Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вспомогательные белки системы а- гемолизина и их влияние на биологию E.coli

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Вспомогательные белки системы а- гемолизина и их влияние на биологию E.coli"

ол

На правах рукописи

Петибская Елена Анатольевна

Вспомогательные белки системы а- гемолизина и их влияние на биологию Е.соИ

03.00.07-микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону - 1997

Работа выполнена в Кубанской государственной медицинской академии

Научный руководитель: заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор А.И.Коротяев.

Научный консультант: кандидат медицииских наук М.Ш.Манувахова.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Васильева Л.И. Доктор медицинских наук, профессор Мишанькин Б.Н.

Ведущая организация Институт Биохимии и Физиолога Микроорганизмов РАН

На заседании диссертационного совета Д084.53.01 при Ростовско! государственном медицинском университете ( 344022, г. Ростов-на-Дон} Нахичеванский пер., 29)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Ростовског государственного медицинского университета

Защита состоится

1997 г. в Ю час.

Автореферат разослан «

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Н.Я. Корганов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Многие патогенные штаммы E.coli обладают способностью вызывать гемолиз эритроцитов животных и человека. Эта способность связана с секрецией мембраноповреждающего токсина - а-гемолизина. Он является наиболее интенсивно изучаемым белком, так как часто бывает причиной воспалительно-дегенеративных заболеваний.

Важность исследования а-гемолизина связана с тем, что он - один из немногих белковых продуктов кишечной палочки, способных секретироваться в среду, минуя периплазматическое пространство.

Исследование механизмов секреции а-гемолизина отстает от интенсивно изучаемых эукариотических систем транспорта белков, поэтому изучение функций вспомогательных белков является актуальной задачей решения фундаментальных проблем секреции белков. Понимание механизма секреции белков в среду и создание генно-инженерных систем транспорта имеет не только общебиологическую значимость, но и способствует развитию биотехнологии и промышленной микробиологии.

Использование генов вспомогательных белков, направляющих транспорт секрстируемых продуктов, минуя периплазматическое пространство, возможно приведет к созданию технологически перспективной векторной системы E.coli, аналогичной системе экспрессии-секреции граммположительных бактерий.

Успех создания высокоактивных штаммов суперпродуцентов белковых продуктов клонированных генов во многом зависит от уровня изучения влияния рекомбинантных плазмид на биологические свойства клеток-носителей. Выяснение механизма воздействия плазмид гемолиза и плазмид, несущих гены вспомогательных белков, будет иметь значение не только для изучения

регуляции факторов патогенности, изыскания методов борьбы с токсинами, но и для культивирования штаммов-продуцентов различных белков.

В настоящее время известно, что транспортный белок Н1уВ, образующий канал в клеточной стенке для выведения а-гемолизина, имеет высокую степень гомологии с Р-гликопротеином - белком мембран опухолевых клеток, отвечающим за выведение химиопрепаратов и антибиотиков из раковых клеток. Следовательно, изучение организации и функционирования Н1уВ позволит подойти к решению некоторых задач в проблеме резистентности опухолей к химиопрепаратам.

Цель II основные задачи

Целью настоящей работы явилось определение роли вспомогательных белков системы а-гемолизина в его секреции и влияние их на физиологические параметры и другие функции клетки.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- клонирование области генов, ответственных за секрецию токсина в

среду, в различных векторах с эффективной системой экспрессии генов;

- определение влияния рекомбинантных плазмид, содержащих ЫуВ и ЫуО-гены, на ростовые характеристики клетки-хозяина и клеточный цикл бактерий;

- выявление влияния плазмид, содержащих гены, ответственные за транспорт токсина, на устойчивость клеток-хозяев к антибиотикам и противоопухолевым препаратам;

- использование системы, несущей вспомогательные белки а-гемолизина, для тестирования противоопухолевых препаратов, способных преодолевать барьер химиорезистентности;

- изучение секреции а-гемолизина в Ьоп-мупшгах Е.соН.

Научная новизна и теоретическая значимость:

- с помощью методов генной инженерии сконструированы плазмиды с генами вспомогательных белков а-гемолизина, проведено картирование полученных рекомбинантных молекул.

- впервые установлена зависимость уровня экспресин ЫуВ и ЫуО от ориентации проклонированного Е^Щ-фрагмента относитгельно 1ас2-промотора;

- впервые выявлена способность плазмид, несущих гены ЫуВ и ЫуО, удлинять продолжительность лаг-фазы и уменьшать суммарное содержание ДНК в клетках Е.соИ;

- обнаружена повышенная чувствительность штаммов Е.соК, несущих гемолитические плазмиды, к канамицину, стрептомицину и сизомицину;

- выявлено новое свойство плазмид, несущих гены ЫуВ и ЫуО увеличивать резистентность штаммов Е.соН к канамицину, стрептомицину, сизомицину и противоопухолевым препаратам;

- впервые установлено функциональное сходство между Н1уВ-белком и Р-гликопротеином - мембранным белком опухолевых клеток, ответственным за множественную лекарственную устойчивость;

предложен новый микробиологический способ тестирования противоопухолевых веществ, способных преодолевать барьер химиорезистентности;

- изучена секреция гемолизина в Ьоп-мутантах и установлена связь секреции токсина ¿делением клетки.

Практическое значение работы:

предложен микробиологический способ тестирования

химиопрепаратов, способных воздействовать на химиорезистентную опухолевую клетку.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. В рскомбинаитных плазмидах рМ5, рМ8, рМ13 проклонированы ЫуВ и ЫуО-гены, ответственные за транспорт а-гемолизина за пределы бактериальной клетки.

2. Плазмида рМПДЯ, имеющая делецию НикИП-фрагмента, содержит ген ЫуВ транспортной системы а-гемолизина.

4. Разный уровень гемолитической активности полученных плазмид связан с неодинаковой экспрессией генов ЫуВ и ЫуО, причиной которой является разная ориентация фрагмента, содержащего исследуемые гены относительно 1ас7.-промогора.

5. Ген ЫуЭ регулирует экспрессию генов в плазмидах и влияет на уровень белкового синтеза на исследуемых матрицах.

6. Плазмиды рМ5, рМ13, рМ13ЛЛ влияют на физиологические процессы, протекающие в клетках Е.соН. Они удлиняют продолжительность лаг-фазы и снижают содержание суммарной клеточной ДНК.

7. Способность плазмиды, содержащей ген ЫуЦ, увеличивать устойчивость клеток Е.соН к противоопухолевым антибиогикам отражает функциональное сходство между Н1уВ белком и Р-гликопротеином - белком мембран опухолевых клеток.

Апробация диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены н представлены на студенческих конференциях Дня науки Кубанского медицинского института им. Красной Армии ( г. Краснодар, 1989, 1991, 1992). Основные результаты диссертации изложены в трех научных публикациях. По материалам диссертации получено два патента. Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедры микробиологии, иммунологии, вирусологии, кафедры клинической иммунологии и лабораторного дела ФППВ, Центральной научно-исследовательской лаборатории Кубанской Государственной Медицинской

Академии, кафедры генетики и микробиологии Кубанского Государственного Университета 17 апреля 1997 года.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, двенадцати глав результатов собственных исследований, общего заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 248 работ, из них 21 отечественных и 227 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 34 рисунками и 9 таблицами.

Научное сотрудничество по созданию бесклеточной системы транскрипции-трансляции на основе экстракта БЗО осуществлялось с лабораторией биосинтеза белка Института Биосинтеза Белка в г. Пущино-на-Оке. Научное сотрудничество по созданию рекомбинантных плазмид осуществлялось с лабораторией генетической инженерии Северокавказского Научно-Исследовательского Института Животноводства, г. Краснодар. Организации работы и методики исследования В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: Е.соШН1, Е.соННВ101, Е.соН с!е§', Е.соН (1её+, Е.соИ802, Е.соПСбОО, Е.соНМКЕбОО, которые выращивали на следующих средах: мясо-пептонном бульоне, мясо-пегггонном агаре, Е-бульоне, среде М-9, бульоне Дифко, АзБ-агаре. При конструировании рекомбинантных клонов применялись следующие векторы: рАСУС184, рЕ1С18, риС 19. Определение чувствительности клеток-штаммов к антибиотикам и противоопухолевым препаратам проводили методом серийных разведений.

Выделение ДНК осуществляли модифицированным методом щелочного лизиса, при получении высокоочищенной ДНК для клонирования и тестирования в бесклеточной системе транскрипции-трансляции использовали очистку ДНК в градиенте СвС!.

Для введения ДНК в клетки штаммов E.coli применяли метод трансформации по способу Cosloy и Oishi, а также метод конъюгации по стандартной схеме Watanabe-Fukasama.

При клонировании генов вспомогательных белков использовали рестрикционно-лигазный метод. Рестрикцию проводили следующими рестриктазами - В gin, HindtD, Pstl, BamHI, EcoRY, Sali, Xhol. Перечисленные рестриктазы применяли как в одиночных, так и в совместных гидролизатах, в буферах специфичных для каждой рестриктазы. Молекулярный вес плазмид и их фрагментов, полученных при рестрикции ферментами, определяли с помощью электорофореза в 0,7 - 1,2% геле. При получении рекомбинантных плазмид сшивание фрагментов проводили полинуклеотидлигазой фага Т4.

Для определения гемолитической активности штаммов, содержащих гемолитические плазмиды, использ^. ¿.ли методику K.Kanclcrsky - R.Mollby, основанную на измерении клеточной плотности эритроцитов.

Визуализацию белковых продуктов проклонированных генов проводили в градиентном (10-25%) полиакриламидном геле. При проведении электрофореза белков, содержащих радиакгивную метку, гели дополшггельно обрабатывали в растворе Amplify.

С целью и анализа и идентификации белковых продуктов проклонированных" генов нами была использована бесклеточная система транскрипции-трансляции на основе экстракта S30. Эга методика, основанная на полученном из экстракта S30, PI00 компоненте позволила также оценить кинетику включения С14-лейцина в полипептиды, кодируемые рекомбинаптными плазмидами.

При исследовании влияния плазмид, содержащих гены вспомогательных белков а-гемолизина, на физиологические параметры клетки-хозяина

синхронизацию культур Е.соП вели путем сочетания голода по источнику питания и холодового шока. Содержание нуклеиновых кислот в клетках определяли по методу Шмидта-Таннхаузера в модификации А.И. Коротяева и Т.П. Кроличенко. Определение общего белка 1гроводили по методу Лоури.

Для изучения секреции ос-гемолизина в 1оп-мутантах Е.соИ индукцию мутации проводили с использованием ультрафиолетового источника в 0,1М растворе Г^БС^. Затем культуры инкубировали при температуре 42°С, а контроль индукции мутации проводили микроскопически, оценивая её по появлению длинных, нитевидных клеток Е.соИ с несформированными клеточными перегородками. Измерение гемолитической активности осуществляли по методу К. Капскгеку-К. Мо11Ьу.

Результаты исследования

Методами молекулярного клошгрования нами были получены ряд плазмид, содержащих гены ЫуВ и ЫуО. Для конструирования рекомбинаитных плазмид была использована плазмида р1Ш1, содержащая целый гемолитический оперон внутри 8а11-фрагмента, встроенного в вектор рВЯ325.

С помощью анализа нуклеотидной последовательности родственной гемолитической плазмиды рН1у152, а также по результатам рестрикиионного кар-пфования плазмиды р!Ю1, установили, что область генов, ответственная за экспорт токсина, расположена внутри BglП-фpaгмeнтa, размером 5,33 кЬ (рис.1).

Этот фрагмент был клонирован по ВашНГ сайту в вектор рАСУС184. В результате чего была получена плазмида рМ5, имеющая молекулярный вес 9,33 кЬ и обладающая резистентностью к хлорамфениколу. Две другие плазмиды были сконструированы на основе векторов риС18 и риС19, причем считывание генов транспортной системы а-гемолизина в плазмиде рМ8 шло в направлении

от ЫуО-гсна к ЫуВ-гену, в плазмиде рМ13 считывание генов происходило в направлении от ЫуВ-гена к ЫуО-гену (рис.2,3).

Для получении плазмиды рМ13ДЯ с отдельным геном ЫуО плазмиду рМ13 подвергали рестрикции Нтс1ГП- рестриктазой (рис.4).

Оценку результатов клонирования области, содержащей гены вспомогательных белков, проводили с помощью комплементационного теста. Для этой цели использовали штаммы Е.соГОН1, Е.соННВ101, имеющие мутации по гену гесА. Отсутствие ферментов, участвующих в репарации и рекомбинации комплементарных цепей ДНК в этом штамме, делала возможным сосуществование двух плазмид в автономном состоянии и проведение комплементационного анализа.

Оценку результатов клонирования области, содержащей гены вспомогательных белков, проводили с помощью комплементационного теста. Для этой цели использовали штаммы Е.соШШ, Е.соННВ101, имеющие мутации по гену гесА. Отсутствие ферментов , участвующих в репарации и рекомбинации комплементарных цепей ДНК, делает возможным сосуществование двух плазмид в автономном состоянии и проведение комплементационного анализа.

Сконструированные плазмиды рМ5, рМ13, рМ13ДК, рМ8 вводили методом трансформации в штамм Е.соННВ101, содержащий плазмиду ЕЖ 32, имеющую инактивированные Тп5 гены ЫуВ и ЫуО. Параллелью, методом конъюгации, плазмиду £N132 вводили в штаммы Е.соШШ, содержащие рекомбинантные плазмиды рМ5, рМ8, рМ13, рМ13ДК.

Отбор комплементарных клонов вели на кровяном агаре в присутствии антибиотиков Ар и Км в концентрации 50 мкг/мл в случае комплементации с рМ13, рМ8, рМ13ДЯ и Ст и Кш в концентрации 50 мкг/мл - срМ5.

EcoRI

Рис. 1. Плазмида pRDl.

Рис.2. Генетическая карта плазмиды рМ8

Рис.3.

Генетическая карта плазмиды рМ13

Hindin

Рис.4. Генетическая карта плазм иды НшёЩ-фрагмента в гене hlyD

рМ13ДК с делецией

Контроль автономности плазмид осуществляли гель-электрофорезом ДНК, выделенной из полученных комплементарных штаммов. При определении гемолитической активности установили, что уровень внеклеточной гемолитической активности после комплементации с плазмидой £N132 выше у плазмид рМ5 и рМ13, а внеклеточная гемолитическая активность отсутствовала у штамма, содержащего плазмиды ЕШ32 и рМ13А11 с делетированным ЫуО-геном. Последнее свидетельствует о нарушении секреции а-гемолизина у мутанта по ЫуО-гену ( таблица 1).

Отличие в уровне гемолитической активности плазмид рМ8 и рМ13 после комплементации с ЕЙ 132 отражает разную экспрессию генов, зависящую от ориентации фрагмента Е^111. Неодинаковая экспрессия генов возможно связана с усилением в случае клона рМ13 или ослаблением в рМ8, собственных промоторов генов ЫуВ и ЫуГ).

Таблица 1.

Гемолитическая активность комплементарных клонов

Штаммы Внеклеточная гемолитическая активность (hu/ш!)

E.coliDHl /рМ5, ENI32/ 48,13± 3,7 '

E.coliDHl /рМ8, ENI32/ 30,3± 4,2

E.coliDHl/pM13, EN132/ 56,2± 5,4

E.coliDHl/pM13AR, ENI 32/ 0

Анализ белковых продуктов, клонированных в векторах рАСУС184, pUC 18, pUC19 генов hlyB и hlyD, а также определение уровня их экспрессии проводили в бесклеточной системе транскрипции-трансляции in vitro на основе экстракта S30.

С помощью электорфореза в градиентном полиакриламидном геле были обнаружены белковые продукты массой 46 и 70 кД. Они относятся к продуктам гена hlyB. Анализ и идентификация белковых продуктов были затруднены в

связи с низкой экспрессией соответствующих генов, находящихся под собственными промоторами. При сравнении уровня экспрессии генов ЫуВ, ЫуО в сконструированных плазмидах рМ5, рМ8, рМ13, рМ13ДЯ, определяли кинетику включения С14- лейцина в полипептиды, синтезируемые на изучаемых матрицах. При внесении матрицы рМ5 в бесклеточную систему включение радиактивности в белок на 10 минуте составляет - 13174 им/мин, на 20 минуте -21200 имп/мин, на 30 мин - 23840 имп/мин, на 40 мин - 23114 имп/мин, на 60 мин - 12200 имп/мин. Матрица рМ8 дает следующие значения включения радиактивности в белок на 10 мин - 15578 имп/мин, на 20 мин- 23400 имп/мин, на 30 мин - 23400 имп/мин, на 40 мин - 23442 имп/мин, на 60 мин - 12200 имп/мин, при использовании матрицы рМ13 включение радиактивности в белок на 10 минуте составляет - 19552 имп/мин, на 20 мин - 27628 имп/мин, на 30 мин - 27594 имп/мин, на 40 мин - 26000 имп/мин, на 60 мин -22000 имп/мин. При синтезе белка на матрице рМ13ДИ. включение радиактивности в белок на 10 мин - 5972 имп/мин, на 20 мин - 6100 имп/мин, на 30 мин - 6420 имп/ мин, на 40 мин - 6432 имп/мин, на 60 мин - 4720 имп/мин.

Стабильное включение С14"лейцина в белки, кодируемые плазмидами рМ5, рМ8, рМ13, рМ13Л11, наблюдается в течение 20-40 мин с начала синтеза. Максимальное включение метки в белки, экспрессирусмые матрицами рМ8, рМ13 приходится на 30 мин с начала синтеза.

При использовании плазмиды рМИДЯ, имеющей делеции по гену ЫуО, отмечается низкий уровень включения метки в синтезируемые белки.

Это свидетельствует о регулирующей роли гена ЫуВ на общий уровень экспрессии генов, находящихся на плазмиде.

Различная ориентация фрагмента В^П, содержащего гены ЫуВ и ЫуЭ в плазмидах рМ8 и рМ13, незначительно влияет на включение С14-лейцина в полипегггиды, кодируемые плазмидами рМ13, рМ8. Матрица рМ13

1 5 ■

обеспечивает повышенный уровень включения радиактивности в общий белок по сравнению с рМ8.

Определение влияния рекомбинантных плазмид на физиологические параметры клетки-хозяина показало, что плазмиды, содержащие гены вспомогательных белков, увеличивают продолжительность лаг-фазы и снижают содержание ДНК в клетке при неизмененном соотношении РНК/ДНК. Плазмида рМ5 увеличивает продолжительность лаг-фазы на 10 мин, плазмиды рМ13 и рМ13AR - на 15 мин по сравнению с контрольными векторами. Содержание ДНК в клетках в присутствии плазмиды рМ5 в 1,7 раз меньше, чем в контрольном штамме. При наличии в клетках плазмид рМ13 и pM13AR количество ДНК уменьшается в 1,4 и 1,2 раза соответственно. Эти данные свидетельствуют о вмешательстве плазмид в клеточный цикл на этапе сопряжения репликации хромосомы и деления клетки (табл. 2,3).

Для изучения влияния деления клетки на процесс секреции токсина, а также возможности использования штаммов, имеющих мутации в гене Ion в качестве реципиентов генно-инженерных конструкции на основе генов вспомогательных белков, использовали штамм E.colideg", содержащий гемолитическую плазмиду pRDl. Исследование гемолитической активности этого штамма при индукции мутации Ion показало, что внеклеточная гемолитическая активность в 4-5 раз меньше, чем у контрольного, а внутриклеточная гемолитическая активность в 3-4 раза превышала контрольную.

Накопление внутриклеточного гемолизина отражает низкую скорость деградации белковых продуктов в штаммах-мутантах по гену Ion, что сопровождается повышением общего белка, измеренного по методу Лоури (табл.4). Снижение уровня внеклеточной гемолитической активности

свидетельствует о сопряженности процесса формирования клеточной перегородки, а значит и процесса деления клетки с секрецией токсина в среду.

Таблица 2.

Влияние плазмид на продолжительность лаг-фазы н удельную скорость роста Е.соШ)Н1

Плазмиды Размеры (кЬ) Продолжительность лаг-фазы (мин) Удельная скорость( ч"1)

рАСУС184 4,0 40 1,27

рМ5 9,55 50 1,23

р11С 19 2,7 50 1,28

рМ13ЛЯ 5,5 65 1,24

рМ13 7,03 65 1,21

Без плазмиды - 45 1,25

Таблица 3.

Содержание суммарной ДНК о клетках Е.соШШ1, несущих плазмиды с генами вспомогательных белков а-гемолизина

Плазм и да Содержание ДНК в клетке ( х 10"15) РНК/ДНК

Без плазмцды 33,8±3,6 5,9±0,8

рАСУС184 36,2±4,2 6,1 ±0,5

рМ5 19,6±5,5 5,8±0,7

р11С 19 27,1±3,2 6,4±0,4

рМ13 19,0±2,5 6,9±0,2

рМ13Д11 21,5±3,0 5,3±0,8

Таблица 4.

Гемолитическая активность штаммов E.colideg+, E.colideg'

Штамм E.coli deg-/pRDl с 1оп+-фенотипом E.coli deg-/pRDl контроль E.coli deg+/pRDl контроль

Гемолитическая активность (hu/ml) 1 час 3 Часа Время 1 час 3 часа 1 час 3 часа

Внеклеточная Внутриклеточная Белок по Лоури % нитевидных клеток 0 3,4 9,3 26,2 53 мг/мл 10 мг/мл 68% 91,3% 4,0 15 2,1 8 40 мг/мл 58мг/мл 7% 18% 5,3 17,3 3,0 8,8 32мг/мл 51 мг/мл 7,3% 7,5%

Помимо влияния плазмид, содержащих вспомогательные белки системы а-гемолизина на физиологические параметры клетки хозяина, было изучено также влияние плазмид, содержащих целый гемолитический оперон и гены вспомогательных белков на чувствительность клеток-хозяев к антибиотикам - стрептомицину, канамицину, сизомицину, хлорамфениколу, тетрациклину,- полимиксину в концентациях от 0,4 до 3 мкг/мл. Штаммы кишечной палочки, несущие цельную плазмиду гемолиза, обладали большей чувствительностью к антибиотикам - стрептомицину, канамицину, сизомицину. Причем уровень этой чувствительности коррелировал с уровнем внеклеточной гемолитической активности, так как плазмида р!Ш1, обеспечивающая более высокую гемолитическую активность по сравнению с рН1у212, придавала клеткам-хозяевам меньшую устойчивость к указанным антибиотикам.

Штаммы Е.соГОН1/рШЭ1, Е.соЮН1/рН1у212 обладали повышенной чувствительностью к антибиотикам: канамицину, стрептомицину, сизомицину,

по сравнению с контрольными штаммами Е.соШН1/рВ11325 и Е.соГОШ. Причем нггамм Е.со1ЮН1/рН1у212, имеющий низкий уровень секреции а-гемолизина, был менее чувствителен к соответствующим антибиотикам. Так при концентрации стрептомицина 0,4;0,8;1,5;3,0 мкг/мл количество выживщих клеток штамма Е.соЮН1/р1Ш1 составило - 8,1x10"; 1х104; 7x10'; 5x10°; Е.соШН 1 /рНЬу212 - 3,2х105;' 5,6x10"; 2,7x10'; 3,4x10'; Е.со1ЮН1/рВ1Ш5 -4,1х10б; 8x105; 6,2x10"; 5,5х102; Е.соШШ - 8,0х105; 2х105; 9,3x10'; 4,3х102; соответственно.

При выращивании штаммов в присутствии канамицина в концентрациях 0,4, 0,8,1,5, 3,0 мкг/мл количество выживших клеток Е.соИОШ/р!Ш1 равнялось - 6,2x10"; 9,4x10'; 3x10°; 3x10°; Е.соШН1/рН1у212 - 1х105; 7x10'; 4х102; 7,8x10'; Е.соЮН1/рВ11325 - 6,8х106; 6,5х10б; 1х106; 9,7х105; Е.соШШ- 1х106; 9,8х1059,7х105; 9,4х105, соответственно.

При добавлении сизомицина в концешрациях - 0,4; 0,8; 1,5; 3,0 мкг/мл количество выживших клеток Е.соШН1/р!Ш1 составило 1,2x106, 1x10", 2,4 х 10'; 1x102; Е.соГОН 1 /рН1у212 - 1,3х106; 2х105; 9,7x10'; 9,5x10'; Е.со1ЮН1/рВЮ25 - 3,3x10й; 3,1х106;3,5х10б; 5,4х105; Е.соШШ - 8,7х10б; 5х106; соответственно.

Заметной разницы в количестве выживших клеток гемолитических штаммов по сравнению с контрольными в присутствии тетрациклина, хлорамфеникола, полимиксина не наблюдалось.

Для исключения влияние клеток-хозяев на чувствительность к антибиотикам, гемолитические плазмиды р!Ш1, рН1у212 были введены методом трансформации в штаммы Е.соИС90, Е.соИ802. Заметной разницы в чувствительности к исследуемым антибиотикам мы не отмечали. Что свидетельствует о том, что повышенная чувствительность клеток Е.соН к

антибиотикам: стрептомицину, канамицину, сизомицину объясняется присутствием в них гемолитических плазмид.

Для определения природы гиперчувствителыюсти гемолитических штаммов Е.соИ к антибиотикам и с целью установления факта влияния вспомогательных белков системы а-гемолизина на чувствительность штамма-хозяина к стрептомицину, " канамицину, сизомицину, тетрациклину, хлорамфениколу, полимиксину в концентрации от 0,4 до 3,0 мкг/мл, определяли количество выживших клеток штаммов Е.соГОН1/рМ8, Е.соШН1/рМ5, Е.соШН1/рМ13. В присутствии канамицина в концентрации от 0,4 до 3 мкг/мл. количество выживших клеток штамма составляло Е.соГОН1/рМ5 - 9,5x105; 1х105; 8хЮ3; 9,4х102; Е.соИ ОН1/рМ13 - 9,2х105; 1,3x10"; 4,7x103; 8,2х102; Е.соШН1/рМ8 - 2х10б; 3,2х105; 8,2хЮ4; ЗхЮ3; Е.соИ ОН1/рМ5ДЯ - 8,9x10"; 1,2х103; 8x10'; 7,8x10'; Е.соИОН1/рАСУС184 - 1,1х105; 1,Зх103; 4x102; 7,ЗхЮ1; Е.соИ ОН1/р11С19 - 7,5x10"; 7,2х102;6,9х10|; 2,8x10'; Е.соИ ОН 1/рис 18 - 3,6х105; 8х103; Е.соИОН1/рМ13ДК - 4,4х104; 2,ЗхЮ3; 9,7x10'; 6,4x10'; Е.соПОН1/РиС18 - 6,8х104; 2х104; 1,ЗхЮ3; 2,8х102; Е.соИ ОН1/РиС18 - 6х103; 4,4хЮ3; 7,5х103; 8,4x10'; Е.соИ ОН1/риС19 - 4,6х104; 2,ЗхЮ3; ЗхЮ2; 5,1x10' кл/мл, соответственно. При выращивании штаммов в присутствии сизомицина количество клеток штамма Е.соИОН1/рМ5 - 1хЮ3; 2,8х104; 5,1хЮ3; 8,6х102; Е.соИОН1/рМ13 составляло 4х105; 3,8х105; 5,1хЮ4; 6,5хЮ3; Е.соИОН1/рМ8 - 8,6х105; 6,ЗхЮ4; 2,ЗхЮ3; 1х103; Е.соГОН1/рМ513Д11 -1хЮ5; 7x103; 8x10'; Е.соИОН1/рАСУС184 - 5,3x10'; 9,2х102; 5x10'; 2x10'; Е.соШН1/риС18 - 1,5хЮ4; 2,ЗхЮ3; 9x10'; 5,5x10'; Е.со1ЮН1/риС19 - 2,ЗхЮ4; 7хЮ3; 4хЮ2; ЗхЮ' кл/мл. При добавлении хлорамфеникола в концентрации от 0,4 до 3,0 мкг/мл количество выживших клеток штамма Е.соИОН1/рМ13 равнялось - 1хЮ5; 1,1хЮ4; З,2х103; 4,7х102; 9x10°; Е.соИОШ/рМПДЯ - 2,ЗхЮ4; 4x103; 4,1x10'; 9x10°; Е.соИОН1/риС19 - З,9х103; 5х102; 6x10'; 2x10° кл/мл.

Присутствие в клетках генов ЫуВ и ЫуБ приводило к повышению устойчивости штаммов к антибиотикам: канамицину, стрептомицину, сизомицину. Штамм Е.соИ, содержащий плазмиду рМ13ЛК, с делегированным ЫуЦ геном, не обладал способностью повышать устойчивость клеток к указанным антибиотикам, так как количество выживших клеток этого штаммы в присутствии канамицина,' сизомицина, стрептомицина, равнялось соответствующему контрольному штамму ЕхоШН1/р11С19. Основываясь на вышеприведенных данных, можно сделать вывод, что присутствие в клетках Е.соИ плазмид, несущих гены ЫуВ и ЫуБ, способствует повышению устойчивости к аминогликозидным антибиотикам и хлорамфениколу. Делеция гена ЫуЭ приводит к потере резистентности к вышеназванным антибиотикам.

Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенная чувствительность штаммов Е.соИ, содержащих целый гемолитический оперон объясняется не присутствием в мембране белков Н1уВ и МуЭ, образующих канал для прохождения а-гемолизина через клеточную стенку, а особенностью самого процесса секреции токсина, который сопровождается повышением проницаемости клеточной стенки к указанным антибиотикам.

Устойчивость клеток Е.соЬ, содержащих гены ЫуВ и МуЕ>, к антибиотикам: сизомицину, канамицину, стрептомицину, хлорамфениколу можно объяснить особенностью функционирования белка Н!уВ, который помимо секреции а-гемолизина выводит антибиотики за пределы клетки в окру.кающую среду. Если образуемый белками Н1уВ и Н1уО канал занят проходящим токсином, то штамм Е.соИ теряет устойчивость к антибиотикам.

Делеция гена ЫуБ также вызывает потерю устойчивости к изучаемым препаратам, что свидетельствует о том, что оба белка Н1уВ и Шуи формируют единый канал, через который происходит выведение антибиотиков в окружающую среду. Как известно, Н1уВ-белок имеет высокую степень

гомологии с Р-гликопротеином, белком мембран опухолевых клеток, который, работая как энергетический насос, способствует выведению химиопрепаратов из опухолевых клеток, тем самым создавая устойчивость к медикаментозному воздействию.

Установленная нами способность плазмиды, содержащей МуВ-белок, способствовать устойчивости ' к аминогликозидным антибиотикам и хлорамфениколу, позволила предположить, что помимо структурного подобия Н1уВ-белок и Р-гликопротеин обладают и функциональным сходством.

С целью проверки этой гипотезы была определена чуствителышсть штамма Е.соГОН1/рМ5 к противоопухолевым препаратам - карминомицину в концентрации 500 мкг/мл, рубомицину ( 500 мкг/мл), фармрубицину (5 мг/мл). Штамм Е.со1ЮН1/рМ5 обладал повышенной устойчивостью к этим антибиотикам. Так количество выросших колоний штамма Е.соЮН1/рМ5 в присутствии рубомицина равнялось 1,2x104, при инкубации с карминомицином 9,1х104, с фармрубицином - З,0х103. Количество выросших колоний контрольного штамма Е.соШШ/ рАСУС184 равнялось - 1,4 х103 при инкубации с рубомицином, 1,3x102 - с карминомицином, 2,1х102 - с фармрубицином. По сравнению с контролем уровень устойчивости штамма Е.соНГ)Н1/рМ5 к рубомицину возрастал в 8,6 раз, к карминомицину - в 700 раз, фармрубицину -14,3 раз.

Эти данные свидетельствуют о том, что штамм Е.соН/рМ5 обладает устойчивостью к противоопухолевым препаратам и является моделью хнмиорезистентной опухолевой клетки, поэтому может использоваться для поиска лекарственных средств, способных преодолевать барьер химиорезистентности опухолевой клетки.

Апробация способа тестирования этих веществ была проведена нами и включала в себя определение чувствительности штамма Е.соГОН1/рМ5 к

рубомицину, карминомицину, фармрубицину в присутствии растворов всрапамила в концентрации 5мг/мл и электролизного серебра в концентрации 1мкг/мл. При совместной инкубации отмечалось снижение устойчивости клеток штамма Е.соГОН1/рМ5 к противоопухолевым препаратам, что свидетельствует о том, что верапамил и электролизное серебро способствуют преодолению химиорезистентности противоопухолевой клетки, а штамм Е.соШН1/рМ5 может использоваться в качестве тест-системы при поиске новых веществ, способных преодолевать устойчивость опухолевых клеток к химиопрспаратам. (таблица 5).

Таблица 5.

Выживаемость штамма Е.соПШП/рМ5 в присутствии противоопухолевых антибиотиков и препаратов - всрапамила и электролизного серебра

Антибиотик Е.соШН1/рМ5 + верапамил мг/мл (кл/мл) Е.соИ ОН1/рМ5 + эл.серебро 1мкг/мл (кл/мл) Е.соИ БН1/рМ5 (кл/мл)

Фармрубицин, 5 мг/мл 4x102 1,2x103 3x104

Рубомицин, 500 мкг/мл 5,2хЮ3 1,2x103 3x10''

Карминомицин, 500 мкг/мл 4x102 3,4х102 7,1x10"

Выводы

1. Сконструировашше плазмиды рМ5, рМ8, рМ13 содержат гены ЫуВ и ЫуО, способствующие секреции а-гемолизина в окружающую среду, плазмида рМ13ДЯ имеет делецию гена ЫуО и содержит только ген ЫуВ.

2. Полученные клоны плазмид комплементируют с плазмидой £N132 и обладают функциональной активностью.

3. Выявленные в бесклеточной системе транскрипции-трансляции на основе S30 экстракта E.coli полипептиды 46кД и 70кД соответствуют продуктам гена hlyB, продукты гена hlyD не выявлены.

3. Установлена регулирующая роль гена hlyD в экспрессии плазмидных генов и синтезе пептидов.

4. Впервые изучено влияние плазмид, содержащих гены hlyB и hlyD на физиологические параметры клетки-хозяина. Установлено что плазмиды рМ5, рМ13, pM13AR удлиняют продолжш-елыюсть лаг-фазы и снижают содержание суммарной клеточной ДНК в клетке.

5. При изучении секреции а-гемолизина в Ion-мутантах E.coli установлена сопряженность процесса секреции токсина с делением клетки и формированием осевого стержня перегородки.

6. Установлена повышенная чувствительности штамма E.coliDHl, несущего плазмиды pRDl и рН1у212 к антибиотикам: стрептомицину, канамицину, хлорамфениколу. Уровень чувствительности коррелирует с уровнем секреции токсина в среду. У штамма E.coliDHl, содержащего плазмиду pRDl, обеспечивающую более высокую гемолитическую активность, отмечается меньшая устойчивость к антибиотикам, чем у штамма E.coIiDHl/pHly2I2, имеющего небольшую гемолитическуцю активность.

7. Плазмиды рМ5, рМ13, рМ8, содержащие гены вспомогательных белков системы а-гемолизина, способствуют повышению устойчивости штамма к антибиотикам: стрептомицину, канамицину, хлорамфениколу. Наличие плазмиды pMI3AR, имеющей делецто в гене hlyD, приводит к уменьшению резистентности к указанным антибиотикам, по сравнению с плазмидами рМ5, рМ8, рМ13.

8. Установлено, что повышенная чувствительность гемолитических штаммов E.coliDHl/pRDl, E.coiiDHI/pHly212 связана с особенностями самого

процесса секреции, а не с наличием в мембране вспомогательных белков системы а-гемолизина.

в. Впервые установлено функциональное сходство белка HlyB и Р-гликопротсина - белка мембран опухолевых клеток, проявляющееся в обеспечении резистентности штамма E.coliDHl/pM5 к противоопухолевым антибиотикам: карминомицину.рубомицину, фармрубицину.

•2. Показано, что сконструированный нами штамм Е.соЮН1/рМ5 является моделью химиорсзистентной клетки и может использоваться для поиска веществ, способных оказывать воздействие на химиорезистентные клетки.

II. Установлено, что растворы верапамила (5 мг/мл) и электролизного серебра (1 мкг/мл) снижают устойчивость штамма E.coliDHl/pM5 к противоопухолевым препаратам: фармрубицину, карминомицину, рубомицину.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Устойчивость к противоопухолевым препаратам, обеспечиваемая плазмидой, содержащей гены ЫуВ и hlyD. ( Манувахова М.Ш., Сумкина М.Ю., Захарова М.В.). - II Депонирована в ВИНИТИ,- 24.11.1994 г.- № 2704-В94.С. 1-8.

2. Микробиологический способ тестирования противоопухолевых лекарственных средств. ( Манувахова М.Ш., Татлок М.С.). - // Указатель депонируемых рукописей по медицине и здравохраненшо. - 1996. - Д - 25.174. С. 1-7.

3.Секреция а-гемолизина в Lon-мутантах E.coli. ( Манувахова М.Ш., Кроличенко Т.П., Егорова C.B.). - // Указатель депонированных рукописей по медицине и здравохранению,- 1996 г. - Д - 25.267. С. 1-12.

4.Способ определения устойчивости живой клетки к противоопухолевому антибиотику. ( Манувахова М. Ш., Захарова М.В.).- // Патент № 2062789. - 1996 г.С.1-7.

5. Способ подавления микрофлоры . ( Авакимян С.Б., Лопунова Ж.К., Манувахова М.Ш.).- // Патент № 2053773,- 1996 г. С.1-8.