Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ гемолизинов холерных вибрионов с помощью монослойных перевиваемых клеточных культур и моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ гемолизинов холерных вибрионов с помощью монослойных перевиваемых клеточных культур и моноклональных антител"

РГБ ОД

На правах рукописи

ТЕЛЕСМАНИЧ Наталья Робертовна

АНАЛИЗ ГЕМОЛИЗИНОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ С ПОМОЩЬЮ МОНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.7 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д. м. н. профессор Ю. М. Ломов,

д. б. н. с. н. с. Л. П. Алексеева

Ростов-на-Дону

19 9 6

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук профессор Ю. М. Ломов;

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии.

Защита состоится 18 декабря 1996 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 0743201 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института «Микроб».

доктор биологических наук старший научный сотрудник Л. П. Алексеева.

член-корреспондент РАТН А. К. Адамов;

кандидат медицинских наук Л. В. Саяпина.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Г. А. КОРНЕЕВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Высокая заболеваемость холерой ежегодно регистрируется в 20-30 странах мира. Седьмая пандемия холеры эльтор продолжается. Несмотря на пристальное внимание исследователей к проблеме патогенностп холерных вибрионов, наименее изученным из секретируемых факторов является гемолизин.

Способность к продукции холерными вибрионами гемолизина изучается с начала XX века (Kraus R., Pribram Е., 1906).

Гемолитическая активность, долгое время считалась свойством, присущим только вибрионам эльтор, и служила критерием отличия их от вибрионов классического биовара. В ходе седьмой пандемии холеры было установлено, что не все штаммы V.chrlerae eltor обладают способностью лизироватъ эритроциты барана, поэтому тест гемолиза нельзя считать абсолютным дифференциальным признаком между классическим холерным вибрионом и вибрионом эльтор (Донская Т.Н. с соавт., 1568; Коробкова Е.И. с соавт., 1969; Мухамедоэ С.М. с соавт., 1990; Осауленко О.В. с соавт., 1933; Печешш ОД, 1930)

Ряд исследователей (Никитина F.F. с соавт., 1976; Осауленко О.В. с соавт., 1983; Семиотрочез B.JI., с соат., 1985, 1990) отвечают, что з определенных условиях н классические холерные вибрионы проявляют 1смслитичсскук> активпость (Feely J.C., Pitünan М., 1962, 1963; Stoebner J.A., 1986).

К настоящему времени накоплены данные по изучению гемолизина холерных вибрионов, но они разрознены и противоречивы. Существуют суждения, что гемолизин является адаптивным энзимом (Kalsaw С.М. et al. 1968; Roy С. Et al, 1962,1963), фактором патоплшости (Finkelstcin RA., 1966; Sakazaki К., 1971; Sanyal S.C. et al., 1974 и др.)» nropoTso распространено мнение о токсичности гемолизина (Семиотрочез В.Л., 1985, 1990; Jamamoto К., 1983 и др.). Однако, единичные исследования свидетельствуют об отсутствии у выделенных препаратов различной биологической активности в тестах in vivo (Олсшгчева JI.C., 1988,1989).

Различие методических подходов, отсутствие эталонного препарат и, наконец, вариабельность свойств самих гемолизинов холерных вибрионов затрудняет оценку роли этого вещества в патогенезе холеры.

Таким образом, изучение свойств гемолизинов холерных вибрионов разных биовцюв продолжает оставаться актуаль-íibiM. Ряд вопросов, связанных с^ свойствами гемолизина, являются дискуссионными, а проблема в целом - открытой. Настоящая работа предпринята с целью анализа препаратов гемолизинов различных биоваров с привлечением комплекса современных методологических приемов, что, надо полагать, позволит уточнить роль гемолизина в патогенезе холеры.

Цель работы. Анализ препаратов гемолизинов, выделенных из штаммов холерных вибрионов, различающихся по гемолитической активности, с помощью комплекса методологических приемов, включающего монослойные перевиваемые клеточные хулыуры и моноклональные антитела.

Задачи работы.

1. Определить информативность комплекса методов ш. vitro, включающего монослойные перевиваемые клеточные культуры и моноклоналыше антитела (МКА) для характеристики препаратов гемолизинов.

2. Оптимизировать условия изучения цитотоксичности гемолизинов холерных вибрионов различного происхождения и биологической активности.

3. Определить активность гемолизинов, выделенных из штаммов холерных вибрионов, различающихся по экспрессии гемолитической активности, в отношении клеточных линий L-929, Hela, Yero, CHO-KI.

4. Определить антигенные свойства препаратов гемолизинов и отработать схему иммунизации для использования ее в технологической процедуре создания габридом - продуцентов MICA, и получения антигемолитических сывороток.

5. Изучить нейтрализующий эффект поликлональных антител в отношении цитотоксического действия препаратов гемолизинов.

6. Получить габридомы, секретарящие МКА к препаратам гемолизинов холерных вибрионов, провести анализ эпи-тонного состава.

Нлучняя шптия.

1. Впервые дан сравнительный анализ препаратов гемолизинов холерных вибрионов, выделенных одним методом из штаммов, отличающихся по признаку гемолитичности.

2. На модели культуры клеток выяснен ряд характеристик препаратов гемолизинов. Показана их различная, нензбира-тсльная акпшность в отношении клеточпых линий L-929, Hela, Vero, СНО-К1.

3. Установлено, что на щтготоксические и антигенные свойства препаратов гемолизинов влияют различные факторы, такие как химическая очистка, повышенная темперзтура, условия хранения.

4. Впервые получены супернатанты клеточных гибридных культур, продуцирующих МКА к препаратам гемолизинов.

5. Впервые с помощью МКА проведен анализ эшгюппого состава очищенных препаратов гемолизинов и установлена связь гсмолитичного белка с липополпеахаридом (ЛПС), что не выявлялось традиционными биохимическими методами.

6. Впервые разработана методика получения мышиных антисывороток к препаратам гемолизинов.

7. Впервые с помощью комплекса методов in vitro дана характеристика гемолизинов слабогемолитичного и кегемоли-тнчного в отношешга эритроцитов барана штаммов, что дало возможность составить гипотетическую схему зависимости биологической активности гемолизинов а тестах in vivo и in vitro от степени гемолитичности и холерогенности штаммов-доноров.

Научг;о-тео».стнческ~ая и практическая значимость.

В работе получены экспериментальные данные, обосновывающие новые научные подходы к анализу гемолизина. Показана целесообразихггь анализа фенотипическои характеристики штаммов- доноров гемолизина с учетом степени выра-

жсшюсга гемолитических и других свойств холерных вибрионов.

Использование комплекса микробиологических, иммунологических методов и клеточных систем in vitro позволило уточнить особенности струтаурно-функциональных характеристик препаратов гемолизинов, отличающихся по гемолитическим, цитотоксическим и энгеропатогешшм свойствам..

Экспериментальные данные свидетельствуют о неоднозначности патогенетического действий гемолизинов холерогек-ных в нехолерогенных штаммов.

Полученные данные дополшшн и обновили представления о структуре и функциях этого токсического вещества холерных вибрионов.

Отработаны условия для изучения препаратов гемолизинов с помощью методов in vitro.

Составлена схема получения гибридом, тестирования и отбора табридных клонов, продуцирующее MICA к гемолизину, что в условиях отсутствия препарата-эталона и наличия в исследуемых образцах иммуногенноги компонента может быть использовано для получения информативных тесг-скстем.

Разработана методика получения мышиных антисывороток к препаратам гемолизинов.

Серологические реакции с использованием МКА позволили обнаружить связь гемолигичного белка с ЛПС, что не выявлялось традиционными биохимическими тестами. Метод МКА может найти практическое применение для оценки однородности очищенных препаратов.

Показана большая информативность методов in vitro для характеристики биологической активности, препаратов гемолизинов по сравнению с методами ш vivo, что обеспечит экономию животных и изучаемых препаратов.

Положения, пыносимые на защиту.

1. Комплекс методов in vitro, включающий перевиваемые клеточные культчры и моноклональные антитела, информативен для оценки биологических особенностей различных препаратов гемолизинов.

2. Препараты гемолизинов, выделенные го штаммов, от-чичающихся по признаку гемолигичности, обладают неизбирательной, но различной активностью в отиошешпг клеточных культур.

3. Использование моноклокалышх антител позволяет выявить общие и- различные детерминанты гемолизинов, выделенных нз холерных вибрионов разных биоваров, а также выяснить наличие шш отсутствие взаимосвязи с другими факторами натогенносш.

Аяробапнп паботм.

Результаты исследований были доложены па научных конференциях молодых ученых РПЧИ в 1938, 1989, 1990, 1595 гг. Материалы диссертации ©бсупгдеш ш общеипсппутской конференции РПЧИ 16 апреля 1996 года.

ТТублгигацпп пс-гулт,тяттг пссяедовппнн.

Основные полохеиия лиссертацпа отражены в 3 опубликованных научных работах.

Стпуктупп дпссептатпл.

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Указатель литературы содержит 194 источника, нз них 71 шгчествеппых и 114 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 8 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И Й1ЕТОДЫ

В работе использованы препараты биологически активных веществ холершых вибрионов, полученных в Ростовском научно-исследовательском противо-тумном иишпуге, любезно предоставленные сотрудниками РПЧИ: ЛПС - Лобановым В.В., иейрашпгадаза и иротеаза - Мареевым В.И., гшолизины -Оленичевой Л.С.

Очищенный препарат ЛПС был получен путем экстракции из клеток У.сЬо!сгае сИог 5879 (Инаба) водпо-бутольньш методом и ряда последовательных этапов очистки. Препарат

содержал 1,7% белка, 51,3% углеводов, 0,8% нуклеиновых кислот, ЕД50 ЛПС составляла 45,2 мкг.

Один из препаратов гемолизина выделен из супернатанта холерогенного штамма 569В, негемолитичного в отношении эритроцягор барака, ко лизирующего эритроциты других видов животных - кролика, корской свинки, цыпленка. Гемолизин V.cholerae eltor выделены из штамма 9949, слабогемолитичного по отношению к эритроцитам барана и не холерогенного. Гемолизин V.cholerae mutant выделен из штамма 461/67-34(0"), гемыштичного по отношению к эритроцитам барана и нехоле-рогенного.

Препараты гемолизинов были получены Оленичевой Л.С., 1989, в результате выращивания клеток холерных вибрионов в синказно-дрожжевом бульоне pH 7,4, в течение 18 часов при 37 С, последующим удалением клетс*: центрифугирование)!,.;, лиофшшзации бесклеточной жидкости, осаждения сульфатом аммония до 50% насыщения, диализа, повторного лиофнлизнрования, хроматографии на ДЭАЭ целлюлозе, уравновешенной 0,06-М фосфатным буфером pH 7,2, элюитэо-кания 0,5% фосфатным буфером pH 7,4.

В 7,5% ПААГ очищенный гемолизин V. cholerae cholerae 56УВ был представлен одной белковой полосой с Rf-0,35, молекулярной массой 40 кДа, обладал сиалидазной активностью в отношении овомуцина и ганглиозидов, имел 45% белка, был термолабилен, вызывал гемолиз эритроцитов морской свинки, кролика, цыпленка, не лизировал эритроциты барана. Активность в агаре с эритроцитами кролика составляла 30 мкг/мл. Препарат не вызывал энтеропатогенного эффекта при введении в гонкий кишечник кроликов-сосунков, отёка лапок белых мышей, гибели и патологических изменений у морских свинок и белых мышей при различных методах введения.

Препарат гемолизина V.cholerae eltor 9949 также являлся термолабильным белком, в ПААГ выявлялись 2 белковые зоны - 80 и 160 кДа, t связи с чем авторы предположили наличие нескольких молекулярных форм гемолизинов. Препарат имел 48% белка; активность в агаре с эритроцитами барана 20

мкг/мл. Он не вызывал энгеропатогенного эффекта у кроликов-сосунков, отёка лапок белых мышей, гибели и патологических изменений у морских свинок при различных методах введения. Препарат гемолизина V.cholerae mutant 461/67-34(0 ) имел в ПААГ 2 белковые зоны 80 и 160 кДа, 44% белка , активность в агаре с эритроцитами барана - 5 мкг/мл. В отличие от первых двух препаратов гемолизин Y.cholerae mutant, вызывал энтеропатогенный эффект кроликов-сосунков, отёк лапок белых мышей, гибель морских свинок при различных методах введения.

Авторы характеризовали очищенные препараты гемолизинов как белки. Об отсутствии примеси ЛПС в препаратах, по мнению авторов, свидслельствовало следующее :

1) препараты гемолизинов были термолабилыгы, после прогревания и кипячения они теряли свою активность в отношении эритроцитов;

2) преципитация с агглютинирующей О-сывороткой была отрицательной;

3) антроновый тест не дал положительного результата."

Фенопшическая характеристика штаммов-доноров гемолизинов позволила дать название штаммам V. cholerae cholerae 569В и V. cholerae eltor 9949 «гемолитически педоминантные», а гемолизинам - «неактивные».

В работе использованы 150 штаммов холерных вибрионов, полученных в музее живых культур РПЧИ я охарактеризованных по родовым и видовым признакам.

Штаммы различались по принадлежности к биотипам, вирулентности, гемолитичности, наличию гена холерного токсина.

Кроличьи ангасыворогки к гемолизинам классического холерного вибриона (АГСк), его мутанта (АГСм), вибриона •зльтор (АГСэ), получены внутривенной иммунизацией кроликов соответственно препаратами гемолизина классического вибриона - Гк, его мутанта - Гм, гемолизина эльтор вибриона -Гэ и любезно предоставлены сотрудником РПЧИ Фсцайловой О.П.

Мы располагали набором монс /локальных антител к О-антигену холерных вибрионов, любезно предоставленных нам сотрудником РПЧИ Еурлаковой О.С.

Для изучения цнгогоксической активности препаратов гемолизинов холерных вибрионов использовали монослой-ные клеточные лишгч Инстшуга цитологии (г. Санкт-Петербург): СНО-К1 (овариальные клетки китайского хомячка), Vero (клетки почки зеленой мартышки), L-929 (мышиные фибробласты), Hela (клетки карциномы шейки матки). Клетки культивировали общепрпятыми методами (Фрешни Р., 1989) в смеси сред Игла и 199 (1:1) с добавлением 5% сыворотки плода коровы. За цитотоксическую дозу принимали цитотоксическое действие минимального количества препаратов, вызывающего дегенерацию 50% клеток популяции (ЦГД50).

Длг. иммунизации мышей Balb/C использовали различные схемы, принимая во внимание слабую иммуногенность гемолизинов. Схемы многократно модифицировали с целью подбора наиболее оптимальной.

Слияние иммунных спленоцитов мыши с миеломными клетками линии Рз-Х63/8-653, дефектными по гипоксантингуа-нинфосфорибозил-трансферазе, производили в соответствии с методикой Farekas de St., Grauth et al., 1980, 1982.

В работе использовали следующие среды для культивирования гибридом:

ростовая - (RPMJ-1640) с 10% эмбриональной сыворотки коров, 4 г/л глюкозы, 2 ммоль глутамина, 10 ммоль буфера Hepes, 110 шсг/мл пирувата натрия;

Сояекгивпая среда ГАТ : к ростовой среде добавляли 0,4 ммоль ашшоптерина, 0,1 ммоль пшоксантина, 16 мкмоль ТЕМндана и 50 мкг/мл гентамицина.

За 24 часа до слияния в 96-луночные планшеты вносили (3-5) х 103 макрофагов в 50 мкл селективной среды на -лунку, иккубировали при 37* С в атмосфере с 5% С02 .

s

Слияние иммунных спленоцитов с клетками миеломы проводили с помощью полиэтиленглнколя с молекулярной массой 1500 ( «Ferak» ).

Определение специфических антител, продуцирз'емых гибридомами, проводили на 14-й день при достижении в лупках плотности клеток 30% и более. Отбор позитивных клонов проводили методом непрямого иммунофлюоресцентного анализа (МНИФ) и с помощью твердофазного варианта имму-поферментшго анализа (ИФА).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первая часть работы посвящена исследованию взаимодействия гемолгоиноз с клетками L-929; Hela; Vero; CHO-Kl . Результаты показали, что гемолизины штаммов V.cholerae cholerae 569В, V. cholerae cltor 9949, пе проявляющие активность в тестах in vivo, так же как и «активный» гемолизин V.cholerae mutant 461/67-34, являлись цитотоксипами. Они были активны и не избирательны в отношении всех исследуемых культур. Чувствительность клеточных линий отличалась не более, чем в 2-4 раза. Однако цптотокстяеская активность трёх препаратов гемолизинов сущестаешю различались (таблица 1).

Таблица 1

СРЕДНИЕ ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ ГЕМОЛИЗИНОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК __(М ± m), п - 6____

Культуры клеток Показатели активности гемолизинов

V.cholerae 569В V.chol. elíor 9949 V.choLmutant 461/67-34

CHO-Ki L-929 Vero Heiz 1,98 + 0,79 1,5±0,32 1,76 + 0,52 3,12 ±0^ 0,52 ±0,16 03 ±0,16 0,9 ±0^2 1 »9 ±0,49 0,001 ±0,003 0;008± 0,007 0,019 ±0,009 0,02 ± 0,02

Цшхггоксичность гемолизина штамма, не лизнрующего эритроциты барана - V.eholerae cholerae 569В, была наименьшей (1,5 мкг/мл) и превышала токовую гемолизина V. cholerae eltor 9949, штамма слабогемолитичного и так же «недоминантчого» по этому признаку только в 3 раза и равнялась 0,5 мкг/мл. В то же время, цитотоксичности «активного» гемолизина V.eholerae mutant 461/67-34(Ö)-0,00S мкг/мл - была ниже цитотоксичности гемолизина V. cholerae eltor в 100 раз, а гемолизина V. cholerae - в 1000 раз. Исследуемые нами «неактивные» гемолизины имели дозы цитотоксической активности в 100 и 1000 раз выше, чем гемолизины, описанные в литературе (Finkelstein R.A.,1996; Yamamoto К., 1983; Me Car-dell, 1985; Семиотрочев B.A.,1990), обладающие биологической активностью in vivo.

При различной активности трёх препаратов, действие и этапы клеточной деструкции были одинаковы. Они обусловили: 1 - наруше1ше межклеточных связей; 2 - изменение формы клеток; 3 - частичную деструкцию и 4 - тотальный лизис всей популяции.

При изучении активности актигемолитичных кроличьих сывороток к трём исследуемым препаратам, любезно предоставленных сотрудником РПЧИ Фецаиловой О.П., нами было установлено, что сыворотки обладали слабым нейтрализующим гемолизины действием к культуре клеток, средняя титров составляла 1,6 + 0,05. При этом в ИФА титры этих сывороток были достаточно высоки и находились в пределах 3,0 + 0,02 (средние взяты в lg). Максимальные титры были у антигемо-литичной сыворотки к гемолизину V. cholerae eltor. Последнее свидетельствовало о том, что препараты способны индуцировать образование антител, которые активны в серологических реакциях, однако, специфическая антицитотоксическая индукция антител чрезвычайно низка. Наличие серологической активности поликлональных антител могло свидетельствовать, что в составе препаратов гемолизинов имеет место структура, обуславливающая их активность в ИФА.

Изучение влияния темпеоатуры на очищенные препараты гемолизинов показало, что они термолабильны. Прогревание при 56 °С в чечение 30 минут значительно снижало их цп тотоксичность. Кипячение нриводдлс к полной потере цитолн-тической активности. Однако, при действии кипячённого гемолизина V. cholerae eltor на культуру клеток можно было наблюдать наличие остаточных морфологических изменений, что свидетельствовало о наличии в препарате веществ термостабильной природы.

Применительно к проблеме гемолизчна, моноспецифические атшела представляют большую ценность для тонкого изучения структуры гемолизинов и их возможной связи с другими факторами патогенкости. Учитывав недостаточную изученность гемолизинов холерных вибрионов, мы не ставили целей, связанных с разработкой на основе MICA диагностических тсст-систсм. Нашей задачей было получить гибридомы, секретирующие МКА, и провести анализ эпигопного состава трёх исследуемых препаратов гемолизинов - V.cholerae cholerae, V.cholerae eltor, V.cholerae mutant.

Для отработки схем иммунизации гемолизинами мышей В ALB'С нами было использовано около 50 их модификаций. Изменяли способы введения, длительность, интервал между инъекциями, адьюваиты. Эффективность схем иммунизации оцешшали но уровню антител в сыворотках опытных мышей в реакции с гемолизинами с помощью ИФА, нейтрализации в культуре клеток, а также по количеству антигелообразуюших гибридом.

Наилучшие результаты были получены по схеме (таблица 2), имеющей следующие параметры -. пролонгароваи-ность - 9 недель, интервал между инъекциями - 3 недели, количество инъекций - 4, место введения - лимфоузлы и селезёнка, червая инъекция - в полном адъюванге Фрейнда.

В гибридизацию брали лимфатические узлы и селезёнку. Оптимальная доза инъекции для всех препаратов равнялась 5 3. Уменьшение, как и увеличение её приводило к уменьшению титров сывороток и пула позитивных гибридных клопов. При

7 .'"лица 2

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТОВ ГЕМОЛИЗИНОВ ДЛЯ МЫШЕЙ ВЛЪВ/С ________(М + т),п = 6__

Показатели Н о м е р с х е м ы

1 2 3 4 5

Тптры сывороток

в ИФА: 2,95 + 0,10

- АГСм 3,00+0,05 3,00 ±0,05 3,10 ±0,05 3,00 ±0,05

- АГСк 3,00 + 0,05 Л,00 ±0,05 3,10 + 0,05 3,30 ±0,05 3,05 + 0,05

-АГСэ 3,05 ±0,05 3,10 ±0,05 3,25 ±0,05 3,85 ±0,05 3,10 + 0,05

Не й г р алн з уго щи ¡1

тптр сывороток в

культуре клеток:

-АГСм 1,14 + 0,05 1,14 ±0,05 1,14 ±0,05 1,19 ±0,05 1,14 ±0,05

- АГСк 1,14 + 0,05 1,19 ±0,05 1,29 ±0,05 1,49 ±0,05 1,14 ±0,05

-АГСэ 1,14+0,05 1,19 + 0,05 1,29 ±0,05 1,04 + 0,05 1,19 ±0,05

Количество

положительных

гибридом (в %):

-Гм 40/0 50/2 50/3 50/3 , 50/2

-Гк 40/0 50/2 50/3 60/5 50/3

-Гэ 40/2 55/5 60/10 60/30 50/5

Прим.: в числителе - выход гибридом, в знаменателе - кол-по полояштельиых гпбрндом

применении описанной выше схемы иммунизации был получен наибольший выход позитивных гибридом и наивысшие титры сывороток. В ИФА они составили для Гм - 3,1; Гк - 3,3; Гэ - 3,85. Нейтрализующий титр сывороток в культуре клеток составлял для; Гм - 1,19; Гк - 1,49; Гэ - 1,84. Наибольшее i м-муногенностью обладал гемолизин V.cholerae eltor (таблица 2).

Остаточная цитотоксичность гемолизина V.cholerae eltor при кипячении позволила нам усомниться в исключительно белковой природе этого препарата. В связи с этим, все полученные гемолитические сыворотки были оттестированы в ИФА с препаратом лкпогольсахарида (ЛПС). Но только сыворотки к гемолизину V.cholerae eltor показали в ИФА невысокий специфический титр с ЛПС. Средняя этих тстров составляла 2,7 + 0,05, в то время как наименьший титр сывороток в реакции с гемолизином составлял 3,05 + 0,05.

Таким образом, результаты наших исследований указали на возможность наличия в препарате гемолизизина V.cholerae eltor углеводного компонента.

В дальнейшем с помощью гибридизаций, с учётом предварительно отработанных условий, нами было получено в общей сложности 2200 первичных гибридных культур, которые были исследованы на антител оопразуюгцую способность.

Для подтверждения строгой специфичности полученных МКА препараты гемапизкнов V.cholerae, V.cholerae mutant, V.cholerae eltor подвергали кипячению н повторяли тестирование методом ИФА. Из 390 первично оттестированных положительных суперкатангов 365 продолжали работать с подверг яхпмнел денатурации препаратами гемолизинов, в том число V.cholerae cholerae, V.cholerae mutant Предварительные исследования не указывали на то, что в гемолизинах V.cholerae cholerae, V.cholerae mutant имеет место термостабильный компонент, наличие которого было выявлено при тестировании образцов супернатантов гибридом с ЛПС в реакции ИФА.

Вероятно, в связи с низкой иммуногенностыо препаратов гемолизинов, многократные попытки получить стабильно про-ллфериругащяе габридомы к гемолизинам V.cholerae

cholerae, V.cholerae mutant, как путём модификаций схем иммунизации, так и путём реглонирований на различных стадиях роста 1слеток не увенчались успехом. Поэтому наши дальнейшие исследования проводились с гемолизином V.cholerae eltor, работа с которым была направлена ца поддержание про-лиферативной и секрстирующей активности гибридом, с целью исследования их свойств на первичных этапах получения.

В результате проведения ряда гибридизаций и клонирований нами был получен набор из 10 гибридных культур, продуцирующих МКА к лрепарату гемолизина V.cholerae eltor. По специфической активности мы разделили МКА на 2 группы. Первая группа МКА - G3, G6, G8 - была активна в отношении гемолизина V.cholerae eltor, подвергшегося кипячению. Эта группа МКА была направлена к термодабильпому компоненту, вызывающему лизис клеточных культур и эритроцитов.

Таблица 3

АНАЛИЗ ПРЕПАРАТОВ ГЕМОЛИЗИНОВ

С ПОМОЩЬЮ МКА К ГЕМОЛИЗИНУ V.cholerae eltor

Группы МКА Йсс ле дуемые препараты

ГЕ гм гк ЛПС НА. ПР АТФ-аза ХТ

1 группа: - реакция до кипячения гемолизинов: G3 G« Gs + + + + + + - - - - -

- реакция п/ кипячения гемолизинов: Сз Сб Gs - .,..." .. - - - - - т

i5

Таблица 3 (продолжение)

2 группа : i

- реакция

до кипяченая

гемолизинов:

В7 + - + + - - - -

С2 + - + + - - - -

Ds + - - + - - -

Gio b - + + - - - -

Bs + - - + - - - -

F2 + - - + - - - -

Ею + + - + - - - -

- реакция

п/кипячения

гемолизинов:

В7 + - + + - - - -

D' + - + + - - -

Ds + - - + - - - -

Gio - ■ь + - - -

В5 - - + - - - -

F2 + - - + - - - -

Ею + + - + - - - -

Примечание: ГЕ - гемолизин V.chokrae elior, ГМ - гемоли-зпп V.chüerae mutant, ЛПС - лтхсшмшсахарпд, НА - нен-рамииядаза, ПР - лротеаза, XT - холсрпыа токсин. + - «+++»-«) in» - специфическая реакция

Вторая rpjuna - В7, D2, G10, В5, F2, ЕЮ - проявляла активность в отношении термостабнльного компонента препарата, не вызывающего гемолиз эритроцитов и цитолиз перевиваемых культур.

Мы изучали взаимодействие обеих групп полученных МКА с гемолизинами V.cho!erae cholerae, V.cholerae mutant, ЛПС, протеазой, нейраминидазой, АТФ-азой, холерным токсином, а также с клетками холерных вибрионов (таблица 3).

Полученные результаты свидетельствовали, что МКА гибридом G3, G6, G8 работали с препаратом гемолизшт V.elv-Ierae mutant (0~), демонстрируя общность антигенных детерминант гемолизинов V.cholerae non 01 и V.choîerae eltor.

При взаимодействии этих же МКА с препарат-ом гемолизина V.cholerae cholerae окрашивание проб в ИФА не наблюдалось, что подтверждало данные литературы о генетическом различии гемолизинов классических и эльтор вибрионов. МКА G3, G6, G8 не вступали в реакцию с ЛПС и не связывались с препаратами нейрамьлидазы, протеазы, АТФ-азьг, холерным токсином, что подтверждало их специфичность в отношении гемолизина V.cholerae eltor. Работа с МКА второй группы, направленными к углеводному компоненту гемолизина V.cholerae eltor, в ИФА продемонстрировала, что три из них узнавали детерминанты в препарате гемолизина V.cholerae cholerae и одна - в препарата гемолизина V.choîerae mutant, что свидетельствовало о наличии отдельных детерминант ЛПС п в зтвх препаратах.

Оценка специфичности МКА G3, G6, G8 да штаммах вибрионов методом ИФА показала, что дапше МКА давали специфическое свеченче только со штаммами, гемоднтйшшми V.cholerae non 01 и V.cholerae eltor, слабовирулешпыми И авирулентиыми, отрицательная реакция наблюдалась в случае штаммов, негемолитичных V.cholerae eltor и V.cholerae. Вме* сте с тем, эти же МКА не взаимодействовали ни с одним из исследсвашшх штаммов в реакции МНИФ. По всей видимости, это связано с особенностью структурной организации де-термшшт гемолизина на клетках вибрионов, которые мотуг выявляться только с помощью ИФА (таблица 4).

Анализ 100 штаммов V.cholerae с помощью МКА второй группы в МНИФ показал, что ivKA к углеводному компоненту гемолизина узнают «свои» детерминанты у части штаммов как ссровара Огава, так и серовара Инаба, что подтверждало специфичность этих MICA детерминантам ЛПС. МКА первой грутгсы не взаимодействовали ни с одним из этих штаммов в данном опыте.

Таблица 4

АКТИВНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ МКЛ П'УППЫ 1, _Р РЕАКЦИИ ИФА И МПИФ___

Характеристика М1 А Г р У П !! Ы 1

Ш т а м м о в В реакции ИФА В реакции МННФ

№ штамма Вирулентность Гемолиз Оз йя вз С8

У.с1н)!егае сЙог:

9949 а/и + + - - - -

9945 а/в + + + - - ■ - -

9865 а/в + + + - - - -

9915 а/в + -ь + - - - -

9952 с/и Н- + + - - - -

4161 с/а + + + - - - -

9913 а/а + + + - - - -

У.сЬо!егие НАГ-мутаит: 451-67-34 а/в + + _

461-67-35 а/в 4- + + - - - -

461-67-36 а/в + + + - - - -

53-2-28 а/а + + + - - - -

У.сЬа1егае еИог:

5544 в - - - - -

4625 в - - - - - - -

5879 в - - - - - -

5«76 Б - - - - - - -

У.сЬо1егае:

569В в " - - - - —

528; 461-67 в а/и - - - - -

Примеч.: а/и - авирулентныи, с/и - слшкншрул., в - вирул., ■ • • 1» - сз.сги ;

В наше распоряжение были предоставлены 14 МКА, полученные непосредственно к разным детерминантам О-ашигена холерного вибриона.

Исследование МКА специфичных ЛПС в реакции ИФА с тремя испытуемыми гемолизинами показало, что О-ахггигеи специфичные МКА распознавали три детерминанты у гемолизина V.choierae cholerae, одну - у гемолизина V.cholcrae mutant и 5 - в составе V.choierae eltor.

Таким образом, с помощью гибридных культур, продуцирующих моноклональпыс иммуноглобулины, удалось выяс-шггь, что у гемолизинов V.choierae eltor и V.choierae cholerae имеют место различные аотигешше детерминанты.

МКА позволили установить, что препараты гемолизинов имеют в своём составе не только белэг, но и отдельные детерминанты ЛПС, что не было подтверждено биохимическими исследованиями.

По всей видимости, наличие детерминант. ЛПС в препаратах гемолизинов определяет их антигенные свойства, так как гемолизин V.choierae eltor имел в своём составе наибольшее количество углеводных детерминант и обладал большей имму-

ПОГС1ШОСТЫО.

В свете изложенного выше материала, нам представляет«-ся возможным обсудить следующее.

Полученные нами материалы о цитотокснческой активности гемолизина и наличии в составе препаратов гемолизина детерминант ЛПС заставили нас обратить внимание на современною характеристику бактериоцинов.

В литературе нет сведений об исследованиях гемолизина как бактериоцшш или бактериоцшюподобного вещества.

По одному из определений, «бактериощш - любая субстанция, образуемая бактериями, которая, связываясь с рецепторами на поверхности чувствительных клеток, способна убивать эти клетки. Первоначально считали, что все бактериоцины яашютсч белками, то есть белком является та часть бактерио-цшш, которая вызывает бактерицидный эффект. Однако вскоре выяснилось, что многие бактериоцины представляют собой

комплексные соединения, содержащие, помимо белка, ЛПС» (Домарадип^кий HB., 1986; Rieger R. et al., 1976 ).

В этом определении не уточнено, какие клетки убивае. бактериоцин. От понятия бактериоципов, распрострилепного ь отечественной литературе, гемолизины отличает лип1ь то, что они убивают клетки животного происхождения. Зарубе::;штс v. г авторы не делают акцепт на происхождешга клеток-мшпеной. Имеющаяся в литературе информация о бактериоцинах и бак-териоциноподобных веществах, а также полученные нами данные позволяют обсудить возможность отнесегагя гемолизинов если не к бактериоцинам, то к бактериоциноподобпым веществам, границу между которыми провести не всегда удаётся.

Дальнейшее изучение гемолизина, как и других биологически активных факторов, будет способствовать более глубокому познанию природы холерных вибрионов и особенностей проявления их патогенных съойств в различных условиях, что, в конечном счёте, необходимо для повышения эффективности санитарно-эпидемиологических мероприятий, совершенствования методов прогнозирования, диагностики и лечения холеры.

ВЫВОДЫ

1. Комплекс методов in vitro информативен для характеристики очищенных препаратов гемолизинов.

2. Все изученные препараты гемолизинов из штаммов холерного вибриона классического биовара, его мутанта и биовара эльтор циготоксичньг в отношении испытанных клеточных культур (СНО-К1, Vero, Hela, L-929 )

3. Препараты гемолизинов, выделенные из штаммов, отличающихся по признаку гемшигичности, и очищенные одним способом, имеют различную цитотокспческую активность. Установлена взаимосвязь степени цитотоксической активности гемолизинов с их активностью в тестах in vivo и с гемолитич-ностыо штаммов-доноров.

4. Исследуемые препараты гемолизинов V.cholerae eltor, V.cholerae cholerae, V.cholerae mutant обладают специфнче-

ской и неспецифической антигенной активностью и содержат в своём составе наряду с гемолигичным белком углеводный чомнонент.

5. Разработана схема получения МКА к препаратам гемолизинов. С помощью МКА установлено, что детерминанты небелковой природы в препаратах' гемолизинов являются общими с детерминантами ЛПС. Метод МКА является объективном тестом оценки однородности очищенных препаратов.

6. С помощью МКА у гемолизинов V.cholerae eltor и V.cholerae mutant выявлены общие детерминанты, отличающиеся от детерминант гемолизина V.cholerae cholcrae.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.Р.Тслесманич. Сравнительная характеристика гемолизинов холерных вибрионов// Микробиологический журнал -1992.-Т.54, Jfä 3.- С. 105-112.

2. Н.Р.Телесмаш1Ч, О.И.Салыпп:оза, Л-СЛодосиншпсова, Л.Г. Воронежская, В.П.Власов, Е.В.Гл2ПЬ::о, Л.В.Ивлнова. Характеристика гемолизинов холерных Енбрнонов по признаку гсмолигичпосги штгммов с помощью различных клеточных методов.// Журхтал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии." 1993. - №6,- C.1S-19.

3. Н.Р.Телесманич, О.ЙСальпикова, О.П.Фсцаплова. Характеристика гемолизинов холерных вибрионов по признаку Д> МОЛ1.ЛГХНОСТИ штамма с помощью различных клеточных мете доз// Холера.Материалы Российской научно-практической конференции пс проблеме «Холера». - Ростов-на-Дону, 1995,- С.137-138.