Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика альдозоредуктазы из хрусталиков крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика альдозоредуктазы из хрусталиков крупного рогатого скота"

Академия наук СССР Ордена Ленина Институт биохимии им. А, Н. Баха

на лразах рукописи

УМ 577.152; 576. 311.1

ВАРТАН.ОЗ СТЕПАН СЕРГЕЕВИЧ

Выделения и характеристика альдозоредуктазы из хрусталиков крупного рогатого скота.

Специальность 03. 00. 04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 199!

Работа выполнена в лаборатории кинетики биохимических процессов Института Биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Научныз руководители - д. х. н. Официальные оппоненты: д.х, н.

А. б. н.

Ведущая организация - Институт

СССР.

A. И. Ярополоо, . И. Л. Рабинович

B. И. Иуронец

физиологически активных веществ АН

Защита состоится о^ 1991 г.

/

в ?0 час. на заседании специализированного совета К 002,83.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А. II. Баха АН СССР (117071 Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2).

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР ((117071 Москва, Ленинский »р., 33).

Автореферат разослан 2 4 г.

Уч8кый секретарь специализированного совета А-б.н. НН. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Изучение регуляции метаболизма в тканях живых организмов является одним из наиболее важных направлений в биохимии. К числу существенных аспектов этой проблемы относится исследование механизмов, с помощью которых поддергивается восстановительная среда в клетках хрусталика. Работы в этой области имеют большое значение для разработки средств лечения такого распространенного заболевания как катаракта.

К числу ключевых ферментов метаболизма хрусталика относится альдозоредукгаза (альдигол: NAOP 1-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.21). Катализируя восстановление глюкозы до сорбитола (так называемый сорбитольный путь утилизации глюкозы) с одновременным окислением

никотинамиданениндинуклеотидфосфата (NADPH), данный фермент способен оказывать влияние как на углеводный обмен, так м на функционирование редуктазных систем, зависящих от NADPH. Это обусловливает его роль, как связующего звена между энергетическими и окислительно-восстановительными процессами в хрусталике. С другой стороны, накопление сорбитола - продукта восстановления глюкозы в катализируемой альдозоредуктазой реакции, оказывает влияние на осмотическое давление в хлетке и на проницаемость клеточных мембран.

Активность альдозоредуктазы может регулироваться эффекторами различной природы. Интересной особенностью фермента является его способность переходить а активированное состояние при инкубации в условиях, близких к возникающим in vivo при гипергликемических патологиях, в том числе при диабете. Весьма вероятно, что именно активация альдозоредуктазы дает начало цепочке патологических изменений в хрусталике, приводящих к развитии катаракты.

Для понимания механизмов катарактогенеза представляется необходимым изучение кинетики действия альдозоредуктазы.

Цель работы. Задачей настоящего исследования являлось изучение взаимодействия натиэной и активированной форм альдозоредуктазы с субстратами, продуктами и эффекторами реакции, с целью установления механизма регуляции каталитической актнпностн фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Прслодгк детальный анализ стационарной кинетики восстановления NADPH глюкозой в кдгал'-эируемой альдозоредуктазой реакции.

Изучено изаимодейовие альдозоредуктазы с рядом зф^екторов.

Показанл эффективная регуляция активности альдоэоредукызы ннкотинамидадениндинуклеотилфосфатами - NADPH и NADP, усыновлено, то при активации характер влияния субстратов на активность фермента претерпевает значительные изменения. Также обнаружена возможность регуляции активности альдоэоредук.азы за счет конкуреной по отношению it NADPH синергистической активации ферментативной реакции аденозиндифосфатом (ЛГР).

Показана перспективность использования одного из ингибиторов альдозоредухтазы - мормна - в составе антикатарактальных лекарственные средств.

На основании равновесных и кинетических исследований предложены механизмы действия нативной и активированной форм фермента.

Полученные результаты вносят вклад в понимание механизма катализируемой альдозоредухтазом реакции и возможных путей регуляции активности этого фермента о клетке.

Объем работу. Диссертационная работа состоит нэ введения, обзора литературы, .посвященного свойствам альдозоредуктазы из хрусталиков и родственных ей альдозоредуктаз из других тканей, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (154 наименования). Объем работы - 145 страниц машинописного текста, включая 29 рисункрв и 9 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

з

Вылелеиие гомогенного препарата йеонснга. ■

Нами был разработан метод выделения альдоэоредуктаэы из хрусталиков крупного рогатого скота. Процедура очистки Сема включала гомогенизацию хрусталиков, осаждение сульфатом аммония и хроматографическое разделение на колонках с Трис-акрил сефарозой, голубой агароэой и с сефадексом б - 100. Данная методика отличается от описания в литературе простотой, высокой воспроизводимостью при использовании разных партий хрусталиков и отсутствием хроматографическиХ стадий, требующих редких и нестабильных носителей. Результаты типичного выделения представлены а табл. 1.

Таблица 1. Очистка альдозоредуктазы.

Стадия Обций белок, иг Активность., Удельная актив -ность /г Степень очистки Выход по активности, X

Осаждение 758 2.13 0.0026 1.0 100

Хроматография на Трие-акрил сефарозе 54.15 2.05 0.04 13.6 97

Аффинная хроматография на голубой агарозе 8 1.37 0.17 57.80 64

Гель-проникающая хроматография на сефадексе Б-100 5.0 0.9 0.18 61.27 42 1

Препараты активированной альдозоредуктазы получалм, инкубируя фермент в присутствие 0.1 мН НАОРН, 56 мН глюкозы н 0. 8 мМ глюкозо - 5 - фосфата в

течение 30 минут. Полученный фермент был гомогенен согласно данным градиентного электрофореза. Молекулярная масса обоих форм составила примерно 40000 Да.

Стацюнарная кинетика реакции, катализируемой альдозоредуктаэой.

Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов. Согласно полученным нами данным, кинетика действия альдозоредуктазы является гиперболической по ИАОРН и негиперболической по глюкозе (рис. 1, 2).

50

7

рис.1 Зависимость скорости

катализируемой альдозоредуктаэой реакции от концентрации МАОРИ а координатах Лайнуивера - Берка. Фиксированные концентрации глюкозы (МН): 1 - 56; г - 11.2; 3 - 5.6; 4 -2.8; 5 -1.12; 6 - 0.67; 7 - 0.56.

о

О 160 320 460 (40 800

1/(ЫА0РН|, тМ

-1

1

рис.2 Зависимость скорости катализируемой альдозоредуктазой реакции от концентрации глюкозы в координатах Лайнуивера - Берка. фиксированные концентрации ИАСРН (мся): 1 - 100; 2-10; 3-5; 4' -2.5; 5 - 1.25.

О 400 800 1200 1800 1000 1/101ИММ1, И"'

>

Зависимости, приведенные на рис. I, 2 можно описать уравнением вида:

а^г + аг$]$2г V - ____(1)

1 + а331 + а^ + 5г + а6$22 + а;*^2

где $2 - МАОРИ, - глюкоза, а а^ - эмпирические константы.

По-видимому, наблюдаемый характер кривых связан с ролью альдозоредуктазы .в регуляции стационарного уровня глюкозы в клетке. Зависимости активности фермента от содержания глюкозы таковы, что скорость превращения глюкозы мало изменяется при уменьшении ее концентрации намного ниже физиологического уровня. В то же время при превышении этого уровня количество восстанавливаемой альдозоредухтазой глюкозы быстро возрастает. Тем самым обеспечивается дополнительный путь утилизации в клетке глюкозы и осуществляется защита белков хрусталика от гликозилирования в условиях ее избытка.

Кинетическая схема альюзооедуктазной реакции. Полученные нами данные позволили предположить механизм восстановления глюкозы НЛОРН, катализируемого ферментом (схема 1). Согласно этой схеме, альдозоредуктаза в процессе катализа может существовать в двух изомерных формах - Е и £', каждая из которых обладает ферментативной активность». К активному центру' альдозоредуктазы в произвольном порядке могут присоединяться НАСРН и глюкоза ($2). Процессы образования комплексов фермента с субстратами равновесии и характеризуются константами диссоциации <1( ив), а процессы изомеризации протекают со скоростями, определяемыми константами скорости к), и сравнимыми со скоростями превращения субстратов. Изомеризации подвергаются только комплексы фермента, содержание никотинамидадениндинуклеотидфосфат-

Рассчитанные из эмпирического уравнения (1) комбинации констант, соответствующие параметрам приведены в таблице 2.

Табл. 2. Коэффициенты уравнения (1).

Аналитическое выражение а< через коэффициенты Значение, неактивир активир. Значение, неактивир активи

Р- „ схемы (1)

концентрация сульфата, Н 0.4 0

*4 - »3 ¿/(к.] + М^/С 85+/-56 13+/-16 370+/-280 76+/-4 21+/-6 358+/-2 38+/-2 7+/-3 453+/-б 5 8+/-8 7+/-12 196+/-4'

2.2+/-2.0 4+/-3 2.5+/-4.0 3.5+/- Ц

«6 [ У®гПК-1 +кг) +1 330+/- 300 463+/-6 227+/-7 152+/-2

+ <*«1г*(к. + к.»)]/С * 0.01+/-0.1 8+/-10 0 10+/-8 0.02+/-12 9.4+/'9.0 0 6.9+/-<5

С ()1к.1 + к^в})

Как видно из таблицы 2, I ; один из параметров схемы 1 в отдельности не может быть определен в результате измерения зависимости скорости реакции от концентрации субстратов. Независимые данные по связывание глюкозы, полученные в результате титрования фермента субстратом позволяет оценить отдельно лишь константу с)г , равную 29 мН В целом, решение задачи количественного определения параметров схемы 1 требует специальны* экспериментальных подходов.

Связывание субстратов альдозооедуктазой в р?яноресных условиях. Важное подтверждение правильности предложенного механизма было получено в экспериментах по спектрофотометрическому титрованию фермента субстратами. Механизм, показанный на схеме 1 предполагает возможность связывания с ферментом любого из субстратов по отдельности. Проведение титрования оказалось возможным так пак. связывание как МАОРК, так и глюкозы сопровождалось изменениями спектра поглощения белка (Рис. 3).

[Glucose]. mM

Рис. 3. Кривыа спехтрофотометрического (а) и глюкозой (б).

титрования

аль дозоре.\:г,'.т азы tlAD?H

Анализ полученных данных показал, что и NADPH и глюкоза способны присоединяться к альдозоредуктазе по отдельности, что указывает на неупорядоченный механизм связывания субстратов. ■

Для исключения из рассмотрения механизма с двумя центрами связывания MADPH в молекуле альдозоредуктазы, один из которых не проявляется в условиях измерения из-за очень прочного связывания или отсутствия влияния этого связывания на ' активный центр, было проведено изучение стехиометрии связывания NADPH с ферментом .методом равновесной гель-хроматографии (рис.

0.05-

-0.05. 0.09

0.04 •

vo-o-o-o

ОО-О /

.оо-о

Q&0

©

| .H -Q-^ JÍ

ю

257

280

40

Рис. 4 Профили эл*ции альдозоредуктазы при разновесной гель-хроматографии на колонке, .уравновешенной 50 мкМ ИАОРН, при длине волны 257 км (¿>) и 340 ни (б), (а) - оптическое поглецение в контрольной хроматограмме прм длине волны 2й0 им.

о

Количество связанного NADPH составило 0.9+/-0.4 моль/моль белка. Пик поглощения на длине волны 340 нм на хроматограмме отсутствует, хотя соответствующий минимум наблюдается и при этой длине волны и совпадает с минимумом при 257 нм. Это позволило предположить, что при связывании с ферментом, NADPH переходит в окисленную форму, причем отщепление NADP возможно лишь в присутствие глюкозы.

Связывание эффекторов в активном центре Фермента. На активность альдозоредуктазы может оказывать влияние ряд веществ, связывающихся в активном центре этого фермента. В нашей работе было изучено влияние на этот фермент NADP, сорбитола, глицерина и - глицерофосфата, являющихся продуктами реакции, а также ADP и АТР, соединений, концентраций которых тесно связана с энергетическими процессами в клетке.

Катализируемая альдозоредуктазой реакция 8 присутствие эффектора может быть описана схемой 2. Соответствующее схеме 2 уравнение скорости реакции включает концентрацию эффектора и NADPH ео второй степени, что соответствует нелинейным зависимостям о координатах Лайнумвера-Берх по обоим субстратам:

ajSjZS2 + a-,Sj2S2z + agSjIS2 + agSjIS2z

v-.............................................. -- (2),

sl+a3sl2+a4sls2+a5sl2s24a6sls2z+a7sl2s22+a101+ ' aj j SjI+a12IS2+ai3SjIS2+a j ^IS^+aj 5SjIS'+a2 612+

где Sj - NADPH, S2 - глюкоза и I - эффектор

Действительно, было обнаружено, что в присутствие NADP кинетика действия альдозоредуктазы является негиперболической по NADPH (Рис. 5).

1/У

в

0.4

О

0 130 360 540 720 900

1/[аисо!81, М~

0 180 320 480 640 600 1/(ШРН|. тМ 1

а)

б)

Рис 5. Зависимость скорости катализируемой альдозоредуктазой реакции от концентрации глюкозы (а) и МЛОРН (б) в координатах Лайнуивера-Берка. Концентрации ИАОР е мН указаны у кривых.

ШР ингибировал альдозоредуктазу конкурентно по отношению к ШРН и неконкурентно - к глюкозе. По-видимому, такой механизм делает возможной эффективную регуляцию активности ' альдозоредуктазы

никотинамидадениндинуклеотидами - субстратом и продуктом реакции за счет изомеризации соответствующих комплексов с ферментом. В присутствии. ИАОР катализируемая альдозоредуктьзой реакция может протекать с заметной скоростью при низком содержании МЛОРН за счет негиперболической зависимости скорости реакции от его содержания в этих условиях. Скорость ферментативной реакции изменяется в малой степени при существенном изменении содержания ИАОРН.в области его малых концентраций, и значительно - при изменении в области высоких концентраций.

АОР выступает как синергистический активатор альдозоредуктазной реакции (рис. б). Присутствие этого соединения не нарушает, линейности зависимости от МАОРН в координатах Лайнуивера - Берка, одновременно увеличивая эффективное сродство фермента к этому субстрату. 8 то же время, АОР практически не влияет на зависимость скорости реакции от концентрации

глюкозы.

ESÍ

E

XlfVV

ES. S -1 2

-2

EJS,

e2

Б'*

>1

1oz

E'SiS2

PU

E'S,

Cxeua í

Е1

11

-з

Е' I-

-4

12

-2

1 2

Схема 2

■ 1 ЕI f

Ч

2

ЕГЭ-,

\

еа

-з

1 ^

"11

*4

Ж

Е* ¡5.

-4

¿и

Те,

<1

Е* 1«.

.Е'Ь

ве.

12 •Е'Я

Схема 3

)

Е<

тЕЗ£——гЕЭ Х-

»«»а.. *•=

Е*' .В'

%т.

Е* Э Э ■ 12

Схема ^

1/v

4.8-

8.0-1

6.4

3.2

1.6

2

0.0

0 160 320 480 640 800 1/INADPH), mM"1

Рис. б. Зависимость скорости альдозоредуктазной реакции от концентрации NADPH в координатах Лайнуивера-Берк. Концентрации А0Р в мМ: 0 -(1). 0.4 - (2).

Обычно, для объяснения такого действия эффекторов предполагают, что они связываются со специальным, отличным от активного центром на ферменте. Особенности механизма изомеризации, предлагаемого для катализа альдозоредуктазой, позволяют объяснить действие ADP в рамках конкурентного по отношению к NADPH связывания с активным центром (схема 2). Это оказывается возможным при выполнени следующих условий: крайне низкого сродства нуклеотида к изомерной форме фермента (£' на схеме 2); высокой скорости изомеризации комплекса E*ADP*G1u; относительно низкой скорости изомеризации комплекса Е*А0Р и' более высокого сродства NADPH к активному центру изомерной формы альдозоредуктазы. В этом случае схема 2 описывает, по сути, катализ А0Р реакции изомеризации фермента, а в уравнении (2) величинами коэффициентов aj0, aj6 -'ijg можно пренебречь.

Добавление в среду ионов кальци.. и магния а концентрации 5 мМ не влияло на активацию ADP. В отличие от ADP, эффект активации не проявлялся ни а присутствии АТР, ни его комплексов с и Са2+.

Активация ферментативной реакции под действием ADP и отсутствие влияния на нее АТР могут увеличивать скорость превращения Сахаров альдозоредуктазой, а следовательно, и эффективность утилизации углеводов по сорбитольному пути метаболизма в условиях низкого содержания NADPH и высокой степени превращения АТР a ADP.

Сорбитол в концентрации до 1.5 М не ингибирует ферментативную реакцию.

Такой же результат был получен в присутствии глицерина - продукта восстановления ферментом глицеральдегида.

В отличие от сорбитола и глицерина, ^-глицеролфосфат - продукт восстановления глицеральдегидфосфата - также являющийся субстратом альдозоредуктазы, ингибировал активность фермента конкурентно по отношению к глюкозе и неконкурентно - по отношению к НАОРН (рис. 7).

Шисозеиг1 . 1ЛЫА0РН], гпМ"1

а) б)

Рис. 7. Зависимость скорости альдозоредуктазной реакции от концентрации глюкозы (а) и МАОРИ (б) з координатах Лайнуивера-Берка. Концентрации с/ - глицерофосфата в мН; 0 - (1), 0.4 - 2.

Связывание зйфекторов в ингибиторном центре альдозоредуктазы. Как следуат из литературных данных, альдоэоредуктаза из хрусталиков имеет специальный центр, в которой связывается большая г. уппа соединений разнообразной структуры как синтетического, так и природного происхождения. Нами были выбраны такие ингибиторы как Каталин, входящий в состав ряда антнкатарактальных препаратов, например сэнкаталина, и флавоноид морин -один из сильнейших ингибиторов альдозоредуктазы, обладающий также антиоксидантным действием. На рис. 8 показано влияние морина на активность фермента.

Ингибирование альдозоредуктазы морином по обоим субстратам носило смешаный характер, при этом линейность характера зависимостей скорости от концентрации МАОРН не наруиалась.

Аналогичную картину наблюдали при исследовании действия каталина. КрМ1 для каталина и морина равны 5 мкм и 1 мхм соответственно.

[Мопл], М

Рис. В. Зависимость активности альдозоредухтазы от содержания морина в координатах Аксона, а - фиксированные концентрации глюхозы в мМ ухазаны у прямых; концентрация ШРН - 100 мкН; б - фиксированные концентрации 1Ш)РН в мкИ указаны у прямых, концентрация глюкозы - 56 мМ.

Б случае, если добавленное соединение присоединяется не к активному центру, и его связывание не вызывает изомеризации альдозоредуктазы, механизм катализа может быть представлен схемой 3. Из нее следует, что линейность зависимостей от МвРН в двойных обратных координатах требует блокирования изомеризации комплексов фермента с МАОРН при связывании ингибитора.

Кинетика и механизм действия активированной альдозоредуктазы.

Инкубация альдозоредухтазы в присутствии субстратов вызывает ее необратимую активацию, сопровождающуюся также ■ снижением сродства к ингибиторам. Максимальная активация достигалась в течение 30 минут и составляла примерно 160 % по отношению к нативному ферменту.

Активированный фермент в координатах Лайнуивера - Верка демонстрирует зависимости аналогичные полученным для нативной форкы (рис.9, .табл. 2).

1/lGlucoss), М"' 1/INADPH], тМ"'

а) б)

Рис. • 9а. Зависимости в координатах Лайнуивера - Берка для реакции, катализируемой активированной альдозоредуктаэой. Фиксированные концентрации NADPH составляют 0.1, 0.01 и 0.005 мМ.

Рис. 96. Зависимости в координатах Лайнуивера - Берк для реакции, катализируемой активированной альдозоредуктазой. Фиксированные концентрации глюкозы составляют 56, 17.2, 5.6, 2.8 и 0.56 мМ.

Анализ полученных данных с использованием уравнения 1 и аналитических выражений коэффицнентоп из таблицы 2 позволил предположить, что актизация является следстп;«ч изменения кинетических и равновесных констант на схеме

(1), при этом фер.чент сохраняет способность к изомеризации в ходе реакции. В рамках схемы (1) практическое равенство нулю коэфициента ад означает одновременное возрастание коэффициентов д2 и е2 и уменьшение коэффициентов с^ и $ в уравнении (1).

При таком изменении схемы (1), концентрации комплексов Е52 и Е'52 . становятся пренебрежимо малы по сравнении с остальными, а схема (1) переходит в схему с упорядоченным присоединением субстратов (схема 4).

Это означает, что свободная форма активированного фермента теряет способность связывать глюкозу. Данный вывод согласуется и с отсутствием спектральных изменений при титровании активированного фермента глюкозой.

Стехиометрия связывания белком никотинамидадениндинуклеотидфосФата. В условиях, когда, судя, по кинетическим измерениям, альдозоредуктаза практически насыщена ИАОРН, с ней, как и для неактивированного фермента, связывается приблизительно ] молекула никотинамидадениндинуклеотидфосфата на молекулу белка. Характер пиков поглощения на длинах волн 340 и 257 им, полученных при равновесной гель-хроматографии в присутствии НАОРН, ухазывает, что этот субстрат переходит в окисленную форму, связываясь с альдозоредуктазой в отсутствие глюкозы.

Активация альдоэоредуктаэы приводит к росту максимальной скорости ферментативной реакции и эффективных констант Михаэлиса по глюкозе и НАОРН. При низкой концентрации глюкозы кинетические зависимости реакции, катализируемой активированным и неактивированным ферментом практически не различаются. Различия проявляются при высоком содержании глюкозы, когда активность фермента практически перестает регулироваться НАОРН. при гипергликемии это может привести к понижению за счет катализируемой альдозоредуктазой реакции концентрации ИАОРН в клетках хрусталика практически до нуля. Конкуренция альдоэоредуктаэы с глутатион-редуктаэной системой, завещающей хрусталик от окислительных повреждений и также использующей НАОРН, способно привести к резкому снижений восстановительного потенциала клеточной среда В то же рьсмя, накопление сорбитола, продукта альдоэоредуктаэной реакции, ведет к пзпенеиия «^магического мления в клетке и нарушению проницаемости клеточных мембран. Таким образом, изменение механизма действия альдозоредуктазы при активации может рассматриваться как важный фактор диабетического катарактогенеэа.

Влияние эффекторов на активированную форму альлозоредукгазы. Зависимости для скорости катализируемой альдозоредуктазой реакции в

присутствие НАОР были аналогичны полученным нами для неактивированного фермента. Таким образом, этот путь регуляции активности не утрачивает значения и для активированного фермента.

АПР не оказывал влияния на активированную форму альдозоредуктазы. Одним из объяснений этого эффекта может быть механизм, в котором присоединение АОР к активному центру альдозоредуктазы возможно только После присоединения глюкозы. Этим объясняется также отсутствие заметной изомеризации комплекса Е*А0Р для нативного фермента, необходимое для проявления синергистической активации.

Так же, как и в случае нативного фермента, морин не конкурировал ни с глюкозой, ни с МАОРИ. Эффективная константа ингибированмя реакции для активированной альдозоредуктазы составляла 15 мкМ,' что на два порядм больше, чем для неактивированной формы.

Изменением сродства альдозоредуктазы к эффекторам, связывающимся в ингибиторном центре может объясняться низкая эффективность лекарственных препаратов, содержащих эти вещества, на поздних стадиях развития диабетической катаракты, когда по литературным данным весь фермент ухе активирован.

Влияние морина на образование активированной формы альАозореАУКтазы. Как следует из линейности зависимостей скорости реакции катализируемой неактивированной альдозоредуктазой в координатах Аксона {рис. 8), морин способен блокировать изомеризацию альдозоредуктазы. В этом случае можно ожидать, что присутствие этого ингибитора должно подавлять активацию альдозоредуктазы при ее инкубации в присутствии активирующей смеси. Действительно, при добавлении в смесь морина было показано существенное снижение степени активации альдозоредуктазы за одинаковое время. 8 то время, как степень активации альдозоредуктазы в смеси, не содержащей морина, составляла 160 процентов по отнопению к наактивированнаму ферменту, с присутствии морина эта величина составляла не более 115 процентов.

Таким образом, морин и. родственные ему соединения могут рассматриваться ие только как ингибиторы альдозоредуктазы, но и в качестве агентов, блокирующих активацию фермента.

Заключение.

Негигзрболическая зависимость скорости альдоэоредуктаэной реакции от концентрации субстрата наблюдается при физиологических концентрациях глюкозы. По-видимому, такой механизм может обеспечить более эффективную регуляцию стационарного уровня глюкозы в клетке. Зависимость активности фермента от концентрации глюкозы такова, что скорость превращения субстрата мало изменяется при уменьшении его концентрации намного ниже физиологического уровня, и быстро возрастает при ого превышении. Возможно, тем самым обеспечивается лучшая защита белков хрусталика от гликозилирования.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что негиперболическая кинетика восстановления глюкозы а катализируемой альдозоредуктазой реакции, вероятно, является проявлением механизма, при котором субстраты присоединяются к активному центру фермемта в квазиравновесном режиме, а изомеризация фермента в процессе катализа зызывается присоединением NADPH. Такой механизм реакции делает возможной эффективную регуляций активности альдозоредухтазы

никотииамидадениндинуклеотидфосфатами - субстратом и продуктом реахции, а следствии изомеризации соответствующих комплексов с ферментом. В присутствии NADPH катализируемая альдозоредуктазой реакция может протекать с заметной скоростью при низком содержании NADPH за счет негиперболической зависимости скорости реакции от его содержания в этих условиях. Скорость ферментативной реакции изменяется в малой степени при существенном изменении содержания NADPH в области его малых концентраций и значительно - три изменении в области высоких концентраций.

Активация ферментативной реакции под действием АДР и отсутствие влияния на нее АТР могут увеличивать скорость превращения сахароа альдозоредуктазой, а следовательно и эффективность утилизиции углеао'ов по сорбитольному пути метаболизма в условиях низкого содержания NADPH и высокой степени превращения АТФ в АДР.

Активация альдозоредуктазы призоднт к pociy максимальной скорости ' ферментативной реакции и эффективного сродства фермента к глюкозе и NADPH. При нним>П " концентрации глюкозы кинетические зависимости реакции, катализируемой актированным и неактиэированным ферментом практически не различаются. Различия проявляются при высоком содержании глюкозы, когда активность фермента практически перестает регулироваться NADPH. При гиперглих ( это может привести к понижению за счет катализируемой

альдозоредуктазой реакции концентрации NADPH в клетках хрусталика практически до нуля. Конкуренция альдозоредуктази с глутатион-редуктазной системой, защищающей хрусталик от окислительных повреждений, способно привести к резкому снижению восстановительного потенциала клеточной среды. Таким образом, изменение механизма действия альдозоредуктази при активации может рассматриваться как важный фактор диабетического катарактогеиезза.

Обнаруженный в настоящей работе эффект предотвращения активации фермента флавоноидом морином, пр-видимому, может объяснять гораздо больаую эффективность некоторых ингибиторов альдозоредуктази в качестве антикатарактальных средств при их введении до или одновременно с созданием гипергликемических условий в экспериментах tn vivo. Другим важным свойством является способность этого вещества участвовать в свободно-радикальных процессах. По-еидимому, подобные соединения при соответствующей стратегии лечения могут быть использованы для предотвращения развития осложнений при диабете.

Выводы.

1. Реакция восстановления глюкозы NADPH, катализируемая альдозоредуктазой из хрусталиков крупного рогатого скота, протекает согласно механизму с равновесным неупорядоченным присоединением субстратов. В составе комплексов, содержащих нихотинаммдадеииндинуклеотидфосфат фермент способен совершать быстрые переходи между двумя изомерами, различавшимися по кинетическим свойствам.

2. Инкубация альдозоредуктази в присутствие субстратов приводит к ее активации. Этот процесс сопровождается ростом максимальной схорости и снижением сродства к ингибиторам, в том числе входящим в состав терапевтических препаратов. По всей вероятности, активация происходит за сче. изменения кинетических параметров схемы реакции таким образом, что присоединение субстратов становится последовательным.

3. Активность альдозоредуктази чувствительна к воздействию целого ряда веществ различной природы. Эффектор может взаимодействовать либо с одним из субстрат - связывающих центров фермента, либо с отличным от него -ингибиторным. в присутствии ADP наблюдается синергистическ«» „«»гг.вация альдозоредуктазной реакции. Это может быть объяснена взаимодействием эффектора с NADPH - связызаицим центром. Процесс, по суцеству, состоит я катализе АДГ' реакции изомеризации фермента. Полученные наш результаты указывает на воэжжмость эффективней регуляции активности альдозоредуктазы

I 9

НАСР и МАОРИ. Впервые удалось показать имгибироаание альдозоредуктазы глицерофосфатом, продуктом превращения альдегида.

4. Флавоноид морин мнгибирует альдозоредуктазу, связываясь вне активного центра. Константа ингибироаания составляет 5*10"' М и увеличивается на два порядка при активации фермента. В то хе время, показано, что связывание марина блокирует сам процесс активации.

По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы:

1. Вартанов С. С., Павлов А. Р. , Ярополов А. И. Регуляция активности альдозоредуктазы хрусталика глаза. Негиперболическая кинетика окисления NADPH глюкозой. \\ Биохимия, 1990, т. 55, № 11, с. 2045 - 2057.

2. Вартанов С. С., Павлов А. Р., Ярополов А. И. Регуляция активности альдозоредуктазы. Влияние эффекторов на обратимую изомеризацию фермента. \\ Биохимия, ¡991, № И, с. 2230 - 2242.

3. Павлов А. Р., Вартанов С. С., Ярополов А. И. Альдозоредуктаза из хрусталиков крупного рогатого скота. Обратимая изомеризация фермента в ходе реакции. \\ Тезисы доклазов 7-го Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, Москва, апрель 1991, с. 50.

4. A. R. Pavlov, S. S. Vartanov and A.!. Yaropolov Aldose reductase from bovine lens: reversible i someri zation of the enzyme during catalysis. \\ Russian Biochemistry & Biotechnology, 1991, v. 1, № 2/3, p. 16

Принята к публикации одна печатная работа:

Вартанов С. С., Павлов А. Р. , Ярополов А. И. Регуляция активности альдозоредуктазы. Механизм действия активированной формы фермента, \\ Биохимия.

Подписано в печать 14.08.91г. Заказ 594 Формат 60x90/16 Тираж 100

Москва, Типография ВАСХНИЛ