Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАСШИРЕНИЕ СПЕКТРА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАСШИРЕНИЕ СПЕКТРА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ"

Я-31 №

На правах рукописи

ЯГОВЕНКО ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

РАСШИРЕНИЕ СПЕКТРА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ

06.01.05 - селекция н семеноводство 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1998

и'-

Работа выполнена в лаборатории физиологии и , научно-исследовательского института люпина в 1989 -1997 гг

Научные руководители •

Официальные оппоненты •

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РЭА и РАЕН Б С Лихачев кандидат биологических наук, В И Костюченко доктор сельскохозяйственных наук, профессор Г Г Гатаулина

кандидат биологических наук. Л Г Копертех

Ведущее учреждение -

ВНИИ зернобобовых и крупяных культур

-С С

часов на

Зашита состоится " М О-Л^У. 199<Р г. в .

заседании диссертационного совета/Д-)20 3504 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550 Москва. Тимирязевская улица, 49 Сектор защиты диссертаций

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Автореферат разослан - ¿._" _199.

Ученый секретарь диссертационного совета - / ,

1 »

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент^' / ^ РР Усманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований. В развитии люпиноссяния России решающее значение имеет создание стабильно высокопродуктивных, болезнеустойчивых сортов с высокими ишательными свойствами разных направлений хозяйственного использования. Успех селекционной работы во многом определяется наличием исходного материала источниками селектируемых признаков.' Положительные свойства мирового разнообразия культивируемых видов люпина практически уже использованы. И в то же время современные сорта люпииа имеют немалый ряд отрицательных свойств, ограничивающих их распространение. В связи с этим необходимо создание принципиально нового исходного материала. Для реализации ■»той задачи следует расширить применение биотехнологических методов получения новых генотипов.

Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в разработке метода культуры ткани для люпина, в получении регенерантов, способных служить исходным материалом в процессе направленной селекции этой ценной кормовой культуры.

Для достижения поставленной цели исследований необходимо было решить следующие задачи:

- детерминировать по генетической способности разные виды люпина к не. дифференцированному росту in vitro на различных средах;

-. оценить способность дифференцированных тканей к регенерации; . - изучить ферментативную активность амилазы и пероксидазы, спектры водорастворимых белков и пероксидазы в проростках, каллусах основных видов , люпина как критерий морфогенеза в разных условиях культивирования; • - изучить идентичность запасных белков семян растений-регенерантов и их исходных форм методом электрофореза;

- разработать схему получения растений регенерантов.

Научная новизна исследовшшй. Проведено широкое сравнительное испытание различных по составу питательных сред и установлена их каллусогенная эффективность для 13 видов люпина. Оценена способность дифференцированных тканей к регенерации. Разработан метод регенерации растений из дифференцированных тканей проростков желтого, узколистного и многолистного люпина. Разработан состав среды для регенерации побегов из тканей незрелых зародышей желтого и узколистного люпина. Выявлена зависимость активности амилазы и пероксидазы в каллусах с регеиерационной способностью.' Изучена динамика концентрации белка н элсктрофоретическая подвижность его водорастворимой фракции в каллусах и проростках люпина. Установлены генотипические различия между растениями-регснерантами и их исходными формами.

Практическая значимость исследований. Предложена схема получения растений • ретенерантов из дифференцированных тканей проростков люпина желтого, узколистного, миоголистного, а также тканей незрелых зародышей узколистного с использованием методов культуры ткани, что открывает возможность получения нового исходного материала для селекции этих видов люпина.

Апробаиия работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных отчетах Всероссийского научно-исследовательского института люпииа (1989-1996 гг.). на научной конференции "Вклад молодых ученых в развитие агропромышленного комплекса Нечерноземья" (Немчиновка, 1993 rJ,jia научной конференции БГСХА "Совершенствование технологий^здетЯания сельскохозяйственных культур в условиях биологизаш«14»ета^^^^ г.).

VI.

VArtS

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ Диссертаиион мая работа рассмотрена и одобрена на расширенном иселлнии кафедры кормо нроишодстна селекции н семеноводства Брянской сельскохозяйственной академии (19971 )

Объем и стрхктлра работы Диссертация изложена на 134 страницах машинописною текста, содержит 21 таблицу, 24 рисунка и 14 приложений Библио графический список включает 207 наименований, из них иностранных - 140

Материалы а методы исследовании Материалом исследований в основном езчжнли культивируемые в сельскохозяйственном производстве Российской Феде рации вилы тюпина полип желтый (I upinus lutcus) узколистный (L angustifolius) белый (I. albus) и многолистный (L polyphyllus) а также ряд других видов основных центров происхождения

В качестве эксплантов для получения каллусов использовали фрагменты различных органов растений на разных стадиях развития незрелые и зрелые зароды шн семядоли, семядоли с частью оси проростка, верхушечные и пазушные мери стемы

Для работы с культурой ткани в основном использовалась методика Р Г Бу-тенко(1964)

Семена подвергались поверхностной стерилизации 20 минут в 96% этаноле 15 минут в 0 1% растворе диацида с последующей пятикратной отмывкой стериль ной водой Стерильные проростки получали высевая стерильные семена на ююдный' агар

Для стерилизации тканей вегетирующих растений (проростков, зародышей полученных из нестерильных семян) использовался метод предложенный фирмои Колбнохим-Бериш " (Fitter М S , Knkonan A D, 1982)

Схема стерилизации

1) инкубация в 1% -ном растворе тритона Х-100 3 мин,

2) промывка водопроводной водой,

3) промывка дистиллированнои водой,

4) инкубация в 70"» ном тганоле 10 сек ,

5) инкчбация в 3°'» ном растворе хлорамина Б в присутствии 0 03". ною тритона X 100 6 10 мин .

6) пятикратная промывка стерильной дистиллированной водой

В качестве питательных сред Мурашиге-Скуга (Murashige Т . Skoog F , IV62), Гамборга В5 (Gamborg О L , Miller R А , Ojima К . 1968), Нича (K>t= L 1988). Хеллера (Kyle L . 1988). Миллера (K.yte L , 1988), Линсмайера Скуга (Sroga G С 1983). Смирнова (Смирнов А М . 1970)

В лвток лавировать ю и охлажденную до 50°С ipul) добавляли витамины и юрмоны стерилизованные фильтрованием (Millipore OS 0 22мкм) Стерильные ра боты проводили в ламинарном боксе типа УО БВ

Условия культивирования

- а темноте, в термостате при 26°С.

- на стеллаже при комнатной температуре освещение люминесцентными лам пами (5000 люкс, фотопериод 16 часов)

Водорастворимые белки из проростков, незрелых зародышей, каллусов экст рагировали 0 09 М трис буфером с 0 08 М борной кислотой. 2.5 мМ ЭДТА и 1 мМ ингибитора протеаз PMSF (фенилмстилсульфонилфторид) pH 8 4 Соотношение

paci игольной ткани и буфера 1:10 (\V:V) для проростков и незрелых зародышей и 1:5 для каллусов. .

Из семян водорастворимые белки экстрагировали 0.0625 М трис-HCI буфером (рН6,8) с 5 мМ PMSF. Соотношение навески муки и буфера 1:10.

Электрофоретнческнй анализ белков проводили в нативных и денатурирующих условиях по методу Лэммли ((.acmmli F.. 1970).

Для определения активности амилазы и пероксидазы использовали общепринятые методики (Плешков Б.П., 1985). ..,,.-.

И юферменты пероксидазы на злектрофореграммах выявляли по Эвансу (Hvans J., Alloige N.. 1965). Концентрацию белка - по Бредфорду (Bradford М.М., 1976). ■.. •

Результаты исследований

Особенности недифференцированного роста люпина в условиях in vitro. В настоящее время не существует единого научно-обоснованного подхода к подбору питательных сред. Ограниченность данных по культуре люпина и бессистемность большого количества эмпирически подобранных сред по другим культурам склонили нас к необходимости сравнительного анализа наиболее часто используемых и наиболее контрастных по составу сред.

Нами изучалась индукция неорганизованного роста тканей люпина на шести питательных средах: Линсмайера - Скуга (LS), Гамборга (Bs), Нича, Хеллера, Смирнова и Миллера. Каждая среда испытывалась в двух модификациях: с добавлением активированного угля (1,5 г/л) и без него. В опытах использовали проростки и полевые растения нескольких десятков линий и сортов люпина ([..angustifolius. L.tuleus, L.aibus, L.polyphyllus, L.mutabilis) Для посева на агаризован-ную питательную среду использовали стерильные фрагменты пятидневных проростков гипокотиля (7-15 мм).

Перед массовым скринингом видов люпина на приведенных средах прослежено влияние разных концентраций фитогормонов (табл. I) на недифференцированный рост тканей проростков четырех коллекционных образцов: люпина белого (Козелецкий), узколистного (Брянский 123) и желтого (Нарочанский, К-1495). За основу взята среда LS (табл. 2).

Таблица 1

Сочетания концентраций фитогормонов

Вариант Концентрация фитогормона, мг/л

2,4-Д (ауксин) БАП (цитокинин)

1 0.00 0.00

2 0.50 0.50

3 5.00 0.10

4 2.00 0.05

5 2.00 0.30

Показано, что люпин обладает заметными видовыми и в отношении желтого люпина сортовыми различиями в способности к каллусообразованию. Для узко-

лис тою нопииа харакц-рно чегко выраженное каллуюобразояаиие при 2 ом и 3 м нарнашах сочетания фитогормонов Узколистный люпин Брянских 123 обладает наименьшей избирательностью к сочетанию фитогормонов в питательном среде После 90 дней инкубирования Брянский 123 значительно превосходил сорта желтою и белого люпина в индукции каллусообразования при 2 3, 4 вариантах соче тапня фитоюрмонов

Таблица 2

Влияние различных фитогормонов на индукцию и рост каллусов зюпина

Сочетания Сорта люпина

фитогормо- Брянский 123 К- 1495 Нарочанский Козелецкии

нов 20 90 20 90 20 90 20 90

дней дней дней дней дней дней днен дней

1 -

2 +++-+ + ++ + ++

3 ++-1- ++++ +++ + ++

4 ++++ + + + -

5 - + - - - - -*•

Условные обозначения каллус не индуцировался, ткань погибла,

ограниченное формирование каллуса в местах порезов ткани, по массе каллус не достигает массы исходного фрагмента ткани, ++ локально индуцированный каллус достигает массы исходного фра! мента ткани,

■►+-•• неограниченный медленный рост кат 1><.а <•++ + неограниченный быстрый рост каллуса

Сорта желтою люпина бот ее гребоватсчьны к соотношению концентрации фитогормонов Так, за 20 дней инкубирования при 4 и 5 вариантах сочетания фи тогормонов в среде рост каллуса у них практически отсутствовал

В отношении процесса каллусообразования наиболее консервативным ока зался белый люпин Для выяснения причин, затрудняющих индукцию и рост кал зуса этого сорта - обусловлено пи это составом питательной среды, природой ш фитогормонов или это обусловлено генетически - нами была предпринята попытка индукции процесса каллусообразования Осою люпина на трех питатстьных сре дах МЧ, ЬБ и Смирнова при широком диапазоне концентраций фитогормонов (2 4 Д - до Ч 0 мг/л, БАП - до 0 5 мг/л) на фоне Са2' - от 0 до I 8 мг/ч, Са(Ш,). 4Н}0 и сахарозы - от 0 до 40 г/л В эксперименте отмечено слабое каллусообразо- шие че рез 25 дней инкубации на среде при концентрациях 2 4 Д - 4 0 мг/з и ЬАП • 0 2 0 7 мг/л Отсутствие кальция в среде несколько усиливает каллусообраэоаание но удовлетворительного роста каллуса используемого генотипа добиться гак и не удалось

Таким образом, результаты наших исследований показали, что оптимальным сочетанием концентраций фитогормонов для каллусообразования у узколистною и желтого люпина является - 0 5 мг/л 24Ди05мг/л БАП

С целью идентификации оптимальней среды для индукции каззусообразова ния и изучения видовых и генотипических особенностей люпина к недифференци рованному росту ш VI(го нами изучено более 40 сортов и форм 13-ти видов люпина на 6 питательных средах (табл 3)

Таблица 3

г Интенсивность каллусообразования люпина на различных питательных средах

№ Образец LS В5 Нича Хеллера Смирнова Миллера

б/угл. | уголь б/угл. | уголь б/угл, | уголь б/угл. | УГОЛЬ б/угл. | УГОЛЬ б/УГЛ. | УГОЛЬ

- L.luteus -

1. Дружный 165 + + + + + + + + + - ' - • • + + . поб. - -

2. Мартин 2 + + - + + + - • + + • + * - - - ■ - •

3. К-2004 + + . + + поб. + + • - + + + + поб. +

4. К-2290 (дик.) + + + + + поб. + + ■ • _ ■ + + корн. - -

5. Ипутьский + + _. . + - - + + ■ - - - + + . + -

6. Факел + + . + + + - ■ • - ■• + поб. + -

7. Цит + + + поб. + - - - + + поб.

8. Афус + + . + - - + поб. + -

9. Брянский 6 ' + + + г. об. + + . + -. - - + + + + + -

10. К- 1551 + + + + + + . + + + + ■ поб. + поб.

II. Родник + + + + + + + .. + + + + ■ + - - . корн.

12. Кастрычник + + + . + корн. • - • + ■ - -

13. Нарочанский поб. + + . . + + ■ ■ • - - - " + + ' поб. + -

14. . Искороеть поб. корн. + + поб. + • + ■ + • - -• поб. + + +

15. К-1495 + + + + + + - + - " + + +

16. К- 1730 + + + + .. _ .. корн. - ■ ..._ - - поб. - -

17. Академический 1 + + поб. + + - - - - + - -

18. Мотив 369 ' + + + ., + + - + + • - V ' - + - - -

L. an gustifolius ..... - -

19. К-401 ат-д-2-г/5 + + + поб. + + - поб. - - корн. + + + корн. поб.

20. К- 402 ат-д-2-r/l + + + поб. + + - - - ■ + . •+ • ■ + + + поб. корн. - •

21. К-403 Лаф-рбс/1 + + поб, + - - ■ + — - " +. ■ -

22, К- 404 Лаф-рбс/10 +• + поб. + + + - + + ■ • + поб. - поб.

23. К-405 кс-д-3-p + + поб. + + + + - + + поб. - + + поб.

Ms Образец LS В5 Нича Хеллера Смирнова Ми пера

б/угл уголь б/угл уголь 6/угл уголь б/у П уголь б/угл уголь 6/>r i УГОЛЬ

24 К- 406 дм-33 + + - + + + поб - ♦ + + + + + + поб

25 К-407 дм-396/77 + + + + - - - + - поб. + -

26 К-410 ли 1ия Нч 1» + + поб + + поб + + + + поб +

27 НоьишЬков.кмП + + + поб * + поб + поб - - * +

28 Брянский 123 + + + поб корн + + поб + + - - + + поб 4

29 109 п-2 + + + + + + - + + + поб

30 Laibus Ортам + * + - - - - поб

3! I albus Ко1елецкии ■f - - - - - - •f поб

32 L albus с н 73 + + поб + поб - - + + - поб

33 ! albus с н 72 + - + поб - + + - - поб -

34 К-604 L eleßans + - + + корн + - + + + - корн +

35 K-605L succulentus + t + * + + + - + - + + - + корн + + ♦ ♦ +

36 K-6I7L micrauthus + + ♦ + + 4 - - - - - - -

37 K-630L coseniim + + + + + + * + + + + поб + +

38 К-634 L hybndus Lern 16 + + + + + + - + + + + ■*■ + поб

39 K-635L mutabilis 35 + + + + + + поб + - + + + + + t + +

40 К-636 L mutabilis 36 + * + + * + + поб + + + + + + + 4- + + + + + ♦ +

41 K-637L mutabilis 37 + + + + + + + + поб + + + + + + + + поб + поб

42 L altococcineus + + + + + + + поб + + + + + + + поб + поб

43 1 arnual * + + + * + + + + + + + + +++ + + + + +

44 L doiglasn + 4 + + * + 1- + + + + + ♦ ♦ + + + +

45 L polyphyllus t ♦ + + поб + + + поб + + * + + + + ++ + + поб + + +

46 L polyphyllus (с белыми цветками) поб + + + поб + + + + + + + +Г+ + поб + +

Обозначения те же, что и 8 таблице 2

Концентрация фитогормонов в этой серии опытов была постоянна - 2.4-Д -0.5 мг/л. КАИ - 0.5мг/л.

Наиболее "каллусогенными" на всех питательных средах являются виды люпина [.. polyphyllus и I., mulabilis, L. annual. I., donglasii. I,. suceulentus. Наиболее благоприятна для индукции и роста каллусов большинства изученных видов люпина -среда LS, хорошие результаты получены и на средах-Bs и Смирнова. ,. -

Выявлена значительная межвидовая и генотнпическая гетерогенность как по .способности ипдущфовать недифференцированный рост на одной и той же среде, так и по особенностям повеления их на разных средах. ,

Так. среди изучаемых образцов желтого люпина для сортов Дружный 165, К-2290. Брянский 6, Родник характерна наиболее интенсивная индукция 'каллуса на среде LS без угля. На средах Хеллера и Миллера - она практически равна нулю. У сортов Факел. Цит. Афус. Кастрычник.Нарочанский, Искорость, К- 173Ю формирование каллуса отмечено лишь в местах среза ткани.

У сортов узколистного люпина способность индукции каллусогенеза, по сравнению с сортами желтого более выражена. Среди образцов этого вида наметились "лидеры" в способности к формированию каллуса. Это К- 401. К- 402, Но-возыбковский. Брянский 123. Как и для желтого люпина среда LS является лучшей для каллусогенеза.

Наиболее трудно поддается клонированию люпин белый - лишь незначительная индукция каллусообразояания отмечена на среде I.S. Добавление в питательную среду активированного угля в подавляющем большинстве случаев делает ее практически непригодной для индукции недифференцированного роста. .

Показано, что интенсивность каллусообразования у многих форм люпина на разбавленной вдвое среде 1-S выше, по сравнению с полной. На примере наиболее каллусогснмых видов люпина (многолистный и узколистный) прослежена динамика роста каллуса, полученного из -жеплантов гипокотиля проростков (рис.1 ).Огмечена значительная межвидовая дифференциация по этому показателю: скорость роста каллуса двух форм многолистного люпина в 20-100 раз интенсивнее, чем у сортов узколистного. Следует отметить и более выраженную межсортовую гетерогенность по скорости роста культуры каллуса у люпина узколистного:* уровень этого показателя для сорта Новозыбковский в несколько раз выше, чем для сорта Брянский 123.; '■•••>

Таким образом, способность образования каллуса и интенсивность его роста н значительной степени определяется генотипом.

Самой эффективной средой для индукции и поддержания роста каллусов изученных генотипов люпина является среда Линсмайера-Скуга (¿5),богатая витаминами и органическими компонентами. Разбавление среды в 2 раза способствует более эффективному росту каллусной ткани. Диапазон концентрации фнтогормонов (ауксинов и цитокииинов). поддерживающих рост каллусов, может быть зна- -чительным. На безгормональной среде индукция каллусов не идет. Добавление в питательные среды активированного угля ингибнрует рост каллуса.

Рис I Динамика роста к)льтуры каллуса из жсшмнтов гнпокотиля проростков люпина

узколистного

1 - Брянский 123,

2 - Новозыбковский, миоголистного:

1 - синецветковая форма

4 белоцветковая форма

Способность дифференцированных тканей к регенерации

Регенерата побегов из фрагментов проростков люпина Способность диффе ренцированных тканей люпина к регенерации побегов и корней на разных средах является базисом для полпенни в определенных условиях полноценных растений рсгенерантов

В отличии от каллусогенеза индукции способствует добавление в питатель мыс среды {ЬБ В* Смирнова) активкровлшо! о упя (1 5 г/л) или простое разбав юнис среды в 2 раза

Следовательно, открывается возможность ускоренного размножения люпина микроклонированием без стадии кллусообразования И именно зто детаст осо бенно актуальной разработку методических подхо шв для вегетативного размно жения разных видов люпина

Исходным материалом в этой серии наших опып в слу*ичи 3 7 дневные верхушечные и пазушные меристемы проростков

Нами установлено, что наибочее оптима 1ьной для микрпк-юнального раз множения мноюлистного люпина явзяется среда 1.5 со вторым сочетанием ком по центов (N^N01 825 мг/л, КГ^О, 475мг/л , БАП- I О мг/л, ИУК 0 04 мг/К

Иобе1и, вычлененные из конгломератов и посаженные на свежие питательные срслы с фитогормонами. обнаруживают способность к дальнейшему умножению числа побеюв в каждом последующем пассаже и таким образом появляется реальная возможность по учения неограниченного числа побеюв от одного зкепланта

Культивируя пазушные почки многолистного люпина в течение 3 х месяцев с пересаживанием на свежие среды через 3 недели, нами получено до 75 побегов.

Изучение соотношения числа индуцированных побегов и концентраций компонентов питательной среды показало, что оптимальными для размножения узколистного люпина являются: сахароза в концентрации 15 г/л: минеральный азот в половиной дозе от LS. БАП 1.0мг/л и ИУК0.1 мг/л.-.-

Узколнстный люпин значительно уступает многолистному по количеству индуцированных in vitro побегов.

Невозможность дифференцировать компонентный состав среды для стабильного корнеобразования у проростков-регенерантов белого и желтого люпина вызвала необходимость подбора других, более специфичных, условий эксперимента: изучение зависимости степени регенерации растений люпина от природы и возраста экспланта (!-, 3-, 5-, 7-, 9-ти дневные семядоли, семядоли с частью оси проростка, верхушечные почки).: ^

Показано, что у люпина узколистного максимальное число нормально развитых растений получено при использовании в качестве эксплантов семядолей с частью оси трехдневных проросгков.С увеличением возраста проростка замедляется процесс ризогенеза, но перекос побегов нз половинную среду Гамборга без гормонов способствует его более активному развитию.

Наиболее перспективным эксплантом для получения регенерантов у люпина белого является также семядоля с частью оси 3-5-дневных проростков. И в этом случае заметно замедляется ризогенез.В отличие от люпинов белого н узколистного на эксплантах -семядолях люпина желтого, на примере сорта Искорость отмечена максимально выраженная регенерация нормальных растений ( среда - 1/2LS+ 0.2мг/л БАП + 0.02мг/л НУК), которая в меньшей степени зависит от возраста проростка.

Растения трёх видов люпина, полученные в серии этих опытов были высажены в стерильную почву а лабораторных условиях. Кроме того, 20 растений сорта Искорость перенесены непосредственно из питательной среды в полевые условия. Девять растений-регенерантов сформировали полноценный урожай. Трансгрессивных или гетерозисных форм по продолжительности вегетационного периода не выявлено. В то же время было отобрано 4 растения-регенеранта, превосходящих исходную форму по количеству бобов и массе семян с растения.

В полевых условиях продуктивность растений-регенерантов узколистного люпина Брянский l?", полученных in vitro из пазушных почек, в целом не превышала уровня исходной формы. Однако из верхушечной почки коллекционного образца К-402(АТ-Д-Г/1) нами регенерировано полноценное растение. На рисунке 2 этот регенерант представлен в фазе бутонизации.

Рис 2 Регснерант сортообразца К-402 (АТ-Д 2 Г/1) в фазе бутонизации

Для регенеранта характерен необычно высокий уровень завязываемости бобов - 202 боба Под тяжестью бобов два боковых побега обломились, в фазу созревания убрано 123 боба Общая масса >релых семян составила 47 0 граммов Для расшифровки механизма такой уникачьиой сеченной продуктивности, а также изучения донорских свойств зтого признака соргообразеа К 402 (АТ Д Г/1| включен в широкою систему скрещиваний При получении гибридных семян Н представится возможность проведения потною I ибрилокн нч^емн о анализа и оценки его донорских свойств

Развитие незречых зародышей папина на раничных питательных средах На питательных средах. раз1ичных по состав} минеральных компонентов и г ормонов нами изучен характер процесса регенерации незрелых заролышей белого, желтого и узколистного люпина

Питательные среды готовили на основе М>раишге и Скуга и Гамборга В5 Исследуемые варианты сред приведены в таблицах 4 и 5

Среду В5 готовили двухфазной, т е в автоктааированной и охлажденной ага-ризованной среде в стерильных условиях летати упуб 1ения которые започняли жидкой средой, и в них помещали незрелые зародыши Гормоны стерилизованные фильтрованием, добавляли только в жидкую среду В отдельных экспериментах вместо двухфазной среды использовали В5 со сниженным содержанием аг • . > 5 г/л Выращивали зародыши при освещенности 5000 тюке, фотопернод 16 ч

Тзбтнца 4

Состав среды для культивирования незрезых зародышей зюпима (оиювиш

компоненты и витамины - согласно МЯ)

Вещество 1 2 3 4 5 6

Гидролизат казеина, г/л 20 20 20 20 -

БАП мг/л - 1 5 1 5 1 5 .

НУК мг/л - - 20 20 -

2 4 - Д, мг/л - - - - 20 50

Кннетин, мг/л - - - - 0 25 -

Итаконовая кислота, мг/л - - - - - 1 0

'Габлииа 3

С »держание юрмоноа в различных вариантах среды В5 для незрелых __зародышей люпина_

1ормоны 1 2 3 4

ЬАИ - 0 1 - -

ИУК - 001 0 05

Чсагии - - 0 $ -

24 Д - - 0 1

Кинетин - - - 001

Таблица б

Г!ол\ченис полноценных растении из незрелых зародышей трех _видов люпина на питательных средах группы Мв_

Вид копима Питательная среда МБ2 МБЗ МЭ4 МИ5 МБ6

Высажено зародышей, шт 16 - 43 20 7 -

и алциэ- иАэЬш Получено нормальных растений, шт 0 - 0 0 -

% нормальных растении 0 „ 11 6 0 0 _

Выезжено зародышей, шт 16 12 10 12 - 12

1 1шеи* Получено нормальных растений, шт 0 I 0 1 - 0

°о нормальных растений 0 83 0 8 3 _ 0

Высажено зародышей шт п 7 12 10 34 17

Ь а1Ьш> Получено нормальных растений, шт 0 0 0 0 2 0

нормальных растений 0 0 0 0 59 0

При культивировании зародышей, достигших размеров 15 2 мм на средах с добавзением 2 4-Д и кинетина происходит образование калзуса По нашим на блюдениям люпин всех исследуемых видов, а в особенности б-чый переходит к каллусообразованию на среде МБ с низким содержанием ч ормонов (0 1 мг/п 2 4-Д, 0 1 мг/л кинетина)

Результаты культивирования нецелых зародышей трех видоз люпина на двухфазных питательных средах, приготовленных на основ В5, представлены в таблице 7 (гормональный состав сред приведен в табл 5)

Наибольший выход мхоровых нормальных проростков почучен для зародышей узколистною чюпина Незначительно уступает по выживаемости желтый люпин Для белого люпина, как свидетельствуют результаты, данные среды не подходят

Таблица 7

Получение нормальных растений из незрелых зародышей люпина на разных

-- ■< ■■ • - ! • вариантах среды В5 ■ - ■ '■-■•■■• _

, Узколистный Желтый Белый

Вариант Отношение Отношение Отношение

среды зародышей к % зародышей к % • зародышей к %

норм. раст. норм. раст. норм. раст.

1 11/9 82 • 9/7 > 78 14/2 ■ 14

2 10/6 60 9/6 67 13/0 0

3 10/9 90 \\П 64 12/2 17:

4 13/9 69 12/8 67 - -

На разбавленных вдвое питательных средах Мв и В5, не содержащих гормонов при добавлении в эти среды БАП 0.05-0.1мг/л на короткий срок (1-2 недели) незрелые зародыши начинают развиваться в нормальные проростки, что лает возможность получить полноценные растения из зародышей на ранних стадиях развития. Это открывает перспективы для получения межвидовых гибридов. От 19 растений-регенерантов узколистного люпина с.н. 479 получено потомство третьего поколения. Внутри каждой семьи обнаружены формы различные по морфотипу, скороспелости, семенной продуктивности, устойчивости к вирусной узколистно-сти. Предполагается, что они послужат исходным материалом для направленной селекции узколистного люпина .. . .

- Биохимический контроль тканей и регенерантов

Качественный и количественный состав водорастворимых белков, активность амилазы, пероксидазы в тканях разных видов люпина. Выбор исследуемых биохимических показателей обусловлен, в первую очередь, их важной физиологической ролью. Так, амилазная активность в норме резко возрастает при прорастании семян -и экспериментально доказано, что сохранение высокой амилаэкой активности в каллусах зерновых - залог успешной регенерации растений из каллусов. Перокси-' дазная активность в тканях растений выполняет защитную функцию при вирусной и грибной инфекциях. Она повышается в результате интродукции возбудителей в растительные ткани, а также при любых механических повреждениях тканей. С этим связана и повышенная пероксидазная активность в каллусах растений. Поэтому необходимо выяснение возможного влияния уровня активности этого фермента в каллусах люпина на морфогенетический потенциал. Исследования проводили на проростках и каллусах четырёх видов люпина - желтого, узколистного, белого и многолистного. ' ..(•••

В одинаковых условиях экстракции из трехдневных проростков экстрагируется больше белка, чем из 10-дневных, а из каллусов - меньше., чем из 10-дневных проростков. Концентрация белка в экстрактах трёхдневных проростков разных видов люпина коррелирует с содержанием белка в зерне люпина разных видов: больше всего в желтом, затем в белом, узколистном; ' " "■ . ' . >

Амилазная активность обнаруживается во всех исследуемых экстрактах. Как • и предполагалось, высокая активность наблюдается в набухших семенах, а затем по мере роста снижается, за исключением многолистного люпина.В 10-дневных проростках активность амилазы ниже, чем в 3-х дневных. В каллусах активность амилолитических ферментов также присутствует. Необходимо отметить, что в каллусах многолистного люпина эта активность выше и максимальна через 2 неде-

in k>лыияирования Нами показано, что каллусы многолисгного люпина обладают высохим регеиерационным потенциалом - были получены растения-pciснеранты Это свидсте 1ьствчет о возможной зависимости амилазной активности и pel енерируюшеи способности каллусов многолистного люпина

В каллусах желтою и у полистного люпина амилазная активность также довольно высокая и при том повышается в пересчете на единицу белка к третьей не деле культивирования

В каллусах мноюлнетного люпина пероксидазная активность намного ниже по сравнению с желтым и узколистным Вероятно, благодаря этому, многолистмый люпин обладает определенным механизмом быстро приспосабливаться к условиям in vitro

При переходе от интактных проростков к культивируемой а условиях in vitro растительной ткани изменяется не только содержание белка на единицу сырой массы, но и активность ферментных систем, в частности, амилазы и пероксидазы

Динамика видовых и генотипичесьих особенностей биохимических показателей в тканях чюпипа в зависимости от условии их тьтивирования Генотипические и межвидовые особенности содержания белка в проростках и каллусах люпина ак тивности амилазы и пероксидазы в них исследованы нами в различных условиях культивирования Динамика содержания белка и активности ферментов пероксидазы и амилазы в первые три недели кдллусообразования прослежена без обновле ния питательной среды Содержание белка на mi сырой массы по мере развития каллуса падает уже к 7 дневному возрасту калл>са его снижение достигает 5-6 раз в зависимости от сорта Объяснить это можно, по видимому, появлением большо-1 о числа вакуолнзироп шш ix к ictok

Активность ферментов, напротив, возрастает в 1,5-3 раза уже через 2 суток после помещения эксплантов на питательную среду Необходимо отметить, что некоторые кривые изменения активности имеют пик в точках 7 - 10 ти дней и затем, после спада соответствующего 10 14 му дню наблюдается дальнейший рост Этот подъем активности ферментов, в особенности пероксидазы, вероятно, обу сювлен истощением среды и вследствие этого мобилизацией всех сил экспланта направленных на выживание Пики активности в 7 10 дней представляют интерес для лальнеишего исследования так как они отражают процессы, происходящие в тканях, когда еще нет видимых изменений (рис 3 4)

Динамика видовых и генотнпическнх особенностей белкового метаболизма тканей интактных проростков и каллусов люпина, особенно активности перокси-да той к амилазной системы существенно зависит от условий и продолжителько-сги их культивирования

Э 1еьтрофоретическиц состав водорастворимых бечков тканей чюпина Экс-гракты из проростков содержат в большой степени медленнодвижущиеся белки Для трехдневных проростков характерно присутствие интенсивно окрашивающихся компонентов Электрофорез в яентгурирующнх условиях показал качественную и количественную гетерогенность голипептилных цепей как в проростках разных видов люпина так и в 1ависимос1И от возраста Как в нативных, так и в денатурирующих условиях электрофорез экстрактов из каллусов выявил превалирование низкомолекулярных фракций белков, которые отсутствуют в спектрах проростков в нативных условиях и представлены в меньшем количестве в денатурирующих ус ловиях Такие различия становятся очевидными, если принять во внимание функциональную ограниченность каллуса Важно отметить, что на данном этапе иссле-

лоюнин по обнаруживаются заметные различия » повелении белков много.зистно-1ч» .нопина и других щученных вилои. * ■ 'п.- г.-

Рис.З. Изменение амилазной активности 8 каллусах желтого и узколистного люпина: • ^

1 : выращивание на среде 1/2М5 с I мг/л 2.4-Д и 0.1 мг/л кинетина на свету, . при комнатной температуре; ; •

2 . на той же среде, в темноте, при 26°С;

3 на среде 1/21-5 с 1.5 мг/л БАП и 2.0 мг/я НУК. на свету, при комнатной . . - температуре: . , . •

4 - на той же среде, в темноте, при 26°С.

Рис 4 Изменение пероксидазной активности 8 каллуса* желтого и узколистного люпина Обозначения те же, что на рисунке 3

Результаты элсктрофоретического анализа изофернентного состава перокси-дазы каллусных тканей этого же набора видов и сортов люпина показывают, что изоферментный состав калпусов одного вида люпина изменяются не только от возраста тканей, но и от гормонального состава питательной среды

Нами показано, что наиболее широкий изоферментный спектр пероксидазы каллусов, с учетом продолжительности культивирования на питательных средах для узколистного и многолистного люпина обеспечивает срсла MS.

Изменения всякое лишила желтого и узколистного пей кумпшаиросаныт тканей in vitro. Семена исходных форм и регенератов использовались в исследованиях злектрофоретических спектров белков с целью изучения их идентичности. Анализ полученных электрофореграмм показал заметные различия белковых спектров между видами, в то время как внутривидовые различия в спектре полос желтого и узколистного люпина не заметны. На фоне почти полного .отсутствия различий внутри вида при детальном анализе исходных форм и растений-регенерантов некоторых сортов зти различия имеют место. Так, например, между исходными формами и регенерантами узколистного люпина Митан и Ащадный видимых различий практически не обнаружено. Исключение может составить выделяющийся по цвету (розовое окрашивание) полипептид, присутствующий в спектре регенеран-тов.

В спектре белковых полос желтого люпина отмечены следующие различия:

1. В спектре регенеранта с.н. 122/90 практически не просматривается полоса с относительной подвижностью (Rf) 0.72, которая присутствует у исходной формы.

2. В спектрах белков семян двух независимо полученных растений-регенерантов сорта Брянский 17 в высокомолекулярной области спектра видимых различий нет. а в зоне с Rf 0.72 очевидна разница между двумя регенерантами, причем, один регенерант отличается от исходной формы.

3. В спектре белков сорта Мутант 273 наблюдается ряд различий по интенсивности окрашивания полос идентичных по относительной подвижности. Также можно обнаружить качественные различия. Например полоса с Rf 0.42 (розовая окраска) присутствует в спектре исходной формы, но её нет в спектре регенеран-та.

4. Особенно интересные результаты дает анализ белковых полос регенеранта и первого поколения этого регенеранта сорта Цит. Отмечены отличия его белкового спектра от спектра белков исходной формы. Они подтвердились и при сравнительном анализе его с белками семян первого поколения этого регенеранта. Исследование идентичных по относительной подвижности (Rf) полос в высокомолекулярной области показало различную их интенсивность. В спектрах белков исходной формы окрашивание более интенсивное, чем в спектре регенеранта и первого поколения этого регенеранта. В низкомолекулярной зоне наблюдается обратная зависимость. В спектре белков регенеранта нарушается соотношение интенсивности окрашивания идентичных по Rf полос по сравнению с исходной формой. Полипептидс RfO.I7 в спектре исходной формы окрашен более интенсивно, чем полипептид с Rf 0.20. В спектре регенеранта это соотношение обратное. Вероятно, различия в интенсивности проявления полос в белковых спектрах вызваны различной активностью регуляторных генов, что в основном отражается в виде изменения количественного содержания белков в полосе. Кроме указанных выше количественных отличий в спектрах белков исходной формы и растений-регенерантов сорта Цит существуют и качественные. В спектре регенеранта появилась полоса с Rf 0.72. которая унаследовалась в первом поколении. Следует отметить, что высокомолекулярные белки в первом поколении регенеранта отличаются как от исходной формы, так и от самого регенеранта.

Таким обрати в результате проведенных исследовании выявлены различия в int.к грач бечков некоторых распиши peí (.нерантов и исходных форм Следова гелыю даже кратковременное инкубирование в ку ibiype in varo может сопровождаться изменениями белковых спектров

ВЫВОДЫ

1 I снотипы изученных видов ш>пина различаются по способности к каллусооб раювакию Наиболее 1ффектиянои средой для индукции и поддержания роста калчусов является среда Линсмайера Ckji j (I S), содержащая по 0 5 мг/л 2 4 Д и БАП

2 Установлена видовая и генотипическая специфичность динамики процесса кал-чусообразования

3 Добавление в питательную среду активированною угчя hhi ибируеткаллусооб-разованис и способствует регенерации фертнльных растении щ дифференцированных тканей проростка

4 Разработаны составы питательных сред для мнкрокчонального размножения чюпина желтого, узколистного и мноюлистного из пазушных и верхушечных меристем проростков

5 Hj среде Гамборга (В5( и Мурашиге и Ckvra (MS) почучены полноценные рас тения регенеранты из незречых зародышей mhoiочистною узколистного и же iToro чюпина

6 Перевод тканей люпина всех изученных видов (желтый узколистный, белый, много шетныи) в культуру in vitro сопровождается падением содержания белка и изменениями его качественного состава

7 Активность амилазы и пероксидазы в проростках и каллусах коррелирует с ре i снерационной способностью

Ü Уровень пероксидазной активности в каллусах четырех видов люпина выше по сравнению с проростками

9 Инкубирование в ку чьтуре in vitro сопровождается изменением спектров фракции водорастворимых белков Кочичество почипептидов в спектрах дедиффе ренаированнои ткани значитечьно ниже по сравнению с интактными проростками

10 Получены регенеранты люпинов жечтого и узколистною которые могут слу жить потенциальными источниками высокой семенной продуктивности

Предложения для селекции

С црч1 ю создания исходною материала для се ¡скипи попинана отдельные и комплекс хозяйственно ценных признаков рекомендуется ш.г »лыование методов ку ]ычры тканей Селекционной практике предлагаются питательные среды обес печивающие успешную регенерацию же mu и узкочнегною mhoi олистною люпина

Дчя микроклонального размножения люпина узколистною предлагается сре да I S - NH.NO) 82< мг/л * I 0 БАП и ИУК 0 I мг/л + 15 мг/i сахарозы, для много-чистного люпина LS + NH«NOj 825 mi/л + KNO} 445 мг/л + I О мг/л БАП «• ИУК 0 04 мг/ч для желтого люпина -1/2 LS + 0 2 мг/л БАП *■ 0 02 мг/ч НУК На втором irane для укоренения рекомендуется среда LSo I 5 г/ч активированного угля

Для культивирования незрелых зародышей трех видов предлагается использовать среду Гамборга В5 Для индукции >мбриогенного каллуса из незрелых зародышей у ^очистного и многолисгного люпина с последующей регенерацией рас-

тений рекомендуется использовать на первом этапе среду MS + 2 мг/л 2.4- Д ■»- 0.25 мг/л кинетика и на втором этапе MS, без гормонов. '

Для селекции узколистного и желтого люпина на высокую семенную продуктивность следует использовать трансгрессивные по этому признаку регенераты.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Kostyuchenko V.I., Yagovenko T.V. Inhereting changes of storage proteins under microcloning II 8Л Inter. Lupin Conf.. California, USA, May.1996: Abst.

2. Костюченко В.И.,. Костюченко Д.А., Хараборкина Н.И., Яговенко T.B. Изучение водорастворимых белков, активности амилазы, пероксидазы в тканях разных видов люпина // Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации: Тез. докл. Межрегионн. Научн.-практич. Конф. IS- 17 июля 1997 г. - Брянск, 1997.-с.85-88..

3. Яговенко Т.В. Биотехнологические методы расширения генофонда исходного материала для селекции люпина // Достижения науки и передовой опыт в производство и учебно-воспитательный процесс - Материалы 10 Межвузовской научно-практической конференции.- Секция агрономии и агроэкологии.-Брянск.-1997. - с.54 - 56.

4. Kostyuchenko V.I., Yagovenko T.V. Instability of qualitative protein composiyion of yellow and blue lupin during in vitro cultivation// Lupin in modern agriculture. Proceedings. Olsztyn-Kortowo-Poland. 1997. V.2. P.43-47.

5. Костюченко В.И., Яговенко T.B. Изучение наследуемых изменений белков люпина желтого и узколистного в культуре тканей in vitro // Докл. Росс. Акад. с.х. наук, N6,1997 - с. 10-12.

6. Костюченко Д.А., Яговенко Т.В., Костюченко В.И., Пигарева С.А. Сравнительная характеристика различных генотипов люпина в культуре ткани in vitro // С.х. биол. (в печати). <

Издательство Брянской гос\ дарственной сечьскохозяйственной академии 241365 Бр шскля обл . Выгоннчский район с Кокнно БГСХА