Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормональная регуляция формирования генеративных органов люпина желтого

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гормональная регуляция формирования генеративных органов люпина желтого"



<л.

О: На правах рукописи

ЗАЯКИН Владимир Васильевич

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ГЕНЕРАТИВНЫХ ОРГАНОВ ЛЮПИНА ЖЕЛТОГО

03.00.12 — Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнялась в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева, Брянской государственной сельскохозяйственной академии.

Научный консультант—академик РАСХН В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Прусакова Л. Д., доктор сельскохозяйственных наук, профессор Дебелый Г. А., доктор биологических наук, профессор Кораблева Н. П.

Ведущая организация—ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

часов на заседании диссертационного Совета Д. 1'20.35.07 'по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Московской сельскохозяйственной академии им. К- А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Академии. .

Автореферат диссертации разослан ¡./НЮ^бр^. 1997 г.

Ученый секретарь

Защита состоится

1997 года

диссертационного совета

А. С. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ, Изучение формирования генеративных органов растений является важнейшей общсбиологической задачей, связанной с вопросами эволюции и выживания видов, и в то же время служит теоретической базой для поиска путей интенсификации сельскохозяйственного производства.

Фитогормоны играют ключевую роль во взаимодействии различных органов и тканей растений, в их реакции на воздействие факторов окружающей среды, и тем самым осуществляют интеграцию физиологических процессов, обеспечивая целостность растительного организма и его приспособительные реакции (Кулаева, 1973, 1982; Ксфели, 1974; Полевой, 1985; Муромцев, Чкаников и др. 1987; Чайлахян, 1964, 1988; Шевелуха, 1992). В частности, гормональная система играет важную роль в регуляции основных процессов, происходящих при формировании генеративных органов, в том числе опадения цветков и завязей, которое мохет существенно ограничивать продуктивность растений люпина.

Опадению органов растений предшествует образование отделительного слоя, которое может индуцироваться как этиленом (Reíd, 1984), так и АБК (Osborne, McManus, 1984; Sargent et al. 1984). Хотя опадающие завязи люпина велтого были одним из первых объектов, из которых была выделена и идентифицирована АБК, мнения о ее возможной роли в опадении цветков люпина были противоречивы: так. Van Stevenlnck (1957) показал, что в опадающих завязях уровень АБК намного выяе, чем в развивающихся плодоэлементах. a Porter (1977, 1981) получил противоположные результаты, и в его опытах экзогенная АБК не вызывала опадения генеративных органов люпина. В отноиении этилена в некоторых работах указывалось, что он не несет функциональной нагрузки регуляции степени опадения, а слупит лнаь координирующим сигналом опадения (Addlcot, 1982). При этом предполагалось, что ИУК ыозет определять чувствительность отделительного слоя к этилену, а в отноаении роли цитокининов и гиббереллинов в регуляции опадения сведения носили противоречивый характер. В результате дате для хлопчатника» одной из наиболее изученных в это« отнонении культур, не удалось разработать строй-нув непротиворечивую» гормональную теорию регуляции опадения генеративных органов (Sadras, 1035).

Существует очевидная взаимосвязь ассныилнрую^ей способности растений и степени спадения генеративных оргакоэ. однако боль-

- г -

Еинство. исследований оставляет открытым вопрос о том, существует ли в растении прямая регуляция опадения цветков и завязей ассими-лятами или она опосредована системой фитогормонов? Ответ на этот вопрос непосредственно связан с актуальной для практики сельского хозяйства проблемой увеличения продуктивности растений люпина путем обработки их регуляторами роста.

Процессы, происходящие при росте и созревании семян, в силу их важности привлекают большое количество исследователей. Давно известна, что фитогормоны "стиыулирущего" действия: ауксины, гиббереллины и цитокинины. - стимулируют рост и развитие плодов, а этилен и АБК связаны с созреванием, обезвоживанием семян и переходом к покою. Однако в конце 70-х и начале 80-х годов появились данные об особой роли АБК при созревании (Ihle, Dure, 1972; Dure,- 1983), в частности, стимуляции ею биосинтеза запасных белков. Однако неполнота, фрагментарность и противоречивость данных, например по поводу влияния АБК на транспорт ассшилятов в генеративные органы (Porter, 1981; Gif ford, 1986; Ross et al., 1987 ). не позволяли однозначно сформулировать роль АБК, как гормона, ко-ординированно и комплексно регулирующего все основные процессы, связанные с формированием и созреванием семян. Роль других фито-гормонов, характер их взаимодействия с АБК, остались почти не изучены. На гелтом /шпине работы в этом направлении совсем не проводились, хотя вопросы формирования полноценных семян и потери их качества при прорастании на корню иысот важное значение для данной культуры.

В последние два десятилетия использование в физиологии растений методов молекулярной биологии и генетической инженерии позволило изучать механизмы гормональной регуляции физиологических процессов, а появление метода имыуноферыентного анализа облегчило определение эндогенного уровная фитогорыонов в растительных, тканях. что значительно расширило возможности исследователей.

При проведении настоящей работы в качестве общих предлологе-ний концептуального характера, на основании которых строились рабочие гипотезы и конкретные эксперименты, мы использовали следующие следующие положения:

- формирование генеративных органов люпина находится под контролем гормональной системы, которая при опадении цветков и завязей люпина и при дальнейаеи развитии плодов опосредует влия-

ние на эти процессы как факторов внешних условий, так и физиологического состояния растения, определяемого предшествующим его развитием;

- ь многокомпонентной системе гормональной регуляции на отдельных этапах формирования и опадения генеративнях органов люпина аелтого выделяются основные и вспомогательные звенья регуляции.

- выделение ключевого звена позволяет углубить понимание физиологического механизма регуляции изучаемых процессов и предло-аить селекционные или технологические решения исследуемых проблем;

- при созревании семян люпина ключевую роль играет абсцизо-вая кислота, которая представляет собой интегрирующий фактор в системе целого растения, обеспечивающий созревание семян. При этом она является триггером, переключающим генетические программы развития, индуцируя созревание и ингибируя прорастание семян.

Цель настоящей работы состояла в изучении на одном объекте -люпине желтом - роли и места гормональной системы в регуляции основных процессов, протекающих при формировании генеративных органов - от бутонизации до полного созревания семян.

В соответствии с этам были'поставлены следующие задачи:

- исследование роли гормональной система в регуляции опадения цветков и завязей люпина, выделение ключевых гормонов и изучение их взаимодействия в этом процессе;

- изучение соотношения трофической и гормональной систем регуляции развития плодоэлементов;

- разработка подходов для уменьшения опадения плодоэлементов с помощью применения регуляторов'роста;

- исследование регуляции основных • программ, реализующихся при формировании семян люпина;

- изучение закономерностей гормональной регуляции поступления питательных веществ в развивающиеся плодоэлементы люпина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые проведено комплексное изучение роли фитогорноноэ при формировании плодоэлементов от цветения до созревания семян на примере люпина желтого и предложены схемы гормональной регуляции вакнейших процессов.

- установлено, что этилем и аукскн являются парой гормонов, играющей главнуо роль в непосредственном контроле процесса иадс-

ния цветков и молодых завязей люпина желтого. Первый из них служит индуктором опадения, а второй определяет чувствительность отделительного слоя к нему, как сигналу опадения.

- обнаружена функциональная физиологическая специализация ПУК и этилена в двух аспектах регуляции опадения цветков у люпина желтого: этилен является не только индуктором и временным коорди-начором процесса опадения, но также наряду с другими факторами участвует в оперативной регуляции опадения плодоэлементов, а гра-дпоп! ПУК вдоль соцветия определяет разницу р опадении цветков верхних и нижних мутовок;

- доказано, что пик выделения этилена при цветении, необходимый для индукции опадения, запрограммирован на уровне экспрессии генов - увеличения количества транскриптов генов АЦК-синтета-зы; •

-установлен диапазон оперативной регуляции опадения цветков лмина этиленом в период цветения: 307. в сторону увеличения и 1015% - уменьшения от общего количества цветков в соцветии;

•- доказано, что опадение цветков и завязей является избыточным - в растении люпина желтого существует резерв поступления ас-симилятов к генеративным органам и прямое торможе: ие механизма опадения плодов приводит к увеличению урожая семян;

- для подавления опадения цветков и завязей и повышения зерновой продую ивиости люпина желтого предложено использовать ингибитор биосинтеза этилена конкурентного действие 2-аминоизомасля-ную кислоту (А'ЛМ), а также его композиции с веществами другого механизма действия, стимулирующими метаболизм и аттракцию ассими-лшов в плодоэлементах, Обработка ими позволяет увеличить зерновую продуктивность люпина на 25-30% (до 4056 - в отдельных опытах);

- установлена высокая эффективность АИМ при меавидовой, гибридизации люпина в случае несовместимых комбинациях;

• показано, что АБК при развитии плода люпина желтого играет триггерну«? роль, переключая генетические программы развития - подавляет программу прорастания и индуцирует процессы, связанные с созреванием, в частности, биосинтез запасных белков;

- продемонстрирована комплексность действия АБК при созревании. она направляет и стимулирует все основные процессы; рост зародыша. накопление запасного белка, разгрузку ассимилятов из фло-

змы внутрь семени, перераспределение ассимилятов. . То есть, АБК является тем самым интегрирующим фактором, который определяет функционирование целостного растения, направляя его на созревание семян;

- фитогормоны "положительного" действия ПУК, ГК и цитокинины неспецифически стимулируют любую активированную программу развития - и прорастания и созревания. Совместно с АБК они обеспечивают аттракцию ассимилятов в растущие плоды люпина;

- показано, что АБК является главным фактором, предохраняющим семена от прорастания на корн» и обеспечивающим их качество. Предложено использовать накопление АБК в створках бобов при созревании как признак в селекции на отсутствие прорастания на корню и сохранение качества семян в неблагоприятных условиях.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В результате выявления основных звеньев регуляции опадения цветков и завязей люпина предложен способ повышения продуктивности растений люпина путем обработки регуляторами роста.

Обнаружение положительного эффекта аминоизомасляной кислоты при развитии зародышей люпина позволяет использовать этот препарат и композиции на его основе для повышения выхода гибридных зародышей при отдаленной гибридизации люпина.

Предложенные схемы гормональной регуляции опадения цветков и формирования семян могут быть полезны для селекционеров и технологов при разработке стратегии селекции и технологических приемов. Например, в селекции на высокое качество семян важно учитывать обнаруженный факт, что АБК створок бобов является основным Фактором, ингибирущим преждевременное прорастание семян у лишенных "твердокаменности" сортов люпина.

Выяснение роли фитогормонов и их взаимодействия в регуляции важнейших физиологических процессов является теоретической основой для разработки биотехнологическил и I онноинкенерных подходов с целью получения новых форм люпина с улучшенными свойствами, так как для большинства фитогормонов известны генетические структуры, которые могут быть использованы для усиления или ослабления биосинтеза этих гормонов. В частности, для этих целей могут быть полезны выделенные- нами полинуклеотиды. содернацие последовательности, кодирующие АЦК-синтетазу люпина келтого.

Полученные результаты являются хороией иллюстрацией общих

принципов функционирования гормональной системы растений и могут Сыть использованы при разработке спецкурсов по физиологии растений в ВУЗах.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты были доложены на конференции "Молекулярные механизмы регуляции иетаболитических процессов" (Минск. 1987), II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Киев,1988), Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск. 1908) , Всесоюзной конференции по физиологии семян (Душанбе, 1988), Международной конференции "Эмбриология и семенное размно- ' йсние" (Ленинград,1990), 5 Международной конференции по люпину (Познань.1988), II съезде ВОФР (Минск,1990), II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущина, 1993), Международном симпозиуме "Физиология абсцизовой кислоты" (Пущи-но, 1993), 8 Международной конференции по люпину (Асиломар, 1990), 3 ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва,1997), 4 Международной конференции ':Регуляторы роста и развития растений" (Москва. 1997). ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего к^О ссылок, и том на МО иностранных работ. Работа изложена на ЗМ страницах, включая 5й рисункоз и 36 таблиц.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ •• Работа проводилась на растениях лапина желтого (ЬирШиэ 1и-ЬеиБ (I.) сортов Академический, Нарочанский, Кастрычник, Брянс-кий-27. Смена сортов в опытах связана со сменой возделываемых сортов в производстве, кроме того проведение опытов на разных сортах позволило выявить общие закономерности, не зависящие от, сортоспецифичности.

В работе использовали характеристики стадии развития семени но только по количеству дней, после начала цветения (ДПЦ). но и по размеру зародыша, что позволяет сравнивать результаты, полученные в различных погодно-климатических условиях, на разных' сортах н даае разных видах бобовых растений Ша'Лсй е1 а1., 1985). Предварительные опыты показали, что при отборе проб растительного мате-

риала по размеру зародыша разброс данных при анализах значительно уменьшается.

Для сравнения цветков верхних и нижних мутовок, раскрывающихся последовательно снизу вверх, период цветения каждой мутовки был разбит на одинаковые фазы: в день распускания цветка данной мутовки фаза его цветения обозначалась как фаза 0. В момент распускания цветков второй, третьей и последующих мутовок фаза цветения первой мутовки была соответсвенно +1, +2, и т.д. Следовательно, в день расцветания цветков первой мутовки фаза цветения для второй мутовки была -1, для третьей - -2 и т.д. Поскольку при температуре 20-25°С каждый день распускается следующая мутовка соцветия люпина, то интервал между фазами составляет примерно сутки.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для анализа абсцизовой кислоты методом газо-кидкостной хроматографии использовали модифицированную методику Кварри (Quar-rie, 1973). Контроль потерь АБК осуществляли с помощью '3Н-АБК, которую получали с помощью изотопного обмене с тритиевой водой (производства ВО "Изотоп", Ленинград) в сильнощелочной срего.

Анализ фитогормонов абсцизовой кислоты, ауксина и зеатина (зеатиноподобных веществ) методом иммуноферментного анализа проводили согласно модифицированной методике Института биологии УрО РАН, у которого были приобретены наборы для ИФА ФГ.

Анализ этилена проводили методом газо-жидкостной хроматографии на колонке с носителем Хромосорб-102, при температуре 50-60° С. Прединкубацию проб для снятия раневого эффекта проводили в течение часа, инкубацию - около 3 часов.

Определение АЦК проводили путем её предварительной конверсии в этилен с помощью гипохлорита по модифицированному методу Lizada и Yang (1979). Предварительно оптимизировав соотношение реактиьов для достиаения максимальной конверсии.

Анализ АЦК-синтетазной активности проводили по модифицированной методике Pua и Chi (1993). Поскольку фермент обладает до-ьольно необычным свойством - инактивироваться собственным субстратом. SAM (Satoh. Esashi, 1986; Satoh, Yang. 1989), предварительно была подобрана его концентрация (40ыкМ) и время реакции.

Для выделения легуминов и вицилинов из семян люпина использовали методику Derbyschire et al.. (1976).

Иммуноэлектрофорез фракций запасных белков по методу Грабар-Уильяме проводили по методике, описанной Остерыаном (Остер-ман. 1983).

Электрофорез глобулиновых белков, выделеленных из зародышей созревающих семян люпина, в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, проводили по методу Лэммли (ЬаеигаП. 1970).

Для культивирования зародышей использовали среду Мурашиге-Ску-га, а которой неорганические формы азота были заменены аспараги-ном в концентрации 62,5 мМ, который стерилизовали ультрафильтрацией.

Хлорофилл определяли по методу Авериной, Шлыка (1972):

Электрофорез РНК и нозерн-гибридизацию проводили по стандартным методикам (Остерман, ¡983).

В качестве зонда использовали плазмиду, содержащую фрагмент ДНК длиной 520 п. о., гомологичный по результатам секвенирования опубликованным последовательностям кДНК для АЦК-синтетазы, который был получен при цепной полимеразной реакции, проведенной на выделенной из цветков лопина РНК с помощью Tth- и Taq-полимераз. В качестве лраймеров при этом использовали (dT)16 и олигонуклео-тид длиной 20 нуклеотидов, соответствующий одной Из чонсерватив-ных областей АЦК-синтетазы. выбранной при сравнении нуклеотидных последовательностей кДНК АЦК-синтетазы, из кабачков, томатов и яблок (Sato et al. 1989; Van Der Straeten et al.1990; Dong et al. 1991).

Выращивание бактерий, ■ выделение плазмидной ДНК, реакции ¡рестрикции, лигироьания и другие ■ операции выполняли согласно «стандартных рекомендаций (Maniatis et al. 1984,1991).

При изучении поступления ассймилятов в семена, бобы люпина раскрывали по нижнему шву и из семян извлекали зародыши, оставляя прикрепленными пустые оболочки, которые заполняли испытуемыми растворами, приготовленными на изоосмотической концентрации ман-нита. определенной в предварительном опыте.

Гедуцирующие сахара (гексозы), кетосахара и азотсодержащие соединения определяли колориметрическими микрометодами (Ермаков. 1987).

Обработки ФАВ проводили путем опрыскивания в начале цветения индивидуальных растений, выравненных'по габитусу и фазе развития и отмеченных этикетками, или делянок площадью 5-10м2. В некоторых

опытах для компенсации микрогетерогенности рельефа и почвы применяли парный метод: в качестве контроля использовали необработанную половину делянки или соседнюю делянку, что позволило значительно повысить достоверность результатов. В этих случаях результаты выражали в процентах от контроля и статистически обрабатывали относительные величины. Для обработок применяли аминокислоты, фитогормоны и 7ИБК фирмы Serva, глифосат фирмы Mansanta, аминоок-сиуксусную кислоту (Aldrich), этиленпродуценты с 2-хлорэтилфосфо-новой кислотой в качестве действующего вещества - этрел (Union Carbide) и кампозан (химкомбинат Bitterfeld).

Ланные были обработаны статистически и представлены в виде М ш. где ш - ошибка среднего. На графиках она указана с помощью отрезков (баров).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ригулнция опадения цветков и завязей люпина. Люпин желтый является прекрасной моделью для изучения регуляции опадения генеративных органов и позволяет изучать этот процесс в двух аспектах: изменение общей степени опадения в зависимости от влияния условий среды, а также различие в опадении цветков верхних и нижних мутовок. В наших опытах опадение цветков 1-й мутовки составляло 2.4-2.8%, а 5-6 мутовок - 73-92% в зависимости от условий (рис.1). Это позволяет отбирать для анализов заведомо "неопадающие" цветки 1-й мутовки, "опадающие" цветки верхних мутовок и цветки с промежуточной степенью опадения. Даже опадающие цветки верхних мутовок у люпина желтого оплодотворены и их полноценность подтверждается опытом, в котором в начале цветения удаляли цветки трех нижних мутовок - потеря была полностью компенсирована за счет верхних мутовок и количество бобов на растениях достоверно не изменилось (в контроле - 12.Oil.5 бобов, в опыте - 14.0±1.4). Одновременно этот результат свидетельствует ь пользу существования четкой регуляции количества остающихся бобов, вероятно с помощью трофических или гормональных факторов.

■ Можно предположить, что причиной опадения цветков и завязей верхних мутовок люпина является недостаток ассимилятов. Для проверки этой гипотезы применяли два подхода: 1) определение динами-

а

ЧТ 1 — Т 1 V

Рис Л. Опадение цветков и завязей люпина яелтого

1 - цветочная кисть;

2 - кисть с бобами.

■з 33о И 5 3 +Г

Рис.2. Динамика содержания кетосахаров в цветках люпина сорта Брянский-27. Цифрами обозначены номера.мутовок. Пунктир - 1994, сплошная - 1995 год.

ки содержания Сахаров и азота в опадающих и неопадающих цветках люпина; 2) обработка растений в самом начале цветения растворами сахарозы и аминокислот.

Динамика содержания кетосахаров, которые могут рассматриваться как индикатор содержания сахарозы плюс продукты ее инверсии, свидетельствует, что их уровень'проходиг при цветении через максимум, и в верхних "опадающих" цветках оказывается не гогае. а во многих точках достоверно выие, чем в низших 'неопадающих" (рис. 2).

Аналогичные результаты получены для содержания редуцирующих Сахаров. Уровни общего азота в опадающих и неопадающих - цветках достоверно не различались. Подобные данные, полученные на нас- • колькил сортах и в разные по погодкьм условиям годы, позволили сделать вывод, что уровень эндогенных Сахаров и азотсодераащих соединений не влияет на опадение плодозлементов люпина.

Обработка растений люпина сахарозой и смесью глутамина с ас-парагиноц (последний является основной транспортной формой азота у люпина) не оказала существенного влияния на опадение цветков и завязей (табл.1), однако эти соединения проявили физиологическую

активность- сахароза увеличивала количество семян в бобах, а аминокислоты - вес 100 семян.

Таблица 1

Влияние Сахаров и аминокислот на количество и массу семян на растении люпина

Вариант- кол-во бобов кол-во семян кол-во семян в бобе масса 100 семян

штук % итук X г 56

контроль сахароза Асн+Глн 12.210,4 12,410,6 12,4Ю.4 100 102 102 46,313.1 59,014.4 39,714.0 100 127 86 3,81 4,76 3,2 11,1Ю,5 9, 8Ю. 6 13,2Ю,2 100 89 119

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать общее заключение об отсутствии непосредственной регуляторной взаимосвязи между опадением цветков люпина и уровнями основных ассимилятов в них, и о наличии альтернативной системы регуляции опадения, в качестве которой выступает гормональная система.

При изучении роли ФГ в регуляции опадения использовали комплекс взаимодополняющих подходов: 1) обработка растений экзогенными ФАВ; 2) анализ динамики эндогенных фигогормонов; 3) опыты по применения ингибиторов биосинтеза ФГ; 4) модельные опыты по обработке фитогормонами цветоножек после удаления цветков.

Обработка цветочных кистей люпина желтого растворами АБК и этиленпродуцентов (этрел или кампозан) может вызвать опадение цветков (табл.2).

Таблица 2

Влияние абсцизовой кислоты и этрела на опадение завязей

Вариант Количество бобов на растении

итук %

контроль АБК, 10 мг/л АБК, 100 мг/л этрел, 0,156 этрел, 0,5% В. 99 ± 0,71 9.79 ± 0.31 6,76 ± 1.67 7,27 ± 0.47 3,57 ^ 0.23 100 109 75 81 40

Влияние дате высокой концентрации АБК относительно невелико и не стабильно, оно могет не проявляться в отдельные годы. Этилен, наоборот, всегда стимулирует опадение с высокой эффективностью. - Эти данные даот возшгность предпо-

лояить. что у люпина, как у других двудольных, индуктором образования отделительного слоя является скорее этилен, нежели АБК.

При определении динамики АБК оказалось, что ее содержание в цветках всех мутовок проходит через четкий максимум, наблюдаемый примерно на пятый день цветения. Величина этого максимума всегда больше для верхних опадающих мутовок, и в засушливые годы с високим опадением плодоэлементов уровни АБК в цветках гораздо выше по сравнению с концентрацией гормона в нормальных условиях (табл.3). Однако в оба года при недостоверной разнице в уровне АБК в цветках 1 и 3 мутовок опадение последней на порядок вьше, чем 1-й. В засушливом 1983 году уровень АБК в 1 мутовке вьше. чем в цветках верхних мутовок в благоприятных условиях 1985 года, однако при атом в 1983 году нижние цветки практически не опадали. То есть, в целом строгая математическая корреляция содержания АБК в плодоэлементах и их опадения отсутствует.

Таблица 3

Содержание абсцизовой кислоты в цветках и завязях разных мутовок и степень их опадения

Год N мутовки Содержание АБК (мкг/г сыр.м.) % опадения

1983 1 1,10 ± 0,32 2,4

3 1,20 ± 0,04 36,0

5 1,92 ± 0,17 92,0

1985 1 0,261 i 0.029 • 2,8

3 0,296 ± 0.036 20,0

6 0.940 ± 0,120 73,2

кривой с явным максимумом, приходящимся на момент раскрытия цветка или на следующие сутки. Однако достоверной разницы в выделении этилена цветками опадающих и неопадающих мутовок не обнаруживается. Этот результат хорошо согласуется с представлениями об этиле- , не как индукторе и временном координаторе опадения, не регулирующим опадение разных мутовок. Разница ве в опадении цветков верхних и нижних мутовок определяется степенью их чувствительности к этилену. Действительно, усиление опадения под действием зтиленп-родуцента, отраженное в табл.2, происходит в первую очередь за счет цветков верхних мутовок, а первая мутовка оказывается практически нечувствительной к этому воздействию. Вместе с тем, эти-

лен явно способен участвовать в регуляции общей степени опадения за счет верхних и средних мутовок, относительно чувствительных к нему. В наших опытах выделение этилена цветками показало себя как чрезвычайно мобильный фактор, чутко реагирующий на изменения внешней среды. Это объясняет, почему даже очень кратковременные стрессы во время цветения вызывают массовое опадение цветков и завязей люпина ¡желтого.

Столь важная роль пика выделения этилена при цветении делает актуальным вопрос о том, на каком уровне регулируется синтез этилена. Определение динамики содержания предшественника этилена аминоциклопропанкарбоновой кислоты (АЦЮ и активности АЦК-синте-тазы (рис.3) показало, что эти компоненты такзе проходят через максимум при раскрывании цветков, причем в нигних мутовках пики не ниге, чем в верхних.

-Я -{ 0 +{ +2

-3 -2 -1

О / Л 3 ~ А

<Раза Цветения

Рис.4 Авторадиограмма нозерн-гибридизации РНК из цветков люпина. Цлчры - фазы цветения.

• Рнс.З Динамика содержания АЩ< (А) и активности АЦК-синтетази (Б) в цветках лзпина. Цифрами обозначены номера мутовок.

За счет чего происходит увеличение активности АЦК-синтетазы в цветках - только за счет активации предсинтезированного фсрнсн-

- и -

та или также за счет регуляции экспрессии генов АЦК-синтетазы?

Анализ тотальной РНК, выделенной из цветков люпина на разных стадиях цветения, методом молекулярной гибридизации (но-эерн-гибридизации) с зондом, последовательность которого отвечает АЦК-синтетазе люпина желтого, показал, что при цветении происходит накопление мРНК для АЦК-синтетазы, т. е. повышение выделения этилена при цветении запрограммировано на уровне регуляции экспрессии генов (рис.4).

В противоположность этилену и АБК, концентрация которых проходит через максимум с падением к концу цветения, уровни "стиму- ' лирующих" фитогормонов - ПУК и цитокинина - явно возрастают после раскрытия цветков (рис.5, 6). Причем концентрация ИУК проходит через четкий минимум перед раскрытием цветков, что обеспечивает максимальную чувствительность к этилену как раз во время его пиковой концентрации.

'I

И

-4 г I о • / •л -V -з -г -/ о I г з

9Ьза цетмл - Яц« ц£в/пенил\

Рис.5 Динамика содержания Рис.6 Динамика содержания

ауксина - в цветках люпина. цитокинина в цветках люпина . Цифра».« на кривых обозначены номера мутовок.

Повышение концентрации "стимулирующих" гормонов к концу цветения объясняет постепенное уменьшение способности плодозлеыентов к опадению (обработка сформировавшихся бобов этиленпродуцентами мало влияет на их опадение).

В содержании цитокинина нет достоверных различий между верхними и нижними мутовками, хотя можно говорить о наличии некоторой тенденции - в нижних цветках уровень гормона несколько выше (рис.6).

В некоторых опытах, как показано для примера на рис.5, уровень ИУК в верхних опадающих цветках ниже, чем в неопадающих цветках 1-й мутовки практически в течение всего анализируемого периода, в других случаях достоверная разница проявляется только через день-два после раскрытия цветков. Это не противоречит представлению об участии ИУК в определении различий в чувствительности верхних и нижних мутовок к этилену. Более того, такая динамика хорошо согласуется с высказанным в литературе предположением о том, что не абсолютная концентрация ИУК, а градиент ее в зоне отделительного слоя определяет чувствительность. Полученные результаты позволяют выдвинуть гипотезу, что ИУК в соцветии люпина может играть роль фактора, выделяемого более старшими, ранее образовавшимися завязями, который способствует опадению более молодых цветков и завязей. Существование таких факторов постулировалось неоднократно, но их природа не была доказана. Эта гипотеза позволяет также объяснить автоматическую перестройку регуляции опадения при обрывании цветков нижних мутовок - при этом восстанавливается отток и градиент ауксина в зоне отделения цветков верхних мутовок и их опадение блокируется.

Факты в пользу этой гипотезы можно получить в опытах с применением экзогенных ФАВ, в частности ИУК, ТИБК - специфического Ингибитора полярного транспорта ИУК, а также глифосата - ингибитора синтеза ароматических аминокислот, в том числе триптофана -непосредственного предшественника ИУК, и их сочетаний с этиленп-родуцентом (табл.4).

ИУК и ТИБК действуют в противоположных направлениях. Хотя эти вещества и могут несколько влиять на биосинтез этилена, анализ этого влияния, а также сохранение такой же тенденции действия На фоне этиленпродуцента при увеличении выделения этилена более, Чем на порядок, свидетельствует о влиянии их именно на чувствительность к этилену. Очень интересен факт индукции практически полного опадения цветков под действием глифосата - при этом снимается почти полная нечувствительность к индукции опадения этиленом цветков первой мутовки (рис.7). Это происходит вследствии

Таблица 4

Влияние ауксина и веществ, влияющих на его метаболизм и транспорт, на опадение генеративных органов люпина

Вариант Количество % к конт- % к ближайшему

бобов ролю _

контролю кампозану

контроль 9,76 ИУК. 28,5мкМ 10,46

ТИБК, 40 мкМ 8,79

глифосат. 0,004% 0,14

кампозан, 0,1% 6,94

ИУК + кампозан 7,41

ТИБК + кампозан 6,63 глифосат + камп. О

+ 0, 58 100

+ 0,62 107 111.

0,76 90 91.

0,01 1,4 1.

± 0, 34 71 74.

+ 0,41 76 76.

+ 0.35 68 73,

0

100

3 ± 6.9 7 ± 6.2 5 ± 1,0

7 ± 5, 8 100 О ± 3,4 103,0 * 2.0 2 ± 4,7 94,8 ± 5,4 О О

резкого (в 30 раз !) падения содержания ИУК после обработки гли-СосатоМ. Это соединение является мощным гербицидом, действующим через подавление биосинтеза ароматических аминокислот и, как следствие, синтеза белка. Однако в наших опытах глифосат применяли в концентрациях в 20-40 раз ниае гербицидних, и какие-либо фи-тотоксические эффекты отсутствовали. Специфичность действия этого препарата в данном случае подтверадалась тем, что опадение - процесс активный, требующий синтеза специфических белков в отдели-

К - контроль

Г1 - глифосат 0.004%

Ц - циклогексимид

100 мг/л Г2 - глифосат 0.2%

Рис.7 Действие глифосата и циклогексимида на опадение цветков.

тельном слое, и при гербицидных концентрациях глифосата, так же. как при обработке циклогексимидом. опадение полностью подавляется - цветки постепенно гибнут и высыхают, оставаясь прикрепленными к стеблю.

Дополнительная информация о гормональной регуляции опадения была получена в опытах с удалением цветков и нанесением на срез ланолиновой пасты, содержащей ФАВ. Эта модельная система позволяет уменьшить влияние эндогенных гормонов и более четко увидеть влияние экзогенных. В опытах, когда удалению подвергались только цветки нижних мутовок, из всех фитогормонов только ИУК. нанесенная в ланолине на срез цветоножки, увеличила опадение вышерасположенной 3-й мутовки, что подтверждает роль ИУК. как фактора, посредством которого нижние цветки влияют на опадение более молодых верхних. В другом опыте для максимального устранения влияния эндогенных фитогормонов стебли с цветочными кистями срезали с растения и удаляли верхнюю часть соцветия, кроме двух нижних мутовок, на которых срезали все цветки. На срезы 1-й мутовки наносили фитогорыоны. При этом наиболее сильно тормозит опадение цветоножек ИУК - на растении остается 229% цветоножек (к контролю); глифосат стимулирует опадение - 33%; при его совместном нанесении с ИУК - 148%. АБК вызывает полное опадение цветоножек в отсутствие других гормонов (0%), этот эффект снимается, по крайней мере, частично под действием ингибитора биосинтеза этилена (33%), что говорит о том, что действие АБК осуществляется через ее влияние на этилен. При совместном применении АБК и ИУК действие последней явно преобладает (87%). Эти данные подтверждает вспомогательную роль АБК в регуляции опадения и объясняют нестабильность влияния АБК при обработке интактных растений. Важно отметить, что в этом опыте ИУК снимала действие глифосата, что еще раз подтвердило специфичность воздействия низких его концентраций через подавление бноскнтеза ИУК.

Выяснение основных закономерностей гормональной регуляции опадения н отсутствие непосредственной связи опадения и уровня ассимилято позволяют выдвинуть предположение о том, что путем воздействия на гормональную систему можно уменьшить опадение, а значит, увеличить продуктивность растений люпина.

Для ингнбирования опадения существует две принципиальные

возможности - применение препаратов стимулирующего действия, которые могут активировать развитие завязей и/или уменьшить их чувствительность к этилену, и, наоборот, использование ингибиторов биосинтеза или действия этилена, являющегося индуктором опадения.

Для изучения влияния ингибиторов биосинтеза и действия этилена мы использовали следующие препараты: соли кобальта, как неконкурентного ингибитора этиленобразующего фермента АЦК-оксидазы; 2-аминоизомасляную кислоту (АИМ) - конкурентный ингибитор этого фермента; аминооксиуксусную кислоту (АОА) - неконкурентный необратимый ингибитор АЦК-синтетазы; соль серебра в виде комплекса с •тиосульфатом, как ингибитор действия этилена. Изученные препараты ингибировали опадение завязей и увеличивали количество бобов, оставшихся на растении, причем существует связь подавления опадения цветков со степенью и устойчивостью ингибирования выделения этилена (табл. 5)

Таблица 5

.Влияние ингибиторов биосинтеза и действия этилена на выделение этилена цветками люпина и опадение генеративных органов

I•Вариайт I 'опыта I

'I

Выделение этилена

через сутки

через 3 суток -1-

Количество бобов I I

к уборке I -,-1

>1 1пМ/час. шт |1 1 % пМ/час. шт1 % 1 | бобов.шт % 1 1

Ч 1 ПКбНтроль 1 1104.8*6.7 100 27.7*5.2 100 12.2*0.5 1 100 1

'(АИМ, 20мМ 1 36.8-4.1 35 14.2*4.7 51 14.1*0.3 115 1

¡1 Кобальт 50мкМ| 48.9*9.5 47 20.8*2.7 75 13.4*0.2 ,109 1

10мкМ| 76.2±6.9 73 23.6*6.1 85 12.8*0.2 105 1

Н 2мнМ| 79.4*3.9 76 22.5-4.3 81 12.4*0.4 103 1

1 Контроль 2 1 42.1*4.0 100 1

1 АОА ЮОмкМ! 47.2*5.9 45 21.0*0.9 50 13.7*0.3 112 1

1АОА 6мкМ| 74.6-15.9 71 33.6*5.4 80 13.4*0.2 109 |

1 Серебро 10мкН| 92.1*16.9 88 29.5*5.4 70 12.6*0.3 103 |

1 1мкк| 109.5*6.7 104 46.1*12.8 110 12.3*0.2 101 1

Примечание: выделение этилена анализировалось в течение дня в виде двух серий со своими контролями. Контроль 2 относится ко всем ниже лежащим вариантам.

По совокупности свойств: эффективности, стоимости и i l-ксич-ности npt'iiapaiua- наибольшие перспективы для практического применения имеет AHM. Был подтвержден конкурентный характер ингибиро-вания выделения этилена In vivo и параметры этого ингибирования. Изучение концентрационных зависимостей в годы с контрастными погодными условиями показало, что в условиях засухи максимальную эффективность имеет более низкая концентрация к\?т, а при улучшении внешних условий параллельно с ростом продуктивности в контроле возрастают концентрации АИМ. проявляющие максимальный эффект (табл.6).

Таблица 6

Влияние AHM на опадение завязей.

Вариант Количество бобов на растении

водный дефицит* нормальное увлажнение**

штук Of / штук %

контроль 7.6Í0,4 100 12,1±0,9 100

АИМ, 1мМ 7, 9Í0. 6 104 - 13,1±0, 7 108

АИМ, 5мМ 9, 9±0. 6 131 13,4±0,7 111

АИМ, 20 мМ 9, 3*0, 7 123 13,8±0,5 114

АИМ, 50 míí 15,4^1. 1 127

АИМ, 100 мМ 13,4—1,2 111

Концентрация 20мМ была выбрана для дальнейших опытов, как достаточно эффективная при различных условиях.

Для повышения стабильности действия АИМ мы использовали ее в сочетании с веществами другого механизма действия, способными стимулировать метаболизм, аттракцию питательных веществ цветками

и завязями, а именно - цитокинин, повышающий продуктивность за счет усиления аттракции и утолщения стебля (Павлов и др. 1981, Atkins, Plgealre, 1993), и смесь лимонной и янтарной кислот, стимулирующих процессы метаболизма, активность последней на люпине была показана ранее (Величева и др.. 1983; Шутов, Сушкевич, 1982). Данные таблицы 7 подтверждают перспективность работы в этом направлении, а также факт проявления действия АИМ в основном через подавление опадения, в отличие от других препаратов.

Таблица 7

Влияние ФАВ на продуктивность растений люпина (% к контролю)

~ Вариант Количество Урожай семян Вес 100 Количество бобов/раст. г/5 кв.м семян, г семян/боб

среднее за 3 года

АИМ, 20 мМ 124±14 120.2+4.1 102.2±1.6 95.8±9.3

6-БАП, 50 мг/л 103± 9 117,5±7.9 99,6i3.5 113,3±3.5

Орг. кислоты, по 0,5% 108±12 113, 4±7.8 98,2±2.1 106.640.9

АИМ + 6-БАП 113±14 121.0+15,4 102,6+1,8 106,016.2

АИМ + орг.кисл. 123±12 128.5±3.9 102.L-2.0 103,4t6,6

Прим. Опыт проведен парным методом, в таблице представлены цифры отношения к ближайшему контролю.

Однако подробный анализ результатов показал, что влияние АИМ

не исчерпывается торможением опадения. Это особенно явно проявились при межвидовой гибридизации люпина при обработке цветков композициями на его основе. При обработке цветочных кистей АИМ и составами на его основе наблюдалось не только торможение опг.дения цветков, гибридные зародыши развивались дольше, имели больший размер и повышенную жизнеспособность. Выход гибридных зародышей сильно увеличивался при обработке АИМ и особенно комбинацией АИМ и БАП (в одном из опытов в десятки раз), что значительно превосходит результаты применения используемых в таких случаях гиббе-реллина, БАП, борной кислоты и других ФАВ. Сочетание обработки цветков АИМ с культурой зародышей In vitro позволило получить пробирочные растения от скрещиваний разнохромосоыных видов люпина и даже несколько цветущих растений гибридов L.angustifollusxL. lu-teus. гибридная природа которых подтверждалась морфологическими признаками, изоферментными спектрами и полной стерильностью растений. В культуре In vitro также подтвердился стимулирующий эффект АИМ на рост зародышей желтого люпина, что было, вероятно, связано, не только с торможением выделения этилена, поскольку другие инги-

биторы были но эффективны; в то ко время АЦК и этиленпродуценты ¿значительно тормозили рост зародышей.

Гормональная регуляция процессов формирования и созревания плодов люпина. Для выяснения роли АБК и других фитогормонов при формировании и созревании семян люпина желтого сопоставляли динамики процессов роста, поступления ассимилятов ь семя, накопления аапасных белков б зародышах, способности зародышей к прорастанию с динамикой эндогенного содержания фитогормонов. Этот подход сочетали с опытами по прямому влиянию фитогормонов на эти процессы в соответствующих модельных системах: поступление ассимилятов в "пустые оболочки" семян; рост, прорастай/"1, накопление запасных белков зародышами люпина в культуре In vitro; рост и позеленение изолированных семядолей.

Определение динамик содержания АБК, ИУК и цитокинина (с ан-vисывороткой к зеатину) в различных частях плодов люпина показало, что уровни всех трех гормонов проходят синхронно по крайней мере через один явный максимум: сначала б створках (при размере зародышей Змм), затем в оболочках (зародыш 6-7мм) и, наконец, в самих зародышах при размере 8-1Омм. Исключением является содержание циточинина в зародыше, которое непрерывно падает. Параллельно проводили определения динамики роста частей плода и содержания в них редуцирующих и кетосахаров, а также общего, белкового и небелкового азота. Оказалось, что п. ¡ни фитогормонов соответствуют периодам максимальной скорости роста соответствующих частей плода и наибольшего их вклада в общую массу боба, и также согласуются с увеличением содержания в них в это время Сахаров и различных форм азота. Причем в створках и оболочках наблюдается временное увеличение содержания белкового азота, что может быть интерпретировано как образование вегетативных запасных белков (Staswlck et al. 1989, 1991). В целом картина хорошо согласуется с представлением об аттрагирующем действии фитогормонов, максимум содержания которых перемещается по частям плода вместе с центром аттракции и активного роста. Вероятно, фитогормоны участвуют в регуляции локального запасания и перераспределения питательных веществ. Конечным пунктом такого перераспределения явл'-'этея зародыш семени, а главным запасным веществом в семенах люпина является запасной белок глобулиновой природы, представленный двумя главными фракциями -пицилиноподобными и легуми] подобными протеинам. Их накопление

было прослежено с помощью электрофореза в присутствии додецил-сульфата. иммуноэлектрофореза по Грабар-Уильяме и иммунодиффузии. Появление запасного белка детектируется в зародышах, достигших 5 мм и больше, причем сначала появляется вицилин, а затем легумин; а активное накопление их происходит с максимальной скоростью после достижения зородышами размера 7мм, когда в них наблюдается пик АБК. Зародыши размером 4-4.5мм, в которых данными методами не об-нарувивается накопление запасных белков, были использованы для изучения в культуре in vitro влияния фитогормонов на индукцию биосинтеза глобулинов. Оказалось, что АБК индуцирует биосинтез запасных белков с типичной для фитогормонов концентрационной зависимостью (рис.8). как на фоне низко- так и высокоосмотической среды.

Рис. 8 Влияние фитогормонов на биосинтез запасных белков в зародышах люпина культивируемых in vitro.

А - влияние концентраций АБК: 1 - 0.1 мг/л; 2 - 0.4 мг/л; Я - 1.0 мг/л; 4-2.5 мг/л; 5-10 мг/л; К - контроль; С - оелки зрелых семян

Б - влияние сочетаний фитогормонов:

1 - белки зрелых семян;

2 - белки исходных зародышей перед культивированием;

3 - контроль; 4 - АБК 0.1мг/л; 5-0.4 мг/л; 6 - 1.0 мг/л; 7-10 мг/л; 8 - ИУК 1мг/л;

9 - ИУК1 + АБК1мг/л;

10 - БАЛ 1.0 мг/л;

11 - АБК1 + БАП 1 мг/л;'

12 - ГК 1.0 мг/л;

13 - АБК1 + ГК 1.0 мг/л;

14 - ИУК1 + БАП1 + ГК 1.Оыг/л;

udt-

тЗэя ■

МЯ» »"W •

о -* ■'

25 kb

■ v 5 • ^ К 4 & 3 ч s~ с

*» г»«» »»«г»«э г»»г|

j * НЧ1 5Ш

± Z 3 tsfir *a i'O . £

& a st

О 1

- йО -

Действие других фитогорионов, ауксинов, гиббереллинов и питокининов зависит от присутствия экзогенной АБК или ее остаточных количеств - они не могут самостоятельно индуцировать биосинтез запасного белка, но после индукции АБК они эффективно стимулируют этот процесс. Фитогормоны "стимулирующего" действия усили-ыают накопление биомассы зародышами в культуре, независимо от их размера, а АБК стимулирует рост зародышей свыше 5.5-Сым, тормозит рост зародышей меньше 4мм и нестабильно влияет на рост зародышей промежуточного размера. Таким образом, фитогормоны обеспечивают накопление запасных веществ и биомассы зародышами люпина, обеспечивая тем самый аттракцию ими питательных гяществ.

Птот процесс должен поддерживаться притоком ассимилятов. Для изучения в прямом эксперименте влияния фитогорионов на транспорт питательных веществ использовали метод "пустых оболочек": после удаления зародыша оболочки, прикрепленные к растенк.о й связанные с ним проводящими пучками, заполняла-.ь растворами фитогорионов в изоосмотическом (0.4К) растворе маннита. Как видно в табл.8, только АБК достоверно стимулировала поступление сахарозы и азотсодержащих соединений внутрь семени.

Таблица 8

Влияние фитогорионов на поступление Сахаров и азота внутрь семян люпина относительно контроля (,% к контролю)

Вариант % к контролю

редуцир.сахара сахароза азот

контроль 100 1G0 100

АБК, 1.51мкМ 104 ± 24 103 ± 9 104 ± 22

7.57мкМ 110 ± 17 123 ± И ИЗ ± 1

37.84мкМ 176 ± 23 120 ± 14 101 ±

ИУК, 11.42мкМ 148 ± 27 90 ± 15 1

57.08I.IKM 117 ± 47 97 ± 3 88 ± 1

ГК, 5.77мкМ 91 ± 10 101 t 4 77 ± 0

С-БАП, 9.8мкМ 99 ± 30 92 £ 8 74 ± 0

АЦК 50мкт 88 £ 17 32 ± 2 76 ± 1

Одновременно ускоряя поступление ассимилятов внутрь семени л стимулируя рост зародышей и накопление в них запасных белков, АБК вызывает общую интенсификацию развитая семени, что должно приводить к важным физиологическим последствиям - повышению скороспелости и/или крупности семян. Зто предположение находит подтверя-

дение в ряде наблюдений и опытов. Так в засушливые годы увеличение скороспелости сопровождается значительным повышением содержания АБК во всех частях плода. При любых погодно-климатических условиях, в том числе при нормальном увлажнении и в целом пониженных уровнях АБК, во всех частях бобов верхних мутовок концентрации АБК оказываются выше, чем в нижних. Поэтому в вышерасположенных бобах наблюдается более раннее, при меньшем размере зародыша, начало биосинтеза запасного белка и, в итоге, бобы верхних мутовок созревают одновременно с нижними или даже раньше них, хотя цветение нижних мутовок начинается существенно рачьше. Сравнительный анализ динамики содержания АЕК в двух селекционных образцах люпина, контрастных по скороспелости и массе ЮООсемян, показал, что более скороспелая и крупносемянная линия содержит больше АБК в различных частях плода на всех этапах развития, кроме зрелых семян, в которых концентрация АБК падает практически до нуля.

Несмотря на вывод о положительной роли АБК при формировании семян, вытекающий из описанных экспериментов, некоторые факты: способность АБК и этиленпродуцентов тормозить рост зародышей в культуре, резкое повышение уровней этих гормонов при засухе при одновременном росте количества абортировавших семян внутри бобов - дают основание для гипотезы о возможной причастности АБК и этилена к этому процессу. Партеноспермические, лишенные зародыша, семыа рассматривались нами как определенная стадия абортивности семян. Анализ содержания АБК в таких семенах показал значительное превышение общего количества гормона в них по сравнению с нормальными семенами. Однако из-за гораздо большего объема эндосперма в партеносг.ермических семенах концентрация АБК в эндосперме, даже если все ее избыточное количество отнести к эндосперму, оказывается не выше, чем в эндосперме нормальных семян. Поэтому возникновение эффекта партеноспермии нельзя приписать ингибирующему действию повышенных концентраций АБК внутри семени. Сравнение результатов воздействия на растения обработок растворами АБК, эти-ленпродуцента (кампозана) с эффектом уменьшения притока ассимиля-тов путем удаления листьев показывает, что только в этом последнем случае увеличивается абортивность семян внутри бобов (табл.9).

Эти результаты в сочетании с данными табл.1, демонстрирующими увеличение количества семян в бобах (уменьшение абортивности) под влиянием обработки растений сахарозой, позволяют заключить.

что абортивность семян внутри бобов находится под прямым контролем поступления ассимилятов. сахарозы в частности.

Таблица 9

Влияние ФАВ и удаления листьев на абортивность семян люпина.

Гормональная регуляция прорастания и качество семян. Современные сорта люпина, лишенные признака 'твердокаменности". не имеют внутреннего покоя и способны прорастать сразу же после попадания в подходящие для этого условия. С этим свойством связано достаточно широко распространенное в отдельные годы явление прорастания семян на корню или вивипарии, приводящем к потере жизнеспособности се1«ян. Неявно выраженное, "внутреннее" прорастание такие ведет к снижению качества зерна.

Экзогенные и эндогенные фитогормоны регулируют прорастание семян люпина: в частности, оказалось, что способность к прорастанию на низкоосмотической среде (IX сахарозы) зародышей люпина различного размера связана с содержанием в них эндогенной АБК (рис.9). Зародыши с исходным размером 2,0-3,5 Ш прорастают в течение 5 дней, у зародыией размером 4-7 мм эта способность теряется. и у зародышей, достигших размера 8-9 мм, она появляется вновь. То есть, прорастают зародыши, не достигшие подъема содераа-ния АБК или те, в которых уровень ее угке снижается.

Вариант опыта

% абортировавших семян

контроль АБК, 50 ыг/л АБК, 200 мг/л кампозан, 0,1% обрывание листьев

19,9 ±2,4

14.6 ±2,5 12.0 ± 2,2

27.7 ± 4,3

Рис.9 Прорастание зародышей люпи-'; на пелтого разного размера в культу-it* :': ре in vitro.

1 - 2.0-2.5 мм; 2 - 3.0-3.5 мм; Щ 3 - 4.0-4.5 мм; 4 - 6.0-7.0 мм; */ 5 - 8.0-9.0 мм

Исходные размеры зародыией:

Экзогенная АБК эффективно подавляет прорастание, концентрациях и рост зародышей (рис. 10).

а в больших

Г

о

е"' ' V

■ С

Cf")

К

р f z

V -J- уЗ

я» »

V > 5"!

й-i ii V £ >

¿.Ъ ^ ?4

Рис. 10 Влияние АБК на рост и прорастание зародышей люпина размером 2.5-3.0 мм в культуре In vitro.

1

3 5 7

контроль; 2 -1.0 мг/л; 4 -10 мг/л; 6 -ИУК 1.0 мг/л;

АБК 0.1 мг/л; 2.5 иг/л; ГК 1.0 мг/л;

Изучение гормональной регуляции процессов, связанных с прорастанием зрелых семян, проводили на модельной системе изолированных семядолей лапина, которые росли и зеленели на свету. Оказалось, что цитокинин активно стимулирует, а АБК ингибирует эти процессы. Причем чувствительность к АБК максимальна у семядолей сухих семян, а чувствительность к цитокинину увеличивалась с возрастом проростков в момент отделения семядолей. Рисунок 11 иллюстрирует это антагонистическое взаимодействие и показывает наличие некоторой "запрещающей" концентрации АБК, действие которой не может бить преодолено высокими концентрациями цитокинина.

рЬ .

Рис.11 Влияние АБК и цитокинина на накопление хлорофилла в семядолях люпина, изолированных у проростков в возрасте 3 дня.

1 - БАП 22мкМ; 2 - АБК 3.8мкМ; 3 - БАП 22мкМ + АБК 3.8мкМ; 4 - АБК 19мкМ; 5 - БАП 22мкМ + АБК 19мкМ; 6- АБК 76мкМ; 7- БАП 88мкМ+АБК 76мкМ; Семядоли инкубировали на раство-

рах фитогормонов 24 часа в темноте, а затем 24 часа на свету. Заштрихованные столбики - варианты содераа-цие БАП. Пунктиром обозначен уровень хлорофилла в семядолях водного контрольного варианта, принятый за 100%.

i

—г-100-/

3 4 5 6

Может ли эндогенная АБК играть роль фактора, предотвращающего преждевременное прорастание? В зародышах и оболочках сухих сс-мян уровень АБК падает практически до нуля, и в качестве фактора, ингибирующего прорастание может выступать только АБК створок, содержание которой сильно возрастает в конце созревания (табл. 10).

Таблица 10

Содержание АБК в разных частях созревающих семян люпина (мкг/г)

Вес зародыша (стадия созревания) Зародь'и Оболочка семени Створки бобов

213 мг (белый корешок) 198 мг (появление рисунка) 116 мг (сухие семена) 0.845 0,92 0 2,42 0,56 0,131 1,45 3,78 3.96

Экстракт створок бооов, содержащий АБК (0. бшкг/мл). и раствор АБК в концентрации, соответствующей содержанию ее в створках (1.5мкг/г сырого веса), а также паста из измельченных створок бобов ингибировали прорастание семян люпина (рис. 12). *

Рис. 12 рпияние АБК и экстракта из створок бобов на прорастание семян лзпина аелтого.

1 - контроль; рок бобов. О, ,1.5 м'т/мл;

2 - экстракт из ство-0.61МКГ/МЛ АБК; 3 - АБК 4. - мука створок бобов.

■3 3 S

Про/>аш,чвАНИЯ

Причем этот ингибиторный эффект In situ моает быть гораздо вше, поскольку реальную физиологически активную концентрацию АБК в створках следует рассчитывать не на сырую массу, а на свободную соду, содержащуюся и. створках, и эта концентрация может оказаться намного больше. Можно заключить, что АБК створок бобов играют вагнуы роль в предотвращении прорастания на корню.

Полученные в настоящей работе результаты обобщены в виде схем гормональной регуляции опадения плодозлементов (рис.13) и гормональной регуляции формирования плодов люпина аелтого (рис.14).

Peo. 13 С1эш участия фзтогораонов s регуллца* миденвя пеятнсв Е заляззй лгпиа желтого.

Р«с. 14 Cxeua гормональной регуляция 4ормяровакяя плодов лгпина желтого

На схеме на рис.13 отражена ключевая роль основной пары фи-тогорыонов - ПУК и этилена, регулирующей этот процесс опадения цветков и завязей люпина желтого. Внешний контур, очерченный жирными стрелками, иллюстрирует обнаруженную каш на этой модельной системе физиологическую специфичность этих гормонов в двух различных аспектах регуляции опадения плодоэлсментов на уровне целого растения: этилен является временным координатором процесса опадения и участвует в оперативной остуллции общей степени опадения, а ауксин определяет разницу в опадении верхних и нижних мутовок. Внутренняя часть схемы, с тонкими стрелками, отразкаст антагонистическое взаимодействие этилена и а^-ксина в регуляции образования отделительного слоя, а также влияние других фитогормо-ков и ФАВ на этот процесс. 3 мировой литературе нет данных о рецепторах ауксина и этилена, Функционирующих при опадении, и связанных с ними регуляторных звеньях, поэтому си01ие»<,*ву|ице1л часть схемы отмечена пунктирными стрелками. Однако показано, в частности нами для люпина желтого, что этилен индуцирует опадение плодоэлсментов, а ауксин блокирует чувствительность тканей к ксы/ и подавляет опадение. Знаки + и - указывают на разнонапрызленность этих процессов. Другие фитогормоны и ФАВ также могут влиять на опадение плодоэлементов люпина, что продемонстрировано в прямых опытах, но они играют вспомогательную роль и зачастую действуют через ключевую пару гормонов.

Все элементы схемы на рис. 14 имеют экспериментальное подтверждение в нашей работе. Эта схема иллюстрирует центральную роль абсцизовой кислоты при формировании семени люгшпа делтого. Именно АБК определяет направленность протекания процесса в сторону созревания и накопления запасных веществ, подавляя прорастание, что связано с рЬгуляцией соответствующих генетических программ. Индикатором реализации программы созревания является увеличение биомассы зародышей и накопление в них запасных белков, а прорастания '- удлинение осевых частей зародыша или позеленение изолированных семядолей. АБК действует более эффективно на стадии индукции этих процессов, направленность ее воздействия на них указана на схеме знаками + и -. В ходе дальнейшего фондирования семян АБК согласованно стимулирует различные процессы, связанные с созреванием, играя роль интегрирующего фактора.. Ауксины, гиббереллины и цито-кинины могут стимулировать сак созревание, так и прорастание, в

зависимости от присутствия или отсутствия АБК. и в этом отношении их стимулирующее воздействие на протекающие в семени процессы рассматривается как неспецифическое.

вывода

3. Доказана важная роль гормональной системы б регуляции всех изученных физиологических процессов, связанных с формированием генеративных органов люпина желтого, за исключением абортив-ности ссмян внутри бобов, непосредственно контролируемой притоком ассимилятов. Выделены ключевые звенья гормональной регуляции основных процессов и доказана возможность направленного воздействия на их протекание путем влияния на эти звенья.

2. Этилен и ауксин являются парой фитогорионов, т'&ашщап главную роль в непосредственном контроле процесса опадения цветков и молодых завязей люпина желтого. Первый из них служит прямым индуктором опадения, а второй определяет чувств! тельность отделительного слоя к этому сигналу и является одним из факторов, определяющих компетентность клеток отделительного слоя к восприятию сигнала опадения.

Другие фитогормоны играют вспомогательную роль в регуляции опадения, влияя на аттракцию ассимилятов, активность метаболизма и др.,л1е физиологически важные процессы.

3. Роль этилена и ауксина в системе регуляции опадении пло-доэлементоо на уровне целого растения и его взаимодействия с факторами окружающей среды оказывается различной: градиент ауксина в цветочной кисти определяет разницу в опадении плодоэлемеишо разных мутовок, а этилен является не только индуктором образования отделительного слоя, но и определяет временные границы периода опадения и оперативную адаптивную регуляцию опадения во время цветения в диапазоне от -30% (усиление опадения) до + 15% (уменьшение опадения) от исходного количества цветков.

4. Чтобы обеспечить сброс избытка цветков и осыпание лепестков на оставшихся завязях, а также четко ограничить этот процесс по времени, в растении предусмотрено повышение выделения этилена, которое запрограммировано на уровне регуляции экспрессии генов -увеличения количества транскриптов генов АЦК-синтетазы.

5. Процесс опадения цветков шшш не связан с ограничением

уровня ассимилятов. он имеет адаптивное значение и является явно избыточным. Растение люпина имеет значительный резерв поступления ассимилятов в развивающиеся плодоэлементы, который может быть использован для формирования дополнительного урожая при стимуляции метаболизма бобов или подавлении их опадения с помощью ингибиторов биосинтеза этилена.

С. Все дальнейшее развитие неопавших завязей, включая созревание семян, происходит под знаком особой физиологической роли АБК. Этот гормон комплексно и координирование регулирует важнейшие процессы, обеспечивающие нормальное развитие семени и его жизнеспособность: накопление биомассы (рост) зародыша, поступление ассимилятов, биосинтез запасных белков - и тем самым выполняет роль интегрирующего фактора.

7. Ситогормоны разных групп - ИУК, цитокинин и АБК, могут совместно обеспечивать аттракцию питательных веществ и их перераспределение в плоде - от створок боба к обеючке семени и далее - к зародышу- по мере смещения центра метаболической и аттрагирующой активности, но только АБК способна непосредственно стимулировать разгрузку флоэмных окончаний и приток ассимилятов внутрь семени к развивающемуся зародышу.

о. АБК играет триггерную роль в регуляции развития заридиша: в ее присутствии включается программа развития и созревания семени, в отсутствии АБК - программа прорастания и формирования нового растения. При этом абсцизовая кислота действует эффективнее на стадии инициации процессов как в случае избирательной активации ею биосинтеза запасных белков по программе созревания, так и в случае ингибирующего действия на программу прорастания семян -в запрещающей концентрации она полностью подавляет процессы, связанные с прорастанием и делает их нечувствительней к стимулирующему влиянию других фитогормонов.

9. АБК является главным фактором, препятствующим преждевременному прорастания незрелых зародышей люпина. Накапливаясь о створках' бобов при созревании, она способна предотвращать прорас тание семян на корню. Повышение накопления АБК в створках мохет слукить маркером дли селекции на отсутствие прорастания на корка

. и улучшение качества семян люпина.'

10. В отличие от АБК, строго специфически определяющей направление процесса формировгчия плодов люпина. ИУК. цитопинины и

гиббореллины могут выступать в качество неспецифических стимуляторов разнонаправленных программ развития - созревания в присутствии АБК или прорастания в ее отсутствии.

11, При регуляции как опадения, так и развития и созревания генеративных ооганов люпина желтого полтверждается один из основных принципов работы гормональной системы растений - протекание процессов в целом определяется балансом всех фитогормонов, но при этом можно выделить ключевые гормоны, а остальные фитогормоны играют вспомогательную функцию, модифицируя, усиливая или ослабляя действие ключевых.

¡2. Складывающийся на разных этапах развития растений люпина желтого гормональный баланс отражает адаптивные свойства вида к условиям центра происхождения, но не является оптимальным для нашей климатической зоны. Возможна его коррекция с помощью применения регуляторов роста растений, в частности, применение композиций на основе AHM позволяет увеличить зерновую продуктивность люпина на 25-30/. (до 40/, - в отдельных опытах).

ПУБЛИКАЦИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заякин В.В. Изолированные семядоли люпина желтого как система для изучения механизма действия цитокинина // Физиол. раст,- 1984,- Т. 31. N. 4,- С. 792-795.

2. Заякин В. В., НАМ И. Я., шутов Г. К. Абсцизовая кислота и опадение завязей люпина // Тез. конф. по молекулярным механизмам регуляции метаболитических поцессов. - Минск. 1987.- С.76.

3. Заякин В. В., Нам И. Я.. Кулаева О.Н. Изучение роли абсцизовой кислоты в процессе формирования генеративных органов люпина // Тез. II Всесоюзн. конф. по регуляторам роста и развития растений,- Киев. 1988,- С. 2G7.

4. Заякин В. В. Нам И.Я. Влияние абсцизовой кислоты на развитие оародыший желтого люпина в культуре in vitro // Тез. Меиду-иар. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология". - Новосибирск. 1988,- С. 237.

[i. Заякин В. В.. Нам И. Я., Кулаоьа О.Н. Динамика содержания абсцизовой кислоты в созревающих семенах желтого люпина // Физиол. раст. 1989.- Т. 36. N.6.- С. 1133-1139.

С. Ziydkin V.V., Natu I.Va.. Kulaeva O.K. The regulation of Uie autoklnase activity bound with RNA polymerase of lupin - the

possible mechanism of effects of phytohormones II TliOii. Y Internat. Lupin conference. - Poznan, 1988,- P. B36.

7. Заякин В.В.. Нам Я.Я., Шутов Г.К.. Кулаова О.Н. Роль абС-цизовой кислоты ПРИ СОЗрСВаНИИ И Прорастании vAJMiiri ЛйпиНа ли н ого // Тез. Всесоюзн. конф. "Физиология семян".- Душанбе, 1988,- С. 214-217.

8. Заякин В. В., Нам И.Я. Роль абсцизовой кислоты в эмбриогенезе люпина // Тез. XI '»'еждунар. симп. "Эмбриология и семенное размножение". - Ленинград, 19S0. - С. 10В.

9. Заякин В. В.. Нам И. Я., Шутов Г. К. Содержание абсцизовой кислоты в опадающих и неоппающих цветках и завя- ч ьях люпина желтого //Физиол. и биохимия культ, растений.- 1990.-

Т. 22, N. 4.- С. 344-348.

10. Заякин В. В., Нам И. Я., Шутов Г. К., Кунаева О.Н. Содержание абсцизовой кислоты и накопление запасного белка j созревающих семенах желтого люпина // Физиол. и биохимия культ, растений.-1990. - Т. 22, N. 4.- С.349-354.

11. Заякин р. Б., Нам И. Я., Кулаова О.Н. Возрастные различия в компетентности изолированных семядолей люпина к абсцизовой кислоте // Физиол. и биох. культ, раст. - 1992. - Т. 246 N. 5. - С. 461-4G7.

12. Заякин В.В.. Нам И.Я., Кулаева О.Н. Влияние абсцизовой кислоты на рост зародышей незрелых семян люпина желтого // Физиол. и биох. культ, раст. - 1992. - Т.24, N.5.- C.4S7-472.

13. Заякин В.В., Нам И. Я. Гормональная регуляция экспрессии генов запасных белков в зародышах люпина // Тез. II Всеросс. симп. "Новые методы биотехнологии растений". - Пущино, 1993.- С. 86.

14. Заккин В.В., Нам И.Я. Абсцизовая кислота как стимулятор развития и накопления запасных белков в семенах люпина желтого // Тез. Междунар. симп. "Физиология абсцизовой кислоты". - Пущино, 1993.- С. 41.

15.' Ham I.Y.. Zayakln V.V., Schevelucha V.S. The hormone regulation of seed development of Lupinus luteus (L.) // In: Abstract book of 8th International lupi" conference. Pacific Grove. California, USA. 1996.P.100.

10. Nam I.Ya.. Zayakln V.V. Approaches to the obtaining of interspecies lupin hybrids between species with different chromp-

some number. // In: Abstract book of 8th International lupin conference. Pacific Grove. California. USA. 1996. P.101.

17. Zayakin V.V., Nam I.Va. Expression of germination gene progi oJu uuiiiig seed development of Lupinus luteus (L.). // In: Abstract book of 8Ui International lupin conference. Pacific Grove. California, USA. 1996. P. 177.

18. Zayakin V. V., Naml.Ya.. Schevelucha V.S. Phytohormonal regulation of lupin generative organs abscission. // In: Abstract book of 8th International lupin conference. Pacific Grove. California. USA. 1990. P. 178

19. B.B. Заякин, И. Я. Нам, В. С. Шевелуха. Уменьшение абортио-ности цветков и завязей люпина под действием аминоизомасляной кислоты И Докл. РАСХН. - 1997,- N. 1.- С. 27-29.

20. В. В. Заякин, И. Я. 1!ды. В. С. Шевелуха. Место этилена в сис-'1 ем о регуляции опадения генеративных органов люпина желтого (Lupinus luteus L.) 11 4 международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" . - Москва, 1997.

21. Заякин В.В.. Нам И.Я.. Шевелуха B.C. Гормональная регуляция поступления ассимилятов из оболочки семени к развивающемуся зародышу на модельной системе люпина желтого (Lupinus luteus L.)// 4 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" .- Москва, 1997.

22. Заякин В. В.. Нам И. Я., Шевелуха В. С. Фитогормоны и способность цветков люпина к опадению // 4 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" .- Москва, 1997.

23. Заякин В. В., Нам И. Я. Фитогормоны - прямое звено в механизме регуляции опадения генеративных органов люпина желтого // Мат. межвузовской научно-практ. конф.„ Брянск, 1997.

24. Заякин В.В., Нагл И.Я. Экспрессия гена синтетазы 1-амино-циклопропанкарбоновой кислоты в цветках люпина перед цветением. //Тезисы 3 ежегодного симпозиума "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" .-Москва, 1997.

25. В.В. Заякин, И.Я. Нам. Стимуляция абсцизовой кислотой поступления ассимилятов из оболочки семени к развивающемуся зародышу люпина (Lupinus luteus L.) // "Сизиол. раст. ".-1997.-Т. , N. 6.

Г1о результатам работы поданы заявки на изобретения:

1. В.В.Заякин, И.Я.Нам. Заявка на изобретение "Применение 2-аминоизомасляной кислоты и композиций на ее основе при гибриди-

аации сельскохозяйственных лулшур", N 95 11 6334/13(031474).

2. В. В.Заякин, И. Я.Нам. Заявка на изобретение "Применение 2-аминоизомасляной кислоты и композиций на ее осново для увеличения семенной продуктивности люпина", N 95 11 8075/13(031479).

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОКРАЩЕНИЯ

АБК - абсцизовгь! кислота

АВГ - аминоэтоксивинилглицин

АОА - аминооксиацетат

АЦК - 1-аминоциклопропанкарбоновая кислота

6-БАП - 6-бснзиламинопурин

га - газо-жидкостная хроматография

гк - гибберелловая кислота

дпц - дни после начала ¡¡потения

лен - додецилсульфат натрия

дтт - дитиотристол

ИУК - индолилуксусная кислота

ПААГ - полиакрилаыидный гель

РРР - регуляторы роста растений

ТЙБК - трииодбензойная кислота

Трис - трис-(гидроксиметил)амичометан

ТХУ - трихлоруксусна* кислота

ФАВ - физиологически активные вещества

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

БАМ - 5-(аденозил)метионин

ФГ - фатогорыоны

Автор благодарит за помощь при выполнении данной работы научного консультанта академика В. С. Шевелуху, сотрудников кафедры биотехнологии и лаборатории регуляторов роста МСХА, "проф. О.Н.Кулаеву /ЙФР РАН/, к.Ь.п. И.Я.Наи /БША/, а такав всех сотрудников других учреждений, пранишшах участие в экспериментам а обсуждения результатов.