Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск новых генов Escherichia Coli, участвующих в экспорте аминокислот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск новых генов Escherichia Coli, участвующих в экспорте аминокислот"

На правах рукописи

РЫБАК КОНСТАНТИН ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ПОИСК НОВЫХ ГЕНОВ ESCHERICHIA COLI, УЧАСТВУЮЩИХ В ЭКСПОРТЕ АМИНОКИСЛОТ

Специальность: 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории №3 Научно-исследовательского института «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»).

Научные руководители: кандидат биологических доктор биологических наук, профессор Ю.И. Козлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.С. Миронов кандидат биологических наук, Л.И. Патрушев

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 22 февраля 2005 года в 14 часов на заседании диссертационного совета ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: Москва, 117545,1-й Дорожный проезд, д.1.

наук

Е.М.Хургес

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат диссертации разослан января 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание эффективных продуцентов аминокислот - комплексная задача, требующая решения множества проблем, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести увеличение экспрессии биосинтетических генов, достаточный уровень предшественников требуемой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза и жизнедеятельности клеток и т.д. Одной из таких важных задач является эффективный транспорт синтезированной аминокислоты из бактериальной клетки. Выброс из клетки продукта может сдвинуть в нужном направлении равновесие в цепи необходимых биохимических реакций, решить проблему негативного контроля синтеза целевого продукта, который в большинстве случаев осуществляет аминокислота, не допустить накопления в клетке ее токсических количеств. Наряду с чисто прикладными задачами, проблема переноса вещества через цитоплазматическую мембрану имеет важное значение и в фундаментальном аспекте, поскольку именно этот процесс обеспечивает проникновение питательных веществ в клетку, поддерживает клеточный гомеостаз и необходим для вывода токсичных метаболитов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось обнаружение новых генов E.coli, участвующих в транспорте аминокислот. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1) осуществить поиск среди всех неохарактеризованных открытых рамок считывания полного генома E.coli тех, которые могут кодировать транспортеры аминокислот;

2) исследовать эффект амплификации отобранных генов на уровень устойчивости клеток E.coli к ингибирующим концентрациям аминокислот и их аналогов, а также на скорость поглощения ими природных аминокислот;

3) оценить влияние амплификации изучаемых генов на продукцию штаммов E.coli - продуцентов различных аминокислот;

4) провести компьютерный анализ upstream-областей изучаемых генов на предмет обнаружения вероятных сайтов связывания регуляторных белков E.coli.

Научная новизна и практическая ценность работы. На основании

сравнительного анализа генома E.coli с геномами других организмов отобрано 30 неохарактеризованных на момент выполнения работы гипотетических белков E.coli (открытых рамок считывания), имеющих гомологию с известными транспортерами или белками систем множественной лекарственной устойчивости.

Изучено влияние повышенной экспрессии этих генов на уровень устойчивости клеток E.coli к 50 соединениям различной химической природы. Обнаружено, что амплификация (в некоторых случаях инактивация) 20 исследуемых генов приводит к изменению устойчивости модельного штамма Е .coli TG1, причем 14 из них влияют на устойчивость бактерий к ряду аминокислот или их аналогов.

Измерены скорости поглощения 18 природных аминокислот клетками модельного штамма Е. coli TGl при амплификации изучаемых генов. Показано, что повышенная экспрессия 5 генов сказывается на скорости поглощения некоторых аминокислот клетками данного штамма.

Исследовано влияние повышенной экспрессии изучаемых генов на продуктивность десяти штаммов E.coli - продуцентов различных природных аминокислот. Обнаружено, что при амплификации 9 генов происходит изменение уровня накопления синтезируемой аминокислоты некоторыми штаммами-продуцентами.

Компьютерный анализ upstream-областей изучаемых генов выявил перед 16 из них предполагаемые места связывания 10 различных регуляторов E.coli. Кроме того, в регуляторной области двух исследуемых генов были обнаружены возможные места связывания неохарактризованных на данный момент регуляторных белков.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на VIII-ой Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 17-21 мая 2004г.); Смотре-конкурсе работ сотрудников АГРИ (Москва, 14-18 июня 2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, из них одна в отечественном журнале, одно тезисное сообщение в материалах научной конференции и три патента.

Структура работы. Диссертация изложена на 90 стр. печатного текста, включая 17 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитированной литературы (119 наименований).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы, плазмиды, среды. При выполнении работы использовался штамм E.coli TGI (supE hsd thi A(proAB-lac) F'[traD36 pro AB* lacfi lacZAM15]), полученный из музея ФГУП ГНИИгенетика.

В работе использованы следующие созданные ранее, а также коммерчески доступные ДНК плазмид:

• pACYC184 (GenBank/EMBL accession number X06403)

• pMWl 19 (GenBank/EMBL accession number AB005475)

• pET-Plac-ilvA* (получена от С.В. Смирнова, ЗАО «АГРИ»)

• pJEL250 ( получена от А.С. Миронова, ФГУП ГосНИИгенетика)

В качестве полноценной среды использовали L-бульон или L-arap, в качестве минимальной - жидкую или агаризованную среду Адамса с необходимыми добавками. Для обеспечения селективного роста клеток с плазмидами в среду добавляли ампициллин (50 мкг/мл) или хлорамфеникол (30 мкг/мл).

Манипуляции с ДНК. Выделение плазмидной ДНК, рестрикционное расщепление и лигирование ДНК, трансдукционное скрещивание с участием фага

а также проведение зависимой трансформации клеток

осуществляли в соответствии с общепринятыми экспериментальными протоколами (Миллер Дж., 1976; Маниатис Т. и соавт., 1984).

Определение предельной неингибирующей концентрации (ПНК) веществ, влияющих на рост бактерий. Ночную культуру E.coli TGI, выращенную в L-

бульоне при 37°С, разводили в 25 раз той же средой и подращивали до середины логарифмической фазы. Клетки собирали центрифугированием и отмывали 0,9% раствором NaCl. После этого клетки высевали на агаризованную среду Адамса с различными концентрациями исследуемого вещества. Для каждого изучаемого вещества определяли ПНК, т.е. такое его количество, при котором еще не уменьшается число выживших колоний на чашке или их размер по сравнению с колониями, растущими на среде Адамса без добавок в течение 1-3 дней при 37°С.

Оценка скорости поглощения аминокислот клетками E.coli. Ночную

культуру бактериального штамма, содержащего гибридные плазмиды, разводили в 20 раз средой Адамса с ампициллином и выращивали до середины логарифмической фазы при 37°С и 240 об/мин. В тех случаях, когда требовалась индукция экспрессии клонированных генов, рост производили в присутствии 0,5 мМ IPTG. Далее, для прекращения процесса трансляции в клетках, к культуре добавляли хлорамфеникол (100 мкг/мл), инкубировали еще 5 минут и определяли оптическую плотность при 595 нм. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл охлажденной (+4°С) среды Адамса, содержащей хлорамфеникол и изучаемую аминокислоту (25-100 мкг/мл), меченую радиоактивно (1-10 мкКю). Смесь помещали в термостат (37°С) и через определенные промежутки времени отбирали пробы, которые делили на две равные части. Одну часть фильтровали через нитроцеллюлозный фильтр (Millipore, размер пор - 0,45 мкм) и быстро отмывали от несвязанной метки охлажденной средой Адамса. Вторую часть пробы обрабатывали 5%-ной трихлоруксусной кислотой и фильтровали через нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Разность между радиоактивностью первого и второго фильтра принималась как количество несвязанной метки, что соответствовало внутриклеточному содержанию аминокислоты, не включенной в белки, мембраны и т.п. Вычисленный пул аминокислоты нормировался на оптическую плотность

культуры и использовался для оценки скорости поглощения исследуемой аминокислоты клетками Е. coli.

Программное обеспечение компьютерных исследований. При выполнении

работы использовались следующие компьютерные программы и базы данных:

1) программы для сравнительного анализа геномов: Cognitor (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/COG), WIT2 (http://selkov7.mcs.anl.gov/WIT/),

PSI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/);

2) программы для анализа нуклеотидных последовательностей: ClustalW(http://www. ebi.ac.uk/clustalw/),

BlastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/);

3) программа для предсказания числа трансмембранных сегментов (ТМС): Tmpred (www.microbiology.adelaide.edu.au/learn/tmpred.html);

4) базы данных: GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/), SWISSPROT (http://expasy.hcuge.ch/sprot//scnpsitl .html), TCDB (http://www.biology.ucsd.edu/~ipaulsen/transport), DPInteract (http://arep.med.harvard.edu/ dpinteract).

Кроме этого, в исследованиях использовались компьютерные программы SignalX и Genome Explorer, разработанные в лаборатории биоинформатики ФГУП ГосНИИгенетики (Миронов А.А. и соавт., 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Компьютерный отбор генов-кандидатов. На первом этапе работы необходимо было выявить среди неохарактеризованных гипотетических белков E.coli те, которые могут участвовать в транспорте аминокислот. Весьма эффективным подходом для такого отбора является сравнительный анализ генома E.coli с геномами других микроорганизмов при помощи специальных компьютерных программ. Эти программы основаны на алгоритмах, позволяющих в результате анализа возможных открытых рамок считывания E.coli найти

гомологи среди белков с известными функциями у других организмов, что, в свою очередь, может служить основанием предположить эти функции для предполагаемого белка Е. coli

Известно, что транспортеры представляют собой интегральные мембранные белки, содержащие в своём составе так называемые трансмембранные сегменты, т.е. области с повышенным содержанием неполярных аминокислот. Для большинства известных мембранных белков минимальное число таких участков равно четырем. Поэтому с помощью программы для предсказания числа возможных трансмембранных сегментов Tmpred осуществили поиск таких полипептидов по всему геному Е coli. В результате был получен список, состоящий из 517 гипотетических трансмембранных белков (Рис. 1).

белки, для когорых не было обнаружено гомологии с известными белками

белков с числом ТМС

Рис. 1. Процедура отбора генов E coli, которые могут кодировать неизвестные транспортеры аминокислот

Анализ данного списка показал, что 285 из них уже описаны как транспортеры (Saier J. et al., 1999), 69 выполняют установленную, но не транспортную функцию, а 163 гипотетических белка ещё функционально неохарактеризованы. К белкам из последней группы последовательно применялись программы для сравнительного анализа геномов: Cognitor, WIT2, PSI BLAST.

В результате был сформирован список из 30 гипотетических белков E.coli, не описанных ранее и имеющих гомологию с известными транспортерами или белками систем множественной лекарственной устойчивости.

Из данных литературы известно, что ряд транспортных систем представляет собой комплексы трансмембранных белковых компонентов с субстратспецифичными растворимыми белками. Структурные части таких многокомпонентных систем обычно кодируются генами, организованными в один оперон, что необходимо для их координированной экспрессии. Поэтому был проведен анализ возможной оперонной организации всех 30 генов, кодирующих отобранные на предыдущем этапе белки. Данное исследование основывалось на предположении, что изучаемый ген и окружающие его гены находятся в опероне, если (Рис. 2):

Оперон

__А._„

• расстояние между ними не более [rcujv4^ НИВИ^ Геном А 100 пар оснований;

• между ними отсутствует последовательность, характерная для промоторов;

• первые два условия выполняются для ортологов этих генов в

близкородственных организмах. Рис. 2. Анализ изучаемых генов на

возможную оперонную организацию

В результате было установлено, что 8 из ранее отобранных кандидатов могут входить в гипотетические опероны (Табл.1). В таких случаях в дальнейшем исследовался полный оперон.

Таблица 1. Неохарактеризованные белки Е.еоН, отобранные в результате компьютерного анализа как возможные транспортеры аминокислот

Белок Число TMC Гомология с известными транспортерами лучший гомолог степень гомологии (E-value) Исследуемые гены

В2680т 8 MhpT E.coli (тр-р 3-гидроксипропионата) 9е'6'> Ь2680ш*

YjiJ 11 Tcr_E.coli (экс-р тетрациклина) е- И«

YicK 10 Bmr B.sub (множ. лек. уст.) 5е'" yicK

YeiO 9 Nor A S.auerus (устойчивость к хинолину) 4е*8:1 yeiO

YabM 10 Nor А S.auerus (устойчивость к хинолину) е'88 yabM

YjdL 13 Pt2b Arab, thaliana (тр-р олигопептидов) e"l<lU yjdL

YgeD 8 Ter E.coli (тр-р тетрациклина) е'111 aas-ygeD

YfhS 8 LacY E.coli (тр-р лактозы) е"1Ш yfhS

YhcP 12 FusC Bur. cepacia (устойч. к фузаровой к-те) 4e"t,s yhcO-P-Q-R

В1645 11 FusC Bur. cepacia (устойч. к фузаровой к-те) le?' Ы643-44-45

B1841 7 CopD Ps. syringae (устойч. к солям меди) 8е"'4 Ы840-41

YhfK 10 ProP E.coli (пролин/бегаин тр-р) бе"" yhfK**

YccS 9 Jenl Sac. cerevisiae (множ. лек. устойч-ть) е"/6 yccF-S

YiaN 10 GntP B.sub (тр-р глюконата) 4е"'" yiaN-M-O

YhgN 6 MarC E.coli (множеств, лек. устойч-ть) Зе'ы yhgN

YchE 5 MarC E.coli (множеств, лек. устойч-ть) 4е"" ychE

YfcC 11 CitM B.sub (М^/цитрат тр-р) 2e"sl yfcC

YfbS 12 TtdT E.coli (переносчик тартрата) е"У0 yfbS

YbdA 9 Bcr E.coli (устойч-ть к бицикломицину) Зе'88 ybdA

YhiD 4 AtmC S.typh (Mg^ -транспортер) 7е"" yhffi

YfdC 5 FocA E.coli (транспортер формиата) е"'8 yfdC

YgaZ 5 AzlC B.sub (тр-р разветвленных аминок-т) Зе"'и ygaZ-H

YraQ 8 Arb2 E.coli (устойч-ть к солям мышьяка) бе"'8 yraQ

YeiU 5 BcrC B.lich (тр-р бацитрацина) бе"4* yeiU-R

YbjG 4 BcrC B.lich (тр-р бацитрацина) 4е"ч~ ybjG

YfeH 6 NTCI H.sapiens (тр-р желчных кислот) 9е"'8 yfeH

YgjT 7 TerC Alcaligenes sp. (устойч. к теллуру) 2е"82 ygjT

YgdQ 6 TerC Alcaligenes sp. (устойч. к теллуру) е"34 ygdQ

B2372 9 Ntcl Rabbit (тр-р желчных кислот) 2e"4U b2372

YbiF 7 YedA E.coli (множеств, лек. устойч-ть) Зе"м ybiF

*- жирным шрифтом выделены те гены, которые удалось клонировать в составе

мультикопийного вектора с получением сегрегационно стабильных гибридных плазмид **- курсивом выделены гены, которые были делегированы на хромосоме Е.еоЫ TGl

Клонирование отобранных генов в составе мультикопийных плазм ид. Для

изучения предполагаемых транспортных функций белков, отобранных после компьютерного анализа, соответствующие этим белкам гены клонировались на мультикопийных плазмидах под контролем регулируемого промотора.

В качестве вектора для клонирования была выбрана плазмида pET-Piac-ilvA, которая была сконструирована С.В. Смирновым (ЗАО «АГРИ») на основе pET22b+ (Novagene, США). Для возможности контроля транскрипции изучаемых генов на средах с IPTG и X-gal мы модифицировали данный вектор: за сайтом BamHl поместили беспромоторную часть гена lacZ, кодирующего а-пептид г$кактозидазы E.coli. Полученный вектор был назван pKRl.

Схема клонирования представлена на Рис. 3. Участки хромосомы E.coli TG1, содержащие исследуемые гены с собственными SD-последовательностями, амплифицировали с помощью ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для ПЦР, содержали сайты узнавания рестриктаз Xbal и BamHI (в некоторых случаях Bgl II) для последующего клонирования на pKRl вместо гена ilvA.

Рис. 3. Схема клонирования исследуемых генов в составе мультикопийного вектора рКШ.

В результате были получены 27 гибридных плазмид с исследуемыми генами. Три фрагмента ДНК, содержащие гены yfdC, yhflC и оперон yhcOPQR, не удалось клонировать на этот вектор. Кроме того, из полученных гибридных плазмид 6 оказались сегрегационно нестабильными в штамме E.coli TG1. Переход на вектор pMW119 с малым числом копий на клетку не изменил ситуации. Поэтому мы инактивировали некоторые из изучаемых генов на хромосоме TG1, встроив в их структурную часть ген устойчивости к антибиотику хлорамфениколу (Табл. 1). В дальнейшей работе использовались эти маркированные делеции и стабильные гибридные плазмиды на основе мультикопийного вектора.

Влияние амплификации (инактивации) исследуемых генов на устойчивость E.coli к различным ингибиторам клеточного роста. Компьютерный анализ показал, что большинство изучаемых генов имеют гомологию с генами, кодирующими компоненты систем множественной лекарственной устойчивости (Табл. 1). Поэтому мы проверили влияние амплификации (в некоторых случаях инактивации) отобранных генов на устойчивость модельного штамма E.coli TGI к ряду веществ (аминокислотам и их аналогам, антибиотикам, детергентам и т.п.; всего 50 соединений).

Для всех этих химических соединений мы подобрали предельную неингибирующую концентрацию (ПНК) в питательной среде, при которой еще не наблюдалось угнетения роста модельного штамма. Далее, исследуемые культуры (с гибридными плазмидами или маркированными делециями) высевали на среды с химическими соединениями в трех разных концентрациях: 0,5хПНК, 1хПНК и 2хПНК и изучали изменение чувствительности бактерий к этим веществам. Подобный подход позволил регистрировать как увеличение, так и снижение устойчивости культуры к тестируемым соединениям.

В результате было установлено, что при амплификации (инактивации) большинства исследуемых генов наблюдается изменение чувствительности модельного штамма к ряду химических соединений, причем 14 генов влияли на устойчивость бактерий к аминокислотам и их аналогам (Табл. 2).

Таблица 2. Эффект амплификации исследуемых генов на устойчивость Е.еоН к ряду аминокислот и их аналогов

Ген(ы) АМИНОКИСЛОТЫ (ИЛИ ИХ аналоги), для которых наблюдали увеличение

устойчивости штамма TG1 чувствительности штамма TG1

Ь1643-44-45 - цистеин

b2372 - тиоизолейцин, т-ф гортирозип, метилтриптофан

Ь2680т триптофан -

ybiF 3,4-дигидропролин, о-метилтреонин, а-метилтриптофан,

серии, 4-азалейцин, гомосерин, 1,2,4-триазол-З-аланин

гидроксинорвалин, гистидин

ychE о-метилсерин, гомосерин -

yeiO - метионин

yfbS а-метилтриптофан -

yfcC триптофан -

ygaZ-H 3,4-дигидропролин, о-мети лтреонип, тиоизолейцин, о-метилсерин, валин, 4-азалейцин, о-фторфенилаланин -

ygdQ - серии, 1,2,4-триазол-З-аланин, а-метилтриптофан

yhgN 6-диазо-5-оксо-норлейцин, о-метилсерин, гидроксинорвалин -

yiaN-M-0 - изолейцин, m-фтортирозин, аргинин

yicK - а-метилтриптофан

yjiJ 3,4-дигидропролин -

Поскольку изучаемые гены были отобраны как гомологи известных транспортных систем, то можно предположить, что наблюдаемые явления связаны с транспортом веществ через мембрану: увеличение устойчивости вызвано активным выбросом веществ из клетки, а её уменьшение, наоборот, усилением транспорта внутрь. Заметим, что в ряде случаев (гены ybiF, ygaZH) наблюдается усиление устойчивости к одним соединениям и снижение к другим. Отталкиваясь только от транспортной гипотезы трудно объяснить механизм данного явления. Однако в литературе присутствуют данные о схожем наблюдении. Так было показано, что при амплификации гена cmlA из E.coli наряду с появлением фенотипа мультирезистентности к ряду химических соединений присутствует увеличение чувствительности данной бактерии к антибиотику спектиномицину (Bohn С, Bouloc Р., 1998).

В дальнейших экспериментах мы исследовали 14 генов, амплификация которых сказывалась на спектре устойчивости модельного штамма TG1 к аминокислотам и их аналогам.

Изучение эффекта амплификации исследуемых генов на скорость поглощения аминокислот клетками E.coli. Для проверки гипотезы о том, что наблюдаемые изменения в устойчивости E.coli к аминокислотам и их аналогам при амплификации изучаемых генов связаны с транспортом этих соединений, исследовали влияние генов на скорость поглощения аминокислот модельным штаммом Е. coli TGI.

В работе использовались 18 природных аминокислот, меченых радиоактивно. Эксперименты показали, что лишь 5 из исследованных генов влияли на характер поглощения, причем эффект был IPTG-зависимым (Рис. 4). Было установлено, что повышенная экспрессия гена Ь1645 приводит к увеличению скорости поглощения лейцина, yfbS - аланина, а Ь2372 - аспартата. При амплификации гена yhgN наблюдается уменьшение скорости поглощения сразу двух аминокислот: гистидина и аргинина. При введении в клетки гибридной плазмиды с геном снижалось поступление в них треонина, пролина и аргинина, но увеличивалось поглощение глутамата.

Специфичность эффектов свидетельствует о том, что обнаруженные изменения не являются артефактом, связанным, например, с изменением общей проницаемости клеточной стенки при амплификации генов, кодирующих мембранные белки. Более вероятным является предположение о том, что эти белки могут быть компонентами специфических транспортных систем. Действительно, амплификация ybiF не только заметно меняла скорость поглощения нескольких аминокислот, но и обеспечивала множественную устойчивость клеток штамма TG1 к ингибиторам роста. Однако изменения в поглощении аминокислот, вызванные амплификацией

слабо коррелируют с тем эффектом, который оказывали эти гены на спектр устойчивости клеток штамма TG1. Кроме того, повышенная экспрессия оперона оказавшая плейотропный эффект на чувствительность бактерий, не изменила скорость поглощения какой-либо аминокислоты.

Рис. 4. Эффект амплификации исследуемых генов на скорость поглощения некоторых аминокислот штаммом E.coli TG1.

13

Данное несоответствие может объясняться тем, что для проявления эффекта необходимы определённые условия, а возможно, и некий генетический «бэкграунд», отсутствующий в экспериментах с мечеными аминокислотами. Тем не менее, эксперименты показали, что исследуемые гены могут влиять и на уровень устойчивости клеток к токсическим концентрациям аминокислот, и на скорость их поглощения, хотя эти свойства бактерий могут также зависеть от множества других факторов, взаимодействие которых и определяет полученные эффекты.

Влияние амплификации изучаемых генов на продуктивность штаммов E.coli- продуцентов аминокислот. Амплификация 14 изучаемых генов изменяла уровень устойчивости модельного штамма TG1 к ряду аминокислот или их аналогов, причем пять генов влияли на скорость поглощения клетками этих соединений. Наблюдаемые явления могут быть связаны с изменением переноса веществ через мембрану E.coli, что, в свою очередь, может сказаться на уровне синтеза внутриклеточных метаболитов. Поэтому влияние амплификации данных генов исследовали также на имевшихся в нашем распоряжении штаммах E.coli -продуцентах 10 природных аминокислот.

Таблица 3. Эффект амплификации исследуемых генов на продуктивность некоторых штаммов Е. coli- продуцентов аминокислот

Гены Изменение продуктивности штаммов-продуцентов следующих аминокислот (в % к контрольному* штамму):

Thr lle Val Leu His Pro Arg Glu Phe Met

b1643-44-45 63

b2372 75 68 86 85

ybiF 120 56 51 144 141

ychE 125 131 64

yfbS 68

yfcC 83

ygaZ-H 213 120 123 200 195 176

ygdQ 80

yhgN 61 133 125

в качестве контрольного штамма использовался тестируемый продуцент,

трансформированный векторной плазмидой (Рис. 3).

В Таблице 3 представлены те результаты, когда амплификация исследуемых генов приводила к изменению продуктивности тестируемых штаммов. Как видно, повышенная экспрессия 9 исследуемых генов приводит к изменению продуктивности ряда продуцентов. Гены ygdQ, у/сС, уА>Б и оперон Ы643-Ы644-Ы645 изменяли уровень продукции только у отдельных продуцентов, остальные -влияли на продуктивность сразу нескольких штаммов, но характер влияния был различен. Амплификация генов уЫЕ, усИЕ и yhgN увеличивала выход аминокислоты у одних продуцентов и уменьшала в других. В то же время влияние гена Ь2372 и оперона у%а2Н на продуценты было единообразно: амплификация Ь2372 приводила только к снижению, а ygaZH только к увеличению уровня продукции ряда штаммов. При этом следует отметить, что повышенная экспрессия гена Ь2372 увеличивала чувствительность модельного штамма Т01 сразу к нескольким веществам, в число которых входили и аналоги аминокислот, а амплификация оперона приводила к фенотипу

множественной устойчивости этого штамма к ряду аминокислот и их аналогов (см. Табл. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что амплификация ygaZH увеличивала продукцию именно тех аминокислот, к которым повышала устойчивость модельного штамма Т01. Что касается остальных генов, то явной закономерности между влиянием их амплификации на продуктивность штаммов и на устойчивость модельного штамма Т01 не прослеживается. По-видимому, в большинстве случаев одной амплификации генов недостаточно; для проявления эффекта необходимы определенные условия, а возможно и определённое генетическое окружение. Подтверждением этому может служить влияние оперона на продукцию лейцина. Как видно из Таблицы 3, введение

плазмиды с этими генами приводило к увеличению продукции в пяти различных штаммах (продуценты треонина, валина, пролина, фенилаланина и метионина). Однако эффект на продукцию лейцина, как оказалось, в значительной степени зависел от генотипа штамма-продуцента: амплификация оперона увеличивала продукцию этой аминокислоты только в тех штаммах, у которых отсутствовал ген кодирующий аминотрансферазу разветвленных аминокислот. При наличии этого гена на хромосоме либо не происходило изменения продуктивности, либо

отмечалось даже снижение продукции лейцина. Причина этой закономерности неясна, но, безусловно, изучение данного феномена может не только помочь в установлении биологической функции белков, кодируемых генами ygaZ и ygaH, но и открыть новые пути для увеличения продукции лейцина в клетках E.coli.

Поиск сайтов связывания регуляторных белков перед исследуемыми генами. Ещё одним способом установления функции гена является изучение его регуляции. Наличие одинаковых регуляторных участков перед генами позволяет судить об их участии в одном метаболическом процессе. Поэтому мы провели анализ нуклеотидных последовательностей перед исследуемыми генами (upstream-области) с помощью компьютерных программ, специально разработанных для таких целей.

При исследовании использовалось два подхода: поиск перед исследуемыми генами предполагаемых мест связывания известных белков-регуляторов Е. coli из базы данных DPInteract и анализ upstream-областей на предмет присутствия сайтов связывания неизвестных регуляторов E.coli. Второе осуществляли, исходя из того, что наличие консервативного участка ДНК перед ортологами в близкородственных организмах является серьёзным основанием предположить, что эта последовательность представляет собой сайт связывания регуляторного белка. Для этого upstream-области исследуемого гена и его ортологов выравнивали с помощью программы для множественного выравнивания ClustalW, после чего осуществляли поиск консервативных участков. В том случае, если такой участок обнаруживался, для него с помощью программы SignalX составляли весовую матрицу, которую использовали для поиска похожих сигналов по всему геному E.coli. Для тех генов, перед которыми обнаруживался гомологичный участок ДНК, процедура повторялась. В итоге мы получали набор генов E.coli, в регуляторной области которых присутствует гипотетический сайт связывания неизвестного регулятора.

В результате проведенной работы перед 16 изучаемыми генами были обнаружены возможные сайты связывания 10 различных регуляторов E.coli (Табл. 4). В основном это регуляторные белки стрессовых условий (SoxS, CpxR, OmpR), а кроме того, регуляторы аэробного/анаэробного развития (ArcA, Fnr) и

16

некоторые глобальные регуляторы E.coli (Fis, Crp). Отметим, что исследуемые гены кодируют белки, гомологичные транспортерам систем множественной лекарственной устойчивости, необходимым для защиты клеток в неблагоприятных условиях. Поэтому насыщенность upstream-областей изучаемых генов возможными сайтами связывания стрессовых регуляторов представляется вполне обоснованной. К тому же это служит ещё одним подтверждением предположения о том, что для функционирования исследуемых генов необходимы определенные условия, например, состояние стресса.

Таблица 4. Вероятные сайты связывания регуляторных белков E.coli, которые были обнаружены перед исследуемыми генами

Ген(ы) E.coli Регуляторный белок E.coli

b1643-44-45 OmpR, Fnr, SoxS, FarR (2 сайта)

b1841-40 OmpR

Ь2680т SoxS

ybdA OmpR, SoxS (2 сайта)

ybjG OmpR (2 сайта), PhoB, Fis (2 сайта)

yccF-S PhoB Crp, CpxR

ychE ArcA, CpxR, Fis (3 сайта)

yeiO SoxS

yfbS SoxS

yfhS FarR, Crp, SoxS

ygdQ Fis

yz/T CpxR

yhgN OmpR

yiaM-N-0 Crp, FarR

yicK NagC, SoxS, FarR, ArcA

Помимо обнаруженных предполагаемых мест связывания известных регуляторов Е.еоН, перед двумя исследуемыми генами были найдены возможные сайты связывания неизвестных регуляторных белков. В одном случае (сайт X,) мы предположили, что этот участок является местом связывания гипотетического регулятора, продукта гена Ы642, дивергентно расположенного к исследуемому оперону Ы643-44-45 (Рис. 5).

Исходя из того, что В1642 гомологичен регуляторному белку SlyA из Salmonella typhimirium, контролирующему синтез гемолизина (Stapleton M., et al., 2001), и что похожий сайт связывания был

обнаружен перед геном рис. 5, Расположение сайта XI в upstream-области критического гемолизина гипотетического оперона b1643-44-45

hlyE E.coli, мы предположили, что белки, кодируемые опероном b1643-44-45, могут принимать участие в секреции этого пептида.

В другом случае (вкеХг) для гена yfeH поиск похожих участков по геному E.coli продемонстрировал наличие таковых у четырёх пар генов, организованных определенным образом (Рис. 6): один ген кодирует регуляторный белок, а направленный противоположно второй ген каждой пары кодирует

либо растворимые белки Рис. 6. Группы генов, в upstream-областях которых

обнаружен гипотетический сайтХ2.

(Ь3356, Ь0618 и асгЕ), либо

белки, содержащие трансмембранные сегменты

Судить о типе регуляции и возможной биологической функции исследуемого гена здесь затруднительно. Можно только предположить, что продукт гена участвует в процессах формирования лекарственной

устойчивости бактерии, поскольку оперон кодирует одну из основных

MDR-систем E.coli (Kobayashi К. et al., 2001).

Список сокращений. ТМС - трансмембранный сегмент; тр-р -транспортер; экс-р - экспортер; IPTG - изопропил-Р-тиогалактопиранозид; X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-О-галактопиранозид;

выводы

1. На основании сравнительного анализа генома E.coli с геномами других организмов были отобраны 30 неохарактеризованных гипотетических генов, кодирующих белки гомологичные известными транспортерами. Анализ на возможную оперонную организацию показал, что 8 из них могут входить в гипотетические опероны.

2. Исследовано влияние повышенной экспрессии отобранных генов на уровень устойчивости клеток E.coli к 50 соединениям различной химической природы. Установлено, что амплификация 14 исследуемых генов приводит к изменению устойчивости модельного штамма E.coli TGl к ряду аминокислот или их аналогов.

3. Изучено влияние амплификации 14 исследуемых генов на скорость поглощения 18 природных аминокислот клетками модельного штамма E.coli TGl. Обнаружено, что повышенная экспрессия 5 из них сказывается на скорости поглощения некоторых аминокислот клетками этого штамма.

4. Осуществлены ферментации штаммов-продуцентов 10 природных аминокислот при амплификации 14 исследуемых генов. Показано, что 9 генов изменяют уровень продукции аминокислот некоторыми штаммами.

5. Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей перед исследуемыми генами (upstream-областей) на предмет обнаружения предполагаемых мест связывания как известных регуляторных белков E.coli, так и неизвестных регуляторов. Обнаружено, что в upstream-областях 16 изучаемых генов присутствуют потенциальные сайты связывания 10 различных регуляторов E.coli, а в регуляторной области двух генов — возможные места связывания неохарактеризованных на данный момент регуляторных белков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., Хургес Е.М. 2004. "Поиск новых генов E.coli, ответственных за транспорт аминокислот". Биотехнология, №2, стр.31-47

2. Рыбак К.В., Сливинская Е.А., Хургес Е.М. 2004. "Исследование некоторых неохарактеризованных генов E.coli, которые могут кодировать транспортеры аминокислот". Тезисы докладов VIII Международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино, стр.29

3. Рыбак К.В., Таболина Е.А, Хургес Е.М., Ворошилова Э.Б., Гусятинер М.М. "Способ получения L-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia (ygaZH)" . Патент РФ №2215784 от 10.10.2003, дата приоритета 13.02.2001.

4. Рыбак К.В., Таболина Е.А, Хургес Е.М. "Способ получения L-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia

Патент РФ №2215785 от 10.10.2003, дата приоритета 28.06.2001.

5. Рыбак К.В., Таболина Е.А, Хургес Е.М. "Способ получения L-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia Патент РФ №2215782 от 10.10.2003, дата приоритета 26.02.2001.

Принято к исполнению 14/01/2005 Исполнено 15/01/2005

Заказ № 547 Тираж: ПО экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www. autoreferat .ru

i S

к ?

. „ .. ,Л- V

1 o c.Li £. -X

746

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рыбак, Константин Вячеславович

I Введение.

II. Обзор литературы.

1. Транспортные белки. Общие положения.

2. Бактериальные экспортеры аминокислот.

2.1 Экспортеры обнаруженные у Coryncbacterium glutamicum.

2.1.1 Экспортер лизина и аргенина LysE.

2.1.2 Экспортер треонина и серина ThrE.

2.1.3 Экспортер разветвленных аминокислот BmEF.

2.2 Экспортеры обнаруженные у Escherihia coli.

2.2.1 Экспортеры гомосерина и треонина - RhtA и RhtB.

2.2.2 Экспортеры L-цистеина и О-ацетил-Ь-серина - YdeD и YßK.

2.2.3 Экспортер L-аргинина - YggA (ArgO).

3. Системы множественной лекарственной устойчивости (MDR).

3.1 Классификация MDR транспортеров.

3.1.1 MDR транспортеры ЛВС-типа.

3.1.2 Вторичные MDR транспортеры.

3.2 Регуляция работы систем MDR-транспорта.

3.3 Физиологическая роль MDR-транспортеров.

III. Материалы п методы.

IV. Результаты п обсуждении.

1. Компьютерный поиск гипотетических белков E.coli, способных транспортировать аминокислоты.

2. Клонирование исследуемых генов в составе мультикопийных плазмид.

3. Влияние гибридных плазмид иа устойчивость клеток Е.coli к различным ингибиторам клеточного роста.

4. Изучение эффекта амплификации исследуемых генов на скорость поглощения аминокислот.

5. Влияние амплификации изучаемых генов на продукцию штаммов E.coli

- продуцентов аминокислот.

6. Поиск сайтов связывания регуляторных белков перед исследуемыми генами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск новых генов Escherichia Coli, участвующих в экспорте аминокислот"

Бактериальная клетка - открытая система, которая непрерывно обменивается с окружающей средой веществом и энергией. Единство автономности и, вместе с этим, тесной связи с окружающей бактерию средой осуществляет биологическая мембрана. Важнейшей функцией любой клеточной мембраны является граничная, которая заключается в создании барьера с селективной проницаемостью, позволяющего как пропускать, так и удерживать необходимые для жизнедеятельности клетки вещества. Во многих случаях биологического транспорта основой переноса веществ является их диффузия по градиент>г концентрации через клеточную мембрану. Однако перенос ряда веществ, например заряженных или гидрофильных, в силу их физико-химических свойств затруднен. Кроме того, для определенных процессов необходимо накапливать вещества, осуществляя перенос против их перепада концентраций. Для этих целей микроорганизмы обладают большим числом специальных транспортных систем, состоящих из одного или нескольких пронизывающих мембрану (трансмембранных) белков.

Как известно, движение веществ через клеточную мембрану не является однонаправленным. В процессе жизнедеятельности бактерии не только поглощают из окружающей среды питательные вещества, но и освобождаются от токсичных продуктов собственного метаболизма, транспортируют сигнальные молекулы, кроме того, многие видел продуцируют антибиотики и экзоферменты. Отдельно стоит отметить важность систем мембранного транспорта для выживания микроорганизмов в неблагоприятных условиях.

Стоить заметить, что о транспортных системах осуществляющих поступление веществ внутрь бактериальной клетки накоплена довольно обширная информация. Определены участвующие в большинстве этих процессов белки, энергетика транспорта, предложены механизмы переноса и возможные схемы регуляции. Что касается транспорта наружу, то функционирование таких систем изучено в меньшей степени. Однако открытие феномена множественной лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов и связанная с этой проблемой необходимость её решения активизировало изучение процессов переноса вещества из клетки наружу. Присутствие таких транспортных систем уже обнаружено у многих организмов и объём такого рода информации всё возрастает.

Наряду с чисто фундаментальными задачами, проблема транспорта веществ из клетки имеет важное значение и в прикладном аспекте. Создание эффективных продуцентов аминокислот - комплексная задача, требующая решения множества проблем, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести увеличение экспрессии биосинтетичеких генов, достаточный уровень предшественников требуемой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза и жизнедеятельности клеток и т.д. Одной из таких задач является эффективный транспорт синтезированной аминокислоты из бактериальной клетки. Выброс из клетки продукта может сдвинуть в нужном направлении равновесие в цепи необходимых биохимических реакций, решить проблему негативного контроля синтеза целевого продукта, который в большинстве случаев осуществляет аминокислота, не допустить накопления в клетке ее токсических количеств.

Данная работа представляет собой поиск среди ¡^охарактеризованных генов Е.соИ тех, которые могут участвовать в экспорте аминокислот из бактериальной клетки, а также оценка их влияния на продуктивность некоторых штаммов Е.соИ - продуцентов различных аминокислот.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рыбак, Константин Вячеславович

VI. выводы

1. На основании сравнительного анализа генома E.coli с геномами других организмов были отобраны 30 неохарактеризованных гипотетических генов, кодирующих белки гомологичные известными транспортерами. Анализ на возможную оперонную организацию показал, что 8 из них могут входить в гипотетические оиероны.

2. Исследовано влияние повышенной экспрессии отобранных генов на уровень устойчивости клеток E.coli к 50 соединениям различной химической природы. Установлено, что амплификация 14 исследуемых генов приводит к изменению устойчивости модельного штамма E.coli TGI к ряду аминокислот или их аналогов.

3. Изучено влияние амплификации 14 исследуемых генов на скорость поглощения 18 природных аминокислот клетками модельного штамма E.coli TGI. Обнаружено, что повышенная экспрессия 5 из них сказывается на скорости поглощения некоторых аминокислот клетками этого штамма.

4. Осуществлены ферментации штаммов-продуцентов 10 природных аминокислот при амплификации 14 исследуемых генов. Показано, что 9 генов изменяют уровень продукции аминокислот некоторыми штаммами.

5. Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей перед исследуемыми генами (upstream-областей) на предмет обнаружения предполагаемых мест связывания как известных регуляториых белков E.coli, так и неизвестных регуляторов. Обнаружено, что в upstream-областях 16 изучаемых генов присутствуют иотенциатьные сайты связывания 10 различных регуляторов E.coli, а в регуляторной области двух генов - возможные места связывания неохарактеризованных на данный момент регуляториых белков.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачей данной работы являлось обнаружение среди ¡^охарактеризованных белков Е.соИ тех, которые могут транспортировать аминокислоты. Для этого на основании сравнительного анализа генома Е.соИ с геномами других микроорганизмов были отобраны открытые рамки считывания Е.соИ, кодирующие белки гомологичные известным транспортерам. Результаты такого подхода носят предсказательный характер и требуют экспериментальной проверки. Поэтому изучались три характеристики исследуемых генов, а точнее влияние их повышенной экспрессии па: а) устойчивость клеток Е.соИ к ингибирующим концентрациям веществ различной химической природы, б) скорость поглощения этой бактерией различных природных аминокислот и в) продуктивность некоторых штаммов Е.соИ - продуцентов аминокислот. Безусловно, амплификация случайного гена также может сказаться на одном из этих свойств, но одновременное изменение этих характеристик может являться серьёзным указанием на то, что изучаемый ген кодирует белок с транспортной функцией. В результате было установлено следующее.

Некоторые из отобранных генов могут входить в опероны. Поскольку подобная организация генов подразумевает общую для них функцию, то в таких случаях исследовали весь оиерон. В частности, для генов и у^аН продемонстрирована необходимость их совместной экспрессии для формирования наблюдаемых эффектов.

Повышенная экспрессия некоторых из отобранных генов оказалась токсична для Е.соИ: часть из них вовсе не удалось клонировать, а остальные образовывали сегрегационно нестабильные плазмиды. Смена в таких случаях мультикопийного вектора на малокопийный не изменила ситуацию.

Амплификация исследуемых генов по-разному сказывалась на устойчивости клеток Е.соИ к ингибирующим концентрациям различных химических веществ. Ряд генов увеличивал устойчивость или, наоборот, чувствительность модельного штамма к одному и даже к нескольким соединениям подчас различной химической природы. При этом амплификация некоторых из них приводила к увеличению чувствительности бактерий к одним веществам и одновременно повышала устойчивость к другим. Кроме того, было обнаружено, что повышенная экспрессия ряда генов не сказывается на устойчивости клеток Е.соИ ни к одному из использованных химических соединений.

В итоге удалось отобрать 14 генов, изменяющих устойчивость бактерий к аминокислотам или их аналогам, что могло свидетельствовать об участии кодируемых ими белков в транспорте аминокислот. Именно эти гены изучались в дальнейших экспериментах. Гибридными плазмидами трансформировали клетки некоторых штаммов продуцентов аминокислот и следили за изменением уровня накопления продуцируемой аминокислоты. В результате было обнаружено, что амплификация 9 из 14 исследуемых генов изменяет продуктивность некоторых штаммов: одни геиы увеличивали или уменьшали накопление продуцируемой аминокислоты лишь определенными штаммами, не изменяя продукцию всех остальных продуцентов. Другие влияли на продуктивность сразу нескольких штаммов. Причем амплификация некоторых из них приводила к увеличению накопления аминокислоты в одних продуцентах, и к уменьшению в других. Сравнение полученных данных с таблицей устойчивостей показало, что лишь для трех генов (ybiF, Ь2372 и оперона ygaZlI) существует некоторая корреляция. При этом было замечены некоторые особенности: необходимость определённого генетического «background» для проявления эффекта при амплификации оперона ygaZ-ygall и возможно неоптимальный уровень экспрессии тепа ybiF.

Прямые измерения влияния повышенной экспрессии отобранных генов на скорость поглощения аминокислот клетками E.coli показали, что 5 из исследованных 14 генов влияют на характер поглощения некоторых аминокислот. Причем три гена (yfbS, Ь2372 и Ы645) изменяли пулы какой-либо одной из тестируемых аминокислот, а при амплификации генов ybiF и yhgN наблюдалось изменение скорости поглощения сразу нескольких аминокислот. Совпадение полученных данных с таблицей устойчивостей имела место только для гена ybiF. Действительно, нлазмида pYBIF не только заметно меняла скорость поглощения нескольких аминокислот, но и обеспечивала множественную устойчивость клеток штамма TG1 к ингибиторам роста. Изменения в пулах аминокислот, вызванные остальными плазмидами не коррелировали с тем эффектом, который они оказывали на спектр устойчивости клеток E.coli. Интересно, что амплификация оперона ygaZH, оказавшая плейотропный эффект на устойчивость бактерий, не изменяла скорость поглощения какой-либо аминокислоты. Возможно, одной амплификации генов недостаточно: для проявления эффекта необходимы определенные условия, а возможно и специфический генотип, что отмечалось в опытах с продуцентами.

Таким образом, корреляция между всеми тремя подходами в изучении отобранных генов имела место только для гена ybiF. Поскольку имеются данные литературы о том, что он кодирует транспортер аминокислот [Livshits V., Zakataeva N. et. al., 2003], это говорит о том, что с помощью выбранного метода исследования можно выявлять и охарактеризовать неизвестные белки-переносчики E.coli. К сожалению, полученные данные не позволяют сделать однозначного вывода о том, что остальные исследуемые гены также кодируют аминокислотные транспортеры. Можно только предполагать, что некоторые из них могут транспортировать их в определенных условиях.

Ещё одним подходом в установлении функции гена является изучение его регуляции. Наличие одинаковых регуляторных сайтов перед генами позволяет судить об их участии в одном метаболическом процессе. Поэтому был проведен анализ upstream-областей исследуемых геиов на предмет выявления как сайтов связывания известных регуляторных белков E.coli (из базы данных DPInteract), так и поиск предполагаемых мест связывания неизвестных регуляторов. В результате проведенной работы перед 16 изучаемыми генами были обнаружены возможные сайты связывания 10 различных регуляторов E.coli. В основном это регуляторные белки стрессовых условий, но присутствуют также регуляторы аэробного/анаэробного развития и некоторые глобальные регуляторы E.coli. Заметим, что отобранные гены кодируют белки, гомологичные транспортерам систем множественной лекарственной устойчивости, которые необходимы для защиты клеток в неблагоприятных условиях. Поэтому насыщение upstream-областей изучаемых генов возможными сайтами для стрессовых регуляторов представляется вполне обоснованными. Более того, это служит ещё одним подтверждением предположения о том, что для функционирования исследуемых генов необходимы определенные условия, например, состояние стресса.

Стоит отметить, что в регуляториой области двух исследуемых генов были обнаружены возможные места связывания неохарактризованных на данный момент регуляторных белков. В одном случае (гипотетический оперон Ы642-Ы643-Ы644), исходя из данных литературы и того факта, что похожий сайт был обнаружен перед геном критического гемолизина, мы предположили, что белки, кодируемые этим оиероном, могут принимать участие в секреции гемолизина.

Таким образом, мы охарактеризовали группу генов E.coli и получили данные о физиологическом эффекте их амплификации на такие свойства E.coli как устойчивость к ингибирутощим концентрациям большого списка весьма разнообразных веществ, скорости поглощения некоторых аминокислот и способности штаммов продуцировать различные аминокислоты. Кроме того, с помощью специализированных компьютерных программ были проанализированы upstream-области этих генов на предмет выявления возможной регуляции. Полученные данные позволили выдвинуть ряд предположений о возможной функции исследованных геиов, а также выбрать некоторых из них как наиболее привлекательных кандидатов для дальнейших более целенаправленных исследований. Безусловно, эти результаты являются важным этапом в изучении этих ^охарактеризованных генов E.coli и могут помочь в дальнейших попытках функционально охарактеризовать эти гены.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыбак, Константин Вячеславович, Москва

1. Домакова Е.В., Эррайс ЛЛ, и др. (1998) Роль дополнительных сайтов связывания CytR белка в регуляции экспрессии гена udp Escherihia coli. Генетика 34(8), 1063-72

2. Кихнер 10. (1981) Тонкослойная хроматография. Мир. Том 1, стр. 478-485i

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Издательство "Мир"

4. Миллер Дж. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Издательство "Мир"

5. Миронов А.А., Винокурова II.П., Гельфанд М.С. (2000) Программное обеспечение анализа бактериальных геномов. Мол. Биология, 34(2), 253-262

6. Abramson J., Smirnova I., Kasho V., Verner G., Ivvata S., Kaback H. (2003). The lactose permease of Escherichia coli: overall structure, the sugar-binding site and the alternating access model for transport.: FEBS Lett 555(1): 96-101

7. Ahmed M., Lyass L., Markham P., Taylor S., Vazquez-Laslop N., Neyfakh A. (1995) Two highly similar multidrug transporters of Bacillus subtilis whose expression is differentially regulated. J.Bacter. 177:3904-3910

8. Aleshin V., Zakataeva N., Livshits V. (1999). A new family of amino-acid-efflux proteins. Trends Biochem Sci 24:133-135

9. Altschul S., Madden Т., Schaffer A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D. (1997) Gapped BLAST and PSI- BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25,3389-402

10. Ames G. (1986) Bacterial periplasmic transport system: structure, mechanism and evolution. Ann Rev Biochem 55: 397-425

11. Ankri S., I. Serebrijski O. Reyes, G. Leblon (1996). Mutations in the Corynebacterium glutamicum proline biosynthetic pathway: a natural bypass of the proA step. J. Bacteriol. 178:4412-4419

12. Belitsky В., Gustafsson M., Sonenshein A., von Wachenfeldt C. (1997). An Lrp-like gene of Bacillus subtilis involved in branched-chain amino acid transport. J. Bacteriol. 179:5548-5557

13. Bellmann A., Vrljie M., Patek M., Sahm H., Krämer R., Eggeling L. (2001). Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum. Microbiology 147:1765-1774

14. Bennik M., Pomposiello P., Thorne D., Demple B. (2000) Defining a rob regulon in Escherichia coli by using transposon mutagenesis. J. Bacteriol 182(13): 37943801

15. Bentley J., Hyatt L., Ainley K., Parish J., Herbert R., White G. (1993). Cloning and sequence analysis of an Escherichia coli gene conferring bicyclomycin resistance. Gene 127:117-120.

16. Bohn C., Bouloc P. (1998). The Escherichia coli cmlA gene encodes the multidrug efflux pump Cmr/MdfA and is responsible for isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside exclusion and spectinomycin sensitivity. J.Bacteriol. 190:6072-6075.

17. Brown M., Paulsen I., Skurray R. (1999). The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters. Mol. Microbiol. 31:394—395

18. Brown, M., Paulsen I., Skurray R. (1999). The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters. Mol. Microbiol. 31:394—395.

19. Chou J., Greenberg J., Demple B. (1993). Posttranscriptional repression of Escherichia coli OmpF protein in response to redox stress: positive control of the micF antisense RNA by the soxRS locus. J. Bacteriol. 175:1026-1031.

20. Cohen S., Hachler H., Levy S. (1993). Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (mar) locus in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:1484-1492

21. Cosloy S., Oishi M. (1973) The nature of transformation process in Escherichia coli K-12 Mol Gen Genet 124(1): 1-11

22. Datta P. (1967) Regulation of homoserine biosynthesis by L-cysteine, a terminal metabolite of a linked pathway. Prot Natl Acad Sei USA 58: 635-641.

23. Eguchi Y., Oshima T., Mori H., Aono R., Yamamoto K., Ishihama A., Utsumi R. (2003). Transcriptional regulation of drug efflux genes by EvgAS, a two-component system in Escherichia coli. Microbiology. 149(Pt 10): 2819-282627,28,29,30,31,32.