозтиз хр. (рисунок 3). Последний был выделен на ацетате при рН=3,5.

Рисунок 2 - Микрофотографии Desulfomicrobium sp. BL (A), Desulfosporosinus sp. OT2 (Б), Desulfosporosinus sp. MS (B) Clostridium sp. KA (Г, Д), Clostridium sp. RL (E). Фазово-контрастная микроскопия, xlOOO

Описанные на сегодняшний день представители этого рода - D. orientis (Stackebrandt et. al., 1997), D. meridie (Robertson et al., 2001), D. auripigmenti (Stackebrandt et. al., 2003) - не проявляли способности к использованию ацетата в качестве донора электронов и углерода. В настоящее время к ацетат-окисляющим СРБ исследователи проявляют особый интерес в связи с их перспективностью для использования в биореакторах в составе консорциумов, традиционно представленных сульфатредукторами с неполным окислением (Puhakka et al., unpublished). Из осадков Кольского полуострова были выделены еще два спорообразующих изолята. СРБ штаммов RL и КА наиболее близкородственны представителям рода Clostridium (рисунок 3). Интересно отметить, что ранее уже была выделена сульфатредуцирующая бактерия этого рода - Clostridium sulfatireducens, которая до настоящего времени полностью не описана (Alvarez et al., unpublished). Последовательность 16S рДНК бактерий штамма RL демонстрирует сходство с последовательностью Clostridium sulfatireducens.

47^1 № т

73»;

_Г- СЫМит (ШоЯ ХЭ5736

— СЫМип р»р1кЬмии: АР156796

Яр 55

1 С1о$1гёИш1 ИаготогрЬиш, ХБЭ184 " С1о5||(Еип кзМо^пя, У13313 ' С(о£(гЁГи«п г^ятгак АГйШ2 ~ СЫгйип ЬзУгит, 137555 " СМгйип (пдкйгатв, №№9742 м»„Г"ипсЛиге<)Ьж!гп11п;А^57(!ЕМ

ИЗ

ч:

ипоЛшк! ЬкЬмип, 00125504 — ипаЛшН Ьэйепщ 00125352 СМшпирцАаг2£51 С1м11Йш »р. КА СМгИшсуМозропщУШТЭ ~ СккШш рипт1[1кип, М60491

93»3" СЫгИш л№«)ис!га, АУ943Э61 СЫгМип 5(1 9(1*1 СЫгИш ЬоГмвгек, АУМЯВг 93«] СккЬИш апдейгат, АУ353Й7 90^ СЫгйш 5КсЬзгс^йсит,У13Ш < СквШипсеЬгкикегс. А^659 0«ЛоЬтаа1ит д11ЬИ*шп, У11563

223

ООО,

СМгШип хуЬгИ^еит, Х71355 ' ОеиЙ«рого$ш шегкКг!, №76217 ' ОеяЛ^рокига! ашрдпегй АН93051 ■ ОезЛироюаш 5р. ' ог(зпЙ1. У11570

' 0«и1Ь;рого$1пи| $р, ОТ — 0в5^(озрога5ик !р. МУ

" 0в5 ЛоЬшаЫиш ас4»Иап), У) 15Б6 ' 0езЫЬ>к>п1ас11и1п гитш, V11572

' М^ЬапоЬайгнит Ьгткхит, АР169245

-ШЛ-

Рисунок 3 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое положение чистых культур СРБ штаммов ОТ2, КА, ЯЬ, МБ, выделенных из низкотемпературных осадков промышленной зоны в Норильске и на Кольском полуострове. Масштаб соответствует 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов

Обилие спорообразующих форм СРБ в осадках, загрязненных стоками металлургических предприятий, объясняется их повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам, в частности, к низкому рН среды. Так, Оези1/озрогозтиз яр. ОТ2 обладает способностью к росту и осаждению меди в условиях начального низкого рН (нижняя граница 1.5).

Неспорообразующий микроорганизм, выделенный из осадков Норильской промышленной зоны, обозначенный как Вези1/отгсгоЫит зр. ВЬ (рисунок 4), утилизирует органические кислоты, аминокислоты, спирты, фруктозу. В отношении использования различных соединений в качестве доноров и акцепторов электронов наиболее близким к Оези1/от¡сгоЫит зр. ВЬ является ранее описанный О. арзИегопит (Розанова с соавт., 1988). Отличия в наборе используемых субстратов проявляются в возможности роста Вези1/отгсгоЬшт зр. ВЬ на среде с цитратом, сукцинатом и фруктозой, тогда как £>. арзЬегопит данные органические вещества не использует.

- £эеЛепеЛй соК

,97%Г

! 9№-

— ОевиШхпжхоЫитогШ ОюЫЬткюЫитзрзЫмхнт г Ре«и1ШшаЫит ЬааАа!ит ^^^ЬткюШт папвдкшп | 1 ОеяиНопшоЫит тлжкй 85%!' 'ОехиНоткюЫит Ьуродект'

_П- РовиНоткгоШт вр. И.

ОеиШоансгоШт еэсатЫепзе Ое§иНсмЫо уи^агЬ г Ооли№оу1Ьгк> зр. А4 Ое$иНо\г!ЬгЬ 5р. А1

I ¡_

0взи^1Ьг1о 5р, А2

■ ОеьиНснЯжк) ктдюасШг&з г Оэ$о№эу/Мо«р. В2

Роии!>1т1яж) ОезиПоьпЬгк) (1езиНчгкап$ зиЬвр. ёевиИипсапз О/^кмЬоосау&пае ■ О&шЯомЗхЮ ¡ткюевкю&з ОеаиЧомЬпо (тск)50\юап$

0.10

Рисунок 4 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое положение чистых культур СРБ, выделенных из экосистем, загрязненных отходами металлургических комбинатов (Оези1/оУ1Ьпо зрр. А!, А2, А4, Я2 и Ое5и1/оппсгоЫит зр. ВЬ). Масштаб соответствует 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов

И D. apsheronum, и исследуемый микроорганизм, способны расти на среде с сульфатом, тиосульфатом, фумаратом в качестве акцептора электронов и не используют нитрат. Однако установлена способность Desuffomicrobium sp. BL к росту на среде с элементной серой.

В работе также использованы чистые культуры СРБ, выделенные ранее из сточных вод Челябинского металлургического комбината. Культуры представлены подвижными вибрионами и определены как принадлежащие к роду Desulfovibrio (рисунок 4). Филогенетически штаммы наиболее близки к Desulfovibrio longreachii (Redburn, Patel, 1994) с 98 % гомологией.

3. Изучение физиологических свойств чистых культур СРБ

Определение оптимальных органических субстратов — доноров углерода и электронов для роста СРБ рода Desulfovibrio. выделенных из сточных вод Челябинского металлургического комбината. Desulfovibrio spp, Al, A2r A4r выделенные из сточных вод Челябинского металлургического комбината, утилизируют широкий круг органических субстратов, включая органические кислоты, спирты, аминокислоты, ароматические соединения моио- и дисахара с неполным окислением. Обнаружены также признаки роста на среде с растворимым крахмалом. Моно- и дисахара являются экономически выгодными субстратами для использования в биотехнологии. Однако оптимальными субстратами для роста Desulfovibrio sp. А4 являются этанол и лактат. Наиболее высокая удельная скорость роста и наименьшее время удвоения для чистой культуры Desulfovibrio sp. А4 отмечены при внесении лактата в качестве донора электронов и углерода (таблица 1).

Таблица 1 - Кинетические параметры роста ОеБи1/о\чЬгю зр. А4 на средах с >азличными органическими субстратами — донорами электронов и углерода

Источник углерода и электронов Удельная скорость роста (ц), час*1 Время удвоения (Т), час

Этанол 0.052 ±0.006 13.52 ± 1.52

Лактат 0.239 ± 0.03 2.94 ± 0.39

Глюкоза 0.084 ±0.03 9.71 ±4.99

Сахароза 0.054 ± 0.009 13.1 ±2.53

Крахмал 0.037 ±0.01 20.37 ±6.72

При росте с добавлением моносахарида глюкозы и дисахарида сахарозы удельные скорости роста были одного порядка с отмеченными в литературе, например, для Desulfovibrio Атмозохогат, растущего на

фруктозе (0.06 ч*1) (Ollivier et al., 1988). Наибольшая продукция белка и сероводорода наблюдалась при росте на среде с этанолом (до 873.5 мг/л и 158.8 мг/л соответственно). Наименьшая продукция сероводорода и белка наблюдалась при культивировании Desulfovibrio sp. А4 на среде с крахмалом (до 14.7 мг/л и 3.2 мг/л соответственно).

Влияние ионов меди и других металлов на рост чистых культур СРБ. Знания о предельных концентрациях металлов, при которых возможен рост, необходимы в связи с использованием СРБ в биотехнологиях очистки (Utgikar et а!., 2001). Так, Desulfomicrobium sp. BL, Clostridium sp. KA и Desulfosporosinus sp, OT2 из низкотемпературных осадков, подверженных загрязнению стоками металлургических комбинатов в Норильске и на Кольском полуострове, толерантны к меди (II) в концентрациях до 450, 550 и 2000 мг/л соответственно, Desulfovbirio spp. Al, А2, А4, выделенные из сточных вод Челябинского металлургического комбината, обладают устойчивостью к меди (II) в концентрации до 600, 2600 и 325 мг/л соответственно. Штаммы Desulfovibrio проявляют также резистентность к никелю (II), кобальту (II), кадмию (II) и хрому (IV).

Обнаружена стимуляция роста Desulfovibrio sp. А2 на среде с медью (II) в небольших концентрациях (рисунок 5, таблица 2). Медь (II) необходима СРБ как микроэлемент, играющий роль кофактора для металлопротеинов и определенных ферментов в концентрации не больше 0.007 мг/л (Widdel, Bak, 1992; Gadd, 1992). В ходе многочисленных исследований показано, что даже такие небольшие количества меди (II) как 0.38 мг/л (Sani et al., 2001) и 0.007 мг/л (Курочкина, 2002) могут ингибировать рост представителей Desulfovibrio. В настоящем исследовании наблюдалось увеличение скорости роста Desulfovibrio sp. А2 в присутствии 0.007 мг/л меди (II) и усиление продукции сероводорода, что свидетельствует в пользу более интенсивной сульфатредукции. В ходе дальнейшего повышения концентрации меди в среде происходил спад продукции белка бактериями изучаемого штамма.

Принимая во внимание вышеизложенные факты, логично предположить, что стимуляция роста в присутствии 10 мг/л и 20 мг/л меди (И) не связана с использованием ионов данного металла в качестве субстрата для роста. Стимуляция метаболизма микроорганизмов невысокими концентрациями токсических веществ может объясняться эффектом Арндт-Шульца (Громов, Павленко, 1989). Данный эффект заключается в том, что аккумуляция яда в нелетальных концентрациях на поверхности клетки изменяет проницаемость мембраны, нарушает ее барьерные свойства, что определяет свободное поступление пищи в клетку и, соответственно, усиление метаболизма.

Рисунок 5 - Рост Desul/ovibrio sp. Л2 в присутствии ионов меди (11) в различных концентрациях

Таблица 2 - Кинетические параметры роста Ое$и1/о\пЬпо зр. А2 в присутствии различных концентраций ионов меди__

Концентрация меди (11), мг/л Удельная скорость роста (И), час'1 Время удвоения (Т), час Продолжительность tag-фазы, час

0.0 0.19 ±0.01 3.63 ±0.18 8.0

0.007 0.203 ±0.01 3,42 ± 0.22 11.0

10.0 0.215 ±0.009 3.22 ±0.14 11.0

20.0 0.232 ± 0.02 3.01 ± 0.27 12.0

35.0 0.233 ± 0.01 2.99 ±0.14 16.0

50.0 0.166 ±0.04 4.39 ± 1.2 23.0

Как известно, ингибирование роста микроорганизмов тяжелыми металлами происходит по типу неконкурентного ингибирования. Так, наблюдали ингибирующнй эффект меди (II) при концентрациях 35-50 мг/л, где Ki составила 57 мг/л. Однако микроорганизм способен расти при содержании меди до 2600 мг/л. Вероятно, в присутствии меди в концентрации выше ингибирующей включаются генетически кодируемые механизмы устойчивости. Наличие генетических детерминант устойчивости к меди ранее было показано для некоторых почвенных бактерий (Trajanovska et al., 1997), энтеробактерий (Williams et al., 1993) и для сульфатредуцирующих бактерий (Karnachuk et ah, 2003).

Влияние температуры на рост Резииот'югоЬ'тт зр. ВЬ. Чистые культуры СРБ, Оези1/озрого$тш зр. ОТ2 и Вези!/отгсгоЫит зр. ВЬ, выделенные из низкотемпературных осадков Норильской промышленной зоны, демонстрируют психротрофные свойства. Огзи1/от1СгоЬтт зр.ВЬ проявляет способность к активному росту и продукции сероводорода при низких положительных температурах. Нижний температурный предел для роста менее +4 °С, верхний - +35 °С, при +36 °С рост отсутствовал. Максимальная скорость роста Исзи^ош\стоЪшт sp.HL, отмечена при температуре +25 °С (рисунок 6). Наибольшая продукция биомассы - до 610.7 мг/л белка - наблюдалась при температуре +23 °С, что ниже оптимальной с точки зрения скорости роста. Таким образом, температурный оптимум для роста данного микроорганизма составляет +23 °С - +25 °С. Зависимость удельной скорости роста от температуры на восходящем участке кривой (рисунок 6) описывается следующим уравнением: 1пц =-10.21х103 -1/Т, где ц - удельная скорость роста, а Т — абсолютная температура в градусах Кельвина.

Температура, "С

Рисунок 6 - Кривая зависимости удельной скорости роста иези1/от\сгоЫит Бр.ВЬ от температуры

Использование нерастворимых природных фосфатов в качестве субстратов для роста чистых культур СРБ. С точки зрения возможного применения СРБ в биотехнологиях очистки от тяжелых металлов полезным свойством может оказаться использование в качестве субстратов роста малорастворимых природных соединений. Ранее было показано, что чистые культуры СРБ способны использовать фосфор, содержащийся в нерастворимых соединениях, в процессе метаболизма, а также могут принимать участие в анаэробной мобилизации ортофосфата в природных экосистемах, причем механизмы, лежащие в основе этого явления, могут быть различными (Карначук, 1995). Для изучения роста СРБ на средах с добавлением природного фосфорита в качестве

единственного источника фосфора был проведен ряд экспериментов с чистыми культурами Desulfovibrio sp. R2, Desulfovibrio sp. AI, Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757, Desulfomicrobium sp. 63. Выяснили, что наиболее активный рост в присутствии нерастворимого источника фосфора демонстрирует Desulfomicrobhtm sp. 63 (таблица 3). Бактерии рода Desulfovibrio обнаруживали менее высокую скорость роста на среде с внесением фосфорита, однако для Desulfovibrio sp. AI отмечена максимальная продукция биомассы и сероводорода. Необходимо отметить, что свойством расти в присутствии нерастворимых источников фосфора обладают СРБ, выделенные как из промышленных экосистем (Desulfovibrio spp. A2t Я2), так и из экологически чистых местообитаний {Desulfomicrobium sp. 63, Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757).

Таблица 3 - Кинетические параметры роста ОеБи}/охчЬгю яр. Я2, Ое$и!/оУ1Ъгю desulfuricans, Оези1/от(сгоЫит зр. 63 и Оези1/о\чЬгю зр. А2 с использованием нерастворимого источника фосфора__

Параметры роста Штамм Удельная скорость роста (ц), час Время уд воения (Г), час

Desulfovibrio sp.R2 0.095 ± 0.02 7.49 ± 1.36

Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757 0.24 ± 0.03 2.91 ± 0.39

Desulfomicrobium sp.63 0.57 ±0.1 1.24 ±0,22

Desulfovibrio sp.A2 0.068 ± 0.003 10,15 ±0.48

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, чистые культуры сульфатредуцирующих бактерий, выделенные из осадков влажных местообитаний, загрязненных стоками металлургических предприятий на полуострове Таймыр и на Кольском полуострове, а также из сточных вод Челябинского металлургического комбината, обладают устойчивостью к ионам меди (II) и других металлов; спорообразующие формы толерантны к повышенной кислотности среды. Изученные СРБ способны к росту с различными органическими субстратами, включая этанол и сахара, а также с использованием нерастворимых источников фосфора, в частности, природного фосфорита.

ВЫВОДЫ

1. Численность СРВ в осадках Норильской промышленной зоны и Кольского полуострова достигает 1.5х107 и 2.5х105 клеток на миллилитр влажного осадка, соответственно. Факторы, влияющие на активность сульфатредукторов, различаются в зависимости от сайта и могут включать наличие доноров электрона, температуру и кислотность среды.

2. Преобладающими группами культивируемых СРВ в осадках Норильской промышленной зоны являются Ьези1/оЬи1Ьиз Брр. и Оези1/озагста-Оези1/ососслз. В осадках Кольского полуострова обнаружены преимущественно Оеви1/агси1№-Ое$и1/отопИе,

Вези1/оЬи1Ьиз зрр., Вези1/отхсгоЫит зрр, и Оези!/о\чЬгю зрр.

3. Из низкотемпературных осадков, загрязненных стоками металлургических комбинатов в Норильске и на Кольском полуострове, выделены в чистые культуры спорообразующие ацидотолерантные СРВ ВезиЦозрогоэЫи$ зрр. ОТ2, ИЬЛс и С1оз&Ш'тм зрр. КЛ, Ш, и неспорообразующий Вези!/откгоЫит зр.ВЬ.

4. Вези1/оггЬпо ¿рр. А1, А2, А4, выделенные из сточных вод Челябинского металлургического комбината, утилизируют различные органические субстраты с неполным окислением. Наиболее предпочтительными субстратами для их роста служат лактат и этанол. Обнаружена способность к росту на среде с сахарами.

5. Вези1/от\сгоЫит зр. ВЬ и Вези¡/озрогозтиз ¿р. ОТ2, выделенные из осадков Норильской промышленной зоны, проявляют психротолерантные свойства. Вези1/откгоЫит Бр. ВЬ способен к активному росту и продукции сероводорода при низких положительных температурах. Определена температурная кинетика. Оптимум для роста Вези1/отгсгоЫит зр. В1 +23 °С - +25 °С.

6. Сульфатредуцирующие бактерии, выделенные из загрязненных местообитаний, устойчивы к меди (II) и другим тяжелым металлам. Обнаружен эффект стимуляции роста Вези1/огЫгю эр. А2 ионами меди (II) в небольших концентрациях. К» составила 57 мг меди (II) на литр.

Отмечено возрастание разнообразия СРБ в накопительных культурах с увеличением концентрации меди (П) в среде, что, вероятно, связано с повышенной устойчивостью бактерий этой группы по сравнению с другими группами микроорганизмов. Представители Desulfovibrio наиболее устойчивы к ионам меди (II) среди сульфатредукторов.

7. Сульфатредуцирующие бактерии способны к активному росту при внесении природного фосфорита как единственного источника фосфора. Свойством расти в присутствии нерастворимых фосфатов обладают сульфатредукторы, выделенные как из промышленных экосистем, так и из экологически чистых местообитаний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карначук О.В., Франк Ю.А. Сапрофитные микроорганизмы подземных и поверхностных вод республики Хакасия // Экология и рациональное природопользование на рубеже веков. Итоги и перспективы: Материалы международной конференции. - Томск: изд-во ТГУ, 2000.—Т. П.—С 54-55.

2. Курочкина С.Ю., Ванина Ю.Н., Ивасенко Д.А., Франк Ю.А. Бактериальная сульфатредукция в водной толще озера Шира // Экология Южной Сибири - 2000 год: Материалы Южно-Сибирской международной научной конференции. - Абакан: изд-во ХГУ, 2000. -С 177-179.

3. Франк Ю.А. Численность сапрофитных микроорганизмов в воде

озера Шира // Материалы V региональной конференции «Ш Сибирская школа молодого ученого». - Томск: изд-во ТГПУ, 2001. -Т.1.-С. 131-134.

4. Казаченок А. А., Франк Ю.А,, Казаков Д.В. Численность

сульфатредуцирующих бактерий в озере Шира И Материалы XL международной конференции молодых ученых «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. — Новосибирск: изд-во H ГУ, 2002 - С. 22-23

5. Казаченок А.А., Франк Ю.А. Изучение устойчивости

сульфатредуцирующих бактерий к низким температурам и тяжелым металлам И Материалы XLI международной конференции молодых ученых «Студент и научно-технический прогресс». — Новосибирск: изд-во НГУ, 2003.-С 114-115.

6. Франк Ю.А. Влияние ионов шести валентного хрома на гидрогеназную активность в бесклеточном экстракте Desuïfobacterium sp.63// Материалы XLI международной

конференции молодых ученых «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск: изд-во НГУ, 2003. - С. 85-86.

7. Гончарова А.И., Франк Ю.А. Выделение чистых культур сульфатредуцирующих бактерий из накопительных культур // Эколого-экономические проблемы природопользования: Материалы юбилейной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Томск: Дельтаплан, 2004. - С. 3-7.

8. Герасимчук А.Л., Франк Ю.А. Выделение и изучение чистой культуры сульфатредуцирующих бактерий, устойчивых к тяжелым металлам и пониженным температурам, из осадков ветландов Норильской промышленной зоны // Экология Южной Сибири и сопредельных территорий: Материалы международной научной конференции. - Абакан, 2004. — С. 9.

9. Франк Ю.А., Герасимчук А.Л. Психротолерантные сульфатредуцирующие бактерии, перспективные для биотехнологии // Материалы XLIII международной конференции молодых ученых «Студент и научно-технический прогресс»: Биология.-Новосибирск: изд-во НГУ,2005.-С. 180-181,

10. Франк Ю.А., Маслянко М.А., Герасимчук А.Л., Суханова О.С, Доноры

углерода и электрона для роста новых сульфаггредуцирующих бактерий родов Desuî/ovibrio, Desuîfomicrobium и Desulfosporosinus П Материалы IX Всероссийской конференции молодых ученых «Наука и образование».- Томск: изд-во ТГПУ, 2005. - Т.1, часть 2. — С. 98102.

11. Карначук О.В., Пименов Н.В., Юсупов С.К., Франк Ю.А., Пухакка Я.А., Иванов М.В. Распределение, разнообразие и активность сульфатредуцирующих бактерий в водной толще озера Гек-Гель, Азербайджан//Микробиология.-2006.-Т. 75,№ 1.-С. 1-9.

12. Герасимчук А.Л., Франк Ю.А., Щучкин А.М, Сульфатредуцирующие ацидотолерантные бактерии из осадков Норильской промышленной зоны // Материалы X международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ». - Новосибирск: изд-во НГУ, 2005. - С. 100.

13. Франк Ю.А., Герасимчук А.Л. Биоразнообразие сульфатредуцирующих бактерий в осадках Норильской промышленной зоны // Сборник докладов 1-ой международной научно-практической конференции «Студент и научно-технический прогресс; лидеры нового поколения». - Усть-Каменогорск, Казахстан, 2006. - С. 68-71.

14. Франк Ю.А., Лушников C.B. Биотехнологический потенциал сульфатредуцирующих бактерий // Экология и промышленность Росси. - 2006. 1. — С. 10-13.

15. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Nicomrat D., Frank Y.A., Ivasenko D.A., Phyilipenko E.A., Tuovinen O.H. Copper resistance in Desulfovibrio strain R2 // Antonie Van Leuwenhoek. Journal of Microbiology. - Holland, 2003. - № 83. - P. 99-106.

16. Karnachuk O.V., Puhakka J.A., Yusupov S.K., Frank Y.A., Kaksonen A., Pimenov N.V., Ivanov M.V., Linstrom E.B. and Tuovinen O.H. Bacterial sulfate-reduction in Russian Arctic sediments impacted by the mining industry // International Conference on Arctic Microbiology (2225.3.2004, Rovaniemi). - Finland, 2004. - P. 29.

17. Karnachuk O.V., Frank Y.A., Kaksonen A.H., Puhakka J.A., Sasaki K. and Tuovinen O.H. Isolation and characterization of new copper-resistant sulfate-reducing bacteria // International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "B ioMicroWorld" Abstracts (Badajoz, March 15-18).- Spam, 2005. - P. 699.

18. Karnachuk O.V., Pimenov N.V., Yusupov S.K., Frank Y.A., Kaksonen A.H., Puhakka J.A., Lidstrom E.B. and Tuovinen O.H. Sulfate reducing potential in sediments in the Norilsk mining area, Northern Siberia // Geomicrobiology. - 2005. - Vol. 22. - P. 1-9.

Автор выражает благодарность научному руководителю к.б.н., С.Н.С. О.В. Карначук и сотрудникам кафедры физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета за неоценимую помощь при проведении исследований и написании диссертации. Также -глубокую признательность к.т.н., профессору ПЛ. Генцлеру и д.б.н., профессору Е.В. Евдокимову за обсуждение диссертации и коллегам, оказавшим содействие при выполнении исследований по теме диссертации. Автор также выражает благодарность за помощь при проведении исследований в Институте инженерии окружающей среды и биотехнологии при Технологическом университете Тампере (Финляндия) старшему исследователю Анне Каксонен, и профессору Яаакко Пухакке.

Работа частично выполнена при финансовой поддержке фонда ИНТАС (гранты «Acidophilic and psychrophilic sulfate-reducing bacteria in boreal, acid mine drenage-impacted environments» (INTAS - 2001 - 0731) и «Microbial processes of carbon and sulfur cycling at the oxic-anoxic interface in meromictic lakes» (INTAS - 2001 - 2333)). Молекулярно-генетические исследования осуществлялись при поддержке фонда Правительства Финляндии CIMO и объединенного исследовательского проекта Европейской комиссии «Biotechnology for metal bearing material in Europe» (BioMinE 500329). Изучение некоторых аспектов устойчивости сульфатредуцирующих бактерий к меди финансировалось Федеральным агентством по образованию России (Грант А04-2.12-725).

Тираж 100. Заказ 872. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Франк, Юлия Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1. СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОД ОТ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

1.1. Общая характеристика сульфатредуцирующих бактерий

1.1.1 .Особенности физиологии сульфатредуцирующих бактерий

1.1.2. Филогения сульфатредуцирующих бактерий

1.1.3. Экология и распространение сульфатредуцирующих бактерий

1.2. Влияние ионов металлов на сульфатредуцирующие бактерии

1.2.1. Токсичность металлов для бактериальных клеток

1.2.2. Устойчивость СРБ к ионам двухвалентной меди и ее генетические детерминанты

1.2.3. Устойчивость СРБ к ионам других тяжелых металлов

1.2.4. Жизнедеятельность СРБ в загрязненных экосистемах

1.3. Возможности применения сульфатредуцирующих бактерий в биотехнологиях очистки вод

1.3.1. Механизмы обезвреживания тяжелых металлов сульфатредуцирующими и другими бактериями

1.3.2. Использование СРБ для обезвреживания кислых шахтных дренажных вод

1.3.3. Осаждение тяжелых металлов в промышленных стоках сульфатредуцирующими бактериями

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Чистые культуры СРБ

2.1.2. Осадки, использованные для выделения чистых культур

2.2. Культивирование сульфатредуцирующих бактерий и ростовые эксперименты

2.2.1. Приготовление среды Видцеля и добавок

2.2.2. Приготовление растворов металлов

2.2.3. Подготовка посуды для посева

2.2.4. Посев сульфатредуцирующих бактерий

2.2.5. Измерение рН среды

2.2.6. Определение круга используемых доноров и акцепторов электрона для сульфатредукции

2.2.7. Определение численности СРБ

2.2.8. Определение кинетических параметров роста чистых культур СРБ

2.3. Аналитические методы

2.3.1. Определение сероводорода по Пахмайеру

2.3.2. Определение белка по методу Лоури

2.3.3. Определение ацетата методом газовой хроматографии

2.4. Молекулярные методы

2.4.1. Выделение хромосомной ДНК бактерий

2.4.2. Электрофорез в агарозном геле

2.4.3. Полимеразная цепная реакция

2.4.4. Градиентный денатурирующий гель-электрофорез (DGGE)

2.4.5. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

2.5. Микроскопирование и микрофотосъемка

2.6. Программное обеспечение и статистическая обработка

3. СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ЭКОСИСТЕМАХ, ПОДВЕРЖЕННЫХ ВЛИЯНИЮ МЕТАЛЛУРГИЧЕСКИХ ПРЕДПРИЯТИЙ

3.1. Численность и филогенетическое положение культивируемых СРБ в осадках влажных местообитаний Норильской промышленной зоны

3.2. Численность и разнообразие культивируемых СРБ в осадках влажных местообитаний промышленной зоны на Кольском полуострове

3.3. Выделение чистых культур СРБ из осадков влажных местообитаний Норильской промышленной зоны, их фенотипическая и филогенетическая характеристика

3.4. Выделение чистых культур СРБ из осадков влажных местообитаний промышленной зоны на Кольском полуострове, их фенотипическая и филогенетическая характеристика

3.5. Фенотипическая и филогенетическая характеристика чистых культур СРБ, выделенных из сточных вод Челябинского металлургического комбината

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и изучение сульфатредуцирующих бактерий из экосистем, подверженных влиянию металлургических предприятий"

Актуальность проблемы. Загрязнение вод тяжелыми металлами - одна из наиболее серьезных проблем окружающей среды России (Государственный доклад «О состоянии окружающей природной среды Российской Федерации», 1998). Интенсивные шахтные разработки в северных регионах и гигантские плавильные производства на Урале, в Норильске и на Кольском полуострове долгое время осуществлялись без учета их воздействия на окружающую среду, что вызвало мощные загрязнения металлами прилегающих экосистем. В местах действующих и заброшенных шахт образуются кислые дренажные воды. Они содержат большое количество тяжелых металлов и сульфатов, а также имеют низкий рН, являющийся результатом окисления сульфидов металлов. В настоящее время широко распространены химические методы обезвреживания кислых шахтных вод. Стоимость подобных процессов велика при не очень высокой эффективности удаления сульфата и металлов (Boonstra et al., 1999). Биологическая очистка стоков, содержащих металлы, имеет несколько существенных преимуществ по сравнению с химическими методами, таких как сравнительно низкая стоимость, высокая эффективность удаления металлов и возможность повторного использования извлеченных металлов.

Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) привлекают внимание исследователей как потенциальные агенты очистки различных сред, загрязненных тяжелыми металлами и сульфатами. В ходе своей жизнедеятельности они восстанавливают сульфаты (White et al., 2000). Продукт сульфатредукции - сероводород - реагирует с ионами тяжелых металлов с образованием нерастворимых сульфидов металлов. Благоприятным фактором является редукция растворимых металлов до менее токсичных или менее растворимых форм. Сульфатредукторы не только эффективно осаждают ионы металлов путем продукции сероводорода, но и естественным путем повышают щелочность среды, переводя серную кислоту в сульфид (Johnson, 2000).

Токсичность ионов металлов для микроорганизмов - одно из главных ограничений применения ремедиационных биотехнологий (Johnson, 2000). Сульфатредуцирующие бактерии проявляют повышенную устойчивость к тяжелым металлам (Karnachuk et al., 2003; Karnachuk et al., 2005), однако, кинетика роста чистых культур сульфатредукторов и ингибирования их роста ионами металлов, в частности ионами меди (II), остается малоизученной. В условиях бореального климата существует перспектива выделения и использования СРБ, устойчивых к низким температурам (Banks et al., 1997). В настоящее время применение микроорганизмов для очистки окружающей среды в период с осени до весны ограничено из-за низких температур. Одним из путей преодоления данного ограничения может быть использование для биоремедиации психротолерантных микроорганизмов.

Актуальной задачей при изучении чистых культур и сообществ микроорганизмов - агентов природоохранных технологий - является также поиск эффективных и экономически выгодных субстратов для роста. Наличие органических веществ - доноров углерода и электронов для сульфатредукции - одно из важнейших условий обеспечения жизнедеятельности для большинства СРБ. Показана возможность стимуляции активности сульфатредукторов в биореакторных системах путем внесения определенных органических веществ (Kaksonen et al., 2004). Нерастворимые фосфаты представляют собой более дешевые ростовые субстраты по сравнению с растворимыми. Способность к утилизации природных нерастворимых фосфатов - важный механизм, обеспечивающий конкурентноспособность СРБ при биоремедиации загрязненных водных экосистем, лимитированных по содержанию фосфора.

В последние годы возрос интерес к изучению возможностей стимулирования активности аборигенной микрофлоры в загрязненных местообитаниях. Целью подобных исследований является поиск новых путей развития биоремедиационных технологий. В связи с этим, данные о численности и разнообразии СРБ в низкотемпературных осадках, загрязненных стоками металлургических производств, представляют особую ценность.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационного исследования являлось выделение и изучение СРБ, перспективных для использования в технологиях очистки вод от металлов, а также определение их численности и разнообразия в загрязненных экосистемах. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать разнообразие и состав сообщества культивируемых СРБ в загрязненных влажных осадках промышленных зон в Норильске и на Кольском полуострове;

4. Изучить филогенетические характеристики чистых культур, выделенных ранее из сточных вод Челябинского металлургического комбината, и определить оптимальные органические субстраты - доноры углерода и электронов для их роста;

6. Изучить влияние ионов меди и других металлов на рост чистых культур СРБ и их разнообразие;

Научная новизна работы. В ходе исследований впервые изучено биоразнообразие СРБ в низкотемпературных экосистемах, загрязненных стоками металлургических предприятий. Пять новых штаммов СРБ выделены в чистые культуры. Один из них предположительно принадлежит к новому, ранее неописанному виду рода Desulfomicrobium. Два изолята являются новыми представителями малоизученных сульфатредуцирующих клостридий. Впервые изучена кинетика роста СРБ с использованием сахарозы и крахмала. Показана возможность роста чистых культур СРБ с использованием нерастворимых источников фосфора. Выявлена стимуляция роста СРБ небольшими концентрациями ионов меди (II).

Практическая значимость. Данные о численности и биоразнообразии СРБ в осадках влажных местообитаний, загрязненных стоками металлургических комбинатов в Норильской промышленной зоне и на Кольском полуострове могут быть использованы при разработке технологий стимуляции аборигенного сообщества микроорганизмов, способных к осаждению металлов в загрязненных экосистемах.

Чистые культуры СРБ, выделенные и охарактеризованные в ходе настоящей работы, обладают свойствами, важными с точки зрения использования в биотехнологиях осаждения металлов, а именно: устойчивостью к металлам, психротолерантностью, ацидотолерантностью, способностью к использованию дешевых органических веществ (этанола, Сахаров) и нерастворимых источников фосфора в качестве ростовых субстратов. Штаммы могут быть рекомендованы для тестирования в in situ и ex situ технологиях очистки вод от металлов. На основе результатов изучения физиологических свойств культур возможно определение технологических коридоров оптимума для их использования в экобиотехнологиях. В настоящее время чистые культуры, выделенные в ходе данной работы, проходят испытание в низкотемпературном биореакторе в Институте инженерии окружающей среды и биотехнологии Технологического университета Тампере (Финляндия) в рамках проекта «Biotechnology for metal bearing material in Europe».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных научных конференциях «Экология и рациональное природопользование на рубеже веков. Итоги и перспективы» (Томск, 2000), «Экология Южной Сибири - 2000 год» (Абакан, 2000), «Эколого-экономические проблемы природопользования» (Томск, 2004), конференциях молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2004), «Наука и образование» (Томск, 2005); школе - конференции «III Сибирская школа молодого ученого» (Томск, 2003); XL, XLI, XLIII международных конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002, 2003, 2005); международной конференции по Арктической Микробиологии «International Conference on Arctic Microbiology» (Рованиеми, 2004), на международной конференции по энвайронментальной, индустриальной и прикладной биотехнологии «BioMicroWorld2005» (Бадахос, 2005), на Российско-французском форуме «Актуальные проблемы экологии и природопользования Сибири в глобальном контексте» (Томск, 2006) и на 11 Международном Симпозиуме по Экологической микробиологии «ISME-И» (Вена, 2006). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю к.б.н., с.н.с. О.В. Карначук и сотрудникам кафедры физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета за неоценимую помощь при проведении исследований и написании диссертации. Также -признательность к.т.н., профессору Г.Л. Генцлеру и д.б.н., профессору Е.В. Евдокимову за помощь в обсуждении диссертации и коллегам, оказавшим содействие при выполнении исследований (в особенности Д.А. Ивасенко).

Автор также выражает благодарность за помощь при проведении исследований в Институте инженерии окружающей среды и Биотехнологии при Технологическом университете г. Тампере (Финляндия) старшему исследователю Анне Каксонен (Anna Kaksonen), исследователям Пайви Киннунен (Paivi Kinnunen), Пертту Коксинену (Perttu Koksinen), а также доценту Уве Мюнстеру (Uwe Munster) и директору института, профессору Яаакко Пухакке (Jaakko Puhakka).

Работа частично выполнена при финансовой поддержке фонда ИНТАС (гранты «Acidophilic and psychrophilic sulfate-reducing bacteria in boreal, acid mine drenage-impacted environments» (INTAS - 2001 - 0731) и «Microbial processes of carbon and sulfur cycling at the oxic-anoxic interface in meromictic lakes» (INTAS - 2001 - 2333)). Молекулярно-генетические исследования структуры сообществ и состава накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий осуществлялись при поддержке фонда Правительства Финляндии CIMO и объединенного исследовательского проекта Европейской комиссии «Biotechnology for metal bearing material in Europe» (BioMinE 500329). Изучение некоторых аспектов устойчивости сульфатредуцирующих бактерий к меди финансировалось Федеральным агентством по образованию России (Грант А04-2.12-725).

СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЯХ ОЧИСТКИ ОТ

ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Заключение Диссертация по теме "Экология", Франк, Юлия Александровна

ВЫВОДЫ

1. Численность СРБ в осадках Норильской промышленной зоны и Кольского полуострова достигает 1.5х107 и 2.5х105 клеток на миллилитр влажного осадка, соответственно. Факторы, влияющие на активность сульфатредукторов, различаются в зависимости от сайта и могут включать наличие доноров электрона, температуру и кислотность среды.

2. Преобладающими группами культивируемых СРБ в осадках Норильской промышленной зоны являются Desulfobulbus spp. и Desulfosarcina-Desulfococcus. В осадках Кольского полуострова обнаружены преимущественно Desulfarculus-Desulfomonile, Desulfobulbus spp., Desulfomicrobium spp. и Desulfovibrio spp.

3. Из низкотемпературных осадков, загрязненных стоками металлургических комбинатов в Норильске и на Кольском полуострове, выделены в чистые культуры спорообразующие ацидотолерантные СРБ Desulfosporosinus spp. ОТ2, RLAc и Clostridium spp. KA, RL и неспорообразующий Desulfomicrobium sp. BL.

4. Desulfovibrio spp.Al, A2, A4, выделенные из сточных вод Челябинского металлургического комбината, утилизируют различные органические субстраты с неполным окислением. Наиболее предпочтительными субстратами для их роста служат лактат и этанол. Обнаружена способность к росту на среде с сахарами.

5. Desulfomicrobium sp. BL и Desulfosporosinus sp. OT2, выделенные из осадков Норильской промышленной зоны, проявляют психротолерантные свойства. Desulfomicrobium sp.BL способен к активному росту и продукции сероводорода при низких положительных температурах. Определена температурная кинетика. Оптимум для роста Desulfomicrobium sp. BL +23 °С - +25 °С.

6. Сульфатредуцирующие бактерии, выделенные из загрязненных местообитаний, устойчивы к меди (II) и другим тяжелым металлам. Обнаружен эффект стимуляции роста Desulfovbirio sp. А2 ионами меди (II) в небольших концентрациях. Ki составила 57 мг меди (II) на литр. Отмечено возрастание разнообразия СРБ в накопительных культурах с увеличением концентрации меди (II) в среде, что, вероятно, связано с повышенной устойчивостью бактерий этой группы по сравнению с другими группами микроорганизмов. Представители Desulfovibrio наиболее устойчивы к ионам меди (II) среди сульфатредукторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рациональное использование бактериальных процессов в очистных сооружениях и эффективное манипулирование аборигенными бактериальными сообществами для стимуляции in situ активности требуют знаний о физиологии и филогении, а также о биоразнообразии и структуре бактериальных сообществ в загрязненных местообитаниях. Методы, основанные на культивировании, дают недостаточную информацию о структуре и динамике микробных сообществ in situ. Достижения в области молекулярной экологии, основанные на анализе последовательностей генов 16S рРНК и функциональных генов, такие как клонирование, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE), представляют собой новые подходы, способствующие изучению микробных сообществ (Amann et al., 1995; Roest, 2005). Однако, выделение и изучение культивируемых микроорганизмов необходимо для лучшего понимания их физиологии и роли в биогеохимических реакциях (Connon, Giovanni, 2002). Кроме того, некоторые авторы считают, что использование в биотехнологиях специально подобранных смешанных культур сульфатредуцирующих бактерий на основе чистых культур является предпочтительным (Vainshtein et al., 2003).

В ходе настоящей работы было выделено 5 новых штаммов СРБ из низкотемпературных осадков влажных местообитаний, загрязненных стоками металлургических предприятий Зполярного филиала ОАО «ГМК «Норильский никель» на Таймыре и АО «Комбинат «Североникель» на Кольском полуострове. Подобные местообитания представляют собой естественные резервуары СРБ, устойчивых к металлам, низким температурам и повышенной кислотности. Так, спорообразующие Desulfosporosinus spp. ОТ2, MS и Clostridium spp. КА, RL обладают ацидотолерантными свойствами. Неспорообразующий Desulfomicrobium sp.

BL способен к активному росту и продукции сероводорода при низких положительных температурах. Desulfosporosinus sp. ОТ2 также проявляет психротолерантные свойства.

В работе установлена возможность роста чистых культур с использованием различных органических веществ - доноров углерода и электронов. Результаты исследований показали, что СРБ способны использовать широкий круг субстратов, однако оптимальным для биотехнологических целей является этанол - дешевый и эффективный субстрат, который активно используется СРБ и дает значительный выход биомассы и сероводорода. Многие из изученных изолятов способны использовать сахара, которые по экономичности превосходят этанол. Наиболее часто на сахарах, а именно, на фруктозе, глюкозе и сахарозе, растут представители рода Desulfovibrio. Они же проявляют наибольшую устойчивость к меди.

Токсичность ионов металлов для СРБ - одно из главных ограничений применения ремедиационных технологий (Johnson, 2000). В связи с этим, актуальным является выделение чистых культур микроорганизмов, устойчивых к ионам металлов в повышенной концентрации. Обнаружено, что чистые культуры СРБ, выделенные из низкотемпературных осадков влажных местообитаний промышленных зон в Норильске и на Кольском полуострове, и чистые культуры из сточных вод Челябинского металлургического комбината, проявляют устойчивость к меди (И) и другим металлам. Показано также, что при увеличении концентрации меди в среде увеличивается содержание СРБ по сравнению с другими группами микроорганизмов. При изучении кинетики роста Desulfovibrio sp. А2 обнаружен эффект стимуляции роста и продукции сероводорода в присутствии меди (II) в небольших концентрациях.

Таким образом, чистые культуры сульфатредуцирующих бактерий, выделенные из осадков влажных местообитаний Норильской промышленной зоны и промышленной зоны на Кольском полуострове, а также из сточных вод Челябинского металлургического комбината, обладают устойчивостью к ионам металлов; спорообразующие формы толерантны к повышенной кислотности среды. Изученные СРБ способны к росту с различными органическими субстратами, включая этанол и сахара, а также с использованием нерастворимых источников фосфора, в частности, природного фосфорита.

Данные, полученные в ходе настоящей работы, важны для пополнения знаний о распространении и активности сульфатредуцирующих бактерий в загрязненных экосистемах. Чистые культуры, выделенные из низкотемпературных осадков, загрязненных стоками металлургических комбинатов, перспективны для использования в биотехнологиях очистки вод от металлов. В настоящее время культуры, выделенные и изученные в данной работе, в составе консорциумов проходят испытание в биореакторной установке в Технологическом университете Тампере (Финляндия) в рамках проекта Европейской комиссии «Biotechnology for metal bearing material in Europe» (BioMinE 500329). Предварительные результаты, полученные исследователями Технологического университета Тампере, свидетельствуют о возможности успешного применения штаммов для очистки водоемов от сульфатов и металлов в составе специально подобранных консорциумов, в том числе в условиях умеренного и бореального климата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Франк, Юлия Александровна, Томск

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: изд-во «Наука», Ленингр. Отд., 1975. - 330 с.

2. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И., Хиппе X. Сульфатредуцирующая бактерия из вечной мерзлоты // Микробиология. 1995. - Том 64. - С. 514-518.

3. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. -М.:ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

4. Государственный доклад «О состоянии окружающей природной реды Российской Федерации в 1997 году» // Госкомитет РФ по охране окружающей среды. М., Центр международных проектов, 1998. - 608 с.

5. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. Л.: Изд-во ЛГУ, 1989.-248 с.

6. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. М.: Книжный дом «Университет», 2001. - 256 с.

7. Иванов А.Ю., Фомченков В.М., Хасанова Л.А. Влияние ионов тяжелых металлов на электрофизические свойства клеток A.nidulans и E.coli II Микробиология. 1992. - Том 61, № 3. - С.455 - 463.

8. Иванов А.Ю., Фомченков В.М., Хасанова Л.А., Гаврюшкин А.В. Токсическое действие гидроксилированных ионов тяжелых металлов на цитоплазматическую мембрану бактериальных клеток // Микробиология. -1997. Том 66, №5. - С.588 - 594.

9. Иванов М.В. Круговорот серы в озерах и водохранилищах // Глобальный биохимический цикл серы и влияние на него деятельности человека. М.:Наука, 1983. - С. 256-280.

10. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. М.: Изд-во АН СССР, 1963.-242 с.

11. Карначук О.В. Влияние шестивалентного хрома на образование сероводорода сульфатредуцирующими бактериями // Микробиология. 1995. -Том 64,№3.-С. 262-265.

12. Карначук О.В. Мобилизация фосфата из нерастворимых соединений под действием сульфатредуцирующих бактерий // Микробиология. 1995. - Том 64, №4. - С. 559 - 563.

13. Карначук О.В., Пименов Н.В., Юсупов С.К., Франк Ю.А., Пухакка Я. А., Иванов М.В. Распределение, разнообразие и активность сульфатредуцирующих бактерий в водной толще озера Гек-Гель, Азербайджан // Микробиология. 2006. - Том 75, №1. - С. 1-9.

14. Кондратьева Е.Н., Гоготов И.Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. М.: Наука, 1981. - 344 с.

15. Курочкина С.Ю. Устойчивость сульфатредуцирующих бактерий к ионам двухвалентной меди: Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 03.00.16/ Науч.ред. О.В. Карначук. Томск: Б.и., 2002.- 107 с.

16. Логинова Л.Г. Анаэробные термофильные бактерии. М.: «Наука», 1982.- 100 с.

17. Лях С.П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам. М.: «Наука», 1976. - 160 с.

18. Мур Дж.В., Рамамурти С. Тяжелые металлы в природных водах. -М.: Мир, 1987.-286 с.

19. Оксенгендлер Г. И. Яды и противоядия. Л., 1982. - С. 94 - 114.

20. Розанова Е.П., Назина Т.Н. и Галушко А.С. Выделение нового рода сульфатредуцирующих бактерий и описание нового вида этого рода Desulfomicrobium apsheronum gen. nov., sp. nov // Микробиология. 1988. -Том 57.-С. 634-641.

21. Савельева Л.С., Эпов А.Н. Очистка сточных вод на биоплато // Экология и промышленность России. 2000. - Т.8. - С.26-28.

22. Фелленберг Г. Загрязнение природной среды. Введение в экологическую химию.: Перевод с нем. М.: Мир, 1997. - 232 с.

23. Akagi J.M. Respiratory sulfate reduction // Sulfate-reducing bacteria, ed. By L.L. Barton. Plenum Press, New York, 1995. - P.89-111.

24. Akagi J.M., Jackson G. Degradation of glucose by proliferating cells of Desulfotomaculum nigrificans II Appl. Microbiol. 1967. - V.15. - P.1427-1430.

25. Amann R.I., Binder B.J., Olson R.J., Chisholm S.W., Devreux R. and Stahl D.A. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations // Appl. Environ. Microbiol. 1990.- V.56.-P. 1919-1925.

26. Amann R.I., Ludwig W. and Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiological Reviews. 1995. - V.59. - P. 143-169.

27. Arundhati P., Paul A.K. Aerobic chromate reduction by chromium-resistant bacteria isolated from serpentine soil // Microbiological Research. 2004. -V.159.-P. 347-354.

28. Badziong W., Thauer R.K. Growth yields and growth rates of Desulfovibrio vulgaris (Marburg) growing on hydrogen plus sulfate and hydrogen plus thiosulfate as the sole energy sources // Archives of microbiology. 1978. -V.117.-P.209-214.

29. Banks D., Younger P.L., Arnesen R., Iversen E.R., Banks Sh.B. Mine-water chemistry: the good, the bad and the ugly // Environmental Ecology 1997. - V.32,№3.-P.157-174.

30. Barghoorn E.S. & Nichols R.L. Sulfate-reducing bacteria and pyretic sediments in Antarctica // Science. 1961. - V. 134. - P. 190.

31. Barton L.L., Tomei F.A. Characteristics and activities of sulfate-reducing bacteria // Sulfate-reducing bacteria (L.L.Barton,eds.). New York: Plenum Press, 1995.-P.1-32.

32. Bassett R.I., Melchior D.C. // Chemical modeling of aqueous systems. Bassett R.I., Melchior D.C. (Eds.). Am. Chem. Soc., Washington D.C., 1990. - P.l

33. BeijerinckW. M. Ueber Spirillum desulfuricans als Ursache von Sulfatreduction // Zentralbl. Bakteriol. 2. Abt., 1895. V.l. - P. 1-9, P. 49-59, P. 104-114.

34. Benner S.G., Blowes D.W., Ptacek C.J., Mayer K.U. Rates of sulfate reduction and metal sulfade precipitation in a permeable reactive barrier // Appl. Geochem. -2002. V.17. - P. 301-320.

35. Blais J.M., Duff K.E., Laing Т.Е., Smol J.P. Regional contamination in lakes from the Norilsk region in Siberia, Russia // Wat. Air Soil Pollut. 1999. -V.l 10. -P.389-404.

36. Bochker H.T., de Graaf W., Koster M., Meyer-Reil L., Cappenberg Т.Е. Bacterial populations and processes involved in acetate and propionate consumption in anoxic brackish sediment// FEMS Microbiol. Ecol. 2001. - V. 35. - P.97-103.

37. Brierley C.L., Brierley J.A., Davidson M.S. Applied microbial processes for metals recovery and removal from wastewater // Metal Ions and Bacteria (Eds. T.J. Beveridge, R.J. Doyle). John Wiley&Sons, New York, 1989. - P. 359 - 381.

38. Brierley C.L., Kelly D.P., Seal K.J and Best D.J. Material and biotechnology // Biotechnology principles and applications (Eds. I.J. Higgins, D.J. Best, J.Jones). Blackwell Scientiphic Publications, Oxford, 1985. - P. 163.

39. Bridge T.A.M., White C. and Gadd G.M. Extracellular metal-binding activity of the sulphate-reducing bacterium Desulfococcus multivorans // Microbiology. 1999. - V.145.-P. 2987-2995.

40. Brown N.L., Barrett S.R., Camakaris J., Lee B.T. and Rouch D.A. Molecular genetics and transport analyses of the copper-resistant determinant (pco) from Escherichia coli plasmid pRJ1004 // Mol. Microbiol. 1995. - V.17. -P.1153-1166.

41. Brown N.L., Rouch D.A. and Lee B.T. Copper resistance determinants in bacteria//Plasmid. 1992. - V.27. - P. 41-51.

42. Burggraf S., Jannasch H.W., Nicolaus, В., Stetter, K.O. Archaeoglobus profundus sp. nov., represents a new species within the sulfate-reducing archaebacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1990. - V.13. - P. 24-28.

43. Campbell L.L. and Postgate J.R. Classification of the spore-forming sulfate-reducing bacteria // Bacteriol.Rev. 1965 - V.29. - P.359-363.

44. Castro H., Williams N.H., Ogram A. Phylogeny of sulfate-reducing bacteria // Appl. Env. Microbiol. 1999. - №10. - P. 189-196.

45. Cervantes C., Campos-Garcia J., Devars S., Gutierrez Corona F., Lora-Tavera H., Torres-Gusman J.C., Moreno-Sanchez R. Interactions of chromium with microorganisms and plants // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - №25. - P. 335-347.

46. Cha J.- S., Cooksey D.A. Copper resistance in Pseudomonas syringae mediated by periplasmic and membrane proteins // Proc. Acad. Sci., USA, 1991. -№88.-P. 8915 -8919.

47. Challenger F. Biological methylation.// Adv. Enzymol. 1951. - №12. -P. 429.

48. Chen L., Liu M.-Y. and Gall J.L. Characterization of electron transfer proteins // Barton L.L. (Ed.) Sulfate-reducing bacteria. Plenum Press, New York, 1995.-P. 113-149.

49. Connon S.A., Giovanni S.J. High-throughput methods for culturing microorganisms in veru-low-nutritient media yield diverse new marine isolates // Appl. Env. Microbiol. 2002. - V.68. - P. 3878-3885.

50. Cooksey D. Copper uptake and resistance in bacteria // Molecular Microbiology. 1993. - V.7, №1. - P. 1-5.

51. Cooksey D. Molecular mechanisms of copper resistance and accumulation in bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - V. 14. - P. 381-386.

52. Cowling S.J., Gardner M.J. and Hunt D.T.E. Removal of heavy metals from sewage by sulphide precipitation: thermodynamic calculations and test on a pilot-scale anaerobic reactor//Environ. Technol. 1992. - V.13. -P. 281-291.

53. Crathorne B. and Dobbs A.J. Chemical pollution of the aquatic environment by priority pollutants and its control // Pollution: Causes, Effects and

54. Control (Harrison R.M., Ed.). The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1990. -P. 1-18.

55. Cypionka H. Oxygen respiration by Desulfovibrio spicies // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V.54. - P. 827-848.

56. Dalsgaard Т., Bak F. Nitrate reduction in a sulfate-reducing bacterium, Desulfovibrio desulfuricans, isolated from rice paddy soil sulfide inhibition, kinetics, and regulation // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60. - P. 291-297.

57. Daly K., Sharp R.J. and McCarthy A. Development of oligonucleotid probes and PCR primers for detecting phylogenetic subgroups of sulfate-reducing bacteria // Microbiology. 2000. - №146. - P. 1693-1705.

58. Daurnas S., Cord-Ruwisch R., Garcia J.L. Desulfotomaculum geothermicum sp.nov., a thermophilic, fatty acid-degrading, sulfate-reducing bacterium isolated with H2 from geothermal ground water // Antonie van Leeuwenhoek. 1988. - V.54. - P. 165-178.

59. Devereux R., He S.H., DoyleC.L., Orkland S., Stahl D.A., LeGall J. , Whitman W.B. Diversity and origin of Desulfovibrio species: phylogenetic definition of a family // J. Bacterid. 1990. - Vol. 172. - P. 3609-3619.

60. Devereux R., Kane M.D., Winfrey J. and Stahl D.A. Genus- and group-specific hybridization probes for determinative and environmental studies of sulfate-reducing bacteria// Syst. Appl. Microbiol. 1992. - V.15.-P. 601-609.

61. Detmers J., Strauss H., Schulte U., Bergmann A., Knittel K. and Kuever J. FISH shows that Desulfotomaculum spp. are the dominating sulfate-reducing bacteria in a pristine aquifer // Microbiol. Ecol. 2004. - V.47. - P. 236 - 242.

62. Diaz M.A., Monhemius A.J. and Narayanan A. Consecutive hydroxide-sulfide presipitation treatment of acid mine drainage // Proceedings of the 4thinternational conference on acid rock drainage. Vancouver, British Columbia, 1997.-Vol.3.-P. 1179-1194.

63. Desulfovibrio spp. // Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Режим доступа: http://www.dsmz.de/species/gn301582.htm (свободный).

64. Dvorak D.H., Hedin R.S., Edenborn H.M. and Mclntyre P.E. Treatment of metal-contaminated water using bacterial sulfate-reduction: results from pilot-scale reactors // Biotechnol. Bioeng. 1991. - V.40. - P. 609-616.

65. Eccles H. Biotreatment of metals: site dependent.// OESD Documents "Wider application and diffusion of bioremediation technologies".- Amsterdam, 1995. P. 296-302.

66. Eger P. Wetland treatment for trace metal removal from mine drainage: The importance of aerobic and anaerobic processes // Water Sci Tech. 1994ю -V.29.-P. 249-256.

67. Ehrlich H.L. Geomicrobiology. Dekker, New York, 1884. - 386 p.

68. Fortin D. and Beveridge T.J. Microbial sulfate reduction within sulfidic mine tailings: formation of diagenetic Fe sulfides // Geomicrobiol. J. 1997. -V.14.-P. 1-21.

69. Fortin D., Davis В., Southham G. and Beveridge T.J. Biogeochemical phenomena induced by bacteria within sulfidic mine tailings // J. Ind. Microbiol. -1995. V.14. -P.178-185.

70. Fortin D., Southam G. and Beveridge T.J. Nickel sulfide, iron-nickel sulfide and iron sulfide precipitation by a newly isolated Desulfotomaculum species and its relation to nickel resistance // FEMS Microbiol. Ecol. 1994. -V.14.-P. 121-132.

71. Freedman J.H. and Peisach J. Resistance of cultured hepatoma cells to copper toxicity. Purification and characterization of hepatoma metallothionein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - №992. - P.145-154.

72. Franzmann P.D., Robertson W.J., Zappia L.R. and Davis G.B. The role of microbial populations in the containment of aromatic hydrocarbons in the subsurface // Biodegradation. 2002. - V.13. - P. 65 - 78.

73. Fude L., Harris В., Urrutia M.M. and Beveridge T.J. Reduction of Cr (VI) by a consortium of sulfate-reducing bacteria (SRB III) // Appl. Env. Microbiol. 1994. - V. 60, № 5. -P.l525 - 1531.

74. Gadd G.M. Metals and microorganisms: a problem of definition // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - Vol.100. - P. 197-204.

75. Gadd G.M. Fungal production of citric and oxalic acid: importance in metal speciation, physiology and biogeochemical processes // Adv. Microb. Physiol. 1999. - V.41.-P. 47-92.

76. Gadd G. M. Bioremedial potential of microbial mechanisms of metal mobilization and immobilization // Current Opinion in Biotechnology. 2000. -V.ll.-P. 271-279.

77. Gale N.L., Wixson B.L. Control of heavy metals in lead industry effluents by algae and other aquatic vegetation // Conf. Management and Control of Heavy Metals in the Environment, London. CEP Consultants Ltd., Edinburgh, U.K., 1979.-P. 580-583.

78. Garrity G.M., Bell J.A. and Lillburn T.G. Taxonomic outline of the Procaryotes, Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edition. Release 4.0, October 2003. - Springer-Verlag, New York, USA, 2003. - P.395.

79. Garrity G.M., Bell J.A. and Lillburn T.G. Bergey's taxonomic outline, 2nd edition. Release 5.0, May 2004. - Режим доступа: http://141.150.157.80/bergeysoutline/outline/index.htm (свободный) - P.401.

80. Gazea В., Adam К. And Kontopoulos A. A review of passive systems for the treatment of acid-mine drainage // Miner. Eng. 1996. - №9. - P. 23 - 42.

81. Genschow E., Hegemann W. and Maschke C. Biological sulfate removal from tannery wastewater in a two-stage anaerobic treatment // Water Research. -1996.-V.30.-P. 2072-2078.

82. Guerinot M.L. Microbial iron transport // Annu. Rev. Microbiol. 1994. -V.48.-P. 743-772.

83. Hammack R.W., Edenborn H.M. The removal of nickel from mine waters using bacterial sulfatereduction // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. -V.37.-P. 674-678.

84. Hansen T.A. Metabolism of sulfate-reducing prokaryotes //Antonie van Leeuwenhoek. 1994. - V.66. - P. 165-185.

85. Hansen T.A. Carbon metabolism of sulfate-reducing bacteria // The Sulfate-reducing bacteria: contemporary perspectives (Eds. J.M. Odom, R. Singleton Jr.). Springer-Verlag, New York, 1995. - P. 21-40.

86. Hard B.C., Friedrich S. and Babel W. Microorganisms and acid mine drainage from uraniun mines // Ecological effect of microorganism action: Materials of international conference (October 1-4). Vilnus, 1997. - P. 11-18.

87. Hawkins W.B., Rodgers J.H. Jr., Gillespie W.B. Jr., Dunn A.W., Dorn P.B., Cano M.L. Design and construction of wetlands for aqueous transfers and transformations of selected metals //Ecotoxicol. Environ. Safety. -1997. V. 36. - P. 238-248.

88. Hebraud M. and Potier P. Cold shock respons and low temperature adaptation in psychrotrophic bacteria//J. Mol. Microbiol. Biotechnol. -1999. №1. - P. 211-219.

89. Hedin R.Sand, Narin R.W. Contaminant removal capabilities of wetlands constructed to treat coal mine drainage // Proceedings of the International

90. Symposium of Constructed Wetlands for Water Quality Improvement (Moshiri, G.A., Ed.). Lewis Publishers, Chelsea, MI, 1991. - P. 187-195.

91. Hess E. Cultural characteristics of marine bacteria in relation to low temperatures and freezing // Contrib. Canad. Biol., Fisheries ser. -1934. №8. - P. 461474.

92. Hiligsmann S., Jacques P., Thonart P. Isolation of highly performant sulfate reducers from sulfate-rich environments // Biodegradation. 1998. - V.9. - P. 285-292.

93. Hippe H., Vainshtein M., Gogotova G.I., and Stackebrandt E. Reclassification of Desulfobacterium macestii as Desulfomicrobium macestii comb.nov // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. - V.53. - P. 1127 - 1130.

94. Hristova К., Май M., Zheng D., Aminov R., Mackie R., Gaskins H., Raskin L. Desulfotomaculum genus and sub-genus-specific 16S rRNA hybridization probes for environmental studies.// Environ. Microbiol. 2000. - №2. - P. 143-160.

95. Hughes V.M. and Datta N. Conjugative plasmids in bacteria of the 'pre-antibiotic' era // Nature. 1983. - №302 - P.725-726.

96. Isaksen M.F., Jergensen B.B. Adaptetion of Psychrophilic and psychrotrophic Sulfare-reducing bacteria to permanently cold marine environments // Appl. Env. Microbiol. 1996. - V. 62, №2. - P. 408 - 414.

97. Isaksen M.F., Teske A. Desulforhopalus vacuolates gen. nov., sp. Nov., a new moderately psychrophilic sulfate-reducing bacterium with gasvacuoles isolated from a temperate estuary // Arch. Microbiol. 1996. - V.166. -P. 160-168.

98. Jaenicke R. Protein structure and function at low temperature // Philos. Trans. R. Soc./ Ser. B. Biol. Sci. London, 1990. - №326. - 535 - 553.

99. Johnson D.B. Biological removal of sulfurous compounds from inorganic wastewaters // Environmental technologies to treat sulfur pollution. Principles and engineering (Ed. By P.N.L.Lens and L.Hulshoff). IWA Publishing, London, 2000. - P. 175-205.

100. Johnson D.B., Ghauri M.A., McGinnes M. Biogeochemical cycling of iron and sulfur in leaching environments // FEMS Microbiol. Rev. -1993. V.l 1. - P.63 -70.

101. Jong T. and Parry D.L. Adsorption of Pb (И), Си (II), Cd (II), Zn (II), Ni (II), Fe (II) and As (V) on bacterially produced metal sulfides // Journal of Colloid and Interface Science. 2004. - №274. - P. 61-71.

102. Jorgensen B.B. Mineralization of organic matter in the sea bed the role of sulfate-reduction // Nature. - 1982. - № 296. - P.643 - 645.

103. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Tuovinen O.H. Growth of sulfate-reducing bacteria with solid-phase electron acceptors // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V.58. - P. 482-486.

104. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Nicomrat D., Frank Y.A., Ivasenko D.A., Phyllipenko E.A., Tuovinen O.H. Copper resistance in Desulfovibrio strain R2II Antonie Van Leuwenhoek. Holland, 2003. - №83. - P. 99-106.

105. Karnachuk O.V., Pimenov N.V., Yusupov S.K., Frank Y.A., Kaksonen A.H., Puhakka J.A., Linstrom E.B. and Tuovinen O.H. Sulfate reducing potential in sediments in the Norilsk mining area, Northern Siberia // Geomicrobiology. -2005.-V.22.-P. 1-15.

106. Karner M.V., DeLong E.F., Karl D.M. Archaeal dominance in the mesopelagic zone of the Pacific ocean // Nature. 2001. - №409. - P. 507-510.

107. Knoblauch C, Jorgensen BB, Harder J. Community size and metabolic rates of psychrophilic sulfate-reducing bacteria in Arctic marine sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V.65. - P. 4230-4233.

108. Knoblauch C., Sahm K., Jorgensen B.B. Psychrophilic sulfate-reducing bacteria isolated from permanently cold Arctic marine sediments: description of Desulfofrigus oceanense gen.nov., sp.nov., Desulfofrigus fragile sp.nov.,

109. Desulfofaba gelida gen.nov., sp.nov. and Desulfotalea arctica sp.nov И J. Syst. Bacterid. 1999. - V.49. - P. 1631 - 1643.

110. Kleikemper J., Pelz 0., Schroth M.H. and Zeyer J. Sulfate-reducing bacterial community response to carbon source amendments in contaminated aquifer microcosms // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. - V.42, №1. - P. 109-118.

111. Klemps R., Cypionka H., Widdel F. and Pfennig N. Growth with hydrogen, and further physiological characteristics of Desulfotomaculum species // Arch. Microbiol. 1985. - V.143. - P. 203-208.

112. Koch A.L. Most probable numbers // Methods for General and Molecular Bacteriology (Gerchard P., Murray R.G.E., Wood W.A. and Krieg N.R., Eds.), American Society for Microbiology. Washington DC, 1994. - P. 257 - 260.

113. Kuo W.-Ch., Shu T.-Y. Biological pretreatment of wastewater containing sulfate using anaerobic immobilized cells // J. Hazardous Materials. -2004.-№ 113.-P.147-155.

114. Lens P.N.L., Omil F., Lema J.M. and Hulshoff Pol L.W. Biological treatment of organic sulphate-rich wastewaters // Lens P.N.L. and Hulshoff Pol

115. W. (eds.) Environmental technologies to treat sulphur pollution. Principles and engineering. IWA Publishing, London, 2000. - P. 153 - 173.

116. Lens P., Vallero M., Esposito G. and Zandvoort M. Perspectives of sulfate-reducing bioreactors in environmental biotechnology // Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 2002. - № 1. - P. 311 - 325.

117. Lide D.R. CRC Handbook of Chemistry and Physics, 76th edn. Boca Raton, FL: CRC Press, 1995.

118. List of Bacteria // Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Режим доступа: http://www.dsmz.de/species /bacteria.htm#D (свободный).

119. Lovely D.R. Dissimilatory metal reduction // Annu.Rev.Microbiol., 1993, V.47.- P.263-290.

120. Lovely D.R. Bioremediation of organic and metal contaminants with dissimilatory metal reduction // J. Ind. Microbiol. 1995. - V.14. - P. 85-93.

121. Lovely D.R, Coates J.D., Woodward J.C. and Phillips E.J.P. Benzene oxidation coupled to sulfate reduction// Appl. Environ. Microbiol. -1995. V.61. -P. 953-958.

122. Lovely D.R. and Coates J.D. Bioremediation of metal contamination // Curr. Opin. Biotechnol. 1997. - V.8. - P. 285-289.

123. Lovely D.R., Dwyer D.F. and Klug M.J. Kinetic analysis of competition between sulfate-reducers and methanogenes for hydrogen insediments.// Appl. Env. Microbiol. 1982. - V.43. - P. 1373-1379.

124. Lovely D.R., Phillips E.J.P., Gorby Y.A. Microbial reduction of uranium // Nature. 1991. - № 350. - P. 413-416.

125. Lovely D.R., Phillips E.J.P. Reduction of chromate by Desulfovibrio vulgaris and its c3 cytochrome // Appl. Env. Microbiol. -1994. V.60. -P.726 - 728.

126. Lovley D.R., Widman P.K., Woodward J.C., Phillips E.J. Reduction of uranium by cytochrome c3 of Desulfovibrio vulgaris И Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 2301-2303.

127. Luptakova A., Kusnierova M. Bioremediation of acid mine drainage contaminated by SRB // Hydrometallurgy. 2005. - V.77. - P. 97-102.

128. Magnani D. and Solioz H. Copper chaperone cycling and degradation the regulation of the cop operon of Enterococcus hirae // BioMetals. 2005. -V.18, № 4. - P. 407-412.

129. Michel С., Brugna M., Aubert C., Bernadac A., Bruschi M. Enzymatic reduction of chromate: comparative studies using SRB. Key role of polycheme cytochromes с and hydrogenases // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V.55. - P.95 -100.

130. Michel C., Giudici-Orticoni M.-T., Baymann F. and Bruschi M. Bioremediation of chromate by sulfate-reducing bacteria, cytochromes c3 and hydrogenases // Water, Air and Soil Pollution: Focus 3.- 2000. P.161-169.

131. Miller C.L., Landa E.R., Updegraff D.M. Ecological aspects of microorganisms inhabiting uranium mill tailings // Microb. Ecol. 1987. - V.14. -P. 141-155.

132. Min H., Zinder S.H. Isolation and characterization of a termophilic sulfate-reducing bacterium Desulfotomaculum thermoacetooxidans sp. nov.// Arch. Microbiol. 1990. - V. 153. - P. 399-404.

133. Muyzer G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems // Current Opinion in Microbiology. 1999. - V.2, № 3. - P. 317-322.

134. Nagpal S., Chuichulcherm S., Livingston A., Peeva L. Ethanol utilization by sulfate-reducing bacteria: an experimental and modeling study // Biotechnology and Bioengineering. 2000. - V.70. - P. 533 - 543.

135. Nedwell D.B. Effect of low temperature on microbial growth: lowered affinity for substrates limits growth at low temperature // FEMS Microbiol.Ecol. -1999.-V.30.-P. 101-111.

136. Newman D.K., Kennedy E.K., Coates J.D., Ahmann D., Ellis D.J., Lovley D.R. and Moral F.M.M. Dissimilatoiy arsenate and sulfate reduction in Desulfotomaculum auripigmentum sp. nov// Arch. Microbiol. -1997. V.168. -P. 380-388.

137. Nielsen J.T., Liesack W., Finster K. Desulfovibrio zosterae sp.nov., a new sulfate reducer isolated from surface-sterilized roots of the seagrass Zostera marina // IJSB. 1999. - V.49. - P.859-865.

138. Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance // Appl.Microbiol.Biotechnol. 1999. - V.51. - P. 730 - 750.

139. Odom J.M. Industrial and environmental activities of the sulfate-reducing bacteria // The Sulfate-reducing bacteria: contemporary perspectives (Eds. J.M. Odom, R. Singleton Jr.). Springer-Verlag, New Yoik, 1995.-P. 189-210.

140. Okabe S., Itoh Т., Satoh H. and Watanabe Y. Analyses of spatial distribution of sulfate-reducing bacteria and their activity in aerobic wastewater biofilms // Appl. Env. Microbiol. 1999. - V.65. - P. 5107 - 5116.

141. Ollivier В., Cord-Ruwisch R., HatdiikianE.C.,GarciaJL. Characterization of Desulfovibriofructosovorans sp^v //Arch. Microbiol. -1988. V.149. -P. 447450.

142. Orphan V., Taylor L., Hafenbradi D., Delong E. Culture-dependent and culture-independent characterization of microbial assemblages associated with high-temperature petroleum reservoirs // Appl Environ Microbiol. 2000. - V.66. - P. 700-711.

143. Pachmayr F. Vorkommen und Schwefelverbindungen in Mineralwasser. PhD thesis. University Munchen, FRG, 1960. - P. 171.

144. Pacyna JM. The origin of Arctic air pollutants: lessons learned and future Research // Sci. Total. Environ. 1995. - V.160/161. - P.39-53.

145. Parkin G.F., Owen W.F. Fundamentals of anaerobic digestion of wastewater sludges // JWPCF. 1986. - V.l 12. - P. 867-920.

146. Pedersen K., Arlongen J., Ekendahl S. And Hallbeck L. 16SRNA gene diversity of attached and unattached bacteria in boreholes along the access tunnel to the Aspo hard rock laboratory, Sweden // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. -V.19, № 4. - P. 249-262.

147. Peters R.W., Ku Y., and Bhattacharyya D. Evaluation of recent treatment techniques for removal of heavy metals from industrial wastewaters // AIChE Symp.Ser. 1985. - № 81. - P. 165-203.

148. Petrilli F.L., Flora S.D. Toxicity and mutagenicity of hexavalentchromium in Salmonella typhimurium // Appl. Env. Microbiol -1977 V.33. - P.805-809.

149. Phelps C.D., Kerkhof L.J. and Young L.Y. Molecular characterization of a sulfate-reducing consortium which mineralizes benzene // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. - V.27. - P. 269-279.

150. Phelps C.D., Young L.Y. Anaerobic biodegradation of BTEX and gasoline in various aquatic sediments // Biodegradation. -1999. V. 10. - P. 15 - 25.

151. Pikuta E., Lysenko A., Suzina N., Osipov G., Kuznetsov В., Tourova Т., Akimenko V. and Laurinavichius K. Desulfotomaculum alkalifllum sp.nov., a new alkaliphilic, moderately thermophilic, sulfate-reducing bacterium // IJSEM. -2000.-V.50.-P. 25-33.

152. Plugge C.M., Balk M. and Stams A.J. Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum subsp. nov., a thermophilic, syntrophic, propionate-oxidizing, spore-forming bacterium // IJSEM. 2002. - V.52. - P. 391 - 399.

153. Postgate J. R. The sulphate reducing bacteria, 2nd. ed.- Cambridge: Cambridge University Press, 1984. P. 1208.

154. Poulson S.R., Colberg P.J.S. and Drever J.I. Toxicity of heavy metals (Ni, Zn) to Desulfovibrio desulfuricans II Geomicrobiology J. -1997. V.14. - P. 41-49.

155. Purdy K.J., Embley T.M. and Nedwell D.B. The distribution and activity of sulfate reducing bacteria in estuarine and coastal marine sediments // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - V.81. - P. 181-187.

156. Purdy K.J., Nedwell D.B., Embley T.M., Takii S. Use of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes to investigate the distribution of sulphate-reducing bacteria in estuarine sediments // FEMS Microbiol. Ecol. -2001. V.36. - P. 165-168.

157. Rabus R., Bruchert V., Amann J., Konneke M. Physyological response to temperature changes of the marine sulfate-reducing bacterium Desulfobacterium autotrophicum II FEMS Microbiology Ecology. 2002. - V.42. - P. 409 - 417.

158. Rae T.D., Schmidt P.J., Pufahl R.A., Culotta V.C. and O'Halloran T.V. Undetectable intracellular free copper: requirement of a copper chaperone for superoxide dismutase // Science. 1999. - № 284. - P.805-808.

159. Ravenschlag К., Sahm К., Knoblauch Ch., Jorgensen B.B. and Amann R. Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine arctic sediments // App Env Microbiol. 2000. - V.66, № 8. - P. 3592-3602.

160. Ravenschlag K., Sahm K., Pernthaler J., Amann R. High bacterial diversity in permanently cold marine sediments // Appl Environ Microbiol. 2000. -V.65.-P. 3982-3989.

161. Redburn A.C., Patel B.K. Desulfovibrio longreachii sp.nov., a sulfate-reducing bacterium isolated from the Great Artesian Basin of Australis // FEMS Microbiol.Lett. 1994. - V.l 15, № 1. - P. 33-41.

162. Reinchenbecher W., Schink B. Desulfovibrio inopinatus sp.nov., a new sulfate-reducing bacterium thet degrades hydroxyhydroquinone (1,2,4-trihydroxybenzene) // Arch. Microbiol. 1997. - V.168. - P. 338-344.

163. Rensing C., Ghosh M. and Rosen B.P. Families of soft-metal-ion-transporting ATP-ases // J.Bacteriol. 1999. - V.l81. - P. 5891-5897.

164. Rensing C., Grass G. Escherichia coli mechanisms of copper homeostasis in a changing environment // FEMS Microbiol. Reviews. 2003. -V.27.-P. 197-213.

165. Richards J.W., Krumholz G.D., Chval M.S. and Tisa L.S. Heavy metal resistance of Frankia Strains // Appl. Env. Microbiol. 2002. - V.68, № 2 - P. 923-927.

166. Risatti J.B., Capman W.C., and Stahl D.A. Community structure of a microbial mat: The phylogenetic dimension // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - № 91. - P.10173.

167. Robertson W. J., Bowman J. P., Franzmann P. D. and Мее B. J. Desulfosporosinus meridiei sp. nov., a spore-forming sulfate-reducing bacterium isolated from gasolene-contaminated ground water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001.-V.51.-P. 133-140.

168. Roest K., Heilig H.G.H.J., Smidt H., de Vos W.M., Stams J.M., Akkermans A.D.L. Community analysis of a full-scale anaerobic bioreactor treating paper millwastewater I I Syst. Appl. Microbiol. 2005. - V.28. - P. 175 - 185.

169. Rouch D.A. and Brown N.L. Copper inducible transcriptional regulation at two promoters in the Escherichia coli copper resistance determinant pco // Microbiology. 1997. - V.143. - P. 1191-1202.

170. Rouch D., Camakaris J., Lee B.T. and Luke P.K. Inducible plasmid-mediated copper resistance in Escherichia coli II J. Gen. Microbiol. 1985. -V.131.-P. 939-943.

171. Rowley D.A. and Halliwell B. Superoxide-dependent and ascorbate-dependent formation of hydroxy 1 radicals in the presence of copper salts: a physiological significant reaction? // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - № 225. -P.279-284.

172. Rowley M., Warkentin D.D. and Sicotta V. Site demonstration of the bisulphide process at the former Britannia mine // Proceedings of the 4th international conference on acid rock drainage, Vancouver, British Columbia. -1997.-P.1531 -1548.

173. Sadler W. R., Trudinger P.A. The inhidition of microorganisms by heavy metals // Min. Dep. 1967. - №2. - P. 158 - 168.

174. Sahm K., MacGregor B.J., Jorgensen B.B. and Stahl D.A. Sulfate reduction and vertical distribution of sulfate-reducing bacteria quantified by rRNA slot-blot hybridization in a coastal marine sediment // Environ. Microbiol. 1999. № l.-P. 65-74.

175. Sagemann J., Skowronek F., Dahmke A. and Schulz H.D. Pore-Water response on seasonal environmental changes in intertidal sediments of the Weser Estuary, Germany // Environ.Geol. 1996. - V.27. - P.362 - 369.

176. Sani R.K., Geesey G.G. and Peyton B.M. Assessment of lead toxicity to Desulfovibrio G20: Influence of components of lactate С medium // Adv. Env. Res. -2001.-V. 5.-P. 269-276.

177. Sani R.K., Peyton B.M., Brown L.T. Copper-induced inhibition of growth of Desulfovibrio desulfuricans G20: Assessment of its toxicity and correlation with those of zinc and lead // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 4765-4772.

178. Sani R.K., Peyton B.M., Amonette J.E., and Geesey G.G. Reduction of uranium (VI) under sulfate-reducing conditions in the presence of Fe(III)-(hydr)oxides // Geochimica et Cosmochimica Acta. 2004. - V.68, № 12. - P. 2639-2648.

179. Sass A., Riitters H., Cypionka H., Sass H. Desulfobulbus mediterraneus sp. Nov., a sulfate-reducing bacterium growing on mono- and disaccharides // Arch. Microbiol. 2002. - V.177. - P. 468-474.

180. Sass H., Overmann J., Riitters H., Babenzien H.-D., Cypionka H. Desulfosporomusa polytropa gen. nov., sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium from sediments of an oligotrophic lake // Arch. Microbiol. 2004. -V.182.-P. 204-211.

181. Schippers A., Hallman R., Wentzien S. and Sand W. Microbial diversity in uranium mine waste heaps // Appl Environ Microbiol. 1995. - V.61. -P. 2930-2935.

182. Seghezzo L., Zeeman G., van Lier J.B., Hamelers H.V.M., Lettinga G. A review: the anaerobic treatment of sewage in UASB and EGSB reactors // Bioresour.Technol. 1998. - V.65. -P.175 - 190.

183. Sharak Genthner B.R., Mundfrom G. and Devereux R. Characterization of Desulfomicrobium, escambium sp.nov. and proposal to assign Desulfovibrio desulfuricans Norway4 to the genus Desulfomicrobium // Arch.Microbiol. 1994. - V.161. -P.215-219.

184. Shen Y., Buick R. and Canfield D.E. Isotopic evidence for microbial sulfate reduction in the early Archaean era // Nature. 2001. - № 410. - P. 77-81.

185. Shirazi F. Development of biological permeable barriers for removal of chlorophenols (2,4,6 trichlorophenol) in contaminated groundwaters, PhD Dissertation. - Oklahoma State Univ., Stillwater, OK, 1997. - P. 114.

186. Silver M., Torma A.E. Oxidation of metal sulfides dy Thiobacillus ferrooxidans grow in different substrates // Can. J. Microdiol. 1974. - V.20. - P. 141-147.

187. Silver S. and Phung L.T. Bacterial heavy-metal resistance : new surprises // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - V.50. - P. 753-789.

188. Singleton R.Jr. The sulfate-reducing bacteria: an overwiew // The Sulfate-reducing bacteria: contemporary perspectives (Eds. J.M. Odom, R. Singleton Jr.). Springer-Verlag, New York, 1995. - P. 1 - 20.

189. Solioz M., Stoyanov J.M. Copper homeostasis in Enterococcus hirae // FEMS Microbiol.Rev. 2003. -V.133, № 6. - P. 817-823.

190. Speece R.E. Anaerobic biotechnology for industrial wastewaters. -Archae Press, USA, 1996. P. 394.

191. Stackebrandt E., Stahl D.A. and Devereux R. Taxonomic relationships// Barton L.L. (Ed.) Sulfate-reducing bacteria, Plenum Press, New York. 1995. P. 49 - 87.

192. Stackebrandt E., Schumann P., Schiiler E., and Hippe H. Reclassification of Desulfotomaculum auripigmentum as Desulfosporosinus auripigmenti conig., comb, nov // bit J. SysL Evol. Microbiol. -2003. V.53. -P. 1439 -1443.

193. Stahl D.A., Fishbain S., Klein M., Baker B.J. and Vagner M. Origins and diversification of sulfate-respiring microorganisms // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - V.81. - P. 189-195.

194. Staley J.T., Irgens R.L., Herwig R.P. Gas vacuolated bacteria from the sea ice of Antarctica//Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V.55.-P. 1033-1036.

195. Stetter K.O. Archaeglobus fulgidus gen. nov., sp. nov.: a new taxon of extremely thermophilic archaebacteria // System. Appl. Microbiol. 1988. - V.10. -P. 172-173.

196. Stucki G., Hanselmann K.W. and Hiirzeler R.A. Biological sulfuric acid transformation: Reactor design and process optimization // Biotechnology and Bioengineering. 1993. - V.41. -P.303 -315.

197. Taylor M.R.G. and McLean R.A.N. Overview of clean-up ethods for contaminated sites // JIWEM. 1992. - V.6. - P. 408-417.

198. Tebo B.M., Obraztsova A.Y. Sulfate-reducing bacterium grows with Cr (VI), U (IV), Mn (IV) and Fe (III) as electron acceptors // FEMS Microbiology Letters. 1998. - 162. - P. 193 - 198.

199. Tetaz T.J., Luke R.K.J. Plasmid-controlled resistance to copper in Ecsherichia coli II J. Bacteriol. 1983. - 170. - P. 1263 - 1268.

200. Thayer J.S., Brinckman F.E. The biological methylation of metals and metalloids // Adv. Organometallic Chem. 1984. - № 20. - P. 313.

201. Trajanovska S., Britz M.L., and Bhave M. Detection of heavy metal ion resistance genes in Gram-positive and Gram-negative bacteria isolated from a lead-contaminated site // Biodegradation. 1997. - V.8. - P. 113-124.

202. Trinkerl M., Breunig A., Schauder R., Konig H. Desulfovibrio termitidis sp.nov., a carbohydrate-degrading sulfate-reducing bacterium from the hindgut of a termite // System. Appl. Microbiol. 1990. - V. 13. - P.372-377.

203. Tsukamoto Т.К., Killion H.A., Miller G.C. Column experiments for microbiological treatment of acid mine drainage: low-temperature, low-pH and matrix investigations // Water Research. 2004. - V.38. - P. 1405-1418.

204. Tucker M.D., Barton L.L., Thomson B.M. Reduction of Cr, Mo, Se and U Desulfovibrio desulfuricans immobilized in polyacrylamide gels // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V.20. - P. 13-19.

205. Tuttle J.M., Dugan P.R. and Randies C. Microbial dissimilatory sulfur cycle in acid mine water // J. Bacteriol. 1969. - V.97. - P. 594 - 602

206. Upadhyay J., Stokes J.L. Anaerobic growth of psychrophilic bacteria // J. Bacteriol. 1962. - V.83. - P. 983-1015.

207. Urukawa H., Kita-Tsukamoto K., Ohwada K. Microbial diversity in marine sediments from Sagami Bay and Tokyo Bay, Japan, as determined by 16S rRNA gene analysis // Microbiology. 1999. - V.145. - P. 3305-3315.

208. Utgikar V.P., Harmon S.M., Chaudhary N., Tabak H.H., Givond R., Haines J.R. Inhibition of sulfate-reducing bacteria by metal sulfide formation in bioremediation of acid mine drainage // Env. Toxicol. 2002. - V.l 7. - P. 40-48.

209. Vainshtein M., Kuschk P., Mattusch J., Vatsourina A., Wiessner A. Model experiments on the microbial removal of chromium from contaminated groundwater // Water Research. 2003. - V.37. - P. 1401-1405.

210. Wagner M., Roger A.J., Flax J.L., Brusseau G.A., and Stahl D.A. Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports an early origin of sulfate respiration //J. Bacteriol. 1998. - V.180. - P. 2975-2982.

211. Wallner G., Amann R. and Beisker W. Optimizing fluorescent in situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes for flow cytometric identification of microorganism // Cytometry. 1993. - V.14. - P. 136-143.

212. Werkman C.H. and Weaver H.J. Studies in the bacteriology of sulphur stinker spoilage of canned sweet corn // Jowa State Coll. J. Sci. -1927. V.2. - P. 57-67.

213. White C. and Gadd G.M. Accumulation and effects of cadmium on sulfate-reducing bacterial biofilms // Microbiology. 1998. - V.144. - P. 14071415.

214. White C., Gadd G.M. Copper accumulation by sulfate-reducing bacterial biofilms // FEMS Microbiology Letters. 2000. - V. 183. - P. 313-318.

215. White C., Sayer J.A., Gadd G.M. Microbial solubilization and immobilization of toxic metals: key biogeochemical processes for treatment of contamination // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - V.33. - P. 197-208.

216. Widdel F. Microbiology and ecology of sulfate-reducing bacteria // Biology of Anaerobic Microorganisms.- Carl Hanser Verlag, Munich. -1988,. V3. -P. 469 -585.

217. Widdel F., Bak F. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria // The Procaryotes, 2nd edn., vol.4 (A. Balows, H.G.Truper, M. Dworkin, W. Harder, and K.-H. Schleifer, Eds). Berling: Springer-Verlag, 1992.- P. 33523378.

218. Widdel F., Hansen T.A. The dissimilatory sulfate- and sulfur-reducing bacteria // Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W. and Schleifer K.-H. (Eds.) The Prokaiyotes., 2nd edition. Springer-Verlag, New York, USA, 1992. -Vol.1.-P.584-624.

219. Widdel F., Pfennig N. Studies on dissimilatory sulfate-reducing bacteria that decompose fatty acidsll. Incomplite oxidation of propionate by Desulfobulbus propionicus gen. nov., sp. nov // Arch. Microbiol. 1982. - V.131. -P. 360-365.

220. Wiegel J. Temperature spans for growth: hypotesis and discussion // FEMS Microbiol. Rev. 1990. - V.75. - P. 155-170.

221. Wielinga В., Lucy J.K., Moore J.N., Seastone O.F. and Gannon J.E. Microbiological and geochemical characterization of fluvially deposited sulfidic mine tailings // Appl. Env. Microbiol. 1999. - V.65. - P. 1548-1555.

222. Williams J.R., Morgan A.G., Rouch D.A., Brown N.L. and Lee B.T.O. Copper-resistant enteric bacteria from United Kingdom and Australian piggeries // Appl. Env. Microbiol. 1993. - V.59. - P. 2531-2537.

223. Zellner G., Messner P., Kneifel H., Winter J. Desulfovibrio simplex sp.nov., a new sulfate-reducing bacterium from a sour whey digester // Arch. Microbiol. 1989. - V.l52. - P. 329-334.

Информация о работе

Франк, Юлия Александровна
кандидата биологических наук
Томск, 2006
ВАК 03.00.16

Диссертация

Выделение и изучение сульфатредуцирующих бактерий из экосистем, подверженных влиянию металлургических предприятий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы