Возрастные изменения межклеточных взаимодействий гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина

Беспятых, Анастасия Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Возрастные изменения межклеточных взаимодействий гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Возрастные изменения межклеточных взаимодействий гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина"

улк 00461628И

УДК - , .О ■ ^ I .\JJ-T.J II. 1

Беспятых Анастасия Юрьевна

ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС И ВЛИЯНИЕ НА НИХ МЕЛАТОНИНА

03.03.05 - биология развития, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ПС|.[ ?П1Г}

Москва-2010

004616280

Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Голиченков Владимир Александрович

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Москва

Антохин Александр Иванович

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва

доктор биологических наук Онищенко Галина Евгеньевна Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова, Москва

Институт общей генетики РАН, Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Ведущая организация:

Защита состоится 21 декабря 2010 года в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «...» ноября 2010 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Накопленные сведения о природе старения позволяют предположить, что среди старческих изменений существенна потеря интегративных свойств системами организма разного уровня и, прежде всего, клеточными популяциями.

Степень кооперации клеток в популяции является отражением межклеточных взаимодействий составляющих ее клеток. Для изучения межклеточных взаимодействий В.Я. Бродским с сотрудниками был разработан метод оценки клеточной кооперации по ритму синтеза белка в первичной культуре гепатоцитов крысы (Вп^ку е1 а1., 1992, 2000).

Было показано, что синтез белка в такой культуре не происходит хаотически, а представляет собой сложный колебательный процесс с периодом около 30-60 мин -околочасовой ритм. Выраженность усредненного ритма в клеточной популяции зависит от степени синхронизации клеток, т.е. от состояния межклеточных взаимодействий в популяции (Вгоскку й а1., 2004).

Показано, что для синхронизации клеток культуры необходима определенная концентрация синхронизирующих факторов, выделяемых клетками в среду. Такими факторами могут быть ганглиозиды, норадреналин и фенилэфрин (Вгоёэку, 2006).

Было показано, что одним из основных событий каскада реакций, вызываемого в клетках синхронизаторами, является высвобождение ионов Са2+ из внутриклеточных депо (ВгосЬку, 2006). Так как все внутриклеточные синтезы, так или иначе, запускаются за счет изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток, при высокой степени межклеточных взаимодействий можно ожидать синхронности динамики уровня кальция между отдельными клетками. Известно, что с возрастом динамика кальциевых сигналов нарушается (Сате11о-А1шагаг е1 а1., 2008).

При исследовании ритма синтеза белка в культуре гепатоцитов старых крыс показано, го амплитуда колебаний синтеза белка в такой культуре вполовину меньше, чем у молодых зыс, что коррелирует с уменьшением количества норадреналина в крови и ганглиозидов в ;чени с возрастом. Добавление же этих синхронизирующих веществ, а также сыворотки крови элодых крыс в среду вызывает увеличение амплитуды ритма синтеза белка в плотных 'льтурах старых крыс и достижению ею уровня амплитуды ритма молодых крыс (Вгоскку й ., 2004, 2005). В связи с этим, для старения как процесса десинхронизации клеток организма :рвично изменение свойств межклеточного посредника, а поиск различных веществ, иливающих степень кооперации клеток, представляет особый интерес.

Маркером старения организма может служить не только изменение степени :жклеточных взаимодействий, но и возрастное изменение уровня некоторых белков в клетках.

Так, показано, что после наступления половой зрелости самцов крыс в клетках печени начинает прогрессивно снижаться экспрессия эстрогенсульфотрансферазы (фермента, инактивирующего эстрогены в их организме (Chatterjee et al., 1994).

Известным синхронизатором ритмов высокого порядка в организме (суточных и сезонных) является мелатонин, который выступает в качестве ритмоводителя и осуществляет интеграцию организма в целом. Так как все изученные циркадианные ритмы включают в себя околочасовые (Brodsky, 2006), вполне вероятен вклад мелатонина и в регуляцию кооперации индивидуальных клеток. Также показано непосредственное участие мелатонина в межклеточных взаимодействиях путем изменения состояния щелевых контактов (Gall et al., 2000, Blackman et al., 2001, Peters et al., 2005), повышения экспрессии коннексинов и диффузии вторичных мессенджеров по ним (Kojima et al., 1997, Blackman et al., 2001).

Содержание мелатонина в крови с возрастом уменьшается, что коррелирует со снижением межклеточных взаимодействий (Анисимов, 2004). Показано, что пересадка эпифизов от молодых крыс старым вызывает значимое увеличение продолжительности их жизни (средней и максимальной), в то время как обратная пересадка уменьшает соответствующие показатели (Pierpaoli et al, 1994). Также было установлено, что долговременное введение мелатонина старым мышам in vivo нивелирует возрастное снижение секреции и нарушения кальциевого сигнала в клетках поджелудочной железы (Camello-Almaraz et al., 2008). Таким образом, мелатонин способен предотвращать проявления старения, действуя, возможно, через повышение кооперативных свойств клеток.

На мембране гепатоцитов обнаружены рецепторы к мелатонину (Pandi-Perumal et al., 2008), кроме того, показано, что мелатонин как паракринный фактор выделяется энтерохромаффинными клетками пищеварительного тракта и может присутствовать в межклеточной среде пищеварительных желез (Camello-Almaraz et al., 2008). Все это позволяет предположить участие мелатонина в координации работы клеток в клеточной популяции и способность восстанавливать степень их кооперации, снижающуюся с возрастом.

Таким образом, целью нашей работы было исследование влияния мелатонина на возрастные изменения кооперативных свойств и метаболических показателей гепатоцитов. В задачи работы входило исследование: 1) влияния мелатонина на степень синхронизации синтеза белка в первичной культуре гепатоцитов крыс как модели межклеточных взаимодействий; 2) влияния мелатонина на синхронизацию синтеза белка в культуре гепатоцитов старых крыс; 3) влияния мелатонина на характер динамики содержания ионов кальция в клетках первичной культуры гепатоцитов молодых и старых крыс; 4) влияния долговременного введения мелатонина старым крысам на динамику ионов кальция в культуре

их гепатоцитов; 5) влияния долговременного введения мелатонина на возрастные изменения метаболической активности печени старых крыс (экспрессию эстрогенсульфотраясферазы).

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате исследования впервые показано влияние мелатонина на синхронизацию околочасового ритма синтеза белка в клетках разреженных культур гепатоцитов молодых крыс, то есть в условиях низкого уровня межклеточной коммуникации. Впервые выявлены долговременные флуктуации уровня внутриклеточного Са2+ в культуре гепатоцитов крыс. Показано, что степень синхронности флуктуаций уровня Са2+ в клетках снижается при уменьшении концентрации их в культуре, а добавление мелатонина к разреженным культурам восстанавливает синхронность. Установлено, что при старении крысы и выраженность ритма синтеза белка, и динамика долговременных флуктуаций уровня Саг+ в культурах гепатоцитов нарушается, как и при разрежении культур молодых клеток, то есть наблюдается снижение коммуникативных свойств. Показана способность мелатонина нивелировать возрастные нарушения степени синхронности гепатоцитов у старых крыс по обоим исследованиым параметрам.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научных семинарах кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова и лаборатории цитологии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008г.), конференции Фундаментальная наука и клиническая медицина (Санкт-Петербург, 2008), I Российском съезде по хронобиологии и :рономедицине с международным участием (Владикавказ, 2008), IX Международном Симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2010), VIII Всероссийской онференции по патологии клетки (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них статей - 2, юнография - 1, тезисов конференций - 5.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 133 страницах и зстоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», Результаты исследования и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы» «Приложение». Работа включает 4 таблицы и 29 иллюстраций. Список цитированной итературы содержит 389 наименований, из которых 19 на русском, 370 на иностранных (ыках.

Список использованных сокращений: ПК - плотные культуры гепатоцитов, РК -преженные культуры гепатоцитов, М - мелатонин, ОФ - относительная флуоресценция.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили первичные суточные культуры гепатоцитов самцов крыс линии Wistar. Культуры клеток получали из печени молодых (3-4 мес.) и старых крыс (24 мес.). Для изучения динамики экспрессии эстрогенсульфотрансферазы дополнительно исследовали самцов крыс в возрасте 7 месяцев. Всего было использовано 36 животных. Крыс содержали в виварии в стандартных условиях кормления и содержания. Эксперименты по выделению культур начинали в одно и то же время.

1.Получение культуры гепатоцитов. Крысу наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг веса), вскрывали брюшную полость и перфузировали через воротную вену печени бескальциевым раствором Хенкса с 0.5 мМ ЭГТА и 0.05%-ным раствором коллагеназы IV в среде 199 по методике (Brodsky et al, 1992, 2000). Для определения экспрессии эстрогенсульфотрансферазы кусочки перфузированной печени массой 30-35 мг помещали в Tri-reagent (Sigma) при -20"С для дальнейшей обработки. Количество выделенных клеток подсчитывали при помощи сортера клеток Scepter (Millipore), жизнеспособность их проверяли методом окрашивания клеток трипановым синим (в экспериментах использовали культуры, содержащие около 90% живых клеток). Суспензию разводили средой до концентрации около 106 (ПК) или 105 (РК) кл./мл, разливали в чашки Петри с покровными стеклами, предварительно покрытыми коллагеном, и культивировали клетки в ССЬ-инкубаторе при 37 °С с 5% СОг. Через сутки инкубации культуры промывали, переносили в свежую среду 199 и исследовали соответствующими методами. 2. Исследование кинетики синтеза белка по включению 'Н-лейцина. Для этих экспериментов было использовано 4 старых и 4 молодых крысы. Пробы для каждой точки инкубировали отдельно в течение 10 мин при 37°С в среде с 3Н-лейцином (92.5 - 110.0 *104 Бк/мл, специфическая молярная активность 259-370 х Ю10 Бк/ммоль). На каждую временную точку (каждые 10 мин) брали по 3 пробы (три стекла) последовательно в течение 2 ч. Культуры промывали холодной средой (физиологический раствор для теплокровных с немеченым лейцином в концентрации около 1 г/л) и обрабатывали холодной (4°С) 5%-ной хлорной кислотой в течение 90 мин (экстракция не включившейся в белки метки). Затем культуры промывали 96%-ным этиловым спиртом (2-3 мин) и клеточные белки растворяли гиамином (Sigma) в течение примерно 12 ч. Радиоактивность лейцина в белках и небелковой кислоторастворимой фракции, т.е. свободного лейцина в клетках, измеряли на каждом стекле, используя сцинтилляционный счетчик LKB 1214 Rackbeta (Швеция). Относительное включение лейцина Icorr, характеризующее интенсивность синтеза белка для каждой пробы, рассчитывали по формуле

Icorr = I xPv/ Р, (импульс / мин),

где Ir включение лейцина в белки в пробе за 10 мин; P¡ - общая радиоактивность определенной пробы, равная /; + p¡, где р, - радиоактивность пула той же пробы (радиоактивность не включившейся в белки метки), и Л>- средняя радиоактивность проб определенного опыта (например, для 2-часового опыта - 36 стекол). Использование относительной величины Ic„rr исключает влияние на уровень радиоактивности различий пула 3Н-лейцина, варьирующего числа клеток в разных культурах и небольших вариаций температуры и рН среды в течение опыта (BrodsKy et al., 2000). Результаты измерений трех стекол каждой пробы усредняли. Каждый опыт ставили на культурах гепатоцитов одной крысы.

3. Исследование динамика уровни нонов кальция в культуре гепатоцитов. Выявление динамики цитоплазматического кальция проводили на суточных культурах гепатоцитов крыс по методике Rooney et al., 1989 и Wang et al., 2007. В данной части работы было использовано 25 животных, из них 17 молодых и 8 старых, от них были получены 46 и 38 культур, соответственно, в которых исследовали 1855 и 2546 клеток. Клетки культуры витально окрашивали флуоресцентным красителем Fluo-3 AM (Fluka) в концентрации 5 мкМ в течение 20 мин при 37*С (в темноте), после чего отмывали и исследовали на конфокальном микроскопе Zeiss Axiovert 200 M с конфокальной приставкой LSM 510 Meta в термостатируемой камере. Съемки клеток проводили с использованием лазера с длиной волны 488 нм, каждое поле клеток фотографировали через 14 с в течение примерно 20 мин. Параметры съемки были одинаковы для каждого эксперимента. Клетки при этом сохраняли свою морфологию и жизнеспособность (проверялась по окрашиванию культуры клеток йодистым пропидием (Sigma, 1:100) после ъемки).

Для каждой культуры проводили съемку нескольких случайно выбранных полей зрения, а которых суммарно регистрировали 50-60 клеток. Данные, описывающие динамику ОФ на диницу площади клетки за время съемки, получали для каждого индивидуального гепатоцита а фотографиях с помощью программы ImageJ. Полученные данные для каждой культуры брабатывали при помощи программы Stadia, а также средствами Microsoft Excel и определяли ээффициент синхронизации культуры. Для этого рассчитывали коэффициенты корреляции ежду рядами данных попарно для всех клеток данной культуры, а величину коэффициента щхронизации определяли по формуле

Ксихр = Кх>,б / п, где

><16 - число коэффициентов корреляции выше 0,6, п - число пар сравнений

Коэффициенты синхронизации для каждого типа суточных культур, вычисленные в разных экспериментах, усредняли. Синхронными считали культуры с Ксш,ур>0,6.

Влияние мелатонина на синхронизацию ритма синтеза белка и динамику уровня ионов кальция в культуре гепатоцитов. Для обработки клеток использовали раствор

синтетического М (Aldrich Chem. Со). Суточные культуры импульсно обрабатывали раствором М на среде в определенных концентрациях. Для исследования геропротекгорного влияния М на старых крыс самцы в возрасте 19 месяцев были разделены на 2 группы -контрольную и опытную (по 4 животных в каждой). Опытная группа получала в течение 4 месяцев М с питьевой водой (5 мг/день/кг веса), доступ к воде не ограничивали. 5. Определение метаболической активности печепн по уровню экспрессия эстрогевсульфотравсферазы.

Выделение тотРНК проводили из кусочков перфузированной печени молодых (3-4 мес., 17 животных), старых крыс (24 мес., 8 животных), а также крыс в возрасте 7 месяцев (3 крысы), хранившихся при -70°С, при помощи смеси TRI® Reagent (Sigma, США) по протоколу, предоставленному производителем.

Получение и нормировка кДНК библиотек. Синтез первой цепи кДНК проводили на матрице мРНК печени крыс разного возраста при помощи M-MLV обратной транскриптазы и олиго(дТ)15 праймеров (Силекс М, Россия). Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов кДНК были предварительно отнормированы по гену глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы GAPDH. Нуклеотидная последовательность праймеров к GAPDH, размер ПЦР-фрагмента - в таблице 1.

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили на матрице кДНК с помощью ColoredTaq-полимеразы, дНТФ и реакционного буфера (набор для амплификации ДНК фирмы Силекс М). Названия анализируемых генов, структуры и положение праймеров, а также размеры соответствующих ПЦР-фрагментов перечислены в таблице 1.

Таблица 1. Праймеры для ПЦР-анализа.

Геи Структура праймеров Размер ПЦР-фрагмента, ЦП.

Stel Пр. 5'gagacttctatgcctgaatact 3' (экзон 2) Обр. 5' attagatcttcatttctgcactcc 3' (экзон 3) 266

Su2 Пр. 5'gagacttctatgcctgaatact 3' (экзон 2) Обр. 5' attagatcttcatttctgcactcc 3' (экзон 3) 270

GAPDH Пр. 5' tgcagtgccagcctcgtctcatag 3' (экзон 1) Обр. 5'ccctWggccccacccttcag 3' (экзон 1) 378

Условия амплификации: 94°С - 1 мин, 60°С - 45 сек, 72°С - 1 мин, 30 циклов. Для анализа ПЦР-продуктов использовали 1.5% агарозный гель в трис-ацетатном буфере. 6. Статистическую обработку результатов проводили, используя пакеты программ Harwards Grafic и Microsoft Excel и методы описательной статистики с использованием программы Stadia. Для выявления скрытых периодичностей в кинетике синтеза белка данные обрабатывали с использованием автокорелляционного анализа временных рядов (Мерсер, 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние мелатонина на степень синхронизации синтеза белка в первичной культуре гепатоцнтов крыс

Эту часть работы проводили на ПК и РК молодых крыс. Маркером клеточной синхронизации являлось увеличение амплитуды суммарного синтеза белка клетками культуры и/или появление в ней ритма синтеза белка.

При исследовании влияния M на суточные РК гепатоцитов Зх-месячных крыс, в норме не синхронные, было показано, что 10-минутное воздействие M во всех исследуемых концентрациях (1, 500 или 1000 нМ) приводит к появлению достоверных колебаний уровня включения меченого лейцина в культурах (рис. 7), отражая синхронизацию клеток. Поскольку действие физиологических веществ часто имеет дозовую зависимость, мы исследовали не только влияние концентрации, но и времени действия. Для исследования влияния временной составляющей действия M провели опыт с 5-минутным инкубированием в среде с 1 и 50 нМ M (рис. 8). Контролем служили РК в среде без М. Инкубация в течение 5 мин также приводила к синхронизации клеток в РК даже при значительном снижении концентрации препарата. Добавление 0,5 нМ M в среду (инкубация в течение 5 мин) не вызывало синхронизации клеток по сравнению с контролем.

Т. о., впервые было показано, что M синхронизует ритм синтеза белка в отдельных клетках РК молодых крыс, а также была выявлена минимальная действующая доза M (1 нМ, 5 мин инкубации), приводящая к синхронизации ритмов синтеза белка в культуре гепатоцитов.

По сравнению с контролем во всех обработанных РК молодых крыс достоверно увеличивался размах амплитуды колебаний синтеза белка, что подтверждает повышение степени синхронности культур. По мере увеличения концентрации M максимальная амплитуда колебаний синтеза белка достоверно повышалась (р<0,05), что, вероятно, связано с усилением синхронизующей способности M за счет влияния на большее число клеток (так как на большие концентрации M реагируют клетки с более высоким порогом чувствительности, что подтверждено также для других типов клеток (Gaspers and Thomas, 2005).

Автокорреляционный анализ данных по интенсивности синтеза белка в культурах молодых крыс, обработанных разными дозами М, выявил отчетливый ритм синтеза белка. При этом ритм синтеза белка в культуре, обработанной 1 нМ М, не имел постоянного периода, в культурах, обработанных 50 и 1000 нМ М, имел период 30 мин, а в культуре, обработанной 500 нМ М, - 20 мин. Такую зависимость, вероятно, можно объяснить следующим образом. Известно, что околочасовые ритмы характеризуются крайней вариабельностью периодов

Мелатонин, 1нМ

30 60 90 120

время, ими

450 х 400 -■

360 -.

г 300

250 - ■

200

150

0 30 60 90 120

вреия, ыин

Мелатонин, 1000 нМ

450

400

350 -

300

250

200 -

150

Мелатонин, 500 нМ

30 60 90 120

вреыя, ынн

Контроль

-+-

[ i i I

30 60 90 120

вреия, ымн

Рис. 7 Влияние 10-минутной инкубации в М на синхронизацию РК молодых крыс

Мелатонин, Мелатонин,

время, мин

Рис. 8. Влияние 5-минутной инкубации в М на синхронизацию РК молодых крыс

колебаний (периоды колебаний синтеза белка могут варьировать от 20 до 120 мин) (Вгоскку, 2006). Возможно, в нашем случае нерегулярность периодов колебаний объясняется разной чувствительностью клеток к М в популяции гепатоцитов. Если в ритме синтеза белка в данной культуре период колебаний не выявляется (культура, обработанная 1 нМ М), можно предположить, что причиной этого является либо отсутствие синхронности в синтезе белка отдельными клетками, либо наличие в культуре нескольких синхронных внутри себя, но несинхронных между собой популяций или одной небольшой синхронной популяции. Так как примененные методы автокорреляционного анализа достоверно свидетельствуют об усилении суммарного синтеза белка и увеличении амплитуды ритма синтеза белка в данной культуре, а доза гормона очень низкая, вероятнее всего, здесь мы имеем дело именно с последним случаем (одной синхронной популяцией). При этом период колебаний синтеза не выявляется, вероятно, из-за наложения периодов синтеза отдельных клеток на период синтеза белка клеток синхронной популяции. При повышении концентрации М число реагирующих на него клеток растет, в связи с чем, возможно, происходит увеличение числа синхронных популяций. Синхронизующий эффект М в данном случае проявляется именно в увеличении «кластеризации» клеток, то есть в образовании синхронных кластеров клеток внутри культуры. При повышении действующей концентрации М увеличивается доля реагирующих на гормон клеток, вследствие чего общая синхронность культуры возрастает, появляется устойчивый период колебаний, а при дальнейшем увеличении действующей концентрации М частота колебаний повышается.

2. Влияние мелатовииа иа синхронизацию синтеза белка в культуре гепатоцитов старых крыс

Известно, что клетки ПК молодых крыс обладают большой синхронностью за счет высокой степени межклеточных взаимодействий, а степень синхронности аналогичных культур старых крыс низка. Добавление синхронизаторов в культуру приводит к повышению кооперации клеток и восстановлению их межклеточных взаимодействий, а, следовательно, и повышению степени их синхронности (Вгобвку е! а1., 1997).

После обработки ПК старых крыс раствором М в концентрациях 1 нМ и 50 нМ в течение 5 мин (рис. 9) выявляли значимое усиление синхронизации клеток в культуре и приближение ее к уровню синхронизации культуры молодых крыс.

Автокорреляционный анализ выявил ритм синтеза белка в культурах старых крыс, обработанных М (и 1, и 50 нМ), с периодами, равными 30 мин. В культурах, обработанных 50 нМ М, достоверно повышалась и максимальная амплитуда колебаний синтеза, то есть увеличение концентрации М повышает эффективность его действия. В культурах,

Мел атонии. 1 нМ

Мелатонин,

Контроль

50 нМ

& 400 --

300 -

200

О 30 60 90 120

0 30 60 90 120

О 30 60 SO 120

ере ил. мин

время, имн

время, иин

Рис. 9. Влияние мелатонина на синхронизацию ПК старых крыс

обработанных 1 нМ М, достоверного повышения амплитуды синтеза белка не происходило, но ритм синтеза обнаруживался, т.е. обработка клеток 1 нМ M все же ведет к кластеризации культуры (культура из слабо синхронной превращается в более синхронную, однако синхронно работающих клеток так мало, что суммарного увеличения амплитуды не выявляется).

Таким образом, впервые были продемонстрированы геропротекторные свойства М. При добавлении M к ПК старых крыс уровень кооперации клеток в них приближался к уровню синхронизации ПК молодых крыс.

Известно, что интегративным механизмом, осуществляющим межклеточные взаимодействия в нативной печени, являются щелевые контакты между клетками (Clair et al., 2001). M способен модулировать состояние межклеточных щелевых контактов, а также количество вторичных мессенджеров, в частности, Са2+ и 1Рз, передающихся по ним (Peters et al., 2005; Kojima et al., 1997; Blackmail et al., 2001), и, тем самым, менять коммуникативные свойства клеток. Таким образом, для клеток печени существуют, как минимум, два различных уровня регуляции клеточной кооперации (щелевые контакты и состав межклеточной среды), поэтому сложно вычленить непосредственное влияние M в системе объединенных гепатоцитов. В наших экспериментах была использована культура разделенных клеток, лишенных контактов, когда синхронизирующий эффект M мог появляться только через межклеточную среду посредством изменения ее состава.

3. Влияние мелатонина на синхронизацию динамики ионов кальция в культуре гепатоцитов молодых крыс

Оценивали организующее действие M по динамике изменения Са2+ прижизненно в отдельных клетках ПК и РК гепатоцитов в норме и под действием М. Известно, что изменение

Рис. 10. Клетки а) РК (объектив 40х), б) ПК (объектив 40х), в) РК, окрашенные флуоресцентным красителем Fluo-3 АМ для выявления свободного внутриклеточного

капытия fобъектии 10x^1

концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток является универсальным способом передачи разнообразных сигналов. Выявление способности М синхронизовать динамику изменения уровня ионов кальция в отдельных клетках даст ключ к пониманию возможного механизма его действия в качестве универсального интегратора организма.

В данных экспериментах действующая доза М составляла 50 нМ (10 мин инкубации), что приводило к выраженной синхронизации на модели синтеза белка.

Для данных экспериментов использовали первичные суточные культуры клеток молодых крыс (ПК и РК, рис. 10), каждый эксперимент повторяли на 14 животных.

Измерение уровня внутриклеточного кальция проводили по методике, описанной выше. Из литературы известно, что флуоресцентный краситель Fluo-З связывается преимущественно с ионами кальция, находящимися в цитоплазме клетки (Paredes et al., 2008). Регистрация ОФ индивидуальных клеток производилась по оптическому срезу, находящемуся в плоскости, равно отстоящей от верхней и нижней поверхности клетки. В предварительных экспериментах мы установили, что динамика ОФ клеток, зарегистрированная таким способом, отражала соответствующую динамику, зарегистрированную по всему объему клетки путем суммирования флуоресценции оптических срезов, сделанных по всей «толщине» клетки (Z-стек). В последнем случае, однако, при измерениях клетки подвергались более

продолжительному воздействию лазера, что гя ,оо приводило к неблагоприятным

последствиям. Поэтому измерение ОФ решено было проводить по центральной плоскости клетки.

Регистрацию ОФ, отражающей

Рис. 11. Примеры изменения уровня внутриклеточного динамики изменения

ОФ интактных РК кальция, проводили на индивидуальных

молодых крыс. клетках культуры каждые 14 секунд в

«.¿»К

РДЗРЕЖ РАЗРЕЖ+Mel

течение приблизительно 20 минут. Примеры графиков изменения ОФ для клеток интактных

РК представлены на рис. 11. Форма графиков, полученных для большого числа отдельных

клеток всех типов культур, в целом, была сходна. Синхронность динамики изменения уровня

ОФ отдельных клеток оценивали по сравнению степени корреляции между парами рядов

значений ОФ, полученных для каждой клетки из 50-80

промеренных клеток одной культуры. Затем для каждой

культуры вычисляли коэффициент синхронности (Ксишр).

Необработанные ПК и РК, а также РК,

обработанные М, обладают разной степенью

синхронности (рис. 12) - ПК достоверно более синхронны

(р<0,01) по сравнению с необработанными РК (Кси„хР -

0,84±0,16 и 0,21±0,15, соответственно). Действие М на РК

приводит к достоверному (р<0,05) повышению их

Рис. 12 Сравнение средних ^„«р синхронности (Kclmxp=0,6l±0,24j, по степени которой для интактных плотных и РК

молодых крыс, а также РК, «Уйгуры становится практически равной ПК

обработанных М (50 нМ, 10 мин), гепатоцитов - их К„тр достоверно не различаются . Здесь и далее на гистограммах

указаны стандартные отклонения. Таким образом, как и в модели синтеза белка, ПК

молодых крыс обладают высокой степенью синхронности, РК же несинхронны, а их обработка М приводит к повышению степени синхронности гепатоцитов, при этом уровень ее приближается к уровню синхронности ПК молодых крыс. Синхронизация отдельных клеток при действии М происходит в результате сдвига временной динамики ОФ клеток - изменение их фаз (уменьшение или повышение

флуоресценции) происходит одновременно, степень кросскорреляции между рядами данных временной динамики клеток повышается, результатом чего является повышение коэффициента синхронизации культур.

4. Влияние мелатовина на синхронизацию динамики ионов кальция в ПК гепатоцитов старых крыс

В клетках ПК старых крыс мы наблюдали значительное достоверное (р<0,01) снижение

синхронности по сравнению с молодыми (Ксииф

Рис. 13. Сравнение средних К;««^, 0,84±0,16 и 0,47±0,09, соответственно, - рис. 13).

для ПК старых и молодых крыс, а ,, „ ,, _тг

Действие М на ПК старых крыс вызывает также ПК старых крыс, м 1

обработанных М (50 нМ, 10 мин), достоверное повышение их синхронизации (р<0,01), при

0.8 а 0.6 ^ 0,

■

...

0.6

0.4

0.8

этом Кснхр достоверно не отличается от показателя ПК молодых крыс (0,91±0,02 и 0,84±0,16, соответственно) (рис. 15). Как и при исследованиях на модели синтеза белка, в данном случае М также синхронизует ПК старых крыс, вследствие чего уровень кооперации их клеток приближается к уровню клеток ПК молодых крыс.

0.2

5. Исследование влияния долговременного введения мелатонина старым крысам на синхронизацию

МОЛОД СТАР CTAP(Mel)

Рис 14 Сравнение степени Динамики ионов кальция в культурах их генатоцнтов.

синхронизации ПК молодых, Получив синхронизующий эффект М in vitro, мы

старых крыс в норме и старых

крыс экзогенно получавших попытались выявить организующую способность М при М- возрастных изменениях свойств клеток in vivo при

пероральном введении его в течение 4 месяцев с питьевой водой старым крысам.

При сравнении КСИМф ПК крыс, получавших экзогенный М, с соответствующими культурами старых крыс в норме, видно, что первые достоверно более синхронизованы (0,88±0,06 и 0,47±0.09, соответственно, р<0,01) и по степени кооперации клеток сходны с плотными культурами молодых крыс (КС1о(хр..=0,84±0,16) (рис. 14).

Степень синхронизации ПК старых крыс значительно повышалась, более того, они были настолько же синхронны, как и ПК молодых крыс. Таким образом, впервые геропротекторное действие М на печень старых крыс было показано при пероральном получении с питьевой водой (в литературе аналогичные данные встречаются только при воздействии М на поджелудочную железу мышей, Camello-Almaraz et al., 2008). Интересно отметить также и относительно небольшой промежуток времени воздействия, необходимый для достижения эффекта. Полученные данные дают основания для возможности использования М в гериатрии.

Была проведена оценка степени синхронизации ПК и РК старых крыс, получавших экзогенный М в течение 4 месяцев, с ПК и РК молодых и интактных старых крыс (рис. 15). Для всех крыс - молодых, старых интактных и получавших экзогенный М, - соотношение между степенью синхронности клеток первичных культур без и под действием М сохраняется, то есть, ПК, полученные от каждого типа крыс, более синхронны, РК - менее, РК после действия М приближаются по уровню синхронности к ПК. Исключение составляют РК старых интактных крыс - Ксинхр для них составляет всего 0,15 ± 0,01, а после обработки М - 0,17± 0,09, то есть различия между Ксикхр недостоверны, однако для последних культур разброс данных повышается.

Полученные данные свидетельствуют, что динамика уровня цитоплазматического кальция в отдельных гепатоцитах для РК старых крыс значительно отличается от таковой в РК

I из

£ 50

31» ; и

Рис. 15. Сравнение степени синхронизации разных типов культур старых крыс, получавших экзогенный М с культурами молодых и старых крыс в норме. ПЛОТН - ПК, РАЗРЕЖ - РК, РАЗРЕЖ+Ме1 - РК, обработанные М; МОЛОД - культуры гепатоцитов интактных молодых крыс, СТАР(Ме1) - культуры гепатоцитов старых крыс, получавших экзогенный М, СТАР -культуры гепатоцитов старых интактных крыс, молодых крыс - появлялись клетки, динамика ОФ в которых выглядела как кратковременные спайки; в РК старых крыс, получавших экзогенный М, такие спайки длились дольше (рис. 16 б, г), также в РК обоих типов старых крыс появлялись «молчащие» клетки, уровень флуоресценции которых был несопоставимо ниже (рис. 16, а), при этом число таких клеток в

культурах старых крыс, получавших экзогенный М, было больше (доля таких клеток от общего числа исследованных клеток культур составила 0,5 и 0,58, соответственно). Обработка М и тех, и других культур значительно снижала долю «молчащих» клеток в них (доля «молчащих» клеток в обоих типах культур после обработки их М составляла 0,28 в каждом).

Вреинс Время, с

Как видно по результатам сравнения

Рис.16. Примеры динамики изменения ОФ в

клетках РК старых крыс: а) «молчащая» УР0ВНЯ синхронизации разных типов культур

клетка интактной РК; б) динамика ОФ со геПатоцитов, полученных от молодых, старых

спайками в интактной РК; в) клетка со

средним уровнем ОФ; г) динамика ОФ со КРЫС> а также КРЫС> получавших экзогенный М,

спайками в РК старых крыс, получавших схепень кооперации их клеток меняется

экзогенный мелатонин.

достаточно закономерно. По уровню клеточной кооперации и ПК, и РК, гепатоциты старых крыс, получавших М, достоверно не отличаются от гепатоцитов молодых крыс, в то время как соответствующие культуры старых интактных крыс показывают значительное снижение синхронности. Действие М на РК гепатоцитов старых

"в

крыс, получавших М, сходно с действием гормона на РК гепатоцитов молодых крыс по степени повышения синхронизации клеток, однако здесь можно наблюдать и существенное отличие. В случае РК молодых крыс обработка М повышает степень их синхронизации без изменения величины разброса значений - то есть среди исследованных культур такого типа встречаются как относительно слабо синхронизующиеся культуры, так и достаточно сильно синхронизуемые. В случае же РК гепатоцитов старых крыс, получавших М, обработка М повышает степень синхронизации гепатоцитов, однако и значительно снижает разброс значений. Это позволяет предположить механизм синхронизующего действия долговременного введения М на гепатоциты старых крыс. Экзогенный М в интактной печени воздействует только на клетки, еще сохранившие прежний уровень восприимчивости к гормону, поэтому синхронизация гепатоцитов происходит за счет синхронизации только этих клеток, вследствие чего коэффициент синхронизации таких культур примерно одинаков у всех исследованных РК гепатоцитов старых крыс, получавших М. Это предположение косвенно подтверждается наблюдениями над «молчащими» клетками РК старых крыс — в интактных культурах этого типа выявляется меньшее число «молчащих клеток», чем в соответствующих культурах клеток крыс, получавших М, - то есть, введение М снижает необходимость деятельности клетки, направленной на синхронизацию ее с другими клетками, за счет внешнего синхронизующего влияния экзогенного М. При этом клеток, самостоятельно поддерживающих синхронизующую деятельность, становится меньше, что четко выявляется при помещении клеток в условия культуры. Дополнительная обработка М РК от обоих типов крыс нивелирует различия между ними по количеству «молчащих» клеток, так как в данном случае межклеточные взаимодействия регулируются не самими клетками, а внешним синхронизующим агентом.

Кроме того, провели сравнение нормированных графиков ОФ гепатоцитов для каждого типа культур (рис. 17-19) по параметрам, приведенным в таблице 2. Для каждой культуры параллельно оценивали шум прибора по темному полю. Амплитуда колебаний шума во всех случаях была на порядок ниже колебаний ОФ гепатоцитов.

При сравнении нормированных графиков изменения ОФ отдельных клеток, построенных для каждого типа культуры, прослежены интересные закономерности, позволяющие сделать некоторые выводы о процессах, происходящих в клетках при старении и при действии на них М.

Показано, что в ПК молодых, старых крыс, получавших М старых крыс, а также ПК старых крыс после обработки М, амплитуда колебаний ОФ для индивидуальных клеток невелика. Характеристики РК всех типов значительно отличаются. В клетках РК молодых крыс в норме амплитуда колебаний ОФ значительно выше, чем в ПК, а обработка М приводит к снижению амплитуды до величин, сравнимых с ПК. В большей части клеток РК старых крыс

Таблица 2. Сравнение нормированных графиков изменения относительной флуоресценции отдельных клеток для каждого типа культур.

Тип культуры Параметры сравнения

Синхронность Разброс амплитуд колебаний флуоресценции для отдельных клеток Разброс динамик отдельных клеток внутри культуры

большой малый нет

Молодая крыса ПК + + нет

Обработка М

РК - + нет

Обработка М + + нет

Старая крыса ПК - + нет

Обработка М + + нет

РК - + + есть

Обработка М - + + есть

Старые крысы, получавшие экзогенный М ПК + + нет

Обработка М

РК - + есть

Обработка М - + есть

амплитуда колебаний ОФ значительно снижается даже по сравнению с соответствующей характеристикой ПК, но в некоторых клетках достоверно повышается - то есть культура «расслаивается» по данному параметру. Обработка такой культуры М приводит к увеличению величины амплитуды колебаний ОФ в той или иной степени во всех клетках. Для РК старых крыс, получавших экзогенный М, по сравнению с РК интактных старых крыс амплитуда колебаний ОФ отдельных клеток выше, но «расслоение» культуры сохраняется. Обработка такой культуры М приводит к значительному снижению амплитуды колебаний ОФ клеток культуры, и культура по этому параметру становится сходной с ПК молодых крыс (рис. 19 г) . Вполне вероятно, что влияние клеток друг на друга в ПК приводит к сужению «коридора» значений амплитуд колебаний ОФ клеток - работа клеток становится более сходной.

Таким образом, действие М, полученного крысой и непосредственно добавленного к культуре гепатоцитов, проявляется не одинаково. Экзогенный М улучшает характеристики отдельных гепатоцитов старых крыс, еще сохраняющих большую амплитуду колебаний ОФ, и мало действует на «постаревшие» клетки (с малой амплитудой колебаний ОФ), при этом синхронность клеток старых крыс, получавших экзогенный М, повышается за счет улучшения их собственных характеристик. Обработка же М культур действует на все клетки культуры в качестве внешнего синхронизующего агента. Интересно, что комбинация этих воздействий оказывает столь мощный эффект, что старые клетки по своим свойствам становятся похожими на молодые клетки.

О 200 400 600 800 1000 1200 1400

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Рис. 17. Нормированные графики относительной флуоресценции клеток ПК а) культура гепатоцитов молодых крыс; б) культура гепатоцитов старых крыс; в) культура гепатоцитов старых крыс, обработанных М; г) культура гепатоцитов старых крыс, получавших экзогенный М.

Рис. 18. Нормированные графики относительной флуоресценции клеток РК молодых крыс а) интактные РК; б) РК, обработанные М.

Как уже отмечалось, визуально синхронизация клеток во всех перечисленных случаях выражалась в сдвиге фаз графиков временной динамики ОФ гепатоцитов по сравнению с соответствующими контрольными клетками и повышению числа клеток с синхронно

Рис. 19. Нормированные графики относительной флуоресценции клеток РК старых крыс а) РК старых интактных крыс; б) РК старых крыс, обработанная М; в) РК старых крыс, получавших экзогенный М; г) РК старых крыс, получавших экзогенный М, дополнительно обработанная М.

меняющейся динамикой внутриклеточного уровня ионов кальция. Таким образом, возможно, импульсное воздействие М и вызванные этим осцилляции уровня ионов кальция приводят к сдвигу фазы долговременных колебаний его уровня в гепатоцитах, результатом чего является синхронизация динамики отдельных гепатоцитов, то есть усиление межклеточных взаимодействий.

Результаты экспериментов по изучению динамики уровня внутриклеточного кальция свидетельствуют о том, что, как и в случае с синтезом белка, степень межклеточных взаимодействий снижается с возрастом. Кроме того, на клетках РК крыс разного возраста показано, что с возрастом изменяется профиль внутриклеточной динамики концентрации кальция, то есть ухудшение функционирования самой клетки все же происходит. Тем не менее, это ухудшение несущественно и не является ключевым при снижении степени межклеточных взаимодействий потому, что улучшение качества межклеточной среды (добавление синхронизующего агента М) приводит к восстановлению нормальных межклеточных взаимодействий, выражающихся в синхронизации функций гепатоцитов. Это еще раз доказывает тот факт, что в возрастных нарушениях функционирования клеток и органов в

целом первично снижение качества межклеточной среды (сыворотки крови), а не нарушение деятельности отдельных клеток.

Таким образом, данные наших экспериментов свидетельствуют о том, что степень синхронности динамики уровня цитоплазматического кальция в гепатоцитах, как и выраженность ритма синтеза белка в них, может служить адекватной моделью для изучения межклеточных взаимодействий. В гепатоцитах крыс разного возраста бьши выявлены долговременные колебания (с большим периодом) уровня кальция в цитоплазме, которые наблюдались как после действия кальциевого агониста, М, так и в интактных клетках. При этом действие M вызывало синхронизацию динамики уровня кальция между отдельными гепатоцитами, то есть приводило к тому же результату, что был показан при исследовании синхронизации клеток по ритму синтеза ими белка. Следовательно, и на данной модели межклеточных взаимодействий показана способность M к кооперации клеток.

Анализ литературы показывает, что большинство работ, посвященных исследованию динамики цитоплазматического кальция в клетках, связаны с оценкой изменения концентрации ионов кальция в клетках непосредственно после воздействия различных агонистов. Необходимо подчеркнуть, что в наших экспериментах мы регистрировали не ответ клеток на стимуляцию их M, а «последействие» гормона, то есть влияние его на активность клеток уже после отмывки гепатоцитов от гормона. Поэтому для объяснения возможного механизма синхронизации гепатоцитов в наших экспериментах данные литературы, касающиеся исследования динамики внутриклеточного кальция, вызванной действием различных стимулов, можно использовать лишь в качестве косвенных доказательств. Тем не менее, можно предположить, что механизм синхронизации динамики кальция в гепатоцитах под действием M сходен с формированием синхронных кальциевых осцилляции в отдельных гепатоцитах в перфузируемой печени (Gaspers and Thomas, 2005) за исключением того, что в нашем случае межклеточная кооперация посредством щелевых контактов отсутствует, а синхронизация происходит только на уровне кондиционирования межклеточной среды. Интересно, что при кратковременном воздействии вазопрессина на культуру гепатоцитов в клетках начинаются осцилляции кальция, однако динамика их в разных клетках отличается, что отражает гетерогенность популяции гепатоцитов по чувствительности их к гормональным воздействиям (Gaspers and Thomas, 2005). Таким образом, само импульсное воздействие гормона в нашем случае вряд ли синхронизует динамику кальция в отдельных гепатоцитах. Для повышения синхронности культуры необходимо насыщение межклеточной среды синхронизующими факторами, продуцируемыми клетками, которое в нашем случае происходит уже после отмывки клеток от стимулирующего выделение кальция М.

Интересно, что при исследовании долговременной динамики изменения уровня кальция в гепатоцитах колебания его были показаны не только в клетках, предварительно обработанных М, но и в интактных клетках. Таким образом, колебания уровня кальция в обработанных М клетках появляются не в результате действия на них гормона и не являются остаточной реакцией на это воздействие, а связаны с периодическими функциями самой клетки. Показано, что при передаче сигнала от различных агонистов внутри клеток возникают осцилляции концентрации кальция в цитозоле (Clapham, 2007, Gomes-Pinilla et al., 2009). В нашем случае никакие сигналы из внеклеточной среды на гепатоциты не действовали, тем не менее, не исключена возможность того, что в покое внутри клеток также присутствуют осцилляции уровня ионов кальция, необходимые для осуществления внутренних синтезов клетки. Механизм подобных колебаний концентрации внутриклеточного кальция на основе осцилляции количества активной протеинкиназы С описан, например, в статье Bird et al., 1993. Обнаружение таких колебаний в нашем случае не является неожиданностью, так как физиологическая активность клетки подвержена определенной периодичности, что можно проиллюстрировать даже на примере периодического синтеза белка. Способность М синхронизовывать эти колебания еще раз подтверждает роль данного гормона в качестве организатора ритмов разного порядка. Несмотря на то, что существование околочасовой ритмики доказано для синтеза гепатоцитами белка, выявить околочасовую периодичность изменения концентрации кальция в гепатоцитах в нашем случае не представляется возможным за счет малой продолжительности регистрации динамики уровня кальция (всего 20 мин), связанной с техническими трудностями. Тем не менее, сравнение формы графиков, отражающих динамику изменения уровня кальция в гепатоцитах, позволяет предположить наличие околочасовой ритмики и для этой функции клетки (рис. 11). Следовательно, вполне вероятно, что околочасовой ритм изменения концентрации кальция определяет и регулирует соответствующий ритм остальных функций клетки. В нативной печени этот ритм, являющийся фундаментальным свойством самой клетки, корректируется за счет межклеточных взаимодействий посредством щелевых контактов, разнообразными нервными влияниями, а также различными синхронизаторами, присутствующими в сыворотке крови, в частности, таким известным координатором ритма, как М.

6. Влияние долговременного введения мелатонина на экспрессию эстрогенсульфотрансферазы в печени старых крыс

Известно, что высокая активность фермента печени эстрогенсульфотрансферазы (ЭСТ) у взрослых крыс наблюдается только в организме самцов и определяет степень ферментативной деградации эстрогенов и, следовательно, гормональный статус особи. По данным литературы (Chatterjee et al.,1994; Demyan et al., 1992, Смирнов, 2009), суммарная экспрессия изоформ ЭСТ

в печени самцов крыс прогрессивно снижается после наступления половой зрелости, а у старых самцов вообще не выявляется. В данной части работы мы попытались определить, способен ли М нивелировать связанные с возрастом, изменения суммарной экспрессии генов, кодирующих ЭСТ ([Stel и Ste2), в печени самцов крыс и, таким образом, может ли он продлить их «репродуктивный» возраст. Для этих экспериментов экспрессию ЭСТ регистрировали дополнительно у крыс в возрасте 7 месяцев как промежуточном между исследованными в литературе (Chatterjee et al., 1994).

Для изучения суммарной экспрессии генов изоформ эстрогенсульфотрансферазы Stel и Ste2 были получены кДНК-библиотеки, синтезированные на мРНК из перфузированной печени молодых, старых крыс и старых крыс, получавших экзогенный М. Исследование проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов кДНК из тканей печени были предварительно отнормированы по гену house-keeping белка GAPDH, количество мРНК которого в клетках различного типа считается одинаковым. кДНК печени считались отнормированными, если уровень экспрессии GAPDH в печени, полученной от разных типов крыс, был одинаков. В случае необходимости изменяли количество кДНК в реакционной смеси. На основании интенсивности окрашивания полос бромистым этидием были сделаны выводы об уровне суммарной экспрессии исследуемых генов. ОТ-ПЦР не является количественным методом, однако нормирование тканей печени по одному из белков общего метаболизма позволяет сделать выводы об уровне экспрессии исследуемых генов.

Результаты свидетельствуют о наличии мРНК обеих изоформ ЭСТ (Stel и Ste2) в печени крыс всех исследованных возрастов (рис.20). При этом уровень суммарной экспрессии изоформ ЭСТ в печени молодых крыс (3 месяца) достоверно выше (р<0,01), чем уровень экспрессии изоформ ЭСТ в печени крыс в возрасте 7 и 24 месяцев (рис.21).

Рис. 20. Оценка суммарного уровня

экспрессии генов Stel и Ste2 в печени крыс разного возраста

относительно гена

GAPDH: 1 - молодая крыса (3 мес.); 2 -молодая крыса (7 мес.); 3 - старая интактная крыса (24 мес.); 4 - старая крыса (24 мес.), получавшая экзогенный М.

отн.ед.

150000

<25ООО 100000 75000 50000 25000 0

24мес (получавшие мелатонин в период дожития)

Рис. 21. Уровень суммарной экспрессии изоформ эстрогенсульфотрансферазы самцов крыс разного возраста (ось У - интенсивность окрашивания полос бромистым этидием).

Таким образом, результаты данного исследования подтвердили данные литературы (СЬайецее й а1.,1994; Оетуап е1 а1., 1992) - суммарная экспрессия обеих изоформ ЭСТ у самцов крыс с возрастом снижается, причем снижение ее начинается уже с 7 месяцев. Долговременное введение М перорально крысам с питьевой водой не вызывало достоверного изменения уровня суммарной экспрессии изоформ фермента в печени старых крыс по сравнению с контролем.

Продемонстрировать геропротекторное действие М на уровне, определяющем функционирование всего организма, в данном случае, по-видимому, не удалось. Это может говорить о том, что М действительно не способен влиять на возрастную экспрессию данного фермента, но также вероятно и то, что времени введения гормона (3 месяца) оказалось недостаточно для проявления его омолаживающего действия. Кроме того, возможно, отсутствие ожидаемого результата связано с тем, что введение М крысам проводили слишком поздно - начиная с 19 месяцев жизни, тогда как снижение суммарной экспрессии изоформ ЭСТ наблюдалось уже с 7 месяцев. Можно предположить, что применение экзогенного М крысам с 7 месяцев позволило бы поддержать и продлить экспрессию фермента на том же уровне, что и у самцов после наступления половой зрелости. В нашем же случае снижение суммарной экспрессии изоформ ЭСТ произошло настолько давно, что, вероятно, резервов для восстановления нормального уровня экспрессии фермента в клетках печени уже не осталось. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что кооперативная активность клеток в составе органа закономерно меняется с возрастом. Таким образом, наши результаты подтвердили, что старение можно рассматривать как потерю интеграции между системами организма, а одной из причин возрастных нарушений функционирования систем организма может являться потеря коммуникативных способностей клеток, что связано, в первую очередь, с изменением свойств межклеточного посредника (состава межклеточной жидкости, сыворотки крови). Показано, что М, определяющий циклы сна-бодрствования, сезонную и суточную организацию функционирования различных систем организма - процессы, представляющие собой долговременные ритмы, - также может выступать организатором ритмов с более коротким

периодом - околочасовых, проявляющихся, в частности, в функционировании клеток печени. Воздействие М восстанавливает околочасовую ритмику работы популяции гепатоцитов и нивелирует проявления старения печени. По-видимому, для регуляции на данном уровне требуются возможности М как паракринного регулятора, то есть вещества, действующего на небольших расстояниях порядка диаметра нескольких клеток.

Из литературы известно, что с возрастом претерпевают изменения характеристики печени на всех уровнях - ухудшается микроциркуляция в капиллярах печени (Warren et al.,

2008), меняется морфология составляющего их эндотелия (Gouteur et al, 2008), снижается пролиферативная способность гепатоцитов в ответ на повреждающие воздействия (Timchcnko,

2009) и способность к глкжонеогенезу (Kim et al., 2009), появляются воспалительные изменения органа (Singh et al., 2008). Меняются также и внутренние параметры гепатоцитов -лабильность мембраны (Kitania et al., 1997), способность к эндоцитозу (Gouteur et al, 2008), снижается экспрессия некоторых рецепторов и происходит их перераспределение, вследствие чего уменьшается чувствительность клеток к действию стимулирующих веществ (Karaat et al., 2008), выявляются изменения структуры гистонов в ядре (Kawakami et at, 2009). Возможно, какие-либо из этих изменений приводят к нарушению коммуникативных свойств гепатоцитов в культуре. В наших исследованиях взаимосвязь между снижением кооперативной активности гепатоцитов и какими-либо их морфологическими параметрами не была прослежена, однако данный аспект проблемы представляет определенный интерес и требует подробного изучения в будущем.

ВЫВОДЫ

1. Мелатонин вызывает синхронизацию клеток, которая выражается в появлении околочасовых ритмов синтеза белка в разреженных, в норме не синхронных культурах гепатоцитов молодых крыс. Выявлены минимальные эффективная концентрация и эффективное время действия мелатонина на гепатоциты первичной культуры крыс (1 кМ, 5 мин инкубации).

2. В плотных культурах старых крыс, в норме слабо синхронизованных, мелатонин восстанавливает синхронизацию синтеза белка.

3. Выявлена долговременная динамика уровня ионов кальция в гепатоцитах крыс. Показана ее синхронность в гепатоцитах плотных культур молодых крыс и отсутствие синхронности в разреженных культурах. Мелатонин синхронизует динамику изменения уровня ионов кальция в разреженных в норме не синхронных культурах гепатоцитов молодых крыс.

4. Показано, что у старых крыс степень синхронности гепатоцитов в плотных культурах по динамике изменения уровня ионов кальция нарушается. Обработка культур мелатонином

восстанавливает синхронизацию динамики изменения уровня ионов кальция между гепатоцитами таких культур.

5. Долговременное пероральное введение мелатонина старым крысам в период дожития восстанавливает межклеточные взаимодействия в плотных культурах их гепатоцитов, что выражается в значимом повышении степени синхронизации динамики уровня ионов кальция составляющих их клеток.

6. Показано снижение суммарной экспрессии изоформ фермента эстрогенсульфотрансферазы (маркер старения) в печени самцов крыс, начиная уже с 7 месяцев. Долговременное пероральное введение мелатонина старым крысам в период дожития не влияет на уровень суммарной экспрессии изоформ эстрогенсульфотрансферазы в их печени.

Список печатных работ, опубликовавнь д по теме диссертации

1. Беспятых А.Ю. Влияние мелатонина на динамику ионов кальция в гепатоцитах крыс // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2008. Секция «Биология». Москва. 2008, с. 207.

2. Беспятых А.Ю. Мелатонин в регуляции околочасовых ритмов синтеза белка в культуре гепатоцитов разновозрастных крыс. // Конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина». Санкт-Петербург. 2008, с.37.

3. Бродский В.Я., Голиченков В.А., Звездина Н.Д., Дубовая Т.К., Фатеева В.И., Мальченко JI.A., Бурлакова О.В., Беспятых А.Ю. Мелатонин усиливает синтез белка и синхронизирует ритм синтеза в культурах гепатоцитов старых крыс.//Онтогенез, 2008, т. 39, № 6, е.443-447.

4. Беспятых А.Ю.. Бурлакова О.В., Голиченков В.А. Мелатонин в регуляции околочасовых ритмов синтеза белка в культуре гепатоцитов разновозрастных крыс.// Материалы I Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. Владикавказ. 2008, с. 106.

5. Беспятых А.Ю.. Бродский В.Я., Бурлакова О.В., Голиченков В.А., Вознесенская Л.А., Колесников Д.Б., Молчанов А.Ю., Рапопорт С.И. Мелатонин: теория и практика, (п/р Рапопорта С.И. и Голиченкова В.А.) М.: ИД «Медпрактика-М», 2009, 100с.

6. Беспятых А. Ю.. Бурлакова О. В., Голиченков В.А. Мелатонин как антиоксидант: основные функции и свойства// Успехи современной биологии, 2010, т. 130, №5, с 487496.

7. Беспятых А.Ю.. Голиченков В.А., Клюс К.А. Возрастные изменения межклеточных взаимодействий в первичной культуре гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина// IX Международный Симпозиум «Биологические механизмы старения», Украина, Харьков, 2010, с. 46.

8. Беспятых А.Ю.. В.А. Голиченков. Межклеточные взаимодействия в культуре гепатоцитов крыс разного возраста в норме и после воздействия мелатонина// VIII Всероссийская конференция по патологии клетки, Москва, 2010, с 35.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.б.н. В.А. Голиченкову, в.н.с. О.В. Бурлаковой, коллективу кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, д.б.н. В.Я Бродскому, В.И Фатеевой и коллективу лаборатории цитологии ИБР РАН, Ю. Смирновой.

Подписано в печать 17.11.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 75 экз. Заказ № 1049 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беспятых, Анастасия Юрьевна

Оглавление

Введение

Обзор литературы;5'

Околочасовые ритмы

1. Распространенность клеточных ритмов в природе. Разнообразие клеточных ритмов. Примеры ритмов.

2. Особенности околочасовых ритмов. Разные уровни околочасовых ритмов.

3. Установление общего ритма клеточной популяции из ритмов отдельных клеток

4. Первичная культуратепатоцитов как модель межклеточных взаимодействий

5. Возрастные изменения в установлении межклеточной кооперации

6. Общий биохимический механизм установления межклеточной кооперации

Мелатонин

1. Биосинтез и секреция мелатонина

2. Инактивация мелатонина

3. Рецепторы мелатонина у млекопитающих

4. Способы передачи сигнала от рецепторов мелатонина

5. Биоритмологические свойства мелатонина

6. Антиоксидантные свойства мелатонина

7. Иммуномодуляторная функция мелатонина

8. Возрастные изменения продукции мелатонина

9. Влияние мелатонина на процесс старения

Изменение различных физиологических параметровпечени при старении организма

Передача сигналов в клетку. Кальций как вторичный мессенджер.

1. Общая информация

2. Частота кальциевых сигналов

3. Особенности частотно-кодируемых Са2+-сигналов в печени

4. Межклеточные волны Са2+ в перфузируемой печени

5. Регуляция мелатонином межклеточных взаимодействий в культуре гепатоцитов

6. Нарушения передачи сигналов с помощью ионов кальция при старении - кальций в поджелудочной железе

Объекты и методы исследования

1. Объект исследования

2. Получение культуры гепатоцитов.

3. Исследование кинетики синтеза белка по включению 3Н-лейцина.

4. Исследование динамики уровня ионов кальция в культуре гепатоцитов.

5. Влияние мелатонина на синхронизацию ритма синтеза белка и динамику уровня ионов кальция в культуре гепатоцитов.

6. Определение метаболической активности печени по уровню экспрессии эстрогенсульфотрансферазы

1) Выделение тотальной РНК

2) Определение концентрации тотРНК в пробе.

3) Синтез кДНК

- 4) Конструирование праймеров.

5) Нормировка кДНК библиотек.

6) Полимеразная цепная реакция.'

7) Секвенирование

7. Статистическая обработка результатов

Результаты исследования и их обсуждение молодых крыс

4. Влияние мелатонина на синхронизацию динамики изменения уровня ионов кальция в плотной культуре гепатоцитов старых крыс

5. Исследование влияния долговременного введения мелатонина старым крысам на синхронизацию динамики ионов кальция в культурах их гепатоцитов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Возрастные изменения межклеточных взаимодействий гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина"

В настоящее время существует ряд гипотез и теорий^ объясняющих причины и механизмы; старения. Обилие таких; теорий'1 связано с тем, что на данном этапе геронтология; находится % в? периоде интенсивного накопления фактов и анализа причин затухания функций организма.

Сведения: о природе, старения позволяют предположить,. чтос среди! старческих; изменений существенна потеря интегративных свойств системами; организма разного' уровня и. прежде всего, клеточными« популяциями; Поэтому в. нашей? работе: мы обратились к изучению возрастных изменений организма? на: уровне* межклеточных взаимодействий.

Степень кооперации клеток в популяции является отражением межклеточных взаимодействия составляющих ее клеток. Для изучения межклеточных взаимодействий Вс.Я. Бродским с сотрудниками был разработан, метод оценки; клеточной!кооперации по ритму синтеза белкавпервичной; культуре гепатоцитов крысы (Вгос^ку е1: аГ:, 1992, 2000): Известно, что нативнаяг печень эффективно'функционирует в ¡' изменяющихся < условиях только благодаря совокупности происходящих в ней локальных синхронных процессов, и именно поэтому она может служить удобным объектом исследования механизмов, осуществляющих временную организацию биологической системы:

Было показано, что синтез* белка в такой культуре не происходит хаотически, а представляет: собой сложный; колебательный процесс с периодом- около - 30-60 * мин, т.е. околочасовой- ритм,. причем ? выраженность усредненного ритма в клеточной; популяции зависит от степени^ синхронизации клеток, т.е: от состояния межклеточных взаимодействий в популяции.(Вгос1зку е1 а1., 2004).

Наг синхронизацию* околочасовых; ритмов- синтеза белка. влияет изменение концентрации Са2+ в клетках; (Бродский и др., 2006). Также известно, что изменение концентрации Са2+ может быть, вызвано действием мелатонина ^оЫот е! а1:, 2003). Существуют данные, указывающие на геропротекторную»роль гормона мелатонина -временного организатора онтогенеза. Поэтому было бы интересно установить, не связана ли его геропротекторная роль в том числе и с регуляцией степени кооперации-клеток.

В соответствии с этим, целью нашей работы, является; исследование влияния мелатонина на возрастные изменения кооперативных свойств и метаболических показателей; гепатоцитов;

Обзор литературы

Околочасовые ритмы

В настоящее время околочасовые ритмы изучаются достаточно широко. Наиболее полно последние данные об этих ритмах активности клеток, органов и организма в целом представлены в обзоре В.Я.Бродского (Brodsky, 2006). jh Распространенность клеточных ритмов,вприроде. Разнообразие клеточных ритмов. Примеры ритмов:

Внутриклеточные ритмы с периодом приблизительно в 1 ч были обнаружены в начале 60-х годов с помощью метода микроинтерферометрии. В 50-е годы считали, что белковая, масса клеток изменяется медленно - за многие часы или даже сутки. Поэтому для оценки методических ошибок показатели регистрировали с 10-минутными интервалами в течение 1-1.5 ч. Однако, неожиданно вместо случайного разброса значений были найдены периодические изменения» (колебания) белковой массы. Существование таких колебаний- было подтверждено параллельными исследованиями тех же клеток с использованием УФ-цитофотометрии (Бродский, 1960, Бродский и др., 1961, цит. по Brodsky, 2006).

После большой серии работ появилось много примеров приблизительно часовых колебаний сухой массы клеток, скорости белкового синтеза, ферментативной активности и, в некоторых случаях, размеров клеток и ядер-(Brodsky, 1975, там же). Колебания с периодами от 20 до 120 мин получили^ название «околочасовые» (circahoralian). В единой номенклатуре позже такие ритмы были названы ультрадианными (по примеру околосуточных - циркадианных - ритмов).

В настоящее время околочасовые (ультрадианные) ритмы белкового синтеза описаны в различных клетках от бактерии до человека как in situ, так и во многих культивируемых клетках. Кроме того, были описаны, ультрадианные ритмы аминоацил-тРНК, активности 20 различных ферментов, аденилатов, включая АТФ и цАМФ, рН и скорости дыхания клеток (Brodsky, 2006).

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Беспятых, Анастасия Юрьевна

Выводы

2. В плотных культурах гепатоцитов старых крыс, в норме слабо синхронизованных, мелатонин восстанавливает синхронизацию синтеза белка.

3. Выявлена долговременная динамика уровня ионов кальция в гепатоцитах крыс. Показана ее синхронность в гепатоцитах плотных культур молодых крыс и отсутствие синхронности в разреженных культурах. Мелатонин синхронизует динамику концентрации ионов кальция в разреженных в норме не синхронных культурах гепатоцитов молодых крыс.

4. Показано, что у старых крыс степень синхронности гепатоцитов плотных культур по динамике изменения уровня ионов кальция нарушается. Обработка культур мелатонином восстанавливает синхронизацию динамики изменения уровня ионов кальция между отдельными гепатоцитами таких культур.

Заключение

Мы показали, что кооперативная активность клеток в составе органа закономерно меняется с возрастом. Таким образом, наши результаты подтвердили, что старения можно рассматривать как потерю интеграции между системами организма разного уровня и в пределах уровня и одной из причин возрастных нарушений функционирования систем организма может являться потеря коммуникативных способностей клеток. При этом в отн. ед.

150000

125000 100000 75000 50000 25000

3 мес 7 мес 24 мес 24 мес получавшие мелатонин в период дожития)

Рис. 25. Уровень суммарной экспрессии изоформ эстрогенсульфотрансферазы самцов крыс разного возраста (ось У - интенсивность окрашивания полос бромистым этидием). нарушении работы органов и систем организма первично изменение свойств межклеточного посредника (состава межклеточной жидкости, сыворотки: крови), а не изменение характеристик , составляющих их: клеток, , так как добавление факторов;, усиливающих кооперативную активность клеток, приводит к восстановлению их синхронной; работы^ Показано, что мелатонии, определяющий ¡циклы сна-бодрствования; сезонную-и суточную организацию функционирования ».различных: систем; организма, то есть процессы, представляющие собой долговременные ритмы,. также может выступать организатором ритмов-» с более коротким периодом — околочасовых, проявляющихся, в частности; в функционировании клеток печени; Возрастные, нарушения околочасовой1; ритмики; работы, в популяции данных клеток приводят к снижению эффективности функционирования печени как целого; что определяется- как старение данного5 органа. Воздействие мелатонином восстанавливает околочасовую ритмику работы в популяции гепатоцитов; и нивелирует проявления старения. По-видимому, для регуляции на данном уровне: функционирования организма: требуются возможности мелатонина как,: паракринного регулятора,, то ' есть вещества; действующего на' небольших расстояниях порядка диаметра нескольких клеток.

Из; литературы известно, что с возрастом- претерпевают изменения; характеристики печени на; всех уровнях - ухудшается микроциркуляция в капиллярах печени-(Warren et all, 2008), меняется морфология составляющего их эндотелия (Goûteur et al, 2008), снижается пролиферативная; способность гепатоцитов в отвёт на повреждающие воздействия (Timchenko, 2009) и способность к глюконеогенезу (Kim et al., 2009), появляются воспалительные изменения* органа (Singh- et al;, 2008). Меняются- также и внутренние параметры, гепатоцитов - лабильность мембраны (Kitania; et al., 1997)] способность к эндоцитозу • (Gouteur. et al; 2008), снижается экспрессия ; некоторых рецепторов и происходит их перераспределение, вследствие чего уменьшается чувствительность клеток к действию стимулирующих веществ (Kamat. et:-, al., 2008),, выявляются изменения структуры гистонов в ядре (Kawakami et at, 2009). Возможно, какие-либо из этих изменений приводят к нарушению коммуникативных свойств гепатоцитов в культуре. В наших исследованиях непосредственная взаимосвязь между снижением кооперативной активности гепатоцитов и какими-либо их морфологическими параметрами не была прослежена, однако данный аспект проблемы: представляет определенный интерес и требует подробного изучениям будущем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Беспятых, Анастасия Юрьевна, Москва

1. Анисимов В.Н. Влияние мелатонина на процесс старения, 2004// в кн. Мелатонин в норме и патологии, под ред. Комарова Ф.И.,Рапопорта С.И., Малиновской Н.К., Анисимова В.Н. М., с.223-237

2. Анисимов В.Н. Возрастные изменения функции эпифиза, 2004// в кн. Мелатонин в норме и патологии, под ред. Комарова Ф.И., Рапопорта С.И., Малиновской Н.К., Анисимова В.Н. М., с. 20-34

3. Анисимов В.Н. Эпифиз и продукция мелатонина, 2004// в кн. Мелатонин в норме и патологии, под ред. Комарова Ф.И., Рапопорта С.И., Малиновской Н.К., Анисимова В.Н. М., с. 7-20

4. Беспятых А. Ю., Бурлакова О. В., Голиченков В.А. Мелатонин как антиоксидант: основные функции и свойства// Успехи современной биологии, 2010, т. 130, №5, с 487:496

5. Бондаренко Л. А. Современные представления о физиологии эпифиза // Нейрофизиология, 1997, т. 29, № 3, с. 212-237.

6. Бродский В.Я, Нечаева Н.В, Новикова Т.В., Гвазова И.Г., Фатеева В.И. Самосинхронизации клеток в культуре гепатоцитов 1 с противофазными колебаниями интенсивности синтеза белка // Известия академии наук, серия биологическая, 1994 №66 с. 853-8.

7. Бродский В.Я. Околочасовые (ультрадианные) клеточные ритмы: начало исследований, некоторые итоги // Онтогенез, 2000, т. 31, № 6, с. 410-419

8. Ю.Бродский В.Я., Дубовая Т.Г., Нечаева Н.В., Фатеева В.И., Новикова Т.Е., Гвазава И.Г. Ритм синтеза белка в денервированной печени крысы// Известия РАН, серия биологическая, 1995, №2, с. 133-136

9. Бродский В.Я., Звездина Н.Д., Фатеева В.И., Мальченко Л.А. Механизм прямых межклеточных взаимодействий. Самоорганизация ритма синтеза белка //

10. Онтогенез, 2006, том 37, №5, с. 384-393

11. Бродский В.Я., Нечаева Н.В., Звездина Н.Д., Авдонин П.В., Новикова Т.Е., Гвазава И.Г., Фатеева В.И. Изменения концентрации ионов кальция и ритм синтеза белка в культуре гепатоцитов // Изв. АН. Gep. биол. 2002. № 1. С. 10-16. Бродский и др., 2006;

12. Бродский В.Я., Нечаева Н.В, Звездина Н.Д., Новикова Т.Е., Гвазава И.Г., Фатеева В.И. Ганглиозиды синхронизируют ритм синтеза белка в гепатоцитах in vitro // Известия РАН серия биологическая, 1996, №5, с. 517-522

13. Звездина Н.Д., Нечаева Н.В., Грачева Е.В. и др. Нарушение кооперации гепатоцитов в ритме синтеза белка хелатором цитоплазматического кальция ВАРТА-АМ // Изв. АН. Сер. биол. 2003. № 1. С. 14-19.

14. Прозоровская М.П. Возрастные изменения в адреналин/норадреналиновом ' отношении в тканях крысы // Физиол. журнал СССР. 1983. Т. 69. С. 1244-1246.

15. Романовский Ю.М., Чернавский Д.С. Взаимная синхронизация многих автоколебательных систем, связанных через диффузию // Тез: IV Международ, биофиз. конгресса. Т. 4. М., 1972. С. 51;

16. Смирнов А.Н. Гормональные механизмы половой дифференцировки печени:, современные представления и проблемы. Онтогенез. 2009, т.40, №5, с. 334-354

17. Abbott LF, Nelson SB. Synaptic plasticity: taming the beast// Nat Neurosci., 2000, Nov;3 Suppl, pp. 1178-83

18. Acuna-Castroviejo, D., Escames, G., Leon, J., Carazo, A., and Klialdy, H. (2003). Adv. Exp. Med. Biol. 527, 549-557

19. Acuna-Castroviejo, D., Martin, M., Macias, M., Escames G, León J, Khaldy H, Reiter RJ. Melatonin, mitochondria, and cellular bioenergetics// J. Pineal Res., 2001,v/30,pp.65-74.

20. Akbulut K.G, Gonül B, Akbulut H. Exogenous melatonin decreases age-induced lipid peroxidation in the brain // Brain Res., 2008, v. 1238, pp. 31-5

21. Alarma-Estrany P, Pintor J. Melatonin receptors in the eye: location, second messengers and role in ocular physiology// Pharmacol Ther., 2007, v. 113(3), pp. 507-22.

22. Allen GJ, Chu SP, Harrington CL, Schumacher K, Hoffmann T, Tang YY, Grill E, Schroeder JI. A defined range of guard cell calcium oscillation parameters encodes stomatal movements//Nature, 2001, v. 411(6841), pp. 1053-7

23. Andrabi S. A., Sayeed I., Siemen D., Wolf G., Horn T. F. Direct inhibition of the mitochondrial permeability transition pore: a possible mechanism responsible for anti101apoptotic effects of melatonin. FASEB J., 2004, v. 18, pp. 869-871

24. André E., Gawlas K., Becker-André M. A novel isoform of the orphan nuclear receptor RORbeta is specifically expressed in pineal gland and retina// Gene, 1998, v. 216, p. 2, pp. 277-83.

25. Arendt J, Deacon S, English J, Hampton S, Morgan L. Melatonin and adjustment to phase shift// J Sleep Res., 1995, v. S2, pp. 74-79

26. Arendt J. Melatonin and the Mammalian Pineal Gland// London: Chapman & Hall, 1995, p. 161

27. Arendt J. Clinical perspectives for melatonin and its agonists// Biol Psychiatry., 1994, v.35(l), pp. 1-2.

28. Axelrod J. The pineal gland: a neurochemical transducer// Science, 1974, v. 184, pp. 1341-1348

29. Balzer I., Hardeland R. Daily profile of melatonin levels in Chenopodium rubrum L. depends on photoperiod// Botanica Acta., 1996. V. 109 (3). P. 180

30. Barlow-Walden LR, Reiter RJ, Abe M, Pablos M, Menendez-Pelaez A, Chen LD, Poeggeler B. Melatonin stimulates brain glutathione peroxidase activity // Neurochem. Int., 1995, v. 26, pp. 497-5027 - ------

31. Bayer KU, De Koninck P, Schulman H. Alternative splicing modulates the frequency-dependent response of CaMKII to Ca(2+) oscillations// EMBO J., 2002, v. 21(14), pp. 3590-7

32. Bergelson LD. Serum gangliosides as endogenous immunomodulators// Immunol Today. 1995, v.10, pp. 483-6.

33. Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Calcium signalling: dynamics, homeostasis102and remodeling// Nat Rev Mol Cell Biol., 2003, v. 4(7), pp. 517-29.

34. Berridge MJ. Inositol trisphosphate and calcium signaling//Nature, 1993, v. 361(6410), pp. 315-25

35. Berrige M.J., Lipp P., Bootman M.D. The versatility and universality of calcium signaling// Nat Rev Mol Cell Biol. 2000;1(1):11-21

36. Beskonakli E, Palaoglu S, Aksaray S, Alanoglu G, Turhan T, Taskin Y. Effect of pinealectomy on immune parameters in rats with Staphylococcus aureus infection// Neurosurg Rev., 2001, v. 24(1), pp. 26-30.

37. Bettahi, I., Pozo, D., Osuna, C., Reiter, R. J., Acuna-Castroviejo, D., and Guerrero, J. M. Melatonin reduces nitric oxide synthase activity in rat hypothalamus //). J. Pineal Res., 1996, v. 20, pp. 205-210.

38. Bhoola R., Hammond K. Modulation of the rhythmic patterns of expression of phosphoprotein phosphatases in human leukaemia cells// Cell Biology International, 2000, v. 24, pp. 539-547;

39. Binkley S. The Pineal.//N. J. Prentice Hall, Englewood Cliffs. 1988. P. 151.

40. Bird G. St. J., Rossier M. F., Obie J. F., Putney Jr. J. W. Sinusoidal Oscillations in Intracellular Calcium Requiring Negative Feedback by Protein Kinase C// The Journal of Biological Chemistry, 1993, v. 268, №12, pp. 8425-4426

41. Blackmail C.F., Andrews P.W., Ubeda A.U., Wang X., House D.E., Trillo M.A. Physiological levels of melatonin enhance gap junction communications in primary cultures of mouse hepatocytes// Cell biology and toxicology, 2001,17,1-9.

42. Blanchard B, Pompon D, Ducroq C Nitrosation of melatonin by nitric oxide and peroxynitrite// J Pineal Res, 2000, v. 29, pp. 184-192

43. Boitano S, Dirksen ER, Evans WH. Sequence-specific antibodies to connexins block intercellular calcium signaling through gap junctions// Cell Calcium, 1998,-v. 23(1), pp: 1-9.

44. Boitano S, Dirksen ER, Sanderson MJ. Intercellular propagation of calcium wavesmediated by inositol trisphosphate// Science, 1992, v. 258(5080), pp. 292-5.j?

45. Boitano S, Evans WH. Connexin mimetic peptides reversibly inhibit Ca(2+) signaling through gap junctions in airway cells// Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 2000, v. 279(4), pp. L623-30

46. Boulware M.J., Marchant J.S. Timing in cellular Ca2+ signaling// Current Biology, 2008, 18, R769-R776

47. Boussard MF, Truche S, Rousseau-Rojas A, Briss S, Descamps S, Droual M, Wierzbicki M, Ferry G, Audinot V, Delagrange P, Boutin'JA. New ligands at the melatonin binding103site MT(3)// Eur J Med Chem, 2006;41(3), pp. 306-20

48. Boutin JA, Audinot V, Ferry G, Delagrange P. Molecular tools to study melatonin pathways and actions// Trends Pharmacol Sci., 2005, v. 8, v. 412-419.

49. Boutin. J.A., Marcheteau E., Hennig P., Moulharat N., Berger S., Delagrange P., Bouchet J.-P., Ferry G. MT3/QR2 melatonin binding site does not use melatonin as a substrate or a co-substrate// J. Pineal Res., 2008; v. 45, pp. 524—531

50. Brainard GC, Lewy AJ, Menaker M, Fredrickson RH, Miller LS, Weleber RG, Cassone V, Hudson D. Dose-response relationship between light irradiance and the suppression of plasma melatonin in human volunteers// Brain Res., 1988; v. 454(1-2), pp. 212-8

51. Brodsky V, Zvezdina ND, Nechaeva NV, Novikova TE, Gvasava IG, Fateeva VI, Malchenko LA. Single short-term signal that enhances cooperative activity of old rat hepatocytes acts for several days// Cell Biol Int., 2005, v. 29(11), pp. 971-975

52. Brodsky V.Y. Protein synthesis rhythm// J. Theor. Biol., 1975, v.55, №2, p. 167-200

53. Brodsky Vs. Ya. Direct cell-cell communication: a new approach derived from recent data on the nature and self-organisation of ultradian (circahoralian) intracellular rhythms // Biol. Rev., 2006, 81, pp: 143-162

54. Brodsky V.Y., Boikov P.Y., Nechaeva N.V., Yurovitsky Y.G., Novikova T.E., Fateeva V.I., Shevchenko N.A. The rhythm of protein synthesis does not depend on oscillation of ATP level// J Cell Sci, 1992, v. 103, pp. 363-370.

55. Brodsky VY, Nechaeva NV, Zvezdina ND, Novikova TE, Gvasava IG, Fateeva VI, ■ Prokazova NV, Golovanova NK. Ganglioside-mediated metabolic synchronization of protein synthesis activity in cultured hepatocytes// Cell Biol Int., 2000; v. 24(4), pp: 211222.

56. Fateeva VI, Malchenko LA. Calcium ions as a factor of cell-cell cooperation in hepatocyte cultures// Cell Biol Int., 2003, v. 27(12), pp. 965-976

57. Brown TM, Piggins HD. Electrophysiology of the suprachiasmatic circadian clock// Prog Neurobiol., 2007, v. 82(5), pp. 229-55.

58. Brydon L, Petit L, de Coppet P, Barrett P, Morgan PJ, Strosberg AD, Jockers R. Polymorphism and signalling of melatonin receptors// Reprod Nutr Dev. 1999, v. 39(3), pp. 315-24. • '

59. Cahill G.M., Besharse J.C. Circadian clock functions localized in Xenopus retinal photoreceptors// Neuron 1993;10:573-7

60. Cahill GM, Besharse JC. Retinal melatonin is metabolized within the eye of Xenopus laevis// Proc Natl Acad Sci USA, 1989, v. 80, pp. 1098-102

61. Calvert-Evers J.L., Hammond K.D. Temporal variations in protein tyrosine phosphatase fcnivity during cell proliferation and differentiation // Cell. Biol. Intemat. 2000. V. 24. P. 559-567.

62. Calvo JR, Rafii-el-Idrissi' M, Pozo« D, Guerrero JM. Immunomodulatory role of melatonin: specific binding sites in human and rodent lymphoid cells// J Pineal Res., 1995< v. 18(3), pp. 119-26.

63. Camello-Almaraz C., Gomez-Pinilla P.J., Pozo M.J., Camello PJ. Age-related alterations in Ca2+ signals and mitochondrial membrane potencial in exocrine cells are prevented by melatonin// J. Pineal Res., 2008, 45, 191-198

64. Camello-Almaraz MC, Pozo MJ, Murphy MP, Camello PJ. Mitochondrial production of oxidants is necessary for physiological calcium oscillations// J Cell* Physiol., 2006, v. 206(2), pp. 487-94.

65. Cancela JM. Specific Ca 2+ signaling evoked by cholecystokinin and acetylcholine: the roles ofNAADP, cADPR, and IP 3// Annu Rev Physiol, 2001, v. 63, pp. 99-117.

66. Carandente F, Angeli A, De Vecchi A, Dammacco F, Halberg F. Multifrequency rhythms of immunological functions// Chronobiologia, 1988, v.15(1-2), pp. 7-23.

67. Carretero M., Escames G., Lopez L. C., Venegas C., Dayoub J. C., Garcia L., Acuna-48"^ Castroviejo D. Long-term melatonin administration protects brain mitochondria from aging// J. Pineal Res., 2009, v. 47, pp.192-200

68. Chakrabarti R, Chakrabarti R: Calcium signaling in non-excitable cells: Ca 2+ release and influx are independent events linked to two plasma membrane Ca 2+ entry channels// J Cell Biochem 2006; 99: 1503-1516.

69. Chan AS, Lai FP, Lo RK, "Voyno-Yasenetskaya TA, Stanbridge EJ, Wong YH. Melatonin mtl and MT2 receptors stimulate c-Jun N-terminal kinase via pertussis toxin-sensitive and -insensitive G proteins// Cell Signal., 2002, v. 14(3), pp. 249-57.

70. Chang, H.-M., Ling, E.-A., Chen, C.-F., Lue, J.-H., Wen, C.-Y., and Shieh, J.-Y. Melatonin attenuates the neuronal NADPH-d/NOS expression in the nodose ganglion.of -acute hypoxic rats J. Pineal Res., 2002, v. 32, pp.65-73

71. Chatterjee B., Song C.S., Kim J.M., Roy A.K. Androgen and estrogen sulfotransferases of the rat liver: physiological functions,' molecular cloning and in vitro expression// Chemico-Biological Interactions. 1994. V. 92, p. 273-279

72. Chawla S, Bading H. CREB/CBP and SRE-interacting transcriptional regulators are fast on-off switches: duration of calcium transients specifies the magnitude of transcriptional responses// J Neurochem., 2001, v. 79(4), pp. 849-58

73. Chugunov AO, Farce A, Chavatte P, Efremov RG. Differences in binding sites of two melatonin receptors help to explain their selectivity to some melatonin analogs: a molecular modeling study// J Biomol Struct Dyn, 2006; 24(2), pp. 91-108

74. Citri A, Malenka RC. Synaptic plasticity: multiple forms, functions, and mechanisms// Neuropsychopharmacology, 2008, v. 33(1), pp. 18-41

75. Clair C, Chalumeau C, Tordjmann T, Poggioli J, Erneux C, Dupont G, Combettes L. Investigation of the roles of Ca(2+) and InsP(3) diffusion in the coordination of Ca(2+) signals between connected hepatocytes// J Cell Sci, 2001 ;114(Pt 11), pp. 1999-2007

76. Clapham D.E. Calcium signaling// Cell, 2007, v. 131(6), pp. 1047-1058'

77. Cobbold P.H., Sanches-Bueno A., Dixon C.J. The hepatocyte calcium oscillator// Cell Calcium, 1991, v. 12, pp. 87-97

78. Cornell-Bell AH, Finkbeiner SM, Cooper MS, Smith SJ. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling// Science,1990, v. 247(4941), pp. 470-3

79. Coto-Montes A, Tomás-Zapico C, Rodríguez-Colunga MJ, Tolivia-Cadrecha D, Martínez-Fraga J, Hardeland R, Tolivia D. Effects of the circadian mutation 'tau' on the Harderian glands of Syrian hamsters. // J. Cell. Biochem. 2001, v. 83, pp.426-434

80. Csaba G, Baráth P. Morphological changes of thymus and the thyroid gland after postnatal extirpation of pineal body// Endocrinol Exp., 1975, v. 9(1), pp. 59-67.

81. Delagrange P., Boutin J.A. Therapeutic potential of melatonin ligands// Chronobiol Int, 2006; v. 23(1-2), pp. 413-8

82. Dolmetsch RE, Lewis RS, Goodnow GC, Healy JI. Differentialactivation of transcription factors induced by Ca2+ response amplitude and duration// Nature, 1997, v. 386(6627), pp. 855-8.

83. Dubocovich, M. L. Melatonin receptors: are there multiple subtypes? Trends Pharmacol. Sci., 1995. v. 16, pp. 50-56

84. Dubocovich, M. L., Rivera-Bermudez, M. A., Gerdin, M. J., and Masana, M. I. (2003). Front. Biosci. 8; dl093-dll08

85. Duchen MR. Mitochondria and Ca(2+)in cell physiology and pathophysiology// Cell Calcium, 2000, v. 28 (5-6), pp. 339-48

86. Dunlap K, Takeda K, Brehm P. Activation of a calcium-dependent photoprotein by chemical signalling through gap junctions//Nature, 1987, v. 325(6099), pp. 60-2

87. Ehret M, Gobaille S, Cash CD, Mandel P, Maitre M. Regional distribution of rat brain tryptophan hydroxylase apoenzyme determined by enzyme-linked immunoassay// Neurosci Lett 1987;73:71-6

88. Ekmekcioglu C. Melatonin receptors in humans: biological role and clinical relevance// Biomed Pharmacother, 2006;60(3), pp. 97-108

89. Ferguson, S. S. Evolving concepts in Gfprotein-coupled receptor endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling. Pharmacol. Rev., 2001, v. 53, pp.1-24

90. Ferrari G., Anderson B.L., Stephens R.M., Kaplan D.R., Green L.A. Prevention of apoptic neuronal death by GM1 ganglioside// Journal of Biological Chemistry, 1195, v. 270, pp. 3074-380, " ---

91. Ferreira G.M.H., Hammond K.D., Gilbert D.A. Distinct High frequency oscillations of the activity and amount of active isozyme of lactate dehydrogenase in murine erythroleukaemic cells and a cell-free system // Ibid. 1996. V. 20. P. 625-633.

92. Ferreira G.M.N., Hammond K.D., Gilbert D.A. Oscillatory variations in the amount of protein extractable from murine erythroleucemic cells // BioSystems. 1994. V. 32. P. 183-190.

93. Finocchiaro LM, Nahmod VE, Launay JM. Melatonin biosynthesis and metabolism in peripheral blood mononuclear leucocytes// Biochem J., 1991, v. 280 ( Pt 3), pp. 727-31.

94. Florez JC, Takahashi JS. Quantitative 2-dimensional gel-electrophoretic analysis107of clock-controlling proteins in cultured chick pineal cells circadian regulation of tryptophan hydroxylase// J Biol Rhythms 1996;11:241-57

95. Gallo EM, Cante-Barrett K, Crabtree GR. Lymphocyte calcium signaling from membrane to nucleus//Nat Immunol., 2006, v. 7(1), pp. 25-32.

96. Garcia JJ, Reiter RJ, Ortiz GG, Oh CS, Tang L, Yu BP, Escames G. Melatonin enhances tamoxifen's ability to prevent the reduction in microsomal'membrane fluidity induced by lipid peroxidation// J Membr Biol, 1998, v. 162, pp. 59-65

97. Gaspers LD, Thomas AP. Calcium signaling in liver// Cell Calcium, 2005, 38(3-4):329-42

98. Gilad E, Cuzzocrea S, Zingarelli B, Salzman AL, Szabo C Melatonin is a scavenger of peroxynitrite// Life Sci, 1997, v. 60, p. 169-174

99. Gilad E, Matzkin H, Zisapel N. Inactivation of melatonin receptors by protein kinase C in human prostate epithelial cells// Endocrinology, 1997, vv. 138(10), pp. 425561.

100. Gilman, A. G. Nobel Lecture. G proteins and regulation of adenylyl cyclase// Biosci. Rep., 1995, v.15, pp. 65-97

101. Godson C, Reppert SM. The Mella melatonin receptor is coupled-to-parallel signal transduction pathways// Endocrinology, 1997, v. 138(1), pp. 397-404.

102. Goldberger A.L., West B J. Fractals in physiology and medicine// Yale J Biol Med., 1987, v.5, pp.421-435;

103. Goldberger A.L., Rigney D.R., Mietus J., Antman E.M., Greenwald S. Nonlinear dynamics in sudden cardiac death syndrome: heartrate oscillations and bifurcations// Experientia., 1988,v. 44 (11-12), pp. 983-987

104. Goldering J.R., Ofis L.O., Yu R.K., DeLorenzo RJ. Calcium/ganglioside dependent protein kinase activity in rat brain membrane // J. Neurochem. 1985. V. 44. P. 1229-1234.

105. Gurdol, F., Gene,. S:, Oner-Iyidogan; Y.,. and Suzme, R. Coadministration of melatonin and estradiol in rats: effects on oxidant status Horm. Metab: Res., 200V, v. 33;. pp. 608-611.

106. Gurlek A, Aydogan Hj Parlakpinar H; Bay-Karabulut A^Celik M^Sezgin N, Acet A. Protective effect of melatonin onrandom pattern skin flap necrosis in pinealectomized rat. J; Pineal Res., 2004, v. 36, pp. 58-63.

107. Guthrie PB, Knappenberger J, Segal M, Bennett MV, Charles AC, Kater SB. AT® released from astrocytes mediates glial5calcium waves// J Neurosci;,' 1999; v. 19(2), pp. 520-8

108. Hannibal J. Regulation of melanopsin expression // Chronobiol Int., 2006;.23(1-2): pp: 159-66

109. Hardeland R., Coto-Montes A., Poeggeler B. Circadian rhythms, oxidative stress, and antioxidative defense mechanisms. Chronobiol. Int., 2003, v. 20, pp. 921-962

110. Harris-White ME, Zanotti SA, Frautschy SA, Charles AC. Spiral intercellular calcium waves in hippocampal slice cultures// J Neurophysiol., 1998, v. 79(2), pp. 104552.

111. Hassinger TD, Guthrie PB, Atkinson PB, Bennett MV, Kater SB. An extracellulartsignaling component in propagation of astrocytic calcium waves// Proc Natl Acad Sci U S A., 1996, v. 93(23), pp. 13268-73.

112. Horstman J.A., Wrona M.Z., Dryhurst G. Further insights into the reaction of melatonin with hydroxyl radical// Bioorg Chem, 2002, v. 30, pp. 371-382

113. Hunt AE, Al-Ghoul WM, Gillette MU, Dubocovich ML. Activation of MT(2) melatonin receptors in rat suprachiasmatic nucleus phase advances the circadian clock// Am J Physiol Cell Physiol. 2001, v. 280(1), pp. CI 10-8.

114. Ikeda M, Sugiyama T, Wallace CS, Gompf HS, Yoshioka T, Miyawaki A, Allen CN. Circadian dynamics of cytosolic and nuclear Ca2+ in single suprachiasmatic nucleus neurons//Neuron., 2003, v. 38(2), pp. 253-63

115. Isasi S.C., Bianco I.D., Fidelio G.D. Gangliosides raise the intracellular Ca2+ level in different cell types // Life Sci. 1995. V. 57. P. 449^156.

116. Jiang ZG, Nelson CS, Allen CN. Melatonin activates an outward current and inhibits Ih in rat suprachiasmatic nucleus neurons// Brain Res., 1995, v. 687(1-2), pp.12532

117. Jin J., Wang G.-L., Shi X., Darlington G. J., Timchenko N. A. The Age-Associated Decline of Glycogen Synthase Kinase 3 Plays a Critical Role in the Inhibition of Liver Regeneration// MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, July 2009, p. 3867-3880

118. Johnson CH, Knight MR, Kondo T, Masson P, Sedbrook J, Haley A, Trewavas A. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants// Science, 1995, v. 269(5232), pp. 1863-5

119. Johnston JD, Tournier BB, Andersson H, Masson-Pevet M, Lincoln GA, Hazlerigg DG. Multiple effects of melatonin on rhythmic clock gene expression in the mammalian pars tuberalis //Endocrinology, 2006; 147(2), pp.959-65

120. Jungermann K, Kietzmann T. Zonation of parenchymal and nonparenchymal metabolism in liver// Annu Rev Nutr., 1996, v. 16, pp. 179-203.

121. Kamat A., Ghosh P. M., Glover R. L., Zhu B., Yeh C.-K., Choudhury G. G., Katz M. S. Reduced Expression of Epidermal Growth Factor Receptors in Rat Liver During Aging// Journal of Gerontology: BIOLOGICAL SCIENCES, 2008, V. 63A, №. 7, pp. 683-692

122. Karasek M. Does melatonin play a role in aging prosesses?// Journal of Physiology and Pharmacology, 2007, v. 58, suppl. 6, pp. 105-113

123. Kawabata T., Kinoshita M., Inatsu A., Habu Y., Nakashima H., Shinomiya N., Seki S. Functional Alterations of Liver Innate Immunity of Mice with Aging in Response to CpG-Oligodeoxynucleotide// HEPATOLOGY, Vol. 48, No. 5, 2008

124. Kawakami K., Nakamura A., Ishigami A., Goto S., Takahashi R. Age-related difference of site-specific histone modifications in rat liver// Biogerontology, 2009, v. 10, pp. 415—421

125. Kim K, Cho S. C., Cova A., Jang I. S., Park S. C. Alterations of epinephrine-induced gluconeogenesis in aging// EXPERIMENTAL and MOLECULAR MEDICINE, Vol. 41, No. 5, 334-340, May 2009

126. Klein D.C., Roseboom P.H., Coon S.L. New light is shining on the melatonin rhythm enzyme// Trends Endocrinol Metab, 1996, v. 7, pp. 106-12

127. Klisch C., Mahr S., Meissl H. Circadian activity rhythms and phase-shifting of cultured neurons of the rat suprachiasmatic nucleus // Chronobiol Int. 2006;23(1-2):181

128. Kojima T., Mochizuki C., Mitaka T., Mochizuki Y. Effects of melatonin on proliferation, oxidative stress and Cx32 gap junction protein expression in primary cultures of adult rat hepatocytes// Cell structure and function, 1997, 22, 347-356.

129. Kong Y., Li R., Ladish S. Natural form of shed gangliosides// Biochimica et Biophysica, 1998, v. 1394, pp. 43-56

130. Korkmaz A. Epigenetic actions of melatonin// J. Pineal Res., 2009; v. 46, pp.117118

131. Kotler M., Rodriguez C., Sainz R.M., Antolin I., Menendez-Pelaez A.Melatonin increases gene expression for antioxidant enzymes in rat brain cortex// J. Pineal Res., 1998, v. 24, pp. 83-89

132. Kreutter D., Kim J.Y., Goldenberg J.R., Rasmussen H., Ukomade C., Yu R.K. Regulation of protein kinase C activity by gangliosides//Journal of biological chemistry, 1997, v.262, pp. 633-637

133. Kuci S., Becker J., Veit G.Circadian variations of immunomodulatory role of the pineal gland// Neuroendocrinol. Lett., 1983, v. 10, pp. 65-79

134. Kvetnoy I.M., Yuzhakov Y.Y. Extrapineal melatonin: nontraditional localization and possible significance for oncology// In: Advances in Pineal Research, London, 1994, v.7, p. 199-212

135. Kvetnoy I.M., Yuzhakov V.V. Hormones in non-endocrine cells// Proc. Roy. Micr. Sos., 1995, v. 30, p. 123-124.

136. Ladisch S, Kitada S, Hays EF. Gangliosides shed by tumor cells enhance tumor formation in mice// J Clin Invest., 1987, v.79, №6, pp. 1879-1882

137. Laitinen JT, Viswanathan M, Vakkuri O, Saavedra JM. Differential regulation of the rat melatonin receptors: selective age-associated decline and lack of melatonin-induced changes// Endocrinology, 1992, v. 130(4), pp. 2139-44. ,

138. Le Gouteur D.G., Warren A., Cogger V.C., Smedsrog B., Sorensen K.K., De Cabo R., Fraser R., McCuskey R.S. Old Age and the Hepatic Sinusoid// THE ANATOMICAL RECORD, 2008, v. 291, pp. 672-683

139. Lechleiter J, Girard S, Peralta E, Clapham D. Spiral calcium wave propagation and annihilation in Xenopus laevis oocytes// Science, 1991, v. 252(5002), pp.123-6.

140. Leon J., Acuna-Castroviejo D., Escames G., Tan D.-X., Reiter R. J. Melatonin mitigates mitochondrial malfunction// J. Pineal Res., 2005, v. 38, pp. 1—9.

141. Lerchl A. Biological rhythms in the context of light at night (LAN)// Neuro Endocrinol Lett., 2002, v. 23, Suppl 2, pp. 23-7.

142. Lesnikov VA, Pierpaoli W. Pineal cross-transplantation (old-to-young and vice versa) as evidence for an endogenous "aging clock"// Ann N Y Acad Sci., 1994, v.719, pp. 456-60

143. Levoye A, Dam J, Ayoub MA, Guillaume JL, Couturier C, Delagrange P, Jockers R. The orphan GPR50 receptor specifically inhibits MT1 melatonin receptor function through heterodimerization// EMBO J, 2006;25(13), pp. 3012-23

144. Levoye A, Jockers R, Ayoub «MA, Delagrange P, Savaskan E, Guillaume JL. Are G-protein-coupled receptor heterodimers of physiological relevance? Focus on-melatonin receptors// Chronobiol Int, 2006; v. 23(1-2), pp. 419-26

145. Leybaert L, Paemeleire K, Strahonja A, Sanderson MJ. Inositol-trisphosphate-dependent intercellular calcium signaling in and between astrocytes and endothelial cells// Glia, 1998, v. 24(4), pp. 398-407

146. Liebmann PM, Hofer D, Felsner P, Wolfler A, Schauenstein K Beta-blockade enhances adrenergic immunosuppression in rats via inhibition of melatonin release// J Neuroimmunol., 1996, v. 67(2), pp: 137-42

147. Lonard DM, Lanz RB, O'Malley BW. Nuclear receptor coregulators and.human disease// Endocr Rev., 2007, v. 5, pp. 575-87

148. Lovenberg W, Jequier E, Sjoerdsma A. Tryptophan hydroxylation: measurement in pineal gland, brainstem and carcinoid tumor// Science, 1967; v. 155, pp. 217-9

149. Maestroni GJ, Pierpaoli W. Factor(s) elaborated by bone marrow that promote persistent engraftment of xenogeneic and semiallogeneic marrow// J Clin1 Lab Immunol., 1980, v. 4(3), pp. 189-93.

150. Maestroni GJ. The immunoneuroendocrine role of melatonin// J Pineal Res., 1993, v. 14(1), pp.1-10

151. Maestroni GJ. T-helper-2 lymphocytes as a peripheral target of melatonin// J Pineal Res., 1995, v. 18(2), pp. 84-9

152. Mahal H.S., Sharma H.S., Mukheijee T. Antioxidant properties of melatonin: a pulse radiolysis study// Free Rad Biol Med, 1999, v. 26, pp.557-565

153. Maharaj D.S., Anoopkumar-Dukie S., Glass B.D., Antunes E.M., Lack B., Walker R.B., Daya S. Identification of the UV degradants of melatonin and their ability to scavenge free radicals// J Pineal Res, 2002, v. 32, pp. 257-261

154. Maharaj D.S., Limson J.L., Daya S. 6-Hydroxymelatonin converts Iron (III) to Iron (II)// Life Sci 72, 2003, pp.1367-75

155. Maharaj D.S., Maharaj H., Antunes E.M., Maree D.M., Nyokong T., Glass B.D., Daya S. 6- Hydroxymelatonin protects against quinolinic acid induced oxidative neurotoxicity and quenches singlet oxygen// J Pharm Pharmacol,2005, v. 57, pp. 877-882

156. Maharaj D.S., Walker R.B., Glass B.D., Daya S. 6-Hydroxymelatonin protects against KCN-induced free radical attack in rat brain homogenates// J Chem Neuroanat,1132003, v. 26, pp.103—107

157. Manev H., Uz T., Qu T. Early upregulation of hippocampal 5-lipoxygenase following systemic administration of kainate to rats// Restor. Neurol. Neurosci., 1998, v. 12, pp. 81-85.

158. Martin-Cacao A, Lopez-Gonzalez MA, Reiter RJ, Calvo JR, Guerrero JM. Binding of 2-125I.melatonin by rat thymus membranes during postnatal development// Immunol Lett., 1993, v. 36(1), pp.59-63.

159. Masana M. I., Dubocovich M. L. Melatonin receptor signaling: finding the path through the dark// Sci. STKE 2001, v. 107, pe39

160. Masana MI, Doolen S, Ersahin C, Al-Ghoul WM, Duckies SP, Dubocovich ML, Krause DN. MT(2) melatonin receptors are present and functional in rat caudal artery// J Pharmacol Exp Ther. 2002, v. 302(3), pp.1295-302.

161. Masini M., Pollera M., Bergamini E. Ageing-related changes in the in vivo function of rat liver macroautophagy and proteolysis// Experimental Gerontology, 2003, v, 38, pp. 519-527

162. Mayo J. C., Sainz R. M., Antolin I., Herrera F., Martin V. Rodriguez C. The Therapeutic Potential of Melatonin: A Review of the Science: Antiaging Hormone// Cell. Mol. Life Sci., 2002, v. 59, pp. 1706- 1713.

163. McArthur AJ, Hunt AE, Gillette MU. Melatonin action and signal transduction in the rat suprachiasmatic circadian clock: activation of protein kinase C at dusk and dawn// Endocrinology. 1997, v. 138(2), pp. 627-634

164. McKinney TD, Vaughan MK, Reiter RJ. Pineal influence on intermale aggression in adult house mice// Physiol Behav., 1975, v. 15(2), pp. 213-6

165. Mene'ndez-Pela'ez A., Reiter R.J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization// J Pineal Res, 1993, v. 15, pp.59-69

166. Miremadi A, Oestergaard MZ, Pharoah PD, Caldas C. Cancer genetics of epigenetic genes// Hum Mol Genet., 2007, v. 16, Spec No 1, pp.R28-49

167. Mogami H., Zhang H., Suzuki Y., Urano T., Saito N., Kojima I., Petersen O. H. Decoding of Short-lived Ca2 Influx Signals into Long Term Substrate Phosphorylation through Activation of Two Distinct Classes of Protein Kinase C// The Journal of

168. Biological Chemistry, 2003, V. 278, No. 11, pp. 9896-9904,

169. Montilla P., Tunez I., Munoz M.C., Lopez A., Loria J.V. Hyperlipidemic nephropathy induced by adriamycin: effect of melatonin administration// Nephron, 1997, v. 76, pp.345-350

170. Moore RY. Neural control of the pineal gland// Behav Brain Res, 1996, v. 73, pp. 125-30

171. Motoyama K., Karl I.E., Flye M.W., Osborne D.F., Hotchkiss R.S. Effect of Ca2+ agonists in the perfused liver: determination via laser scanning confocal microscopy// Am. J. Physiol., 1999, v. 276, pp. R575-R585.

172. Murakami N, Nakamura H, Nishi R, Marumoto N, Nasu T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail using cell perfusion systems// Brain Res, 1994; v. 651pp. 209-14

173. Naji L, Carrillo-Vico A, Guerrero JM, Calvo JR. Expression of membrane and nuclear melatonin receptors in mouse peripheral organs// Life Sci., 2004, v.74(18), pp. 2227-36

174. Nedergaard M. Direct signaling from astrocytes to neurons in cultures of mammalian brain cells//Science, 1994, v. 263(5154), pp. 1768-71

175. Nelson C.S., Ikeda M., Gompf H.S., Robinson M.L., Fuchs N.K., Yoshioka T., Neve K.A., Allen C.N. Regulation of melatonin la receptor signaling and trafficking by asparagine-124// Mol. Endocrinol. ,2001, v. 15, pp. 1306-1317

176. Nelson CS, Marino JL, Allen CN. Melatonin receptors activate heteromeric G-protein coupled Kir3 channels//Neuroreport., 1996, v. 7(3), pp.717-20.

177. Neu J.M., Niles L.P. A marked diurnal rhythm, of melatonin ML1A receptor mRNA expression in the suprachiasmatic nucleus// Molecular Brain Research , 1997, v. 49, pp. 303-306

178. New D. C., Tsim S. T., Wong Y. H. G protein-linked effector and second messenger systems involved in melatonin signal transduction.// Neurosignals, 2003, v. 12, pp. 59-70

179. Newman EA, Zahs KR. Calcium waves in retinal glial cells// Science, 1997, v. 275(5301), pp. 844-7

180. Newman EA, Zahs KR. Modulation of neuronal activity by glial cells in the retina//J Neurosci., 1998, v. 18(11), pp. 4022-8.

181. Newman LA., Walker MT., Brown RL., Cronin TW., Robinson PR. Melanopsin forms a functional short-wavelength photopigment // Biochemistry, 2003, 42(44):pp. 12734-12738

182. Niessen H, Harz H, Bedner P, Kramer K, Willecke K. Selective permeability of different connexin channels to the second messenger inositol 1,4,5-trisphosphate// J Cell Sci., 2000, v. 113 ( Pt 8), pp. 1365-72

183. Niessen H, Willecke K. Strongly decreased gap junctional permeability to inositol 1,4, 5-trisphosphate in connexin32 deficient hepatocytes// FEBS Lett., 2000, v.466(l), pp. 112-4.

184. Noda Y, Mori A, Liburty R, Packer L. Melatonin and1* its precursors scavenge nitric oxide// J Pineal Res, 1999, v. 27, pp. 159-163

185. Nosjean O., Ferro M., Coge F., Beauverger P., Henlin J.M., Lefoulon F., Fauchere J.L., Delagrange P., Canet E., Boutin J.A. Identification' of the melatonin-binding site MT3 as the quinone reductase 2 //J. Biol. Chem., 2000, v. 275, pp. 31311-31317.

186. Nosjean, O., Nicolas, J. P., Klupsch, F., Delagrange, P., Canet, E., and Boutin, J. A. Comparative pharmacological studies of melatonin receptors: MT1, MT2 and MT3/QR2. Tissue distribution of MT3/QR2// Biochem. Pharmacol., 2001, v. 61, pp. 1369- 137

187. Nowak J.Z. and Zawilska J.B., Melatonin and its physiological and therapeutic properties// Pharm World Sci, 1998; v. 20(1), pp. 18-27

188. Oancea E, Meyer T. Protein kinase C as a molecular machine for decoding calcium and diacylglycerol signals// Cell.,1998, v. 95(3), pp. 307-18

189. Okatani Y., Wakatsuki A., Kaneda, C. Melatonin increases activities of glutathione peroxidase and superoxide dismutase in fetal rat brain// J. Pineal Res., 2000, v. 28, pp. 89-96.

190. Okatani Y., Wakatsuki A., Reiter R. J. Melatonin protects hepatic mitochondrial respiratory chain activity in senescence-accelerated mice// J. Pineal Res., 2002, v.32, pp. 143-148.

191. Okatani Y., Wakatsuki A., Reiter R. J., Miyahara Y. Acutely administered melatonin restores hepatic mitochondrial physiology in old mice// The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2003, v. 35, pp. 367-375

192. Okatani Y., Wakatsuki A., Reiter R. J., Miyahara Y. Hepatic mitochondrial dysfunction in senescence-accelerated mice: correction by long-term, orally administered physiological levels of melatonin// J. Pineal Res., 2002, v. 33, pp. 127-133

193. Okatani Y., Wakatsuki A., Reiter R. J., Miyahara Y. Melatonin reduces oxidative damage of neural lipids and proteins in senescence-accelerated mouse// Neurobiol. Aging, 2002, v. 23, pp.639-644.

194. Okatani Y., Wakatsuki A., Reiter R. J., Enzan H., Miyahara Y. Protective effect of melatonin against mitochondrial injury induced by ischemia and reperfusion of rat liver// Eur. J. Pharmacol., 2003, v. 469, pp. 145-152.

195. Okatani Y., Wakatsuki A., Shinohara K., Kaneda C., Fukaya T. Melatonin stimulates glutathione peroxidase activity in human chorion// J. Pineal Res., 2001, v. 30,pp.199-205.

196. Osipchuk Y, Cahalan M. Cell-to-cell spread of calcium signals mediated by AT® receptors in mast cells//Nature, 1992, v. 359(6392), pp. 241-4

197. Ozil JP, Markoulaki S, Toth S, Matson S, Banrezes B, Knott JG, Schultz RM, Huneau D, Ducibella T. Egg activation events are regulated by the duration of a sustained Ca2+.cyt signal in the mouse// Dev Biol., 2005, v. 282(1), pp. 39-54

198. Ozkok E., Cendiz S., Guevener B. Age-dependent changes in liverganglioside levels// Journal of Basic and clinical Phisiology and Pharmacology, 1999, v. 1, pp. 337344

199. Ozturk G., Coskun S., Erbas D., Hasanoglu E. The effect of melatonin on liver superoxide dismutase activity, serum nitrate and thyroid hormone levels// Jpn. J. Physiol., 2000, v. 50, pp. 149-153.

200. Pablos M.I., Chuang J., Reiter R.J., Ortiz G.G., Daniels W.M., Sewerynek E., Melchiorri D., Poeggeler B. Time course of the melatonin-induced increase in glutathione peroxidase activity in chick tissues.// Biol.Signals, 1995, v. 4, pp.325-330.

201. Paemeleire K, Martin PE, Coleman SL, Fogarty KE, Carrington WA, Leybaert L, Tuft RA, Evans WH, Sanderson MJ. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26// Mol Biol Cell., 2000, v. 11(5), pp.181527.

202. Paredes R. M., Etzler J. C., Watts L.T., Lechleiter J. D. Chemical Calcium ndicators// Methods, 2008 ; v. 46, №3, pp. 143-151.

203. Paredes S.D., Korkmaz A., Manchester L.C., Tan D.X., Reiter R.J. Phytomelatonin: a review// J. of Exp. Botany, 2009, V. 60 (1). P. 57.

204. Patel S., Joseph S.K., Thomas A.P. Molecular properties of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors// Cell Calcium, 1999, v. 25, pp. 247-264

205. Pavlidis T., The Free Run Period of Circadian Rhythms and Phase Response Curves//American Naturalist, 1973, v.107, pp. 524-530.

206. Peters JL, Cassone VM, Zoran MJ. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes// Brain Res, 2005; 1031(1), pp. 10-9

207. Peters JL, Earnest BJ, Tjalkens RB, Cassone VM, Zoran MJ. Modulation of intercellular calcium signaling by melatonin in avian and mammalian astrocytes is brain region-specific //J Comp Neurol. 2005;493(3), pp.370-80117

208. Petersen OH, Michalak M, Verkhratsky A. Calcium signalling: past, present and future// Cell Calcium, 2005; v. 38, pp. 161-169.

209. Petersen OH, Sutton R. Ca2+ signalling and pancreatitis: effects of alcohol, bile and coffee// Trends Pharmacol Sci., 2006, v. 27(2), pp. 113-20

210. Petersen OH, Tepikin AV. Polarized calcium signaling in exocrine gland cells// Annu Rev Physiol, 2008; v .70:, pp. 273-299.

211. Petersen OH: Ca 2+ signalling and Ca 2+ -activated ion channels in exocrine acinar cells// Cell Calcium, 2005; v. 38, pp. 171-200.

212. Philosophe B, Miller RA. Diminished calcium signal generation in subsets of T lymphocytes that predominate in old mice// J Gerontol., 1990, v. 45(3), pp. B87-93

213. Pierpaoli W, Regelson W. Pineal control of aging: effect of melatonin and pineal grafting on aging mice// Proc Natl Acad Sci USA, 1994, v. 91(2), pp. 787-91.

214. Poeggeler B. Melatonin, aging, and age-related diseases: perspectives for prevention, intervention, and therapy// Endocrine., 2005, v. 27(2), pp. 201-12.

215. Poeggeler B., Reiter R.J., Hardeland R., Tan D.X., Barlow-Walden L.R. Melatonin and structurally related endogenous indoles act as potent electron donors and radical scavengers in vitro// Redox Rep, 1996, v. 2, pp. 179-184

216. Poeggeler B, Reiter RJ, Tan DX, Chen LD, Manchester LC. Melatonin, hydroxyl radical-mediated oxidative damage, and aging: a hypothesis// J Pineal Res., 1993, v. 14(4), pp. 151-68.

217. Pogan L, Bissonnette P, Parent L, Sauve R. The effects of melatonin on Ca(2+) homeostasis in endothelial cells// J Pineal Res, 2002,v. 33(1), pp.37-47

218. Poon AM, Mak AS, Luk HT. Melatonin and 2125I.iodomelatonin binding sites in the human colon// Endocr Res., 1996, v. 22(1), pp. 77-94.

219. Popova J. S. and Dubocovich M. L. Melatonin receptor-mediated stimulation of phosphoinositide breakdown in chick brain slices// J. Neurochem, 1995, v.64, pp. 130138

220. Pozo D, Delgado M, Fernandez-Santos JM, Calvo JR, Gomariz RP, Martin-Lacave I, Ortiz GG. Guerrero JM. Expression of the Mella-melatonin receptor mRNA in T and B subsets of lymphocytes from rat thymus and spleen// FASEB J., 1997, v. 11(6), pp.466-473

221. Pozo D., Reiter R.J., Calvo J.R., Guerrero J.M. Inhibition of cerebellar nitric oxide synthase and cyclic GMP production by melatonin via complex formation with calmodulin// J Cell Biochem, 1997, v. 65, pp.430-442

222. Pozo D., Reiter R. J., Calvo J. R., Guerrero J. M. Physiological concentrations of melatonin inhibit nitric oxide synthase in rat cerebellum// Life Sci. ,1994, v. 55, PL455-460.

223. Ravindra T., Lakshmi N.K., Ahuja Y.R. Melatonin in pathogenesis and therapy of cancer // Indian Journal Med Sci, 2006,60 (12), pp. 523-535

224. Reiter RJ. Melatonin: the chemical expression of darkness// Mol Cell Endocrinol.,1991, v. 79(1-3), pp. CI 53-81991;j

225. Reiter R.I Oxidative damage in the central nervous system: protection by melatonin// Prog Neurobiol, 1998, v. 56, pp. 359-384

226. Reiter R.J. Pineal function during aging: attenuation of the melatonin rhythm and its neurobiological consequences. Acta Neurobiol Exp, 1994; v. 54(Suppl.), pp. 31-9

227. Reiter R.J. Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological interactions// Endocr Rev, 1991; v.12, pp.151- 80

228. Reiter R.J. The mammalian pineal gland as an end organ of the visual system. In: Wetterberg L, ed. Light and Biological Rhythms in Man. Oxford: Pergamon Press 1993; p.145

229. Reiter R.J. The melatonin message: duration versus coincidence hypotheses// Life Sci, 1987; v. 46, pp. 2119-31

230. Reiter R.J., Acuna-Castroviejo D., Tan D.-X., Burkhardt S. Free radical-mediated molecular damage. Mechanisms for the protective actions of melatonin in the central nervous system// Ann. NY Acad. Sci., 2001, V. 939. P. 200-215.

231. Reiter RJ, Craft CM, Johnson JE Jr, King TS, Richardson BA, Vaughan GM, Vaughan MK. Age-associated reduction in nocturnal pineal melatonin levels in female rats//Endocrinology, 1981, v. 109(4), pp. 1295-7.

232. Reiter R.J., Garcia J. J., Pie J. Oxidative toxicity in models of neurodegeneration: responses to melatonin// Restor. Neurol. Neurosci. 1998. v. 12, pp. 135-142

233. Reiter R.J., Melchiorri D., Sewerynek E., Poeggeler B., Barlow-Walden L., Chuang J., Ortiz G.G., Acuna-Castroviejo D. A review of the evidence supporting melatonin's role as an antioxidant// J. Pineal Res., 1995, v. 18, pp. 1-11

234. Reiter RJ, Paredes SD, Korkmaz A, Manchester LC, Tan DX. Melatonin in relation to the "strong" and "weak" versions of the free radical theory of aging// Adv Med Sci., 2008, v. 53(2), pp. 119-29.

235. Reiter R J., Tan D.-X., Burkhardt S. Reactive oxygen and nitrogen species and cellular and organismal decline: amelioration with melatonin// Mech. Ageing Dev., 2002, v.123, pp.1007-1019

236. Reiter R. J., Tan D.-X., Mayo J. C., Sainz R. M., Leon J., Czarnocki Z. Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans// Acta Biochim. Pol. 2003, v. 50, pp.1129- 1146

237. Reiter R.J, Tan DX, Osuna C, Gitto E. Actions of melatonin in the reduction of oxidative stress: a review// J Biomed Sci, 2000, v. 7, pp. 444-458

238. Reiter R.J., Tan D.X., Acuna-Castroviejo D., Burkhardt S., Karbownik M. Melatonin: mechanisms and actions as an antioxidant.//Curr. Topics Biophys. 2000. V. 24. P. 171"

239. Reiter R.J., Tan D.-X., Manchester L. C., El-Sawi M. R. Melatonin reduces oxidant damage and promotes mitochondrial respiration: implications for aging//Ann. NY Acad. Sci., 2002, v. 959, pp. 238-250

240. Reiter R.J., Tan D.X., Qi W. Suppression of oxygen toxicity by melatonin// Acta Pharmacol Sinica, 1998, v. 19, pp.575-581

241. Reppert S. M., Weaver D. R., Godson C. Melatonin receptors step into the light: cloning and classification of subtypes//Trends Pharmacol. Sci., 1996 , v. 17, p.100-102

242. Reyes-Toso C. F., Ricci C. R., de Mignone I. R., Reyes P., Linares L.M., Albornoz L.E., Cardinali D.P., Zaninovich A.In vitro effect of melatonin on oxygen consumption in liver mitochondria of rats//Neuroendocrinol. Lett., 2003. v. 24, pp. 341344

243. Rimler A, Jockers R, Lupowitz Z, Sampson SR, Zisapel N. Differential effects of melatonin and its downstream effector PKCalpha on subcellular localization of RGS proteins// J Pineal Res. 2006, v. 40(2), pp. 144-52.

244. Rimler A, Jockers R, Lupowitz Z, Zisapel N. Gi and RGS proteins provide biochemical control of androgen receptor nuclear exclusion// J Mol Neurosci., 2007; v. 31(l),pp.l-12

245. Rivera-Bermudez M. A., Masana M. I., Brown G. M., Earnest D. J., Dubocovich M. L. Immortalized cells from the rat suprachiasmatic nucleus express functional melatonin receptors//Brain Res., 2004, v.l002,pp. 21-27

246. Rivera-Bermudez MA, Gerdin MJ, Earnest DJ, Dubocovich ML. Regulation of basal rhythmicity in protein kinase C activity by melatonin in immortalized rat suprachiasmatic nucleus cells//Neurosci Lett., 2003, v. 346(1-2), pp. 37-40

247. Rizzuto R, Pozzan T. When calcium goes wrong: genetic alterations of a ubiquitous signaling route//Nat Genet., 2003, v. 34(2), pp. 135-41

248. Robb-Gaspers LD, Rutter GA, Burnett P, Hajnoczky G, Denton RM, Thomas AP. Coupling between cytosolic and mitochondrial calcium oscillations: role in the regulation of hepatic metabolism// Biochim Biophys Acta, 1998, v. 1366(1-2), pp. 17-32

249. Robb-Gaspers LD, Thomas AP. Coordination of Ca2+ signaling by intercellular propagation of Ca2+ waves in the intact liver// J Biol Chem., 1995, v. 270(14), pp. 81027

250. Roberts J.E., Hu D.N., Martinez L., Chignell C.F. Photophysical studies on melatonin and its receptor agonists// J Pineal Res, 2000, v. 29, pp. 94—99

251. Robertson L.M., Takahashi J.S. Circadian clock in cell culture: I. Oscillation1 of melatonin release from dissociated chick pineal cells// J Neurosci, 1988;8:22-30

252. Rodriguez C., Mayo J. C., Sainz R'. M., Herrera F., Martin V., Reiter R. J. Regulation of antioxidant enzymes: a significant role for melatonin// J. Pineal Res., 2004, v. 36, pp. 1-9

253. Rogerio F., de Souza Queiroz L., Teixeira S. A., Oliveira A. L., de Nucci G., Langone F. Neuroprotective action of melatonin on neonatal rat motoneurons after sciatic nerve transection// Brain Res., 2002, v. 926, pp. 33-41.

254. Rooney T.A., Sass E.J., Thomas A.P. Characterization of cytosolic calcium oscillations induced by phenylephrine and vasopressin in single fura-2-loaded hepatocytes// J Biol Chem., 1989,'v. 264(29), pp. 17131-41.

255. Rooney TA, Sass EJ, Thomas AP. Agonist-induced cytosolic calcium oscillations originate from a specific locus in single hepatocytes// J Biol Chem., 1990; v. 265(18), pp. 10792-6

256. Rosenberg OS, Deindl S, Sung RJ, Nairn AC, Kuriyan J. Structure of the autoinhibited kinase domain of CaMKII and SAXS analysis of the holoenzyme// Cell, 2005, v. 123(5), pp. 849-60

257. Rosenstein RE, Golombek DA, Kanterewicz BI, Cardinali DP.f Time-dependency for the bimodal effect of melatonin on calcium uptake in rat hypothalamus. Short communication// J1 Neural Transm Gen Sect., 1991; v. 85(3), pp. 243-7

258. Sack RL, Lewy AJ, Erb DL, Vollmer WM, Singer CM. Human melatonin production decreases with age// J Pineal Res. ,1986; v. 3(4), pp. 379-88

259. Sâez JC, Connor JA, Spray DC, Bennett MY. Hepatocyte gap junctions are permeable to the second messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate, and to calcium ions// Proc Natl Acad Sci U S A., 1989, v. 86(8), pp. 2708-12

260. Sâez JC, Gregory WA, Watanabe T, Dermietzel R, Hertzberg EL, Reid L, Bennett MV, Spray DC. cAMP delays disappearance of gap junctions between pairs of rat hepatocytes in primary culture// Am J Physiol., 1989,- v. 257(1 Pt 1), pp. Cl-11.

261. Sallinen P, Saarela S, lives M, Vakkuri O, Leppaluoto J. The expression of MT1 and MT2 melatonin receptor mRNA in several rat tissues// Life Sci. 2005, v. 76(10), pp. 1123-34

262. Sampson SR, Lupowitz Z, Braiman L, Zisapel N. Role of protein kinase Calpha in121melatonin signal transduction// Mol Cell Endocrinol., 2006, v. 252(1-2), pp. 82-87.

263. Sandberg K, Bor M, Ji H, Markwick A, Millan MA, Catt KJ. Angiotensin II-induced calcium mobilization in oocytes by signal transfer through gap junctions// Science, 1990, v. 249(4966), pp. 298-301.

264. Sanderson MJ, Charles AC, Dirksen ER. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells// Cell Regul., 1990, v. 1(8), pp. 585-96.

265. Senn HJ, Orth M, Fitzke E, Wieland H, Gerok W. Gangliosides in normal human serum. Concentration, pattern and transport by lipoproteins// Eur J Biochem. 1989; v.181, №3, pp.657-62.

266. Shaposhnikova G.I., Prokazova N.V., Buznikov G.A., Zvezdina N.D., teplits N.A., Bergelson L.D. Shedding of gangliosides from tumor cells depends on cell dencity// European Journal of Biochemistry, 1984, v. 14, pp.567-570;

267. Sharma R, Ottenhof T, Rzeczkowska PA, Niles LP. Epigenetic targets for melatonin: induction of histone H3 hyperacetylation and gene expression in CI7.2 neural stem cells// J Pineal Res. 2008, v. 45(3), pp. 277-84

268. Sharman E. H. and Bondy S. C. Effects of age and dietary antioxidants on cerebral electron transport chain activity// Neurobiol. Aging, 2001, v. 22(4), pp.629-634

269. Shibuya H. Torn M, Watanabe S. A circadian rhythm of tryptophan hydroxylase in rat pineals// Brain Res, 1978; v. 138, pp. 364- 8.

270. Singh P., Coskun Z. Z., Goode C., Dean A., Thompson-Snipes L., Darlington G. Lymphoid Neogenesis and Immune Infiltration in Aged Liver// HEPATOLOGY, 2008, V. 47, №. 5, 1680-1690

271. Singla SI, Hudmon A, Goldberg JM, Smith JL, Schulman H. Molecularcharacterization of calmodulin trapping by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II/ J Biol Chem., 2001, v. 276(31), pp. 29353-60.

272. Sjoblom M., Safsten B., Flemstrom G. Melatonin-induced calcium signaling in clusters of human and rat duodenal enterocytes// Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003,284, pp. G1034-G1044

273. Slaugenhaupt S. A., Roca A. L., Liebert C. B., Altherr M. R., Gusella J. F., Reppert S. M. Mapping of the gene for the Mella-melatonin receptor to human chromosome 4 (MTNR1A) and mouse chromosome 8 (Mtnrla)//Genomics, 1995, v. 27, pp. 355-357

274. Slominski A, Tobin DJ, Zmijevvski MA, Wortsman J, Paus R. Melatonin in the skin: synthesis, metabolism and functions// Trends Endocrinol Metab., 2007, v. 1, pp. 1724.

275. Stauffer PL, Zhao H, Luby-Phelps K, Moss RL, Star RA, Muallem S. Gap junction communication modulates Ca2+.i oscillations and enzyme secretion in pancreatic acini// J Biol Chem., 1993, v. 268(26), pp. 19769,-75

276. Stehle J.H., von Gall C., Korf H.W. Melatonin: a clock-output, a clock-input// J Neuroendocrinol., 2003; v. 15(4), pp. 383-9

277. Tan D., Manchester L.C., Reiter R.J., Qi W., Hanes M.A., Farley N.J. High physiological levels of melatonin in the bile of mammals// Life Sci, 1999, v. 65(23), pp. 2523-2529

278. Tang F, Hadjiconstantinou M, Pang SF. Aging and diurnal rhythms of pineal serotonin, 5-hydroxyindoleacetic acid, norepinephrine, dopamine and serum melatonin in the male rat//Neuroendocrinology, 1985, v. 40(2), pp. 160-4.

279. Tesoriere L., D'Arpa D., Conti S., Giaccone V., Pintaudi A.M., Livrea M.A. Melatonin protects human red blood cells from oxidative hemolysis: new insights into the radical-scavenging activity// J Pineal Res, 1999, v. 27, pp. 95-105

280. Thomas A.P., Renard D.C., Rooney T.A. Spatial and temporal organization of calcium signalling in hepatocytes// Cell Calcium, 1991, v. 12, pp. 111-126

281. Thomas CP, Dunn MJ, Mattera R. Ca2+ signalling in K562 human erythroleukaemia cells: effect of dimethyl sulphoxide and role of G-proteins in thrombin-and thromboxane A2-activated pathways// Biochem J., 1995, v. 312 ( Pt 1), pp. 151-8.

282. Thomas K.B., Iuvone P.M. Circadian rhythm of tryptophan hydroxylase activity in chicken retina// Cell Molec Neurobiol,1991; v. 11, pp. 511-7

283. Timchenko N.A. Aging and liver regeneration// Trends in Endocrinology and Metabolism, 2009, V.20, No.4,pp. 171-176

284. Toescu EC, Verkhratsky A. Neuronal ageing in long-term cultures: alterations of Ca2+ homeostasis// Neuroreport., 2000, v. 11(17), pp. 3725-9.

285. Tordjmann T, Berthon B, Claret M, Combettes L. Coordinated intercellular calcium waves induced by noradrenaline in rat hepatocytes: dual control by gap junction permeability and agonist// EMBO J., 1997, v. 16(17), pp. 5398-407.

286. Touitou Y. Human aging and melatonin. Clinical relevance// Exp Gerontol., 2001, v. 36(7), pp. 1083-100.

287. Touitou Y. Introduction to biological rhythms in the domain of health// Pathol Biol (Paris)., 1996, v. 44(6), pp. 479-86.

288. Touitou Y, Bogdan A, Haus E, Touitou C. Modifications of circadian and circannual rhythms with aging// Exp Gerontol., 1997, v. 32 (4-5), pp. 603-14.

289. Touitou Y, Haus E. Aging of the human endocrine and neuroendocrine time structure// Ann N Y Acad Sci., 1994, v. 719, pp. 378-97.

290. Underwood H, Barrett RK, Siopes T. The quail's eye: a biological clock// J Biol Rhythms 1990;v. 5, pp. 257-65

291. Ustundag B., Kazeze A., Demirbag M., Canatan H., Halifeoglu I., Ozercan I. H. Protective effect of melatonin on antioxidative system in experimental ischemia-reperfiision of rat small intestine.// Cell. Physiol. Biochem., 2000, v.10, pp. 229-236.

292. Uz T. and Manev H. Circadian expression of pineal 5-lipoxygenase mRNA//. Neuroreport, 1998, v. 9, pp.783-786.354. * Vanecek J. Cellular mechanisms of melatonin action// Physiol. Rev., 1998, v.78, pp.687-721

293. Vaughan MK, Reiter RJ. Transient hypertrophy of the ventral prostate and coagulating glands and accelerated thymic involution following pinealectomy in the mouse// Tex Rep Biol Med., 1971, v. 29(4), pp.579-86.

294. Wakatsuki A., Okatani Y., Shinohara K., Ikenoue N., Kaneda C., Fukaya T. Melatonin protects fetal rat brain against oxidative mitochondrial damage// J. Pineal Res., 2001, v.30, pp. 22-28.

295. Wang H., Wei W., Shen Y. X., et al. Protective effect of melatonin against liver injury in mice induced by Bacillus Calmette-Guerin plus lipopolysaccharide// World J. Gastroenterol. 2004, v. 10, pp. 2690-2696.

296. Wang S.S., Chen L., Xia S.K. Cadmium is acutely toxic for murine hepatocytes: effects on intracellular free Ca2+ homeostasis II Physiol Res., 2007;v. 56(2), pp. 193-201.

297. Warren A., Chaberek S., Ostrowski K., Cogger V.C., Hilmer S.N., McCuskey R.S., Fraser R., Le Couteur D.G. Effects of old age on vascular complexity and dispersion of the hepatic sinusoidal network// Microcirculation, 2008 №3, pp. 191-202

298. Yule DI, Stuenkel E, Williams JA. Intercellular calcium waves in rat pancreatic acini: mechanism of transmission// Am J Physiol., 1996, v. 271(4 Pt 1), pp. CI 285-94.

299. Zang L.Y., Cosma G., Cardner H., Vallyathan V. Scavenging of reactive oxygen species by melatonin// Biochim Biophys Acta, 1998, v. 1425, pp. 469-477

300. Zatz M., Mullen D.A., Moskal J.R. Photoendocrine transduction in cultured chick pineal cells: Effects of light, dark, and potassium on the melatonin rhythm// Brain Res., 1988, v.438, pp.199-215

301. Zawilska J.B. Clonidine in vivo mimics the acute suppressive but not the phase-shifting effects of light on the circadian rhythm of serotonin N-acetyltransferase activity in chick pineal gland// J Pineal Res, 1994, v.17, pp. 63-8.

302. Zawilska J.B. Melatonin as a chemical indicator of environmental light-dark cycle// ActaNeurobiol Exp, 1996; v. 56, pp. 757- 67

303. Zawilska J.B. Stimulation of D4-like dopamine receptor suppresses serotonin N-acetyltransferase activity but does not phase-shift the circadian oscillator in chick retina// Neurosci Lett, 1994;v. 179, pp. 107-10

304. Zawilska JB, Iuvone PM.Melatonin synthesis in chicken retina: effect of kainic acid-induced lesions on the diurnal rhythm and D2-dopamine receptor-mediated regulation of serotonin N-acetyltransferase activity// Neurosci Lett, 1992;v. 135, pp. 71-4

305. Zawilska J.B, Jarmak A, Woldan-Tambor A, Nowak JZ. Lightinduced suppression of nocturnal serotonin N-acetyltransferase activity in chick pineal gland and retina: a wavelength comparison// J Pineal Res, 1995; v.19, pp. 87-92

306. Zawilska J.B, Nowak J.Z. Regulatory mechanisms in melatonin biosynthesis in retina//Neurochem Int, 1992; v. 20, pp. 23-36

307. Zawilska J. B., Skene D. J., Arendt J. Physiology and pharmacology of melatonin in relation to biological rhythms// Pharmacological Reports, 2009, v. 61, pp. 383-410

308. Zechel C. Requirement of retinoic acid receptor isotypes alpha, beta, and gamma during the initial steps of neural differentiation of PCC7 cells// Mol Endocrinol, 2005; v. 19, pp.1629-1645

309. Zhang H., Akbar M., Kim H. Y. Melatonin: an endogenous negative modulator of 12-lipoxygenation in the rat pineal gland// Biochem. J., 1999, v. 344 (Pt. 2), pp. 487-493

310. Zimmermann B, Walz B. The mechanism mediating regenerative intercellular Ca2+ waves in the blowfly salivary gland// EMBO J., 1999, v. 18(12), pp. 3222-31.

Информация о работе

Беспятых, Анастасия Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.03.05

Диссертация

Возрастные изменения межклеточных взаимодействий гепатоцитов крыс и влияние на них мелатонина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы