Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика противоопухолевых белков из лимфоцитов и тромбоцитов человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика противоопухолевых белков из лимфоцитов и тромбоцитов человека"

-7 Г ' /

о

• ? .:••■■ 'Л-:'.;.// г,

г га од

/

На правах рукописи УДК 577.112.083.3

ПАРОМОВ Виктор Максимович

Выделение и характеристика противоопухолевых белков из лимфоцитов и тромбоцитов человека

(Специальность 03.00.04 - Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1999

Работа выполнена в Институте Биоорганической химии им,- М.МШемдкина, и

Ю.А.Овчинникова РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук Долгих Д.А. доктор медицинских наук Киселевский М.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Абрамов В.М. доктор биологических наук Зезеров Е.Г.

Ведущая организация: Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится " "_1999 года в _ на заседании

Диссертационного совета Д 074.05.10 при Московской Медицинской Академии

им. И.М.Сеченова по адресу: 119881 Москва,.ул. Б. Пироговская, д. 2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии

им. И.М.Сеченова по адресу: Москва, Зубовская площадь, д. 1.

Автореферат разослан " "_1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Кандидат медицинских наук А.Ю.Миронов

РОССИЙСКАЯ )СУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

ТулТ^О!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Важную роль в осуществлении иммунного ответа организма играют цнтокины -белковые факторы, продуцируемые в основном лимфоцитами и другими клетками иммунной системы. Цнтокины составляют особый класс секреторных белков, которые действуют через рецептор-опосредованные пути и регулируют различные межклеточные взаимодействия, вызывая гуморальный ответ как иммунных, так и тканевых клеток организма. Цнтокины, таким образом, вызывают широчайший спектр клеточных ответов: активацию, пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов и других клеток крови, направленную миграцию клеток-эффекторов, активизацию процессов программируемой клеточной гибели и т.п. Изучение как самих цитокиков, так и всего многообразия опосредованных ими клеточных ответов имеет традиционно важное значение для развития новейших методов иммунотерапии онкологических заболеваний.

Последние исследования в данной области показали, что наряду с лимфоцитами и другими иммунными клетками важную роль в проведении сигналов и осуществлении как противовоспалительных, так и противоопухолевых функций играют клетки крови, основные "задачи" которых напрямую не связаны с модуляцией иммунных ответов организма. К таким клеткам относятся, например, тромбоциты, основными функциями которых являются, как известно, адгезивно-аггрегационная и абсорбционно-транспортная способности. Наряду с этими функциями тромбоциты, как было показано (¡Ье!е е1 а1., 1985), осуществляют активное участие в процессах цитолиза различных опухолевых клеток.

В ряде последних работ показано, что тромбоциты проявляют 1цЕ-

опосредованную цитотоксичность как в отношении паразитических одноклеточных

микроорганизмов (Joseph et a!., 1983; Yong et al., 1991), так и в отношенин эндотелиальных клеток (Jorgensen et al., 1970; Kishi et al., 1972) и эритроцитов (Okada et al., 1993). Лизис опухолевых клеток-мишеней тромбоцитами может быть опосредован, также, белками комплемента (Slezak et al., 1987). Как активированные, так и неактивированные тромбоциты способны эффективно лизировать различные линии опухолевых клеток в отсутствии специфических антител и белков комплемента (Быковская и др., 1988; Sagawa et al., 1993). Таким образом, тромбоциты можно рассматривать в качестве полноценных эффекторных клеток иммунной системы. Хотя эти кровяные тельца довольно малы по сравнению с лимфоцитами и макрофагами и, кроме того, не обладают ядром, по общему количеству и общей площади поверхности клеточных мембран находящиеся в кровяном русле организма тромбоциты значительно превосходят как лимфоциты, так и любые другие "классические" клетки-эффекторы иммунной системы. Таким образом, роль тромбоцитов в активизации защитных процессов организма на клеточном уровне заслуживает пристального внимания.

Электронно-микроскопические исследования показали, что характер морфологических изменений тромбоцита (изменение формы клеточной мембраны после образования фокального межклеточного контакта, гипертрофия аппарата Гольджи, укрупнение секреторных гранул и скопление их в зоне контакта) при его взаимодействии с клеткой-мишенью, предшествующих гибели последней, очень похожи на аналогичные морфологические реакции лимфоцитов (Bykovskaya et al., 1991). Кроме того, активация тромбоцитов может быть опосредована оккупацией специфических мембранных рецепторов, идентичных VLA-2, VLA-5 и CD69 активационным рецепторам Т-лимфоцитов (Testi et al., 1990). По характеру поверхностной экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости, тромбоциты близки к полиморфно-ядерным лейкоцитам и моноцитам (Ломакин, 1990). Киллинг опухолевых клеток, опосредованный

тромбоцитами, по некоторым данным (Окас1а е1 а1., 1996) может происходить посредством выделения в зону межклеточного контакта окиси азота, впервые охарактеризованной как эффекторный агент, продуцируемый макрофагами (ТСЬЬэ & а!.. 1988).

Все вышеперечисленные факты дают основание предполагать существование секретируемых тромбоцитами белковых факторов, способных оказывать прямое цитолитическое воздействие на опухолевые клетки, а также белковых медиаторов, участвующих в активации других эффекторных клеток. В целом, можно полагать, что механизмы противоопухолевой активности тромбоцитов и других эффекторных клеток иммунной системы (лимфоцитов, макрофагов, моноцитов и др.) имеют много общего.

Цель работы.

Основной целью данной работы являлось изучение механизмов стимуляции тромбоцитов различными экзогенными агентами (Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином) и последующее выделение из полученного клеточного материала белковых медиаторов, способных оказывать прямое цитолитическое воздействие на опухолевые клетки, либо активирующих мононуклеарные клетки периферической крови.

В ходе исследования предполагалось решение следующих задач:

1. Изучение цитотоксической активности очищенных тромбоцитов человека против клеток линии К 562 после стимуляции первых различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА в наномольных концентрациях и рицином в пикомольных концентрациях, а также определение наличия апоптотической гибели клеток-мишеней.

2. Определение возможной активации очищенных тромбоцитов человека по циклооксигеназному пути при стимуляции различными экзогенными агентами: Са-

ионофором А23187, ФАТ, ФГА в наномольных концентрациях и рицином в пикомольных концентрациях.

3. Получение и исследование лизатов и супернатантов очищенных тромбоцитов человека, активированных различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином.

4. Выделение цитотоксических белковых факторов из полученных лизатов и супернатантов, определение их М-концевых аминокислотных последовательностей и изучение опосредованного ими механизма гибели клеток-мишеней.

5. Выделение из полученных супернатантов белковых медиаторов, активирующих мононуклеарные клетки периферической крови, определение их И-концевых аминокислотных последовательностей и изучение механизмов воздействия.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе на примере клеток линии К562 было показано, что противоопухолевая циготоксичность тромбоцитов человека может быть эффективно стимулирована различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином в наномольных и пикомольных концентрациях. При этом стимуляция цитотоксичности сопровождается активацией тромбоцитов по классическому циклооксигеназному пути. При этом, стимулированные всеми вышеперечисленными экзогенными агентами тромбоциты человека не опосредуют апоптоз клеток-мишеней.

Также, было показано, что стимулированные всеми вышеперечисленными экзогенными агентами тромбоциты человека накапливают и секрегируют в межклеточное пространство специфические медиаторы белковой природы (цитотоксические тромбоцитарные факторы) ЦТФ-14 и ЦТФ-28. Данные медиаторы, однако, не способны вызывать апоптоз клеток-мишеней.

Вышеупомянутые цнтотоксические тромбоцитарные факторы были выделены и их активность в разных концентрациях против клеток К 562 была изучена. Впервые определена N-концевая аминокислотная последовательность цитотоксического белка тромбоцитов массой 28 кДа.

Из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором А23187 был выделен ранее не описанный белок массой 14 кДа, способный усиливать пролиферативный ответ мононуклеарных клеток периферической крови человека на стимуляцию конканавалином А. Была определена N-концевая аминокислотная последовательность данного белкового фактора.

Апробация работы.

Результаты данной работы были представлены на межлабораторном научном семинаре Лаборатории спектрального анализа Института Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и Лаборатории клеточного иммунитета НИИ Клинической Онкологии Российского Онкологического Научного Центра РАМН, а также на V Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство".

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания экспериментальных методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 108 страниц машинописного текста, 16 рисунков и иллюстраций. Список литературы включает 102 источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Цитотокслческая активность и функциональные исследования тромбоцитов человека, стимулированных различными экзогенными агентами.

С целью изучения стимуляции цитотоксичности тромбоцитов против опухолевых клеток линии К 562 было исследовано влияние на кровяные пластинки различных экзогенных агентов (Са-ионофор А23187, ФАТ, ФГА, рицин) в различных концентрациях. Как видно на гистограмме (Рис. 1) стимуляция тромбоцитов различными экзогенными агентами несколько повышает уровень цитотоксичности этих клеток. Наибольшая цитолитическая активность тромбоцитов в отношении клеток линии К 562 была зарегистрирована после стимуляции 10"7М Са-ионофором (32,6+4,1%), 10"8М ФАТ (27,3+ 3,6%), 10"'М ФГА (30,6+3,9%), Ю'13М рицином (28,6+3,4%). Сравшггельно высокую активность нестамулированных тромбоцитов (21.3+4.2%) можно объяснить как следствие стимуляции тромбоцитов при непосредственном контакте с клетками-мишенями.

Следует отметить, что во всех проведенных нами экспериментах концентрации стимуляторов, под воздействием которых отмечались максимальные для данного стимулятора значения цитотоксичности тромбоцитов, были как минимум на порядок ниже концентраций, вызывающих полную агрегацию тромбоцитов. Этот факт можно рассматривать как весомый довод в пользу гипотезы о дифференцированном механизме активации (меньшие концентрации одного и того же экзогенного агента стимулируют цитотоксическую активность тромбоцитов, тогда как большие - вызывают агрегацию).

Стимуляция цитотоксичности тромбоцитов неразрывно связана с их активацией. Очевидно, что все использованные в данной работе экзогенные стимуляторы осуществляют воздействие на различных стадиях начального этапа активации вплоть до

цитотоксичность, %

40

30 20

10

о

Рис. 1 Цитотоксичность громбошггов, стимулированных различными экзогенными агентами, в отношении клеток линии К 562 в 18-часовом МТТ-тесте. Соотношение эффекторы/мишени 200:1.*Р<0.05 уэ. контроль

повышения внутриклеточной концентрации кальция. Так, ФАТ является "сильным агонистом", т.е. классическим стимулятором активации, оккупирующим собственный специфический рецептор на поверхности клеточной мембраны тромбоцита; ФГА осуществляет опосредованную активацию ФЛС, неспецифически связывая различные мембранные гликопротеины; Са-ионофор вызывает повышение внутриклеточной концентрации кальция. Очевидно, что все вышеперечисленные воздействия стимулируют дальнейшее развитие процесса активации, продолжением которого могут быть морфологические изменения и секреция гранул хранения, а также - агрегация тромбоцитов.

Для того, чтобы сравнить активацию тромбоцитов под воздействием вышеперечисленных экзогенных агентов была измерена продукция тромбоксана В2 (ТХВг) после 15-ти минутной стимуляции тромбоцитов 10"7М Са-ионофором А23187, либо

ФГА -о- ФАТ —«— рмцин

контроль г в 3 10 11 12 13 14 15 16

-|д[М]

10"8М ФАТ, либо 10'9М ФГА, либо 10'13М рицином. Поскольку ТХВ2 является продуктом быстрого пиролиза тромбоксана А2 (ТХАг), по его концентрации в межклеточном пространстве можно с увереннотью судить об изменении уровня продукции ТХАг тромбоцитами. Во всех случаях было зарегистрировано значительное повышение продукции ТХАг (не менее, чем в 7 раз по сравнению с контролем). Максимальный уровень продукции ТХАг (3,62 пкг/106клеток) был зарегистрирован при стимуляции тромбоцитов 10"7М Са-ионофором А23187. Полученные данные свидетельствуют об активации циклооксигеназы и последующей стимуляции ТХАг-синтетазы. В целом, полученные результаты не дают оснований предполагать наличие каких-либо существенных различий в механизмах активации тромбоцитов и стимуляции их цитотоксичности. Следует отметить, что характерные морфологические изменения клетки и секреция содержимого гранул хранения наблюдаются как в первом (активация и агрегация), так и во втором случае (стимуляция цитотоксичности). Однако, определенные сигналы могут ингибировать аггрегацию не понижая при этом уровень продукции ТХАг (ОЬкБОМсг а[ а1., 1991). Логично предположить, что должны существовать более тонкие различия в механизмах двух вышеназванных процессов.

2. Сравнительная цитотокснчность тромбоцитов и мононуклеаров

периферической крови человека, стимулированных Са-ионофором.

Максимумы цитотоксичности как тромбощгтов (32,1±6,3%), так и МНК (63,2+ 5,8%), были отмечены (Рис. 2) при стимуляции эффекторных клеток Са-ионофором в одной и той же концентрации (10"7М). Исходя из полученных данных, можно предположить, что цитотокснчность тромбоцитов по отношению к ШС-чувствительным опухолевым клеткам вносит ощутимый вклад в противоопухолевый иммунитет.

цитотоксичность, %

80

40

20

60

о

контроль

-9

-8

•7

-6

1д [ ГЛ ] (концентрация Са-ионофора)

Рис. 2 Цитотоксичность тромбоцитов (серые столбцы) и МНК человека {черные столбцы) после стимуляции Са-ионофором, в отношении клеток линии К 562. Соотношение тромбоциты/мишени 200:1. соотношение МНК/мишени 10:1. *Р<0.05 уэ. контроль.

3. Выделение и структурные исследования цитотоксических белков ЦТФ-14 и

ЦТФ-28 >п лизата тромбоцитов человека, стимулированных Сл-нонофором.

С целью предотвращения ингибирования и инактивации цитотоксических компонентов гранул тромбоцитов перед выделением белка стимулированные 10 М Са-инофором тромбоциты разрушали в жестких денатурирующих условиях (0.1% ТРА, 2М №С1). Известно (51егак е1 а]., 19В7), что при таких условиях содержимое гранул хранения практически полностью переходит в супернатант.

Для выделения белковых цитотоксических тромбоцитарных факторов (ЦТФ) в

качестве исходного сырья использовали очищенные от плазмы тромбоциты человека, стимулированные 10'7М Са-ионофором А23187. Вышеописанным способом был получен лизат данных клеток, который немедленно наносили на колонку С4 (№ Роге ЯР-304, Вю-

Rad, 4.6 x 250 mm), уравновешенную 0.1% ТФУ и элюировали в течение 60 мин в линейном градиенте ацетошггрила от 0% до 90% (Рис. 3).

время, мин

Рис 3 ВЭЖХ клеточного лизата (1 мл) тромбоцитов, стимулированных 10"'М Са-ионофорои. Колонка Hi Pore RP-304 (Bio-Rad, 4,6x250 nun). Скорость злющи - 1 мл/мин. Цитотоксичносгь фракций в отношении клеток линии К 562 измерена в 18-часовом МТТ-тесте. *Р<0.05.

Фракции F5 и F8, полученные после первого этапа хроматографической очистки (Рис. 3) и показавшие наибольшую цитотоксичносгь (24+6.4% и 19.8+5.4% соответственно), ресуспендировали в 0,2 мл 0.1% ТФУ и наносили на колонку Си (Zorbax ODS, Du Pont, 9.4 x 250 mm), уравновешенную 0.1% ТФУ, содержащей 10% ацетошггрила, затем элюировали в течение 40 мин в линейном градиенте ацетошггрила от 10% до 60%.

После хроматографического разделения фракции F5 (Рис. 4) была получена фракция F1.4, показавшая достоверно высокую цитотоксичносгь в МТТ-тесте против клеток линии К 562 (22+4.6%). После электрофореза данной фракции с последующим

электропереносом на Р\ТЭР мембрану был обнаружен белок массой около 14 кДа (ЦТФ-14) (Рис. 5). По результатам денситометрического анализа пятна данного белка на РУОР мембране, 10 мл экстракта тромбоцитов содержат не менее 20 пкМоль ЦТФ-14.

И-концевая аминокислотная последовательность ЦТФ-14 была определена секвенированием при помощи автоматического газофазного секвенатора. Ы-концевой участок данного белка оказался гомологичен региону от 241-го до 249-го аминокислотного остатка СИ компоненту комплемента человека: 1 УАР(ЗХ<ЗРОР9-... ЦТФ-14

-241УА001«2Р0Р249-... С

После хроматографического разделения фракции (Рис. 6) были получены две фракции Р2.5 и Р2.11, показавшие достоверно высокую цитотоксичность в МТТ-тесте против клеток линии К 562 (21±4.3% и 1б.З±З.Е% соответственно). После электрофореза фракции Р2.5 с последующим электропереносом на РУОР мембрану был обнаружен белок массой около 28 кДа (ЦТФ-28) (Рис. 5).

И-концевая аминокислотная последовательность ЦТФ-28 была определена секвенированием при помощи автоматического газофазного секвенатора. Не удалось найти какую-либо гомологию 1Ч-концевого участка данного белка (ОУОЬТ-) по отношению к известным белкам человека.

время, мин

Рис. 4 ВЭЖХ хроматографической фракции F5 на колонке С|8 (Zorbax ODS, Du Pont, 9.4x250 mm). Скорость элюции - 2 мл/мин. Цшотоксичносгь фракций в отношении клеток линии К 562 измерена в 18-часовом МТТ-гесте. »Р<0.05.

Были получены поликлональные анти-ЦТФ-Н и анти-ЦТФ-28 антитела из сыворотки иммунизированных кроликов. С помощью иммуноблоттинга с данными антителами удалось показать присутствие как ЦТФ-14, так и ЦТФ-28 в супернатантах тромбоцитов, стимулированных 10"7М Са-ионофором А23187, или 10'8М ФАТ, или 10"9М ФГА, или 10'13М рицином.

1 2 3 4 5 6

Рис. 5 Электрофорез супернатангов (5 |Л/трек), полученных из лизатов тромбоцитов человека, стимулированных различными экзогенными агентами: КГ'М ФГА (1), Ю'|3М рицином (2), 10"8М ФАТ (3). 10'7М Са-ионофором А23187 (4), а также, .\ром,что графически очищенные белки ЦГФ-28 (5) и ЦГФ-14 (б) после электропереноса на Р\ТЖ мембрану.

время, мин

Рис. 6 ВЭЖХ хроматаграфической фракции F8 на колонке С)8 (Zotbax ODS, Du Pont, 9.4x250 mm). Скорость элюции - 2 мл/мин. Цкготоксичность фракций в отношении клеток линии К 562 измерена в 18-часовом МТТ-тесге. *Р<0.05.

Полученные результаты доказывают, что тромбоциты человека действительно содержат растворимые цитотоксические белки. Вероятно, эти белки содержатся в гранулах хранения и секретируются непосредственно после стимуляции.

4. Изучение механизма гибели клеток-мишеней, индуцируемой ЦТФ-14 и ЦТФ-28.

Исследования фрагментации ДНК клеток-мишеней позволяют предположить, что гибель опухолевых клеток линии К 562 под воздействием цитотоксических факторов тромбоцитов не является апоптотической, поскольку не было выявлено явных признаков нукпеосомальной фрагментации клеток-мишеней как после совместной инкубации с тромбоцитами, стимулированными 10"7 М Са-ионофором, так и после инкубации в присутствии 1ДФ-14 и ЦГФ-28.

цитотоксичность, %

за

20 10 о

Рис. 7 Цисгготоксическая активность хроматографически очищенных белков ЦГФ-14 (серые столбцы) и ЦГФ-28 (черные столбцы) по .отношению к клеткам К 562. *Р<0.05.

5. Выделение и частичная характеристика белка массой 14 кДа, повышающего

иролиферативный ответ мононуклеаров периферической крови человека на

:тнмуляцню конканавалином А.

При аналитическом электрофорезе лизата тромбоцитов, стимулированных 10"7М

Га-ионофором, детектировали довольно четкую одиночную полосу ЦТФ-14. Однако, при

шалогичном разделении образцов супернатантов тромбоцитов, стимулированных

эазличными экзогенными агентами (10"7М Са-ионофором А23187, или 10"8М ФАТ, или 10'

'М ФГА, или Ю~,:,М рицином), наблюдали дополнительную полосу меньшей

1нтенсивности (Рис. 8) чуть выше полосы, соответствующей ЦТФ-14. Аналогичную юлосу детектировали при аналитическом электрофорезе образцов супернатантов МНК, ггимулированных различными экзогенными агентами (10"7М Са-ионофором А23187, или 10 8М ФАТ, или Ю'М ФГА или 10"13М рицином) (Рис. 8).

С целью выделения растворимого белкового фактора массой 14 кДа (р-14) из супернатанта стимулированных тромбоцитов в качестве исходного продукта использовали лиофилизованные образцы супернатанта тромбоцитов, стимулированных 10"7М Са-ионофором. Для удаления балластных белков, массами более 30 кДа перед хроматографическим разделением провели процедуру "cut-off" - удаление высокомолекулярных компонентов посредством центрифугирования через специальную мембрану Microcon-ЗО. Фракцию, содержащую белки массой менее 30 кДа немедленно подвергали очистке с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Образец наносили на колонку С4 (Hi Pore RP-304, Bio-Rad, 4.6 х 250 mm), уравновешенную 0.1% ТФУ и элюировали в течение 40 мин в линейном градиенте ацетонитрила от 10% до 60% (Рис. 9).

После хроматографического разделения была получена фракция 7, не обладавшая цитотоксичностью против клеток линии К 562, однако, показавшая наибольшее стимулирующее воздействие на пролиферацию МНК (1080+220 срт) в [3Н]тимидин-тесге. После анализа данной фракции с помощью электрофореза с последующим электропереносом на PVDF мембрану был выделен р-14 (Рис. 8).

кОа

р-14

12 3 4

Рис.8 Электрофорез супериатантов тромбоцитов (1) и МНК (4), стимулированных 10"' М Са-ионофором. 2, 3 - хроматографически очищенный р-14 после элекгроблоттинга на РМЭР мембрану.

A IZZOnm]

цитотоксичность, %

профиль градиента

60

О

10

20

30

время, мин

Рис. 9 ВЭЖХ фракции, полученной после предварительной очистки супернатанта тромбоцитов, стимулированных 10'М Са-иоиофором, с использованием мембраны Microcon-30, на колонке Ci g (Zorbax ODS, Du Pont, 9.4x250 mm). Скорость элюции - 2 мл/мин. Цитотоксичность фракций в отношении клеток линии К 562 измерена в 18-часовом МТТ-тесте. *Р<0.05.

N-концевая аминокислотная последовательность р-14 была определена секвенированием при помощи автоматического газофазного секвенатора. N-концевой участок данного белка оказался гомологичен региону (99 - 103 аминокислотный остаток) антигена DQ-ß 1 класса II главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) человека:

Данные результаты позволяют предполагать, что данный 14 кДа белок, возможно, является фрагментом молекулы Б(}-Р1. Маловероятно, что р-14 содержится в тромбоцитарных гранулах, скорее, он может быть продуктом ресинтеза или специфического протеолиза белка-предшественника (31-цепи антигена ОС>-р 1 класса II ГКГ. Однако, данная гипотеза требует строгого доказательства. С другой стороны, как

VLERTXA7-...

р-14

■"VLERTRA105-.

HLADQ-ßl

[звестно р!-иепи молекул О0-|31 являются наиболее вариабельными, а структура •ецептор-связывающего медиатора предполагает строгий консерватизм аминокислотной юследовательносги. В этой связи, можно предположить, что р-14 является продуктом льтернативной транскрипции гена НЬА 00 Ы или, вообще, не имеет отношения к ранскрипции данного гена.

6. Исследования биологической активности белка массой 14 кДа нз супернатанта

тромбоцитов человека, стимулированных Са-нонофором.

С целью изучения биологической активности р-14 получали чистый белок в астворе известной концентрации после элюции электрофоретически очищенного белка с ЛТО- мембраны. Исследуемый белковый фактор не проявил цитотоксической активности клеткам линии К 562, поскольку цитотоксичность р-14 в 18-часовом МТТ-тесте при всех зученных концентрациях (10'8М+10'ПМ) статистически не отличалась от контроля Рис. 9). Также не было отмечено повышения цитотоксичности МНК в отношении клеток инии К 562 при совместной инкубации в присутствии р-14 в различных концентрациях Ю'8М-=ТО"пМ). Однако, данный белок оказал некоторое стимулирующее воздействие на ролиферацию МНК в [3Н]тимидин-тесте. Наиболее выраженный стимулирующий эффект -14 наблюдался в том случае, если МНК были предварительно активированы убоптимальной дозой (2 мкг/мл) Кон А (при оптимальной концентрации Кон А 10 мкг/мл) влияние р-14 на пролиферацию МНК не обнаруживалось). Наибольшее лияние на пролиферацию МНК (8 980+1380 ерш), активированных Кон А (2 мкг/мл) аблюдали при концентрации р-14 равной 10"8М (Рис. 10). Полученные результаты оказывают, что белковый медиатор р-14 не обладает собственной цитотоксичносгью, а акже не проявляет сильного митогенного эффекта, подобно агглютининам. С другой гороны, р-14, очевидно, оказывает определенное рецептор-опосредованное влияние на

мононуклеары периферической крови. Можно предположить, что данный бел ко вы i фактор имеет сродство к рецепторам каких-либо ростовых факторов, или усиливаел экспрессию подобных рецепторов на поверхности активированных клеток.

Также, р-14 был выделен из супернатанта МНК, стимулированных 10-7М Са-ионофором. Для удаления балластных белков, массами более 30 кДа провели процедуру "cut-off1 посредством центрифугирования с использованием мембраны Microcon-30. Нижнюю фракцию, содержащую белки массой менее 30 кДа немедленно подвергали разделению с помощью электрофореза с последующим электропереносом белковых полос на PVDF мембрану (Рис. 8). Искомый белок массой 14 кДа был обнаружен. По результатам определения N-концевой аминокислотной последовательности (VLERTXA-) белка массой 14 кДа, выделенного из стимулированных МНК, а также по результатам анализа биологической активности, можно заключить, что данный белок идентичен 14 кДа белковому фактору из супернатанта стимулированных тромбоцитов.

включение [3Н ]-тимцдина, cpm х 103

lg[M] (концентрация р-14)

Рис. 10 Влияние р-14 на пролиферацию мононуклсаров периферической крови, стимулированных Кон А (2 мкг/мл) в [3Н]тимидин-тестс. *Р<0.05 контроль.

выводы

. Исследована цитотоксическая активность тромбоцитов человека в отношении опухолевых клеток линии К 562 после стимуляции первых различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА, конканавалином А и рицином в наномольных и пикомольных концентрациях. Определены концентрации стимуляторов (10'7М Са-ионофор А23187, 10'8М ФАТ, 10'9М ФГА, 10"иМ рицин), вызывающие наибольшее повышение цитотоксичности тромбоцитов.

. Установлено, что стимуляция цитотоксической активности тромбоцитов сопровождается резким повышением продукции тромбоксана А2, что показывает очевидное сходство основных этапов активации и стимуляции цитотоксичности тромбоцитов.

. Установлено, что цитолитический эффект тромбоцитов в отношении клеток линии К 562 во многом определяется воздействием на данные опухолевые клетки растворимых цитотоксических тромбоцитарных факторов ЦТФ-14 и ЦТФ-28, находящихся, вероятно, в гранулах хранения тромбоцитов и секретируемых после стимуляции.

. Выделены цитотоксические тромбоцитарные факторы ЦТФ-14 и ЦТФ-28, являющиеся растворимыми белками молекулярными массами 14 кДа и 28 кДа соответственно. Определены М-концевые аминокислотные последовательности данных белковых медиаторов. Определены концентрации ЦТФ-14 и ЦТФ-28, в которых они наиболее цитотоксичны для опухолевых оегок линии К 562.

5. Установлено, что совместная инкубация как нестимулированных, так и стимулированных тромбоцитов человека с клетками линии К 562, а также инкубация данных опухолевых клеток в присутствии ЦТФ-14 и ЦТФ-28 в наиболее цитотоксических концентрациях, не вызывают нуклеосомальной фрагментации ДНК клеток-мишеней.

6. Выделен уникальный белок р-14 из супернатанта тромбоцитов, стимулированных Са-ионофором, а также из супернатанта мононуклеаров периферической крови, стимулированных Са-ионофором. Определена N-концевая аминокислотная последовательность данного белка.

7. Установлено, что р-14 не обладает собственной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток линий К 562 и ACL, а также, не стимулирует цитотокснчность МНК периферической крови при совместной 48-часовой инкубации. В то же время данный белковый фактор оказывает слабое стимулирующее влияние на пролиферацию МНК, а также, усиливает митогенное воздействие субоптимальных концентраций конканавалина А на пролиферацию МНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Golubeva T.S., Paromov V.M., Tuguz A.R., Chertov O.Yu., Kiselevsky M.V. (1997) "Cytotoxic protein from human platelets." - FEBS Letters, v.405, p.312-314.

2. Paromov V.M., Bughlava S., Malakhova N. V., Kiselevsky M. V., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. (1998) "Stimulation of human platelet cytotoxicity by various activators in the absence of antibodies: release of thromboxane A2 and soluble cytotoxic factors. Purification and partial characterisation of 14 кДа и 28 кДа cytotoxic proteins." - Russian Journal of Immunology, v.3, p.245-254.

3. Paromov V.M., Bughlava S., Malakhova N.V., Kiselevsky M.V., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. (1999) "Ricin at subpicomole concentrations stimulates cytolytic activity and lymphokine secretion by human peripheral blood mononuclear cells." - Russian Journal of Immunology, v.4, p.26-34.

4. Киселевский M.B., Бугхлава С., Новожилова Т.Н., Паромов В.М., Малахова Н.В., Казанова Г.В., Деревянченко И.Г. (1998) "Цитотоксическая и иммуномодулирующая активность рицина" - V Российский Национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, с.З 72-373.

5. Paromov V.M., Bughlava S., Malakhova N.V., Kiselevsky M.V., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. (1999) "Purification and partial characterisation of a 14 кДа protein enhancing mitogen-stimulated proliferation of human peripheral blood mononuclear cells." - Russian Journal of Immunology, v.4 (in press).