Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоразнообразие сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащих водах Черного и Балтийского морей

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биоразнообразие сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащих водах Черного и Балтийского морей"

На правах рукописи

КОРНЕЕВА ВАЛЕРИЯ АЛЕКСЕЕВНА

Биоразнообразие сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащих водах Черного и Балтийского морей

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 АВГ 2015

Москва-2015

- \ / 1

1 <

V,'

д)

005561421

005561421

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.

Г.К. Скрябина Российской академии наук», заместитель директора по научной работе

Николаев Юрий Александрович

доктор биологических наук Отдел очистки сточных вод Инженерно-технологического центра Управления новой техники и технологий, АО «Мосводоканал», главный специалист

кандидат биологических наук, доцент Брюханов Андрей Леонидович

доктор биологических наук Пименов Николаи Викторович

Вайи штейн Михаил Борисович

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет, биологический институт»

Защита состоится 22 сентября 2015 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, г. Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1. Тел.: 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ и на сайте биологического факультета МГУ http://www.bio.msu.ru/.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

К сульфатредуцирующим бактериям (СРБ) относят анаэробные микроорганизмы, использующие сульфат в качестве конечного акцептора электронов при окислении органических соединений или молекулярного водорода. В анаэробных местообитаниях СРБ, наряду с метаногенными археями, осуществляют терминальную деструкцию органических соединений, продуцируя при этом сероводород. СРБ традиционно считаются строго анаэробными микроорганизмами, однако в последнее время показано, что многие из них обладают эффективными ферментативными системами антнокислительнон защиты [Dolla et al., 2006; Brioukhanov et al., 2010], позволяющими им не только выживать, но и оставаться метаболически активными в окисленных слоях осадочных отложений, в циано-бактериальных матах, биопленках, активных илах сточных вод и других местообитаниях, подвергающихся периодическому воздействию кислорода [Canfield a. Des Marais, 1991; Krekeler et al., 1997; Jonkers et al., 2005].

Черное море - крупнейший в мире меромиктический водоем, где наблюдается существование несмещнваемых слоев воды (аэробные воды, зона хемоклина и анаэробные воды, содержащие значительные количества растворенного сероводорода) [Сорокин, 1982]. Хорошо известно, что сероводород в Черном море образуется, в основном, за счет деятельности сульфатредуцпрующих бактерий в анаэробной водной толще и донных осадках [Сорокин, 1970; Леин и др., 1990; Гулки, 1991; Иванов и др., 1992]. В литературных источниках разными исследователями приводятся количественные оценки масштабов бактериальной сульфатредукции в анаэробных водах Черного моря [Sorokin, 1971; Леин и др., 1990; Albert, 1995]. С использованием молекулярно-биологическнх методов было подтверждено присутствие СРБ [Vetriani, 2003; Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Neretin et al., 2007] в анаэробной водной толще и зоне хемоклина, а также в анаэробных матах [Basen et al., 2011] Черного моря, но филогенетический состав сообществ черноморских СРБ оставался до конца не выясненным, кроме того, полностью отсутствовали данные о выделении, идентификации и описании чистых культур этих бактерий. Нет информации и о возможности протекания процесса сульфатредукции в аэробной водной толще, несмотря на то, что сотрудники Института океанологии им. П.П. Ширшова РАН более 20 лет назад обнаружили в аэробных водах Черного моря присутствие аналитически определяемых количеств восстановленных соединений серы [Волков и др., 1992], появление которых можно объяснить только протеканием биологических процессов восстановления сульфатов.

Балтийское море представляет собой мелководный мезотрофный морской бассейн со специфическими особенностями гидрологического режима, присущими внутренним водоемам с затрудненным водообменом. Его поверхностные, сильно распресненные и более глубинные, соленые воды имеют разное происхождение: первые поступают со стоком рек, вторые - из

Северного моря. Затрудненный водообмен в сочетании с достаточно высокой продуктивностью приводит к тому, что во впадинах Балтийского моря за счет деятельности микроорганизмов происходит быстрое исчезновение кислорода и формируется обширная зона сероводородного заражения водной толщи, обусловленная жизнедеятельностью СРБ [Fonselius, 1986; Андерсен и Паулак, 2007; Carstensen et al., 2014]. В анаэробной водной толще Готландской впадины Балтийского моря немецкими исследователями выявлены процессы сульфатредукцни и молекулярными методами идентифицированы некоторые представители СРБ [Brettar et al., 2012], но данных о присутствии активных форм этих микроорганизмов в подповерхностных аэробных водах в литературе нет. В российском секторе Балтийского моря анаэробные придонные слои водной толщи практически постоянно наблюдаются в Гданьском впадине на глубинах свыше 8085 м [Нефть и окружающая среда Калининградской области, 2012].

Высокая антропогенная нагрузка, которой подвержены внутриконтинентальные моря, окруженные промышленно развитыми регионами, способствует значительному расширению площади постоянного или периодического заражения придонной водной толщи сероводородом, как это наблюдается в водной толще северо-западного шельфа Черного [Кондратьев и Внуков, 1999] и во впадинах Балтийского и Каспийского морей [Бруевич, 1937; Сапожников и Мордасова, 2007; Carstensen et al., 2014].

Большинство исследователей склоняются к гипотезе, что основным источником сероводорода во впадинах мелководных бассейнов являются донные осадки, где в условиях увеличения потока органического вещества резко усиливается интенсивность процесса сульфатредукцни. Однако с учетом новых данных о СРБ, обладающих эффективными биохимическими и физиологическими способами защиты от окислительных стрессов и способных в водной толще морей сохранять физиологическую активность в микроаэробных микронишах взвешенных частиц [Shanks & Reeder, 1993], можно предположить, что СРБ аэробной водной толщи оказывают существенное воздействие на кислородный режим вод мезотрофных и эвтрофных морских водоемов.

Таким образом, изучение филогенетического и функционального разнообразия сообществ сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащей (подповерхностные воды и зона хемоклина) водной толще Черного и Балтийского морей с использованием комплекса молекулярно-биологических, биохимических и традиционных микробиологических методов является весьма актуальной и интересной научной задачей

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение филогенетического разнообразия

сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащей (подповерхностные воды и зона

хемоклина) водной толще Черного и Балтийского морей с использованием комплекса

молекулярно-биологических, биогеохимических и традиционных микробиологических методов.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

4

1. Оценить с помощью стандартной и вложенной ПЦР с праймерами, специфичными на гены 16S рРНК, распространение ассоциированных с взвесью и свободноживущих сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) шести основных филогенетических подгрупп в гидрохимически различающихся слоях кислород-содержащей водной толщи Черного и Балтийского морей.

2. Определить численность СРБ на различных горизонтах кислород-содержащей водной толщи Черного моря методами флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) и количественной ПЦР.

3. Получить с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) профили сообществ СРБ (по гену dsrB, кодирующему р-субъединицу диссимиляционной сульфитредуктазы) на различных глубинах кислород-содержащей водной толщи Черного и Балтийского морей, отсеквеннровать участки гена dsrB, выделенные и реамплифицированные из отдельных ДГГЭ-полос, и провести полный филогенетический анализ сообществ СРБ по гену dsrB.

4. Получить накопительные культуры СРБ из кислород-содержащей водной толщи Черного и Балтийского морей.

5. Дать описание чистой культуры СРБ, выделенной из фотической зоны Черного моря, и дать оценку способности выделенного штамма к росту и осуществлению процесса сульфатредукцин в условиях кислородных стрессов.

Научная нопизна работы. Впервые с помощью комплекса современных молекулярно-биологических методов детально изучен филогенетический состав сообществ СРБ в подповерхностной кислород-содержащей водной толще Черного и Балтийского морей. Обнаружены физиологически активные клетки СРБ в аэробных морских водах, а также подтверждено их присутствие в зоне хемоклина Черного моря. Получены накопительные и чистая культуры СРБ из аэробной водной толщи Черного моря. Впервые выделенная из аэробной водной толщи (глубина - 30 м) Черного моря чистая культура психрофильной сульфатредуцирующей бактерии полностью охарактеризована и описана как новый вид Desulfofrigus euxinos. Показано, что данная бактерия обладает относительной аэротолерантностыо, сохраняя жизнеспособность при начальных концентрациях кислорода до 5.2% в газовой фазе над средой культивирования. Практическая и теоретическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в получении новых и принципиально важных данных о филогенетическом составе сообществ СРБ в кислород-содержащей водной толще Черного и Балтийского морей, а также о свойствах выделенной в чистую культуру черноморской СРБ. Полученные результаты дополняют накопленные к настоящему моменту знания о распространении сульфатредуцирующих бактерий в местообитаниях, подверженных воздействию кислорода, а также о составе микробных сообществ водной толщи исследуемых морей.

С практической точки зрения, точенные данные о биоразнообразии сульфатредуцирующих бактерий в морских аэробных водах могут служить основой для разработки новых способов борьбы с биокоррозией металлических конструкций в морских водоемах, а также учитываться при заводнениях нефтяных пластов морской кислород-содержащей водой. Выделенная с глубины 70 м Черного моря накопительная культура, содержащая СРБ рода Desulfosporosinus и нуждающаяся для роста в присутствии бихромата калия в среде, потенциально может являться объектом для использования в биоремедиации различных соленых водных экосистем от загрязнений токсичными солями хрома, в том числе для очистки промышленных стоков с высоким содержанием хрома (гальваники, кожевенного производства и др.). Апробация работы. Результаты исследований были представлены на V, VI и VII молодежных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009, 2010 и 2011 гг.), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010 г.), XVII, XVIII, XIX и XXI международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011, 2012 и 2014 гг.), 3-м Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах» (Иркутск, 2011 г.), 4-м и 6-м конгрессах европейских микробиологов FEMS (Швейцария, Нидерланды, 2011 и 2015 гг.), 16-й и 18-й международных Путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2012 и 2014 гг.), Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва. 2014 г.), а также на заседании кафедры микробиологии биологического факультета МГУ (2015 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК. Кроме того, 2 работы находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 236 литературный источник, из которых 210 англоязычных. Работа изложена на 178 страницах, содержит 24 рисунка и 17 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования были сообщества сульфатредуцирующих бактерий кислородсодержащих вод Черного и Балтийского морей.

Пробы воды с глубин от 30 до 200 м Черного моря отбирали в июле 2010 г. с борта НИС «Ашамба» на станции с глубиной 1300 м (N44°27'48", W37°52'92") с помощью батометров зондирующего комплекса типа «Rosette», оснащенного гидрофизическим зондом фирмы «Sea-Bird

Electronics, Ine.» (США) с дополнительными датчиками содержания Ог, мутности и Eh. Пробы воды с глубин от 0 до 110 м Гданьской впадины Балтийского моря в точке с координатами N54°51'36", W19°19'58,8" (станция № 22) отбирали аналогичным образом в июле 2011 г. с борта малого рыболовного траулера МРТК-1073.

При проведении метода FISH за основу брали стандартный протокол [Araann et al., 1992; Glockner et al., 1996; Pemthaler et al., 2002]. Применяли меченные цианином 3 зонды для идентификации представителей Bacteria [Amann et al., 1990], Archaea [Stahl et al., 1995] и более специфичные - для выявления подгрупп сульфатредуцирующих бактерий [Devereux et al., 1992; Manz et al., 1998; Hristova et al., 2000; Lücker et al., 2007]. Для поиска нужных зондов использовали также базу данных probeBase (http://www.microbial-ecology.net/probebase). Микроскопический анализ для подсчета клеток, гибридизовавшихся со специфическими зондами, проводили при увеличении *1000 на эпифлуоресцентном микроскопе Axio Iraager.Dl («Carl Zeiss», Германия) с цифровой камерой Axio Cam HRc, светофильтром Zeiss 20 и компьютерным программным обеспечением Axio Vision.

Для выделения ДНК пробы воды (по 5 л) были последовательно профильтрованы через стекловолокоиные крупнопористые (GF/C) и мембранные (диаметр пор 0,22 мкм, «Millipore», США) фильтры. Фильтры хранили в смеси буферный раствор ТЕ (pH 8,0): этанол (1:1) при 4 °С. ДНК с разрушенных в жидком азоте фильтров выделяли с использованием коммерческого набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas», Литва) в соответствии с протоколом производителя. ПЦР с праймерами рА-рН' на ген 16S рРНК Bacteria, а также с праймерами, специфичными к участку гена dsrB и участкам гена 16S рРНК шести основных филогенетических подгрупп СРБ, проводили по стандартным протоколам [Edwards et al., 1989; Daly et al., 2000; Geets et al., 2006].

Подсчет количества копий участка гена dsrB проводился методом количественной ПЦР с использованием красителя SYBR Green [Wittweret al., 1997] на ДНК-амплификаторе Mini Opticon («Bio-Rad», США) с использованием пары праймеров DSRp2060F и DSR4R. Для построения калибровочной кривой использовали ДНК, выделенную из чистой культуры Desulfovibrio vulgaris Hildenborough АТСС 29579.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) для разделения смеси продуктов ПЦР-амплификации с праймерами DSRp2060F (с прикрепленным к 5'-концу ГЦ-богатым участком) и DSR4R проводили по стандартному протоколу [Geets et al., 2006].

Секвенпрование участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных

ДГГЭ-полос. с прямым (DSRp2060F) и обратным (DSR4R) праймерами к участку гена dsrB

проводили на автоматическом четырехкапиллярном генетическом анализаторе ABI Prism 3130

(«Applied Biosystems», США) по протоколу для полимера 3130 РОР-6 («Applied Biosystems»,

США) на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ и в Центре «Биоинженерия»

РАН. Первичный анализ сходства полученных аминокислотных последовательностей,

7

кодируемых геном dsrB, с известными последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программного пакета BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Филогенетические дендрограммы строили по методу ближайших соседей (neighbour-joining), реализованному в пакете программ TREECONW, используя референтные последовательности из GenBank.

Для культивирования СРБ использовали жидкую питательную среду Видделя для морских форм сульфатредуцирующих бактерий [Widdel et al., 1992] с добавлением микроэлементов [Pfennig, Lippert, 1966], витаминов [Widdel et al., 1981] и других растворов, состав которых приведен в полном тексте кандидатской диссертации. Для приготовления сред использовали модифицированную анаэробную технику Хангейта [Hungate, 1969]. Пробирки с накопительными культурами инкубировали при 22-23 °С в теченне 7-21 сут. Для выделения чистых культур СРБ из накопительных использовали метод предельных разведений в полужидкой агаризованной питательной среде.

Микроскопию препаратов культуры Desulfofrigus sp. осуществляли на фазово-контрастном микроскопе Olympus ВХ41 («Olympus», Япония) при увеличении х 1 ООО с цифровой камерой Olympus С-7070 («Olympus», Япония) и компьютерным программным обеспечением Imagescope Lite («Системы для микроскопии и анализа», Россия). Исследование тонких структур клеток Desulfofrigus sp. проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100CX («Jeol», Япония).

Сероводород в растущих культурах сульфатредуцирующих бактерий определяли колориметрическим методом путем специального окрашивания проб из культур Ы,Ы-диметил-я-фенилендиамином и железоаммонийными квасцами с последующим определением интенсивности окраски растворов на спектрофотометре [Triiper et al., 1964]. Измерение скоростей процесса сульфатредукции в пробах морской воды и культурах Desulfofrigus sp. проводили радиоизотопным методом с использованием 3!S-SOi2' по методике, подробно описанной ранее [Пименов и др., 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сообщества сульфатредуцирующих бактерий в подповерхностных кислородсодержащих водах Черного моря.

1. Содержание кислорода, сероводорода и интенсивность сульфатредукции в верхней водной толще Черного моря. Максимальная концентрация Ог на станции с координатами 44°.458N, 37°.882Е (максимальная глубина 1300 м) наблюдалась на глубине около 30 м и составляла 300 мкМ. Ниже этой глубины содержание кислорода в воде постепенно снижалось до 200 мкМ (на глубине 80 и), а затем происходило резкое уменьшение его концентрации до 70 мкМ на глубине 100 м, что характерно для верхней части зоны хемоклина (рис. 1а). С дальнейшим увеличением глубины концентрация кислорода продолжала снижаться, и ниже 160 м он уже не обнаруживался методом Винклера.

Первые следы присутствия сероводорода появлялись на глубине 153 м (1,2 мкМ), соответствующей нижней границе хемоклина. С увеличением глубины наблюдалось увеличение содержания сероводорода, и на глубине 191 м его концентрация равнялась 11,82 мкМ (рис. 1а).

Аналогично предыдущим исследованиям [Пименов и др., 2000] в анаэробных водах на глубинах 190-400 м мы наблюдали повышенные скорости сулъфатредукции - около 0,8 мкмоль/(л х сутки). Однако отдельные максимумы скоростей сульфатредукции были обнаружены не только в верней части хемоклина на глубине 150 м (1,06 мкмоль/(л х сутки)), где концентрация растворенного Ог низка, но также и в аэробной зоне на глубине 100-110 м (0,76-1,01 мкмоль/(л х сутки)) и даже в подповерхностном слое воды (рис. 16).

В связи с обнаружением процесса сульфидогенеза в аэробных водах и зоне хемоклина нами было сделано предположение о присутствии на данных горизонтах метаболически активных сульфатредуцирующих бактерий.

(а) 02. мкМ (б) ССР, мкмолг>/(л сут)

0 100 200 300 400 0 0.5 1.0 1.5

0 5 10 15

H3S, мкМ

Рис. 1. Содержание О2, H2S и скорость сульфатредукции в водной толще глубоководной зоны Черного моря в районе г. Геленджик (44°.458N, 37°.882Е, глубина 1300 м): а - содержание кислорода (1) и сероводорода (2) в подповерхностной водной толще; б - профиль скорости сульфатредукции (ССР) в подповерхностной водной толще (0-200 м) [Брюханов и др., 2011].

2. Исследование сообществ СРБ в верхних водных горизонтах Черного моря методом

флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Общая численность клеток микроорганизмов,

определенная окрашиванием с флуоресцентным ДНК-специфичным красителем 4',6-диамидино-

2-фенилиндолом (ДАФИ), в водной толще Черного моря постепенно увеличивалась от подповерхностных аэробных вод к зоне хемоклина, достигая наибольших значений в верхних

горизонтах анаэробных вод (глубина 210 м: 1,60 х 106 кл./мл). Доля бактерий постепенно снижалась от 75% от общего числа микробных клеток в аэробных водах до 40% в зоне хемоклина (рис. 2). Доля архей при этом возрастала от 11,6 до 47% от всех клеток. На глубине 600 м

(бескислородная водная толща) наблюдалось снижение общей численности микроорганизмов по сравнению с зоной хемоклина (2,58 х Ю3 кл./мл). При этом большую часть всех метаболически активных прокариотических клеток составляли бактерии (34%), а доля архей была незначительна (1,5%).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

157.5 167.5 Глубина, м

хЮ'кл/мл 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

ПВаскпа GM'r.'.vAj Всепрокаридгы -+-Д.4ФП

Рис. 2. Распределение прокариот в водной толще континентального склона Черного моря, определенное с помощью FISH

Методом FISH на глубине 30 м в аэробной зоне континентального склона Черного моря (содержание СЬ - 300 мкМ) было обнаружено большое количество клеток СРВ родов Desulfotomaculum (22,8% от общей численности микроорганизмов) и Desulfovibrio (36%), а также около 5% Desulfobacter spp. (табл. 1).

В зоне хемоклина доминирующей филогенетической подгруппой СРБ, выявляемой с помощью FISH-зондов. являлись представители рода Desulfomicrobium, доля которых составляла от 9,3 до 13,4% от общей численности микроорганизмов (табл. 1). В кислород-содержащих подповерхностных водах, а также в бескислородных глубинных водах, клетки Desulfomicrobium spp. практически не обнаруживались. Также в зоне хемоклина были детектированы представители рода Desulfovibrio в количестве от 2,7% до 3,9% от общей численности микроорганизмов (табл. 1).

На глубине 600 м наблюдались только сигналы для зондов, специфичных к 16S рРНК СРБ родов Desulfomicrobium и Desulfovibrio.

3. Численность СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря. По результатам анализа сообществ микроорганизмов Черного моря методом количественной ПЦР доля СРБ от всех микроорганизмов составляла от 0,065% в аэробной водной толще до 9% в верхней части анаэробных вод (табл. 2). Доля СРБ постепенно увеличивалась с глубиной с локальным пиком (0,78%) в зоне хемоклина на глубине 150 м. Абсолютная численность СРБ составляла 0,17-15,66 х

10

Ю3 кл./мл, постепенно увеличиваясь от поверхности к анаэробным водам. Однако на глубине 110 и численность СРБ была практически равна таковой в подповерхностных водах (0,18 * 103 кл./мл). Это объясняется тем, что на глубине 110 м находится холодный промежуточный слой (ХПС), характеризующийся понижением общего числа клеток.

Таблица 1.

Распределение сульфатредуцирующих бактерий в водной толще континентального склона Черного моря, определенное с помощью FISH

Зонд Количество клеток в 1 мл пробы

30 м, аэробная зона 150 м, зона хемоклина 157,5 м, зона хемоклина 167,5 м, анаэробная зона 210 м, анаэробная зона 600 м, анаэробная зона

ДАФИ 8,82 х 10! 1,06 х ю6 7,11 х ю5 1,23.x ю' 1,60 х 106 2,58 х Ю5

Bacteria 6,60 х Ю5 (74,8%) 4,24 х Ю! (40,0%) 2,72 х ю5 (38,2%) 5,62 х 105 (45,7%) 5,49 х ю5 (34,3%) 8,80 х Ю4 (34,1%)

Archaea 1,02 х 105 (11,6%) 4,77 х ю5 (45,0%) 3,35 х ю5 (47,1%) 4,47 х 105 (36,3%) 4,43 х ю4 (2,8%) 3,87 х 101 (1,5%)

Большинство Desulfobacter 4,40 х ю4 (5%) н.о. НО. н.о. н.о. н.о.

Большинство Desulfomicrobium Н.О. 1,42 х Ю! (13,4%) 6,60 X 104 (9,3%) но. 4.04 х ю' (0,25%) 2.40 х ю' (0,9%)

Некоторые Desulfovibrio 1,95 х Ю' (22,1%) но. но. но но. н.о

Некоторые Desulfovibrio 1,23 х 105 (13,9%) 4,10 х Ю4 (3,9%) 1,91 х 104 (2,7%) 2,58 х Ю4 (2,1%) 4,01 х ю' (0.25%) 3,3 х 101 (1,3%)

Desulfotomaculum (кластер I) 2,01 х Ю5 (22,8%) Н О. но. но. н о. но

Примечания: 1) н.о. - практически не обнаружены или единичные клетки: 2) процентное соотношение ятя всех групп микроорганизмов приводится относительно общего количества клеток ынкроорганитмов, окрашенных ДАФИ

Таблица 2.

Численность сульфатредуцирующих бактерий в верхней водной толще Черного моря, определенная методом количественной ПЦР.

Глубина, м Численность СРБ, кл./мл % СРБ от всех микроорганизмов

30 0,17 х 10J 0,065

50 0,413 х 10J 0,125

110 0,182 х 10J 0,13

150 0,585 х 10J 0,78

170 1 x 10J 0,48

200 15,66 x 10J 9

Как видно из таблиц 1 и 2, для аэробных вод и зоны хемоклина метод FISH дает значительно более высокие численности СРБ, чем метод количественной ПЦР в реальном времени. Вероятно, это связано с использованием нескольких родоспецифичных зондов и ошибками, возникающими, во-первых, из-за частичного перекрывания специфичности некоторых

и ' .

зондов между собой, а во-вторых, из-за возможной неспецифической адсорбции их на поверхности клеток нецелевых микроорганизмов. Кроме того, существуют определенные ограничения по использованию метода FISH для обнаружения морских прокариот в зависимости от их метаболической активности. Аналогичная картина наблюдалась и в других работах при сравнении численностей СРБ, определенных методами FISH и количественной niJP[Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Neretin et al., 2007]. Таким образом, метод FISH больше подходит для определения качественного, а не количественного состава нативных сообществ микроорганизмов.

4. Обнаружение СРБ в пробах воды из подповерхностной водной толщи Черного моря с помощью ПЦР-анализа генов 16S рРНК и dsrB. Для подтверждения результатов, полученных методом FISH, нами было проведено исследование филогенетического состава сообществ СРБ на разных глубинах подповерхностных кислород-содержащих вод Черного моря с помощью более чувствительного и достоверного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для отделения клеток СРБ, обитающих в крупных взвешенных частицах, от клеток свободноживущих СРБ, а также живущих в мелких взвешенных частицах и слизи, мы применяли последовательную двухстадийную фильтрацию отобранных водных проб (через крупнопористые стекловолоконные фильтры GF/C, задерживающие частицы размером >1,2 мкм, и мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм).

ПЦР-анализ тотальной ДНК с праймерами, специфичными к гену dsrB (кодирующему ß-субъединицу диссимиляционной сульфитредуктазы - ключевого фермента метаболизма сульфатредуцирующих микроорганизмов), показал присутствие генетического материала СРБ на всех исследованных глубинах - от 30 до 200 м.

Таблица 3.

Результаты анализа филогенетического разнообразия сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Черного моря из отфильтрованных через мембранные фильтры проб с использованием

вложенной ПЦР (для гена 16S рРНК основных подгрупп СРБ).

Специфичность ПЦР-праймеров Глубина, м

30 100 145 165 180 200

Ген dsrB + + + + + +

Ген 168 рРНК Оеэи^оЮтасиЫт + + + - + +

Ген 165 рРНК£>е.ги№Ыйм - - - - - -

Ген 16Э рРНК Ое5и//о6ас/еп'ит - - - - - -

Ген 168 рРНК Ое5иРоЬас1ег + - - - - +

Ген 16Э рРНК Ое5и1/ососсш-Ое$и1/опета- + + + + + +

Ген 168 рРНК Оези!/опЬпо-Ое5и1/от1СгоЫит + + + + + +

В нашей работе было подтверждено, что для изучения сообществ морских СРБ метод

вложенной ПЦР (nested PCR) является более чувствительным, чем метод прямой ПЦР [Daly et al.,

2000]. С использованием вложенной ПЦР было показано присутствие участков гена 16S рРНК

12

представителей подгрупп Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и Desulfovibrio-Desulfomicrobium на всех исследованных глубинах верхней водной толщи Черного моря, а также присутствие генетического материала Desulfolomaculum spp. на всех глубинах (за исключением 165 м - верхней анаэробной зоны), и Desulfobacter spp. в подповерхностных аэробных (глубина 30 м) и анаэробных водах (глубина 200 м). Гены 16S рРНК представителей родов Desulfobulbus и Desulfobacterium не были обнаружены ни на одном из исследованных горизонтов верхней водной толщи Черного моря.

Результаты ПЦР-анализа сообществ СРБ кислород-содержащей водной толщи Черного моря достаточно хорошо коррелируют с данными по филогенетическому разнообразию, полученными нами при применении метода FISH. С помощью последнего было показано присутствие в подповерхностных водах (глубина 30 м) представителей родов Desulfolomaculum и Desulfobacter, участки генов 16S рРНК этих подгрупп СРБ были также детектированы на данной глубине с помощью метода ПЦР. Кроме того, суммарно клетки Desulfomicrobium spp. и Desulfovibrio spp. были представлены на всех горизонтах кислород-содержащей водной толщи Черного моря, и при ПЦР-анализе участки гена 16S рРНК 6-й подгруппы СРБ (Desulfovibrio-Desulfomicrobium) были обнаружены также на всех этих исследуемых глубинах.

В свою очередь, с помощью вложенной ПЦР было показано присутствие генетического материала СРБ, принадлежащих к роду Desulfolomaculum, не только в аэробной зоне (на глубине 30 м), но и практически по всей исследованной верхней водной толще Черного моря (за исключением глубины 165 м). Участки гена 16S рРНК бактерий, принадлежащих к роду Desulfobacter, также, согласно данным ПЦР-анализа, встречались не только в аэробных, но и в верхних анаэробных водах (200 м). Эти данные не противоречат друг другу, так как FISH позволяет обнаружить только физиологически активные клетки, в то время как ПЦР выявляет просто целевые участки ДНК, которые могли принадлежать покоящимся или неактивным в неблагоприятных условиях клеткам.

5. Получение ДГГЭ-профилен участков гена dsrB, амплифнцированных с использованием в качестве ПЦР-матрицы тотальной ДНК из водных проб Черного моря. Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей участков гена dsrB, выделенных и реамплифнцировапных из отдельных ДГГЭ-полос. По гену dsrB были получены ДГГЭ-профили сообществ СРБ верхней водной толщи Черного моря с шести исследуемых глубин (30, 100, 145, 165, 180 и 200 м). Всего были определены 32 нуклеотидные последовательности участков гена dsrB, депонированные в GenBank под номерами JX181944-JX181975.

Согласно сравнешпо транслированных аминокислотных последовательностей, кодируемых геном dsrB, СРБ из верхней водной толщи Черного моря были представлены 5 отдельными кластерами (рис. 3).

Большая часть кодируемых геном dsrB аминокислотных последовательностей со всех глубин подповерхностной водной толщи Черного моря формировала отдельный кластер на филогенетической дендрограмме, для которого в базе данных GenBank не было обнаружено аналогичных последовательностей (с гомологией 87% и выше) ни среди описанных видов СРБ, ни среди некультивируемых СРБ из разных местообитаний. Наиболее близкой к этому кластеру (с гомологией 85%) оказалась некультивируемая СРБ из покмарка Норвежского моря [Lazar et al., 2011].

Два кластера по гену dsrB, не содержащих культивируемых СРБ, включали в себя черноморских СРБ из кислород-содержащих подповерхностных вод (30 м), холодного промежуточного слоя (100 м), верхней зоны хемоклина (145 м) и верхней анаэробной водной толщи (200 м). Наиболее близкой по гомологии к этому кластеру оказалась некультивируемая СРБ из глубоководных осадков Нанкайского желоба [Kaneko et al., 2007].

Некультивируемые представители рода Desulfobulbus, участки гена dsrB которых были обнаружены только в холодном промежуточном слое (100 м) и зоне хемоклина (145-185 м), могут участвовать в процессе анаэробного окисления метана в бескислородной водной толще [Losekann et al., 2007].

Кластер из двух аминокислотных последовательностей (с глубин 30 и 200 м) имел наибольшую гомологию с некультивируемыми СРБ, обнаруженными при изучении процесса биокоррозии стальных конструкций на Атлантическом побережье Франции (неопубликованные данные) и, предположительно, принадлежащими к семейству Desulfobacteraceae, в частности, филогенетически близких к Desulfobacula toluolica.

Анализ транслированных аминокислотных последовательностей, кодируемых геном dsrB, показал присутствие в аэробных водах и в зоне хемоклина Черного моря сульфатредуцирующих бактерий, наиболее близких к некультивируемым представителям рода Desulfobulbus, которые не были обнаружены методом ПЦР с праймерами на 16S рРНК Desulfobulbus spp. Однако необходимо также учитывать и определенные ограничения по достаточно широкому применению гена dsrB для построения филогенетических дендрограмм из-за его возможного латерального переноса [Dar et al., 2007].

б. Накопительная культура СРБ, выделенная с глубины 70 м аэробной зоны водной толщи Черного моря. С помощью метода молекулярного клонирования участков гена 16S рРНК с последующим их секвенированием было показано, что в накопительной культуре СРБ, выделенной из Черного моря с глубины 70 м, присутствовали сульфатредуцирутощие бактерии рода Desulfosporosinus (93-97% гомологии с Desulfosporosinus ¡acus), а также облигатно анаэробные бактерии родов Anaerobranca (91,5-91,8% гомологии с Anaerobranca gottschalkii) и Natronincola (91-93% гомологии). Представители рода Desulfosporosinus известны как строго

- 200 meters DGGE band 30 (JX181969) \ 30 meters DGGE band 5 (XXI81948) 100 meters DGGE band 11 (JX181953) 200 meters DGGE band 29 (JX181968) 200 meters DGGE band 34 (JX181973) 200 meters DGGE band 33 (JX181972) 185 meters DGGE band 27 (JX181967)

- 185 meters DGGE band 25 (JX181965) 100 meters DGGE band 10 (JX181952) 200 meters DGGE band 32 (JX181971) 165 meters DGGE band 22 (JX181963) 100 meters DGGE band 7 (XX181950) 30 meters DGGE band 4 (JX181947) 30 meters DGGE band 3 (XX181946) 30 meters DGGE band I (JX181944) 185 meters DGGE band 24 (XXI81964)

145 meters DGGE band 17 (JX181958) L 165 meters DGGE band 19 (JX181960)

uncultured sulfate-reducing bacterium (HM004730) Desulfobaclerium anilini (AF482455 ) '

Desulfoiotnaculum Ibermosapovorans (AF271769) Desulfovibrio senezii (JF830006) Desulfomicrobium apsheronum (AF418188)

Delta proteobacterium AV-1 (HQ659547) lOOr— Desulfovibrio oceani (FJ655910)

— Desulfovibrio marinisediminis (AB218445)

Desulfotomaculum ruminis (U58118) Desulfobulbuspropionicus (AF218452)

uncultured sulfate-reducing bacterium (AB124936) uncultured Desulfobulbus sp. (FJ544799) uncultured Desulfobulbus sp. (JN684080)

185 meters DGGE band 26 (XXI81966) 145 meters DGGE band 16 (XX181957) 145 meters DGGE band 15 (XX181956) 165 meters DGGE band 21 (JX181962)

_I 165 meters DCGE band 20 (1X181961)

' 100 meters DGGE band 8(1X181951) O)

uncultured sulfate-reducing bacterium (JF906965) — uncultured sulfate-reducing bacterium (AY337212) 145 meters DCGE band 18 (JX181959) 100 meters DGGE band 12 (1X181954) 200 meters DGGE band 36 (XXI81974)

uncultured sulfate-reducing bacterium (AB265143) 200 meters DGGE band 37 (JX181975) 100 meters DGGE band 13(XX181955) 30 meters DCGE band 6 (XX181949) Desulfofaba fastidwsa (AY268892)

-Desulfonema limicola (AY626031)

uncultured sulfate-reducing bacterium (EF065000) Desulfobacula roluolica (CAD29755) Desulfobacier halololerans (AF388256) uncultured bacterium (FR689676) 99 | 200 meters DGGE band 31 (JX181970) 30 meters DGGE band 2 (XXI81945)

О Ii

0 U

га 5 з •о

э

V)

01 Q

Olavius ilvae endosymbiont (DQ058672)

О га и и

Р

о о га •О

а и

О Q

э S: з

и

Рис. 3. Филогенетическая дендрограмма СРБ из подповерхностной водной толщи континентального склона Черного моря, построенная на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых геном (¡згВ. Масштабная метка соответствует 10% расчетной дивергенции последовательностей.

анаэробные епорообразующие СРБ, выделенные к настоящему времени, в основном, из пресноводных анаэробных осадков, почв и осадков кислых сточных водоемов [Spring et al., 2006].

Данная накопительная культура представляет интерес тем, что растет на питательной среде, содержащей бихромат калия, что свидетельствует о ее потенциальной возможности быть хорошим микробиологическим объектом для биоремедиации сточных вод и почв от загрязнений токсичными солями хрома и других тяжелых металлов.

7. Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 - новый вид СРБ, выделенный из аэробных вод Черного моря. Из накопительной культуры, полученной с глубины 30 м континентального склона Черного моря, нами была выделена чистая культура СРБ, принадлежащая к роду Desulfofrigus. Наиболее близкой (гомология 99%) к отсеквенированному гену 16SpPHK (номер КР455293 в GenBank) оказалась последовательность гена 16S рРНК типового представителя данного рода -Desulfofrigus fragile штамм LSv21T [Knoblauch et al., 1999], выделенного из морских арктических осадков вблизи архипелага Шпицберген. При этом уровень гомологии при проведении ДНК-ДНК гибридизации исследуемого штамма SrB-ЗО и типового штамма D. fragile LSv21T составил всего 56%, что свидетельствует о принадлежности данных СРБ к разным видам [Wayne et al.,1987].

Электронно-микроскопические исследования показали, что штамм SrB-ЗО представлен грамотрицательными палочками с закругленными концами (размер 0,5-0,8 х 3,7-4,2 мкм). Спор обнаружено не было. Нуклеоид большого размера, занимает почти всё внутреннее пространство клетки. Вокруг клеток были видны остатки защитных капсул.

По морфологическим признакам, молярному содержанию ГЦ-пар в ДНК (52%), а также по отношению к температуре и рН, выделенная нами чистая культура была во многом схожа с типовым штаммом D. fragile LSv21T [Knoblauch et al., 1999] (табл. 4). Однако штамм SrB-30 обладал значительно более широким спектром используемых доноров и акцепторов электронов, чем типовои штамм LSv21T (табл. 5).

Различался также и состав жирных кислот в клетках выделенного нами в чистую культуру Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 и типового штамма D. fragile LSv21T. Две жирные кислоты - Ci6 o и Ci6 i w9c преобладали в составе клеток как D. fragile LSv21T (21,7 и 30,6% соответственно), так и Desulfofrigus sp. SrB-30 (17,73 и 35,96% соответственно). Жирная кислота Ci8:i wile, обнаруживаемая в значительном количестве в клетках типового штамма LSv21T (18,5%), у штамма SrB-ЗО, выделенного нами из Черного моря, отсутствовала. В свою очередь, содержание жирной кислоты Сi4:o (11,46%) в клетках штамма SrB-ЗО было в 2,3 раза больше, чем у типового штамма, а также в относительно большом количестве (8,82%) у SrB-30 была обнаружена жирная кислота Ci8:i w7c, отсутствующая в клетках D. fragile LSv21T.

На основании обнаруженных генетических и физиолого-биохимических отличий от типового штамма D. fragile LSv21T впервые выделенный нами из кислород-содержащих вод

Таблица 4.

Сравнение выделенной чистой культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 и типового штамма Desulfofrigus fragüe LSv21T по морфологическим признакам и отношению к физико-химическим

параметрам культивирования.

Параметр Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 D. fragile штамм LSv211 [Knoblauch et al., 19991

Форма клеток Палочки Палочки

Размер клеток, мкм 0,5-0,8 х 3,7-4,2 0.8 х 3,2-4,2

Оптимум рН 7,2 7,0-7,4

Диапазон рН 6,6-7,8 -//-

Оптимум температур, °С 15-18 18

Диапазон температур, °С 4-26 -1,8-27

Таблица 5.

Рост DesIllfofrigus эр. штамм БгВ-30 при использовании различных доноров и акцепторов электронов, а также сбраживаемых субстратов, в сравнении с типовым штаммом рода ОмиТ/о/п^!«.

Субстрат Desulfofrigus fragüe штамм LSv21T (Knoblauch et al., 1999J Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 Субстрат Desulfofrigus fragile штамм LSv21T [Knoblauch et al., 1999] Desulfofrigus sp. штамм SrB-30

Доноры электронов (мМ) Доноры электронов (мМ)

Формиат (20) + ++ Глутарат (10) - -

Ацетат (10) - ++ Бетаин (10) - ±

Пропионат(15) - ± Хлорид холина (10) - +

Бутират(5) + + L-пролнн (10) - ±

Валерат(5) - ++ D-сорбитол(5) _ ± ;

Капроат(3) -H- ++ D-маниитол (5) - +

Капрат(2) ++ + Бенэоат(1) - +

Пальмитат (2) ± ++ Глюкоза (5) - ++

Лактат(Ю) ++ ++ Фруктоза (5) _ ++

Пируват (10) ++ + Акцепторы электронов (мМ)

Малат(Ю) ++ + Сульфат(28) + +

Сукцинат (10) -H- Тиосульфат (10) - ±

Фумарат (10) + + Сульфит (2) - ++

Этанол (10) ++ ++ Сера(3) - ±

Пропанол (10) ++ ++ Цитрат железа Ш (30) + -

Бутанол (10) ++ + Оксигидроксид железа III (4) - -

Глицерол (10) -н- ++ Нитрат(5) - +

Глицин (10) - ± Сбраживаемые субстраты (мМ)

Алании (10) + ± Пируват(10) + +

Серии (10) + + Манат (10) + +

Нг/С02 + ацетат (2) - . + Лактат(10) - +

Изовалерат(5) - - Фумарат (10) - +

Метанол (10) -

Примечание: ++ очень хороший рост, + хороший рост, ± слабый рост, - отсутствие роста. Серым цветом отмечены различия между штаммами в потребляемых субстратах

Черного моря штамм сульфатредуцнрующей бактерии SrB-ЗО был отнесен к новому виду рода Desulfofrigus и депонирован под видовым названием Desulfofrigus eiainos штамм SrB-ЗО (от древнегреческого названия Черного моря Emeinos Pontos) в две международные коллекции микроорганизмов: DSMZ (Германия) и JCM (Япония).

8. Рост выделенной в чистую культуру СРБ Desulfofrigus euxinos штамм SrB-ЗО в присутствии различных концентраций кислорода.

Поскольку штамм SrB-ЗО был выделен с глубины 30 м континентального склона Черного моря, где концентрация растворенного кислорода достигает 300 мкМ, мы предположили, что данный штамм должен обладать определенной аэротолерантностью, а также, возможно, иметь эффективные системы защиты от окислительных стрессов. Воздействие кислорода на рост культуры D. euxinos штамм SrB-ЗО оценивали по влиянию различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на три показателя: число клеток в жидкой культуре, количество продуцируемого культурой сероводорода и скорость сульфатредукции.

4

3 4 5 Время, сут -^5.:% -»-10.4«о

Концентрация кислорода

Концентрация кислорода

Рис. 4. Численность клеток и образование сероводорода в культурах Desulfofrigus егато! штамм ЭгВ-ЗО при росте в присутствии различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе.

Внесение 0,5% и 1,3% кислорода в газовую фазу приводило к удлинению лаг-периода роста культуры до 3 сут и резком}', по сравнению с контролем (анаэробные условия культивирования), снижению образования сероводорода (более чем в 2 раза). Увеличение начальной концентрации кислорода в газовой фазе до 2,6% и 5,2% приводило к резкому снижению образования сероводорода более чем в 4 раза по сравнению с контролем, а количество клеток к концу экспоненциальной фазы роста (на 4-е сут) было в 2 и 3,4 раза ниже, чем в контроле, соответственно (рис. 4). При начальном содержании кислорода в газовой фазе 7,8% образование культурой сероводорода полностью подавлялось, а количество клеток к концу экспоненциальной

фазы роста (на 4-е сут) снижалось в 5 раз по сравнению с контролем. При более высоких начальных концентрациях кислорода в газовой фазе образование сероводорода и рост культуры отсутствовали. Также было показано, что при культивировании штамма 8гВ-30 с начальной концентрацией кислорода в газовой фазе 2,6% скорость сульфатредукции (ССР), измеренная радиоизотопным методом, практически не отличалась от таковой в контроле. Увеличение начальной концентрации кислорода в газовой фазе до 5,2% приводило к резкому снижению ССР -более чем в 4 раза по сравнению с контролем.

Сообщества сульфатредуцирующих бактерий в кнслород-содержащих водах Гданьской впадины Балтийского моря.

9. Гидрохимические параметры вод Гданьской впадины Балтийского моря.

Анализ данных, полученных с помощью гидрофизического зонда, позволил выявить значительную неоднородность вод Гданьской впадины в период наших исследований (рис. 5). Содержание кислорода в интервале глубин 0-75 м составляло от 10,61 до 13,69 мл/л, а на глубине 80-90 м наблюдался хорошо выраженный оксиклин. На глубинах 97-100 м содержание кислорода снижалось до 0,05-0,22 мл/л, и появлялся свободный сероводород (0,79 мл/л на глубине 102 м).

О,, мл/л; Т. °С

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

102 м - ПОН13.НЧПН' ((1.79 м.['.|)

-1-1-1-1-Г""т-I-1-1-1---1-1-1-1-1-1-1

0 2 4 8 8 10 12 14 16 18

Рис. 5. Гидрохимические параметры водной толщи глубоководной зоны Гданьского залива Балтийского моря (станция № 22): содержание кислорода (/), температура (2).

10. Обнаружение СРБ в пробах воды из Гданьской впадины Балтийского моря с помощью ПЦР-анализа генов 168 рРНК и (кгВ. По аналогии с исследованиями кислородсодержащих вод Черного моря вначале мы осуществляли двухстадийную фильтрацию проб

морской воды через крупнопористые фильтры СР/С, задерживающие частицы размером более 1,2 мкм, и мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм.

С помощью ПЦР было детектировано наличие гена в образцах ДНК, выделенных из водных проб со всех исследуемых глубин водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря (табл. 6). Вложенной ПЦР было показано присутствие участков гена 16Э рРНК, специфических для представителей подгрупп Ое5и1/ососси5-Ое5и1/опета-Оези1/ошгста и Оеий/о\1Ьпо-ОезиуЬткгоЫит, на всех исследованных глубинах верхней водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря, а также присутствие генетического материала Ое5и1/о1отаси!ит эрр. на всех глубинах, за исключением придонного слоя (107 м). Генетический материал Оези1/оЬас1ег врр. был обнаружен только в верхних аэробных водах (0-30 м). Гены 16Б рРНК представителей родов Оет1/оЬи1Ьиз и ОезиУоЬааепит не были обнаружены ни на одном из исследованных горизонтов водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря.

Таблица 6.

Результаты анализа филогенетического разнообразия сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря из отфильтрованных через мембранные фильтры

проб с использованием вложенной ПЦР (для гена 168 рРНК основных подгрупп СРБ).

Специфичность ПЦР-праймеров Глубина, м

0 10 30 50 80 102 107

Ген скгВ + + + + + + +

Ген 16Б рРНК йгБг^оЮтасиЫт + + + + + + _

Ген 16Э рРНК Ос5и1/оЬи1Ьиз - -

Ген 165 рРНК Ое5и1/оЬас1епшп - - _

Ген 16Э рРНК ПеафЬааег + + + _ _

Ген 168 рРНК ВезЫ/ососсиз-йаи^опета-Оет^о1агс1па + + + + + + +

Ген 168 рРНК Ое5и1/ох1Ьгю-Оези1{от1сгоЫит + + + + + + +

11. Получение ДГГЭ-профнлей участков гена /кгВ, амплифицированных с использованием в качестве ПЦР-матрицы тотальной ДНК из водных проб Гданьской впадины. Секвенированпе п филогенетический анализ последовательностей участков гена <кгВ, выделенных и реамплпфицированных из отдельных ДГГЭ-полос.

По гену АгВ были получены ДГГЭ-профили сообществ СРБ Гданьской впадины Балтийского моря с пяти исследуемых глубин (0, 10, 30, 70 и НО м). Всего была определена 21 нуклеотидная последовательность участков гена сЬгВ, которые были депонированы в вепБапк под номерами КП96659-КЛ96679.

Анализ транслированных аминокислотных последовательностей участков гена ЖгВ из водных проб с различных глубин Гданьской впадины Балтийского моря показал, что на всех исследуемых горизонтах (кислород-содержащие подповерхностные воды, зона хемоклина и придонные воды, содержащие НгЭ) присутствовали участки гена сЬгВ, наиболее сходные (87-95%

гомологии) с последовательностями участков гена сЬгВ некультивируемых СРБ из Арктических морских осадков в районе Шпицбергена, несульфидогенных тропических подвижных грязей, осадков в устье р. Янцзы и биопленок холодных сипов центральной части Красного моря. Также для некоторых последовательностей отмечался аналогичный уровень гомологии с транслированными участками гена скгВ морских коррозионно-активных некультивируемых СРБ (сиквенсы с глубин 0, 10 и 70 м), некультивируемых СРБ из морских осадков моря Яцусиро (сиквенсы с глубин 10, 30, 70 и 110 м), глубоководных осадков Нанкайского желоба (сиквенсы с глубин 30 и 70 м), из зоны кислородного минимума осадков Аравийского моря (сиквенсы с глубин 30, 70 и 110 м) и водной толщи Черного моря вблизи г. Геленджик (сиквенсы с глубин 70 и 110 м). В то же время, на всех исследованных глубинах были обнаружены составляющие отдельную ветвь на филогенетической дендрограмме аминокислотные последовательности, кодируемые геном скгВ, для которых в базе данных ОепВапк не было обнаружено аналогичных последовательностей (с гомологией не ниже 87%) ни среди описанных видов СРБ, ни среди некультивируемых СРБ из разных местообитаний.

12. Получение накопительных культур СРБ из водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря. Помимо изучения нативного состава сообществ СРБ в Гданьской впадине Балтийского моря молекулярно-биологическими методами, нами также были проведены эксперименты по получению накопительных культур СРБ из водной толщи Гданьской впадины. Были получены накопительные культуры с глубин 30 (кислород-содержащие воды), 102 и 107 м (бескислородные воды), сохраняющие активность в течение нескольких пересевов, что свидетельствует о том, что в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря присутствует не только генетический материал, но и живые клетки сульфатредуцирующих бактерий.

По результатам ПЦР-анализа сообщества СРБ кислород-содержащей водной толщи обоих морских водоемов с меромиктическими условиями оказались достаточно схожи. Участки генов, кодирующих р-субъединицу диссимиляционной сульфитредуктазы и 163 рРНК Ое$и1/ососси$-Оези1/опета-йези!/озаг&па и Ое$и1/о\>1Ьгю-Ое$и1/от1сгоЫит, были обнаружены в Черном и Балтийском морях на всех исследованных глубинах. Участки гена 16Б рРНК представителей рода Оези1/о1отаси1ит присутствовали во всех гидрохимически различающихся слоях как Черного, так и Балтийского морей, однако в Черном море они не были обнаружены в середине зоны хемоклина (глубина - 165 м), а в Гданьской впадине Балтийского моря - в придонном слое (глубина - 107 м). Генетический материал СРБ рода Оези1/оЬас1ег в обеих экосистемах был детектирован в подповерхностных кислород-содержащих горизонтах, а в зоне хемоклина отсутствовал. При этом в Черном море, в отличие от Балтийского, последовательности гена 16Б рРНК, специфичные для ВеьиЦоЪааег 5рр., также были обнаружены и в верхних горизонтах анаэробных вод (на глубине 200 м).

Анализ транслированных аминокислотных последовательностей участков гена dsrB показал, что в обоих исследованных морях с меромиктическими условиями обитают СРБ, сходные с СРБ из различных морских экосистем, зачастую значительно удаленных как от Черного, так и от Балтийского морей, а также уникальные СРБ, для которых на данный момент не удается обнаружить сходных последовательностей гена dsrB в базе данных GenBank. Кроме того, несколько транслированных аминокислотных последовательностей из обоих морей имели высокий уровень гомологии между собой, что может означать, что там обитают филогенетически близкие друг другу СРБ.

Заключение.

В настоящей работе впервые было детально изучено филогенетическое разнообразие сульфатредуцируюдшх бактерий в подповерхностной кислород-содержащей водной толще Черного и Балтийского морей. В исследованиях были использованы как традиционные микробиологические методы, основанные на выделении микроорганизмов, их культивировании в различных условиях и описании морфологии клеток, так и современные молекулярно-биологические методы анализа микробных сообществ (флуоресцентная in situ гибридизация, вложенная и количественная ПЦР, денатурирующий градиентный гель-электрофорез с последующим секвенированием выделенных и реамплифицированных участков ДНК), что позволило получить всестороннюю характеристику сообществ СРБ в гидрохимически различающихся слоях меромиктических зон обоих морей.

Методом ПЦР было показано присутствие генетического материала СРБ четырех основных филогенетических подгрупп (Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и Desulfovibrio-Desulfomicrobium) на различных глубинах кислород-содержащей подповерхностной водной толщи Черного моря и Гданьской впадины Балтийского моря. Результаты анализа транслированных аминокислотных последовательностей гена dsrB, кодирующего ключевой фермент сульфатредуцирующих микроорганизмов - диссимиляционную сульфитредуктазу, свидетельствуют о том, что большинство СРБ в исследуемых меромиктических экосистемах наиболее сходны с некультивируемыми и неописанными к настоящему времени микроорганизмами, что представляет большой потенциал в плане выделения новых чистых культур аэротолерантных сульфатредуцирующих бактерий из обоих морей.

Получение активных накопительных культур СРБ из кислород-содержащих вод Черного и Балтийского морей свидетельствует о присутствии там не только генетического материала, но и потенциально метаболически активных клеток СРБ, осуществляющих процесс сульфатредукции. А способность впервые выделенной нами из аэробных вод Черного моря чистой культуры СРБ, описанной и депонированной как новый вид рода Desulfofrigus (Desulfofrigus euxinos штамм SrB-

30), выдерживать кислородные стрессы свидетельствует о её приспособленности к обитаниям в условиях, подвергающихся воздействию кислорода.

Учитывая, что в обеих меромиктических экосистемах вертикальная циркуляция вод затруднена вследствие существования постоянных гало- и пикноклинов, суммируя полученные в данной работе результаты, можно заключить, что в кислород-содержащей водной толще и зоне хемоклина Черного моря и Гданьской впадины Балтийского моря существуют сложившиеся сообщества СРБ, приспособленные к существованшо в микроаэробных условиях.

Выводы.

1. Методом прямой и вложенной ПЦР в подповерхностных кислород-содержащих водах и в зоне хемоклина Черного и Балтийского морей (Гданьская впадина) обнаружены участки генов 16S рРНК сульфатредуцирующих бактерий, принадлежащих к филогенетическим подгруппам Desulfotomaculum, Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina, Desulfovibrio-Desulfomicrobium и Desulfobacter.

2. Доля СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря в период исследований составляла от 0,065 до 9% от числа клеток всех прокариотных микроорганизмов.

3. По транслированным аминокислотным последовательностям гена dsrB сульфатредуцирующие бактерии, обитающие в подповерхностных водах и в зоне хемоклина Черного и Балтийского морей, имеют наибольшую гомологию с некультивируемыми СРБ из различных морских местообитаний. Кроме того, на каждой исследованной глубине в обеих меромиктических экосистемах были также обнаружены последовательности гена dsrB, не имевшие высокой гомологии с известными последовательностями гена dsrB из GenBank.

4. Из подповерхностной аэробной водной толщи и зоны хемоклина Черного моря, а также из кислород-содержащих вод Гданьской впадины Балтийского моря, были выделены активные накопительные культуры СРБ, что подтверждает жизнеспособность обнаруженных на исследованных водных горизонтах обоих морей сульфатредуцирующих бактерий.

5. Впервые выделенная из кислород-содержащих подповерхностных вод Черного моря чистая культура СРБ была полностью охарактеризована и описана как новый вид Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30. Клетки D. euxinos SrB-30 обладают относительной аэротолерантностыо и способны расти и осуществлять процесс сульфатредукции при начальных концентрациях кислорода в газовой фазе до 8%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК:

1. Корнеева В.А.. Пименов Н.В., Крек А.В, Турова Т.П., Брюханов А.Л. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря. // Микробиология. - 2015. - Т.84(2). - С.250-260.

2. Захарова Е.Е., Корнеева В.А.. Брюханов А.Л., Пименов Н.В. Психрофильная сульфатредуцирующая бактерия из аэробных вод Черного моря. // Микробиология. - 2012. -

Т.81(6). - С.812-814.

3. Брюханов А.Л., Корнеева В.А.. Канапацкнй Т.А., Захарова Е.Е., Менько Е.В., Русанов И.И., Пименов Н.В. Изучение состава сообществ сульфатредуцирующнх бактерий в аэробных водах и зоне хемоклина Черного моря с использованием метода FISH. //Микробиология. - 2011. -Т.80(1). -С.112-120.

4. Брюханов А.Л., Корнеева В.А.. Пименов Н.В. Детекция анаэробных сульфатредуцирующнх бактерий в кислородсодержащих верхних водных горизонтах Черного и Балтийского морей. // Вестник Московского Университета. Серия 16. Биология. - 2015. - № 4. (в печати).

5. Brioukhanov A.L., Korneeva V.A.. Kizilova А.К., Merkel A.Yu., Sigalevich P.A., Pimenov N.V. Sulfate-reducing bacterial communities in the Black Sea oxic and suboxic water column. // Aquatic Microbial Ecology. -2015. (in press).

Статья в сборнике:

1. Pimenov N.V., Bryukhanov A.L., Komeeva V.A.. Zakharova E.E., Sigalevich P.A., Rusanov 1.1., Yakushev E.V.,. Chasovnikov V.K. Anaerobic microbial community in the aerobic water and at the oxic/anoxic interface in the Black Sea. // In Chemical Structure of Pelagic Redox Interfaces: Observation and Modelling. The Handbook of Environmental Chemistry. Heidelberg, Germany. -

2013.-V.22. -P.27-46.

Тезисы докладов:

1. Brioukhanov A., Korneeva V., Zakharova E„ Dolla A., Brasseur G.,OHivier В., Pieulle L., Fardeau M.L., Valette O., Kizilova A., Joseph M.,Netrusov A., Pimenov N. Anaerobic sulfate-reducing bacteria in the oxic water column of the Black Sea. // FEMS 2015: 6th Congress of European Microbiologists, Maastricht, Netherlands. Published on CD.

2. Брюханов А.Л., Брассе Г., Пиёль Л., Пименов Н.В., Корнеева В.А.. Налдина Е.П., Нетрусов А.И., Долла А. Системы антиокислителыюй защиты в клетках нового вида сульфатредуцирующей бактерии рода Desulfofrigus, выделенной из кислородсодержащих поверхностных вод Черного моря. // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». МАКС Пресс, Москва. - 2014. - С.39.

3. Корнеева В.А.. Захарова Е.Е., Брюханов А.Л.,. Налдина Е.П, Пименов Н.В. Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 - новая психрофильная сульфатредуцирующая бактерия, выделенная из аэробной водной толщи Черного моря. // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». МАКС Пресс, Москва. -2014. - С. 127.

4. Корнеева В.А.. Брюханов А.Л., Пименов Н.В. Изучение биоразнообразия сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Балтийского моря. // Сборник тезисов 18-й Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. -2014. -С.214.

5. Налдина Е.П., Корнеева В.А. Анаэробная сульфатредуцирующая бактерия Desulfofrigus sp., выделенная из поверхностных окисленных вод Черного моря. // Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2014». Москва. -

2014. -С.191-192.

6. Корнеева В.А.. Брюханов А.Л., Пименов Н.В. Детекция анаэробных микроорганизмов в поверхностных водах Черного моря с использованием молекулярно-биологических методов. // Сборник тезисов 16-й Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. - 2012. - С.24.

7- Korneeva У.. Brioukhanov A., Zakharova Е., Pimenov N. Analysis of sulfate-reducing bacterial communities in enrichment cultures from the upper water column of the Black Sea. FEMS 2011: 4tb Congress of European Microbiologists, Geneva, Switzerland. Published on CD.

8. Корнеева В.А.. Брюханов А.Л., Захарова E.E., Пименов Н.В. Получение и идентификация накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий из поверхностных вод Черного

моря. // Материалы 3-го Байкальского микробиологического симпозиума с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах (BSM-2011)». Изд-во Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, Иркутск. - 2011. - С.66-68.

9. Брюханов А.Л., Корнеева В.А.. Часовников В.К., Пименов Н.В. Сообщества сульфатредуцирчтощих бактерий в аэробных водах Черного моря. // Материалы 3-го Байкальского микробиологического симпозиума с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах (BSM-2011)». Изд-во Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, Иркутск. -2011. -С.22-24.

10. Корнеева В.А.. Брюханов А. Л., Пименов Н.В. Изучение биоразнообразия сульфатредуцирующих бактерий в водах Черного и Балтийского морей. // Тезисы VII молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс, Москва. -2011. - С.78-81.

11. Корнеева В.А.. Брюханов А.Л., Захарова Е.Е., Кравченко И.К., Кизилова А.К., Пименов Н.В. Получение и идентификация накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий из аэробных вод и зоны хемоклина Черного моря. // Тезисы VI молодёжной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс, Москва.-2010,-С.33-35.

12. Корнеева В.А.. Брюханов А.Л., Пименов Н.В. Применение метода флуоресцентной in situ гибридизации для исследования биоразнообразия сульфатредуцирующих бактерий в водах Черного моря. // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы». МАКС Пресс, Москва. -2010. -С.52.

13. Брюханов А.Л., Корнеева В.А.. Канапацкий Т.А., Захарова Е.Е., Менько Е.В., Пименов Н.В. Биоразнообразие сульфатредуцирующих бактерий в водах Черного моря. // Тезисы V молодёжной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». МАКС Пресс, Москва. - 2009. - С. 13-14.

Подписано в печать: 20.07.2015 Объем: 1,2 п.л. Тираж 80 экз. Заказ № 426 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского, д.39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru