Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток"

На правах рукописи

¿¿¿¿¿¿Л

МАРКИНА Ольга Владимировна 003 16521Т

ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИНОПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE OI 11 VIBRIO CHOLERAE 0139 С ПОМОЩЬЮ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 9п

Ставрополь 2008

003165217

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении

здравоохранения Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени

научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Алексеева Людмила Павловна.

Официальные оппоненты доктор биологических наук, доцент

Жарникова Ирина Викторовна;

доктор медицинских наук, профессор Пожарская Виктория Олеговна.

Ведущая организация ФГУЗ Волгоградский научно-

исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится 2 апреля 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212 256 09 при Ставропольском государственном университете по адресу 355009, г Ставрополь, ул Пушкина, д 1,корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Ставропольского государственного университета

Автореферат разослан » Фг®/¿.¿и**/

2008 г

Ученый секретарь I /(ЛУ^ V-—

диссертационного совета 1А ч/^НХДлЛ^сО И В Ржепаковский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Своевременное определение токсигенности холерных вибрионов имеет большое значение при определении рационального объема противохолерных мероприятий В настоящее время в лабораторной практике для оценки эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae используют такие методы как ПЦР, ДНК-зондирование, тестирование на кроликах-сосунках, определение гемолитической активности по Грейгу и чувствительности к холерным фагам ctx+ и ctx" (М У 4 2 1097-02 Лабораторная диагностика холеры,2002)

Из вышеупомянутых методов достаточно широкое применение нашли мо-лекулярно-генетические и, в частности, ПЦР - анализ, который за 3-4 часа позволяет проанализировать значительное число проб Последний может быть использован в экспресс - диагностике для прямого выявления ДНК токсиген-ных штаммов от больных людей (Савельев В Н с соавт 2002, Касина ИВ с со-авт, 2003, Miyagi К et al, 1999), как ускоренный метод для идентификации подозрительных колоний, а также в научных работах и ретроспективном анализе с целью получения информации о вирулентности изолятов путем детекции фрагментов генов ctx A, tcp A, tox R, hapA, RS (Кутырев В В с соавт, 2000, Ефременко В И с соавт , 2003, Куличенко А Н с соавт , 2003, Водопьянов С О с соавт , 2006, Lyon W J et al, 2001, Karunasagar I et al, 2003, Lipp E К et al,

2003, Rivera IN et al, 2003, Gubala A J , 2006) Однако известно, что мутации в различных генах могут снизить и даже полностью исключить продукцию холе-рогена (Gardel С L et al, 1996, Haralalka S et al, 2003, Lauriano CM et al, 2004) В лабораторной практике часто используют и такие методы, как определение гемолитической активности вибрионов и определение чувствительности к фагам ctx+, ctx" В то же время известно, что среди нетоксигенных холерных вибрионов можно нередко обнаружить штаммы негемолитичные по фенотипу (Кюрегян А А с соавт , 2002, Лобанов В В с соавт , 2004), а некоторые штаммы ctx" могут оказаться чувствительными к фагам ctx+ (Безсмертный В Е с соавт ,

2004, Нановская Н Н с соавт, 2004) В связи с этим, эпидемический потенциал штаммов подтверждают другими методами, например, используя биологические модели, однако методы in vivo требуют использования лабораторных животных, применение которых в полевых условиях не всегда возможно

Альтернативой биологическим тестам считают культуру клеток Установлены индикаторные для холерного токсина (XT) клеточные линии, которые позволяют по изменению морфологии клеток определять активность токсина с чувствительностью 10-30 пг/мл (Сальникова ОИ, 1994, Guerrant RLet al, 1974) Однако в последнее время были обнаружены токсины, вызывающие удлинение клеток СНО-К1 подобно холерогену Cef (CHO-cell elongating factor), S-CEP (secreted CHO elongating protein), W07 (novel toxin) (Sanial S С et al, 1984, Walia К et al, 1999, McCardell В A et al, 2000, Bhattacharyya S et al, 2004) Иммунологическое отличие этих токсинов от холерогена можно подтвердить только с помощью иммунохимических методов

По мнению большинства исследователей, высокой специфичностью и чувствительностью отличаются некоторые варианты иммуноферментного анализа (ИФА) Среди них можно выделить следующие двойной антительный сэндвич-ИФА, где выявляемый холероген заключен между двумя слоями антитоксических антител (Bhadra R К et al, 1991), bead-ИФА - прямой метод выявления XT с применением полимерных носителей (Ramamurthy Т et al, 1992, 1996), GM1-ИФА с использованием в качестве твердой фазы планшетов, покрытых ганг-лиозидами GM1 (Honda Т et al, 1984, Clark G J et al, 1988) и др По данным зарубежных и отечественных авторов, чувствительность ИФА колеблется от 130 пг/мл до 10-50 нг/мл Поиск новых сорбентов привел к созданию новых улучшенных в практическом плане вариантов иммуноферментного анализа, где вместо полистироловых планшетов используются магнитные сорбенты (Покровский В И с соавт, 2000, Ефременко В И с соавт, 2003), пьезоэлектрические иммуносенсоры (Ewalt KL et al, 2001) Однако наиболее доступными в отечественной практике являются полимерные мембраны, в частности, нитро-целлюлозные (НЦМ) Последние очень удобны для проведения реакции, так как в порах из-за микроскопических размеров лучше происходят процессы мас-сообмена, что во много раз ускоряет кинетику реакции Так, чувствительность дот-ИФА относительно XT, по данным отечественных и зарубежных авторов, составляет от 10 до 160 нг/мл, а время проведения анализа сокращается до 2-3-х часов (Федорова В А с соавт, 1996, Девдариани 3 Л с соавт , 1999, Beutin L et al, 1984) К преимуществам иммуноферментного метода относятся также экс-прессность, возможность тестирования большого числа проб одновременно, сравнительно невысокая себестоимость анализа

Однако, данные отечественных авторов относительно чувствительности и специфичности различных вариантов ИФА достаточно противоречивы, так как целенаправленных исследований по их сравнительной оценке не проводилось Кроме того, мы не встретили отечественных публикаций, касающихся одновременного использования для тестирования холерного токсина культуры клеток и ИФА, как это принято в зарубежных лабораториях Мало сведений и в отношении тестирования ctx" штаммов Vcholerae 01 и Vcholerae 0139 на культуре клеток СНО-К1 Заслуживает внимания также выяснение возможных причин появления ложноположительных результатов при тестировании суперна-тантов ctx" штаммов холерных вибрионов как в ИФА, так и в культуре клеток СНО-К1

Цель работы изучение токсинопродуцирующей способности Vibrio chol-erae OI и 0139 серогрупп с использованием комплекса методов in vitro, включающего варианты сэндвич-иммуноферментного анализа и культуру клеток

Задачи исследования. 1 Отработать условия постановки различных вариантов сэндвич-ИФА на основе ганглиозидов GM1 и антитоксической сыворотки (GMl-ИФА, GM1-ДИА, СНО-ИФА) для тестирования XT, включающие подбор оптимального разведения антитоксической сыворотки и препарата XT, используемого в качестве положительного контроля, а также концентрации ганглиозидов и способа их адсорбции на пластике и нитроцеллюлозной мембране

2 Получить МКА к XT, оценить их специфичность и иммунохимическую активность

3 Отработать и оптимизировать постановку сэндвич-варианта ИФА-2АТ на основе МКА к XT и антитоксической сыворотки (АТС) для определения токсинопродуцирующих свойств штаммов холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп

4 Установить наиболее чувствительные монослойные клеточные линии в отношении цитотонического фактора Cef, токсина зонального поглощения (Zot) и гемагглютинин/протеазы (HA/P) Vcholerae Ol и V cholerae 0139

5 Сравнить специфичность и чувствительность методов in vitro, используемых для тестирования XT, и оценить возможные аспекты их применения

Научная новизна. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о возможности использования ганглиозидов GM1, нанесенных на нитроцеллю-лозную мембрану, в качестве твердой фазы для разработки нового варианта дот - иммунологического анализа -GM 1 -ДИА, позволяющего выявлять XT на уровне 75 нг/мл

Впервые для тестирования XT отработан новый вариант СНО-ИФА на основе клеток монослойной линии СН0-К1, богатых ганглиозидами, с чувствительностью около 1 мкг/мл

Созданы гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела классов G и М, направленные к эпитопам В-субъединицы XT, расположенным вблизи ганглиозид - связывающего участка, и блокирующие связывание токсина с рецепторами GM1 В результате целенаправленного скрининга выявлены моноспецифические антитела, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям ИФА, на основе которых отработан и оптимизирован ИФА-2АТ с чувствительностью 50 нг/мл

Анализ в иммуноблоте с помощью АТС, МКА к XT и МКА к ЛПС спектра белковых и углеводных компонентов супернатантов атоксигенных штаммов Vcholerae Ol и Vcholerae 0139, дающих ложноположительные результаты в ИФА, позволил выявить в их составе белковые соединения, вступающие в реакцию с антитоксическими антителами, по-видимому, из-за структурного сходства с отдельными эпитопами XT

Получены новые данные о токсинопродуцирующей способности штаммов Vcholerae eltor и Vcholerae Ol39 из коллекции музея Ростовского НИПЧИ Среди них выявлены активные продуценты, отличающиеся высокой стабильной продукцией холерогена m vitro независимо от срока их хранения

Впервые на монослойных перевиваемых клеточных линиях, имеющихся в Ростовском НИПЧИ, изучен биологический эффект дополнительных токсинов Vcholerae Ol и Vcholerae 0139, продуцируемых штаммами Escherichia coli, несущими рекомбинантные плазмиды со вставками генов cef, zot, гемагглютинин/протеазы Установлены наиболее адекватные клеточные модели для их тестирования, а именно L-929 и СНО-К1- для изучения цитотонического фактора Cef (CHO-cell elongating factor), CaCo-2- токсина зонального поглощения (Zonula occludens toxin), a CHO-K1, L-929, M-Hela, Hep-2, MDCK - гемагглюти-нин/ протеазы

Теоретическая и практическая значимость результатов исследований.

По материалам диссертации составлены и утверждены на Ученом совете Ростовского НИПЧИ методические рекомендации «Оценка способности холерных вибрионов продуцировать холерный токсин в условиях in vitro» (протокол №8 от 17 06 04), которые могут быть использованы для оценки токсинопродуци-рующих свойств штаммов Vcholerae Ol и Vcholerae 0139

Получены гибридомы-продуценты МКА к XT, из которых отобрано две, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям иммунофермент-ного анализа Штамм гибридомы GCT-4F7, секретирующий МКА к XT, депонирован в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской Коллекции клеточных культур 3 03 1999 г под номером РККК (П)654Д 26

Линии СНО-К1 и L-929 использованы для отбора рекомбинантных штаммов Е coli, продуцирующих биологически активный цитотонический фактор Cef (CHO-cell elongating factor) Штаммы Ecoli Jml03pCef61B, Jml03pCef69B, Jml03pCef49B, Jml03pCef31B, экспрессирующие клонированные гены cef Vcholerae Ol обоих биоваров, Vcholerae 013 и Vcholerae 0139 под контролем Pbad - промотора, депонированы в ГКПБ при Российском НИПЧИ «Микроб» в качестве охраноспособных под номерами КМ 188, КМ189, КМ190, КМ191(2005)

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Различные варианты ИФА на основе ганглиозидов GM1 и АТС (GMl-ИФА, GMl-ДИА) позволяют выявлять XT с чувствительностью примерно 75 нг/мл

2 Полученные гибридомы продуцируют моноклональные антитела к В-субъединице XT, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуно-блоте и в культуре клеток СНО-К1

3 На основе МКА к XT, в большей степени отвечающих диагностическим требованиям иммуноферментного анализа, разработан ИФА двойных антител (ИФА-2АТ) с чувствительностью порядка 50 нг/мл

4 Перевиваемые монослойные линии можно использовать для оценки биологического эффекта гемагглютинин/протеазы и таких дополнительных токсинов Vcholerae Ol и Vcholerae Ol39 как Cef и Zot наряду с клетками СНО-К1, традиционно применяемыми для обнаружения и количественного определения холерного токсина

5 Совместное применение культуры клеток и ИФА позволяет одновременно определить иммунохимическую и биологическую активность препаратов холерогена, выявить наибольшее число токсинопродуцентов Vcholerae Ol и Vcholerae Ol39

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всероссийских конференциях «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998), Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С -Петербург, 1998), конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 1999), Международной конференции

«Vibrio 2007» (Париж, 2007), на проблемных конференциях «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 1999-2003, 2005-2007)

Исследования выполнены в рамках плановых научных тем «Особенности токсинопродукции холерных вибрионов 0139 серогруппы и конструирование на основе их холерогена - токсина препаратов и тест-систем для диагностики холеры» (№ гос регистрации 01 200 1 15555), «Антигены поверхностных структур холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения» (№ гос регистрации 01 200 2 12989), «Совершенствование метода серологической идентификации холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп» (№ гос регистрации 01 200 2 12999), «Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия дополнительных токсинов (Zot и Асе) кассеты вирулентности холерных вибрионов» (№ гос регистрации 01 20 03 11548)

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано в соавторстве 23 научные работы

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, и списка литературы, включающего 254 работы отечественных и зарубежных авторов Работа иллюстрирована 10 таблицами и 22 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. В работе использованы культуры токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов из музея живых культур Ростовского НИПЧИ, в том числе штаммы Vcholerae eltor, выделенные от больных людей во время вспышки в г Казани в 2001 г Для определения токсинопродукции штаммы были выращены в бульоне Мартена (pH 7,6-7,8) и в среде AKI (pH 7,4-7,6) с дополнительным аэрированием по M Iwanaga (1986) Супернатанты получали на базе лаборатории микробиологии холеры Ростовского НИПЧИ путем осаждения клеток центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 минут В надосадочные жидкости вносили формалин до 0,025 M концентрации или мертиолят натрия до конечной концентрации 1 10000 и выдерживали 48 часов при 4°С Для тестирования в культуре клеток супернатанты обеззараживали добавлением гентамицина до конечной концентрации 0,5 мг/мл с последующей проверкой на специфическую стерильность

В иммунизациях, постановках различных вариантов ИФА и иммуноблот-тинге были использованы

- электрофоретически чистый препарат ХТ-569В («Calbiochem»),

- препарат ХТ-569, очищенный на D-галактозе по J Clemens (1979), любезно предоставленный к м н А Б Мазрухо,

- препараты ХТ Vcholerae classica 569В и Vcholerae 0139 Р-16064, очищенные методом ионообменной хроматографии путем бач-адсорбции на кар-боксиметилцеллюлозе (КМЦ) по JI С Оленичевой (1986), любезно предоставленные д м н В В Лобановым

Препарат ХТ-569В, очищенный на Б -галактозе, содержал 54% белка, а токсины, очищенные на КМЦ - 50% белка

Гипериммунные антитоксические сыворотки (АТС) любезно предоставлены зав лаб микробиологии холеры Ростовского НИПЧИ, к м н Б Л Мазрухо и с н с отдела диагностики ООН, к м н Л М Веркиной Определение активности и специфичности АТС проводили в твердофазном ИФА с использованием в качестве сенситинов препаратов ХТ-569 «Са1ЬюсЬеш», ЛПС-01 и ЛПС-0139

Определение холерогена в супернатантах холерных вибрионов проводили с помощью различных вариантов ИФА Для постановки ОМ1-иммуноферментного анализа (СМ1-ИФА) 1 мг сухого препарата ганглиозидов растворяли в 1 мл 70% этанола, после чего раствор вМ1 разводили до 5 мкг/мл в 0,05М карбонат-бикарбонатном буфере (КББ), рН 9,6, и в объеме 100 мкл вносили в лунки планшета Через 18 часов инкубации при 25°С лунки отмывали буфером (ФСБ-0,01% твин-0,5% БСА) и блокировали свободные сайты 1% раствором БСА в течение 30 минут Затем раствор удаляли и вносили на 60 минут (37 С) супернатанты, разведенные в ФСБ до 12-1 10 После отмывания лунок вносили на 60 минут АТС в подобранном рабочем разведении (1 10000) Планшеты отмывали и добавляли антикроличий пероксидазный конъюгат в разведении 1 1500 (Ин-т им НФ Гамалеи, Москва) Через 45 минут раствор удаляли, лунки отмывали дистиллированной водой и вносили субстратную смесь (0,4 мг/мл ортофенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,0, содержащем 0,0015% Н202) на 20 минут Реакцию останавливали 2М Н2804 и результаты учитывали с помощью фотометра (итякап, Великобритания)

ОМ 1 -дот-иммунологический анализ (ОМ1-ДИА), СНО-

иммуноферментный анализ (СНО-ИФА) и сэндвич - иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ) проводили аналогично ОМ1-ДИА, используя в качестве твердой фазы соответственно нанесенные на нитроцеллюлозную мембрану ганглиозиды вМ1 в концентрации 5 мкг/мл, (Владипор, Россия, БсЫе^ег & БсЬиеП, Германия), высушенные на дне лунок планшетов клетки СНО-К1(Ю6/мл) или сорбированные в лунках планшетов моноклональные антитела (5 мкг/мл)

Биологическую активность препаратов ХТ, осветленных ультразвуковых дезинтегратов штаммов Е сок 1гп103, несущих рекомбинантные плазмиды со вставками генов йхАВ, се£ ЫуА, ЬарА, г(А, и очищенного препарата гемагглю-тинин/протеазы, любезно предоставленных с н с лаб микробиологии холеры Ростовского НИПЧИ к б н Е В Монаховой, оценивали с использованием перевиваемых клеточных линий СНО-К1, Ь-929, М-НеЬа, СаСо-2, МБСК (1МВЬ-2) (Институт цитологии РАН, С -Петербург) и НЕр-2 (Институт вирусологии им Д И Ивановского, Москва) в соответствии с описанием метода О И Сальниковой (1994)

Слияние иммунных спленоцитов мыши с клетками плазмоцитомы N80/1 индуцировали обработкой клеточной суспензии полиэтиленгликолем (ПЭГ) 1500 («Мегск», Германия) в соответствии с методикой Рагекаэ <1е й а1 (1980)

Первичный скрининг МКА, изучение их активности, специфичности, определения изотипов проводили с помощью иммуноферментного набора для скрининга гибридом («Calbiochem») с использованием препаратов ХТ-01, ХТ-0139, клеток бактерий Vcholerae classica 569В и Vcholerae 0139 Р-16064, ЛПС-Ol и ЛПС-0139

Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных супернатан-тов гибридом и асцитных жидкостей мышей осуществляли преципитацией сульфатом аммония Очищенные препараты иммуноглобулинов консервировали добавлением мертиолата натрия до конечной концентрации 1 10000 и хранили при температуре -20°С

Разделение препаратов ХТ вели в SDS-электрофорезе в 15% ПААГ (ЮмА, 2 часа) по V К Laemmli (1970) с последующим электропереносом на нитроцел-люлозную мембрану (1,5 часа 55мА) (Towbin Н, 1984) Для обработки имму-ноблотов использовали полученные в результате гибридизаций МКА к ХТ, МКА к ЛПС-0139, а также АТС-01 и АТС-139 Визуализацию реакции проводили с помощью антимышиного или антикроличьего пероксидазного конъюга-та, соответственно, и ДАБ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общеизвестно, что специфичность и чувствительность как цитологических, так и иммунохимических методов находятся в прямой зависимости от качества используемых реагентов и в первую очередь — токсинов и антитоксических сывороток В связи с этим первоначальным этапом работы явился отбор и характеристика имеющихся в нашем распоряжении кроличьих гипериммунных АТС, полученных к очищенным препаратам холерного токсина Из ATC-Ol наиболее активной оказалась сыворотка сер 581, с антитоксическим титром равным 1 25000, полученная в результате иммунизации кроликов препаратом ХТ-569В, очищенным по методу J Clements (1979) с использованием D-галактозы Изучение с помощью иммуноблоттинга спектра иммуноглобулинов, содержащихся в данной сыворотке, показало, что она в разведении 1 5000 выявляет в препаратах ХТ-01 и ХТ-0139, очищенных на карбоксиметилцеллюло-зе, только зону на уровне 54-56 кД, соответствующую молекулярной массе (мм) холерогеноида, свидетельствуя о том, что основной пул антител в сыворотке индуцирован холерогеном В нашем распоряжении были и АТС к ХТ-0139 Среди них наиболее активной в ИФА оказалась сыворотка с антитоксическим титром - 1 40000 (сер 527), полученная к ХТ V cholerae 0139 Р-16064, очищенному на КМ- целлюлозе Данная АТС также была исследована в имму-ноблоттинге Из его результатов следует, что сыворотка-0139 окрашивает в препаратах ХТ Vcholerae classica 569В и Vcholerae 0139 Р-16064, очищенных на КМЦ, зону в районе 54-56 кД, соответствующую м м холерогеноида Кроме этого, АТС-0139 в ХТ-0139 выявляет зону липополисахарида (ЛПС) и в обоих препаратах токсинов - различные белки Таким образом, АТС-0139 содержит помимо иммуноглобулинов к ХТ антитела к ЛПС-0139 и к белкам, общим для вибрионов обеих серогрупп Исходя из результатов иммуноблоттинга, наиболее

специфичной оказалась ATC-Ol (сер 581), поэтому она и была использована в дальнейших постановках ИФА

Среди иммуноферментных способов детекции холерного токсина наиболее часто в зарубежных и отечественных исследованиях используется ИФА на основе ганглиозидов GM1 (GMl-ИФА), поэтому этот вариант ИФА и был нами апробирован для обнаружения и количественного определения XT в надоса-дочных жидкостях бульонных культур холерных вибрионов 01 и 0139 серо-групп Первоочередной задачей отработки метода было определение оптимальных условий сорбции ганглиозидов на пластике С этой целью подбирали буфер для разведения ганглиозидов, их концентрацию, температурный режим и продолжительность сенсибилизации на полистироле В качестве положительного контроля использовали препарат ХТ-569В, очищенный на D-галактозе, так как согласно характеристике он был более активен, чем XT «Calbiochem» и не содержал в своем составе примесей других белков (электрофоретически чистый) Для выявления холерогена использовали АТС-01 (сер 581) в разведении 1 10000 и антикроличий конъюгат В результате, было установлено, что оптимальными условиями являются доза ганглиозидов, растворенных в 0,05 М кар-бонат-бикарбонатном буфере, рН 9,6, равная 5 мкг/мл, продолжительность сенсибилизации - 18 часов при 25°С В этом случае нам удавалось выявить примерно 75 нг/мл XT

Для оценки специфичности GMl-ИФА использовали супернатанты холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп и культуральные жидкости 11 штаммов гетерогенных микроорганизмов 3-Escherichia colt, 2-Yersmia pestis, 2-Yersima enterocolitica, 2-Yersiniapseudotuberculosis, 2-Shigella Установлено, что ни один из супернатантов гетерологичных штаммов не дал положительных результатов в GMl-ИФА

После отработки данный метод был использован при тестировании 30 све-жевыделенных от человека в 2001г в г Казани штаммов V cholerae eltor (ctx+) Бесклеточные надосадочные жидкости вибрионов, выращенных в бульоне Мартена, были обеззаражены и протестированы в разведениях 1 2-1 10 Количество XT в супернатантах определяли по калибровочной кривой, построенной относительно препарата ХТ-569В В результате, холерный токсин в количестве 150-350 нг/мл был обнаружен в супернатантах 27 штаммов Vcholerae eltor, что соответствует 90% В супернатантах трех штаммов холероген не был выявлен, возможно, из-за слабой токсинопродукции Тестирование вибрионов повторили через 6 месяцев после хранения на полужидком агаре и обнаружили снижение их токсинопродуцирующей способности более чем в 2 раза, при этом XT не выявили в супернатантах уже 9 штаммов, процент обнаружения токсинопроду-центов составил 70%

Этот факт послужил основанием для оценки токсинопродуцирующей активности штаммов, хранящихся более длительное время Наличие токсина в надосадочных жидкостях 18 штаммов V cholerae eltor (17ctx+ и 2 ctx") из коллекции музея Ростовского НИПЧИ исследовали с помощью GMl-ИФА Штаммы выращивали на среде AKI с активным аэрированием по М Iwanaga (1986), разводили 1 2-1 10 и тестировали в GMl-ИФА В результате, холероген был

выявлен в 7 из 9 супернатантов штаммов У.сИокгае еког, выделенных от человека, и в 3-х из 7 супернатантах У.сИокгае еког, выделенных из воды, т.е. из 16 сЛх+ штаммов только 10 продуцировали ХТ в среду культивирования. Как видно, нам удалось выявить холероген в надосадочных жидкостях в общей сложности у 62,5% штаммов. Максимальное количество ХТ, на уровне 3,8-5,5 мкг/мл, было зарегистрировано в супернатантах У.сИокгае еког 1781, У.ско1егае еког 18826, У.сИокгае еког 18847. В супернатантах некоторых вибрионов холероген содержался в концентрации менее 150 нг/мл. Очевидно, что условия и продолжительность хранения вибрионов существенно сказываются на их способности продуцировать холероген, и, соответственно, на эффективности выявления токсинопродуцентов. Так с помощью ОМ1-ИФА мы обнаружили холероген в надосадочных жидкостях свежевыделенных холерных вибрионов в 90% случаев, тогда как тестирование штаммов из музея позволило вывить ХТ в супернатантах только 62,5% штаммов.

Известно, что вибрионы классического биотипа характеризуются наилучшей продукцией холерогена в среде ЬВ при 30°С, а вибрионы эльтор и 0139 - в среде АК1 с активным аэрированием при 37°С. В отечественной лабораторной практике культивирование штаммов У.сИокгае 01 и У.сИокгае 0139 для определения их токсинопродуцирующих способностей чаще всего проводят в бульоне Мартена и в щелочном мясо - пептонном бульоне. Для того чтобы выяснить, насколько состав среды влияет на токсинопродуцирующую способность вибрионов, мы с помощью СМ1-ИФА протестировали супернатанты 5 штаммов У.сИокгае с1аззка (с1х+), 17 штаммов У.сИокгае еког (с1х+), 10 штаммов У.сИокгае 0139 (йх+) из музея Ростовского НИПЧИ, выращенных одновременно в среде АК1 и в бульоне Мартена с активным аэрированием. В результате показано (рис.1), что культивирование штаммов У.сИокгае еког и У.сИокгае 0139 (с1х+) на среде АК1 является наиболее оптимальным, так как в этом случае было обнаружено наибольшее число токсинопродуцентов. При выращивании вибрионов в бульоне Мартена количество выявленных штаммов У.сИокгае еког и У.сИокгае 0139 было ниже. Необходимо отметить, что штаммы У.сИокгае Ыаяйка отличались высокой токсинопродуцирующей способностью как в случае культивирования их в среде АК1, так и в бульоне Мартена, поскольку число выявленных токсинопродуцентов составило 100%.

Рис. 1. Процент выявления штаммов У.сИокгае, выращенных в среде АК1 и в бульоне Мартена: 1. У.сИокгае с!аз$1са, 2. У.сИокгае еког, 3. У.сИокгае 0139.

Оценка токсинопродуцирующей активности штаммов У.с!ю1егае в СМ1-ИФА

Таблица 1

Штамм Разве- Активность в вМ 1-ИФА

№ Наличие Источник Место выделе- Год выделения дение су- ОП реакцион- Коли-

УсИо1егае генов йх выделения ния пер- Визуаль- чество

еког натанта ный учет ной смеси, 450 ХТ,

им мкг/мл

1 13762 + человек Ташкент 1988 1 2 + 0,399 0,15

2 8425 + человек Ростов/Дон 1974 1 2 - 0,215 <0,15*

3 17391 + человек Дагестан 1994 1 10 3+ 0,862 3,8

4 1781 + человек Индия 1963 1 10 4+ 0,987 5,5

5 18895 + человек Москва 2005 1 10 2+ 0,445 0,8

6 18746 + человек Башкортостан 2004 1 10 2+ 0,413 0,7

7 18826 + человек Тверь 2005 1 10 4+ 1,087 5,7

8 1132 + человек Пакистан 1958 1 2 - 0,237 <0,15

9 2044 + человек Ирак 1966 1 10 2+ 0,424 0,75

10" ~12019 + вода р Темерник " 198 Г Т2 - 0,228 <0Л 5

11 17480 + морск вода Сочи 1996 1 2 + 0,397 0,15

12 18375 + вода Казань 2001 1 2 - 0,208 <0,15

13 18367 + сточн вода Ростов/Дон 2001 1 2 - 0,215 <0,15

14 18368 + вода рДон 2001 1 2 - 0,218 <0,15

15 17917 + вода рДон 1999 1 10 2+ 0,420 0,75

16 18847 + вода р Нева 2005 1 10 4+ 0,986 5,0

17" 18897 - вода р Темерник 2006 12 - 0,247 -

18 18896 _ - вода Азов 2006 1 2 - 0,270 -

19 Среда АК1 1 2 - 0,155 -

Примечания

1- *токсина менее 0,15 мкг/мл

2- Визуальная оценка в ИФА «4+», «3+», «2+», «+»- интенсивность окрашивания лунок, «-»-реакция отрицательная

Дот-иммунологический анализ, являющийся разновидностью ИФА - наглядный пример экспрессного метода обнаружения антигена, так как время проведения анализа сокращено до нескольких часов, а его постановка не требует наличия специального оборудования. Использование нами ганглиозидов СМ1, сорбированных на нитроцеллюлозной мембране, позволило разработать новый вариант метода - ОМ1-ДИА. В процессе отработки метода было установлено, что интенсивной окраски пятен контрольного препарата холерного токсина можно достичь в случае разведения ганглиозидов в фосфатно-солевом (рН 7,4) буфере. Оптимальной дозой СМ1 является 5 мкг/мл. Как следует из рисунка 2, одновременное титрование контрольного препарата ХТ-569В и суперна-тантов штаммов У.сИо1егае 01 и У.скокгае 0139 позволяет ориентировочно определить количество холерогена в тестируемом образце, поскольку количество холерогена коррелирует с интенсивностью окраски пятен на НЦМ. Чувствительность йМ1-ДИА относительно ХТ-569В составила около 75 нг/мл ХТ.

Тестирование супернатантов 20 штаммов У.сИо1егае еког (с1х+), 10 штаммов У.сИо1егае 0139 (с1х+) из музея Ростовского НИПЧИ показало, что процент обнаружения в ОМ1-ДИА токсинопродуцентов, выращенных в бульоне Мартена, аналогичен ОМ1-ИФА - порядка 50% для вибрионов эльтор и около 30% для У.ско1егае 0139. Преимуществом СМ1-ДИА является возможность тестирования большого числа проб одновременно на небольшом участке мембраны с последующим сохранением результатов реакции в течение длительного срока. Он имеет и более высокую скорость проведения анализа - порядка 2-3 часов.

4 О 0 &

Б ¡т' т С ГЗ &

& 1 г *

Г >

Д @ и ч У р

Рис. 2. Результаты тестирования супернатантов штаммов V. ско1егае 01 и К сИо1егае 0139. У.МегаеО 1 (йх+): А) У.сИЫегае с1а.мса 1,569В, 2.1076, 3. 1380,4.1388; 5.1385;

Б) У.сШегае е11ог 1.2044,2.14455, 3.14383,4.14388, 5.14460; V.сИо1егае 0139 (с1х+): В) 1. 16064, 2.16063, 3.17258, 4.17259, 5.16077; У.скокгае еПог (йх-): Г) 1. 14246,2.17479,3.17480,4.18530,5.18325; ХТ-569В, мкг/мл: Д) 1. 1,5,2.0,15, 3.0,075,4.0,037,5.0,018.

Однако коммерческие препараты ганглиозидов не всегда доступны, а получение их в лабораторных условиях длительно и трудоемко. В то же время в литературе есть данные о возможности использования в ИФА в качестве твердой фазы клеточных культур (Носик Д.Н. с соавт., 1985; Буркин М.А. с соаят., 1997). В связи с этим на следующем этапе работы был апробирован вариант ИФА с использованием клеток монослойной линии СНО-К1, богатых ганглио-

зидами GM1 В процессе отработки метода применяли различные приемы сорбции клеток на пластике Установлено, что сенсибилизация панелей клетками СНО-К1 без их фиксации не эффективна, так как в процессе анализа клетки смываются Прочного связывания клеток СНО-К1 с пластиком достигали только путем их фиксации с помощью 0,25% глютаральдегида в течение 5-7 минут Увеличение концентрации клеток от 1 до 3 млн/мл и времени их контакта с токсином от 2 до 18 часов, а также обработка клеток СНО-К1 нейраминидазой («Serva») для увеличения числа доступных рецепторов не обеспечило значительного повышения чувствительности метода В результате установлено, что чувствительность СНО-ИФА находится на уровне 1 мкг токсина/мл, то есть он не может быть использован для тестирования супернатантов холерных вибрионов, продуцирующих менее 1 мкг ХТ/мл

Как видно, нами было апробировано 3 различных варианта ИФА с применением ганглиозидов GM1 Наиболее чувствительными оказались варианты GMl-ИФА и GMl-ДИА, которые позволяют выявлять холероген в супернатан-тах ctx+штаммов V cholerae 01 и V cholerae 0139 на уровне примерно 75 нг/мл Обращает внимание факт, что в обоих вариантах метода регистрировали 1015% ложноположительных результатов при тестировании атоксигенных штаммов Учитывая вышепредставленные результаты иммуноблоттинга, согласно которым в составе АТС-01 содержатся только иммуноглобулины к холерогену, мы предположили, что какие-то биологически активные соединения из супернатантов имеют эпитопы, структурно сходные с ХТ, в результате чего и вступают в реакцию с сывороткой Для решения этого вопроса нам представлялось уместным применение в ИФА наряду с АТС таких высоко специфических реагентов, как моноклональные антитела к отдельным эпитопам холерогена, в связи с чем были проведены работы по их получению

Мышей BALB/c иммунизировали препаратами ХТ, очищенными методом ионообменной хроматографии путем бач-адсорбции на КМЦ, так как количество имеющихся в нашем распоряжении высокоочищенных препаратов ХТ-569В было ограничено Как известно, препараты токсинов, очищенных данным способом, кроме холерогена содержат примеси других белков и определенное количество ЛПС, между тем, используя токсины-сырцы, удавалось получать достаточно активные специфические кроличьи антитоксические сыворотки (Дер-тева И И с соавт., 1972, Лобанов В В с соавт , 1994, Мазрухо А Б , 1997) Однако в наших экспериментах мы установили, что присутствие липополисахари-да в препаратах XT-Ol и ХТ-0139, очищенных на КМЦ, способствовало накоплению в селезенках мышей В-лимфоцитов, активно продуцирующих антитела не только к ХТ, но и к ЛПС При этом титры антител к ХТ составили около 1 10000-1 20000, тогда как титры иммуноглобулинов к ЛПС-Ol - 1 1000-1 3000, а к ЛПС-0139- 1 5000-1 10000 Проведение гибридизаций позволило получить и исследовать антителопродуцирующую активность в общей сложности 300 первичных культур Как следует из результатов таблицы 2, было получено 3 группы моноклональных антител 1- МКА к холерогену, 2- МКА к ЛПС-Ol, 3-МКА к ЛПС-0139 Наибольшее количество гибридом - продуцентов МКА к ХТ, порядка 8%, получено при иммунизации XT-Ol, в случае использования

ХТ-0139 - выход гибридом оказался несколько ниже - 4% В то же время процент гибридом, продуцирующих МКА к ЛПС-01, составил около 2%, тогда как выход гибридных клонов-продуцентов МКА к ЛПС-0139, оказался наиболее высоким - примерно 10%

Таблица 2

Результаты скрининга МКА в ИФА __

Взаимодействие в ИФА с антигеном Эффективность

МКА XT «Calbiochem» ЛПС-01 ЛПС-0139 гибридизации, %

1группа XT-Ol + 8

ХТ-0139 + - - 4

2 группа ЛПС-Ol + _ 2

3 группа ЛПС-0139 _ _ + 10

Примечание «+» - наличие реакции, «-» - отсутствие реакции

В течение первых 2-3-х недель пассирования большая часть гибридом-продуцентов МКА к XT утратила антителообразующую способность, и поэтому в массовую культуру было выведено только 5 гибридных клеточных линий, отличавшихся активной пролиферацией и стабильной продукцией иммуноглобулинов при культивировании in vitro

Все МКА к XT взаимодействовали в ИФА с обоими препаратами XT-Ol и ХТ-0139, свидетельствуя о том, что они выявляют общие эпитопы токсинов обеих серогрупп Так как мы не располагали препаратами отдельных субъединиц холерогена, то для выяснения к какой из субъединиц XT получены моноспецифические антитела, препарат ХТ-569В был разделен в SDS-электрофорезе, перенесен на нитроцеллюлозную мембрану и обработан МКА к XT Ранее G J Clarke etal (1988) при постановке иммуноблоттинга с помощью антитоксической сыворотки выявили зоны, соответствующие В5-ХТ, на уровне 62 кД и В4-ХТ - на уровне 44 кД В А Федоровой с соавт (1996) было показано, что МКА к В-субъединице окрашивают область в препарате XT примерно на уровне 56 кД Аналогично в нашем эксперименте МКА к XT 2СЗ, 4ЕЗ и 4F7 выявляли общую полосу в районе 56-60 кД, которую можно отнести к зоне пентамера В5-ХТ, а также линию на уровне 44 кД, принадлежащую, по-видимому, к В4-субъединицам XT

В соответствии с задачами работы мы оценили способность полученных МКА вступать в реакцию с XT после его взаимодействия с ганглиозидами GM1 Для этого 96-луночные планшеты в течение ночи сенсибилизировали ганглиозидами GM1, затем блокировали свободные сайты 1% раствором БСА, после чего в каждую лунку планшета вносили по 50 мкл раствора XT Через 60 миунт инкубации планшеты отмывали и добавляли раствор МКА к XT и далее анализ проводили по обычной схеме GMl-ИФА, описанной в «Материалах и методах» Оказалось, что МКА не взаимодействовали с холерным токсином по-

еле связывания его с ганглиозидами, по-видимому, из-за направленности их к эпитопам XT, расположенным близко к рецепторному участку

При дальнейшем выборе методов обнаружения токсигенных штаммов, где могут быть применены МКА, наиболее приемлемым оказался вариант сэндвича, так называемого, ИФА двойных антител Первоначально были определены сенсибилизирующие свойства МКА Степень связывания МКА с полистиролом оценивали по интенсивности окрашивания лунок в результате взаимодействия иммуноглобулинов с антителами антимышиного конъюгата Установлено, что для всех типов исследованных МКА оптимальными условиями сенсибилизации были концентрация антител- 5 мкг/мл в 0,05М КББ, продолжительность сенсибилизации - в течение 2 часов при 37°С и затем - в течение ночи при 4°С Однако при постановке ИФА-2АТ, по схеме описанной в «Материалах и методах», оказалось, что из пяти только три МКА (4F7, ЗВ7, 4ЕЗ) после сорбции на пластике оставались способными затем вступать в реакцию с холерогеном Два других МКА после связывания с полистиролом утратили способность взаимодействовать с токсином Возможно, это связано с конформационными изменениями иммуноглобулинов, нанесенных на пластик, так как известно, что некоторые белки сорбируясь на полистироле, могут претерпевать структурные изменения (Friguet В et al, 1984, McCullough КС et al, 1985, Vaidya et al, 1985) С учетом полученных данных, для постановки ИФА-2АТ отобрали из 5 только 3 МКА Определение чувствительности метода относительно ХТ-569В показало, что она зависит от сенсибилизирующей способности МКА Так, в случае применения МКА 4F7 она равнялась примерно 50 нг/мл, при использовании 4ЕЗ и ЗВ7- около 75 нг/мл Очевидно, это обусловлено различной аффинностью МКА, или конформационными изменениями иммуноглобулинов в процессе сорбции их на пластике В качестве оптимальной нами была принята сенсибилизация лунок моноклональными антителами гибридомы 4F7 в концентрации 5 мкг/мл, разведенными в КББ (рН 9,6) Специфичность данного метода была подтверждена при изучении культуральных жидкостей 11 штаммов гетерогенных микроорганизмов (Escherichia coll, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella)

При тестировании в ИФА-2АТ 26 супернатантов ctx+ штаммов V cholerae classica, V cholerae eltor и V cholerae 0139 из коллекции музея Ростовского НИПЧИ, выращенных в среде AKI по Iwanaga (1986), установлено, что все штаммы классического биовара активно продуцировали XT в среду культивирования - на уровне 5-7 мкг/мл Количество XT, продуцируемого штаммами V cholerae eltor и V cholerae 0139, было несколько ниже -2-4 мкг/мл

При изучении в этих же методах 14 супернатантов ctx" штаммов V cholerae были получены ложноположительные результаты примерно в 15% случаев Очевидно, в испытуемых АТС присутствуют иммуноглобулины, связывающиеся с какими-то белками из супернатантов Наиболее интенсивное окрашивание реакционной смеси (на «2+») регистрировали при тестировании супернатанта штамма Vcholerae eltor 9898 (ctx"), выделенного от человека С целью сравнения белкового спектра супернатантов V cholerae eltor 9898 и V cholerae classica 569В белки из надосадочных жидкостей были осаждены с помощью сульфата

аммония, разделены в SDS-ПААГ и перенесены на мембрану После обработки НЦМ препаратами моноклональных антител к XT в препарате Vcholerae classica 569В выявлены зоны, соответствующие В5- и В4-субъединицам холе-рогена Реакции МКА с препаратом Vcholerae eltor 9898 не было зарегистрировано В то же время АТС-01 в разведении 1 5000 в препарате Vcholerae eltor 9898 окрашивала две зоны, первая - на уровне 44-46 кД, вторая - примерно 3640 кД (отсутствующая у Vcholerae classica 569В) Как следует из результатов иммуноблоттинга, АТС, полученная к ХТ-569В, очищенному на D-галактозе, в препарате Vcholerae eltor 9898 выявляет белковые детерминанты, отсутствующие у холерогена Этот факт свидетельствует о том, что иммуноглобулины АТС (сер 581) взаимодействуют с белком, имеющим эпитопы, структурно сходные с XT Для сравнения во всех трех постановках ИФА использовали антитоксическую сыворотку-Ol (сер 474), полученную к XT «Calbiochem», любезно предоставленную с н с отдела диагностики ООИ, к м н J1 М Веркиной Активность ее, по данным твердофазного ИФА, была ниже, чем у ATC-Ol (сер 581) - не более 1 10000 Однако, использование данной сыворотки, позволило полностью исключить ложноположительные результаты Высокую специфичность АТС можно объяснить тем, что коммерческий препарат токсина не содержал посторонних примесей

Следовательно, ложноположительные результаты в ИФА могут быть обусловлены использованием антитоксических поликлональных сывороток, включающих иммуноглобулины к ЛПС, которые вступают с ним во взаимодействие при тестировании супернатантов гомологичных штаммов V cholerae, к белкам, общим для вибрионов Ol и 0139 серогрупп, а также, к белковым соединениям, имеющим эпитопы структурно идентичные отдельным эпитопам XT

Как нами было показано, чувствительность отработанных вариантов ИФА составляет примерно 50-75 нг/мл Некоторые штаммы Vcholerae продуцируют холероген in vitro в гораздо меньшей концентрации Для того чтобы его выявить, необходимо использовать более чувствительные методы, в частности, цитологические Среди монослойных клеточных линий наиболее чувствительной в отношении XT является культура клеток СНО-К1, позволяющая выявлять пикограммовые количества токсина (Guerrant R L et al, 1974), а так как большинство штаммов V cholerae продуцируют холерный токсин в среду культивирования в малых количествах, то, очевидно, что он позволяет обнаружить максимальное число токсинопродуцентов Титрование имеющегося в нашем распоряжении ХТ-569В, очищенного на D-галактозе, показало, что минимальное количество XT, которое может быть выявлено в культуре СНО-К1, составляет 5 нг/мл При первичном тестировании супернатантов 30 свежевыделенных от больных людей штаммов V cholerae eltor (ctx+) во время вспышки в г Казани в 2001 г на модели СНО-К 1 процент положительных реакций составил только 83,3% В пяти супернатантах (16,7%) XT не был выявлен из-за их токсичности, вызывающей гибель клеток СНО-К 1 Ранее О И Сальниковой (1994) было установлено, что цитотоксичность супернатантов обусловлена наличием в них гемолизина, больших количеств ЛПС и нейраминидазы В нашем эксперименте цитотоксическая активность образцов исключалась только с помощью высоко-

IS

специфической сыворотки, полученной к очищенному препарату цитолизина, что и позволило затем выявить холерный токсин в остальных пробах Специфичность реакции удлинения клеток под действием XT подтверждали с помощью МКА к XT и АТС-OI

Так как штаммы, длительно хранящиеся в лиофилизированном состоянии, обладают низкой способностью продуцировать холероген in vitro, то нами была оценена токсинопродуцирующая активность 20 штаммов V cholerae eltor (ctx+), 10 штаммов Vcholerae 0139 (ctx+) и 4 штаммов Vcholerae non01/non0139 (ctx+) из музея Ростовского НИПЧИ Штаммы были выращены на среде AKI по М Iwanaga, обеззаражены и раститрованы в культуре клеток СНО-К1 В результате, при первичном тестировании мы не смогли обнаружить XT в 20% случаев из-за гибели клеток, в 15% случаев - по причине их округления, вызываемого протеазами и компонентами цитотоксического комплекса RTX В су-пернатантах 10% штаммов Vcholerae (ctx+) холероген вообще не был выявлен из-за низкого его содержания - менее 5 нг/мл После нейтрализации цитотоксического эффекта супернатантов с помощью антицитолизиновой сыворотки удлинение клеток было зарегистрировано под действием супернатантов в 75% случаев

Кроме этого при тестировании супернатантов атоксигенных штаммов Vcholerae в ряде случаев регистрировали удлинение клеток СНО-К1, свидетельствующее о наличии в исследуемых образцах каких-то цитотонических факторов Нейтрализации эффекта удлинения клеток с помощью АТС-OI и МКА к XT не наблюдалось, что дает основание говорить о продукции штаммами токсина, отличного от холерогена К настоящему времени установлено, что такой биологический эффект в культуре клеток регистрируют под действием цитотонического фактора Cef (CHO-cell elongating factor) (McCardell В A et al, 2000), и как было показано Е В Монаховой с соавт (2005), его ген часто обнаруживается в геномах штаммов Vcholerae Предположив, что в тестируемых образцах может содержаться данный токсин, в культурах клеток СНО-К1 и L-929 были изучены осветленные ультразвуковые дезинтеграты штаммов Е coli, несущих рекомбинантные плазмиды со вставками генов cef Оказалось, что изучаемые препараты вызывали удлинение клеток сходно с тем, что мы наблюдали при тестировании некоторых ctx" штаммов Vcholerae (рис 3).

Полученные результаты послужили основанием для изучения в культуре клеток других токсинов холерного вибриона с целью оценки их влияния на процесс тестирования холерогена Исследование в культурах клеток дезинте-гратов штаммов Ecoli, несущих рекомбинантные плазмиды со вставкой гена Zot- токсина Vcholerae, позволило установить, что он не вызывает явных морфологических изменений отдельных клеток СНО-К1 На основании этого нами сделан вывод о том, что данный токсин существенно не влияет на результаты тестирования холерогена в культуре изолированных клеток СНО-К1 Тестирование очищенного препарата гемагглютинин/протеазы показало, что она достаточно быстро, в течение 1-3 часов, вызывает округление клеток Это приводит тому, что действие холерогена маскируется, и он может остаться не выявленным

f

Рис. 3. Морфологические изменения клеток СНО-К1 под действием цитотонического фактора Cef и гемагглютинин/протеазы: 1-исходная морфология клеток, 2-клетки под действием Cef, 3-клетки под действием гемагглютинин/протеазы.

Таким образом, результаты проведенной работы позволяют заключить, что чувствительность методов ИФА относительно свежевыделенных холерных вибрионов составляет не менее 90%, что позволяет их рекомендовать для выявления и количественной оценки токсинопродуцирующей способности холерных вибрионов. Каждый из вариантов метода имеет свои преимущества и может быть применен в зависимости от конкретных задач исследования. Так, GMl-ДИА отличается наиболее высокой скоростью постановки реакции, возможностью применения в полевых условиях, а ИФА-2АТ - более высокой чувствительностью. В случае сомнительных результатов, не совпадающих с данными других методов, в частности, ПЦР в работу необходимо привлекать другие более чувствительные тесты, например, культуру клеток СНО-К1. Комплекс методов, включающий варианты сэндвич - ИФА и культуру клеток, способствует и обеспечивает более эффективное выявление токсигенных штаммов V.cholerae Ol и V.cholera 0139, позволяет значительно снизить процент ложно-положительных результатов и получить ответ на вопрос о возможной продукции штаммами V.cholerae дополнительных токсинов.

1. Отработаны и оптимизированы условия постановки сэндвич - ИФА и дот-иммунологического анализа на основе ганглиозидов СМ1 и антитоксической сыворотки для обнаружения и количественного определения холерного токсина в надосадочных жидкостях холерных вибрионов 01 и 0139 серо-групп с чувствительностью около 75 нг/мл.

2. Получены стабильные культуры гибридом, продуцирующие моноклональ-ные антитела к В-субъединице холерного токсина, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуноблоте и в тесте нейтрализации холерогена в культуре клеток СНО-К 1.

3. Отобраны наиболее значимые диагностические МКА к ХТ, определена их оптимальная концентрация и условия сенсибилизации на планшетах для постановки ИФА-2АТ, который позволяет оценить токсинопродукцию штам-

выводы

мов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с чувствительностью 50 нг/мл

4 Сравнительные исследования показали что, наиболее чувствительным является вариант ИФА-2АТ, позволяющий со специфичностью 85-95% выявлять в супернатантах холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп холерный токсин в количестве 50 нг/мл, тогда как в практическом плане предпочтительнее использовать новый вариант дот - иммунологического анализа на основе ганглизидов GM1 (GMl-ДИА) с чувствительностью 75 нг/мл ввиду его экспрессное™ и простоты технического исполнения

5 На основании экспериментальных исследований установлено, что ложнопо-ложительные результаты в ИФА обусловлены наличием в антитоксических сыворотках антител к ЛПС, которые могут взаимодействовать с ним при тестировании супернатантов гомологичных штаммов V cholerae, присутствием в АТС антител к белкам, общим для вибрионов 01 и 0139 серогрупп, и продукцией некоторыми штаммами V cholerae белковых соединений, имеющих эпитопы, структурно идентичные отдельным эпитопам XT

6 Показано, что у штаммов Vcholerae 0139 (ctx+) и Vcholerae eltor (ctx+), хранящихся длительное время в музее, значительно снижается токсинопро-дукция, и в результате этого с помощью сэндвич-иммуноферментного анализа и культуры клеток СН0-К1 можно выявить холероген в супернатнатах 50-60% штаммов, тогда как в случае свежевыделенных вибрионов этот показатель повышается до 90%

7 Совместное применение МКА к XT, ЛПС-01 и ЛПС-0139 в ИФА и имму-ноблоте позволяет оценить наличие примеси ЛПС в образцах, отобранных на всех этапах очистки препаратов холерогена

8 Установлены наиболее адекватные клеточные модели для изучения дополнительных токсинов Vcholerae Ol и Vcholerae 0139 цитотонический фактор Cef (CHO-cell elongating factor) вызывает удлинение клеток СНО-Kl и L-929, токсин зонального поглощения (Zonula occludens toxin) ослабляет межклеточные контакты в культуре СаСо-2, гемагглютинин/протеаза вызывает округление клеток всех испытанных монослойных линий СНО-Kl, L-929, НЕр-2, HeLa, MDCK

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Сальникова, О И Выявление токсинопродуцирующих штаммов холерных вибрионов в иммуноферментном методе двойных антител / О И Сальникова, Л П Алексеева, В В Лобанов, О В Смирнова и др // Гомеостаз и инфек процесс Мат второй Всерос конф - Саратов, 1998 - С 62

2 Сальникова, О И Разработка простого способа выявления токсигенных штаммов холерных вибрионов / О И Сальникова, В В Лобанов, Л П Алексеева, О В Смирнова и др // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями Вторая междунар конф, посвященная 75-летию института им Пастера - Санкт-Петербург, 1998 - С 144

3 Сальникова, О И Оценка возможности использования СНО-ИФА для тестирования холерного токсина / О И Сальникова, О В Смирнова, Л П Алек-

сеева, Б JI Мазрухо // Диагностика, лечение и профилактика ин-фек заболеваний Биотехнология Ветеринария Мат научн конф, посвященной 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ - Екатеринбург, 1999 - С 224

4 Сальникова, О И. Чувствительность культуры клеток СНО и ТИФА при тестировании холерного токсина in vitro / О И Сальникова, JI П Алексеева, JI С Подосинникова, В В Лобанов, А В Карагозова, О В Смирнова и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д , 1999 -Вып 12-С 83-84

5 Сальникова, О И Моноклональные антитела для идентификации холерного токсина / О И Сальникова, J1 П Алексеева, О В Смирнова и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д , 1999 -Вып 12 - С 84

6 Алексеева, J1 П Моноклональные антитела к ЛПС V cholerae 0139 и их характеристика / Л П Алексеева, О И Сальникова, О С Чемисова, О В Смирнова и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д , 2000 - Вып 13 - С 71-72

7 Сальникова, О И Использование твердофазного СНО-ИФА для тестирования холерного токсина / О И Сальникова, Л П Алексеева, О В Смирнова, Б Л Мазрухо//Биотехнология -2000 - №2 - С 73-78

8 Сальникова, О И Оценка токсинопродуцирующей активности штаммов холерного вибриона, выделенных при вспышке холеры в Казани в 2001 году, на модели культуры клеток СНО-К1 и ИФА-2АТ / О И Сальникова, О В Маркина, Б Л Мазрухо и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2002 - Вып 15 - С 41-42

9 Алексеева, Л П Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae 0139 / Л П Алексеева, О И Сальникова, Б Л Мазрухо, О В Маркина и др // Биотехнология - 2002 - № 1 - С 79-84

10 Алексеева, Л П Получение диагностических флюоресцирующих монокло-нальных иммуноглобулинов к Vcholerae 0139 серовара / ЛП Алексеева, Б Л Мазрухо, О В Маркина и др //Клин лаб диагностика -2002 -№12 -С 50-51

11 Алексеева, ЛП Оценка полисахаридных антигенов Vibrio cholerae 0139 различного происхождения с помощью моноклональных антител / Л П Алексеева, Б Л Мазрухо, О С Чемисова, О И Сальникова, О В Маркина и др // Журн микробиол , эпидемиол и иммунол - 2002 - № 4 - С 25-29

12 Маркина, О В Характеристика антитоксических сывороток, используемых в иммуноферментных методах для тестирования холерного токсина / О В Маркина, О И Сальникова, Л П Алексеева, В В Лобанов и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2002 -Вып 15 - С 84-85

13 Мазрухо, Б Л Принцип конструирования диагностических препаратов на основе энтеротоксина холерных вибрионов «Бенгал» / Б Л Мазрухо, В В Лобанов, Л П Алексеева, Е В Ишина, И С Шестиалтынова, Н Б Непомнящая, О И Сальникова, О В Маркина // Пробл комиссия «Хо-

лера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2002 - Вып 15 -С 83

14 Мазрухо, А Б Синтетическая среда для накопления холерного токсина (СТ) / А Б Мазрухо, Е В Монахова, JIМ Овсова, К К Рожков, Н К Михась, О И Сальникова, О В Маркина, и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2002 - Вып 15 - С 141-143

15 Маркина, О В Характеристика препарата холерного токсина Vibrio cholerae 0139, очищенного на СМ-целлюлозе / О В Маркина, ЛП Алексеева, О И Сальникова, Б Л Мазрухо и др // Холера Мат VIII Российской науч - практич конф по проблеме «Холера» - Ростов н/Д, 2003 -Вып 16 - С 241-243

16 Монахова, Е В Цитотонический фактор cef холерных вибрионов / Е В Монахова, Ю М Ломов, Р В Писанов, Л П Алексеева, О В Маркина и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2005 - Вып 18 - С 66-68

17 Маркина, О В Иммуноферментные методы тестирования холеного токсина / О В Маркина, Л П Алексеева, Б Л Мазрухо, О И Сальникова // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2005 -Вып 18 - С 133-135

18 Писанов, Р В Конструирование рекомбинантной плазмиды pZot69 и штамма Е coli-продуцента zonula occludens toxin Vibrio cholerae / P В Писанов, E В Монахова, Л П Алексеева, О В Маркина и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2006 - Вып 19-С 64-66

19 Монахова, Е В Цитотоксический фактор NMDCY и гемагглюти-нин/протеаза холерных вибрионов / ЕВ Монахова, РВ Писанов, ЛП Алексеева, О В Маркина и др // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2006 - Вып 19 - С 66-69

20 Маркина, О В Культуры клеток в изучении биологической активности токсинов Vibrio cholerae, продуцируемых рекомбинантными штаммами Escherichia coli / О В Маркина, Л П Алексеева, Е В Монахова // Пробл комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» - Ростов н/Д, 2006 -Вып 19 - С 91-93

21 Монахова, Е В Клонирование гена цитотонического фактора Cef (CHO-cell elongating factor) Vibrio cholerae в Escherichia coli и его экспрессия под контролем Рвдс-промотора /ЕВ Монахова, Ю М Ломов, Р В Писанов, Л П Алексеева, О В Маркина и др //Биотехнология -2006 -№5 - С 12-18

22 Писанов, Р В Штамм Escherichia соИ-продуцент zot-токсина Vibrio cholerae / Р В Писанов, Е В Монахова, Л П Алексеева, О В Маркина, Л А Гончарова // Проблемы особо опасных инфекций - 2007 - Вып 93 - С 62-65

23 Monakhova, Е V Hemagglutinin/protease of Vibrio cholerae gene cloning, expression in Escherichia coli, purification and characterization of biological activity / E V Monakhova, R V Pisanov, E A Bardakhchian, N G Kharlanova, S R Sayamov, О V Markma et al // Vibrio 2007 The second conference on the Biology of Vibrios -Paris, 2007 -P 69

Печать цифровая Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Формат 60x84/16 Объем 1,0 уч -изд -л Заказ № 640 Тираж 100 экз Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г Ростов-на-Дону, ул Суворова, 19, тел 247-34-88

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маркина, Ольга Владимировна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Современные представления о структуре холерного токсина.

1.2 Методы обнаружения холерогена in vitro.

1.3 Моноклональные антитела к холерному токсину.

Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы и условия их выращивания.

2.2 Бактериальные токсины и антитоксические сыворотки.

2.3 Ганглиозиды.

2.4 Перевиваемые клеточные линии и их культивирование.

2.5 Лабораторные животные.

2.6 Гибридизация клеток.

2.7 Культивирование гибридом in vivo и in vitro.

2.8 Скрининг моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом.

2.9 Клонирование гибридом.

2.10 Криоконсервирование.

2.11 GMl-иммуноферментный анализ (GMl-ИФА).

2.12 GM1-дот-иммунологический анализ (GMi-ДИА).

2.13 СНО-иммуноферментный анализ (СНО-ИФА).

2.14 Сэндвич-иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ).

2.15 Тест в культуре клеток.

2.16 Иммуноблоттинг препаратов холерного токсина.

2.17 Фотографирование.

2.18 Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Монослойные клеточные линии в тестировании холерного токсина

3.1 Характеристика препаратов XT и антитоксических сывороток.

3.2 Особенности тестированиясупернатантов ctxf штаммов V.cholerae 01,

V.cholerae 0139 и V.cholerae non 01/поп в культуре клеток СН0-К1.

3.3 Тестирование супернатантов ctx" штаммов V.cholerae 01 в культуре клеток.

Глава 4. Варианты иммуноферментного метода для выявления холерогена с использованием ганглиозидов GM1 и поликлональных антитоксических сывороток

4.1 Применение варианта вМ1-ИФА для обнаружения и количественного определения ХТ.

4.2 Отработка условий постановки дот-иммунологического анализа (ДИА) с использованием ганглиозидов

0М1 и нитроцеллюлозной мембраны.

4.3 Разработка твердофазного СНО-ИФА для обнаружения ХТ.

Глава 5. Получение и характеристика моноклональных антител к холерному токсину

5.1 Получение гибридом- продуцентов МКА к ХТ и их первичный скрининг.

5.2 Определение эпитопной направленности моноклональных антител к ХТ.

5.3 Определение класса и подкласса моноклональных антител.

5.4 Изучение специфичности и активности МКА к ХТ.

5.5 Токсиннейтрализующие свойства МКА.

5.6 Получение препаративных количеств МКА.

5.7 Изучение способности МКА взаимодействовать с ХТ после его связывания с ганглиозидами вМ1.

5.8 Разработка ИФА с использованием МКА к холерному токсину (ИФА-2АТ).

5.9 Оценка чувствительности различных вариантов ИФА.

5.10 Изучение влияния различных биологически активных веществ на специфичность ИФА.

Глава 6. Аспекты применения методов in vitro для тестирования холерного токсина

6.1 Культура клеток в изучении биологической активности токсинов V.cholerae, продуцируемых рекомбинантными штаммами

Escherichia coli.

6.2. Изучение влияния условий хранения и обеззараживания препаратов холерогена на его активность с помощью ИФА и культуры клеток СНО-К1.

6.3 Влияние условий культивирования на токсинопродуцирующую активность штаммов V.cholerae OI и V.cholerae OI39.

6.4 Оценка качества очистки препаратов ХТ-0139 с использованием МКА к ЛПС-0139.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток"

Актуальность проблемы

Своевременное определение токсигенности холерных вибрионов имеет большое значение при определении рационального объема противохолерных мероприятий. В настоящее время в лабораторной практике для оценки эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae используют такие методы как ПЦР, ДНК-зондирование, тестирование на кроликах-сосунках, определение гемолитической активности по Грейгу и чувствительности к холерным фагам ctx+ и ctx" (М.У.4.2 1097-02. Лабораторная диагностика холеры, 2002).

Из вышеупомянутых методов достаточно широкое применение нашли молекулярно- генетические и, в частности, ПЦР-анализ, который за 3-4 часа позволяет проанализировать значительное число проб. Последний может быть использован в экспресс- диагностике для прямого выявления ДНК токсигенных штаммов от больных людей (Савельев В.Н. с соавт., 2002; Касина И.В. с соавт., 2003; Miyagi К. et al., 1999), как ускоренный метод для идентификации подозрительных колоний, а также в научных работах и ретроспективном анализе с целью получения информации о вирулентности изолятов путем детекции фрагментов генов ctx A, tcp A, tox R, hap A, RS (Кутырев В.В. с соавт., 2000; Ефременко В.И. с соавт., 2003; Куличенко А.Н. с соавт., 2003; Водопьянов С.О. с соавт., 2006; Lyon W.J. et al., 2001; Kamnasagar I. et al., 2003; Lipp E.K. et al., 2003; Rivera I.N. et al., 2003; Gubala A.J., 2006). Однако известно, что мутации в различных генах могут снизить и даже полностью исключить продукцию хо-лерогена (Gardel C.L.et al., 1996; Haralalka S. et al., 2003; Lauriano C.M. et al., 2004). В лабораторной практике часто используют и такие методы, как определение гемолитической активности вибрионов и определение чувствительности к фагам ctx+, ctx". В то же время известно, что среди нетоксигенных холерных вибрионов можно нередко обнаружить штаммы негемолитичные по фенотипу (Кюрегян А.А с соавт., 2002; Лобанов В.В. с соавт., 2004), а некоторые штаммы ctx" могут оказаться чувствительными к фагам ctx+ (Безсмертный В.Е. с соавт., 2004; Нановская Н.Н. с соавт., 2004). В связи с этим эпидемический потенциал штаммов подтверждают другими методами, например, используя биологические модели, однако методы in vivo нестандартны, а получаемые результаты не всегда воспроизводимы ввиду индивидуальной реакции животных.

Альтернативой биологическим тестам считают культуру клеток. Установлены индикаторные для холерного токсина (XT) клеточные линии, которые позволяют по изменению морфологии клеток определять активность токсина с чувствительностью 10-30 пг/мл (Сальникова О.И., 1994; Guerrant R.L.et al., 1974). Однако в последнее время были обнаружены токсины, вызывающие удлинение клеток СНО-К1 подобно холерогену: Cef (CHO-cell elongating factor), S-CEP (secreted CHO elongating protein), W07 (novel toxin) (Sanial S.C. et al., 1984; Walia K. et al., 1999; McCardell B.A. et al., 2000; Bhattacharyya S. et al., 2004). Иммунологическое отличие этих токсинов от холерогена можно подтвердить только с помощью иммунохимических методов.

По мнению большинства исследователей, высокой специфичностью и чувствительностью отличаются некоторые варианты иммуноферментного анализа. Среди них можно выделить следующие: «двойной антительный» сэндвич, где выявляемый холероген, заключен между двумя слоями антитоксических антител (Bhadra R.K. et al., 1991), bead-ИФА - прямой метод выявления XT с применением полимерных носителей (Ramamurthy Т. et al., 1992,1996), GM1-ИФА с использованием в качестве твердой фазы планшетов, покрытых ганг-лиозидами GM1 (Honda Т. et al., 1984; Clark G.J. et al., 1988) и др. По данным зарубежных и отечественных авторов, чувствительность его колеблется от 1-30 пг/мл до 10-50 нг/мл. Поиск новых сорбентов привел к созданию новых улучшенных в практическом плане вариантов ИФА, где вместо полистироловых планшетов используются магнитные сорбенты (Покровский В.И. с соавт., 2000; Ефременко В.И. с соавт. 2003), пьезоэлектрические иммуносенсоры (Ewalt K.L. et al., 2001). Однако наиболее доступными в отечественной практике являются полимерные мембраны, в частности, нитроцеллюлозные (НЦМ). Последние очень удобны для проведения реакции, так как в порах из-за микроскопических размеров лучше происходят процессы массообмена, что во много раз ускоряет кинетику реакции. Так, чувствительность дот-ИФА относительно XT, по данным отечественных и зарубежных авторов, составляет от 10 до 160 нг/мл, а время проведения анализа сокращается до 2-3 часов (Федорова В.А. с соавт., 1996; Девдариани 3.JL с соавт., 1999; Beutin L. et al., 1984). К преимуществам иммуноферментного метода относятся также экспрессность, возможность тестирования большого числа проб одновременно, сравнительно невысокая себестоимость анализа.

Однако данные отечественных авторов относительно чувствительности и специфичности различных вариантов ИФА достаточно противоречивы, так как целенаправленных исследований по их сравнительной оценке не проводилось. Кроме того, мы не встретили отечественных публикаций, касающихся одновременного использования для тестирования холерного токсина культуры клеток и ИФА, как это принято в зарубежных лабораториях. Мало сведений и в отношении тестирования ctx" штаммов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 в культуре клеток СНО-К1. Заслуживает внимания также выяснение возможных причин появления ложно-положительных результатов при тестировании суперна-тантов ctx" штаммов холерных вибрионов как в ИФА, так и в культуре клеток СНО-К1.

Целью работы явилось изучение токсинопродуцирующей способности V.cholerae 01 и 0139 серогрупп с использованием комплекса методов in vitro, включающего варианты сэндвич иммуноферментного анализа и культуру клеток.

Задачи исследования

1. Отработать условия постановки различных вариантов сэндвич - ИФА на основе ганглиозидов GM1 и антитоксической сыворотки (GMl-ИФА, GM1-ДИА и СНО-ИФА) для тестирования XT, включающие подбор оптимального разведения антитоксической сыворотки и препарата XT, используемого в качестве положительного контроля, а также концентрации ганглиозидов и способа их адсорбции на полистироловом планшете и нитроцеллюлозной мембране.

2. Получить моноклональные антитела (МКА) к XT, оценить их специфичность и иммунохимическую активность.

3. Отработать и оптимизировать постановку сэндвич варианта ИФА-2АТ на основе МКА к ХТ и антитоксической сыворотки (АТС) для определения токсинопродуцирующих свойств штаммов холерных вибрионов Ol и Ol39 серогрупп.

4. Установить наиболее чувствительные монослойные клеточные линии в отношении цитотонического фактора Cef, токсина зонального поглощения (Zot) и гемагглютинин/протеазы (HA/P) V.cholerae Ol и V.cholerae 0139.

5. Сравнить специфичность и чувствительность методов in vitro, используемых для тестирования ХТ, и оценить возможные аспекты их применения.

Научная новизна и теоретическая значимость

Получены приоритетные данные, свидетельствующие о возможности использования ганглиозидов GM1, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану, в качестве твердой фазы для разработки нового варианта дот - иммунологического анализа -GMl-ДИА, позволяющего выявлять ХТ на уровне 75 нг/мл.

Впервые для тестирования ХТ отработан новый вариант СНО-ИФА на основе клеток монослойной линии СНО-К1, богатых ганглиозидами, с чувствительностью около 1 мкг/мл.

Созданы гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела классов G и М, направленные к эпитопам В-субъединицы ХТ, расположенным вблизи ганглиозид - связывающего участка и блокирующие взаимодействие ХТ с рецептором GM1. В результате целенаправленного скрининга отобраны моноспецифические антитела, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям ИФА, на основе которых отработан и оптимизирован ИФА-2АТ с чувствительностью порядка 50 нг/мл.

Анализ в иммуноблоте с помощью АТС, МКА к ХТ и МКА к ЛПС спектра белковых и углеводных компонентов супернатантов атоксигенных штаммов V.cholerae Ol и V.cholerae Ol39, дающих ложноположительные результаты в ИФА, позволил выявить в их составе белковые соединения, вступающие в реакцию с антитоксическими антителами, по-видимому, из-за структурного сходства с отдельными эпитопами ХТ.

Получены новые данные о токсинопродуцирующей способности штаммов V.cholerae eltor и V.cholerae 0139 из коллекции музея РостРГИПЧИ. Среди них выявлены активные продуценты, отличающиеся высокой стабильной продукцией холерогена in vitro независимо от срока их хранения.

Впервые на монослойных перевиваемых клеточных линиях, имеющихся в Ростовском НИПЧИ, изучен биологический эффект дополнительных токсинов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139, продуцируемых штаммами Escherichia coli, несущими рекомбинантные плазмиды со вставками генов cef, zot, гемагглютинин/протеазы. Установлены наиболее адекватные клеточные модели для их тестирования, а именно: L-929 и СН0-К1- для изучения цитотоническо-го фактора Cef (CHO-cell elongating factor), CaCo-2- токсина зонального поглощения (Zonula occludens toxin), a CH0-K1, L-929, M-HeLa, HEp-2, MDCK- re-магглютинин/ протеазы.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследований

По материалам диссертации составлены и утверждены на Ученом совете РостНИПЧИ методические рекомендации «Оценка способности холерных вибрионов продуцировать холерный токсин в условиях in vitro» (протокол №8 от 17.06.04), которые могут быть использованы для оценки токсинопродуци-рующих свойств штаммов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139 .

Получены гибридомы- продуценты МКА к XT, из которых отобрано две, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям иммунофер-ментного анализа. Штамм гибридомы GCT-4F7, секретирующий МКА к XT, депонирован в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской Коллекции клеточных культур 3.03.1999 г. под номером РККК (П)654Д. 26.

Линии СНО-К1 и L-929 использованы для отбора рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих биологически активный цитотонический фактор Cef (CHO-cell elongating factor). Штаммы E.coli Jml03pCef61 В, Jml03pCef69B, Jml03pCef49B, Jml03pCeßlB, экспрессирующие клонированные гены cef V.cholerae Ol обоих биоваров, V.cholerae 013 и V.cholerae Ol39 под контролем Pbad -промотора, депонированы в ГКПБ при Российском

НИПЧИ «Микроб» в качестве охраноспособных под номерами КМ 188, КМ189, КМ190, КМ191(2005).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Различные варианты ИФА на основе ганглиозидов GM1 и АТС (GM1-ИФА, GMl-ДИА) позволяют выявлять ХТ с чувствительностью примерно 75 нг/мл.

2. Полученные гибридомы продуцируют моноклональные антитела к В-субъединице ХТ, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуноблоте и в тесте нейтрализации холерогена в культуре клеток СНО-К1.

3. На основе МКА к ХТ, в большей степени отвечающих диагностическим требованиям иммуноферментного анализа, разработан ИФА двойных антител (ИФА-2АТ) с чувствительностью 50 нг/мл.

4. Перевиваемые монослойные линии можно использовать для оценки биологического эффекта гемаггшотинин/протеазы и таких дополнительных токсинов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 как Cef, Zot наряду с клетками СН0-К1, традиционно используемыми для обнаружения и количественного определения холерогена.

5. Совместное применение культуры клеток и ИФА позволяет одновременно определить иммунохимическую и биологическую активность препаратов холерогена, выявить наибольшее число токсинопродуцентов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на Всероссийских конференциях «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); на Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С.-Петербург, 1998); на конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 1999); на проблемных конференциях «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 1999-2003, 2005- 2007).

Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: «Особенности токсинопродукции холерных вибрионов 0139 серогруппы и конструирование на основе их холерогена - токсина препаратов и тест-систем для диагностики холеры» (№ гос.регистрации 01.200.1 15555), «Антигены поверхностных структур холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения» (№ гос.регистрации 01.200.2 12989), «Совершенствование метода серологической идентификации холерных вибрионов не О Уне 0139 серогрупп» (№ гос.регистрации 01.200.2 12999), «Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия дополнительных токсинов (Zot и Асе) кассеты вирулентности холерных вибрионов» (№ гос.регистрации 01.20.03 11548).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы в соавторстве 23 научные работы.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 10 таблиц и 22 рисунка. Библиография представлена 254 отечественными и зарубежными источниками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Маркина, Ольга Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Отработаны и оптимизированы условия постановки сэндвич-ИФА и дот-иммунологического анализа на основе ганглиозидов GM1 и антитоксической сыворотки для обнаружения и количественного определения холерного токсина в надосадочных жидкостях холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с чувствительностью около 75 нг/мл.

2. Получены стабильные культуры гибридом, продуцирующие моноютональные антитела к В-субъединице холерного токсина, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуноблоте и в тесте нейтрализации холерогена в культуре клеток СНО-К1.

3. Отобраны наиболее значимые диагностические моноютональные антитела к ХТ, определена их оптимальная концентрация и условия сенсибилизации на планшетах для постановки ИФА-2АТ, который позволяет оценить токсинопродукцию штаммов холерных вибрионов OI и 0139 серогрупп с чувствительностью метода 50 нг/мл.

4. Сравнительные исследования показали что, наиболее чувствительным является вариант ИФА-2АТ, позволяющий со специфичностью 85-95% выявлять в супернатантах холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп холерный токсин в количестве 50 нг/мл, тогда как в практическом плане предпочтительнее использовать новый вариант дот иммунологического анализа на основе ганглизидов GM1 (GM1 -ДИА) с чувствительностью 75 нг/мл ввиду его экспрессности и простоты технического исполнения.

5. На основании экспериментальных исследований установлено, что ложноположительные результаты в ИФА обусловлены наличием в антитоксических сыворотках антител к ЛПС, которые могут взаимодействовать с ним при тестировании супернатантов гомологичных штаммов V.cholerae, присутствием в антитоксических сыворотках антител к белкам, общим для вибрионов 01 и 0139 серогрупп, и продукцией некоторыми штаммами V.cholerae белковых соединений, имеющих эпитопы, структурно идентичные отдельным эпитопам XT.

6. Показано, что у штаммов V.cholerae 0139 (ctx+) и V.cholerae eltor (ctx+), хранящихся длительное время в музее, значительно снижается токсинопродукция, и в результате этого с помощью сэндвич-иммуноферментного анализа и культуры клеток СНО-К1 молено выявить холероген в супернатнатах 50-60% штаммов, тогда как в случае свежевыделенных вибрионов этот показатель повышается до 90%.

7. Совместное применение МКА к XT, ЛПС-Ol и ЛПС-0139 в ИФА и иммуноблоте позволяет оценить наличие примеси ЛПС в образцах, отобранных на всех этапах очистки препаратов холерогена.

8. Установлены наиболее адекватные клеточные модели для изучения дополнительных токсинов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139: цитотонический фактор Cef (CHO-cell elongating factor) вызывает удлинение клеток СНО-К1 и L-929, токсин зонального поглощения (Zonula occludens toxin) ослабляет межклеточные контакты в культуре СаСо-2, гемагглютинин/протеаза вызывает округление клеток всех испытанных монослойных линий: СНО-К1, L-929, НЕр-2, HeLa, MDCK.

110

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Главным фактором вирулентности холерных вибрионов является термолабильный энтеротоксин- холероген, синтезируемый ctx+ штаммами V.cholerae. В настоящее время для определения токсигенности вибрионов используют молекулярно-генетические, биологические, цитологические и серологические методы. Так, использование ПЦР позволяет прогнозировать эпидситуацию по обнаружению у выделяемых штаммов генетической детерминанты вирулентности - гена холерного токсина. Однако этот метод свидетельствует только о потенциальной возможности продукции холерогена штаммами холерного вибриона, так как известно, что не все ctx+ штаммы экс-прессируют гены ХТ. Биологические методы с использованием лабораторных животных до сих пор являются незаменимыми при оценке вирулентности штаммов, кроме того, позволяют оценить биологическую активность препаратов токсинов и интенсивность продукции холерогена вибрионами. Альтернативой биологическим методам являются цитологические. Данные методы высокочувствительны и воспроизводимы, так как в работе используются стандартные среды и референтные клеточные линии. Они гуманны, нетрудоемки и экономически более выгодны. Чаще всего в работе с холерным токсином используют клеточные линии СНО-К1, Vero, Y-1. Клетки СНО-К1 под действие ХТ удлиняются, a Vero и Y-1-округляются. Наиболее чувствительной линией в отношении ХТ является культура СНО-К1, позволяющая выявлять до 20-30 пг/мл токсина (Сальникова О.И., 1994; Guerrant R.L. et al., 1977; Tornbull P.C. et al., 1985). Учитывая, что большинство штаммов продуцирует холерный токсин в среду культивирования в очень малых количествах, очевидно, что этот метод позволяет выявлять максимальное число токсинопроду-центов. Однако в процессе тестирования бульонных культур V.cholerae 01, выращенных на среде AKI по M.Iwanaga (1986), нами было зарегистрировано удлинение клеток СНО-К1, обусловленное действием супернатантов некоторых ctx~ штаммов, свидетельствующее о наличии в исследуемых образцах ци

§ тотонических факторов. К настоящему времени установлено, что такой биологический эффект в культуре клеток регистрируют под действием CHO-cell elongating factor (Cef) (McCardell В.A. et al., 2000), и, как было показано E.B. Монаховой с соавт. (2005), его ген широко представлен в геноме штаммов V.cholerae. В наших опытах с помощью специфической АТС нейтрализации эффекта удлинения клеток не наблюдалось, что дает основание говорить о продукции штаммами токсина, отличного от холерогена. Кроме того, часто в супернатантах и ctx ~ и ctx + холерных вибрионов присутствуют БАВ, которые вызывают гибель клеток СНО-К1, вследствие чего выявление XT становится невозможным. Так, при первичном тестировании мы не смогли обнаружить XT в супернатантах некоторых токсигенных штаммов V.cholerae eltor, V.cholerae 0139 и V.cholerae non01/non0139 из-за деструкции клеток. Ранее О.И. Сальниковой (1994) было установлено, что цитотоксичность супернатан-тов обусловлена наличием в них гемолизина и больших количеств ЛИС. В нашем эксперименте цитотоксическая активность супернатантов исключалась только с помощью специфической сыворотки к цитолизину, что и позволило затем выявить холерный токсин. Округление клеток, вызываемое протеазами, гемагглютинин/протеазой, компонентами цитотоксического комплекса RTX, также способствует снижению чувствительности теста и мешает выявлению холерогена. В этом случае, при отсутствии высокоспецифических сывороток к данным биологически активным веществам, обнаружение холерогена представляется затруднительным.

С учетом вышеизложенного, достоверность отрицательных или сомнительных результатов тестирования в культуре клеток необходимо подтверждать, привлекая другие методы, в частности, иммуноферментные.

Среди иммуноферментных способов детекции холерного токсина наиболее часто в зарубежных и отечественных исследованиях используется вариант с использованием ганглиозидов GM1 (GMl-ИФА). Нами был апробирован этот вариант ИФА для обнаружения и количественного определения XT в супернатантах бульонных культур холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. В работе были использованы препараты ганглиозидов, полученные по методу А.-М. Svennerholm, и ганглиозиды («Serva»). Чувствительность данного варианта в отношении XT-Ol, очищенного на КМЦ, составила примерно 75 нг/мл. При исследовании супернатантов штаммов V.cholerae eltor ctx+ после выращивания на среде AKI холероген был обнаружен у 64,7% штаммов, в случае тестирования V.cholerae 0139 - 50%. Можно предположить, что такие результаты тестирования являются следствием изменения токсинопродуцирующих свойств вибрионов, хранившихся длительное время в музее, в результате чего продукция ХТ значительно снизилась и находится за пределами чувствительности анализа.

При дальнейшем выборе наиболее чувствительных методов обнаружения токсигенных штаммов наиболее приемлемым оказался дот - иммунологический анализ. Время его проведения сокращено до нескольких часов, а его постановка не требует наличия специального оборудования. Использование нами ганглиозидов GM1, сорбированных на нитроцеллюлозной мембране, позволило разработать новый вариант метода- GMl-ДИА. Чувствительность анализа оказалась на уровне планшетного варианта GMl-ИФА и составила примерно 75 нг/мл. Однако GMl-ДИА отличается наиболее высокой скоростью постановки реакции, возможностью применения в полевых условиях. Одновременно с GMl-ДИА нами был отработан новый вариант метода, где в качестве твердой фазы использовали клетки СНО-К1, богатые рецепторами GM1. При его отработке оказалось, что наибольшая трудность связана с подбором условий фиксации клеток на пластике. Сенсибилизация планшетов клетками, выращенными в полной ростовой среде по I.Ravdin с соавт. (1986), а также клетками, отмытыми от ростовой среды по методу М.А. Буркина с соавт. (1997), или высушенными на дне лунки, как предложено Д.Н. Носик с соавт. (1985), оказалась неэффективной. Предпринята была попытка фиксировать клетки с помощью 96° этилового спирта после их взаимодействия с токсииом, так как, известно, что этанол не влияет на возможность обнаружения ХТ в ИФА (Трофимов Е.Н. с соавт.,1987; Федорова В.А. с соавт,.1996). Однако в результате такой обработки положительной реакции не наблюдали: оптическая плотность опытных проб была на уровне отрицательных контролей. Прикрепления клеток СНО-К1 к пластику достигали только путем фиксации их раствором глютарового альдегида. Такая процедура, как установлено, не отражается на реакции связывания токсинов с мембранными рецепторами эу-кариот (ИататигШу Т. е! а1.,1996). Титрование препарата ХТ-569В показало, что чувствительность данного варианта составила всего 1 мкг/ мл, что не позволяет его использовать достаточно широко, принимая во внимание невысокий уровень токсинопродукции у большинства штаммов.

Как видно, нами было апробировано 3 различных варианта ИФА с применением ганглиозидов ОМ1. Наиболее приемлемыми оказались варианты ОМ1-ИФА и ОМ1-ДИА, которые позволяют выявлять холероген в суперна-тантах штаммов У.сИо1вгае 01 и V. ско1егае 0139 с чувствительностью 75 нг/мл. Обращает внимание факт, что в обоих вариантах метода регистрировали 10-15% ложноположительных результатов при тестировании некоторых атоксигенных штаммов. По всей видимости, какие-то биологически активные соединения из супернатантов имеют эпитопы сходные с ХТ, в результате чего и вступают в реакцию с АТС. Нам представлялось уместным, что применение в ИФА моноклональных антител к отдельным эпитопам холерогена, позволит повысить специфичность анализа, и поэтому были проведены работы по получению МКА к ХТ.

В качестве иммуногена использовали препараты ХТ У.ско1егае 01 и У.сИо1егае 0139, очищенные путем бач - адсорбции на КМЦ по методу, предложенному Л.С. Оленичевой (1988), так как в литературе описана возможность получения антитоксических сывороток при использовании токсинов, содержащих некоторые примеси различных БАВ (Мазрухо А.Б., 1999). Применение стандартных схем иммунизации мышей ВАЬВ/с позволило получить мышиные антитоксические сыворотки с титрами в пределах 1:10000-1:20000. Используя иммунные спленоциты мышей ВАЬВ/с и клетки миеломной линии N80 нами были проведены гибридизации. Итог их показал, что количество клонов, продуцирующих МКА к ХТ, составило 12%. Одновременно были получены МКА к ЛПС-0139 (10%) и ЛПС-01 (2%).

После детальной предварительной характеристики было отобрано пять гибридом - продуцентов МКА к ХТ. Изучение эпитопной направленности полученных МКА показало, что они выявляют три различных эпитопа на молекуле холерогена. Иммуноблоттинг препарата ХТ-01 с помощью МКА к ХТ позволил установить, что все они направлены к В-субъединице холерного токсина. МКА были испытаны также в ОМ1-ИФА, однако оказалось, что они не взаимодействовали с ХТ после связывания его с ганглиозидами, по-видимому, из-за направленности их к эпитопам ХТ, расположенным близко к рецепторному участку.

Полученные МКА апробировали в другом варианте метода - так называемом ИФА-2АТ. Нам удалось отработать вариант ИФА, согласно которому, на пластик наносили МКА (5 мкг/лунка), затем препарат ХТ и после добавляли раствор АТС-01 (1:10000). В результате оказалось, что чувствительность метода составляет примерно 50 нг/мл в отношении ХТ-569В. Можно было ожидать, что применение МКА полностью исключит ложноположительные результаты, однако оказалось, что супернатанты некоторых с!х" штаммов продолжали давать положительную реакцию в ИФА. Наиболее интенсивное окрашивание реакционной смеси (на 2 креста) регистрировали при испытании супернатанта штамма У.с1ю1егае еНог 9898 (с!х~), выделенного от человека. Возможно, МКА к ХТ взаимодействуют с каким-то белком из супернатанта У.ско1егае еког 9898, имеющим структурно сходные с ХТ эпитопы.

С целью изучения этого вопроса белки супернатанта штамма У.сИо/вгае еког 9898 осадили с помощью сульфата аммония, разделили в БОЭ-ПААГ и перенесли на мембрану. В качестве контроля использовали супернатант

У.сИокгае с1ахн[са 569В (с*х+). После обработки НЦМ препаратами монокло-нальных антител к ХТ в препарате У.сНо1егае Ыаьъчса 569В выявлены зоны, соответствующие В-субъединице холерогена. Реакции МКА с препаратом УсИо1егае еког 9898 не было зарегистрировано, что свидетельствует о специфичности МКА к ХТ, не смотря на то, что в последнее время все больше накапливается фактов, свидетельствующих о том, что некоторые МКА обладают потенциальной полиреактивностью. Так, например, Ь.Ойе е1 а1. (2006) показали, что МКА ТЕЗЗ, полученные к отдельному эпитопу холерного токсина, могут связать до 45 различных пептидов, выделенных от гетерологичных протеинов. В то же время АТС-01 (сер. 581) в разведении 1:5000 в препарате У.ско1егае еког 9898 окрашивала две зоны, первая - на уровне 44-46 кД, вторая - примерно 36-40 кД (отсутствующая у У.сИокгае с1а^1са 569В). Таким образом, АТС, полученная к ХТ-569В, в препарате У.скокгае еНог 9898 выявляет белковые детерминанты, отсутствующие у холерогена. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование в ИФА поликлональных антитоксических сывороток может явиться причиной появления ложно-положительных результатов за счет взаимодействия иммуноглобулинов сыворотки с белками, имеющими сходные с ХТ эпитопы.

В нашем распоряжении была и антитоксическая сыворотка-01 (сер. 474), полученная к ХТ «СаИносЬет». Активность ее, по данным твердофазного ИФА, была ниже, чем у АТС-01 (сер.581) - не более 1:10000. Однако, использование данной сыворотки позволило полностью исключить ложно-положительные результаты в ИФА. Таким образом, применение сывороток, полученных к коммерческим препаратам холерогена, не содержащим посторонних примесей, обеспечивает наиболее высокую специфичность анализа. Это свидетельствует о необходимости наиболее тщательного отбора антитоксических сывороток для проведения реакции.

Отработанные варианты вМ1-ИФА и ИФА-2АТ параллельно с культурой клеток СНО-К1 использовали при тестировании 30 с1х+ штаммов, выделенных во время вспышки холеры в 2001 г. в г. Казани. Согласно полученным данным, у всех штаммов с помощью обоих методов была обнаружена токси-нопродукция. Тестирование штаммов через 6 месяцев после хранения на полужидком агаре показало снижение их токсинпродуцирующей способности в 4-6 раз, и поэтому XT в некоторых пробах не смогли выявить.

Количество секретируемого холерогена зависит и от состава питательных сред и условий культивирования вибрионов. Так, вибрионы классического биотипа характеризуются хорошей продукцией XT на среде LB при 30°С, тогда как для вибрионов эльтор эти условия не являются оптимальными. В основном это связано с различиями в активации генов-регуляторов экспрессии генов ctx в этих биотипах. Некоторые авторы считают, что для улучшения секреции XT V.cholerae eltor в отличие от V.cholerae classica необходимо проведение бифазного культивирования (статические условия роста- шутте-лирование при 37 С), при этом имеет большое значение объем и площадь аэрируемой поверхности флакона, фаза роста вибрионов (Medrano А. I. et al., 1999; Murley Y.M. et al., 2000). Tischler A. D. et al. (2002) предполагает, что XT V.cholerae eltor в наибольшем количестве секретируется в комплексной среде AKI, предложенной M.Iwanaga (1986), вероятно, из-за того, что в её составе содержатся ингредиенты, которые могут запускать регуляторную систему VieS секреции холерного токсина вибрионов эльтор в условиях in vitro. Культивирование в условиях неблагоприятных для токсинообразования (в присутствии солей Na, в бедных средах, высоких pH и др.) приводит к снижению продукции XT (Hase С.С., Mekalanos J.J., 1999; Lauriano C.M. et al., 2004; Nag S. et al., 2005). Испытание в ИФА супернатантов штаммов, выращенных в разных средах: AKI, бульон Мартена при различной степени аэрирования показало, что культивирование вибрионов на среде AKI с активным шуттелирова-нием является наиболее оптимальным, так как в этом случае было обнаружено в ИФА наибольшее число токсинопродуцентов. Культивирование можно проводить и в бульоне Мартена по способу, предложенному с. н. с. лаборатории микробиологии холеры РостНИПЧИ, д.м.н. В.В.Лобановым, хотя в этом случае число выявленных штаммов - токсинопродуцентов было несколько ниже.

Нельзя обойти вниманием и тот момент, что чувствительность ИФА напрямую зависит от качества препарата ХТ, который был использован в процессе его отработки. Очевидно, чем чище и активнее использован токсин, тем выше будет чувствительность метода. В наших опытах наибольшей активностью в сравнении с ХТ «Са1Ыос11ет» обладали препараты ХТ, очищенные на О-галактозе и КМЦ. Согласно характеристике, препараты ХТ, очищенные на КМЦ, содержали примесные компоненты. Чтобы минимизировать их влияние на структурную организацию холерогена и предотвратить диссоциацию субъединиц холерогена, препараты были разлиты по аликвотам и заморожены. Неоднократное размораживание токсинов с последующим их испытанием в культуре клеток и ИФА показало, что снижение биологической активности холерогена, регистрируемой на клетках СНО-К1, идет гораздо быстрее, чем иммунохимической. В связи с этим в работах по одновременному тестированию ХТ в цитологическом тесте и ИФА необходимо использовать однократно размороженные препараты ХТ.

Из веществ, присутствующих в препаратах, самое заметное влияние на чувствительность и специфичность ИФА оказывает ЛПС, именно он, как считают, наиболее часто является причиной ложноположительных результатов при тестировании ХТ. Однако освободиться полностью от ЛПС практически сложно по причине связывания его с различными белками (8а1та1 О. et а1., 1992; Ра1 8. е! а1., 1996). С учетом этого контроль наличия ЛПС в образцах токсина является необходимым. Из литературы известны такие достаточно трудоемкие методы выявления ЛПС в белковых препаратах, как окрашивание эндотоксина серебром после электрофореза препаратов в полиакриламидном геле (КлИеНэе^ег И. е1; а1.,1993), ЬАЬ- тест, как в оригинальной разработке, так и в различных модификациях с использованием хромогенных субстратов (Бондаренко В.М. с соавт., 2002; 1пас1а К. е! а1., 1991; ЫеЬзсЬ М. е1: аЦ 1995;

Tanaka S. et al., 1993), использование моноцитарных клеток - МопоМасб, J771A.1, Raw 264.7 (Moesby L. et al., 1999; Peterbauer A. et al., 1999). Однако, согласно имеющейся литературе, наиболее практичны методы ИФА, основанные на идентификации ЛПС соответствующими сыворотками. С помощью полученных нами МКА к ЛПС-0139, было установлено, что некоторые образцы ХТ-0139, очищенные на КМЦ, содержат ЛПС в значительных количествах. Именно такой препарат ХТ-0139 был использован нами для иммунизации мышей с целью получения гибридом- продуцентов МКА. Очевидно, что наличие ЛПС в образцах ХТ и послужило причиной обнаружения в процессе скрининга продуцентов МКА к ЛПС-0139. Мы полагаем, что применение в качестве иммуногена препаратов ХТ, максимально лишенных ЛПС, может существенно повысить выход гибридом - продуцентов МКА к ХТ. Как возможных кандидатов - продуцентов ХТ можно рассматривать рекомбинантные штаммы E.coli Jml03pCT110 и E.coli Jml03pCT105, из-за отсутствия в полученных препаратах ЛПС V.cholerae.

108

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркина, Ольга Владимировна, Ростов-на-Дону

1. Адамов, А.К. Иммунология холеры / А.К. Адамов. Саратов, 1981.- 320 с.

2. Ашмарин, И.П.Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А.Воробьев. Л., 1962. - 180 с.

3. Бабицын, Н.С. Антиэнтеротоксические моноклональные антитела в диагностике холеры / Н.С. Бабицын // Автореф. дис. канд.мед.наук.-Алма1. Ата, 1992.- 22 с.

4. Бардахчьян, Э.А. Особенности ультраструктурных изменений в тонкой кишке кроликов-сосунков при действии vet- штамма холерных вибрионов / Э.А. Бардахчьян, Ю.М. Ломов, Н.Г. Харланова, и др. // Архив патологии. 2000. -№1.-С.24-29.

5. Бахуташвили, В.И. Взаимодействие вибрионов с культурами клеток / В.И. Бахуташвили, В.Г. Бочоришвили, И.Г. Велиджанашвили, и др. // Журн. мик-робиол., эпидемиол. и иммунол.- 1973. №10. - С.82-86.

6. Белая, Ю.А. Определение холерного энтеротоксина с помощью реакции ко-агглютинации / Ю.А. Белая, И.Н. Гайлонская, С.М. Быстрова, Г.К.Ферапонтова // Вестник АМН СССР,- 1984. №10. - С.69-73.

7. Владимирцева, И.В. Иммунофлюоресцентный метод обнаружения холерного энтеротоксина / И.В. Владимирцева, В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь и др. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.-1986. №12. - С.62-65.

8. Власов, В.П. Штамм бактерий Escherichia coli-продуцент гемолизина Vibrio cholerae eltor / В.П. Власов, H.K. Михась, E.B. Монахова, и др. // Авт. свид.№1649809.-1991.

9. Водопьянов, С.О. ПЦР с флюоресцентной детекцией результатов. Перепек-тивы возможного применения при эпиднадзоре за холерой / С.О. Водопьянов // Пробл. комиссия: «Холера и патогенные для человека вибрионы».-Ростов н/Д., 2006.-Вып. 19.- С.62-64.

10. Гайлонская, И.Н. Определение холерного энтеротоксина в супернатантах гомогенатов стенки тонкой кишки кролика в реакции пассивного иммунного