Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура клеток в изучении и тестировании токсинов холерного вибриона

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Культура клеток в изучении и тестировании токсинов холерного вибриона"

ГосударствениыП notomrr сакмтарно-эпидекиологнческого индаоря

Российской Федерации

Российский научно-исследовательский протнвочумний институт

"Микроб"

IIa правах рукописи

Сальникова Ольга Ивановна

КУЛЬТУРА КЛЕТОК В ИЗУЧЕНИИ И ТЕСТИРОВАНИИ ТОКСИНОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА

03.00.07-мнкробиология

АВТОР Е 4> Е Р А Т ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1944

Работа выполнена в Ростовском н/Д ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном

институте '

Научные руководители:

Лоитор £и&а-и<щския наун Л.П.Алексеева Доктор медицинских наук,профессор Ю.Ы.Лоят

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудечк Девдярнзни Э.Л. Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Г.В.Адамова

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится"13 декабря",1994 г.на заседании специализированного Совета Д 074 32 01 по защите докторских диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских нау|^ при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071,г.Саратов,ул.Университетская,46).

Автореферат разослан "13 ноября " 1994 г:

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

Г. А. Корне*

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.Оценка вирулентности холерных вибрионов в экспериментальных условиях, как известно, требует одновременного научения нескольких факторов, причастных к патогенетическому процессу, ведущим'm которых является хермолабильный знтеро-токстш-холероген (Адамов А.К с соавт.,1981,198б;Сомова А.Г.с со-авт.,1000;West P.A.,1909;П0Д0С1ШШ1К0ва Л.С.,с соавт.,1992;)Вместо о тем, холерные вибрионы способны вырабатывать п другие токси-1Ш:зндотоксин, дермотоисин,цитолизин ы, или гемолизины,новый холерный Sanyal С.5.,шига-подоб1ше (Адамов А.К,,1982;Помухнна О.Н.о соавт.,1930,i992;McCardéll B.A.et al,i9a5;Yamamoto К.et al, 10QG; Цитцер A.O. с соавт.,1990;Sanyal S.С., 1581, lS89;0,Brien A.D. et al,1083) Несмотря на существование большого количества методов "in vivo"H"in vitro"-, позволяющих изучать и идентифицировать ан-теротоксины.ие утратила актуальности проблема, касанн^ис^ разработки новых тест-систем.

В последние десятнетия широкое распространение в различных областях В1фусодогин, фармацевтике, биотехнологии, микробиологии, нашли цитологические методы, которые в какой-то степени стали альтернативой биологнчес>шм методам. Найдены индикаторные для XT клеточные линии,, которые позволяют простим титрованием в мини-культуре определять его активность по юненениго морфологии клеток. С помощью культуры клеток изучались гемолизины(МсСаг<1е11 В.A.et ах.19В5 м Др.), шига-подобные токсини (0,Brie» A.D. et al,1983 л др.), эндотоксины (Яговкин Э.А. с соавт.1980 и др.). Однако в доступной литературе нет обобщенных данных по исследова-шт действия различиях биологичест-активиых веществ холерного вибриона, их взаимовлияния в культуре плеток. Кроме.того, в доступной литературе имеются сведения о различных приемах использования культуры плеток в тестировании XT,и не предстапляетсн воа-можным говорить об униф)щ)фова11ном диагностическом способе выявления токсина в бульонных культурах холерных вибрионов, что ограничивает его применеиио. И, несмотря на высокую чувствительность и стандарность метода, он не вошел еще в широкую лабораторную практику. В отечественной ме литератур« такие исследования практически отсутствуют. Вышеперечисленное определило актуальность выбранного нами направления исследований.

Целью настоящей работ» явилось научение активности токсинов И других биологически активных веществ холерного вибриона о па-мощью культуры клеток, разработка к апробация клеточной тест-сип-теми в широкой лабораторной практике для выявления токсилопроду-цирущях штаммов. , , ■•-."..'•'

Задачи работы;

1.Выявить ная&олее чувствительную в отношении но юрного тер-мол-Оилышго экзотоксина (колерного токсина, холерргена.ХТ) клеточную линию, оптимизировать процедуру ее культивирования, установить факторы, способствующие повышению чувствительности клеточной тест-системы дmi обнаружения холерогена в препаратах различной степени очистки.

2. Изучить активность токсинов и других биологически активны? веществ колерного вибриона (гемолизинов,дермотонснна, эндотоксина, нейраминидааы и протеазы) на модели культуры перевиваемых ш-нослойныя клеток СН0-К1, Vero, L-929, Hela, llsp-2 и исследовать их влияние на действие холерного токсина.Подобрать условия обнаружения колерного токсина в супернатаитах бульонных культур холерных вибрионов, содержащих различные биологически активные вещества. .;..•••'...

3.Изучить влияние условий культивирования тогсинпродуцирую-|цих бактериальных штаммов,а также способов хранения, стерилизации, на активность токсинов в культура клеток.

4.С помощью разработанной клеточной тест-системы оценить токсинопродуцнрующие свойства коллекции различающихся по характеристикам штаммов холерных вибрионов и определить возможность использования метода в широкой лабораторной практике.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. ■

Разработйны методические приемы, обеспечивающие' повыменке чувствительности нл«точных линия, используемых при изучении био-1 логически активных веществ холерного вибриона.

Установлено,что из испытанных перевиваемая монослойныя линий, в том числе и индикаторных для холерогена,наиболее чувствительном со специфичной реакцией «леток в виде их удлинения является культура »теток СН0-К1.

В работе вперние показано, что протеазы холерного вибрионы,

как и известные нротоолитические Ферменты, используемы«; при пере-

- а -

зеках клеточных культур, округляют клетки испуганных линий без нарушения ин жизнеспособности.Это действие протеаа камуфлирует специфическую для ЙТ реакцию клеток,чем аатрудняет его теотирова-Е!НО.

Впервые показано,что дермотоксин, как и г-емолизины,вызывая деструкцию клеток, является высокоактивнымцитотоксином в отношении всех испытанных в работе клеточных культур.На модели кулитури клеток научен характер действия цитотоксинов, показаны и* похожие и отличительные свойства.

Подобраны условии культивирования штаммов, способствующие снижению активности 'цитотоксинов и протеза в составе супернатан-то» бульонных культур холерных вибрионов,с целью снижении их нежелательного влияния на результаты тестирования холерного токсина. '

Впервые показано, что эндотоксин и нэйрамйнидааа холерного вибриона характеризуются слабой цитотоксической активность«) и их присутствие в супернатантах не аатрудняет тестирование холероге-на.

Изучение очищенных препаратов биологически активных веществ холерного вибриона показало возможность изучения на модели культуры клеток С1Ш-К1 активирующего действия протеааы 1 типа и ней-рамииидазы в отношении холерного токсина.*

Установлены факторы, влияющие на результаты определения активности холерного токсина в культуре клеток,включающие условия культивирования холерных вибрионов,а такие методы хранения н стерилизации опытных образцов.

В результате проведенных исследований разработана клеточная тест-система, позволяющая идентифицировать холерный токсин в ошггних образцах в присутствии цитотоксинов и протеаа, пригодная для использования в лабораторной практике.

Практическая значимость.

Разработан метод о использованием культуры клеток 1"Н0, позволяющий идентифицировать ХТ в супернатантах бульонных культур холерных вибрионов различных биоваров, отличающихся по степени вирулентности и огмнам выделения.Разработаны оптимальные способы оценки иммунных свойств сывороток и специфичности действии токсинов холерных вибрионов в культуре клеток.Составлены и утверждены Ученым Соке!ом РПЧИ 10.06.199*? г. Методические рекомендации: "Тес-

- о'-1.

тирование XI в очищенных образцах и и супернатантах бульонных культур холерных вибрионов с помощью культуры клеток СНО", которые использованы в работе РЛЧИ, Среднеазиатском ПЧИ, Днепропетровском мединституте. ,

Разработаны приемы, поаволякицне изучать взаимодействие различных биологичеони активных м токсических веществ на модели культуры клеток.Использование разработанных приемов поаволило раош!.,/ить csjepy применения метода для оценки активности токсинов других микроорганизмов.Предложен способ тестирования "мышиного" токсина чумного микроба в культуре клеток на основе его и ХТ конкурентного взаимодействия с клетками СНО, на который было получерно авторское свидетельство "СросоЗ определения активности "мышиного" токсина чумного мнкроба"аа номером 1775472 от.15 июля 199Н года.

Основные положении,выносимые на защиту:

1.Культура Клеток СН0-К1 является наиболее чувствительной и удобной клеточной, моделью для выявления активности и иаучения свойств холерного токсина. '

2.Модель культуры клеток позволяет оценить биологическую активность гемолизина,дермотоксина, эндотоксина, нейраминидазы г протеаа, а также изучать их влияние на активность холерного токсина. • •

3.Результаты выявления токоинопродунцни штаммов холерных вибрионов с помощью культуры клеток имеют положительную кор1>еля-цим с данными о наличии в составе бактерий гена токсинообрааова-ния их вирулентностью для лабораторных животных и токсигенностью "in vi Ьго",онг>еделяемой внутрикожным титрованием но Крейгу.

4.Тест-система на основе клеток СН0-К1 может быть испольао-вана для исследования фанторов, влияющих на токоинопродукцию холерных вибрионов, оценки экспрессии гена токсинообразования у снеменыделенных и муаеймнх штаммов, нейтрализующей способности иммунных ошюроток, истинности препаратов холерного тонсимп я процессе выдеремся и очистки

Ь. Н*му.»*ч'атк • т».чягй»н»в«м«ии. большого числа штаммов и субкультур хоп.-»рнк« 'юпч»ионои различного нроисхоиления .о-помощью .нультут 1>ы клнтои. ШО-Ki -,дп»т ooubn.we- .дли. внедрения eco н ишрокуи лабораторную практику.

Апробация работы.Результат» исследований били доложены па научных конференциях молодых ученых РПЧИ в 1007,1080 и 1990 гг.; на всесоюзной конференции "Бактериальные токскны"{г.Юрма-ла,1989г.)¡Межрегионально*- конференции "Организация эпиднадзора при чуме и мери ее про$>игактики"г.Алма-Ата,1992 г.)¡на 1 Съезде иммунологов РС5СР(г.Новосибирск. 1992 г)¡на Всесоюзных конференци-ях,посвященных актуальным вопросам экологии, иммунологии,микробиологии. лабораторной диагностики и профилактики холеры(г.Рос-тов-ка-Дзну,гг 1988,1990,1992) ¡на Российской научной конференции " Иммунология и специфическая профилактикаООИ"(Саратов,1993).Материалы диссертация обсуждены на общеинститутской конференции РПЧН в июле 1994г.

Публикация результатов исследование. Основные положения диссертации отражены в 18 опубликованных научных работах.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит иа введения, обзора литературы, списания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указатели литературы, включающего работы 104 отечественных авторов и 100 зарубежных. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками, в том числе 9 графиками и 10 монтажами из 40 фотографий. \ <

■ СОДЕРННИЕ РАБОТЫ

Материалы и метода

В работе испольаовано 100 штамма холерных вибрионов, ралпча-ющихся но принадлежности к биоварам, вирулентности и гемолмтич-ности, наличию гена холерного токсина, а также по срокам выделения. Кроме того,были изучены 1,Ь тысячи субкультур 4х клонированных штаммов, подвергнутых различным воздействиям, в том числе длительное культивирование в речной и в воде, взятой ч месте измышленных стокои,Ь-трансй>ормация (Ломои Ю.М. ,19ñ7.обработка мутагеном Н-нитроаометилмочевиной (Фецайлова О. ¡1. ,Помухииа О.й. ,i977t и пассирование через лелчный пузырь иммунизированного холерным токсином кроликов. При культивировании штаммов использовал»- . личные среды и режимы к-льтивирования а также способы стернли;* t ции и хранения бесклечочных цувернатамтои.

- u 'Препараты биологически активных веществ (БАВ) холерного виб риона,в том числе холерного токсина,гемолизина ,дермотонсина,эн дотоксина, нейраминидазы и протеазы, были получены и любезно пре доставлены сотрудниками РПЧИ Ыареевым В.И. .Оленичевой Л.С. (холер ный токсин) ,Лобановым Б.В. (эндотоксин),Помухишй í>.И. (дермотся сии).вецайловой 0. П. (гемолизины) или использованы коммерчески препараты ширм '\Serva'' (нейраминидаза, проназа) "Caíbíochem"(xo лернни токсин).Мы также располагали соотвеству»1Дими кроличьим иммунными сыворотками,а такле набором моноклонал&ных aurore. (ЫКА) к ХТ и О-анз-игену, полученных, соотаежстненно, сотрудники Среднеазиатского ПЧН Бабициным С.Я. и сотрудницей РПЧИ Бурлаково О.С.

Для научения цнтотоксичесной активности холерного токсина других биологически активных веществ холерного вибриона иснользо вали монослоАные клеточные линии (ин-т Цитологии, г.С.Петербург СК0-К1 (овариалыше клетки китайского хомячна), Vero (клетки псч ки зеленой мартышки), L-S29 (мышинные фибробласты), Hela и Нер-(олуяодевые кдетнн человека).Клетки культивировала общепринятым методами [©решим Р.,1389Í о смеси сред Игла и 199 (lîî)c добавле мнем 5% пшгоротки плодов коровы (СПК) и 1мг/мл глутамина.

Тестирование токсинов в Культуре клеток проводили по отрзбя тачной нами методике: 0,05 ил исследуемого образца токсина кг супернатаята бульонной культуры холерных вибрионов титровали иультуральной SG-луночной панели в объеме 0,05 мл бессывороточнс культуралкней среды; затем в куждую из них добавляли 0,05 свежел ригоговленной на Сессывороточной культуральной среде суспензи клеток линии СН0-К1 из расчета но 3 тыс.клеток в лунку. Пане/ инкубировгти я течение ночи в СО-2 инкубаторе. Учет реакции кле тон вели по сравнению изменения морфологии опытных и ■ контролмп (иитактных) клеток с помощью инвертированного микроскопа плг после окраски, обычного микробиологического. За цитотоксичеси} (цитотонмческун») дозу принимачи минимальное разведение препарате •вызывающее изменени« морфологии 50% клеток популяции (ЦТЕ 50] Дли каждой дозы считали no 300 клеток в трех параллельны* ту-m«. Активность .токсинов и супернатантов выражали либо в едииицг активности, количество которых ооотвегствовади величине, обратш тигру разведения образна(иди логарифму разведения),лнбо в bhí KiiHiit'ü-fpaüMn мчц'чмгм, cotVmmtTnyinttpfl данному разведению преп< IVriiii. 0THtx'»iTi!.'isHyH' уптпниосте к«ра*али в'..единицах.'' активносп

- 9 -..

приходящихся иа мг белка испытуемого препарата.

В отдельных исследованиях использовали различные клеточные линии, нагруани клеток(от 0,5 до 30 тыо.кл.на лунку), опытную культуральную среду с содержанием от 1 до 1Q Z СПК, время инкубации клеток о токсинами от 5 минут до 5 суток, панели новые и использованные ранее после их соответствующей обработки.

Для фотографирования клеток клеточный монослой прополаскивали $из.раствором, висушшади на воздухе, фиксировали 9ио этанолом 10 мин и после прополаскивания в воде окрашивали реактивам Гимза (1:15) в течение 10 мин. После промывания панелей водой, влажный монослой клеток фотографировали через прозрачное дно панели , об X ок ». 10 х G, с обвд» увеличе лем на фотоснимках ?Л0х.

Кроме исследований и культуре клеток для оценки токсинолро-дуцнрушщих свойств штаммов были привлечены i етоды ДНК-ДНК гибридизации (Гинцбург А.Я.,с соавт.,1987); проба Крейга; изучение хо-лерогадностн на лабораторных животных; оценка гемолитичности по Грейгу, спектрофоретическом методе (Yamarcomlo К. et. al,1686)и в агаре ç эритроцитами; протеолитическу» активность оценивали по радиусу протеолиаа молока в агаре, нейраминидааную - по специфическому флуоресцентному свечению отщепленного умбелли$еррона (Му-ег R.W.at al.1080.).гемморагическу» и дермонекротическум - по комплексному методу внутриножного титрования.на кроликах (Помухи-

4 s

на О.И. с соавт.,1989),активность О-антигена -в реакции двойной иммунодиёЁфузин в геле и иммуноферментном анализе с 0-сывороткой и (ЖЛ.Все эксперименты повторяли не менее 6 раз.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами.

Результаты исследований

Предварительные экспериментальные разработки поаволили установить, что ХТ,аналогично данным других исследователей, пнерглл» нашедших удачную клеточную модель для тестирования холерного и холерсподобных токсинов IGuerrant R.L.. ,et al 19741,аиатыя удлинение в 2-3 раза «меток линии СН0-К1, наглядно отличаницилеи от контрольных, уже я иоае 0,003 mVмл. Подобной реакции m не наблюдали при взаимодейстяии холерного токсина г, другими клеточными культурами, и никакой доус-ой токсин пли фермент, взятии для paûo-ты, не вызывая ¡гзрактермого дли ХТ удопнсння (рисунок). Cneimî«4-nocjh клеточной реакций Г>члл почти ¿тдони к помощью гинериммуниоп

• « F • i

:. ■ ' » '. ■ Ф > ' '' У ■ .Y*/« в . • • -ч • ' ' чз» . Ï'-V 7. \ 1 L .J Б . \ ■ sil V . * : -t ' ; ■■** • , - • * ййт"* . В . "'-С •| „Liflfil ЦгТПГ-"ИгАиДП*1"

' «fcS-;.!. • ^ i Г ' - '■ад Vf ' >> . .У ': *■ 'tí ■ tr ••■'. • ■ . ti < 4 '... • / J »лЛИУ*..\ -

Ряс. Корфшготачесмв изменения клеток данян СН0-К1 под воздоГ явив» <3иологнч0ска ахтмлнг ввщаств холерного ввбриона А - контроль кяетох; Б - холерный токежв; В - гфотеааа; Г - нвйраывдадаза;

Д - гвмсишзмн; Ï - дармотоксин.

- 11 - .

антитоксической сыворотки и моноклоналышх антител, направленных и А и В субьединнцаы холерогена.

Подобранные экспериментально условия тестирования обеспечивали высокую чувствительность клеток к XT. При этом предварительный учет активности токсина можно сделать уже череа три часа, что позволяет говорить об экспресс-диагностике.

Из факторов, влияющих на активность XT "in vitro", следует выделить, во-первых, степень очистки препаратов и условия их получения, хранения и.стерилизации. Чистые препараты были активнее в нультуре клеток, iiu их активность более резко снижалась после температурных воздействий н длительного xpL пения по сравнению с неочищенными токсинами. Поэтому препараты токсина, на наш взгляд, необходимо хранить при низкой температуре (-SOoC)о однократным размораживанием непосредственно перед опытом,что нашли оптимальным и для сохранения j активности других биологически активных веществ холерного вибриона,хотя раствори дермогоксина и эндотоксина были устойчивы к различным перепадам температуры.Опытные пробы пе^ед испытанием чаще всего мы обрабатывали гентамицином (0,4 мкг/ыл), наиболее доступным и нетрудоемкии способом,не влияющим на чувствительность плеток к токсинам.

При подборе оптимальных условий культивирования бактериальных культур,использовали среды, специально разработанные для накопления XT "in vitro": КА.КДС и AKI (казаминовую, каэамиио-дроше-Byw,6aKTonenToiiiiy»)(Finkelstein R.A. et al,1970;Ywanaga М. et al,1985). Известно, что на токсииопродунцию холерных вибрионов в определенной степени влияет как состав ростовой среды так и условия аэрации. Поэтому в нашей работе било использовано два приема культивирования: статическое выращивание и дробное шуттелирование Clwanaga V. et al,19851.

Из трех испытанных нами сред AKI в большей степени отвечала цели эксперимента. Супернатанты штаммов, выращенные на этой среде имели активность токсина в 2-4,иногда в 8 раз более высокую, чем на других средах.

Одно-двухкратное пассирование музейных штаммов, длительное' время находившихся на полужидком агаре, через организм кроликов также приводило к 2-4 кратному повышению уровня их токоинопродук-ции, что было зарегистрировано и в культуре клеток и в пробе Крейга. Наилучшими же были результа-ч, когда тестировали оубкулл-туры,клонированные и отобранные по нрианаку тонсишюбрааования.

Существенное повышение токсинопродуцирущел способности наблюдали в случае дополнительного шуттелировавия при культивировании штаммов по 1уапайа М.. Показатели активности токсина у аэрированных культур примерно в 8-30 раз были выше по сравнению со статически выращенными культурами холерных вибрионов.Однако, процедура шуателирования более эффективно, чем состав питательной среды, влияла и на продукцию других биологически актиьчых веществ холс.ного вибриона . Накопление последних наряду с токсином в среде культивирования затрудняло его обнаружение о помощью клеточной тест-системы. Так,было установлено,что статические условия культивирования вибрионов способствуите усилению продукции гемолизина, дермотонснна, а также нейраминидааы. йуттелирование бульонных культур в процессе выращивания сопровождалось увеличением количества пршеааы и О-антигена в Ъупернатантах, тогда нан уровень вышеперечисленных гогготоксинов и нейраминидазы резко снижался.

Для изучении влияния биологически активны*- веществ холерного вибриона на активность XI в культуре клеток мы предприняли специальную работу, целью которой было установить характер паненення морфология клеток в реакции с очищенными БАВ отдельно и в сочетании с холерным токсином. : '

Оказалось, что все испытуемые вещества вызывали ответную реакцию используемых в работе клеточных культур в виде атипичной морфологии. Реакция клеток была дозозависима, их чувствтельность находилась в обратнопропорцнональной зависимости рт плотности клеток в культуре, что согласуется о общепринятой нормой, по которой клеточную модель можно использовать для оценки активности данных веществ [фрешни Р.,1989].

Изменение морфологии клеточных культур при действии отдельных БЛВ была неодинаковой .Протеаза вызывала округление в дозе 1,9x10-4 миг/мл за счет нарушения межклеточных белковых связей, не влияя на жизнеспособность клеток.В литературе,посвященной ци-ттоксинай иногда встречается термин "округление клеток"для обозначения цитоксического действия ГЧервонская Г. 11. о со-, авт., 1?«8;Р,Бге1*пе АЛ). ,е1 а1,19в41. Нам представляется, что этот термин более уместен для обозначения действяч протеолитичеових ф*>рчевто«.Вк13Ыйа«1цих характерное для них изменение морфологии ' клеток и не приводящих к гибели последних,- что свойственно цнто-токомнам. . .-.•■-..•■

Дгрчотононн и гомрлн'еши холерных вибрионов ■ видимому,

'".';■ '■.■■■.;.. ......-13-

следует, отнести к группе типичных цнтотоксипов, таи как они вызывали необратимую гибель клеток в относительно низкой концентрации. Дермотоксин при этом был особенно токсичен, вызывая деструкцию клеток в дозе 0,03 иг/мл. Он был на два порядка более активен, чем гемолизин мутантного штамма холерных вибрионов, на три порядка активнее гемолизина эль тор вибрионов и гемолизина классических вибрионов.

АнтидврмонБнротичесиая сыворотка обличалась высокой нейтрализующей активность» кал в отношенют дермотоисина (1:СООО), так и В отношении гемолизинов (1:250-1:500). Антнгемолитические сыворотки -хдрактеризовачись слабой протективной активностью ,^1:50-1:100) и практически не обладали перекрестной активностью в отношении дермотоксина.

К признакам, отличающих цитотоксины друг от друга, следует отнести различную' чувствительность их к нагреванию, устойчивость к длительпому хранению и лнофиизацнн, высоким температурам, обратимость действия на клетки.

Анализ полученных и литературных данных показывает, что активность действия изученных препаратов гемолизинов аналогичен препаратам очищенного цитолизина холерных вибрионов не 01 и эль-тор ГЦитцер А.А. с соавт.,1991,1992- HcKardell В.A et al, Íii85; Yamarooto К. ét al, 138БТ по термолабильвостн, химическому составу, молекулярному весу.характеру воздействия на клетки культуры, быстрой потере аитианости при даителвном хранении. Однако, ми работали о препаратами, по-видимому,утратицшмми отдельные ф' гг-и&нты при очистке, поскольку они были неактивны в плане энтеропа-тогенности. •■■'■

Вто ш время препарат дермотоксина активен при испытании "in vivó", . но отличается от цитолизина териоустойчивосг ;i и присутствием углеводов в.свое* составе. По ряду свойств он имеет сходство о нигагтоксииом Olewlánd J.W. et al,lS85;'Yutsudo Т. et al,1986;3(тсрйоустойчивостъ, высокая активность и необратимость действия), но/отличается тем, что не-активен в кератоконъюкти-вальной пробе. Совершенно очевидно,, что необходимы дальнейгаие исследования для установления природы указанных токсинов о использованием вьюоноочищепных оохраняювря активность препаратов и специфичных сывороогон. Решение этих вопросов дало бы ío3w0J*hoCT6 с гомоцью культура кдетсн слзбовирулентиые итаммы, вирулентность í .обусловлена циготоксинами , а не холерин» то*еяж>м.

- 14 - ; • .

Из других биолог^шески активных веществ цитотшсическую реакцию в сравнительна высокой концентрации 1,9-3,0 мкг/ыл обеспечивала иейрамипидааа.; Характер вызываемой ей цитодеструкции отличался от вышеописанного: клетки увеличивались в раамерах за счет большого количества вакуолей, которые как бы раарывали клетки. Обработка неЯраминидааи сыворотками к токсинам не устраняла цито-. аффект. ;

Исследование препаратов эндотоксина различной степени очистки показало их низкую чувствительность в отношении клеточных культур:в пределах от! 0,20 до 6,0 мкг/мл. На глубину-реакции влияла чистота препарата: при увеличении доли углеводов цшотонси-ческая ан-чвнооть снималась, что свидетельствует об участии и других структур токсина в его цитотоксическом действии.

Известно, что НА.протеааы 1 пша и эндотоксин могут в различной степени усиливать активность ХТ, в частности, его холеро-гениое действие СЕаенчук 10. В. ,1085;Павлова ЛЛ1. о соавт.,1982; Соловьев В.Д. с соавт.,1989; РшкеШдеш Й.А. еЬ а1, 13023,то есть оказывать не прямое, а опосредованное действие. Проведенные модельные опыты для оценки влияния ВДВ на цихотоннческую реакцию XI показали,что нейраммнидааа и протеааа увеличивали активность очищенных препаратов ХТ в культуре клеток, однако не влияли на действие токсина после внесения в супернатанты холерогенных штаммов. По-видимому,усиление активности секретируемого токсина максимально обеспечивается ферментами, содержащимися в надосадочной жидкости вибрионов. ■ ;'■'■'

В наших исследованиях эндотоксин не оказывал влияния как ш» активность очищенных препаратов ХТ, так и в сс*гаве оупериатантоь п сочетании о другими БАЙ. Очевидно, что отмеченный рядом авторов факт усиления холерогеннаго действия ХТ в организме ° животного в присутствии ЛПС нельзя объяснить механизмом действия только на клеточном уровне.

О прямой влиянии • на результаты определения активности очищенных препаратов ХТ ыы можем говорить только в отношении цито-токсинов и протеаз. При соединении растворов (1:1) различных ио-пытуемых веществ и холерного токсина о последующим их титрованием и культуре клеток установлено суммарное мх действие в вид наложения клеточных реакций, характерных для наждого ьещеотва. Причем, цитотоксическая (деструкция клеток) и протеол>.¿-ичеокая (ок-руглкнме) маскировал^ эффект, обусловленный ХТ, В этом случае ре-

акция клеток на действие яолерогеиа (удлкн..ние) могла бмгь зарегистрирована, если титр ее активности был ты:о титра активности примесного вещества.

Для подтверждения сделанных вами- предварительных выводов исследовали 100 штамма холерных вибрионов различных биотипов, из ноторых ЗЭ были предварительно охарактеризован« как вирулентные vet-»-, еще 2 vet* штамма - явируленткые, остапьние ус1-штам( / оценены как слабовирулент11че(45) или авируя^нтные (14). После пкра-щивания штаммов в статических условиях из 39 вирулентных, с помощь» нульзуры илетпн было выявлено 33 тохеигенных. У 6 штаммов этой группы обнаружение XT било затруднено вследствие преобладающего действия цитотокемнов.Выращивание vct-поаитивныя штаммов с ' Дополнительной аэрацией способствовало выявлению уже 37 токенгеи-ных штаммов холерных вибрионов иа ЗЭ.Обнаружить токсин у остальных 2 вирулентных штаммов не удалось из-за выраженного действия протеаз (таблица).

Использование различных ре-ювюв культивирования позволило выявить наличие токсина в супернатактах штаммов независимо от сроков хранения (музейные, свежрвыделе1шые),и по суммарным результатам экспериментов все 39 штаммов было охарактеризованы кап тоисинопродугшрующие, а корреляция о вирулентностью бактериальных культур составляла 1,0. Супернатант > vet- штаммов холерных виери-онов, как и двух авирулентних vct+jHe обеспечивали специфической для XT реакции в культуре клеток.

Примечательно, что псе свежевцделенние штаммы V.eltor обладали значительной протеолиТической активностью по срацненин» с музейными ( поэтому такие штаммы следуе? виращивать в условиях ста-пионарного режима, при котором снижается количество протеаз в пс-пытанних суперчатантах холерных вибрионов и сводится и минимуму их реактивность в отношении гклеточных нультур.Музейные штаммы, как показывая«! нак'и исследования, • отдичамтся сравнительно ниапоЯ протеолитической активностью, .последняя не вйичла на результаты тестирования. Поэтому обнаружение гокоина у таких штаммов требует выраиикаии». в условиях аэрации, которые, кроке того, стхюбатвукт повышении) их тонсинопродуничн.К этой же группе иггаммов моино отнести все vet*- штампы V.cliolerae поп 01 .как свеиевыпеленные, и после хранения на нолу-лидком ar.-ijw. которые, нлрнду о иолеро-генностью. обладали гемолитической и цитотоисичес*ой акткнноотр-ми. особенно значительной при стационарном вырацивании.

Реаультати выя&ленки кжсинопродукцируюцих штаммов с помощь» культуры клеток CHQ и пробы Крейга при культивировании холерных вибрионов в ралнчиых условиях аэрации

Г I I Количество штаммов, продуцирующих XT |

IХарактерно- |Общее|"ш vitro" при культивировании 2 способам^

(тика групп |кол. {всего по 2 -;4 |культивирова-{культивирова1

J штаммов |шт. в¡способам куль- |иие с дополн.|ние в стаци-J

I (груп-|тивирования |аэрироианием ¡оиарных ус- |

I , |пе __j___КмуттелирЛ_I лоииих 1

\ I ¡гаю |Крейг |СН0 J Крейг |СНО (Крейг |

l_ 1-—J . L___I____\ ■ I___1_________t

I ША I I I! • I ' I

(вирулентные 13? |37 30 { 35 30 | 33 22 |

¡слабовиру- !• I I j I

¡лентнке | £ | 2 0 J 2 0 | 0 о |

Гашфуленг- | | | , | ,, i

!ниа I 2 I 0 ' О i 0 О I О О \

I Всего: ¡41 |39 30 ¡ 37 30 1 33 22 |

1._________I__1 ___L.__I ■ I '

\ I Г I . I 1

I vot' I I I i I

(слабовиру- j I I I J

¡лентные |45 | 0 0 | 0 0 J 0 0 j

|авирулеж- j I I V I

fH'JS» j 14 10 .0 I О 0|0 0|

' Всею: ISO I О О ¡0 О | О О Г

I_____I__-I-_:______1_______I______• J

В связи с вшеизложепиим, совершенно очевидно. что для ослабления влияния протеаз, гемолизина, дермотоясина на реакции ХТ с клетками ОГО и поввдения достоверности результатов тестирования токсинопродуцирущих штаммов вибрионов, необходимо использовать оба режикз культивирования, особенно, если речь идет о штаммах, предварительно не охарактеризованных.

Подобрашшо условия культивирования штаммов в большинстве случаен отвечали цели работм-виявлешм. токсигеннчх отаммов. однако, иногда нам не удавалось установить фе.чотипическое прояллешст экспрессии гена. Так, ми не обнаружит активности ХГ у двух лтш-рулонтнил vct+ итамкоз ни в одном из тестов. Кроме того, мы иаб-"людалн, что определенные воздействия (L-трансформация, длительное -хранения штаммов в воде, пассирование через иммунный организм, мутагенез) могут привести к временному сннксня» или утрате продукции токсина вибрионами, которые регистрировали как в культуре ¡меток тан и другая общепринятых методах обнаружения активности холерогена. В этом случав единственным методом обнаружения эниде-шг-iecioi значимых штзимов может быть только ДНК-гмбриднзацич.

Обобщение вышеизложенного материала дает основание констатировать , что метод культуры клеток эффективен и практически значим при тестировании штаммов, продуиирувдих хокскн в среду ку. ътиви-ровання.

Нам представляется, что введение в лабораторные исследования *метода.йлеточних культур ножет обеспечить существенное сокращение животных при решении вопросов, насаючихся обнаружения тонси-енншг штаммов; качественной jí количественно)! сценки биологической активности препаратов токсина различной степени очистки • и других биологически активных вв1честв холерного вибриона; определения лейтралгаугацеЛ активности иммунных сывороток и изучег-я взаимодействия токсинов.. ' ■

"••.'*'■'.'■ •*.'.•••'•• ''.*'"'•.'■ • ■ V выводы ^

1.Установлено, что из испытанны* монослойних клеточных культур (СН0-К1, Yero, Hela, Нер-2, l-929)наиболее чувствительной и действию холерного тонстша является СНО-Ki.Оптимизирована процедура тестирования токсина с максимальной чувстюггелыюсть» метода.

Z.Ha основе клеточных линий (CHO-Kl,Vero,Hela,Нер-2) проведена сцениа тдаюггности Отологически shthbhhs ведеств холерного

- 1в

вибриона и обнаружено, что гемолизины и дермотоксии являются цн-тотоисниэыи,вызывающими клеточную деструкцию. в отношении веек перевиваемых монослойных клеток; нейраминидаза и ЛПС характеризуется слабой ш«тотоксич1Юстью;для протеазы характерно обратимое действие на клетки,сопровождающееся их округлением без деструкции.

3.Ири испытании образцов, включающих одновременно холерный? токсин и биологически активные вещества холерного вибриона, «оказано. что а)нейраминидаза и протеаза 1 типа активирует действие токсина,б) выявление XX с помощью клеточной тест-системы затруднено, если цитотоксины и протеазы содержатся в испытуемых пробах в дозах, превышающих по активности холерный токсин вследствие камуфлирован я специфического для него удлинения клеток их округлением или деструкцией.

4.Негативное влияние протеаз и цитотоксинов, содержащихся в составе супернатантов бульонных культур холерных вибрионов на результаты оценки их токсинопродукции в культуре клеток можно преодолеть путем изменения условий культивирования штаммов:в стационарных условиях снижается уровень протеаз. в условиях шуттелиро-вашш - активность цитотоксинов.

5. На модели культури «леток СН0-К1 установлена зависимость Токсинопродукции различных по характеристике. штаммов холерных вибрионов от принадлежности их к биовару, степени вирулентности, сроков выделения, способов культивирования, стерилизации и хранения, а также показано влияние различных факторов внешней среды в эксперименте: Ь-трансформации, мутагенеза, длительного пребывания в воде и организме иммунного животного.

6.Разработан способ тестирования ХТ в присутствии биологически активных веществ холерного вибриона, который необходимо рекомендовать в широкую лабораторную практику для выявления токси-генных штаммов, продуцирующих токсин в среду культивирования.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ (10 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Помухина О.И., Уралева В.С.. Козырева Л.А. Сальникова О.И. Г'/Юлот-ическое де1!ствие дермонекротического фактора холерных вибрионов в эксперименте.// Акт.вопр.микробиол.,лаб.диагностики и профилактики холеры:те». Всесоюзн.иаучн.коиф. - Ростов и/Ь. 198в. -С.101-103.

2.Сальникова О.И..Лобанов В.В..Алексеева Л.П.,подосинкикова

Л.С.-ТеЬткрованле супернатаптоз бульонных культур колерных вибрионов на наличие холерного токсина с использованием овариальних клеток китайского хомячка СНО.//Ант.вопр.микробиол. ,лаб.диагностики н профилактики холеры: тез. Всесоизн, научи, конф.-Ростов Н/Д,1988.-С.80-89.

3.Помухина О.И., Уралеза B.C.. Козырева Л. А., Сальникова О. И.. Общетоксическое действие дермонекротического фактора холерных вибрионов.// Бактериальные токсины. 2-я Всесоюзн.конф.: Тез.-Юрмала.1989.-С.104.

4.Сальникова 0. И. .Рожков К.К., Алутин H.H., Марченков В.П., Алексеева Л.П., Новохатский A.C.. Влияние "мжмного" токсина на ¡зеревимемые культуры клеток.// Бактериальные токсины.2-я Зсесо-йзн.ибнф.: Тез.-Юрмала,1989.-С. 115.

5.Алексеева Л.П..Сальникова О. И..Лобанов 8.В..Оленичева Л. С. .Помухнна О.И.. Взаимодействие холерного токсина с культурой овариальних клеток китайского хомячка (СНО) в присутствии биологически активных вещесат» холерного-вибриона.// Бактериальные ток-' сшн. 2-я Всесоюзн. коиф.: Тез.-Юрмала, 1989. -С.3

6.Сальникова О.И., Лобанов В.В., Ииманюи Н.Я.. Использование культуры клеток СЬ'О при изучении холерных вибрионов, в проект* в различных условиях.//Микробиолог. жу;>н.-Клев*. 1991. - Н.б - С.94-99.

7.Рожков К.К..Сальникова О.И..Новохатский A.C..Алексеева Л.П..Марченков В.Л..Алутин И.М. "Способ определения активности '"мышиного" токсина чумного микроба".А/с. Н 1775472 от 15 июля 1992 года. * -

8.Помухина О.И., Уралева B.C., Сальникова О.И., Горина О.И.. Получение и характеристика токсиннейтралмзующих. антител к дермо-неиротичесиону фактору холерных вибринов. //Холера. Вопр.эпидеми-ол., мннробиолб. и лаб.задачи: Натер. Рос. научн. кенф./РПЧН -Ростов н/Д,1992. —-С. 85-Е7. ,

9.Сальникова О.И., Рожков К.К., Новохатский A.C., Алексеева Л.П., Нарченков В.И. Клеточная модель для изучения "мшимого" токсина воь^удителя чумы.//Орг-ция эпиднадзора при чуме и меры ео проф.: Метер. межгос.научн.-практ.конф. -Алма-Ата, 1992 - ч.1. -С. 141-150.

10.Сальникова О.И., Бабицин С.Н.Использование культур« клеток С1Ю для лпределения биологической активности НКАТ, полученных и холерному токсину.// 1 съезд иммунологов России, тез.докл. -Новосибирск.1992. - С.417.

ЕС) -

И.Атарова Г.Г., Помухина О.И., Козырева Л.А., Сальникова' О.Н., Ыишанькин Б.Н., Уралова B.C., Черепахина И. Я., Горша О.М.. Выделение дермонекротического фактор холерных вибриона,его серологические и другие свойства// 1 съезд иммунологов России, тез.докл. - Новоси(3нрск;1992. - с. 22.

12.Помухина О.Н., Уралева B.C., Сальникова О.И., Горина О. М..Токсиннейтралязующие антитела к дермонекротическому фактору холерных вибрионов.// 1 съезд иммунологов России, тез.докл. - ио-воск0ирск,1992. - С.373.

13.Водопьянов С.О., Мяшанькнн Б.Н., Олейникова H.H.. Ермоленко Т.Д., Сальникова О.И.: Разработка способа получения muían адгезии (лектина) чумного мнкройа//Виатеккология -1992. - 11.4. -С.18-21.

14.Сальникова О.И., Помухина O.K., Лодосшншкова Л.С.. Определение нейтрализующей активности иммунных сывороток к токсинам холерных вибрионов на модели культуры клеток.// Иимупол. и спец.проф.ООИ:Матер.Рос.научн.нонф. - Саратов,1993. - С.255.

15.Балахкова В.В., Сальникова О.И.. Выявление коклюшного токсина в коклюшном диализате in vitro на СНО-клетках// Кммунол. и спец,проф.ООН:tóatep.Рос.научи.ночф. - Саратов.1993. - С.301.

16.Помухина О.И.. Уралева B.C., Сальникова О.Н., Атарова .Г.Т., Горина О.Ы.. Дермотоксины патогенных вибрионов и их серологическое родство с дермотоксином возбудителя холеры// Иммунсл. и спец.проф.ООН:Натер.Рос.иаучн.конф. - Саратов,1993. - С.254.

17.Сальникова О.И., Подосинкикова Л.С., Воронежская Л.Г., Иванова Л.В., Телесманич II.Р., Глянько Е.В., Власов В.П.. Определение текснгешгости штамыов V.cholerae с помощь» культуры оварн-альных клеток китайского хомячка// Кури.микроб..зпидем. и иммун., - 1993. -N.6. - С.18-19.

18-Пригода A.C.. Коновалова Е.Ю., Сальникова О.И., Николенко О.Б., Алексеева Л.II., Иафеева P.C. Конструирование бессшюроточ-иой С{к*ды для культивирования клеток млекопитающих.>1.Культивирование перевиваемых клеток СН0-К1, Ve~o, L-929 и Hela, гибридом человека 61063 и 610А1 в питательных средах с низким содержанием сыворотки//Биотехнология. - 1993 - Н.7. - С.21-22.

Подписано к'пйЧои. /Л^г

'±оудат бумага 60 3.84. 1Д6'; 'Бумага- офоотигя. Начать оф>01пвл. Лоч. лист -'I

Заказ -836 тврэа --/СО

/