Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Расширение спектра исходного материала для селекции люпина с использованием методов культуры тканей

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Расширение спектра исходного материала для селекции люпина с использованием методов культуры тканей"

На правах рукописи

ЯГОВЕНКО ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

РАСШИРЕНИЕ СПЕКТРА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ

06.01.05 - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1998

Работа выполнена в лаборатории физиологии и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института люпина в 1989 - 1997 гг.

Научные руководители -

Официальные оппоненты -

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РЭА и РАЕН Б.С.Лихачев кандидат биологических наук, В.И.Коспоченко доктор сельскохозяйственных наук, профессор Г.Г.Гатаулина

кандидат биологических наук, Л.Г.Копертех

Ведущее учреждение -

ВНИИ зернобобовых и крупяных культур

Зашита состоится

199

<£.. Л

гГхз

часов на

заседании диссертационного совета^Д-120.35.04 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева.

Адрес: 127550. Москва, Тимирязевская улица, 49. Сектор защиты диссертаций

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им.К.А.Тимирязева

Автореферат разослан.

199 _ г.

Ученый секретарь диссертационного совета -кандидат сельскохозяйственных наук, доцс^Т^

й. Усманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований, В развитии люпиноссяиия России решающее зиачснис имеет создание стабильно высокопродуктивных, болезнеустойчивых сортов с высокими 1Ш1 отельными свойствами разных направлений хозяйственного использования. Успех селекционной работы во мношм определяется наличием исходного материала - источниками селектируемых признаков. Положительные свойства мирового разнообразия культивируемых пило» люпина практически уже использованы. И в то же время современные сорта люпина имеют немалый ряд отрицательных свойств, ограничивающих их распространение. В свячи с этим необходимо создание принципиально нового исходного материала. Для реализации тгой задачи следует расширить применение биотехнологических методов получения новых генотипов.

Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в разработке метода культуры ткани для люпина, в получении регенерантов, способных служить исходным материалом в процессе направленной селекции этой ценной кормовой культуры.

Для достижения поставленной цели исследований необходимо было решить следующие задачи:

- детерминировать по генетической способности разные виды люпина к недифференцированному росту т уНго на различных средах;

- оценить способность дифференцированных тканей к регенерации;

- изучить ферментативную активность амилазы и пероксидазы, спектры водорастворимых белков и пероксидазы в проростках, каллусах основных видов люпина как критерий морфогенеза в разных условиях культивирования;

- изучить идентичность запасных белков семян растений-регенерантов и их исходных форм методом электрофореза;

- разработать схему получения растений регенерантов.

Научная новизна исследований. Проведено широкое сравнительное испытание различных по составу питательных сред и установлена их каллусогенная эффективность для 13 видов люпина. Оценена способность дифференцированных тканей к регенерации. Разработан метод регенерации растений из дифференцированных тканей проростков желтого, узколистного и многолистного люпина. Разработан состав среды для регенерации побегов из тканей незрелых зародышей желтого и узколистного люпина. Выявлена зависимость активности амилазы и пероксидазы в каллусах с регенерационной способностью. Изучена динамика концентрации белка и электрофоретическая подвижность его водорастворимой фракции в каллусах и проростках люпина. Установлены генотипнческие различия между растеннями-регснерантами и их исходными формами.

Практическая значимость исследований. Предложена схема получения растений - регенерантов из дифференцированных тканей пророегков люпина желтого, узколистного, многолистного, а также тканей незрелых зародышей узколистного с использованием методов культуры ткани, что открывает возможность получения нового исходного материала для селекции этих видов люпина.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных отчетах Всероссийского научно-исследовательского института люпина (1989-1996 гг.), на научной конференции "Вклад молодых ученых в развитие агропромышленного комплекса Нечерноземья" (Немчиновка, 1993 г.), на научной конференции БГСХА "Совершенствование технологий возделывания сельскохозяйственных культур в условиях биологизации растениеводства" (Кокино, 1997 г.).

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Диссертационная работа рассмотрена и одобрена на расширенном заседании кафедры кормопроизводства, селекции и семеноводства Брянской сельскохозяйственной академии (1997 г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 24 рисунка и 14 приложений. Библиографический список включает 207 наименований, из них иностранных - 140.

Материалы и методы исследований. Материалом исследований в основном служили культивируемые в сельскохозяйственном производстве Российской Федерации виды люпина: люпин желтый (Lupimis luteus), узколистный (L. angustifolius), белый (L. albus) и многолистный iL. polyphyllus) а также ряд других видов основных центров происхождения.

В качестве эксплзнтов для получения каллусов использовали фрагменты различных органов растений на разных стадиях развития: незрелые и зрелые зародыши, семядоли, семядоли с частью оси проростка, верхушечные и пазушные меристемы.

Для работы с культурой ткани в основном использовалась методика Р.Г. Бу-тенко(1964).

Семена подвергались поверхностной стерилизации: 20 минут в 96% этаноле, 15 минут а 0.1% растворе диацида с последующей пятикратной отмывкой стерильной водой. Стерильные проростки получали высевая стерильные семена на "голодный" агар.

Для стерилизации тканей вегетируюших растений (проростков, зародышей, полученных из нестерильных семян) использовался метод, предложенный фирмой "Колбиохим-Беринг" (Fitter M.S., Krikorian A.D., 1982)

Схема стерилизации

1) инкубация в 1% -ном растворе тритона Х-100 3 мин;

2) промывка водопроводной водой;

3) промывка дистиллированной водой;

4) инкубация п 70%-ном этаноле 10 сек.;

5) инкубация в 3%-ном растворе хлорамина Б в присутствии

0.03%-ного тритона Х-100 6-10 мин.;

6) пятикратная промывка стерильной дистиллированной водой.

В качестве питательных срсд: Мурашиге-Скуга (Murashige Т., Skoog F., 1962), Гамборга В5 (Gamborg O L., Miller R.A., Ojima К., 1968), Нича (Kyt; L., 1988). Хеллсра (Kyte L.. 1988), Миллера (Kyte L.. 1988), Линсмайера-Скуга (Sroga G. E.. 1983), Смирнова (Смирнов A.M., 1970).

В автоклавкрованную и охлажденную до 50°С среду добавляли витамины и гормоны, стерилизованные фильтрованием (Millipore GS 0.22мкм). Стерильные работы проводили в ламинарном боксе типа УО-БВ.

Условия культивирования:

- в темноте, в термостате при 26°С;

- на стеллаже при комнатной температуре, освещение люминесцентными лампами (5000 люкс, фотопериод 16 часов).

Водорастворимые белки из проростков, незрелых зародышей, каллусов экстрагировали 0.09 М трис-буфером с 0.08 М борной кислотой, 2,5 мМ ЭДТА и I мМ ингибитора протсаз PMSF (фенилмстилсульфонилфторид) pH 8.4. Соотношение

paci тельной гканн и буфера I: К) (\V:V) для проростков и незрелых зародышей и 1:5 для каллусов.

Из семян водорастворимые белки экстрагировали 0.0625 М трис-HCI буфером (рН6,8) с 5 мМ PMSF. Соотношение навески муки и буфера 1:10.

Электрофоретический анализ белков проводили в нативных и денатурирующих условиях по методу Лэммлн (Laemmli F.. 1970).

Для определения активности амилазы и пероксидазы использовали общепринятые методики (Плешков Б.П., 1985).

Изоферменты пероксидазы на электрофорефаммах выявляли по Эвансу (livans J.. Alloige N.. 1965) Концентрацию белка - по Бредфорду (Bradford М.М., 1976).

Результаты исследований

Особенности недифференцированного роста люпина в условиях in vitro. В Настоящее время не существует единого научно-обоснованного подхода к подбору питательных сред. Офаниченность данных по культуре люпина и бессистемность большого количества эмпирически подобранных сред по другим культурам склонили нас к необходимости сравнительного анализа наиболее часто используемых и наиболее контрастных по составу сред.

Нами изучалась индукция неорганизованного роста тканей люпина на шести питательных средах: Линсмайера - Скуга (LS), Гамборга (Bs), Нича, Хеллера, Смирнова и Миллера. Каждая среда испытывала«, в двух модификациях: с добавлением активированного угля (1,5 г/л) и без него. В опытах использовали проростки и полевые растения нескольких десятков линий и сортов люпина (Laiigusrifolius. L.luteus, L.albus. L.polyphyllus, L.mutabilis). Для посева на агаризован-ную питательную среду использовали стерильные фрагменты пятидневных проростков гипокотиля (7 - 15 мм).

Перед массовым скринингом видов люпниа на приведенных средах прослежено влияние разных концентраций фитогормонов (табл. I) на недифференцированный рост тканей проростков четырех коллекционных образцов: люпина белого (Козелецкий), узколистного (Брянский 123) и желтого (Нарочанский, K-I495). За основу взята среда LS (табл. 2).

Таблица 1

Сочетания концентраций фитогормонов

Вариант Концентрация фитогормона, мг/л

2,4-Д (ауксин) БАП (цитокинин)

1 0.00 0.00

2 0.50 0.50

3 5.00 0.10

4 2.00 0.05

5 2.00 0.30

Показано, что люпин обладает заметными видовыми и в отношении желтого люпина сортовыми различиями в способности к каллусообразованию. Для узко-

лиспюю лкшииа характерно четко выраженное каллусообразование при 2-ом и 3-м вариантах сочетания фитогормонов. Узколистный люпин Брянский 123 обладает наименьшей избирательностью к сочетанию фитогормонов в питательной срсде. После 90 дней инкубирования Брянский 123 значительно превосходил сорта желтого и белого люпина ы индукции каллусообразования при 2, 3, 4 вариантах сочетания фитогормонов.

Таблица 2

Влияние различных фитогормонов на индукцию и рост каллусов люпина

Сочетания Сорта люпина

фитогормо- Брянский 123 К- 495 Нарочанский Козелецкий

нов 20 90 20 90 20 90 20 90

дней дней дней дней дней дней дней дней

1 - - - - - - -

2 +++ ++++ + ++ + ++ - -

3 ++ + +++ + +++ + ++ - +

4 + ++++ - + + ++ - -

5 - + - + - - - +

Условные обозначения: - каллус не индуцировался, ткань погибла;

+ ограниченное формирование каллуса в местах порезов ткани, по массе каллус

не достигает массы исходного фрагмента тканн; ++ локально индуцированный каллус достигает массы исходного фрагмента ткаии;

+++■ неограниченный медленный рост каллуса; ++++ неограниченный быстрый рост каллуса.

Сорта желтого люпина более требовательны к соотношению концентраций фитогормонов. Так, за 20 дней инкубирования при 4 и 5 вариантах сочетания фитогормонов в среде рост каллуса у них практически отсутствовал.

В отношении процесса каллусообразования наиболее консервативным оказался белый люпин. Для выяснения причин, затрудняющих индукцию и рост каллуса этого сорта - обусловлено ли это составом питательной среды, природой ли фитогормонов или это обусловлено генетически - нами была предпринята попытка индукции процесса каллусообразования белого люпина на трех питательных средах: MS, LS и Смирнова при широком диапазоне концентраций фитогормонов (2.4-Д - до 8.0 мг/л, БАП - до 0.8 мг/л) на фоне Са2' - от 0 до 1.8 мг/л, Ca(NO,h . 4Н20 и сахарозы - от 0 до 40 г/л. В эксперименте отмечено слабое каллусообразование через 25 дней инкубации на среде LS при концентрациях 2.4-Д - 4.0 мг/л и БАП - 0.2 -0.7 мг/л. Отсутствие кальция в среде несколько усиливает каллусообразование, но удовлетворительного роста каллуса используемого генотипа добиться так и не удалось.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что оптимальным сочетанием концентраций фитогормонов для каллусообразования у узколистного и желтого люпина является - 0.5 мг/л - 2.4-Д и 0.5 мг/л - БАП.

С целью идентификации оптимальной среды для индукции каллусообразования и изучения видовых и генотипических особенностей люпина к недифференцированному росту in vitro нами изучено более 40 сортов и форм i 3-ти видов люпина на 6 питательных средах (тзбл. 3).

Таблица 3

Интенсивность каллусообразования люпина на различных питательных средах

№ Образец В5 Нича Хеллера Смирнова Миллера

б/угл. | уголь б/угл. | уголь б/угл. 1 уголь б/угл. | УГОЛЬ б/угл. | уголь б/угл. | уголь

Ышеи5

1. Дружный 165 + + + + + + + + + - - - + + поб. -

2. Мартин 2 + + - + + - + - + + + + - - - -

3. К- 2004 + + + + поб. +• + - + + - + + поб. + -

4. К- 2290 (дик.) + + + + + + поб. + + - - - + + корн. - -

5. Ипутьский + + - + - + + - - + + + -

6. Факел + + + +■ + - - - - + поб. +

7. Цит + + + поб. + - - - + + поб. - -

8. Афус + + + - - - - - + поб. + -

9. Брянский 6 + + + поб. + + - + - + + - + + +

10. К- 1551 + + + + + + + + + + поб. + - - - - поб.

11. Родник + + + + + + + + + + + + - - корн.

12. Кастрычник + + + + + корн. - - + - -

13. Нарочанский + поб. •+ + + + - - - + + поб. + -

14. Искорость + поб. корн. + + поб. + + + - поб. + + +

15. К- 1495 + + + + + + - - + - + + + -

16. К- 1730 + + + + - - корн. - - - поб. - -

17. Академический 1 + + поб. + + - - - - - + + - -

18. Мотив 369 + + + + + - - - + .. - _ -

Ь. ап КихпСоИиБ

19. К-401 ат-д-2-г/5 + + + поб. + + - поб. - - корн. + + + корн. - поб.

20. К- 402 ат-Д-2-гЛ + + + поб. + + - - - + + + + + поб. корн. - ■ -

21. К-403 Лаф-рбсЛ +■ + поб. + - - - + - + - + -

22. К-404 Лаф-рбс/10 + + поб. + + + - + + + поб. - поб.

23. К-405 ке-д-3-р + + поб. + + + + - + +■ + поб. - + + поб.

№ Образец LS В5 Нича Хеллера Смирнова Миллера

б/угл. уголь б/угл. уголь б/угл. уголь 6/угл. уголь б/УГЛ. уголь б/\ГЛ. утоль

24. К- 406 дм-33 + + - + + + поб. - + + + + + + + поб.

25. К- 407 дм-396/77 + + + + - - - + - + поб. + -

26. К-410 линия H.<s 10 + + поб. + + поб. + + + + поб. +

27. Новозыбковский + + + поб. + + поб. + поб. - - + + - -

28. Брянский 123 + + + поб. корн. + + поб. + + - - + + поб. > -

29. 109 п-2 + + + - + + + - + + поб.

30. L.albus Ортам + + - + - - - - - + поб. - -

31. L.albus Козелецкий + - - - - - - - + - поб. -

32. L.albus с.н. 73 + + поб. + поб. - - + + - .V поб. - -

33. L.albus с.н. 72 + - + поб. - - + + - - поб.

34. 1С-604 L.elepans + - + + корн. + - + + + - корн. + -

35. К-605 L. succulentus + + + + + + + - + - - + + - + корн. + + + + +

36. К-617 L. micrauthus ' + + + + + -V - - - - - _ . - - -

37. К-630 L. cosentini + + + + + + + + + + + поб. + + +

38. К-634 L. hybridus Lern 16 + + + + + + + + - + + + + + + поб.

39. К-635 L. mutabiüs 35 + + + + ++ поб. + - + + + -f + + + +

40. К-636 L. mutabilis 36 +++ + + + + поб. + + + + + + + + + + +

41. К-637 L, mutabilis 37 ++++ + + + + поб. + + + + + + + + поб. + поб.

42. L. albococcineus + + + + + 4 + поб. + + + + + + + поб. + поС.

43. L. annual + + + + + + + + + + + + + ++++ + +■ +

44. L. donglasii + + + + + + + + + + + + + + + + + +

45. L. polyphyllus ++++ поб. + + + поб. + + .+ + + + + ++++ поб. + + +

46. L. polyphyllus (с белыми цветками) ++++ поб. + + + поб. + + + + + + поб. + +

Обозначения те же, что и в таблице 2.

Концентрация фнтогормоноп в этой серии опытов была постоянна - 2.4-Д -0.5 win. BAIT - 0.5mi7;i.

Наиболее "каллусогенными" на всех питательных средах являются виды люпина {.. polyphyllus it I., mulabilis, 1- annual, I., donglasii. I., succulentus. Наиболее благоприятна для индукции и роста каллусов большинства изученных видов люпина -среда LS, хорошие результаты получены и на срелах-Bs й Смирнова.

Выявлена значительная межвидовая и генотипнчсская гетерогенность как по .способности иидуци'ровать недифференцированный рост на одной и той же среде, гак н по особенностям поведения их на разных средах.

Так. среди изучаемых образцов желтого люпина для сортов Дружный 165, К-2290, Брянский 6, Родник характерна наиболее интенсивная индукция каллуса на среде LS без угля. На средах Хеллера и Миллера - она практически равна нулю. У сортов Факел, Цит. Афус. Кастрычник, Нарочанский, Искорость, К- 1730 формирование каллуса отмечено лишь в местах среза ткани.

У сортов узколистного люпина способность индукции каллусогенеза, по сравнению с сортами желтого более выражена. Среди образцов этого вида наметились "лидеры" в способности к формированию каллуса. Это К- 401, К- 402, Но-возыбковский, Брянский 123. Как и для желтого люпина среда LS является лучшей для каллусогенеза.

Наиболее трудно поддается клонированию люпин белый - лишь незначительная индукция каллусообразоаакия отмечена на среде I.S. Добавление в питательную среду активированного угля в подавляющем большинстве случаев делает се практически непригодной для индукции недифференцированного роста.

Показано, что интенсивность каллусообразоваиия у многих форм люпина на разбавленной вдвое среде I.S выше, по сравнению с полной. На примере наиболее каллусогсниых видов люпина (многолнетный и узколистный) прослежена динамика роста каллуса, полученного из эксплантов гипокотиля проростков (рис. I (.Отмечена значительная межвидовая дифференциация по этому показателю: скорость роста каллуса двух форм многолистного люпина в 20-100 раз интенсивнее, чем у сортов узколистного. Следует отметить и более выраженную межсортовую гетерогенность по скорости роста культуры каллуса у люпина узколистного: уровень этого показателя для сорта Новозыбковский в несколько раз выше, чем для сорта Брянский 123.

Таким образом, способность образования каллуса и интенсивность его роста в значительной степени определяется генотипом.

Самой эффективной средой для индукции и поддержания роста каллусов изученных генотипов люпина является среда Линсмайера-Скуга (LS),богатая витаминами и органическими компонентами. Разбавление среды в 2 раза способствует более эффективному росту каллусной ткаии. Диапазон концентрации фитогормо-нов (ауксинов и цитокишшов), поддерживающих рост каллусов, может быть значительным. На безгормональной среде индукция каллусоп не идет. Добавление в питательные среды активированного угля ингибирует рост каллуса.

Дин

Рис. I. Динамика роста культуры каллуса из эксплантов гипокотиля проростков люпина

узколистного:

1 - Брянский 123; 2- Новозыбковсхий; многолистного:

.1 - синецветковая форма; 4 - белоцветковая форма.

Способность дифференцированных тканей к регенерации

Регенерация побегов из фрагментов проростков люпина. Способность дифференцированных тканей люпина к регенерации побегов и корней на разных средах является базисом для получения в определенных условиях полноценных растений -рсгенерантов.

В отличии от каллусогенеза индукции способствует добавление в питательные среды (1.5. В$. Смирнова) активированною угля (1.5 г/л) или простое разбавление среды в 2 раза.

Следовательно, открывается возможность ускоренного размножения люпина микроклонированием без стадии каллусообразования. И именно это делает особенно актуальной разработку методических подходов для вегетативного размножения разных видов люпина.

Исходным материалом в этой серии наших опытов служили 3-7 дневные верхушечные и пазушные меристемы проростков.

Нами установлено, что наиболее оптимальной для микроклонального размножения многолистного люпина является среда ЬБ со вторым сочетанием компонентов <N^N03- 825 мг/л; 475мг/л ; БАП- 1.0 мг/л; ИУК- 0,04 мг/л).

Побеги, вычлененные из конгломератов и посаженные на свежие питательные среды с фитогормоиами, обнаруживают способность к дальнейшему умножению числа побегов в каждом последующем пассаже и таким образом появляется реальная возможность получения неограниченного числа побегов от одного экспланта.

Культивируя пазушные почки многолистного люпина в течение 3 х месяцев с пересаживанием на свежие среды через 3 недели, нами получено до 75 побегов.

Изучение соотношения числа индуцированных побегов и коицензраций компонентов питательной среды показало, что оптимальными для размножения узколистного люпина являются: сахароза в концентрации 15 г/л; минеральный азот в половиной дозе от LS, БАП 1.0 мг/л и ИУК 0.1 мг/л.

Узколистный люпнн значительно уступает многолистному по количеству индуцированных in vitro побегов.

Невозможность дифференцировать компонентный состав среды для стабильного корнеобразования у лроростков-рсгенерантсв белого и желтого люпина вызвала необходимость подбора других, более специфичных, условий эксперимента: изучение зависимости степени регенерации растений люпина от природы и возраста экспланта (1-, 3-, 5-, 7-, 9-ти дневные семядоли, семядоли с частью оси проростка, верхушечные почки).

Показано, что у люпина узколистного максимальное число нормально развитых растений получено при использовании в качестве эксплантов семядолей с частью оси трехдневных проростков.С увеличением возраста проростка замедляется процесс ризогенеза, но перенос побегов на половинную среду Гамборга без гормонов способствует его более активному развитию.

Наиболее перспективным эксплантом для получения регенерантов у люпина белого является также семядоля с частью оси 3-5-дневных проростков. И в этом случае заметно замедляется ризогеиез.В отличие от люпинов белого и узколистного на эксплантах -семядолях люпина желтого, на примере сорта Искорость отмечена максимально выраженная регенерация нормальных растений ( среда - I/2LS+ 0.2мг/л БАП + 0.02мг/л НУК), которая в меньшей степени зависит от возраста проростка.

Растения трёх видов люпина, полученные в серии этих опытов были высажены в стерильную почву в лабораторных условиях. Кроме того, 20 растений сорта Искорость перенесены непосредственно из питательной среды в полевые условия. Девять растений-регенерантов сформировали полноценный урожай. Трансгрессивных или гетерозисных форм по продолжительности вегетационного периода не выявлено. В то же время было отобрано 4 растения-регенеранта, превосходящих исходную форму по количеству бобов и массе семян с растения.

В полевых условиях продуктивность растений-регенерантов узколистного люпина Брянский полученных in vitro из пазушных почек, в целом не превышала уровня исходной формы. Однако из верхушечной почки коллекционного образца К-402 (АТ-Д-Г/1) нами регенерировано полноценное растение. На рисунке 2 этот регенерант представлен в фазе бутонизации.

Рис.2. Регснерзнт сортообразцз К-402 (АТ-Д-2-Г/1) в фазе бутонизации.

Для регенерата характерен необычно высокий уровень завязываемости бобов - 202 боба. Под тяжестью бобов два боковых побега обломились, в фазу созревания убрано 123 боба. Общая масса зрелых семян составила 47.0 граммов. Для расшифровки механизма такой уникальной семенной продуктивности, а также изучения донорских свойств этого признака соргообраэец К-402 (АТ-Д-Г/1) включен в широкую систему скрещиваний. При получении гибридных семян Рг представится возможность проведения полною гибридологического анализа и оценки его донорских свойств.

Развитие незрелых зародышей люпина па различных питательных средах. На питательных средах, различных по составу минеральных компонентов и гормонов, нами изучен характер процесса регенерации незрелых зародышей белого, желтого и узколистного люпина.

Питательные среды готовили на основе Мурашиге и Скуга и Гамборга В5. Исследуемые варианты сред приведены в таблицах 4 и 5.

Среду В5 готовили двухфазной, т.е. в автоклавированной и охлажденной ага-рмзованной среде в стерильных условиях делали углубления, которые заполняли жидкой средой, и в них помещали незрелые зародыши. Гормоны, стерилизованные фильтрованием, добавляли только в жидкую среду. В отдельных экспериментах вместо двухфазной среды использовали В5 со сниженным содержанием агаря - до 5 г/л. Выращивали зародыши при освещенности 5000 люкс, фотопериод 16 ч.

Таблица 4

Состав среды для культивирования незрелых зародышей люпина (основные

компоненты и витамины - согласно М5)

Вещество 1 2 3 4 5 6

Гидролнзат казеина, г/л 2.0 2.0 2.0 • - 2.0 -

БАП, мг/л 1.5 1.5 1.5 - -

НУК, мг/л - 2.0 2.0 - -

2.4 - Д, мг/л - - - 2.0 5.0

Кинетин, мг/л - - - 0.25 -

Итаконовая кислота, мг/л - - - - 1.0

Таблица 5

Содержание гормонов в различных вариантах среды В5 для незрелых

зародышей люпина_

Гормоны 1 2 3 4

БАП - 0.1 - -

ИУК - 0.01 0.05

Зеагин - - 0.5 -

2.4-Д - - - 0.1

Кинетин - - - 0.01

Таблица 6

Получение полноценных растений из незрелых зародышей трех _видов люпина на питательных средах группы М5__

Вид люпина Питательная среда MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6

L. angus-tifoiius Высажено зародышей, шт. 16 - 43 20 7 -

Получено нормальных растений, шт. 0 - 5 0 0 -

% нормальных растений 0 11.6 0 0 _

L.luieus Высажено зародышей, шт. 16 12 10 12 - 12

Получено нормальных растений, шт. 0 1 0 1 - 0

% нормальных растений 0 8.3 0 8.3 „ 0

L. albus Высажено зародышей, шт. 13 7 12 10 34 17

Получено нормальных растений, шт. 0 0 0 0 2 0

% нормальных растений 0 0 0 0 5.9 0

При культивировании зародышей, достигших размеров 1.5-2 им на средах с добавлением 2.4-Д и кинетина происходит образование каллуса. По нашим наблюдениям люпин всех исследуемых видов, а в особенности белый переходит к каллусообразованию на среде МЗ с низким содержанием фитг?гормонов (0.1 мг/л 2.4-Д; 0.1 мг/л кинетина).

Результаты культивирования незрелых зародышей трех видов люпина на двухфазных питательных средах, приготовленных на основе В5, представлены в таблице 7 (гормональный состав сред приведен в табл.5).

Наибольший выход здоровых нормальных проростков получен для зародышей узколистного люпина. Незначительно уступает по выживаемости желтый люпин. Для белого люпина, как свидетельствуют результаты, данные среды не подходят.

Таблица 7

Получение нормальных растений из незрелых зародышей люпина на разных __вариантах среды В5__

. Узколистный Желтый Белый

Вариант Отношение Отношение Отношение

среды зародышей к % зародышей к % зародышей к %

норм. раст. норм. раст. норм. раст.

( 11« 82 9/7 78 14/2 14

2 10/6 60 9/6 67 13/0 0

3 10/9 90 11/7 64 12/2 17

4 13/9 69 12/8 67 - -

На разбавленных вдвое питательных средах МЯ и В5, не содержащих гормонов при добавлении в эти среды БАП 0.05 -0.1мг/л на короткий срок (1-2 недели) незрелые зародыши начинают развиваться в нормальные проростки, что даст возможность получить полноценные растения из зародышей на ранних стадиях развития. Это открывает перспективы для получения межвидовых гибридов. От 19 растений-регенерантоз узколистного люпина с.н. 479 получено потомство третьего поколения. Внутри каждой семьи обнаружены формы различные по морфотипу, скороспелости, семенной продуктивности, устойчивости к вирусной узколистно-сти. Предполагается, что они послужат исходным материалом для направленной селекции узколистного люпина

Биохимический контроль тканей и регенерантов

Качественный и количественный состав водорастворимых белков, активность амшазы. яероксидази в тканях разных видов люпина. Выбор исследуемых биохимических показателен обусловлен, в первую очередь, их важной физиологической ролью. Так, амилазная активность в норме резко возрастает при прорастании семян и экспериментально доказано, что сохранение высокой амилазной активности в каллусах зерновых - залог успешной регенерации растений из каллусов. Перокси-дазная активность в тканях растений выполняет защитную функцию при вирусной и грибной инфекциях. Она повышается в результате интродукции возбудителей в растительные ткани, а также при любых механических повреждениях тканей. С этим связана и повышенная пероксидазная активность в каллусах растений. Поэтому необходимо выяснение возможного влияния уровня активности этого фермента в каллусах люпина на морфогенетический потенциал. Исследования проводили на проростках и каллусах четырёх видов люпина • желтого, узколистного, белого и многолнетного.

В одинаковых условиях экстракции из трёхдневных проростков экстрагируется больше белка, чем из 10-дневных, а из каллусов - меньше., чем из 10-дневных проростков. Концентрация белка в экстрактах трёхдневных проростков разных видов люпина коррелирует с содержанием белка в зерне люпина разных видов', больше всего в желтом, затем в белом, узколистном.

Амилазная активность обнаруживается во всех исследуемых экстрактах. Как и предполагалось, высокая активность наблюдается в набухших семенах, а затем по мере роста снижается, за исключением многолистного люпина.В 10-дневных проростках активность амилазы ниже, чем в 3-х дневных. В каллусах активность амилолитических ферментов также присутствует. Необходимо отметить, что в каллусах многолистного люпина эта активность выше и максимальна через 2 неде-

;in культивирования. Нами показано, что каллусы многолистного люпина обладают высоким рсгенераиионным потенциалом - были получены растсния-регенеранты. Это свидетельствует о возможной зависимости амилазной активности и регенерирующей способности каллусов многолистного люпина.

В каллусах желтого и узколистного люпина амилазная. активность также довольно высокая, и при том повышается в пересчете на единицу белка к третьей неделе культивирования.

В каллусах многолистного люпина пероксидазная активность намного ниже по сравнению с желтым и узколистным. Вероятно, благодаря этому, многолистный • люпин обладает определенным механизмом быстро приспосабливаться к условиям in vitro.

При переходе от интактных проростков к культивируемой в условиях in vitro растительной ткани изменяется не только содержание белка на единицу сырой массы, но и активность ферментных систем, в частности, амилазы и перокендазы.

Динамика видовых и генотипических особенностей биохимических показателей е тканях люпина в зависимости от условий их культивирования. Генотипические и межвидовые особенности содержания белка в проростках и каллусах люпина, активности амилазы и пероксидаэы в них исследованы нами в различных условиях культивирования. Динамика содержания белка и активности ферментов пероксидаэы и амилазы в первые зри недели каллусообразования прослежена без обновления питательной среды. Содержание белка на мг сырой массы по мере развития каллуса падает: уже к 7-дневному возрасту каллуса его снижение достигает 5-6 раз в зависимости от сорта. Объяснить это можно, по-видимому, появлением большого числа вакуолизированных клеток.

Активность ферментов, напротив, возрастает в 1,5-3 раза уже через 2 суток после помещения эксплантов на питательную среду. Необходимо отметить, что некоторые кривые изменения активности имеют пик в точках 7 - 10-ти дней и затем, после спада, соответствующего 10-14-му дню, наблюдается дальнейший рост. Этот подъем активности ферментов, в особенности пероксидазы, вероятно, обусловлен истощением среды и, вследствие этого, мобилизацией всех сил экспланта направленных на выживание. Пики активности в 7-10 дней представляют интерес для дальнейшего исследования, так как они отражают процессы, происходящие в тканях, когда ещё нет видимых изменений (рис. 3-4).

Динамика видовых и геиотипических особенностей белкового метаболизма тканей интактных проростков и каллусов люпина, особенно активности перокси-дазной и амилазной системы существенно зависит от условий и продолжительно-сги их культивирования.

Электрофоретический состав водорастворимых белков тканей люпина. Экстракты из проростков содержат в большой степени медленнодвижущиеся белки. Для трёхдневных проростков характерно присутствие интенсивно окрашивающихся компонентов. Электрофорез в денатурирующих условиях показал качественную и количественную гетерогенность полипептидных цепей как в проростках разных видов люпина, так и в зависимости от возраста. Как в нативных, так и в денатурирующих условиях электрофорез экстрактов из каллусов выявил превалирование ннзкомолекулярных фракций белков, которые отсутствуют в спектрах проростков в нативных условиях и представлены в меньшем количестве в денатурирующих условиях. Такие различия становятся очевидными, если принять во внимание функциональную ограниченность каллуса. Важно отметить, что на данном этапе иссле-

Д|ш;нм!Й не обнаруживаются замешме различия и поведении белков миоголиайоги .помтш и лрм их и чучекиых видов.

Ст-.Л Изменение амилазиоП активности в каллусах желтого и узколистного люпина:

1 выращивание на среде ШМЬ с I мг/л 2.4-Д и 0.1 мг/л кннетина на свету, при комнатной температуре;

2 на той же среде, в темноте, при 26°С;

3 на среде !/2ЬБ с 1.5 мг/л БАП и 2.0 мг/л НУК, на свету, при комиатной температуре;

4 - на той же среде, в темноте, при 26°С.

Рис. 4. Изменение лероксидазной активности в каллусах желтого и узколистного люпина. Обозначения те же, что на рисунке 3.

Результаты электрофоретичесхого анализа нзоферментного состава перокси-дазы каллусных тканей этого же набора видов и сортов люпина показывают, что изоферментный состав каллусов одного вида люпина изменяются не только от возраста тканей, но и от гормонального состава питательной среды.

Нами показано, что наиболее широкий изофермектный спектр пероксидазы каллусов, с учетом продолжительности культивирования на питательных средах для узколистного и многолистного люпина обеспечивает среда MS.

Изменения белков luomina желтого и узколистного при культивирогании ткачей in vitro. Семена исходных форм и регенерантов использовались в исследованиях злектрофоретических спектров белков с целью изучения их идентичности. Анализ полученных электрофореграмм показал заметные различия белковых спектров между видами, в то время как внутривидовые различия в спектре полос желтого и узколистного люпина не заметны. На фоне почти полного .отсутствия различий внутри вида при детальном анализе исходных форм и растений-регснерантов некоторых сортов эти различия имеют место. Так, например, между исходными формами и регенерантами узколистного люпина Митан и Ащадный видимых различий практически не обнаружено. Исключение может составить выделяющийся по цвету (розовое окрашивание) полипептид, присутствующий в спектре регенерантов.

В спектре белковых полос желтого люпина отмечены следующие различия:

1. В спектре регенеранта см. 122/90 практически не просматривается полоса с относительной подвижностью (Rf) 0.72, которая присутствует у исходной формы.

2. В спектрах белков семян двух независимо полученных растений-регенераитов сорта Брянский 17 в высокомолекулярной области спектра видимых различий нет, а в зоне с Rf 0.72 очевидна разница между двумя регенерантами, причем, один регенерант отличается от исходной формы.

3. В спектре белков сорта Мутант 273 наблюдается ряд различий по интенсивности окрашивания полос идентичных по относительной подвижности. Также можно обнаружить качественные различия. Например полоса с Rf 0.42 (розовая окраска) присутствует в спектре исходной формы, но её нет в спектре регенеранта.

4. Особенно интересные результаты дает анализ белковых полос регенеранта и первого поколения этого регенеранта сорта Цит. Отмечены отличия его белкового спектра от спектра белков исходной формы. Они подтвердились и при сравнительном анализе его с белками семян первого поколения этого регенеранта. Исследование идентичных по относительной подвижности (Rf) полос в высокомолекулярной области показало различную их интенсивность. В спектрах белков исходной формы окрашивание более интенсивное, чем в спектре регенеранта и первого поколения этого регенеранта. В низкомолскулярной зоне наблюдается обратная зависимость. В спектре белков регенеранта нарушается соотношение интенсивности окрашивания идентичных по Rf полос по сравнению с исходной формой. Полипептид с Rf 0.17 в спектре исходной формы окрашен более интенсивно, чем полипептид с Rf'0.20. В спектре раек ера ига это соотношение обратное. Вероятно, различия в интенсивности проявления полос в белковых спектрах вызваны различной активностью регулхторных генов, что в основном отражается в виде изменения количественного содержания белков в полосе. Кроме указанных выше количественных отличий в спектрах белков исходной формы и растений-регенераитов сорта Цит существуют и качественные. В спектре регенеранта появилась полоса с Rf 0.72, которая унаследовалась в первом поколении. Следует отметить, что высокомолекулярные белки в первом поколении регенеранта отличаются как от исходной формы, так и от самого регенеранта.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлены различия в спектрах белков некоторых растений - регенерантов и исходных форм. Следова-гельно, даже кратковременное инкубирование в культуре in vitro может сопровождаться изменениями белковых спектров.

ВЫВОДЫ

1. Генотипы изученных видов люпина различаются по способности к каллусооб-разованию. Наиболее эффективной средой для индукции и поддержания роста каллусов является среда Линсмайера Скуга (I.S), содержащая по 0.5 мг/л 2.4-Д и БАП.

2. Установлена видовая и генотипическая специфичность динамики процесса кал-лусообраэова н ия.

3. Добавление в питательную среду активированного угля ингибируеткаллусооб-разование и способствует регенерации фертильных растений из дифференцированных тканей проростка.

4. Разработаны составы питательных сред для микроклонального размножения люпина желтого, узколистного и многолистного из пазушных и верхушечных меристем проростков.

5. На среде Гамборга (В5) и Мурашиге и Скуга (MS) получены полноценные рас-тсния-регенеранты из незрелых зародышей многолистного, узколистного и желтого люпина.

6. Перевод тканей люпина всех изученных видов (желтый, узколистный, белый, многолистный) в культуру in vitro сопровождается падением содержания белка и изменениями его качественного состава.

7. Активность амилазы и пероксидазы в проростках и каллусах коррелирует с ре-генерационной способностью.

8. Уровень пероксидазной активности в каллусах четырех видов люпина выше по сравнению с проростками.

9. Инкубирование в культуре in vitro сопровождается изменением спектров фракции водорастворимых белков. Количество полипептидов в спектрах дедиффе-ренцированной ткани значительно ниже по сравнению с интактными проростками.

10. Получены регенеранты люпинов желтого и узколистного которые могут служить потенциальными источниками высокой семенной продуктивности.

Предложения для селекции

С целью создания исходного материала для селекции люпина на отдельные и комплекс хозяйственно-ценных признаков рекомендуется использование методов культуры тканей. Селекционной практике предлагаются питательные среды обеспечивающие успешную регенерацию желтого, узколистого, многолистного люпина.

Для микроклонального размножения люпина узколистного предлагается среда LS + NH«NOj 825 мг/л + 1.0 БАП и ИУК 0.1 мг/л + 15 мг/л сахарозы, для многолистного люпина LS + NH,NO) 825 мг/л + KNOj 445 мг/л + 1.0 мг/л БАП + ИУК 0.04 мг/л. для желтого люпина -1/2 LS + 0.2 мг/л БАП + 0.02 мг/л НУК. На втором этапе для укоренения рекомендуется среда LSo + 1.5 г/л активированного угля.

Для культивирования незрелых зародышей трёх видов предлагается использовать среду Гамборга В5. Для индукции эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей узколистного и многолистного люпина с последующей регенерацией рас-

тений рекомендуется использовать на первом этапе среду MS + 2 мг/л 2.4- Д + 0.25 мг/л кинстииа и на втором этапе MS, без гормонов.

Для селекции узколистного и желтого люпина «а высокую семенную продуктивность следует использовать трансгрессивные по этому признаку регенеранты.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Kustyuchenko V.I., Yagovenko T.V. Inhereting changes of storage proteins under microcloning // 8й" Inter. Lupin Conf., California, USA, May.¡996: Abst.

2. Костюченко В.И., Костюченко Д.А., Хараборкина Н.И., Яговенко Т.В. Изучение водорастворимых белков, активности амилазы, пероксидазы в тканях разных видов люпина // Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации: Тез. докл. Межрегионн. Научн.-практич. Конф. 15-17 июля 1997 г. - Брянск, 1997. -с.85-88.

3. Яговенко Т.В. Биотехнологические методы расширения генофонда исходного материала для селекции люпина II Достижения науки и передовой опыт в производство и учебно-воспитательный процесс - Материалы 10 Межвузовской научно-практической конференции.- Секция агрономии и агроэкологии.- Брянск.-1997. - с.54 - 56.

4. Kostyuchenko V.L, Yagovenko T.V. Instability of qualitative protein composiyion of yellow and blue lupin during in vitro cultivation// Lupin in modern agriculture. Proceedings. Olsztyn-Kortowo-Poland. 1997. V.2. P.43-47.

5. Костюченко В.И., Яговенко Т.В. Изучение наследуемых изменений белков люпина желтого и узколистного в культуре тканей in vitro // Докл. Росс. Акад. с.х. наук, N6, 1997-с. 10-12.

6. Костюченко Д.А., Яговенко Т.В., Костюченко В.И., Пигарева С.А. Сравнительная характеристика различных генотипов люпина в культуре ткани in vitro // С.х. биол. (в печати).