Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и функциональный анализ нового АБК-регулируемого гена и кодируемого им белка из Lupinus luteus

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выделение и функциональный анализ нового АБК-регулируемого гена и кодируемого им белка из Lupinus luteus"

На правах рукописи

Демиденко Артем Владимирович

Выделение и функциональный анализ нового АБК-регулируемого гена и кодируемого им белка из Ьиртия 1Шет

03.01.05-физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

004606989

Работа выполнена в Лаборатории экспрессии генома растений Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, г. Москва

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор биологических наук, профессор, Кандидат биологических наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится «22» июня в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д.35.

Факс: (495) 977 80 18, электронная почта: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К А Тимирязева РАН.

Автореферат разослан "¿4" мая 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

Кузнецов Виктор Васильевич Кудрякова Наталья Васильевна

Клячко Нелла Леопольдовна Соловьев Александр Александрович

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с тем, что растениям свойственен прикрепленный образ жизни, они должны приспосабливаться к многочисленным внешним воздействиям и соответствующим образом координировать свой рост и развитие. Растительные гормоны - группа различных по структуре малых молекул -являются центральными сигнальными единицами в процессе интеграции различных стимулов окружающей среды с генетической программой растений. Большинство гормонов вовлечено во множество различных процессов в течение роста и развития растений (Кулаева., Прокопцева, 2004; Алехина и др, 2005; De Smet et al, 2006).

Единая картина гормонального сигнапинга пока не создана, и, несмотря на то, что было предпринято немало попыток объединения имеющихся данных, современная модель представляет собой набор условно связанных фрагментарных путей регуляции, относящихся к индивидуальным гормонам, и лишь в немногих случаях описаны взаимодействия элементов регуляторных систем от двух и более гормонов. Однако все возрастающее количество данных указывает на то, что гормональная регуляция у растений организована не в виде линейных, изредка пересекающихся путей, а в виде общей сети, узлы которой, связанные с ответами на различные стимулы, находятся в постоянном взаимодействии между собой (Santner and Estelle, 2009).

Одним из наиболее важных направлений в физиологии растений, имеющим фундаментальное и прикладное значение, является изучение механизмов толерантности растений к стрессовым условиям окружающей среды. Абсцизовая кислота (АБК) играет ключевую роль в регулировании механизмов обеспечения устойчивости к широкому спектру стрессов окружающей среды (Addicott, 1983), а также к биопатогенам. АБК отвечает за устойчивость к засухе, повышенной засоленности и холодовому стрессу, т.о. позволяя растениям колонизировать экологические ниши, где доступность воды крайне ограничена, либо непостоянна. Существуют предположения, что в 21 столетии недостаток воды станет одной из наиболее тяжелых проблем окружающей среды. В связи с этим, модификации в биосинтезе и восприятии АБК также привлекают внимание как потенциальные меры повышения устойчивости злаков и других сельскохозяйственных культур к засухе (Wasilewska et al., 2008; Sirichandra et al., 2009).

Недавно, в связи с обнаружением эндогенной АБК у различных видов многоклеточных животных, была описана значимость этого гормона для организмов, принадлежащих к другим биологическим царствам (Puce et al., 2004, Bruzzone et al., 2007), что позволяет предположить значительное родство и консервативность сигнальных механизмов, изучение которых на растительных объектах также позволит сделать вклад в общее знание о сигнальных системах живых организмов в целом.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение физико-химических свойств и биологической активности белка, кодируемого АБК- и цитокинин-зависимым геном CIP2.1.

В соответствии с поставленной целью были выдвинуты следующие задачи:

1. Выделение и характеристика АБК-регулируемого гена CIP2.1 из генома Lupinus luteus.

2. Структурный анализ белка, кодируемого геном CIP2.1. Биоинформационный поиск гомологов гена С1Р2.1 в других растительных геномах.

3. Получение рекомбинантного белка, представляющего собой фрагмент CIP2.1. Изучение его физико-химических свойств in vitro.

4. Получение и очистка поликлональных антител к фрагменту белка CIP2.1.

5. Тест на связывание с АБК - исследование с помощью аффинной хроматографии и методов ИФА с анти-идиотипическими антителами к АБК.

6. Изучение с помощью полученных поликлональных антител динамики содержания белка CIP2.1 в люпине и его гомологов в Arabidopsis thaliana под воздействием гормонов и абиотических стрессов.

7. Изучение регуляции экспрессии генов-гомологов гена С1Р2.1 в растениях Arabidopsis thaliana (с использованием данных об экспрессии этих генов на уровне мРНК, доступных в базах коллективного пользования).

8. Получение и отбор чистых линий инсерционных мутантов по отдельным генам-гомологам CIP2.I из A. thaliana и морфофизиологический анализ полученных линий.

Научная новизна работы. Впервые выделен и охарактеризован неизвестный ранее АБК- и цитокинин-регулируемый ген (CIP2.1) из Lupinus luteus и кодируемый им белок. Найдены гомологи C/P2.I в 22 геномах различных растений (как

двудольных, так и однодольных). Показана консервативность структуры изучаемого белка С1Р2.1 и близких ему белков.

Получена и аффинно очищена фракция кроличьих высоко специфичная к рекомбинантному Ыр154Гг.

Методами аффинной хроматографии и твердофазного ИФА показано, что фрагмент белка С1Р2.1 - а'р 154й- - способен связывать АБК, ковалентно сшитую с сефарозой, а также антиидиотипические антитела к АБК, что характеризует полный белок С1Р2.1 как АБК-связывающий и является важным доводом в пользу участия этого белка в сигналинге или метаболизме АБК.

Для С1Р2.1 и его гомологов из АгаЫс1ор$1$ IИаИапа показана положительная регуляция на уровне мРНК и на уровне белковых продуктов в ответ на обработку АБК и на воздействие таких абиотических стрессов, как засоление и гипотермия.

Описаны мутанты по генам гомологов С1Р2.1 из АгаЫ(1ор$'13 ¡¡¡аНапа (А1^21670 и АМ^1870). Мутантные растения обладали измененными реакциями на АБК - фенотип по состоянию устьиц и боковых корней имитировал ответ на-АБК в отсутствии гормона, что подчеркивает участие изучаемой группы генов в АБК-сигналинге.

Практическое значение работы. Полученные в диссертационной »работе результаты имеют фундаментальное и прикладное значение. Данные о гене С1Р2.1. из 1мрти$ Ыеш и о его гомологах из других растений могут быть использованы при подготовке лекционного материала по физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений. Устойчивость растений к абиотическим стрессам является признаком, имеющим практическую ценность. Выявление генов, экспрессия которых изменяется в ответ на воздействие абиотических стрессов, позволит дополнить информацию о механизмах устойчивости растений к ним. В перспективе возможно применение генно-инженерных подходов с использованием данных диссертационной работы для получения растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), Конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии»

(Ростов-на-Дону, 2006), Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), Международной конференции «Физико-химические основы структурно функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), Международной конференции "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера", (Апатиты, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит ^таблиц и ¿^рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись проростки Lupinus luteus, растения дикого типа Arabidopsis thaliana экотипа Colambia-0 и инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana экотипа Colambia-0 по генам Atlg21670 и At4g01870.

Условия выращивания растений. Растения Lupinus luteus выращивали в климатической камере при 23°С в кюветах на увлажненной фильтровальной бумаге в темноте, либо при постоянном освещении 120 мкмоль квантов/(м2*с). Растения Arabidopsis thaliana выращивали в почвенной, либо в стерильной культуре (1/2 среды Мурасиге—Скуга) в климатической камере при 23°С и освещенности 120 мкьоль квантов/(м2*с) в условиях длинного светового дня (8 ч темнота, 16 ч свет). Возраст растений считали в днях после прорастания.

Методы исследования.

Обработка гормонами. Проростки люпина обрабатывали абсцизовой кислотой (АБК, 76 мкМ) и цитокинином (БАП, 22 мкМ). Инкубацию с гормонами проводили в темноте, либо на свету, в кюветах.

Выделение ДНК из различных образцов и ПЦР-анализ проводили в соответствии с методическим руководством (Маниатис и др., 1984). TAIL-PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR) проводили как указано в работе авторов метода (Liu et al., 1995).

Выделение РНК проводили с реактивом TRIZOL (Chomczynski et al, 1987). Дифференциальный дисплей и Nothern-блоттинг проводили как указано в более ранней работе нашей лаборатории (Chereptieva et al., 1998). Секвенирование проводили на оборудовании Applied Biosystems в ЗАО "Синтол" (Москва).

Для биоинформационного анализа были использованы следующие программы и он-лайн ресурсы: NCBI (Nacional center of bioinformatics, USA, www.ncbi.nlm.nih.gov), T1GR-TG1 (The Instittute of genome research - The Gene Indices, compbio.dfci.harvard.edu/tgi), EMBL-EBI (European Molecular Biology Laboratory -European Bioinformatics Institute, www.ebi.ac.uk), TAIR-ABRC (The Arabidopsis Information Resource - Arabidopsis Biological Resource Center, www.arabidopsis.org), NASC (European (Nottingham) Arabidopsis Stock Centre, arabidopsis.info), CDD (Conserved Domain Database, www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd), Pfam (Protein families database, http://pfam.sanger.ac.uk/), EXPASY.ORG (Gasteiger et al., 2005), программный пакет VectorNTI Suite 9 (Invitrogen), программа CN3D (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml).

Клонирование последовательности CIP2.1 в векторе для экспрессии pQE-30, трансформацию штамма E.coli Ml5, экспрессию рекомбинантного белка и аффинную очистку на Ni-NTA сефарозе проводили в соответствии с руководством производителя QIAexpress Kit (QIAGEN). Иммунизацию кроликов рекомбинантным белком cipl54fr и получение специфической поликлональной сыворотки проводили, как описано в литературе (Егоров и др., 1991). Выделение фракции IgG проводили на ProteinG-Sepharose (Sigma) в соответствии с руководством производителя. Выделение специфической к cipl54fr фракции IgG проводили с помощью метода «истощения» (Rybicki, 1986).

Определение АБК-связывающих свойств рекомбинантного белка cip!54fr проводили на АБК-конъюгированной сефарозе 4В. Подтверждение специфичности связывания белка с гормоном проводили с помощью различных методов твердофазного ИФА (взаимодействие с антиидиотипическими антителами к АБК -аиА'ГАБК, вытеснение гормоном аиАТДЕК, конкурентное связывание с АБК в системе с антителами к АБК).

Инсерционные мутанты A.thaliana Col-О по генам-гомологам CIP2.1 -At4g01870 и Atlg21670 - были получены из банков семян ABRC (arabidopsis.org) и

NASC (arabidopsis.info). Отбор чистых линий проводили с использованием двух праймеров к соответствующему гену, фланкирующих область вставки, и двух праймеров на область вставки - ее левую и правую границу. Праймеры подбирали с помощью VectorNTI Suite 9 (Invitrogen).

Морфофизиологический анализ мутантов A.thaliana. Проводили оценку потери влаги розеточными листьями мутантных растений в сравнении с диким типом; визуальную оценку развития корневой системы мутантов выращенных на вертикальной агаризованной среде; оценку удлинения корней в присутствии АБК различных концентраций. Указанные тесты являются классическими подходами для оценки чувствительности растений к АБК (Vogel et al., 1998; Shen et al., 2006; Iwama et al„ 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и первичная характеристика гена. Известно, что растения на ранних стадиях развития являются очень чувствительными к действию различных фитогормонов, поэтому для обнаружения новых гормон-регулируемых генов были выбраны молодые проростки люпина желтого (Lupinas luteus L.). Из различных вариантов, контрольных растений и растений, которые были предварительно обработаны фитогормонами (АБК и цитокинином), была выделена тотальная РНК и методом дифференциального дисплея проводился поиск гормон-регулируемых мРНК. Одна из попавших в поле нашего зрения мРНК в значительной степени положительно регулировалась абсцизовой кислотой (АБК, 76 мкМ) и незначительно подавлялась цитокинином (БАП, 22 мкМ). Соответствующая ей полноразмерная кДНК была выделена, клонирована и секвенирована. В связи с тем, что обработка цитокинином снижала содержание обнаруженной мРНК, кодирующий ее ген был назван CIP2. /(cytokinin-inhibited protein 2.1 - по продукту, кодируемому этим цитокинин-ингибируемым геном, размер гена - около 2100 п.о.). Однако, поскольку эффект АБК был более значителен (рис. 1Б), дальнейшая работа была сконцентрирована на изучении эффектов абсцизовой кислоты. Ген представлен одной копией в геноме люпина желтого, что было показано методом Саузерн-гибридизации.

А.

1200

А 1ППП

С

о

ши

(7

с вии

о

400

X

б 200

0

Л

□ 5 дней ■ В дней

лист семядоли гипокотиль корень

Б.

1400 1200 1000 800 600 400 200 О

В темн. □ све

1

я ё

ПЫ; [пгк 1я

ш т < ш ш < ш

т- N N «

си < ш ш < из

С помощью праймеров, подобранных к границам последовательности кДНК, была секвенирована последовательность гена С1Р2.1, что при сравнении с кДНК показало, что выделенный ген не содержит интронов. Методом Нозерн-гибридизации было проведено исследование динамики мРНК изучаемого гена. Показано, что ген экспрессируется преимущественно в семядолях на ранних стадиях развития проростков люпина желтого (рис. 1А). Экспрессия гена чувствительна к свету - активация гена под влиянием АБК на свету была выражена в меньшей степени.

2. Биоинформационный анализ. Для того чтобы выяснить имеет ли изучаемый нами белок

с

Рис. 1. Определение содержания матричной РНК близкородственные белки С1Р2.1 в пробах из ¿ир/пю Ыеш методом Нозерн-

гибридизации. Оценка проведена с помощью известной функцией или несет

1п^еС>иаЩ ТЬ, (ОЕ НеМсаге) по оптической какие-либо известные плотности полос. ОПС-оптич. плотность

сигнала; ОПФ - оптич. плотность фона. функциональные домены, нами

А. Проростки 5- и 8-дневного возраста. был предпринят анализ белка с

Содержание мРНК С1Р2.1 в различных органах. помощью различных

Б. Проростки 8-дневного возраста. Обработка биоинформационных Интернет. гормонами. В - контроль (вода); А —

АБК(76 мкМ); Б - (БАП, 22 мкМ) ресурсов. Поиск по гомологии в базах данных обнаружил наличие близких к С1Р2.1 экспрессируемых последовательностей (Е8Т-1а§5) в 22 растительных геномах (как двудольных, так и

однодольных). С помощью программного инструментария, использующего различные алгоритмы BLAST, доступного на сайтах таких Интернет-проектов, как NCBI, TIGR-TGI, EMBL-EBI, по гомологии с С/Р2.1 в полностью секвенированном геноме Arabidopsis thaliana были выявлены три гена с неизвестной функцией (At4g01870, Atlg21670, Atlg2!680), обладающие наибольшей степенью сходства с исследуемым геном из Lupinus luteus- инсерционные мутанты по двум из этих генов были получены и использованы в дальнейшей работе. В результате проведенного биоинформационного анализа последовательностей генов CIP2.1 и его гомологов в других видах растений, а также последовательностей кодируемых ими белков (рис. 2), была выявлена высокая степень их межвидового сходства, что говорит в пользу консервативности функции этой группы белков.

Транслированные (еккые гшсл-ш AWgOl 870 All 921670 TG! _se<L_Gtyía sttüva TGI_icq_Aqu¡teg¡a T GL,$cq_Lacluca íeliva TG!_*<f4_Lyc0Pfil»I:on cscufrr.tun;

TGI_teq_uolato TG}_scq_Sorgum f GI:e.|_Pim: TQI ieq.Biotucá naput

TGI_<eq_rMCOtiana TCI_»c4_Víni* Víratela

: 5^.6% MáñUyr

Рис. 2. Сравнение с помощью алгоритма AlignX транслированных последовательностей из геномов различных растений демонстрирует очень высокую межвидовую степень консервативности исследуемых белков. Цветовая маркировка: светло-серый - абсолютная консервативность (помечено звездочками); серый - высокая степень консервативности; темно-серый - низкая степень консервативности (либо замена высоко-консервативной аминокислоты без существенного изменения локальных характеристик последовательности). Сокращения: TGI_seq - префикс, поясняющий, что последовательность белка или его фрагмента получена с помощью web-pecypca The Gene Index Project. После префикса даны видовые или родовые названия источников (растений), из генома которых были получены эти последовательности в качестве EST (Expression sequence tags). Первыми двумя строчками даны последовательности генов-гомологов С1Р2. / из Arabidopsis thaliana.

Также были найдены факты, говорящие в пользу консервативности структуры этих белков: в ряде доступных в настоящее время полных последовательностей, проанализированных с помощью ресурса InterPro, было показано наличие функционально значимых аминокислотных повторов Р040-типа, составляющих основу для построения третичной бета-пропеллерной структуры. Для многих белков с известной функцией показано, что данная структура может выполнять функцию

«белковой платформы», на базе которой может происходить сборка различных белковых комплексов. С помощью базы консервативных доменов CDD (Conservative Domain Database) определен ближайший гомолог с известной структурой и функцией, белок TolB из E.coli (рис. 3).

1 125 250 375 500 625 652

а>- .......I.......I...........................................

Рис. 3. Расположение консервативных доменов в последовательности белка гена At4g01870 (такое же расположение доменов свойственно и Atlg2I670).

а). Домены, распознанные в составе последовательности базой CDD (Conservative Domain Database). TolB - области белка At4g01870, гомологичные белку TolB Е. coli. DPP IV - области белка At4g01870, гомологичные с дипептидилпептидазой IV типа.

б). Бета-пропеллерная структура бактериального TolB белка: темным цветом отмечены области гомологии с белковыми последовательностями At4g01870 и Atlg21670.

TolB участвует в структурно-функциональнй организации Tol-Pal системы бактериальной клетки, предназначенной для защиты клетки от проникновения пептидных токсинов (колицинов), а так же для поддержания водно-солевого обмена клетки бактерии (Bonsor et al., 2009). Также было выявлено частичное сходство их С-концевой части с дипептидилпептидазой IV типа (DPP IV), однако сохранение функции пептидазы требует дополнительной экспериментальной проверки.

PTS Нроиотор + 2xLacO

/* cip i 54&-1ЮДНрукш(ая

^ ^ иосясдовательность

Рис. 4. Схема вектора pQE-30 (Qiagen), экспрессирующего белок cip 154fr.

рОЕ-ЗО (Qiagen) (рис. 4).

Полноразмерная кДНК (2137 п.о.), полученная из фаговой библиотеки экспрессирующихся последовательностей люпина желтого (созданной ранее), была проклонирована в векторе рВ1ие8спр1 II К8+ (81га1а§епе) по сайту £с0Ы.

Затем с помощью ПЦР, в котором в один из праймеров был введен сайт рестрикции ВатН\ заменой одного нуклеотида А->С, а в качестве второго праймера был использован стандартный для этого вектора праймер ТЗ, был получен фрагмент с одной заменой в положении 241 исходной кДНК. Этот фрагмент был рестриктирован по

3. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка и получение антител к нему. С целью получения поликлональных антител для изучения экспрессии гена CIP2.1 на уровне белка, а также для изучения физико-химических свойств самой белковой молекулы CIP2.1 нами была предпринята попытка получить рекомбинантный белок в E.coli.

Экспрессирующая конструкция была получена на базе вектора

M

!m20 1ш20+рН6 M15

93 Юа ббкВа

3QK03Î

шёш

А

Рис. 5. Результаты очистки рекомбинантного белка cipl54fr с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA Sephapose (Qiagen).

M — низкомолекулярный белковый маркер (Amersham); Im20 - элюция в денатурирующих условиях 8 M мочевиной рН 8.0 с 20 мМ имидазолом; Im20+pH6.0 - элюция в денатурирующих условиях 8 M мочевиной рНб.З с 20 мМ имидазолом; MI5 - тотальный белок, выделенный из бактерий штамма M15, несущих pQE30+cipl54fr, после индукции 1PTG.

введенному сайту ВатНХ и сайту Hindill, присутствующему в MCS-зоне (multiclonmg site) вектора и клонирован по этим сайтам в векторе pQE-30. Однако экспрессии белка, соответствующего этому фрагменту добиться не удалось, вероятно, по причине токсичности продукта для Е. coli. Для получения конструкции, экспрессирующей белок меньшего размера, была удалена 3'-область последовательности при помощи рестрикции по сайту С1а\ (внутренний сайт рестрикции, нативно присутствующий в CIP2.1) и сайту WwdIII (MCS-зона вектора pBlueScript II KS+). После рестрикции полученные «липкие концы» были обработаны экзонуклеазным фрагментом полимеразы Кленова и лигированы. В результате в векторе pQE-30 остался фрагмент длиной 429 п.о., соответствующий области 237-665 п.о. исходной кДНК, что вместе с участком, кодирующим 6xHis и «линкер», составило 462 п.о. Этот участок успешно был экспрессирован в гетерологической системе: в штамме Е. coli Ml5.

M PGA Serum Экспрессируемый белок

93kOa ^^^^ представлял собой рекомбинантный

86 kOa ШЁШ ЩШшш фрагмент белка CIP2.1, содержащий

45KD3 iЯЁЁ ЩИР BRI 6xHis, размером 154

аминокислотных остатка и 30 Юа « молекулярной массой 17,5 кДа

(рис. 5). Полученный

рекомбинантный белок очищали от примесей других белков клеток Е. coli MI5 с использованием аффинной хроматографии на Gravity Flow-колонке с Ni-NTA-Sepharose

20.1 kOa

14.4 kOa

Рис. 6. Полученный препарат очищенных (Qiagen).

антител к cipl54fr. PGA - белок, _

n t • г- с и С помощью варьирования

элюированныи с колонки ProtemG-bepharose r г

- фракция IgG; Serum - сыворотка после концентрации конкурентного

прохождения через ProteinG—Sepharose - тест „ 1Т.

, заместителя 6xHis метки —

на полноту связывания иммуноглобулиновои

фракции. имидазола - с различными

значениями рН отмывочного раствора (в конечном итоге были выбраны: 20 мМ имидазол и рН 6,3), удалось добиться чистоты получаемого рекомбинантного белка, близкой к 100% (оценку чистоты препарата белка проводили по отношению

плотности специфических полос на геле к плотности всего трека в программе ImageQuant TL, (GE Helthcare).

С использованием полученного рекомбинантного белка проводили иммунизацию кроликов. После развития вторичного иммунного ответа, отбирали кровь и получали сыворотку. Из полученных сывороток аффинной хроматографией на Protein G-Sepharose были выделены иммуноглобулины типа G (IgG). Из полученного препарата IgG методом истощения на мембране с сорбированным CIP2.1 была выделена фракция иммуноглобулинов, преимущественно взаимодействующая с изучаемым белком (рис. 6).

4. АБК- связывающие свойства CIP2.1. Целью данного этапа работы являлось исследование АБК-связывающих свойств рекомбинантного фрагмента белка. Белок был очищен путем аффинной хроматографии на Ni-NTA-Sepharose (Qiagen) до чистоты порядка 99%, что было оценено компьютерным расчетом оптической плотности на электрофорезном геле.

Полученный препарат очищенного белка был нанесен на аффинную колонку с Sepharose 6В, ковалентно связанной с АБК. 100% белка связалось с колонкой, что было продемонстрировано при промывке колонки с помощью буфера высокой ионной силы (содержащего 200 мМ NaCl). Белок полностью элюировался с колонки раствором, содержащим 0.2 М NaOH (рис.7а). Фракции, полученные с колонки, были сорбированы на полистироловые планшеты Costar серии HiBond.

Для дополнительного подтверждения АБК-связывающих свойств рекомбинантного белка методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием антиидиотипических антител к АБК было продемонстрировано их высокоспецифическое связывание со 154-аминокислотным фрагментом изучаемого белка CIP2.1, что явным образом указывает на АБК-связывающие свойства последнего. Чтобы продемонстрировать специфичность данного связывания параллельно с тестами на связывание с антиидиотипическими антителами были проведены тесты на связывание с преиммунной сывороткой и сывороткой, имеющей другую специфичность - в нашем случае в качестве второй сыворотки использовались антитела к конъюгату зеатин—БСА

-г 0,090

0.9 0.8

§ 0,6 ^0.5 0 0.4 | 0.3 О 0.2 0.1 0

0,040

0,030

0,000 -и—I—I—I——I—I——|——»—I—I—I—I—I—I—I—I—I— 0,020

1011 121314 15^1718 192021 222324 25 26 27 28 29 3031 32

А.

*

1

н

ад

— В&

10л-5 10л-6 10л-7 0 н/и Концентрация АБК, М

^ ^ *

В.

Концентрация АБК, М или объем ар154й-(пик)

Рис. 7. Подтверждение АБК-связывающих свойств рекомбинантного белка С[р154й-. А. Аффинная хроматография и ИФА с аиАТ к АБК, Левая ордината — Опт.пл.(ОФД) 490 нм (все реакции с АТ): правая ордината - показания увикорда, Опт.пл. 280 нм; ось абсцисс - номера фракций (4 мл), собранные с колонки с АБК-сефарозой. С 1-ой по 16-ю фракцию - отмывка избытка и неспецифики буфером высокой ионной силы, с 16ой фракции - элюция 0,2М ИаОН.Б. Прямая система вытеснения (сорбирован С1р 154Гг из пика, гормон вытесняет аиАТ к АБК из комплекса с с:р154Гг); В. Конкурентная система вытеснения (сорбирован АБК-овальбумин, гормон, либо С1р154й" вытесняют АТ к АБК из комплекса с АБК-овальбумином)

В этих двух контрольных вариантах взаимодействие С1Р2.1 с антителами методом ИФА не детектировалось, что дополнительно указывает на специфичность взаимодействия изучаемого белка с АБК, в особенности, в совокупности с данными, полученными по специфическому связыванию белка С1Р2.1 с АБК-конъюгированной сефарозой. Кроме того, для дополнительного подтверждения специфичности взаимодействия АБК с рекомбинантным белком С1р154й", были поставлены опыты на базе ИФА по конкурентному связыванию АБК с <ар154&. В т.н. «прямой системе» (рис. 76) на планшеты был сорбирован с1р154й-, полученный из фракций пика, полученного при аффинной хроматографии на АБК-конъюгированной сефарозе. При этой постановке гормон вытеснял аиАТ к АБК из комплекса с С1р 154й") - большие концентрации гормона вытесняли антитела из комплекса с Сф154й\ что еще раз доказывает специфичность взаимодействия АБК с рекомбинантным белком с1р1541х. В «конкурентной системе» (рис. 7в) на планшеты был сорбирован АБК-овальбумин, при этом различные концентрации АБК, либо различные количества С1р154(т, полученного из пика элюции, вытесняют АТ к АБК из комплекса с АБК-овальбумином. Показана количественная зависимость взаимодействия рекомбинантного белка ар154Сг с сорбированым АБК-овальбумином, что опять же указывает на специфичность взаимодействия гормона с изучаемым белком.

Таким образом, доказаны АБК-связывающие свойства фрагмента белка С1Р2.1 - с!р 154Й-, что может характеризовать полный белок, как АБК-связывающий и является важным доводом в пользу участия этого белка в сигналинге или метаболизме АБК.

5. Изучение экспрессии С1Р2.1 Ьир'шиь /и/еиь и его генов-гомологов из А гаЬЫоръ'н 11гаИапа (А1^21670 и А14801870) на уровне мРНК и белка.

С помощью полученных на ранних этапах работы

специфических антител к белку С1р1541Гг изучали экспрессию этого гена на уровне белка.

О ч 5 ч 24 ч 48 ч Ш А \У А А

Рис.8. Накопление белка С1Р2.1 в семядолях 3-дневных растений Ыр'тт 1ыет в ответ на обработку абсцизовой кислотой. XV - контроль (вода); А - АБК(76 мкМ)

Предполагалось выяснить, сохраняется ли органно-специфичность экспрессии, показанная ранее на уровне мРНК Нозерн-блоттингом (рис. 1), на уровне содержания изучаемого белка под воздействием абиотических стрессов, в обеспечении ответа на которые, как известно, вовлечена абсцизовая кислота

По результатам твердофазного ИФА и вестерн-блотов с антителами к С1р 154П-выявлено сохранение органо-специфичности экспрессии гена С1Р2.1 Ьир1пш \uteus на уровне белка и показано АБК-зависимое накопление белкового продукта С1Р2.1 в семядолях (рис.8), что соответствует данным, полученным ранее на уровне РНК. Также было изучено изменение содержания белка С1Р2.1 в ответ на такие абиотические стрессы, как гипотермия и засоление - показано накопление изучаемого белка в семядолях в ответ на эти стрессы (рис.9).

м

к+

ЭЗШа , ббкОа

150тМ №С1

корни 24 ч 72ч

150тМ №С! семядоли 24ч 72ч

Холодовой стресс (Л;) семядоли 24ч 72ч

'йшрх- ФШШ

Контроль

корни 24 ч 72 ч

Контроль семядоли 24 ч 72ч

45кОа М

ЗОкОа 1

■23

20к0а

14к0а :#«тДИ

С1ог-

1-С1-ЫарМо1 +рвгох1ба5в

Экспонирование на фотопленку по методу с люминолом (ЕСЦ

Рис.9. Индуцируемая экспрессия С1Р2.1 в ¡0-дневных проростках в ответ на абиотические стрессы (гипотермию и засоление). М - низкомолекулярный белковый маркер (АтегБИаш); К+ - положительный контроль специфического связывания антител (взаимодействие с С1р154Гг).

Кроме того, получены предварительные данные, характеризующие экспрессию на белковом уровне генов-гомологов С/Р2.1 из АгаЫ&р$1$ ¡ИаИапа - At¡g21670 и At4g0I870 - продемонстрировано наличие продуктов в диапазоне ожидаемых

молекулярных масс в 7- и 16-дневных растениях, а также усиление сигнала в ответ на обработку АБК и воздействие комплексным абиотическим стрессом «засоление+гипотермия». Также методом ИФА на полистироловых планшетах показана суточная динамика белка из Arabidopsis thaliana, взаимодействующего с антителами к cip!54fr - показано наличие суточного максимума и минимума (данные приводятся в диссертации).

Полученные предварительные результаты хорошо соотносятся с данными, полученными нами в результате обработки информации из Интернет-баз коллективного пользования, где представлены результаты экспериментов с использованием полногеномных ДНК-микрочипов производства фирмы Affimetrix. При помощи программных ресурсов (Microarray Expression Search), доступных он-лайн на сайте проекта TAIR (http://www.arabidopsis.org) было выявлено, что изменение экспрессии исследуемых генов-гомологов CIP2.1 связаны с эмбриогенезом и ранними стадиями развития проростков A. thaliana, с действием холодового стресса, с засолением, а также было выявлено различное содержание мРНК С1Р2. /-подобных генов в разных органах растения. Полученные данные по экспрессии изучаемых генов Arabidopsis thaliana на уровне мРНК дали подтверждение гипотезе о гомологии генов CIP2.1 с Atlg21670 и At4g01870, так как наряду с высоким сходством последовательностей ДНК были выявлены сходные профили экспрессии - усиление уровня транскрипции под воздействием АБК и абиотических стрессов, таких как гипотермия и засоление (Рис. 10, на примере одного из генов At4g01870). Это дает основание предположить сходные функции исследуемых генов в растениях.

Рис. 10. Экспрессия одного из генов-гомологов CIP2.I - At4g0l870 - в ответ на гипотермию в корнях 18-дневных проростков A.thaliana в ответ на засоление -150 мМ NaCl (А), и в ответ на гипотермию - 4°С (Б). Данные Affimetrix 25К.

6. Изучение инсерцнонных мутантов по генам-гомологам С1Р2.1. В ходе изучения физиолого-биохимической роли АБК-активируемого белка CIP2.1 из люпина желтого (Lupinus luteus) и его гомологов в других растениях также были проанализированы морфо-физиологические реакции двух мутантных линий A. thaliana, в каждой из которых был инактивирован один из двух обнаруженных генов-гомологов С1Р2.1. Семена растений с инактивированными генами At4g01870 и Atlg21670 были получены из банков семян ABRC(USA) и NASK(UK) - семена растений с инактивированным Atlg2J680 не были найдены в банках семян.

Определение растений «чистой линии» по вставке в гены Atlg21670 и Aí4g0l870 проводили с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими область слияния Т-ДНК с целевым геном и ПЦР с праймерами, фланкирующими область вставки. Однако четкое подтверждение гомозиготности вставки было получено лишь для линии с инсерцией в Atlg21670. Подобное подтверждение, однако, не-удалось получить для линии со вставкой в ген At4g01870. Несмотря на использование стандартных последовательностей праймеров, взятых с сайтов ABRC(USA) и NASK(UK), не был получен продукт ПЦР на область слияния Т-ДНК с целевым геном, хотя вставка Т-ДНК в геноме предполагаемого инсерционного мутанта по гену At4g0l870 наследовалась, что было подтверждено ее ПЦР с праймерами на внутреннюю область вставки в нескольких поколениях растений. В связи с возникшими проблемами определения гомозиготности вставки предполагаемый инсерционный мутант по гену At4g01870 был исключен из последующих исследований до экспериментального подтверждения, либо опровержения наличия аннотированной на сайтах ABRC(USA) и NASK(UK) мутации.

С целью получения более подробных данных о возможных функциях in vivo белка CIP2.1 мы исследовали ряд физиологических ответов, определяемых АБК, таких как прорастание семян, переход к цветению, старение листьев, ответ на обезвоживание, а также удлинение корней и рост гипокотилей под влиянием гормонов у мутантных растений с инсерцией в Atlg2l670.

АБК, как известно, задерживает прорастание семян, и эта реакция видоизменена у мутантов по передаче сигнала АБК, проявляющих гипо- или гиперчувствительность к АБК (Chen et a!, 2006). Однако ингибирующий эффект экзогенной АБК был идентичен у изучаемых мутантов и у контрольных

немодифицированных растений арабидопсис зкотипа Со1шпЫа-0, и эти данные позволяют предполагать, что АБК регулируемые гомологи белка С1Р2.1, возможно, не принимают участия в каноническом пути передачи сигнала АБК в семенах. Также нами не было обнаружено достоверных отличий от дикого типа по времени перехода к цветению, а также изменению сроков появления цветоносов и числа розеточных листьев в ответ на опрыскивание проростков абсцизовой кислотой в течение трех недель. Т.о., наши результаты позволяют предполагать, что мутация гена А1^21670 не включена передачу сигнала АБК в автономном пути цветения, где участвует предполагаемый рецептор АБК - БСА (Яагегп е1 а1., 2006).

Однако значительные фенотипические отличия были получены нами в опытах по дегидратации листьев и развитию корневой системы. Срезанные розетки линии АН £21670 проявили повышенную устойчивость к дегидратации, тесту, характеризующему функционирование устьиц, и, подобно АБК-нечувствительному мутанту АгаЫс1ор518 gип5, практически не изменили скорость потери воды в ответ на предварительное опрыскивание интактных растений АБК (Рис.11). Но стоит отметить, что уровень потери воды у &т5 соответствовал уровню потери воды диким типом в отсутствии АБК, тогда как для растений инсерционной линии А^21670 был характерен уровень потери воды диким типом в присутствии АБК.

2 3 4 5 6 Время, часы

н,о

2 3 4 5 6 Время, часы

АБК

Рис. 11. Тест на функционирование устьиц. Потеря воды срезанными розеточными листьями 7-недельных инсерционных мутантов А. ОюНапа на воде и после обработки АБК (5* 10"5М).

В биологическом тесте, где рассматривалось влияние гормонов на удлинение корней, 7-дневные проростки ЛгаШорж были перенесены на вертикально ориентированные агаровые пластины, содержавшие различные концентрации АБК, АЦК, транс-зеатина и ИУК. Через 3 дня роста корней вдоль поверхности агара измеряли величину их прироста. У мутанта по А\.\%2\Ы0 была изменена чувствительность корней к экзогенной АБК, что подтверждается достоверным отличием от дикого типа по удлинению корней в присутствии АБК. Кроме того, даже в отсутствие фитогормонов у этого мутанта формировалось существенно меньше боковых корней, что также является признаком нарушения чувствительности к этому гормону (Рис. 12).

Рис. 12. (А) Влияние АБК на удлинение корней инсерционного мутанта А1^21670 А. ЛаИапа. (Б,В) Фото растений на вертикальных чашках без обработки гормонами.

Изучение инсерционного мутанта по гену-гомологу CIP2.1 из Arabidopsis thaliana Atlg21670 показало, что мутация в этом гене изменяла реакцию растений на АБК. Фенотип мутанта Atlg21670 по состоянию устьиц и боковых корней в отсутствии гормона иммитировал ответ на АБК, характерный для растений дикого типа, что подчеркивает участие данного белка в АБК-сигналинге, возможно, в качестве негативного регулятора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выделен и охарактеризован неизвестный ранее АБК- и цитокинин-регулируемый ген (CIP2.1) из Lupinus luteus, который кодирует белок, состоящий из 647 аминокислот, не имеет интронов и наиболее активно экспрессируется на ранних этапах развития проростков.

Проведен биоинформационный анализ нуклеотидной последовательности гена CIP2.1 и аминокислотной последовательности кодируемого им белка. Найдены его гомологи в 22 растительных геномах (как двудольных, так и однодольных). Показана консервативность структуры изучаемого белка CIP2.1 и близких ему белков. Установлено наличие в их последовательностях функционально значимых аминокислотных повторов PD40-THna, составляющих основу для построения третичной бета-пропеллерной структуры, которая может выполнять функцию «белковой платформы» в образовании белковых комплексов.

Получена конструкция, экспрессирующая фрагмент гена размером 428 нуклеотидов (область 237—665 гена CIP2.1), которая кодирует белок размером 154 аминокислоты (включая 6xHis последовательность) - cip 154fr. Рекомбинантный белок получен в Е. coli и аффинно очищен. Получены кроличьи антитела к cipl54fr. Выделена и аффинно очищена фракция IgG, высоко специфичная к CIP2.1, что позволило проводить анализ экспрессии на уровне белковых продуктов гена CIP2.1 в Lupinus luteus, а также генов-гомологов в Arabidopsis thaliana.

Нозерн-блоттингом показана положительная регуляция содержания мРНК CIP2.1 в растениях Lupinus luteus в ответ на обработку АБК. Накопление матричной РНК этого гена начиналось через несколько часов после обработки гормоном. Такая же динамика ответа на обработку АБК наблюдалась и у гомологов CIP2.1 -генов At4g01870 и Atlg21670 Arabidopsis thaliana. Для CIP2.1 и его гомологов из Arabidopsis thaliana показана положительная регуляция ответа на воздействие таких абиотических стрессов, как засоление и гипотермия, как на уровне мРНК, так и на уровне белковых продуктов.

Кроме того, в работах с инсерционным мутантом, в котором вставкой Т-ДНК был инактивирован гомолог гена CIP2.1 показано, что фенотип мутанта по состоянию устьиц и боковых корней в отсутствии гормона иммитировал ответ на АБК,

характерный для растений дикого типа. Инактивация этого гена-гомолога (Л1^21670) вызывала яркий фенотипический эффект - снижение количества боковых корней. Это отчасти имитирует эффект обработки абсцизовой кислотой растений дикого типа. В мутантах по этому же гену продемонстрирована динамика потери воды срезанными розеточными листьями без обработки АБК, которая характерна для растений дикого типа, обработанных АБК. Исходя из полученных данных, можно предположить функцию этого белка в качестве негативного регулятора ответа на АБК в рамках описанных реакций - в процессе закладки боковых корней и регуляции работы устьиц. Полученные результаты, вследствие высокого сходства по белковой последовательности, могут быть отнесены к гомологу в люпине желтом - С1Р2.1.

Методами аффинной хроматографии и твердофазного ИФА было показано, что фрагмент белка С1Р2.1 - С1р 154Гг - способен связывать АБК, говалентно сшитую с сефарозой, а также антиидиотипические антитела к АБК. Кроме того, специфичность взаимодействия фрагмента белка С1Р2.1 была показана с использованием различных методик вытеснения на базе ИФА. Это доказывает принадлехшость С1Р2.1 к АБК-связывающим белкам, что является важным доводом в пользу его участия в сигналинге или метаболизме АБК

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что С/Р2.1 и гомологичные ему гены с большой вероятностью вовлечены в АБК-сигналинг, а также участвуют в ответе на стрессы, связанные с повышением содержания АБК в клетке, такие как гипотермия и засоление. Одной из предполагаемых функций продуктов изучаемой группы генов является негативная регуляция устьичных ответов и процесса закладки боковых корней.

выводы

1. Выделен и охарактеризован неизвестный ранее АБК- и цитокинин-регулируемый ген (С1Р2.1) из ¿иршц5 ¡Шею, который кодирует белок, состоящий из 647 аминокислот, не имеет интронов и наиболее активно экспрессируется на ранних этапах развития проростков.

2. С помощью биоинформационного анализа показана высокая гомология С1Р2.1-белка с белками из 22 видов растений. Показано наличие в этих белках повторов Р040-типа, составляющих основу бета-пропеллерной структуры, которая может выполнять функцию «белковой платформы» при сборке белковых комплексов.

3. Получена конструкция, экспрессирующая фрагмент гена размером 428 нуклеотидов (область 237-665 гена С1Р2.1), которая кодирует белок размером 154 аминокислоты (включая бхШэ последовательность, кодируемую вектором) -Сф154й\ Рекомбинантный белок получен в Е.соН и аффинно очищен. К этому белку получены поликлональные кроличьи антитела. Выделена и аффинно очищена фракция ^О, высоко специфичная к С1Р2.1.

4. Методами аффинной хроматографии и твердофазного ИФА доказаны АБК-связывающие свойства с!р 154Гг. Это доказывает принадлежность белка С1Р2.1 к АБК-связывающим белкам, что является важным доводом в пользу его участия в сигналинге или метаболизме АБК.

5. Изучена экспрессия С1Р2.1 Ьиртю ¡Шега и его генов-гомологов из АгаЫ^рэ'^ ГИаЦапа (Л11^21670 и А(4$!870) на уровне мРНК. С помощью полученных антител изучено изменение содержания белка С1Р2.1 под воздействием АБК и абиотических стрессов.

6. Мутация в генах АгаЫск>р$и ¡каНапа (АИ%21670 и А14$1870), гомологичных С1Р2.1 изменяла реакцию на АБК. Фенотип мутанта А1^21670 по состоянию устьиц и боковых корней имитировал ответ на АБК в отсутствии гормона, что подчеркивает участие данного белка в АБК-сигналинге, возможно, в качестве негативного регулятора.

7. Суммируя все полученные результаты, можно заключить, что С/Р2.1 и гомологичные ему гены участвуют в АБК-сигналинге, а также в ответе на абиотические стрессы.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Демиденко A.B.. Черепнева Г.Н., Кулаева О.Н., Оельмюллер Р., Кузнецов В.В. Выяснение функциональной роли белка, кодируемого новым гормон-регулируемым геном cip 2.1 люпина желтого. Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». Вологда, 2005.

2. Демиденко A.B.. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Изучение экспрессии генов-гомологов A. thaliana для выяснения функции гена CIP 2.1 люпина желтого. Конференция «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии». Ростов-на-Дону, 2006 г.

3. Демиденко A.B., Кудрякова Н.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Изучение влияния АБК на старение листьев и прорастание семян мутантов Arabidopsis с выключенными генами-гомологами гена CIP2.1 люпина желтого для дальнейшего выяснения его функции. Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», часть 1. Сыктывкар, 2007 г.

4. Каравайко H.H., Демчденко A.B., Кудрякова Н.В., Шевчнеко Г.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. АБК - связывающие свойства белка CIP2.1 люпина желтого. Международная конференция «Физико-химические основы структурно функциональной организации растений», Екатеринбург, 2008 г.

5. Демиденко A.B., Кудрякова Н.В., Каравайко H.H., Шевчнеко Г.В., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Измененные физиологические реакции растений A. thaliana с инактивированными генами гомологов. Международная конференция «Физико-химические основы структурно функциональной организации растений», Екатеринбург, 2008 г.

6. Демнденко A.B., Кудрякова Н.В., Черепнева Г.Н., Оэльмюллер Р., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Участие белков, содержащих WD40-like домены, в ответе растений на фигогормоны и стресс. Известия высших учебных заведений.Северо-Кавказский регион. Естественные науки.2008, № 4, стр.58-61.

7. Демиденко A.B.. Кудрякова Н.В., Кузнецов B.B. Получение двойного мутанта gun5*atlg21670 Arabidopsis thaliana и его фенотипическая характеристика. Международная конференция "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера", Апатиты, 2009 г.

8. Шевченко Г.В., Каравайко H.H., Демиденко A.B.. Селиванкина С.Ю., Зубкова Н.К., Куприянова Е.В., Лось Д.А., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. Обнаружение АБК-связывающих белков в цианобактериях (Synechocystis sp. РСС 6803) Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Агрономия и животноводство. 2010. № 1. С. 13-19.

Подписано в печать:

20.05.2010

Заказ № 3788 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Демиденко, Артем Владимирович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. История открытия АБК.

1.2.Биосинтез АБК.

1.3. Биологическая активность АБК.

1.4. Сигналинг АБК.

1.4.1. Вторичные мессенджеры.

1.4.2. Обратимое фосфорилирование.

1.4.2.1. Протеинкиназы.

1.4.2.2. Протеинфосфатазы.

1.4.3. Белки 14-3-3.

1.4.4. Регуляция транскрипции.

1.4.5. Рецепция.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и объекты, используемые в работе.

2.1.1. Выращивание люпина желтого (.Lupinus lutheus L).

2.1.2. Выращивание люпина в условиях абиотических стрессов.

2.1.3. Выращивание арабидопсис в стерильной культуре.

2.1.4. Выращивание Arabidopsis thaliana в условиях абиотических стрессов или обработки гормоном.

2.1.5. Выращивание растений арабидопсис с инактивированными инсерцией Т ДНК генами для последующего анализа ДНК.

2.1.6. Выращивание растений арабидопсис для экспериментов по изучению прорастания семян на среде, содержащей АБК.

2.1.7. Выращивание растений арабидопсис для экспериментов по изучению старения отделенных листьев.

2.1.8. Выращивание растений арабидопсис для экспериментов по изучению потери воды.

2.1.9. Выращивание растений арабидопсис для экспериментов по изучению удлинения гипокотиля.

2.1.10. Выращивание растений арабидопсис для экспериментов по изучению удлинения корней. ^ ^

2.2. Методы исследований. ^ ^

2.2.1 Методы работы с ДНК и РНК.^

2.2.1.1 Выделение ДНК..

2.2.1.2. Выделение РНК.„.4?

2.2.1.3 Выделение плазмидной ДНК из Е. coli микрометодом. ^ ^

2.2.1.4. Трансформация E.coli плазмидной ДНК.^ ^

2.2.1.5 УФ спекгрофотометрический анализ ДНК.^ ^

2.2.1.6 Полимеразная цепная реакция.^ j

2.2.1.7 TAIL-PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR)..

2.2.1.8 Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.2.1.9 Дифференциальный дисплей.

2.2.1.10. Нозерн-блоттинг и гибридизация.^

2.2.2 Методы работы с белками..

2.2.2.1 Выделение белка.' ^

2.2.2.2. Методы определения концентрации белка.

2.2.2.3 Электрофорез белков в полиакриламидном геле (PAAG).^

2.2.2.4. Окраска геля с помощью красителя Coomassie Blue R250 . ^

2.2.2.5. Вестерн- блоттинг.

2.2.2.6. Предварительная тотальная окраска белка, перенесенного на мембрану, методом с хлорамином Т.

2.2.2.7. Специфическая окраска мембраны методом ECL.

2.2.2.8. Специфическая окраска мембраны методом с хлорнафтолом.

2.2.2.9. Методы «истощения» сыворотки на мембране и различные методы вытеснения в твердофазном ИФА.

2.2.3. Получение и очисткарекомбинантного белка и антител к нему.^

2.2.3.1 Очистка рекомбинантного белка.

2.2.3.2. Получение антител.

2.2.4. Биоинформационные методы (in silico).

2.2.4.1. Использование алгоритмов BLAST для поиска последовательностей, гомологичных белку CIP2.1.

2.2.4.2 Поиск консервативных доменов и определение принадлежности к существующему семейству белков.

2.2.4.3. Трехмерная (3D) структура TolB E.coli и визуализация гомологичных участков с белками из люпина и арабидопсиса.

2.2.4.4. Оценка in silico различных параметров белковых последовательностей.

2.2.4.4. Использование on-line ресурсов для получения данных экспериментов по оценке полногеномной экспрессии A thaliana на микрочипах.

2.2.4.5. Подбор праймеров и построение схем в программе VectorNTI Suite 9 (Invitrogen).

2.3. Приборная база.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение и характеристика АБК-регулируемого гена CIP2.1 из генома Lupinus luteus.

3.2. Структурный анализ белка, кодируемого геном CIP2.1. Биоинформационный поиск гомологов гена CIP2.1 в других растительных геномах.

3.3. Получение рекомбинантного белка, представляющего собой фрагмент CIP2.1. Изучение его физико-химических свойств in vitro.

3.4. Получение и очистка поликлональных антител к cipl54fr.

3.5. Тест на связывание cipl54fr с АБК - подтверждение с помощью аффинной хроматографии и метода ИФА с антиидиотипическими антителами к АБК.

3.6. Изучение с помощью полученных поликлональных антител динамики содержания белка CIP2.1 и его гомологов в Arabidopsis thaliana под воздействием гормонов и абиотических стрессов.

3.7. Изучение экспрессии генов-гомологов CIP2.1 из A.thaliana с использованием данных из баз коллективного пользования.

3.8. Получение и отбор чистых линий инсерционных мутантов по отдельным генам-гомологам CIP2.1 из A.thaliana и морфофизиологический анализ полученных линий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и функциональный анализ нового АБК-регулируемого гена и кодируемого им белка из Lupinus luteus"

В связи с тем, что растениям свойственен прикрепленный образ жизни, они должны приспосабливаться к многочисленным внешним воздействиям и соответствующим образом координировать свой рост и развитие. Растительные гормоны - группа различных по структуре малых молекул — являются центральными сигнальными единицами в процессе интеграции различных стимулов окружающей среды с генетической программой растений. Большинство гормонов вовлечено во множество различных процессов в течение роста и развития растений.

Наши дни - это очень значимый этап в области биологии растительных гормонов, поскольку знания об их биосинтезе, метаболизме, транспорте, восприятии, передаче и ответе на гормональный сигнал выросли экспоненциально за последние несколько лет. Возможность столь стремительного накопления данных была обеспечена благодаря успешному завершению проектов полного секвенирования геномов таких растений, как Physcomitrella patens (мох), Selaginella (папоротник - голосеменные), Arabidopsis thaliana (резушка Таля - двудольные крестоцветные) и Oriza sativa (рис - однодольные), а также существованию EST(expressed sequence tag)-библиотек других растительных объектов, что, в свою очередь, позволило в значительной степени продвинуться в области сравнительной геномики и объединить большой объем разрозненных данных, в том числе касающихся гормональных регуляторных систем.

Единая картина гормонального сигналинга пока не создана, и, несмотря на то, что было предпринято немало попыток объединения имеющихся данных, современная модель на сегодняшний день представляет собой набор условно связанных фрагментарных путей регуляции, относящихся к индивидуальным гормонам, и лишь в немногих случаях описаны взаимодействия элементов регуляторных систем от двух и более гормонов.

Однако все возрастающее количество данных указывает на то, что гормональная регуляция у растений организована не в виде линейных, изредка пересекающихся, путей, а в виде общей сети, узлы которой, связанные с ответами на различные стимулы, находятся в постоянном взаимодействии между собой. Причем характерная для растительных организмов генетическая избыточность еще более усложняет эту систему, что значительно затрудняет выявление в ней новых регуляторных элементов, поскольку в таких случаях фенотипический эффект инактивации одного сигнального элемента может «маскироваться» за счет подмены его функции другими близкородственными элементами.

Но, несмотря на все описанные сложности, нельзя недооценить важности изучения каждого элемента гормональной системы растений и ценности получаемых в результате этого данных. Уже сегодня полученные в этой области знания используются как в фундаментальных исследованиях, так и в прикладных разработках.

Так, изучение пути биосинтеза этилена и его тканеспецифичная блокировка в плодах позволяет повысить их срок хранения. Данные, полученные относительно роли АБК при развитии семени, позволяют разработать условия для сохранения семян зерновых и способы предотвращения вивипарии (преждевременного прорастания). И многие другие прикладные аспекты, как-то: повышение эффективности укоренения растений, техника микроклонального размножения и техника апикальных меристем, для получения безвирусного семенного материала, создание синтетических регуляторов роста для повышения урожайности, или ингибиторов роста для угнетения развития сорных растений - все это стало возможным благодаря фундаментальным знаниям в области регуляторной роли различных фитогормонов.

В биотехнологии перспективным направлением считается использование растений в качестве биореакторов для производства к ой И небелковой природы. Однако для того, чтобы это препаратов эфф„ым, необходимо знать, « а—и>>, их стабильностью и „род,.»—, ^ управлять такими горм0нальная регуляция.

ITT^^-—- — ^

ОДЙИМ Ю Т также и— прикладное —, являет.^ физиологии растении, ^^ ^^ ^ стрессовым услови*^ изучение механизмов толера ключевую роль ^

- Абсиизовая кислота (АБК) игра окружающей средь, А усгойчив0сти к широкому спектр регулировании механизмов обеспечени^ ^^ ^ ^ спрессов окружающей сред ,^ ^ ^^ ^ устойчивость к эколо„с ИИЩИ, где доступно^ позволяя растениям колон Р ^^ ^^ предположенвд q

ВОДЫ крайне ограничена, наи6олее тяжсЛ1а.1х том, „ . М столетии иедосгатоквод, ^ проблем окру—-Р-ивлеюют внимание кзк потенциальные ^ восприятии АБК такж сельскохозяйственных культу^ к повыщення устойчивости злаков и друг

330УХе' о В связи с обнаружением зндогениой АБК у различных

Недавно, в ^ ^^ ^^ этого ropMOHa ^ многоклеточных живогнь ^ 6иопогическим царствам, ^ организмов, ^ne~4ifrenbHoe родство и консервативно позволяет предположи ^ ^ ^^ о6ъекгах ^ сигнальных механизмов, ^ ^ еистемах ЖИВых позволит сделать вклад в общ организмов в целом. Шт L < экспрессия й^отппии был открьи-В НЗШеИ Л ал^ь^ВК и ингибировалась цитокинином (ген CIP2.7). в

КОТ0Р0Г0 акгивировалас ^ ^^ ^ регулеторных связи с обнаружением в н сигналинге АБК, представ„яется белков, играющих ключевую роль перспективным дальнейший поиск участников, вовлеченных в сигнальную систему этого гормона.

В соответствии с этим, целью нашей работы являлось изучение физико-химических свойств и биологической активности белка, кодируемого АБК- и цитокинин-зависимым геном CIP2.1.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Демиденко, Артем Владимирович

ВЫВОДЫ:

1. Выделен и охарактеризован неизвестный ранее АБК- и цитокинин-регулируемый ген (CIP2.1) из Lupinus luteus, который кодирует белок, состоящий из 647 аминокислот, не имеет интронов и наиболее активно экспрессируется на ранних этапах развития проростков.

2. С помощью биоинформационного анализа показана высокая гомология CIP2.1-белка с белками из 22 видов растений. Показано наличие в этих белках повторов РБ40-типа, составляющих основу бета-пропеллерной структуры, которая может выполнять функцию «белковой платформы» при сборке белковых комплексов.

3. Получена конструкция, экспрессирующая фрагмент гена размером 428 нуклеотидов (область 237-665 гена CIP2.1), которая кодирует белок размером 154 аминокислоты (включая 6xHis последовательность, кодируемую вектором) — cipl54fr. Рекомбинантный белок получен в E.coli и аффинно очищен. К этому белку получены поликлональные кроличьи антитела. Выделена и аффинно очищена фракция IgG, высоко специфичная к CIP2.1.

4. Методами аффинной хроматографии и твердофазного ИФА доказаны АБК-связывающие свойства cipl54fr. Это доказывает принадлежность белка CIP2.1 к АБК-связывающим белкам, что является важным доводом в пользу его участия в сигналинге или метаболизме АБК.

5. Изучена экспрессия CIP2.1 Lupinus luteus и его генов-гомологов из Arabidopsis thaliana (Atlg21670 u At4g01870) на уровне мРНК. С помощью полученных антител изучено изменение содержания белка CIP2.1 под воздействием АБК и абиотических стрессов.

6. Мутация в генах Arabidopsis thaliana (Atlg21670 u At4g01870), гомологичных CIP2.1 изменяла реакцию на АБК. Фенотип мутанта Atlg21670 по состоянию устьиц и боковых корней имитировал ответ на АБК в отсутствии гормона, что подчеркивает участие данного белка в АБК-сигналинге, возможно, в качестве негативного регулятора.

7. Суммируя все полученные результаты, можно заключить, что CIP2.1 и гомологичные ему гены участвуют в АБК-сигналинге, а также в ответе на абиотические стрессы.

Автор выражает благодарность научным руководителям д.б.н. профессору Кузнецову Виктору Васильевичу и к.б.н. Кудряковой Наталье Васильевне за чуткое руководство, поддержку и непосредственное участие в работе.

Автор благодарит д.б.н. профессоа Кулаеву Ольгу Николаевну за внимательный анализ работы и постоянную помощь и поддержку в процессе ее подготовки.

Автор выражает благодарность Каравайко Наталье Николаевне и Шевченко Гале за непосредственное участие в работе и поддержку в процессе ее подготовки.

Автор благодарит д.б.н. Новикову Галину Викторовну и д.б.н. Мошкова Игоря Евгеньевича за ценные советы и поддержку в процессе подготовки работы.

Автор выражает благодарность Черепневой Галине Николаевне за ее вклад в работу.

Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории экспрессии генома растений ИФР РАН за помощь в работе, идеи, обсуждение, советы и хорошее отношеие.

Отдельная благодарность родным и близким за веру, помощь и поддержку во всех отошениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Нами был выделен и охарактеризован неизвестный ранее АБК- и цитокинин-регулируемый ген (CIP2.1) из Lupinus luteus, который кодирует белок, состоящий из 647 аминокислот, не имеет интронов и наиболее активно экспрессируется на ранних этапах развития проростков. Поиск по гомологии в базах данных обнаружил наличие близких к CIP2.1 экспрессируемых последовательностей (EST-tags) в 22 растительных геномах (как двудольных, так и однодольных). В результате проведенного биоинформационного анализа последовательностей генов CIP2.1 и его гомологов в других видах растений, а также последовательностей кодируемых ими белков, была выявлена высокая степень их межвидового сходства, что говорит в пользу консервативности функции этой группы белков. Получены факты, подтверждающие консервативность структуры изучаемого CIP2.1 и близких ему белков. Показано наличие в их последовательностях функционально значимых аминокислотных повторов PD40-THna, составляющих основу для построения третичной бета-пропеллерной структуры, которая может выполнять функцию «белковой платформы» в образовании белковых комплексов. Определен ближайший гомолог с известной структурой и функцией - белок TolB из E.coli. Этот белок является важной частью транспортной системы колицинов бактерий, расположенной в периплазматическом пространстве, и как показано в ряде микробиологических исследований важен для поддержания вводно-солевого баланса бактериальной клетки. Во всех белках из различных видов растений, гомологичных CIP2.1, при помощи биоинформационного поиска консервативных доменов обнаруживается сходство с TolB, что является дополнительным аргументом в пользу консевативности структуры, а возможно, и функции изучаемой группы белков. В некоторых полноразмерных последовательностях найдена гомология С-концевой части с дипептидилпептидазой IV типа (DPP IV), однако сохранение функции пептидазы требует дополнительной экспериментальной проверки.

Фрагмент белка был проклонирован в векторе pQE30, в результате чего получена химерная конструкция, экспрессирующая белок размером 154 аминокислоты молекулярной массой 17,5 кДа с 6xHis последовательностью, что позволило получить высоко очищенный рекомбинантный белок. Полученный фрагмент белка CIP2.1 был использован для иммунизации кроликов. В конечном итоге была выделена и аффинно очищена фракция IgG, высоко специфичная к CIP2.1, что позволило проводить анализ экспрессии на уровне белковых продуктов гена CIP2.1 в Lupinus luteus, а также генов-гомологов в Arabidopsis thaliana.

Нозерн-блоттингом показана положительная регуляция содержания мРНК CIP2.1 в растениях Lupinus luteus в ответ на обработку АБК. Накопление матричной РНК этого гена начиналось через несколько часов после обработки гормоном. Такая же динамика ответа наблюдалась и у гомологов CIP2.1 - генов At4g01870 и Atlg21670 Arabidopsis thaliana.

Кроме того, для CIP2.1 и его гомологов из Arabidopsis thaliana показана положительная регуляция ответа, как на уровне мРНК, так и на уровне белка в ответ на воздействие таких абиотических стрессов, как засоление и гипотермия. Известно, что при этих стрессах происходит накопление АБК в растительных клетках, и что АБК играет важную роль в обеспечении ответа на эти стрессы и в повышении устойчивости растений. Однако и в этом случае повышение содержания изучаемых белков и соответствующих мРНК было несколько отсрочено во времени по отношению к началу стрессового' воздействия. Это позволяет сделать нам предположение, что CIP2.1 и гомологичные ему белки, вероятно, не являются одними из первичных компонентов АБК-сигналинга, а могут участвовать в реализации более позднего ответа на АБК. В недавних широкомасштабных работах по протеомике (Gepstein et al., 2003;Mueller et al. 2008) показано участие гомологов CIP2.1 из Arabidopsis thaliana в процессах, связанных со старением листьев, а также при развитии ответа на биотический стресс - в ответ на обработку биопатогеном рода Pseudomonas. Эти результаты в совокупности с данными, полученными нами, позволяют с уверенностью отнести изучаемый ген и его гомологов, к неизменных участникам широкого спектра реакций, для которых в той или иной степени показано вовлечение АБК-сигналинга.

Кроме того, в работах с инсерционными мутантами, в которых вставкой Т-ДНК были инактивированы гомологи гена CIP2.1 показано, что отсутствие продуктов генов At4g01870 nAtlg21670 модулирует ответ растений на обработку гормонами, в частности АБК, а также влияет на формирование корней и функционирование устьиц. Это подтверждает вовлечение белков-продуктов изучаемых генов A. thaliana в гормональный сигналинг, а также, вследствие высокого сходства, может быть отнесено к гомологу в люпине желтом - CIP2.1.

Инактивация одного из генов-гомологов Atlg21670 вызывала яркий фенотипичеекий эффект - снижение количества боковых корней. Это отчасти имитирует эффект обработки абсцизовой кислотой растений дикого типа. В мутантах по этому же гену продемонстрирована динамика потери воды срезанными розеточными листьями без обработки АБК, которая характерна для растений дикого типа, обработанных этим гормоном. Для сравнения опыты проводились также на растениях линии gunS, в которых нарушена функция предполагаемого хлоропластного рецептора АБК, поэтому gun5 мутанты в устьичных ответах являются АБК-нечувствительными. Эти наблюдения демонстрируют, что ответы растений с инакгивированным Atlg21670 геном, имитируют ответы растений дикого типа, находящихся под воздействием АБК. Т.о, отсутствие продукта этого гена, по нашим данным, вероятно, повышает чувствительность мутантных растений к эндогенным концентрациям абсцизовой кислоты, что позволяет предположить функцию этого белка в качестве отрицательного регулятора ответа на АБК в рамках описанных реакций — в процессе закладки боковых корней и регуляции апертуры устьиц.

По данным двух недавних работ, в которых разными методами был показан пул белков, входящих в протеом апопласта растительной клетки, продукт гена Atlg21670 был локализован в апопластном пространстве (Minic et al., 2007; Boudart et al., 2005; Kwon et al., 2005). Учитывая при этом наши результаты, показывающие участие продукта гена Atlg21670 в таких АБК-зависимых реакциях, как регуляция апертуры устьиц, закладка боковых корней и его возможную функцию в качестве негативного регулятора, а также взяв в расчет вероятное наличие у этого белка бета-пропеллерного домена для осуществления белок-белковых взаимодействий, можно предположить, что механизм действия этого белка связан с оказанием на АБК-регулируемые белки мембраны эффекта, обратного тому, который, оказывает на них этот гормон. В число таких мишеней попадают различные ионные каналы (калиевые, кальциевые, хлоридные), либо белки, регулирующие их активность или каким-то образом проводящие сигнал АБК внутрь клетки.

Как было показано методами аффинной хроматографии и твердофазного ИФА (раздел 3.5 главы «Результаты»), фрагмент белка CIP2.1 - cipl54fr - способен связывать АБК, ковалентно сшитую с сефарозой, а также антиидиотипические антитела к АБК, что может характеризовать полный белок, как АБК-связывающий и является важным доводом в пользу участия этого белка в сигналинге или метаболизме АБК. Если допустить, вследствие высокой гомологии по белку наличие этих свойств и у белка-продукта гена Atlg21670 Arabidopsis thaliana, то можно предположить, что в ответ на воздействие АБК, либо стрессов, при которых происходит повышение ее содержания в растении, усиливается экспрессия гена Atlg21670, и его белковый продукт АБК-зависимо оказывает ингибирующее влияние на белки-мишени растительной клетки, участвующие в обеспечении клеточного ответа на АБК, т.о. выступая в качестве негативного регулятора ответа на этот гормон.

Однако нами также получены результаты, в некоторой степени противоречащие предположению, что продукт гена-гомолога CIP2.1 из Arabidopsis thaliana Atlg21670 может функционировать исключительно как негативный регулятор. В разделе 3.8 была изучена деградация хлорофилла в отделенных листьях инсерционных мутантов под воздействием АБК. Известно, что АБК ускоряет деградацию хлорофилла в листьях растений, однако, как показывает полученная концентрационная кривая, листья инсерционных мутантов по гену Atlg21670 по данному параметру менее чувствительны к АБК, что противоречит постулату о функции белка в качестве негативного регулятора, потому как в этом случае в отсутствии продукта Atlg21670 реакция на АБК должна быть, наоборот, усилена.

Кроме того, в дальнейшей работе нами были получены двойные мутанты (из данных не вошедших в диссертационную работу), несущие инсерционную мутацию по Atlg21670 и мутацию gun5, что приводило к доминированию мутантного фенотипа Atlg21670 над фенотипом gun5 в опытах по потере воды, т.е. устьица нечувствительного к АБК мутанта gun5 при скрещивании с мутантом по Atlg21670 становились гиперчувствительными. Были также получены предварительные данные по влиянию рекомбинантного cipl54fr фрагмента белка на уровень тотальной транскрипции в различных транскрипционных системах in vitro. Поэтому есть основания предположить, что продукт CIP2.1-подобного гена Atlg21670, а также и самого гена CIP2.1, может осуществлять и другие клеточные функции, отличные от описанных нами в процессах закладки боковых корней и регуляции транспирации.

В дальнейшем планируется изучение локализации белка в клетке с помощью иммунологических методов и рекомбинантных технологий с использованием флуоресцентного белка GFP.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что CIP2.1 и гомологичные ему гены с большой вероятностью вовлечены в АБК-сигналинг, а также участвуют в ответе на стрессы, связанные с повышением содержания АБК в клетке, такие как гипотермия и засоление. Одной из предполагаемых функций продуктов изучаемой группы генов является негативная регуляция устьичных ответов и процесса закладки боковых корней. Однако есть данные, указывающие на возможную функцию этих белков и в других клеточных процессах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демиденко, Артем Владимирович, Москва

1. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В., Мейчик Н.Р., Носов A.M., Полесская О.Г., Харитоношвили Е.В., ЧубВ.В. (2005) Физиология растений: Учебник для студентов вузов. М.: Издательский центр «Академия», 422 с.

2. Бутенко Р.Г. (1999) Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие.- М.: ФБК-ПРЕССД60 с.

3. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзаитиев Б.Б. , Гаврилова Е.М. (1999) Теория и практика иммуноферментного анализа. М.:Высшая школа, 288 с.

4. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. (2005) Физиология растений. М.: ФГУП Издательство «Высшая школа», 481 с.

5. Кулаева О.Н. (1973) Цитокинины, их структура и функция. Москва: Наука,.264 с.

6. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. (2004) Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов. Биохимия, 69, 293-310.

7. Либберт Э. (2006) Физиология растений. М.: Мир, 580 с.

8. Маниатис Т., Фрич 3., Сембрук Д. (1984) Методы генетической инженериии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 480 с.

9. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. (1987) Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. Москва: ВО «Агропромиздат», 383 с.

10. Новикова Г.В., Степанченко Н.С., Носов А.В., Мошков И.Е. (2009) В начале пути: восприятие АБК и передача ее сигнала у растений. Физиология растений, 56, 806-823.

11. Северин С., Соловьева Г. (1989) Практикум по биохимии. М.: Издательство МГУ. 509 с.

12. Abe Н., Yamaguchi-Shinozaki К., Urao Т., Iwasaki Т., Hosokawa D., Shinozaki К.1997) Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs in drought- and abscisic acid-regulated gene expression. Plant Cell, 9, 1859-1868.

13. Addicott F.T. (1983) Abscisic acid. New York: Praeger Publishers, 607 p

14. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410.

15. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402.

16. Arnon D.I. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in beta vulgaris. Plant Physiol. 24, 1-15.

17. Bergmann D.C., Lukowitz W., Somerville C.R. (2004) Stomatal Development and Pattern Controlled by a MAPKK Kinase. Science, 304. 1494-1497.

18. Berman H.M., Henrick K., Nakamura H. (2003) Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology, 10 , 980

19. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. (2000) The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28, 235-242

20. Bernstein F.C., Koetzle T.F., Williams G.J.B., Meyer E.F. Jr, Brice M.D., Rodgers J.R., Kennard O., Shimanouchi Т., Tasumi M. (1977) The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. J. Mol. Biol. 112,. 535-542.

21. Blatt M.R. (2000) Cellular signaling and volume control in stomatal movements in plants. Annual Review of Cell Developmental Biology, 16, 221-241.

22. Boudsocq M., Barbier-Brygoo H., Lauriere C. (2004) Identification of nine SNF1related protein kinases2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsisthaliana. J. Biol. Chem., 279, 41758-41766.

23. Bradford M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Annals of Biochemistry, 72, 248-254.

24. Bulow L., Engelmann S., Schindler M., Hehl R. (2009) AthaMap, integrating transcriptional and post-transcriptional data. Nucleic Acids Res. 37, D9S3-D986.

25. Burnett E., Desikan R., Moser R., Neill S. (2000) ABA Activation of an MBP Kinase in Pisum sativum Epidermal Peels Correlates with Stomatal Responses to ABA. J. Exp. Bot., 51. 197-205.

26. Busk P.K., Pages M. (1998). Regulation of abscisic acid induced transcription. Plant Mol Biol, 37,425-435.

27. Chen H., Huang K., Sun Z. (2006) SubLoc: a server/client suite for protein subcellular location based on SOAP. Bioinformatics. 22, 376-377.

28. Cheong Y.H., Kim K.-N., Pandey G.K., Gupta R., Grant J.J., Luan S. (2003). CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in Arabidopsis. Plant Cell, 15, 1833-1845.

29. Cherepneva G.N., Oelmuller R., Kulaeva O.N., Kusnetsov V.V. (1998) Expression of the ribosomal protein S14 in lupin cotyledons is stimulated by cytokinin and inhibited by abscisic acid and light Botanica Acta. Ill, 287-290.

30. Chevalier D., Morris E.R., Walker J.C. (2009) 14-3-3 and FHA domains mediate phosphoprotein interactions. Annu. Rev. Plant Biol 60, 67-91.

31. Choi H., Hong J., Ha J., Kang J., Kim S. (2000). ABFs, a family of ABA-responsive element binding factors. J. Biol. Chem., 275, 1723-1730.

32. Chomczynski P, Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-9.

33. Combet C., Blanchet C., Geourjon C., Deleage G. (2000) NPS@: network protein sequence analysis. Trends Biochem. Sci. 25, 147-150.

34. Conlon H., Salter M. (2007) Plant Protein Extraction. Circadian Rhythms. 362 p.

35. Cornforth J. W., Milborrow В. V., Ryback G. (1965b) Synthesis of (±) abscisin II. Nature 206, 715.46

36. Cornforth J. W., Milborrow В. V., Ryback G., Rothwell K., Wain R.L. (1966). Identification of the yellow lupin growth inhibitor as (+)-abscisin II ((+)-dormin).1. Nature 211, 742-43.

37. Cornforth J. W., Milborrow В. V., Ryback G., Wareing P. F. (1965a) Chemistry and physiology of Могший in sycamore. Identity of sycamore 'dormin' with abscisin II.1. Nature 205, 1269-70.

38. BMC Bioinformatics, 4, 1-11.

39. Desikan R., Cheung M.K., Bright J., Henson D., Hancock J.T., Neill S.J. (2004) ABA, Hydrogen Peroxide and Nitric Oxide Signaling in Stomatal Guard Cells. J. Exp.1. Bot., 55. 205-212.

40. Eagles C.F. and Wareing P.F. (1963) Dormancy regulators in woody plants. Experimental induction of dormancy in Betula pubescens. Nature 199, 874-75.

41. Emi Т., Kinoshita Т., Shimazaki K. (2001) Specific binding of vfl4-3-3a isoform to the plasma membrane H+-ATPase in response to blue light and fosicoccin in guard cellsof broad bean. Plant Physiology, 125, 1115-1125.

42. Fan L., Zheng S. and Wang X. (1997). Antisense suppression of phospholipase Da retards abscisic acid- and ethylene-promoted senescence of postharvest Arabidopsisleaves. Plant Cell, 9,2183-2196.

43. Finkelstein R. (2006) Studies of abscisic acid perception finally flower. The Plant Cell, 18., 786-791.

44. Finkelstein R., Gibson S.I. (2002) ABA and sugar interactions regulating development: "cross-talk" or "voices in a crowd"? Curr. Opin. Plant Biol. 5, 26-32.

45. Finkelstein R., Rock C. (2002). Abscisic acid biosynthesis and signaling. In The Arabidopsis Book, C.R. Somerville and E.M. Meyerowitz, eds (Rockville, MX): American Society of Plant Biologists http://www.aspb.0rg/publicati0ns/arabid0psis/3

46. Fujii H., Zhu J. (2009) Arabidopsis mutant deficient in 3 abscisic acid-activated protein kinases reveals critical roles in growth, reproduction, and stress. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 106, 8380-8385.

47. Fulgosi H., Soil J., de Faria Maraschin S., Korthout H.A., Wang M., Testerink C. (2002) 14-3-3 proteins and plant development. Plant Mol Biol. 50, 1019-29.

48. Gampala S., Hagenbeek D., Rock C. (2001). Functional interactions of lanthanum and phospholipase D with the abscisic acid signaling effectors VP1 and ABI1-1 in rice protoplasts. J. Biol. Chem. 276, 9855-9860.

49. Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A. (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31, 3784-3788.

50. Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A. (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 571-607

51. Gattolin S, Alandete-Saez M, Elliott K, Gonzalez-Carranza Z, Naomab E, Powell C, Roberts JA (2006) Spatial and temporal expression of the response regulators ARR22 and ARR24 in Arabidopsis thaliana. J Exp Bot. 57, 4225-33.

52. Gazzarrini S., McCourt P. (2001). Genetic interactions between ABA, ethylene and sugar signaling pathways. Curr. Opin. Plant Biol., 4, 387-391.

53. Gepstein S., Sabehi G., Carp M.J., Hajouj Т., Nesher M.F., Yariv I., Dor C., Bassani M. (2003) Large-scale identification of leaf senescence-associated genes. Plant J. 36, 629-42.

54. Gilroy S., Read N.D., Trewavas A.J. (1990). Elevation of cytoplasmic calcium by caged calcium or caged inositol trisphosphate initiates stomatal closure. Nature, 343, 769-771.

55. Gish W., States D.J. (1993) Identification of protein coding regions by database similarity search. Nature Genet. 3, 266-272.

56. Grabov A, Blatt MR. (1997) Parallel control of the inward-rectifier K+ channel by cytosolic free Ca2+ and pH in Vicia guard cells. Planta, 201, 84-95.

57. Gu J., Stephenson C.G., Iadarola M.J. (1994) Recombinant proteins attached to a Ni-NTA column: Use in affinity purification of antibodies. BioTechniques, 17, 257-262.

58. Gudesblat G.E., lusem N.D., Morris P.C. (2007) Guard Cell-Specific Inhibition of Arabidopsis MPK3 Expression Causes Abnormal Stomatal Responses to Abscisic Acid and Hydrogen Peroxide. New Phytol, 173, 713-721.

59. Gupta R., Luan S. (2003) Redox Control of Protein Tyrosine Phosphatases and Mitogen-Activated Protein Kinases in Plants. Plant Physiol., 132, 1149-1152.

60. Hetherington A. (2001) Guard cell signaling. Cell, 107, 711-714.

61. Himmelbach A., Yang Y., Grill E. (2003). Relay and control of abscisic acid signaling. Curr. Opin. Plant Biol., 6, 470-479.

62. Hobo Т., Kowyama Y., Hattori T. (1999). A bZIP factor, TRAB1, interacts with VP1 and mediates abscisic acid-induced transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 15348-15353.

63. Hunter D.A., Ferrante A., Vernieri P., Reid M.S. (2004). Role of abscisic acid in perianth senescence of daffodil (Narcissus pseudonarcissus 'Dutch Master'). Physiol. Plant, 121,313-321.

64. Hunter R. (1970) Standardization of the chloramine-T method of protein iodination. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 133, 989-992.

65. Jacob T, Ritchie S, Assmann SM, Gilroy S. (1999) Abscisic acid signal transduction in guard cells is mediated by phospholipase D activity. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 96, 12192-12197.

66. Jang Y.H., Lee J.H., Ют J.-K. (2008) Abscisic Acid Does Not Disrupt Either the Arabidopsis FCA-FY Interaction or Its Rice Counterpart in vitro. Plant Cell Physiol,49, 1898-1901.

67. Kim S.Y. and Thomas T.L. (1998). A family of novel basic leucine zipper proteins binds to seed-specification elements in the carrot Dc3 gene promoter. J. Plant Physiol,152, 607-613.

68. Kinoshita T, Shimazaki K. (1997). Involvement of calyculin A- and okadaic acid-sensitive protein phosphatase in blue light response of stomatal guard cells. Plant and

69. Cell Physiology, 38, 1281-1285.

70. Kovaleva L.V. and Zakharova E.V. (2003). Hormonal status of the pollen-pistil system at the progamic phase of fertilization after compatible and incompatible pollination in Petunia hybrida L. Sex. Plant Reprod., 16, 191-196.

71. Kwak J.M., Mori I.C., Pei Z.M., Leonhardt N., Torres M.A., Dangl J.L., Bloom R.E., Bodde S., Jones J.D., Schroeder J.I. (2003) NADPH oxidase AtrbohD and AtbohF genes function in ROS-dependent ABA signaling in Arabidopsis. EMBO Journal, 22, 2623-2633.

72. Kwon H.K., Yokoyama R., Nishitani K. (2005) A proteomic approach to apoplastic proteins involved in cell wall regeneration in protoplasts of Arabidopsis suspension-cultured cells. Plant Cell Physiol. 46, 843-57.

73. Laemmli U. (1970) Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

74. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bio informatics. 23, 2947-2948.

75. Leckie C.P., McAinsh M.R., Allen G.J., Sanders D. and Hetherington A.M. (1998). Abscisic acid-induced stomatal closure mediated by cyclic ADP-ribose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15837-15842.

76. Leckie C.P., McAinsh M.R., Allen G.J., Sanders D., Hetherington A.M. (1998) Abscisic acid-induced stomatal closure mediated by cyclic ADP-ribose. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95, 15837-15842.

77. Leube M.P., Grill E., Amrhein N. (1998) ABI1 of Arabidopsis is a protein serine/threonine phosphatase highly regulated by the proton and magnesium ion concentration. FEBS Letters, 424, 100-104.

78. Leung J. and Giraudat J. (1998). Abscisic acid signal transduction. Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol, 49, 199-222.

79. Leung J., Merlot S. and Giraudat J. (1997) The Arabidopsis ABSCISIC ACID-INSENSITIVE2 (ABI2) and ABI1 genes encode homologous protein phosphatases 2C involved in abscisic acid signal transduction. Plant Cell, 9, 759-771.

80. Levy Y. and Dean C. (1998) The transition to flowering. Plant Cell, 10, 1973-1990.

81. Li J. and Assmann S.M. (1996) An abscisic acid-activated and calcium-independent protein kinase from guard cells of Fava bean. Plant Cell, 8, 2359-2368.

82. Li J., Kinoshita Т., Pandey S., Ng C.K.-Y., Gygi S.P., Shimazaki K.-I. and Assmann S.M. (2002) Modulation of an RNA-binding protein by abscisic-acid-activated protein kinase. Nature, 418, 793-797.

83. Li J., Wang X.-Q., Watson M.B. and Assmann S.M. (2000) Regulation of abscisic acid-induced stomatal closure and anion channels by guard cell AAPK kinase. Science, 287, 300-303.

84. Li L., Kim B.G., Cheong Y.H., Pandey G.K. and Luan S.A. (2006a). Ca2+ signaling pathway regulates a K+ channel for low-K response in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 13625-12630.

85. Lin B.L., Wang H.J., Wang J.S., Zaharia L.I. and Abrams S.R. (2005). Abscisic acid regulation of heterophylly in Marsilea quadquadrifolia L: effects of R-(-) and S-(+) isomers. J. Exp. Bot., 56, 2935-2948.

86. Liu W.-C and Carns H. R. (1961) Isolation of abscisin, an abscission accelerating substance. Science, 143, 384-85.

87. Liu Y.-G., Mrtsukawa N., Oosumi Т., Whittier R.F. (1995) Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR. The Plant Journal 8, 457-463

88. Lu C., Han M.-H., Guevara-Garcia A., Fedoroff N.V. (2002) Mitogen Activated Protein Kinase Signaling in Postgermination Arrest of Development by Abscisic Acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 15812-15817.

89. Ma Y., Szostkiewicz L, Korte A., Moes D., Yang Y., Christmann A., Grill E. (2009) Regulators of PP2C Phosphatase Activity Function as Abscisic Acid Sensors. Science, 324, 1064

90. Macknight R., Bancroft I., Page T. et al. (1997) FCA, a gene controlling flowering time in Arabidopsis, encodes a protein containing RNA-binding domains. Cell, 99, 737-745.

91. MacRobbie E.C. (1995) ABA-induced ion efflux in stomatal guard cells: Multiple actions of ABA inside and outside the cell. Plant J., 7, 565-576.

92. Marchler-Bauer A., Anderson J.B., Cliitsaz F., Derbyshire M.K., DeWeese-Scott

93. C., Fong J.H., Geer L.Y., Geer R.C., Gonzales N.R., Gwadz M., He S., Hurwitz

94. McGinnis S., Madden T.L. (2004) BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32:W20-W25.

95. Meinhard M., Grill E. (2001) Hydrogen peroxide is a regulator of ABI1, a protein phosphatase 2C from Arabidopsis. FEBS Letters, 508, 443-^146.

96. Meinhard M., Rodriguez P.L., Grill E. (2002) The sensitivity of ABI2 to hydrogen peroxide links the abscisic acid-response regulator to redox signalling. Planta, 214, 775-782.

97. Melcher K., Ng L.-M., Zhou E., Soon F.-F., Xu Y., Suino-Powell K.M., Park S.-Y., Weiner J.J., Fujii H., Chinnusamy V., Kovach A., Li J., Wang Y., Li J., Peterson

98. F.C., Jensen D.R., Yong E.-L., Volkman B.F., Cutler S.R., Zhu J.-K., Xu H.E.2009) A gate-latch-lock mechanism for hormone signalling by abscisic acid receptors. Nature, 462, 602-608

99. Merlot S., Leonhardt N., Fenzi F. et al. (2007) Constitutive activation of a plasma membrane H+-ATPase prevents abscisic acid-mediated stomatal closure. The EMBO Journal, 26, 3216-3226.

100. Merlot S., Mustilli A.-C., Genty В., North H., Lefebvre V., Sotta В., Vavasseur A. and Giraudat J. (2002). Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. Plant J., 30, 601-609.

101. Minic Z., Jamet E., Negroni L., Arsene der Garabedian P., Zivy M., Jouanin L. (2007) A sub-proteome of Arabidopsis thaliana mature stems trapped on Concanavalin A is enriched in cell wall glycoside hydrolases. J Exp Bot. 58, 2503-12.

102. Mishra G., Zhang W., Deng F., Zhao J., Wang X. (2006) A Bifurcating Pathway Directs Abscisic Acid Effects on Stomatal Closure and Opening in Arabidopsis. Science, 312, 264-266.

103. Miyazono K., Miyakawa Т., Sawano Y., Kubota K., Kang H.J., Asano A., Miyauchi Y., Takahashi M., Zhi Y., Fujita Y., Yoshida Т., Kodaira K.S., Yamaguchi-Shinozaki K., Tanokura M. (2009) Structural basis of abscisic acid signalling. Nature, 462, 609-14.

104. Mohan Ram I.I.Y. and Juiswal Y.S. (1972) Induction of male flowers on female plants of Canabis sativa by gibberellins and its inhibition by abscisic acid. Planta, 105, 263-266.

105. Mori I.C. (2006). CDPKs CPK6 and CPK3 function in ABA regulation of guard cell S-type anion- and Ca2+-permeable channels and stomatal closure. PLoS Biol, 4, e327.

106. Mueller S., Hilbert В., Dueckershoff K., Roitsch Т., Krischke M., Mueller M.J., Berger S. (2008) General detoxification and stress responses are mediated by oxidized lipids through TGA transcription factors in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 768-85.

107. Miiller A.H., Hansson M. (2009) The Barley Magnesium Chelatase 150-kDa Subunit Is Not an Abscisic Acid Receptor. Plant Physiol, 150, 157-166

108. Munnik Т. (2001) Phosphatidic acid: an emerging plant lipid second messenger. Trends in Plant Science, 6, 227-233.

109. Munnik Т., Meijer H. (2001) Osmotic stress activates distinct lipid and МАРК signalling pathways in plants. FEBSLetters, 498, 172-178.

110. Mustilli A.-C., Merlot S., Vavasseur A., Fenzi F. and Giraudat J. (2002) Arabidopsis OST1 protein kinase mediates the regulation of stomatal aperture by abscisic acid and acts upstream of reactive oxygen species production. Plant Cell, 14, 3089-3099.

111. Neill S., Barros R., Bright J., Desikan R., Hancock J., Harrison J., Morris P., Ribeiro D., Wilson I. (2008) Nitric oxide, stomatal closure, and abiotic stress. Journal of Experimental Botany, 59, 165-176.

112. Ng, C.K.-Y., Carr K., McAinsh M.R., Powell В., Hetherington A.M. (2001) Drought-induced guard cell signal transduction involves sphingosine-1-phosphate. Nature, 410, 596-599.

113. Ohkuma K., Lyon J.L., Addicot F.T., Smith O.E. (1963) Abscisin II. an abscission-accelerating substance from young cotton fruit. Science, 142, 1592-1593.

114. Osakahe Y., Maruyama K., Seki M., Satou M., Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. (2005) Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinase 1 Is a Key Membrane-Bound Regulator of Abscisic Acid Early Signaling in Arabidopsis. Plant Cell, 17, 1105-1119.

115. Pan S., Sehnke P.C., Ferl R.J., Gurley W.B. (1999) Specific interactions with TBp and TFIIB in vitro suggest that 14-3-3 proteins may participate in the regulation of transcription when part of a DNA binding complex. Plant Cell, 11, 1591-602

116. Pandey G.K., Cheong Y.H., Kim K.N., Grant J.J., Li L., Hung W., D'Angelo c., Weinl S., Kuda J. and Luan S. (2004). The calcium sensor calcineurin B-like 9fmodulates abscisic acid sensitivity and biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell, 1, 1912— 1924.

117. Pandey S., Nelson D.C., Assmann S.M. (2009) Two Novel GPCR-Type G-Proteins Are Abscisic Acid Receptors in Arabidopsis. Cell 136, 136-148.

118. Paul A.L., Sehnke P.C., Ferl R.J. (2005) Isoform-specific subcellular localization among 14-3-3 proteins in Arabidopsis seems to be driven by client interactions. Mol. Biol Cell 16, 1735-43

119. Pei Z.-M., Murata Y., Benning G., Thomine S., Klusener В., Allen G.J., Grill E., Schroeder J.I. (2000) Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells. Nature, 406, 731-734.

120. Pernas M., Garcia-Casado G., Rojo E., Solano R., Sanchez-Serrano J.J. (2007) A protein phosphatase 2A catalytic subunit is a negative regulator of abscisic acid signaling. Plant J., 51, 763-778.

121. Phillips I.D.J., Wareing P.F. (1958) Studies in dormancy of sycamore I Seasonal changes in the growth-inhibitors in Acerpseudoplatanus. JExp.Bot. 9, 350-64.

122. Pierleoni A., Martelli P.L, Fariselli P., Casadio R. (2006) BaCelLo: a balanced subcellular localization predictor. Bioinformatics. 22, e408-e416.

123. Puce, S., Basile, G., Bavestrello, G., Bruzzone, S., Cerrano, C., Giovine, M., Arillo, A., and Zocchi, E. (2004). Abscisic acid signaling through cyclic ADP-ribose in hydroid regeneration. J. Biol. Chem. 279, 39783-39788.

124. Quevillon E., Silventoinen V., Pillai S., Harte N., Mulder N., Apweiler R., Lopez R. (2005) InterProScan: protein domains identifier. Nucleic Acids Research, 33, W116-W120.

125. Razem F.A., Hill R.D. (2007) Hydrogen peroxide affects abscisic acid binding to ABAP1 in barley aleurones. Biochemistry and Cell Biology, 85, 628-637.

126. Razem F.A., Luo M., Liu J.-H., Abrams Z.R., Hill R.D. (2004) Purification axid characterization of a barley aleurone abscisic acid-binding protein. Journal of

127. Biological Chemistry, 279, 9922-9929.

128. Risk J.M., Macknight R.C., Day C.L. (2008) FCA Does Not Bind Abscisic Acid.1. Nature, 456, E5-E6.

129. Ritchie S. and Gilroy S. (2000) Abscisic acid stimulation of phospholipase D in the barley aleurone is G-protein-mediated and localized to the plasma membrane. Plant1. Physiol, 124, 693-702.

130. Ritchie S., Gilroy S. (1998) Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 2697-2702.

131. Roberts M.R. (2003) 14-3-3 proteins find new partners in plant cell signalling. Trends1. Plant Sci., 8, 218-223.

132. Robinson P. M., Wareing P. F., Thomas Т. H. (1963) Isolation of the inhibitor varying with photoperiod in Acer pseudoplatanus. Nature, 199, 875-76

133. Rock C. (2000) Pathways to abscisic acid-regulated gene expression. New Phytol, 148,357.396.

134. Rybicki EP (1986). Affinity purification of specific antibodies from plant virus capsid proteins immobilised on nitrocellulose. J Phytopathol 116, 30-38.

135. Sambrook J., Russell D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor NY : Cold Spring Harbor Laboratory, 387 p.

136. Sanchez J.-P., Chua N.-H. (2001) Arabidopsis PLC1 is required for secondary responses to abscisic acid signals. Plant Cell, 13, 1143-1154.

137. Santiago J., Dupeux F., Round A., Antoni R., Park S.Y., Jamin M., Cutler S.R., Rodriguez P.L., Marquez J.A. (2009) The abscisic acid receptor PYR1 in complex with abscisic acid. Nature, 462, 665-8.

138. Santner A, Estelle M. (2009) Recent advances and emerging trends in plant hormone signalling. Nature. 459, 1071-8

139. Schoonheim P.J., Sinnige M.P., Casaretto J.A., Veiga H., Bunney T.D., Quatrano R.S., de Boer A.H. (2007b) 14-3-3 adaptor proteins are intermediates in ABA signal transduction during barley seed germination. Plant J., 49, 289-301.

140. Schultz T.F., Medina J., Hill A., Quatrano R.S. (1998) 14-3-3 proteins are part of an abscisic acid VIVIPAROUS 1 (VP1) response complex in the Em promoter and interact with VP1 and EmBPl. Plant Cell, 10, 837-847.

141. Schweighofer A., Hirt H., Meskienne I. (2004) Plant PP2C phosphatases: emerging functions in stress signaling. Trends in Plant Science, 9, 236-243.

142. Shen Y.-Y., Wang X.-F., Wu F.-Q., Du S.-Y., Cao Z., Shang Y., Wang X.-L., Peng C.-C., Yu X.-C., Zhu S.-Y., Fan R.-C., Xu Y.-H., Zhang D.-P. (2006) The Mg-Chelatase H Subunit Is an Abscisic Acid Receptor. Nature, 443, 823-826.

143. Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. (2000) Molecular responses to dehydration and low temperature: Differences and cross-talk between two stress signaling pathways. Curr. Opin. Plant Biol, 3, 217-223.

144. Sirichandra С, Wasilewska A, Vlad F, Valon C, Leung J. (2009) The guard cell as a single-cell model towards understanding drought tolerance and abscisic acid action. J Exp Bot. 60, 1439-63.

145. Sokolovski S., Hill A., Gay R., Garcia-Mata C., Lamattina L., BlattM.R. (2005) Protein phosphorylation is a prerequisite for intracellular Ca2+ release and ion channel control by nitric oxide and abscisic acid in guard cells. Plant J., 43, 520-529.

146. Stoscheck C.M. (1990) Quantitation of Protein. Methods in Enzymology, 182, 50-69

147. Thomas T. (1993) Gene expression during plant embryogenesis and germination: An overview. Plant Cell, 5, 1401-1410.

148. Timmons Т., Dunbar B. (1990) Protein blotting and immunodetection. Methods Enzymol. 182, 679-688.

149. Ullah H., Chen J.-G., Young J., Im K.-H., Sussman M., Jones A. (2001) Modulation of cell proliferation by heterotrimeric G protein in Arabidopsis. Science, 292, 20662069.

150. Uno Y., Furihata Т., Abe H., Yoshida R., Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki

151. K. (2000) Arabidopsis basic leucine zipper transcription factors involved in an abscisic acid-dependent signal transduction pathway under drought and high-salinity conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11632-11637.

152. Urao Т., Yamaguchi-Shinozaki K., Urao S., Shinozaki K. (1993) An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence. Plant Cell, 5, 1529-1539.

153. Van den Wijngaard P.W.J., Sinnige M.P., Boobeek I., Reumer A., Schoonheim

154. P.J., Mol J.N.M., Wang M., De Boer A.H. (2005) Abscisic acid and 14-3-3 proteins control K+ channel activity in barley embryonic root. Plant J., 41, 43-55.

155. Wang P., Song C.-P. (2008) Guard-cell signalling for hydrogen peroxide and abscisic acid . New Phytologist, 178, 703-718.

156. Wang X., Zhang D. (2008) Abscisic Acid Receptors: Multiple Signal-perception Sites. Annals of Botany, 101, 311-317.

157. Wang X.-Q., UHah H., Jones A., Assmann S. (2001) G protein regulation of ion channels and abscisic acid signaling in Arabidopsis guard cells. Science, 292, 20702072.

158. Wareing P.F., Eagles C.F., Robinson P.M. (1964) Natural inhibitors as dormancy agents. In J. P. Nitsch (ed.), Regulateurs Naturels de la Croissance Vegetale. Paris: Cent. Nat. Rech. Sci. Pp. 377-86.

159. Wasilewska A, Vlad F, Sirichandra C, Redko Y, Jammes F, Valon C, Frei dit Frey N, Leung J. (2008) An update on abscisic acid signaling in plants and more. Mol Plant., 1,198-217.

160. Wolf E., Kim P.S., Berger B. (1997) MultiCoil: a program for predicting two- and three-stranded coiled coils. Protein Sci. 6, 1179-1189.

161. Wu Y., Kuzma J., Marechal E„ Graeff R., Lee H.C., Foster R„ Chua N.-H. (1997) Abscisic acid signaling through cyclic ADP-ribose in plants. Science, 279, 2126-2130.

162. Xiong L., Ishitani M., Lee H., Zhang C., Zhu J.-K. (2001). FIERY 1 encoding an inositol polyphosphate 1-phosphatase is a negative regulator of abscisic acid and stress signaling in Arabidopsis. Genes Dev., 15, 1971-1984.

163. Xiong L., Schumaker K., Zhu J.-K. (2002) Cell signaling during cold, drought and salt stress. Plant Cell, 14 (suppl.), S165-S183.

164. Xu J., Li H.D., Chen L.Q., Wang Y., Liu L.L., He L., Wu W.H. (2006) A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis. Cell, 125, 1347-1360.

165. Zhang D.-P., Wu Z.Y., Li X.Y., Zhao Z.X. Purification and Identification of a 42-Kilodalton Abscisic Acid-Specific-Binding Protein from Epidermis of Broad Bean Leaves. Plant Physiol. 128, 714-725.

166. Zhang Z., Schwartz S., Wagner L., Miller W. (2000) A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J Comput Biol; 1, 203-14.

167. Zimmermann P., Hirsch-Hoffmann M., Hennig L, Gruissem W. (2004) GENEVETIGATOR. Arabidopsis microarray database and analysis toolbox. Plant Physiol. 136, 2621-2632.