Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Введение в культуру трансформированных корней шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi. ) и содержание в них флавоноидов

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Введение в культуру трансформированных корней шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi. ) и содержание в них флавоноидов"

На правах рукописи

РТВ од

?*5 гри пт

ГУСЕВА АНАСТАСИЯ ВИКТОРОВНА

ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО {SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI.) И СОДЕРЖАНИЕ В НИХ ФЛАВОНОИДОВ

03.00.05 - Ботаника 03.00.12- Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2000

Работа выполнена на кафедре физиологии и биотехнологии растений Томского государственного университета и в группе специализированного метаболизма корней Института физиологии растений РАН (г.Москва).

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор P.A. Карначук

кандидат биологических наук, в.н.с. И.Н. Кузовкина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Т.П. Березовская

кандидат биологических наук, в.н.с. Г.С. Верхотурова

Ведущая организация: Сибирский государственный

медицинский университет, г.Томск

Защита диссертации состоится " 29 " июня 2000 г. в 11 часов на заседании Специализированного совета К.063.53.08 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Гербарии им. П.Н.Крылова Томского государственного университета.

634050, Томск-50, пр. Ленина, 36.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Томского государственного университета.

Автореферат разослан " 2000 г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук,

диссертационного совета Д°чент С.Н. Кирпотин

тЛ Ъ9 Шимлл ШМС - 3-/4:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Род шлемник {Scutellaria L.) является одним из самых многочисленных в семействе Lamiaceae, он насчитывает около 360 видов растений (Paton, 1991), но к настоящему времени наиболее полно изучены химический состав и фармакологические свойства шлемника байкальского {Scutellaria baicalensis Georgi). Это многолетнее растение применяется в традиционной и официальной медицине, в основном, России, Китая, Японии, Кореи и Монголии, что объясняется его ограниченным ареалом.

Спиртовая настойка корней шлемника обладает четко выраженным противовоспалительным, гипотензивным и седативным действием (Вершинин, Яб-локов, 1946; Huang, 1993). В последние годы внимание к шлемнику байкальскому особенно возросло в связи с тем, что экспериментально доказан ряд других ценных свойств экстрактов из его корней. Обнаружена антиаллергическая, антиоксидантная и противоопухолевая активность, что подтверждено клиническими испытаниями (Ryu et al., 1985; Разина и др., 1987; Konoshima et al., 1992; Гольдберг и др., 1994; Gabrielska et al., 1997; Miao et al., 1997).

Основными действующими веществами, определяющими фармакологические свойства растения являются флавоноиды.

В связи с ценными лекарственными свойствами корней шлемника байкальского, медленными темпами возобновления роста растений в естественных зарослях (5-10 лет) и сложностью получения экологически чистого сырья было апробировано введение шлемника в культуру in vitro. Сравнительно недавно были получены каллусная и суспензионная культуры шлемника байкальского (Трофимова, 1982; Yamamoto et al., 1986; Yamamoto, 1991; Seo etal., 1993), аза-тем - корневые культуры методом трансформации фрагментов проростков pRi Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes (Zhou et al., 1997; Nishikawa, Ishirnam, 1997, Nishikawa et al., 1999). Последний способ представляет наибольшую ценность для выращивания больших масс корней шлемника, так как в этом случае корни культивируются на безгормональной питательной среде, что гарантирует получение экологически чистого сырья.

Однако, полученные до настоящего времени быстро растущие pRi Т-ДНК трансформированные корневые культуры шлемника байкальского были инициированы с помощью штаммов A.rhizogenes, Т-ДНК которых содержала маркерные гены, нетипичные для диких штаммов агробактерии, что не желательно при биотехнологическом использовании культивируемых корней шлемника. Использование при проведении трансформации дикого, немодифииированного штамма агробактерии обеспечивает сохранение природной естественности системы, и поэтому может представлять ценность для биотехнологических разработок с целью получения экологически чистых препаратов, обладающих важными фармакологическими свойствами.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было введение в культуру pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского с использованием не модифицированного, а дикого штамма A.rhizogenes, опреде-

ление ее биосинтетической продуктивности и поиск способов направленной регуляции образования в корневой культуре флавоноидов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1) получить культуру pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского с использованием дикого штамма A. rhizogenes и подобрать оптимальную питательную среду для роста корневой культуры;

2) исследовать динамику роста трансформированных корней шлемника, и изменение гормонального статуса культуры при выращивании на свету;

3) исследовать влияние освещения, фенилаланина и метилового эфира жасмоновой кислоты на продуктивность корней;

4) провести качественный и количественный анализ флавоноидов, образующихся в культуре трансформированных корней шлемника.

Научная новизна. Впервые получена культура трансформированных корней шлемника байкальского путем инокуляции листовых эксплантов стерильных проростков диким штаммом А-4 A. rhizogenes.

Результаты настоящей работы расширяют представления о роли баланса эндогенных гормонов в процессах роста культур трансформированных корней т vitro. Впервые получены экспериментальные данные о том, что изменение ростовой активности pRi Т-ДНК трансформированных корней на свету сопровождалось изменением гормонального баланса.

Практическая ценность работы. Выращивание трансформированных корней шлемника байкальского, способных к интенсивному, стабильному росту и синтезу флавоноидов в контролируемых условиях, может быть перспективным при решении проблемы дефицита лекарственного сырья.

Результаты, полученные в данной работе, используются при чтении лекционных курсов «Основы биотехнологии», «Клеточная культура растительной ткани» и при проведении практических занятий со студентами биолого-почвенного факультета Томского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999); на Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999); на VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа (116 страниц, 28 рисунков, 9 таблиц) состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объекта исследования и методик работы, изложение результатов экспериментов и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы (177 наименований, из них 97 зарубежных издания).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования был выбран шлемник байкальский {Scutellaria baicalensis Georgi.) - ценное лекарственное растение семейства губоцветных (Lamiaceae).

Культура трансформированных корней шлемника была получена путем инокуляции листовых эксплантов стерильных проростков A. rhizogenes (штамм А-4) суточного возраста. Для элиминирования агробактерии корни дважды пересаживали на питательную среду с клафораном (500 мг/л и 250 мг/'л).

Полученную корневую культуру выращивали на качалке (90 об/мин) в жидкой питательной среде В-5, не содержавшей гормоны, в темноте, при температуре 25-26 °С и влажности 60-70 %. Трансформированные корни пересаживали через 4 недели. Отношение инокулята к объему питательной среды при пересадке поддерживали в пределах 1 :Ю0.

Ростовую активность корней рассчитывали по разнице сырого веса корней в конце и начале пассажа. Сухой вес корней определяли после их высушивания при 70 °С в течение 48 часов.

При исследовании влияния света трансформированные корни в течение пассажа (4 недели) выращивали при 12-часовом освещении белым светом. Для освещения использовали люминесцентные лампы ЛБ-40.

В опыте с экзогенным введением в питательную среду фенилаланина (ФЕН), ФЕН (Merck) вводили в среду асептически, стерилизуя через мембранный фильтр. Длительность выращивания корней на среде с ФЕН составляла 4 недели.

При элиситации корней метиловым эфиром жасмоновой кислоты (МЖ) использовали корневую культуру трехнедельного возраста. Концентрация МЖ (Siama-A.!drich) прн элиситации составляла 100 mkNI. Контролем служили колбы, в которые вводили соответствующую аликвоту этилового спирта. Длительность элиситации корней метилжасмонатом составляла 72 ч.

Выделение ИУК и АБК проводили по методу (Кефели, Турецкая, 1966), ЦТК - по методу (Негрецкий, 1988), ГА - по методу (Ложникова и др., 1973). Разделение гормонов проводили с помощью ТСХ. В качестве детекторов использовали стандартные метчики ИУК, ГА3 и ГА4 ("Serva", Германия), АБК, 3, РЗ ("Sigma", США). Количественное определение 3 и РЗ проводили с помощью ИФА по методу (Кудоярова и др., 1989), ГА, ИУК и АБК - по методу (Холодарь и др., 1995).

Качественное определение флавоноидов проводили ТСХ. Метчиками служили стандарты флавонов - вогонин, байкалеин и байкалин (Aldrich Chem. Co.). Детекцию веществ проводили в УФ-свете (254 и 365 нм). Кроме того, для подтверждения идентичности веществ применяли обработку хроматограмм реактивом Naturstoff Reagens (NST/PEG), дающим специфичное окрашивание флавонов в видимом свете (Wagner et al., 1983). Полосы с выявленными флавонами элюиров&ти смесью хлороформа и метанола (6 : 4), элюаты упаривали, остаток растворяли на ультразвуковой бане в метаноле и снимали

спектры. поглощения растворов в ультрафиолете, сопоставляя поглощение неизвестных веществ с поглощением имеющихся стандартов и с литературными данными (Mabry et al., 1970).

Количественное определение флавоноидов-агликонов проводили по методу, который используется в Фармакопее Германии (Qualitative..., 1995).

При суммарном определении содержания флавоноидов использовали тот факт, что метанольный экстракт корней и корневой культуры шлемника байкальского имел спектр поглощения в ультрафиолете, типичный для флавонов, в связи с чем их содержание в исходном метанольном экстракте определяли спектрофотометрически при 276 нм. Концентрацию флавоноидов рассчитывали с использованием удельного коэффициента поглощения метанольного раствора байкалеина при 276 нм, определенного экспериментально (Е>%- 929).

Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась на ПК с помощью специализированного пакета «Statistica for Windows 4.3».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА РОСТОВОЙ АКТИВНОСТИ КУЛЬТУРЫ

ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА

Стабильно растущая pRi Т-ДНК трансформированная корневая культура шлемника в конце пассажа представляет собой плотную розетку центробежно растущих желтоватых корней. Время удвоения культуры составляло 48 часов, что позволило отнести ее к быстро растущим корневым культурам.

В течение всего культивирования число хромосом (2n=i 8) в трансформированных корнях шлемника было постоянным и таким же, как у интактного растения (Хромосомные числа.., 1966).

Максимальный рост корней достигался на питательной среде В-5. На средах MS (1/2N) и MS корневая культура шлемника росла медленнее в 2,1 и 3,1 раза соответственно. Кроме того, корни растущие на средах MS (1/2N) и MS изменялись морфологически, становясь утолщенными за счет своего недифференцированного роста.

Изучение изменения рН питательной среды в ростовом цикле корневой культуры шлемника показало, что в течение 2-х недельного выращивания корни поглощали основную часть питательной среды, повышая рН с 5,5 до 6,75. Поэтому для дальнейшего нормального роста требовалось своевременное обновление среды.

Добавление новой порции среды на 14-й-15-й день роста корней значительно увеличивало скорость их роста и существенно повышало продуктивность корневой культуры. Как видно из рисунка 1, при таком способе культивирования масса корней к концу пассажа увеличивается в 25-30 раз, а при пролонгированном росте - регулярном добавлении свежей среды в течение 6-недельного выращивания - возможно и 50-кратное увеличение массы корней.

5 8 11 14 18 21 25 28 30 Возраст культуры, дни

» - вес сырых корней вес сухих корней

Рисунок 1 Динамика роста культуры трансформированных корней шлемника байкальского в пассаже

ФЛАВОНОИДЫ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА

В результате качественного определения флавоноидов, в дихлорметано-вом извлечении из метанольного экстракта культуры трансформированных корней шлемника байкальского были обнаружены два основных флавона, типичных для интактных корней шлемника, - вогонин и байкалеин. В зтилацетат-ном извлечении был обнаружен глюкуронид байкалеина - байкалин.

В последние годы экспериментально установлено, что вогонин, байкалеин и байкалин проявляют антибактериальную (КиЬо ег а1., 1981), антитромбическую (КиЬо й а1., 1985), антиоксидантную (Кшига й а!., 1982, К1шига в1 а1., 1984; Сао е1 а!., 1995; баМекка а1„ 1997, М1ао <л а1„ 1997), противопухолевую (Юшига е1 а1., 1997), а байкалеин - антигенотоксическую активность (Ьее е1 а1., 2000).

Количественное определение содержания суммы флавоноидов-агликонов показало, что на долю агликонов в культуре корней приходится 41 %, почти

половина от общего содержания флавоноидов, в то время как в корнях целых растений агликоны составляют лишь 27 % (таблица 1).

Таблица 1 - Содержание флавоноидов в корневой культуре шлемника байкальского и в корнях целого растения (%% на вес сухих корней)

Вариант определения Сумма флавоноидов Флавоноиды-агликоны

Корневая культура 5,94 ±0,08 2,42 + 0,08

* Корни целого растения 11,16±0,16 2,96 ±0,11

Общее содержание флавоноидов в культуре трансформированных корней шлемника при выращивании ее в колбах на 100 ют, составляет к концу пассажа (28-й день) около 5,94 %, что только в 1,88 раз ниже содержания флавонондов в корнях целых р&стздш«* 1 него возраста (т«6дйцй 1). Продуктивность

культуры (содержание суммы флавоноидов на литр питательной среды за цикл выращивания культуры) составляет около 0,8 г/ л. Если учесть, что корень одного растения шлемника при заготовке сырья весит около 12 г (сухой вес), то при среднем значении концентрации в нем флавоноидов, равном 15 %, в одном корне 5-ти-летнего возраста содержится около 2 г ценных вторичных метаболитов. Такое же количество флавоноидов может быть получено при выращивании рШ Т-ДНК трансформированной корневой культуры шлемника в 2,5 л питательной среды за один цикл их культивирования (4 недели).

Важной характеристикой культуры трансформированных корней шлемника байкальского является ее стабильность в отношении синтеза флавоноидов в течение всего времени существования культуры.

При изучении динамики образования флавоноидов в пассаже установлено, что концентрация флавоноидов в культуре трансформированных корней, выращенной в колбах объемом 100 мл, в течение пассажа изменялась незначительно (рисунок 2). Наименьшая концентрация суммы флавоноидов (3,56-4,01 %) была отмечена на 14-й-25-й дни, что соответствовало максимальному росту корневой культуры. В связи с относительной стабильностью концентрации флавоноидов в растущих корнях шлемника содержание флавоноидов в расчете на колбу определялось только интенсивностью роста культуры: с увеличением массы корней увеличивалось и общее содержание флавоноидов в расчете на колбу, что наглядно демонстрирует рисунок 2.

5 8 11 14 IS 21 25 28 30 Возраст культуры, дни

концентрация флавоноидов —«— содержание флавоноидов

Рисунок 2 Изменение содержания флавоноидов в культуре трансформированных корней шлемника в пассаже

Таким, образом, проведенные исследования показали, что в культуре трансформированных корней шлемника синтезируются флавоноиды (вогонин, байкалеин и байкалин), ответственные за проявление основных фармакологических эффектов растения. Это позволяет говорить о перспективности выращивания корневой культуры шлемника с целью получения ценных метаболитов.

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА РОСТ КУЛЬТУРЫ

ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА

И СОДЕРЖАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ

Существенным преимуществом культивирования корней in vitro является возможность регуляции образования в них вторичных соединений за счет воздействия на растущие корни различными стрессовыми факторами, что может обеспечить значительное повышение продуктивности выращиваемых корней.

Регуляцию биосинтеза флавоноидов можно проводить разными путями, так как на их образование в клетках, тканях и органах растений оказывают

влияние многие факторы, такие как свет, температура, состав газовой среды, факторы минерального питания, атака патогена. В значительной мере это объясняется, по-видимому, разнообразием тех функций, которые выполняют в растениях различные флавоноиды (Минаева, 1978; Запрометов, 1993).

Действие света.

Первой попыткой изменения биосинтетической активности трансформированных корней шлемника байкальского было культивирование их на свету. В подавляющем большинстве известных случаев освещение значительно стимулирует образование флавоноидов как у целых растений, так и культивируемых клеток, тканей и органов (Yamamoto, 1991; Запрометов, 1993).

Культивирование корней шлемника на свету интенсивностью 5000 лк не влияло на биосинтез флавоноидов. Однако, рост корней на свету интенсивностью 10000 и 15000 лк сопровождался увеличением содержания флавоноидов. Концентрация флавоноидов в опытных вариантах была почти в 1,32 раза выше по сравнению с контролем, но так как, свет ингибировал рост трансформированных корней шлемника продуктивность корневой культуры по флавоноидам на свету была в среднем на 11,3 % меньше, чем в темноте.

Известно, что свет модифицирует рост растений через систему гормонов. Баланс между свободными стимуляторами и ингибиторами, с одной стороны, и соотношение свободных и связанных регуляторов, с другой, являются основой гормональной регуляции всевозможных процессов жизнедеятельности в зависимости от внешних условий (в частности, световых) (Кефели, 1975;

ТГ---------------1

Ivciptia^iji iv И Мр., LsJVJ.

Как в темноте, так и на свету в трансформированных корнях шлемника образовывались основные фитогормоны: индолилуксусная кислота, гиббереллины, цитокинины и абецизовая кислота. В связи с тем, что уменьшение ростовой активности трансформированных корней шлемника на свету сопровождалось увеличением свободных форм ГА, ЦТК и АБК, то по всей видимости, именно с этими группами гормонов связано изменение роста культуры под действием света.

Кроме того, рост трансформированных корней шлемника на свету сопровождался и изменениями фотосинтетических параметров. Известно о способности культур трансформированных корней различных семейств (Astern-сеае, Solariaceae, Cucurbitaceae) зеленеть при росте на свету (Christen et al., 1992; Flores et al., 1993). Трансформированные корни шлемника байкальского растущие на свету также зеленели. Исследование содержания пигментов показало, что в корневой культуре щлемника на свету накапливался хлорофилл а и хлорофилл Ь, которые в темноте не обнаружены. На свету в клетках трансформированных корней шлемника хлоропласты имели шарообразную форму, характерную для хлоропластов листьев этого растения.

Таким образом, установлено, что культивирование pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника на свету сопровождалось увеличением содержания флавоноидов, уменьшением ростовой активности, изменением

содержания эндогенных гормонов и формированием фотосинтетического аппарата.

Влияниефенилаланина.

Второй попыткой изменения биосинтетической активности культивируемых корней было введение в питательную среду одного из предшественников биосинтеза флавоноидов - фенилаланина (ФЕН). Аминокислоту вводили при пересадке корней на свежую питательную среду, используя при этом концентрации ФЕН (0,01-1 мМ), которые не изменяли ростовые параметры культуры.

В результате 4-х-недельного выращивания корней шлемника на среде, содержавшей ФЕН, не было обнаружено стимулирующего влияния предшественника на биосинтез флавоноидов. При этом, ФЕН в концентрациях 0,1-1,0 мМ ингибировал образование флавоноидов почти в 1,4 раза по сравнению с контролем.

Поведение корневой культуры шлемника в этом отношении существенно отличалось от реакции каллусной культуры, полученной H.Yamamoto (1991), который обнаружил стимулирующее влияние экзогенного ФЕН на содержание флавоноидов в недифференцированно растущих клетках шлемника. Причина различной реакции двух систем на введение в среду ФЕН может состоять в меньшей зависимости дифференцированной корневой культуры шлемника от экзогенного предшественника и в ее большей самодостаточности, то есть в большей способности к самостоятельному синтезу ФЕН.

Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты.

Следующей попыткой увеличения продуктивности культуры было введение в среду метилового эфира жасмоновой кислоты (МЖ). Жасмоновая кислота и ее производные принимают участие в ответной реакции растительных клеток на действие стрессовых факторов (Kutchan, 1993, Gross, Parthier, 1994). Экзогенные или синтезируемые в ответ на обработку элиситорами жасмонаты вызывают усиление биосинтеза разных классов вторичных соединений. К настоящему времени экспериментально доказано индуцирующие действие метилового эфира жасмоновой кислоты на активность ряда ферментов фенилпропаноидного пути (Mizukami et al., 1993).

Трехдневная элиситация корневой культуры шлемника МЖ оказала ингибирующее действие на рост корней (рисунок 3). За время элиситации МЖ подавлял рост корневой культуры на 22 % по сравнению с контролем. В итоге, продуктивность корней по биомассе (г сухой массы/ л среды) составляла 5,71 ± 0,03 в опытном варианте и 7,41 ± 0,65 в контроле.

Результаты химического анализа "элиситированных" корней шлемника свидетельствовали о том, что обработка их МЖ в возрасте 21 суток сопровождалась увеличением содержания в них флавоноидов (рисунок 3). Концентрация флавоноидов в опытных вариантах была в 2,3 раза выше по сравнению с контролем. В связи с тем, что введение МЖ в питательную среду оказывало ингибируюшее действие на рост корневой культуры, продуктивность по флавоноидам в расчете на колбу увеличивалась в 1,79 раза.

0,9

30

{

- 5

0

0

1

?

л

Варианты опыта

! I вес сухих корней концентрация флавоноидов

Рисунок 3 Влияние метилового эфира жасмоповой кислоты на рост трансформированных корней шлемника и содержание в них флавоноидов

1. трехнедельная культура перед элиситацией

2. контроль - этанол (72час)

3. элиситация метилжаемонатом (72час)

Вероятно, выбранная нами концентрация МЖ является слишком высокой для чувствительных корней шлемника и, возможно, при использовании более низких концентраций можно добиться меньшего ингибирования роста при сохранении индуцирующего эффекта на образование флавоноидов.

Результаты работы показывают перспективность использования МЖ для индукции биосинтеза в культуре рШ Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского флавоноидов и возможность значительного повышения продуктивности культуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интерес к получению культуры трансформированных корней шлемника байкальского определялся исключительной ценностью корней этого растения и сложностью получения экологически чистого сырья. Известные до настоящего времени быстро растущие pRi Т-ДНК трансформированные корневые культуры шлемника байкальского были получены с помощью штаммов A.rhizogenes, Т-ДНК которых содержала маркерные гены, нетипичные для диких штаммов аг-робактерии (Zhou et al., 1997; Nishikawa, Ishimaru, 1997). Использование при трансформации модифицированного штамма агробактерии ведет к потере природной естественности системы. Этот недостаток был устранен в данной работе при трансформации листовых эксплантов стерильных проростков шлемника диким штаммом А-4 A. rhizogenes.

Культура трансформированных корней шлемника байкальского характеризуется высокой и стабильной скоростью роста. Время удвоения культуры составляло 48 часов. Продуктивность по биомассе в конце пассажа достигала 417,6 г сырой массы/ л среды.

По интенсивности роста полученная нами культура трансформированных корней шлемника байкальского в два раза превосходит корневую культуру, инициированную К. Nishikawa et al. (1999) с помощью дикого штамма АТСС 15834.

Не менее интересны данные, полученные в опытах по фотогормональной регуляции роста трансформированных корней шлемника. Уменьшение ростовой активности на свету сопровождалось изменением содержания эндогенных гормонов. Показано, что свет увеличивал содержание свободных форм ГА, ЦТК и АБК.

При культивировани на свету в трансформированных корнях шлемника формировался фотосинтетический аппарат.

Установлено, что трансформированные корни шлемника синтезируют флавоны, ответственные за проявление основных фармакологических эффектов корней интактных растений - вогонин, байкалеин и байкалин. Исследование количественного содержания суммы флавоноидов показало, что продуктивность корневой культуры шлемника по флавоноидам составляла около 0,8 г/ л. Следует отметить, что при выращивании pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника в 2,5 л питательной среды за один цикл их культивирования (4 недели) можно получить такое же количество флавоноидов, которое образуется в одном корне целого растения за 5 лет роста в природе. Особенно важно, что полученные in vitro трансформированные корни представляют собой экологически чистое сырье, не содержащее свинец, который в высоких концентрациях накапливается в корнях шлемника в природе (Иванов, 1996).

Результаты экспериментов по повышению продуктивности трансформированных корней шлемника показали перспективность использования метилового эфира жасмоновой кислоты для индукции биосинтеза в корнях флавоноидов и возможность значительного повышения продуктивности культуры.

Полученная pRi Т-ДНК культура трансформированных корней шлемника байкальского представляет интерес как для физиолого-биохимических исследований, так и для выращивания лекарственного сырья в контролируемых условиях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получена pRi Т-ДНК трансформированная корневая культура шлемника байкальского путем инокуляции листовых эксплантов стерильных проростков диким штаммом А-4 А. rhizogenes, стабильно растущая на протяжении всего времени выращивания. Оптимизированы условия культивирования трансформированных корней шлемника. Показано, что обновление питательной среды на 14-Й-15-Й день выращивания существенно повышает продуктивность корневой культуры.

2. Максимальная продуктивность корневой культуры по биомассе наблюдалась в конце ростового цикла (28-й - 30-й дни). Скорость роста трансформированных корней шлемника в пассажах изменялась незначительно.

3. Установлено, что трансформированные корни шлемника синтезируют флавоноиды, ответственные за проявление основных фармакологических эффектов корней интактных растений - вогонин, байкалеин и байкалин. Содержание суммы флавоноидов в пассажах существенно не изменялось и составляло 53,12 -61,09 мг/гсухой массы.

4. Свет уменьшал ростовую активность pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника, изменял содержание эндогенных i ирминов и увеличивал содержание флавоноидов. Показано формирование фотосинтетического аппарата в корневой культуре на свету.

5. Введение в питательную среду предшественника биосинтеза флавоноидов - фенилаланина в концентрации 0,01-0,05 мМ не влияло на ростовую активность корневой культуры шлемника и на содержание в ней флавоноидов.

6. Метиловый эфир жасмоновой кислоты стимулировал образование флавоноидов в культуре трансформированных корней шлемника.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гусева A.B., Савельева О.В. Формирование фотосинтетического аппарата и активность гормонов в культуре трансформированных корней шлемника байкальского И Мат-лы XXXVII Международной конференции "Студент и научно-технический прогресс". Новосибирск, 11-14 апреля 1999 г. -Новосибирск. НГУ, 1999. - С.5-6.

2. Гусева A.B., Карначук P.A., Кузовкина И.Н. Активность фитогормонов в культуре трансформированных корней шлемника байкальского // Мат-лы 5 межд. конф. "Регуляторы роста и развития растений". Москва, 29 июня - 1 июля 1999 г. - М.: РАСХН, 1999. - С. 317-318.

3. Гусева A.B., Карначук P.A., Кузовкина И.Н. Рост и формирование

фотосинтетического аппарата в культуре трансформированных корней шлемника байкальского // Мат-лы меж д. конф IV Съезда физиологов растений России. Москва, 4-9 октября 1999 г. - М., 1999. - С. 562.

4. Гусева А.В. Рост и образование флавоноидов в культуре генетически трансформированных корней Scutellaria baicalensis Georgi // Мат-лы XXXVIII межд. конф. "Студент и научно-технический прогресс", посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.А. Лаврентьева. Новосибирск, 10-14 апреля 2000 г. - Новосибирск: НГУ, 2000. С. 16.

5. Гусева А.В. Введение в культуру генетически трансформированных корней Scutellaria baicalensis Georgi и образование флавоноидов // VII Молодежная конференция ботаников в Санкт-Петербурге. - С-Пб, 2000. - С Л 09.

6. Кузовкина И.Н., Гусева А.В., Альтерман И.Е., Карначук Р.А. Образование флавоноидов в pRi T-DNA трансформированных корнях шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) и способы его регуляции // Физиология растений, 2001 (в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гусева, Анастасия Викторовна

03.00.05 -Ботаника

03.00.12 - Физиология растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биол. наук, проф.Р.А.Карначук кандидат биол. наук, в.нИ.Н.Кузовкина

Томск

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 5 1. ШЛЕМНИК БАЙКАЛЬСКИЙ - ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

1.1. Химический состав 9 1.1.1. Флавоноиды шлемника

1.2. Фармакологическое действие 17 2 ГЕНЕТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ КОРНИ -ПЕРСПЕКТИВНАЯ СИСТЕМА IN VITRO

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объект исследования

3.2. Методики исследования

3.2.1. Получение трансформированных корней шлемника байкальского

3.2.2. Определение ростовых параметров

3.2.3. Определение эндогенных гормонов

3.2.4. Определение содержания пигментов

3.2.5. Определение содержания флавоноидов

4. ХАРАКТЕРИСТИКА РОСТОВОЙ АКТИВНОСТИ pRi Т-ДНК ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО

4.1. Введение в культуру 49 4.1.1. Подбор питательной среды

4.2. Динамика роста в пассаже

4.3. Влияние различных факторов на рост культуры

4.3.1. Действие света 61 4.3.1.1. Формирование фотосинтетического аппарата

4.3.2. Влияние фенилаланина

4.3.3. Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты 75 5. СОДЕРЖАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО

5.1. Флавоноиды и динамика их образования 79 5.1.1. Динамика образования флавоноидов

5.2. Влияние различных факторов на содержание флавоноидов

5.2.1. Влияние различных питательных сред

5.2.2. Действие света

5.2.3. Влияние фенилаланина

5.2.4. Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты

Введение Диссертация по биологии, на тему "Введение в культуру трансформированных корней шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi. ) и содержание в них флавоноидов"

Актуальность проблемы. Род шлемник {Scutellaria) является одним из самых многочисленных в семействе Lamiaceae, он насчитывает около 360 видов растений мировой флоры (Чемесова, 1993), но к настоящему времени наиболее полно изучены химический состав и фармакологические свойства шлемника байкальского {Scutellaria baicalensis Georgi). Это многолетние растение применяется в традиционной и официальной медицине, в основном, России, Китая, Японии, Кореи и Монголии.

Спиртовая настойка корней шлемника обладает четко выраженным противовоспалительным, гипотензивным и седативным действием, в связи с чем препараты растения включены в фармокопеи России, Китая и Японии (Гольдберг и др., 1994). В последние годы внимание к шлемнику байкальскому особенно возросло в связи с тем, что экспериментально доказан ряд других ценных свойств экстрактов из его корней. Обнаружена антиаллергическая, антиоксидантная и противоопухолевая активность, что подтверждено клиническими испытаниями (Разина и др., 1987; Гольдберг и др., 1994; Gabrielska et al., 1997; Miao et al., 1997). Основными действующими веществами, определяющими фармакологические свойства растения являются флавоноиды, которые в основном содержатся в корнях шлемника.

В связи с исключительной ценностью корней шлемника байкальского, ограниченным ареалом, относительно малыми природными запасами, медленными темпами возобновления роста растений в естественных зарослях (5-10 лет) и сложностью получения экологически чистого сырья появилась необходимость получения культуры шлемника в условиях in vitro. Сравнительно недавно были получены каллусная и суспензионная культуры шлемника байкальского (Трофимова, 1982; Yamamoto et al., 1986; Yamamoto, 1991; Seo et al., 1993), а затем - корневые культуры методом трансформации фрагментов проростков pRi Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes (Zhou et al., 1997; Nishikawa, Ishimaru, 1997, Nishikawa et al., 1999). Последний способ представляет наибольшую ценность для выращивания больших масс корней шлемника, так как в этом случае корни культивируются на безгормональной питательной среде, что гарантирует получение экологически чистого сырья.

Однако, полученные до настоящего времени быстро растущие pRi Т-ДНК трансформированные корневые культуры шлемника байкальского были инициированы с помощью штаммов A.rhizogenes, Т-ДНК которых содержала маркерные гены, нетипичные для диких штаммов агробактерии, что также не желательно при биотехнологическом использовании культивируемых корней шлемника. Поэтому использование для проведения трансформации дикого, немодифицированного штамма агробактерии сохраняет природную естественность системы, которая может представлять ценность для биотехнологических разработок с целью получения экологически чистых препаратов, обладающих важными фармакологическими свойствами.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было введение в культуру pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского с использованием не модифицированного, а дикого штамма A.rhizogenes, определение ее биосинтетической продуктивности и поиск способов направленной регуляции образования в корневой культуре флавоноидов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1) получить культуру pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского с использованием дикого штамма A. rhizogenes и подобрать оптимальную питательную среду для роста корневой культуры и образования флавоноидов;

2) исследовать динамику роста трансформированных корней шлемника, и формирование в них гормонального статуса при культивировании на свету;

3) исследовать влияние освещения, фенилаланина и метилового эфира жасмоновой кислоты на продуктивность корней;

4) провести качественный и количественный анализ флавоноидов, образующихся в культуре трансформированных корней шлемника.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получена культура трансформированных корней шлемника байкальского путем инокуляции листовых эксплантов стерильных проростков А. rhizogenes (дикий штамм А-4). Показана способность корневой культуры к интенсивному росту и высокой продуктивности.

Результаты настоящей работы расширяют представления о роли баланса эндогенных гормонов в процессах роста культур трансформированных корней in vitro. Впервые получены экспериментальные данные о том, что изменение ростовой активности pRi Т-ДНК трансформированных корней на свету сопровождалось изменением гормонального баланса в корневой культуре. Показано, что уменьшение ростовой активности при культивировании трансформированных корней шлемника на свету сопровождалось увеличением свободных форм ГА, ЦТК и АБК.

Установлено, что трансформированные корни шлемника синтезируют флавоны, ответственные за проявление основных фармакологических эффектов корней интактных растений - вогонин, байкалеин и байкалин. Показано, что при выращивании pRi Т-ДНК трансформированной культуры шлемника в 2,5 л питательной среды за 4 недели можно получить такое же количество флавоноидов, которое образуется в одном корне целого растения за 5-10 лет роста в природе. Кроме того, полученные in vitro трансформированные корни шлемника представляют собой экологически 8 чистое сырье, что может служить основой для коммерческого получения флавоноидов.

Результаты, полученные в данной работе, используются при чтении лекционных курсов «Основы биотехнологии», «Клеточная культура растительной ткани» и при проведении практических занятий со студентами биолого-почвенного факультета Томского государственного университета.

Работа выполнена на кафедре физиологии и биотехнологии растений Томского государственного университета и в группе специализированного метаболизма корней Института физиологии растений РАН (г.Москва).

1. ШЛЕМНИК БАЙКАЛЬСКИЙ - ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Лекарственные растения были известны еще в глубокой древности. Так, на самых древних письменных источниках - глиняных табличках, обнаруженных в Ассирии, уже содержатся сведения о лекарственных растениях; причем наряду с описанием различных лекарственных растений указано против каких болезней и в каком виде это растение необходимо применять.

Лекарственные растения и сегодня играют значительную роль в здравоохранении, их удельный вес в арсенале лекарственных средств очень велик. Постоянно ведутся научные исследования в области изучения старых и открытия новых лекарственных растений (Гаммерман и др., 1976). Современная фармацевтическая промышленность пошла дальше, выделяя чистые химические вещества, ответственные за лекарственную активность растения. Например, эметин из ипекакуаны (Psychotria ipecacuanha), винкристин из барвинка розового (Vine a rosea), и подофиллотоксин из подофилла (Podophyllum). Растения продолжают оставаться основным источником биологически активных веществ, так как большинство химических соединений, вырабатываемых растениями, представляют собой структурный комплекс, делающий их химический синтез экономически невыгодным (Signs, Flores, 1990).

1.1. Химический состав корней шлемника байкальского

Среди лекарственных растений рода Scutellaria наиболее популярным является шлемник байкальский. Поэтому первые исследования химического состава проводились именно с этим видом. Корни Scutellaria baicalensis содержат до 17 % крахмала и 15 % дубильных веществ (Хныкина, 1963; Дьяконова, Алексеева, 1953), 8,5 % моносахаридов и до 16 % фенольных соединений (Гольдберг и др., 1994). Кроме того, корни содержат эфирное масло, алкалоиды (Минаева, 1991), смолы (2-5 %) (Гаммерман, Гром, 1976). Также в корнях шлемника байкальского были обнаружены стеролы (Ishimaru et al., 1995) и дитерпены (Hussein et al., 1996, 1998).

Основными компонентами в составе фенольных соединений и основными действующими веществами шлемника байкальского являются флавоноиды.

Флавоноиды представляют собой наиболее многочисленную группу природных фенольных соединений. Основу их структуры составляет флаван (рисунок 1), содержащий два бензольных ядра (А и В), соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом (Запрометов, 1993).

Кольцо А молекул флавоноидов образуется из ацетата, а кольцо В - из продуктов шикиматного пути (Гудвин, Мерсер, 1986; Запрометов, 1993)

Исследованием химического состава шлемника байкальского начали заниматься еще в прошлом веке. В 1889 японским исследователем из корней был выделен первый флавон - вогонин, однако его структура была установлена только много лет спустя. Следующим из корней был выделен

1.1.1. Флавоноиды шлемника байкальского у

Рисунок 1 Флаван байкалин. При кислотном гидролизе байкалина образуются глюкуроновая кислота и флавоновый агликон, названный байкалеином (Tang, Eisenbrand, 1992). Вогонин, байкалин и байкалеин являются основными действующими метаболитами корней шлемника (рисунок 2) (Kubo et al., 1985; Tang, Eisenbrand, 1992; Kimura et al., 1997).

Рисунок 2 Основные флавоноиды корней шлемника байкальского

1. -вогонин;

2. - байкалин;

3. -байкалеин.

Интенсивные исследования флавоноидов шлемника байкальского начались в середине 60-х годов в нашей стране, Японии и Китае. Эти работы развернулись в связи с выявлением новых видов биологической активности флавоноидов этого растения (Гольдберг и др, 1994).

Флавоноиды, выделенные из корней шлемника байкальского представлены в таблице 1. он 3 он о

Таблица! - Флавоноиды корней шлемника байкальского

Название Литературный источник

X а л к о н ы

2,4,2',6'-тетраокси-6-метоксихалкон Таг^, Е1зепЬгапс1, 1992

Флаваноны

5,7-диоксифлаванон

5.6-диокси-7-метоксифлаванон

5.7-диокси-6-метоксифлаванон (дигидроороксилин А)

5.7-диокси-8-метоксифлаванон (дигидровогонин)

5.8-диокси-7-метоксифлаванон

5.6.7-триоксифлаванон (дигидробайкалеин)

5.7.8-триоксифлаванон (28)-5,7,2',6'-тетрагидроксифлаванон (28)-5,7,2',6'-тетрагидрокси-5-метоксифлаванон

Растительные., 1991 Гольдберг и др., 1994

Тап§, Е1зепЬгапс1, 1992

Гольдберг и др., 1994 Там же

Тап§, Е1зепЬгапс1, 1992 Там же Чемесова, 1993

Там же

Гликозиды флаванонов

7-0-|3-0 глюкуронид дигидробайкалеина 7-0-(3-Т) глюкуронид дигидронорвогонина

Гольдберг и др., 1994 Там же

Название

Флаванонолы

Литературный источник

3,5,7,2',6'-пентагидроксифлаванонол Гольдберг и др., 1994

Флавоны

5,7-диоксифлавон (хризин)

5-окси-6,7-диметоксифлавон

5-окси-7,8-диметоксифлавон

5-окси-7,8,2'-триметоксифлавон

5-окси-6,7,8,2',6'-пентаметоксифлавон

5-окси-7,8,2',5',6'-пентаметоксифлавон

2'-окси-5,7,8-триметоксифлавон

5.6-диокси-7-метоксифлавон

5.7-дигидрокси-6-метоксифлавон (ороксилин А)

5,7-диокси-8-метоксифлавон (вогонин)

5.7-дигидрокси-6,8-диметоксифлавон

5.8-диокси-6,7-диметоксифлавон 5,2'-диокси-7,8-диметоксифлавон (скуллкепфлавон I) 5,2'-диокси-6,7,8-триметоксифлавон (тенаксин I)

Тап§, Е1зепЬгап(1, 1992 Гольдберг и др., 1994 Тащ, Е1зепЬгапс1, 1992 Чемесова, 1993 Там же Гольдберг и др., 1994

Там же

Попова и др., 1973

Тап^, КзепЬгапё, 1992

Там же Гольдберг и др., 1994

Тап§, Е1БепЬгап(1, 1992

Название

Литературный источник

5,2'-диокси-7,8,6'-триметоксифлавон (ривулярин)

5,6'-диокси-2,7,2'-триметоксифлавон 5,2'-диокси-6,7,8,6'-тетраметоксифлавон (скуллкепфлавон И) 5,6,7-триоксифлавон (байкалеин) 5,7,8 -триоксифлавон (норвогонин) 5,7,2'-триоксифлавон 5,7,2'-триокси-6-метоксифлавон (тенаксин II)

5,7,2'-тригидрокси-8-метоксифлавон

5,8,2'-триокси-7-диметоксифлавон

5,8,2'-триокси-6,7-диметоксифлавон

5,7,2'-диокси-8,6'-диметоксифлавон

5,7,6'-триокси-8,2-диметоксифлавон

5,7,6'-триокси-2-оксифлавон

5,7,2'-триокси-6'-метоксифлавон

5,7,2'-триокси-8,6'-диметоксифлавон

5,7,4'-трирокси-6-метоксифлавон

5,7,4'-триокси-8-метоксифлавон

5,8,2'-триокси-7-метоксифлавон

5,8,2'-триокси-6,7-диметоксифлавон гагщ^аЦ 1994 Гольдберг и др., 1994

Тап§, Е1зепЬгап(1, 1992

Там же

Гольдберг и др., 1994 шg, Е1зепЬгап(1, 1992 Там же Чемесова, 1993 Таг^, Е1зепЬгапё, 1992

Там же Гольдберг и др., 1994

Там же

Zang & а1., 1994 Тап§, Е18епЬгапс1, 1992

Там же

Название

Литературный источник

5,2',6'-триокси-7,8-диметоксифлавон (висцидулин II)

5,2',5'-триокси-6,7-диметоксифлавон

5,2',5'-триокси-7,8-диметоксифлавон

5,2',5'-триокси-6,7,8-триметоксифлавон

5,6,7,2'-тетраоксифлавон

5,6,7,4'-тетраоксифлавон (скутеллареин)

5,7,2',3'-тетраоксифлавон

5,7,2',5'-тетраоксифлавон

5,7,2',6'-тетраоксифлавон

5,7,3',6'-тетраокси-8,2'-диметоксифлавон

5,7,2',3'-тетраокси-8,6'-диметоксифлавон

5,7,2',5'-тетраокси-8,6'-диметоксифлавон висцидулин III)

5,7,3',6'-тетраокси-6,2'-диметоксифлавон 5,7,2',6'-тетраокси-6,2'-диметоксифлавон

Гликозиды флавонов

6-С-а-0-глюкозидо-8-С-а-Ь-арабинозид хризина

6-С-а-Ь-арабинозидо-8-С-Р-0-глюкозид хризина

Гольдберг и др., 1994

Там же

Tang, Eisenbrand, 1992 Там же Zang et al., 1994 Tang, Eisenbrand, 1992 Гольдберг и др., 1994 Там же

Tang, Eisenbrand, 1992 Гольдберг и др., 1994 Там же

Takagi et al., 1981

Takagi et al., 1981

Название

Литературный источник

8-син-С-а-Ь-арабинозидо-б-С-анти-а-Э-глюкозид хризина 8-анти-С-ос-Ь-арабинозидо-6-С-анти- а-Э-глюкозид хризина 8-син-С-а-Ь-арабинозидо

6-С-син-а-О-глюкозид хризина 8-анти-С-а-Ь-арабинозидо-8-С-син-а-Б-глюкозид хризина

7-0-(3-0-глюкуронид ороксилина А 5-0-РЛ)-глюкозид вогонина 7-0-(3-0-глюкуронид вогонина (вогонозид) 7-0-|3-В-глюкуронид хризина 2,-0-(3-0-глюкозид-5,2',6'-триокси-6,7-диметоксифлавон 2'-0-Р-В-глюкозид-5,2',6'-триокси-6,7,8-триметоксифлавон

7- ОР-Э-глюкуронид скутеллареина (скутелларин)

2- О-Р-Б-глюкозид висцидулина III 7- О-Р-О-глюкуронид байкалеина (байкалин)

Гольдберг и др., 1994

Там же

Tang, Е1зепЬгапс1, 1992

Там же

Гольдберг и др., 1994

ЬЫтаги е1 а1., 1995

ЬЫтаги е1 а1., 1995

Тап§, Е1зепЬгапс1, 1992 г^егаЬ, 1994

Tang, Е1зепЬгапс1, 1992

Название Литературный источник

7- O-ß-D-глюкозид байкалеина Там же

Флавонолы

3,5,7,2',6'-пентагидроксифлавонол висцидулин I) Tang, Eisenbrand, 1992

В результате многочисленных работ отечественнных и зарубежных исследователей последних лет в корнях шлемника байкальского обнаружено и охарактеризовано 77 флавоноидных соединений. На основании химического исследования флавоноиды корней отнесены к пяти классам: халконам, фла-ванонам, флаванонолам, флавонам и флавонолам. Огромное разнообразие флавоноидных производных обусловлено также большим разнообразием типов и моделей замещения в А- и В-кольцах. Гликозиды представлены в основном глюкуронидами, которым сопутствуют глюкозиды (Так^1 et а1., 1981; Гольдберг и др., 1994; Мопшйо а1., 1995).

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Гусева, Анастасия Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые получена рШ Т-ДНК трансформированная корневая культура шлемника байкальского путем инокуляции листовых эксплантов стерильных проростков диким штаммом А-4 А. rhizogen.es, стабильно растущая на протяжении всего времени выращивания. Оптимизированы условия культивирования трансформированных корней шлемника. Показано, что обновление питательной среды на 14-й-15-й день выращивания существенно повышает продуктивность корневой культуры.

2. Максимальная продуктивность корневой культуры по биомассе наблюдалась в конце ростового цикла (28-й - 30-й дни). Скорость роста трансформированных корней шлемника в пассажах изменялась незначительно.

3. Установлено, что трансформированные корни шлемника синтезируют флавоноиды, ответственные за проявление основных фармакологических эффектов корней интактных растений - вогонин, байкалеин и байкалин. Содержание суммы флавоноидов в пассажах существенно не изменялось и составляло 53,12 - 61,09 мг/г сухой массы.

4. Свет уменьшал ростовую активность рЯ1 Т-ДНК трансформированных корней шлемника, изменял содержание эндогенных гормонов и увеличивал содержание флавоноидов. Показано формирование фотосинтетического аппарата в корневой культуре на свету.

5. Введение в питательную среду предшественника биосинтеза флавоноидов - фенилаланина в концентрации 0,01-0,05 мМ не влияло на ростовую активность корневой культуры шлемника и на содержание в ней флавоноидов.

6. Метиловый эфир жасмоновой кислоты стимулировал образование флавоноидов в культуре трансформированных корней шлемника.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интерес к получению культуры трансформированных корней шлемника байкальского определялся исключительной ценностью корней этого растения и сложностью получения экологически чистого сырья.

Известные до настоящего времени быстро растущие pRi Т-ДНК трансформированные корневые культуры шлемника байкальского были получены с помощью штаммов A.rhizogenes, Т-ДНК которых содержала маркерные гены, нетипичные для диких штаммов агробактерии (Zhou et al., 1997; Nishikawa, Ishimaru, 1997). Использование при трансформации модифицированного штамма агробактерии ведет к потере природной естественности системы. Этот недостаток был устранен в данной работе при трансформации листовых эксплантов стерильных проростков диким штаммом А-4 A. rhizogenes. По интенсивности роста полученная нами культура трансформированных корней шлемника байкальского в два раза превосходит корневую культуру, инициированную К. Nishikawa et al. (1999) с помощью дикого штамма АТСС 15834.

Корневая культура шлемника байкальского обладает высокой и стабильной скоростью роста. Время удвоения культуры трансформированных корней шлемника составляло 48 часов. Продуктивность по биомассе в конце пассажа достигала 417,6 г сырой массы/л среды.

Не менее интересны данные, полученные в опытах по фотогормональной регуляции роста трансформированных корней шлемника. Уменьшение ростовой активности на свету сопровождалось изменением содержания эндогенных гормонов. Показано, что свет увеличивал содержание свободных форм ГА, ЦТК и АБК.

При культивировани на свету в трансформированных корнях шлемника формировался фотосинтетический аппарат, причем размер хлоропластов и их число в клетке зависело от интенсивности света.

Установлено, что трансформированные корни шлемника синтезируют флавоны, ответственные за проявление основных фармакологических эффектов корней интактных растений - вогонин, байкалеин и байкалин. Исследование количественного содержания суммы флавоноидов показало, что продуктивность корневой культуры шлемника по флавоноидам составляла около 0,8 г/л.

Следует отметить, что при выращивании pRi Т-ДНК трансформированной культуры шлемника в 2,5 л питательной среды за один цикл их культивирования (4 недели) можно получить такое же количество флавоноидов, которое образуется в одном корне целого растения за 5-10 лет роста в природе. Особено важно, что полученные in vitro трансформированные корни представляют собой экологически чистое сырье, не содержащее свинец, который в высоких концентрациях накапливается в корнях шлемника в природе (Иванов, 1996).

Результаты экспериментов по повышению продуктивности трансформированных корней шлемника показали перспективность использования метилового эфира жасмоновой кислоты для индукции биосинтеза в корнях флавоноидов и возможность значительного повышения продуктивности культуры.

Полученная нами pRi Т-ДНК культура трансформированных корней шлемника байкальского представляет интерес как для физиолого-биохимических исследований, так и для выращивания лекарственного сырья в контролируемых условиях, в качестве источника флавоноидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусева, Анастасия Викторовна, Томск

1. Армитидж Ф., Уолден Р., Дрейпер Дж. Агробактериальные трансформирующие векторы растений / Генная инженерия растений. Лабораторное руководство М.: Мир, 1991. - С. 11-86.

2. Асеева Т.А., Батуев Б.Б., Ханкин И.С., Федотовских H.H., Дашнев Д.Б. Изучение тибетских многокомпонентных лекарственных смесей // Растительные ресурсы. 1985. - Т.21,Вып.1. - С. 15-25.

3. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений / Под ред. П.С.Чикова. М.: Медицина. - 1976. - С.340.

4. Банаева Ю.А. Шлемник байкальский {Scutellaria baicalensis Georgi.): Экология, биология, интродукция: Автореф. дис. канд. биол. наук. -Новосибирск, 1994. 12 с.

5. Березнеговская JI.H. Выращивание лекарственных растений в Томске // Вопросы фармакогнозии. 1960. - Т.12, № 5. - С.30-55.

6. Блинова К.Ф., Куваев В.Б. Лекарственные растения тибетской медмицины Забайкалья // Вопросы фармакогонозии. 1965. - Т. 17, №3. -С.163-178.

7. Бутенко Р.Г. Культура клеток и тканей растений. М.: Знание, 1971.96с.

8. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: Наука, 1999. - С. 16-32.

9. Вершинин Н.В., Яблоков Д.Д. Фармакология и клиника сибирских растений с седативным и гипотензивным действием // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты. 1946. - Вып.2. - С. 10-16.

10. Гамбург К.З. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений. -Новосибирск: Наука, Сиб.отд-ние, 1976. 272 с.

11. Гамбург К.З. Фитогормоны и клетки. М., Наука, 1970. - 104 с.

12. Гаммерман А.Ф., Гром И.И. Шлемник байкальский Scutellaria bai-calensis Georgi. / Дикорастущие лекарственные растения СССР. - М.: Медицина, 1976. - С.208.

13. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Щупинская М.Д., Яценко-Хмелевский. Шлемник байкальский / Лекарственные растения,- М.: Высшая школа, 1976. -С.236-238.

14. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Литвиненко В.И., Попова Т.П., Суслов Н.И. Шлемник байкальский. Фитохимия и фармакологические свойства. -Томск: Изд-во ТГУ, 1994. 222 с.

15. Головацкая И.Ф., Карначук Р.А. Практикум по физиологии растений. Ростовые вещества. Томск: Изд-во ТГУ, 1995. - 113 с.

16. Головацкая И.Ф., Семенов Д.А. Действие света на рост и гормональный баланс фасоли при прорастании / Материалы Всероссийского совещания "Физиология и биотехнология растений". Томск: Изд-во "Факел", 1998.- С.14-17.

17. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986. -Т.2, - 312 с.

18. Гусева А.П. 1961. Применение в тибетской медицине забайкальских растений//Вопросы фармакогонозии. 1961. - Т.13, №1. - С.363-366.

19. Гэлстон А., Девис П., Сэттер Р. Жизнь зеленого растения. М.: Мир, 1983.- 552 с.

20. Даниелян Т.С., Арустамян А.В. Влияние света и темноты на активность фитогормонов в различных органах растений // Тез. докл. 2-го с. ВОФР (24-29 сент. 1990, Минск). М. - 1992. - 4.2. - С.61.

21. Дерфлинг К. Гормоны растений. М.: Мир, 1985. - 304с.

22. Дощинская Н.В. К биологии семян шлемника байкальского // Новые лекарственные растения Сибири, их лекарственные препараты и применение. Томск, 1958. - С. 15.

23. Дрейпер Дж., Скотт Р., Хэмил Дж. Трансформация клеток двудольных растений с помощью Тьплазмид А^гоЪаМегшт Ште/аЫет и Ш-плазмид А. rhizogenes / Генная инженерия растений. Под ред. Дж. Дрейпера и др. М.: Мир, 1991.- С.87-193.

24. Думенова Е.М. К вопросу о гипотензивном действии шлемника и чистеца байкальских // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты. 1946. - Т.46, Вып.2. - С.31-37.

25. Думенова Е.М. Влияние шлемника байкальского на мотрную хронок-сию // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты. -1959. Т.58, Вып.5. - С.89-92.

26. Дьяконова Л.Н., Алексеева Г.П. Количественное определение дубильных веществ в корнях шлемника байкальского // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты. 1953. - Т. 56, Вып.4. - С.33-35.

27. Дьяконова Л.Н., Думенова Е.М. Препарат из шлемника байкальского для парэнтерального введения // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты. -1953.- Т.56, Вып.4, С.29-32.

28. Дьяконова Л.Н., Ермоленко А.П. Получение скутеллареина и его химическое исследование // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты. -1953.- Т.56, Вып.4, С.36-38.

29. Дьяконова Л.Н., Калашникова В.А., Кочеткова З.А. Химическое исследование шлемника байкальского // Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты. -1953.- Т.56, Вып.4. С.25-28.

30. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. - 272 с.

31. Ибрагимов Ф.И., Ибрагимова B.C. Основные лекарственные средства китайской медицины. М.: Медгиз, 1960. 412 с.

32. Иванов В. Черемуху бог задумывал без молибдена.// Сибирское здоровье сегодня. 1996. - №5.

33. Карначук Р.А., Негрецкий В.А., Головацкая И.Ф. Рост растений и содержание гормонов в зависимости от спектрального состава // Физ. раст. -1990. Т.37, вып.З. - С.527-534.

34. Кахнович JI.B. Структурная организация фотосинтетического аппарата растений в условиях разного светового режима / Оптимизация фотосинтетического аппарата воздействием различных факторов. Минск: Изд-во БГУ, 1976. -С.3-12.

35. Кахнович Л.В. Фотосинтетический аппарат и световой режим. -Минск: Изд-во БГУ, 1980. 142 с.

36. Кефели В.И. Действие света на рост и морфогенез высших растений / Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений М.: Наука, 1975. -С.209-227.

37. Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин Е.Н. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота. - М.: Наука. - 1989. - 184 с.

38. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю. и др. Иммуноферментная система дляопределения цитокининов // Физ. раст. 1990. - Т.37. - С.193-199.

39. Кузовкина И.Н. Культивирование генетически трансформированных корней растений: возможности и перспективы использования в физиологии растений // Физ. раст. 1992. - Т.39, Вып.6 - С. 1208-1214.

40. Кузовкина И.Н., Мантрова О.В., Альтерман И.Е., Якимов С.А. Получение культуры генетически трансформированных корней марены красильной, продуцирующей антрахиноны // Физиология растений. 1996. -Т.43, №2 - С.121.

41. Кулаева О.Н. Цитокинины. Их строение и функции. М.: Наука, 1973.264 с.

42. Кунах В. А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro II Физиология растений. -1999. Т.46, №6 - С.919-929.

43. Ложникова В.Н., Хлопенкова Л.П., Чайлахян М.Х. Определение природных гиббереллинов в растительных тканях / Методы определения фитогормонов, ингибиторов роста, дефолиантов и гербицидов. Под ред. Ракитина Ю.В. М.: Наука, 1973. - С.50-58.

44. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 480 с.

45. Мантрова О.В., Дунаева М.В., Кузовкина И.Н., Шнайдер Б., Мюллер-Ури Ф. Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты на биосинтез антра-хинонов в генетически трансформированных корней марены кра-сильной // Физ. раст. 1999. - Т.43, №2. - С.292-295.

46. Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическоеиспользование / Под ред. Запрометова М.Н. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1978. - 255с.

47. Минаева В.Г. Шлемник байкальский Scutellaria baicalensis Georgi. / Лекарственные растения Сибири - Новосибирск: Наука, Сиб. Отд-ние, 1991.- С.212-214.

48. Негрецкий В. А. Методические рекомендации по определению цитокининов / Методические рекомендации по определению фитогормонов.- Киев: Ин-т ботаники АН УкрССР, 1988. С.31-40.

49. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1974.304с.

50. Пиле П.Э. Влияние эндогенных ингибиторов на процесс роста корней и их геореакцию / Рост растений и дифференцировка. М.: Наука, 1981. -С.30-40.

51. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988.- 303 с.

52. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений. М.: Наука, 1985. - 277с.

53. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Создание трансгенных растений // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1994. - №5. - С.36-37.

54. Попова Т.П., Литвиненко В.И., Ковалев И.П. Флавоны корней Scutellaria baicalensis II Химия природных соединений. 1973. - №6. - С.729-733.

55. Разина Т.Г. Шлемник байкальский как корректор цитостатической химиотерапии опухолей (экспериментальное исследование): Автореф. дис.канд. биол. наук. Томск, 1988. - 12с.

56. Разина Т.Г., Литвиненко В.И., Попова Т.П., Гольдберг Е.Д. Влияние экстрактов из стеблей и листьев Scutellaria baicalensis Georgi на эффективность химиотерапии экспериментальных опухолей // Раст.ресурсы.- 1993. Вып.З. - С.90-94.

57. Разина Т.Г., Удинцев С.Н. и др. Повышение избирательности действия цитостатиков с помощью экстракта шлемника байкальского в эксперименте // Вопросы онкологии. 1987. - Т.ЗЗ, №2. - С.80-84.

58. Разина Т.Г., Удинцев С.Н. Изучение роли агрегационной функции тромбоцитов в механизме противометастатического действия экстракта шлемника байкальского // Вопросы онкологии. 1989. - Т.35, №3. - С.331-334.

59. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hippuridaceae-Lobeliaceae. С.Пб.: Наука, 1991. - С.86-87.

60. Ревердатто В.В. Лекарственные растения семейства губоцветных и их действующие начала // Новые лекарственные растения Сибири. Томск, 1953. - Вып.4. - С.21-24.

61. Смирнов A.M. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре. М.: Наука, 1970. - 455с.

62. Соколова B.C., Сацыперова И.Ф. О лекарственных растениях, их препаратах и о введении в культуру // Вопросы фармакогнозии. 1960. -Т.1.,№5. - С.351-358.

63. Сытник K.M. Физиология корня. Киев.: Наук, думка, 1972. - 354с.

64. Тепфер Д. Биология генетической трансформации высших растений с помощью Agrobacterium rhizogenes / Молекулярная генетика взаимодействия бактерий с растениями. Москва: ВО "Агропромиздат", 1988. - С.272-282.

65. Трофимова H.A. Шлемник байкальский в изолированной культуре тканей / Растительные ресурсы Южной Сибири, их рациональное использование и охрана. Томск: Изд-во ТГУ, 1982. - С.80-82.

66. Урманцева В.В., Карягина Т.Б. и др. Индукция фенилаланинаммиаклиазы метилжасмонатом в культуре клеток Arnebia euchroma II Физ. раст. 1999. - Т.46, №6. - С.855-860.

67. Флора Сибири. Т.П.: Pyrolaceae-Lamiaceae (Labiatae) / Сост.

68. B.М.Доронькин, Н.В.Ковтонюк, В.В.Зуев и др.: В 14 т. Новосибирск: Наука, Сибирская издательская фирма РАН, 1997. - С. 162.

69. Хайдав Ц., Алтаичимэг Б., Варламова П.С. Лекарственные растения в монгольской медицине. Улан-Батор: Гос. Изд-во, 1985. - 390с.

70. Ханкин И. С., Федотовских Н.Н. и др. Изучение тибетских многокомпонентных смесей // Растительные ресурсы. 1985. - Т.21, Вып.2.1. C.187-193.

71. Хныкина Л.А. Фармакогностические и биологические особенности шлемника байкальского. Диссертация на соискание к.б.н. Томск, 1953. -190с.

72. Холодарь В.А., Шевцов С.В., Чекуров В.М. Применение иммуноферментного анализа для изучения фоторегуляции уровня гиббереллинов в этиопластах пшеницы / Физ. раст. 1995. - Т.42. - С.647-651.

73. Хромосомные числа цветковых растений. Л.: Наука, 1966. - С.371.

74. Чемесова И.И. Флавоноиды видов рода Scutellaria Georgi. // Раст.ресурсы. 1993. - Вып.2. - С.89-99.

75. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. М.: Наука, 1971.-С.154-171.

76. Юлдашев М.П., Батиров Э.Х., Маликов В.М. Флавоноиды корней Scutellaria baicalensis и S. glabrata II Химия природных соединений. 1994. -№6. -С.471-472.

77. Яблоков Д.Д., Воронова A.M. Клинические наблюдения над действием байкальского шлемника при гипертонической болезни / Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты и применение. Новосибирск, 1949. - Вып.5. - С.201-210.

78. Amselm J., Tepfer M. Molecular basis for novel root phenotypes induced by Agrobacterium rhizogenes A4 on cucumber // Plant Mol. Biol. 1992. - V.19. -P.421-432.

79. Andolfatto P. Transformed hairy root of Mesenbryanthemum crystallinum II Physiol, plant. 1994. - V.90, № 4. - P.708-714.

80. Berlin J. Isoflavone glycoside formation in transformed and non-transformed suspension and hairy root cultures of Lupinus polyphyllus and Lu-pinus hartwegii II Z.Naturforsch. 1991. - V.46, № 9-10. - P.725 - 734.

81. Blakesley D., Chaldecott M.A. The role of endogenous auxin in root initiation. II. Sensitivity and evidence from studies on transgenic plant tissues // Plant Growth Reg. 1993. - V. 13. - P.77-84.

82. Buitelaar R.M., Cesario M.T., Tramper J. Elicitation of thiophene production by hairy roots of Tagetes patula 11 Enzyme Microb. Technol. 1992. - №14. -P.2-7.

83. Choi J.W., Cho J.M. et al. Application of genetic algorithm to self-organizing fuzzy controller fed-batch culture of Scutellaria baicalensis G. plant cell //Korean journal of chemical engineering. 1986. - №15. - P.404-410.

84. Christen P., Aoki T., Shimomura K. Characteristics of growth and tropane alkaloid production in Hyoscyamus albus hairy roots // Plant Cell Repts. 1992. -V.l 1, №12. - P.597-600.

85. Chung CP., Park JB., Bae KH. Pharmacological effects of methanolic extract from the root of Scutellaria baicalensis and its flavonoids on human gingival fibroblast//Planta Med. 1985. V.61. - P.150-153.

86. Costantino L., Rastelli G., Albasini A. Natural olyhydroxylated compounds as inhibitors of xanthine oxidase // Pharmazie. 1996. - V.51, №12. - P.994-995.

87. Doerk K., Witte L. Indentification of tropane alkaloids in hairy roots cultures Hyoscyamus albus II Z.Naturforsch.C. 1991. - V.46, № 7-8. - P.519-521.

88. Ermayanti T.M., McComb J.A., O'Brien P.A. Growth and swainsonine production of Swainsona galegifolia (Andr.) untransformed and transformed root cultures // Exp.Bot. 1994. - V.45, № 274. - P.633-639.

89. Estruch J., Ghriqui D. et al. The plant oncogene rol C is responsible for the release of cytokinins from glucoside conjugates // EMBO J. 1991. - V.10. -P.2889-2895.

90. Flores H.E. Roots as chemical factories // Chem. Ind. 1992. - V.10. -P.374-377.

91. Flores H.E., Curtis WR. Approaches to understanding and manipulating the biosynthetic potential of plant roots // Ann NY Acad Sci. 1992. - V.65. - P. 188209.

92. Flores H.E., Dai Y-R, Cuello J.L., Maldonado-Mendoza I.E., Loyola-Vargas V.M. Green roots: Photosynthesis and photoautotrophy in an underground plant organ//Plant Physiol. 1993. - V.101. - P.363 - 371.

93. Flores H.E., Hoy M.W., Pickard J.J. Secondary metabolites from root cultures // Trends Biotechnol. 1987. - V.5. - P.64-69.

94. Furze JM., Rhodes MJC. et al. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phyto-alexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium II Plant cell reports. 1991. - V.10. - P. 111-114.

95. Gabrielska J., Oszmianski J., Zylka R., Komorowska M. Antioxidant activity of flavones from Scutellaria baicalensis in lecithin liposomes // Z.Naturforsch. 1997. - V.52. -P.817-823.

96. Gamborg O.L. The effects of amino acids and ammonium on the growth of plant cells in suspension culture // Plant Physiol. 1970. - V.45. - P.372-375.

97. Gao D.Y., Sakurai K., Chen J.M., Ogiso T. Protection by baicalein against ascorbic acid-induced lipid peroxidation of rat liver microsomes // Research communications in molecular pathology and pharmacology. 1995. - V.90, №1. -P.103-114.

98. Gross D., Parthier B. Novel natural substances acting in plant growth regulation // J. Plant Growth Regul. 1994. - V.13. - P.93-114.

99. Gundlach H., Muller M.J., Kutchan T.M., Zenk M.N. The jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1992. - V.89. - P.2389-2393.

100. Halicka H.D., Ardelt B., Juan G., Mittelman A., Chen S., Darzynkiewicz Z. Apoptosis and cell cycle effects induced by extracts of the Chinese herbal preparation PC SPES//International journal of oncology. 1997. - V.l 1. - P.437-448.

101. Hamill J.D., Parr A.J., Robins RJ., Rhodes M.J.C. Secondary product formation by cultures of Beta vulgaris and Nicotiana rustica transformed with Agro-bacterium rhizogenes II Plant Cell Rep. 1986. - V.5. - P.111-114.

102. Hamill J.D., Parr A.J., Rhodes J.C., Robins R.J., Walton N.J. New routes to plant secondary products // Biotechnology. 1987. - V.5. - P.800-804.

103. Hilton M.G., Wilson P.D.G, Robins R.J., Rhodes M.J.C. 1988. Transformed root cultures fermentation aspects / Manipulating secondary metabolism in culture, ed. Robins R.J. and Rhodes M.J.C. - Cambridge:Cambridge University Press, 1988. -P.239-245.

104. Hoog J. Secondary metabolites in hairy roots culture of Leontopodium al-pinus Cass.(Edelweiss) // Plant cell, tissue and organ culture. 1994. - V.38, №23, - P.321-326.

105. Hussein A.A., delà Torre M.C. et al. A neo-clerodane diterpenoids from Scutellaria baicalensis II Phytochemistry 1996. - V.43. - P.835-837.

106. Jaziri M. Establishment of normal and transformed root cultures of Artemisia annua L. for artemisinin production // Plant Phisiol. 1995. - V.145, №1-2. -P.175-177.

107. Kamada H., Okamura N., Satake M., Harada H., Shimomura K. Alkaloid production by hairy root cultures in Atropa belladonna II Plant Cell Reports. -1986. V.5. -P.239-242.

108. Kim S. Hairy root growth models: Effect of different branching patterns// Biotechnol.Progr. 1995. - V.ll,№2. - P. 178-186.

109. Kimura Y., Okuda H., et al. Studies on Scutellariae Radix IX: New component inhibiting lipid peroxidation in rat liver // Planta medica. 1984. - V.51. -P.290-295.

110. Kimura Y., Okuda H., Tani T, Arichi S. Studies on Scutellariae Radix VI: Effects of flavonone compounds on lipid peroxidation in rat liver // Chem. Pharm. Bull. 1982. - V.30. - P.1792-1795.

111. Kimura Y., Okuda H., Ogita Z.S. Effects of flavonoids isolated from Scutellariae radix fibrinolytic system induced by trypsin in human umblical vein endothelial cells // Journal of natural products. 1997. - V.60. - P.598-601.

112. Knaga T. Growth and steroidal saponin production in hairy root cultures of Solanum aculeatissimum // Plant Cell Repts. 1995. - V.14,№ 7. - P.413-417.

113. Kubo M., Kimura Y., Odani T., Tani T, Namba K. 1981. Studies on Scutellariae Radix. II: The antibacterial substance // Planta medica. 1981. - V.43. -P. 194-201.

114. Kubo M., Matsuda H., Tanaca M. Studies on Scutellariae Radix. VII. Anti-arthritic and anti-inflammotory actions of methanolic extract and flavonoid compounds from Scutellariae Radix // Chem. Pharm. Bull. 1984. V.32. - P.2724.

115. Kubo M., Matsuda H., et al. Studies on Scutellariae Radix. XII. Anti-trombic actions of various flavonoids from Scutellariae Radix // Chem. Pharm. Bull. 1985. -V.33. -P.2411-2415.

116. Kutchan T.M. 12-oxo-phytodienoic acid induces accumulation of berberine bridge enzyme transcript in a manner analogous to methyl jasmonate // J.Plant Physiol. 1993. - V.142. - P.502-505.

117. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoids. Berlin-Heidelberg-New York: Springer-Verlag, 1970. - P.35-40.

118. Miao Z., Kayahara H., Tadasa K. Superoxide-scavenging and tyrozinase-inhibitory activities of the extracts of some Chinese medicines // Bioscience biotechnology and biochemistry. 1997. - V61, №12. - P.2106-2108.

119. Michaels P.J., Flores N.E. Polyacetylenes in Carthamus tinctorus "hairy root" //Plant Phisiol. 1993. - V.102, № l,Suppl. - P.48.

120. Mizukami H., Tabira Y., Ellis B.E. Methyl jasmonate-induced rosmarinic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Plant Cell Reports. 1993. - V.12. - P.706-709.

121. Morimoto S., Harioko T., Shoyama Y. Purification and characterization of flavone-specific (3-glucuronidase from callus culture of Scutellaria baicalensis Georgi. // Planta. 1995. - V.195. - P.535-540.

122. Mugner J. Establishment of new axenic hairy root lines by inoculation with Agrobacterium rhizogenes II Plant cell reports. 1988. - V.7. - P.9-12.

123. Mundan U., Hjortso M.A. Effect of light on growth and thiophene accimu-lation in transformed roots of Tagetes patula II Plant Phisiol. 1991. - V.138,№ 2.- P.252-255.

124. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol, plantarum. 1962. - V.15. - P.473-479.

125. Nakahata N., Kutsuwa M. et al. Analysis of inhibitory effects of Scutellariae Radix and baicalein on prostoglandin E-2 production in rat C6 glioma cells // American journal of chines medicine. 1998. - V.26. - P.311-324.

126. Neill SJ., Lenton JR., Wibberley M.S. Differential effects of elicitors on secondary metabolism in hairy root cultures of tobacco {Nicotiana tabacum) // Biochemical society transactions. 1994. - V.22. - P.383-388.

127. Nishikawa K., Furukawa H. et al. Flavone production in transformed root cultures of Scutellaria baicalensis Georgi. // Phytochemistry. 1999. - V.52. -P.885-890.

128. Nishikawa K., Ishimaru K. Flavonoids in root cultures of Scutellaria bai-calensisll Plant Physiol. 1997. - V.151. - P.633-636.

129. Nishioka T., Kawabata J., Aoyama Y. Baicalein, an a-glucosidase inhibitor from Scutellaria baicalensis II J.Nat.Prod. 1998. - V.61. - P.1413-1415.

130. Nuutila A.M., Toivonen L., Kauppinen V. Bioreactor studies on hairy root cultures of Catharanthus roseus: Comparison of three bioreactor types // Bio-tehnol. Techn. 1994. - V.8, №1. - P.61-66.

131. Ogure H. Chromosome variation in plant tissue culture / Biotechnology in agriculture and forestry, vol. 11. Somaclonal Variation in Crop Improvement I, by Bajaj Y.S.P. Berlin Heidelberg New York: Springer-Verlag, 1991. - P.49-75.

132. Parr A.J., Hamill J.D. Relationship between Agrobacterium rhizogenes transformed hairy roots and intact, uninfected Nicotiana plants // Phytochemistry.- 1987.-V.26.-P.3241-3245.

133. Parthier B. Jasmonates, new regulators of plant growth and development: many facts and few hypotheses on their actions // Bot. Acta. 1991. - V.104. -P.446-454.

134. Plant growth substances: principles and applications / by Richard N.Arteca.- New York: Chapman & Hall., 1995. 332 p.

135. Qualitative und quantitative flavonoid-bestimmung am beispiel Betulae folium, Crataegi folium c. Flore und weiterer flavonoid-drogen. Hagers handbuch der pharmazeutisehen praxis 5, Herausgeber folgewerk. 1995. - P.263-270.

136. Reinbothe S., Mollenhauer B., Reinbothe C. JIPs and RIPs: The regulation of plant gene expression by jasmonates in response to environmental cues andpathogens // Plant cell. 1994. - Y.6. - P.l 197-1209.

137. Rhodes M.J.C., Parr A.J., Giulietti A., Aird H. Influence of exogenous hormones on the growth and secondary metabolite formation in transformed root cultures //Plant cell, tissue and organ culture. 1994. - V.38. - P. 143-151.

138. Rhodes M.J.C., Robins R.J. et al. Regulation of secondary metabolism in transformed root cultures / Primary and secondary metabolism of plant cell cultures, ed.by Kurz. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1989. - P.58-72.

139. Ryu SH., Ahn BZ., Pack MY. The cytotoxic principle of Scutellaria Radix against L1210 Cell // Planta Medica. 1985. - V.51. - P.462.

140. Saiton T., Kamada H., Harada H. Light requirement for shoot regeneration in horseradish hairy roots //Plant Phisiol. 1992. - Y.99, № 4. - P.1336-1341.

141. Sato K., Yaamazaki T. Anthraquinone production by transformed root culture of Rubia tinebarum II Phyto chemistry. 1990, - V.30, № 5. - P.1507-1509.

142. Seo W.T., Park Y.H., Choe T.B. Identification and production of flavonoids in a cell suspension culture of Scutellaria baicalensis G. // Plant cell reports. -1993. V.6. -P.414-417.

143. Shen W., Petit A., Guern J., Tempe J. Hairy roots are more sensitive to auxin than normal roots // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V.85. - P.3417-3421.

144. Signs M.W., Flores H.E. The biosynthetic potential of plant roots // BioEssays. 1990. V.12. -P.7-13.

145. Schramm DD., German JB. Potential effects of flavonoids on the etiology of vascular disease // Journal of nutritional biochemistry. 1998. - V.9, №10. -P.560-566.

146. Shimomura K., Sudo H., Saga H., Kamada H. Shikonin production and se-cretaion by hairy root cultures of Lithospermum erythrorhizon II Plant Cell Repts. 1991. - Y.10, №6-7. - P.282-285.

147. Takagi S, Yamaki M., Inoue K. Flavone di-C-glicosides from Scutellaria baicalensis II Phytochemistry. 1981. - V.20. - P.2443-2444.

148. Tang W., Eisenbrand G. Scutellaria baicalensis Georgi. / Chinese drugs of plant origin. Berlin Heidelberg New York: Springer-Verlag, 1992. - P.919-929.

149. Wagner H., Bladt S., Zgainski E.M. Drogenanalyse, Dunnschicht chromatographische analuse von arzneidrogen. Berlin- Heidelberg-New-York: SpringerVerlag, 1983.- 304 p.

150. Weathers P.J. Artemisinin production by transformed roots of Artemisia ati-nuaH Biotechnol.Lett. 1994. - V.16,№12. - P.1281-1286.

151. Wysokinska H., Chmiel A. Transformed root cultures for biotechnology // Acta Biotechnol. 1997. - V. 17. - P. 131-159.

152. Yamamoto H., Chatani N., Kitayama Z., Tomimori T. Flavonoid production in Scutellaria baicalensis callus cultures // Plant cell tissue organ culture. 1986. -V.5. - P.219-222.

153. Yanhala L. Virulence of different Agrobacterium strains on hairy root formation of Hyoscyamus muticus II Plant Cell Repts. 1995. - V.14,№ 4. - P.236-240.

154. Yokozava T., Chen C.P., Lin Z.W. Effect of traditional Chinese prescriptions and their main crude drugs on l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical // Phytotherapy research. 1998. - V.12. - P.94-97.

155. Yonemitsu H. Production by hairy root culture of Lobelia inflata L. // Plant Cell Repts.-1995.- 9,№ 10 P.307-310.

156. Yoshino M., Ito M., Okajima H., Haneda M., Mrakami K. Role of baicalein compounds as antioxidant in the traditional herbal medicine // Biomedical research Tokyo. 1997. - V.18. - P.349-352.

157. Yoshikawa T., Furuya T. Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes II Plant Cell Repts. 1987. - V.6, №6. . P.449-453.

158. Zang Y-Y., Guo Y-Z. et al. Four flavonoids from Scutellaria baicalensis II Phytochemistry. 1994. -V.35. - P.511-514.

159. Zhou Y., Hirotani M., Yoshikawa T., Furuya T. Flavonoids and phenyletha-noids from hairy root cultures of Scutellaria baicalensis II Phytochemistry. 1997. - V.44. -P.83-87.