Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс)

Карпенко, Марина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс)
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс)"

003462914

На правах рукописи

Карпенко Марина Николаевна

ВОВЛЕЧЕНИЕ КАЛЬПАИНОВОЙ СИСТЕМЫ В АУТОИММУННЫЕ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ

(на модели аллергического энцефаломиелита крыс)

03.00.13 — физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 0 3 ^' "

2009

003462914

Работа выполнена в Физиологическом отделе им. И.П. Павлова ГУ Научно-исследовательский Институт экспериментальной медицины РАМН (ГУ НИИЭМ РАМН)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Виктор Матвеевич Клименко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Hepa Яковлевна Лукомская

доктор медицинских наук, профессор Андрей Федорович Якимовский

Ведущее научное учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится «26» марта 2009 г. в //часов на заседании совета Д001.022.03 по защите докторских диссертаций при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376 Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИЭМ РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12).

Автореферат разослан « февраля 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

JI.B. Пучкова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Ограниченный протеолиз белков и пептидов в живых тканях и клетках является особой формой физиологической регуляции и считается универсальным механизмом, ответственным за образование и модификацию ферментов. Реакции ограниченного протеолиза лежат в основе функционирования важнейших физиологических систем, в частности, иммунитета, гемостаза, апоптоза, регуляции экспрессии генов (Чипенс и др., 1985). Поэтому для понимания принципов регуляции физиологических систем необходимо детальное изучение внутриклеточных регуляторных протеаз и тех реакций, которые они катализируют.

Среди внутриклеточных протеолитических систем особого внимания заслуживают те из них, которые активируются в ответ на увеличение в клетке концентрации ионов кальция - ключевого посредника множества клеточных реакций. Однако при развитии ряда патологических процессов существует опасность чрезмерной активации кальций-зависимых протеолитических систем вследствие нарушения гомеостаза ионов кальция. (Lajtha, Banik, 2002). С этой точки зрения особый интерес вызывает Са2+-зависимая кальпаиновая система внутриклеточных протеаз, гиперактивация которой приводит к нарушению регуляции многих физиологических функций организма (Göll et al.,. 2003). Например, при развитии аутоиммунных нейродегенеративных процессов у людей и при индукции этих процессов у лабораторных животных, в частности, у животных с индуцированным экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (ЭАЭ) в иммуноцитах и клетках ЦНС наблюдается увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция (Lajtha, Banik, 2002). На основании вышеприведенных данных, логично предположить, что в этих клетках кальпаины могут проявлять повышенную протеолитическую активность, сказывающуюся на всех этапах патогенеза: от регуляции миграции активированных Т-лимфоцитов и расщепления белков миелина до активации проапоптотических ферментов. Действительно, расщепление кальпаином основного белка миелина, белка нейрофиламентов может стимулировать образование энцефалитогенных пептидов; расщепление прокаспаз до каспаз способствует запуску апоптотических каскадов; расщепление белков клеточной адгезии увеличивает миграционную способность клетки (Göll et al., 2003). Кроме этого, выявление новых субстратов кальпаина расширяет представление о функциональной роли кальпаиновой системы. Так, недавно было показано, что нейроспецифический белок GAP-43 (growth associated protein) является субстратом кальпаина (Захаров и др., 2005). Поскольку белок GAP-43 известен как маркер регенеративных процессов, протекающих в нервной ткани (Oestreicher et al., 1997), весьма вероятно, что протеолитическое расщепление белка GAP-43 кальпаином в условиях развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса может, существенно изменяя его свойства, подавить регенеративную способность клеток ЦНС и усугубить течение заболевания. Приведенные факты свидетельствуют о том, что исследование вовлеченности кальпаиновой системы иммуноцитов и клеток ЦНС в

аутоиммунные нейродегенеративные процессы является одним из наиболее актуальных направлений клеточной физиологии.

Цели и задачи исследования. Цель работы: показать включение кальпаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие аутоиммунных нейродегенеративных процессов на модели ЭАЭ у крыс.

Задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Определить уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу ЭАЭ.

2. Определить уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках различных отделов ЦНС на пике развития ЭАЭ. Сопоставить полученные данные с тяжестью клинического течения ЭАЭ.

3. Исследовать действие ингибитора кальпаина I на выраженность клинических проявлений ЭАЭ.

4. Определить уровень экспрессии мРНК ОАР-43, а также изучить распределение белка ОАР-43 и его протеолитического фрагмента в клетках спинного мозга на пике развития ЭАЭ. Сопоставить полученные данные с тяжестью клинического течения ЭАЭ.

5. Определить уровень белка ОАР-43 в ликворе крыс в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Кальпаиновая система клеток ЦНС и иммунной системы вовлечена в процесс формирования и развития нейродегенеративной патологии аутоиммунного генеза.

2. Увеличение уровня белка ОАР-43 в ликворе крыс с ЭАЭ и увеличение степени его протеолиза кальпаином в клетках ЦНС отражает тяжесть течения заболевания, что может служить диагностическим и/или прогностическим критерием развития и интенсивности аутоиммунного нейродегенеративного процесса.

3. Подавление активности кальпаинов с помощью специфических ингибиторов является перспективным направлением для разработки новых подходов в лечении аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний.

Научная новизна работы. В проведенном исследовании впервые получены данные о включении кальпаиновой системы клеток лимфатических узлов брыжейки и верхних отделов спинного мозга в процесс формирования и развития нейродегенеративной патологии аутоиммунного генеза. Выявлено, что распространенность гиперактивации и сверхэкспрессии ш-кальпаина по различным отделам спинного мозга крыс связана с тяжестью течения ЭАЭ. Впервые показано увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина и нейроспецифического белка ОАР-43 в клетках различных отделов спинного мозга крыс с бессимптомным и легким течением ЭАЭ, а также обнаружено увеличение степени протеолитического расщепления белка ОАР-43 кальпаином в клетках различных отделов спинного мозга крыс с тяжелой формой ЭАЭ.

Установлено увеличение содержания белка GAP-43 и его протеолитических фрагментов в ликворе крыс с симптомами ЭАЭ на пике заболевания. Впервые продемонстрировано, что подавление активности кальпаинов с помощью интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина I предотвращает развитие или снижает выраженность ЭАЭ.

Научно-практическое значение результатов работы Выявленное в данном исследовании включение кальпаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие ЭАЭ у крыс углубляет представление о физиологических функциях кальпаинов и раскрывает ряд неизвестных ранее звеньев механизма формирования аутоиммунных нейродегенеративных процессов. Предотвращение развития или снижение выраженности ЭАЭ у крыс в результате подавления активности кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина I указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаина для лечения аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний и других форм патологии ЦНС, связанных с деструкцией нервных клеток. Данные о протеолизе белка GAP-43 под действием кальпаина существенно расширяют и дополняют сложившиеся к настоящему времени представления о механизмах функционирования белка GAP-43 в условиях развития нейродегенеративного процесса. На основе полученных данных об изменении уровня белка GAP-43 и его протеолитических фрагментов в ликворе могут быть разработаны новые подходы для диагностики и прогнозирования течения аутоиммунного нейродегенеративного процесса в клинике. Личный вклад соискателя. Соискатель проанализировал литературу по теме исследования, осуществил планирование экспериментов и получил основную часть результатов, которые представил в докладах на конференциях и в статьях. Экспериментальная часть исследования полностью выполнена на базе Физиологического отдела им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН. Индукция ЭАЭ и оценка клинического течения заболевания проводилась совместно с к.б.н. И.Н. Абдурасуловой (Физиологический отдел им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН) и к.м.н. Ю.Л. Житнухиным (Отдел иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН).

Апробация результатов работы. Материалы, изложенные в диссертации, были представлены на VI Сибирском Физиологическом съезде (Барнаул, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); 11-th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference "Stress and behavior" (St.-Petersburg, 2008); XLVII неделе науки Санкт-Петербургского государственного политехнического университета (Санкт-Петербург, 2008); Политехническом симпозиуме: Молодые ученые -промышленности Северо-Западного региона (Санкт-Петербург, 2008).

Диссертационная работа была апробирована на научном заседании Физиологического отдела им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН 22 октября 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура диссертации. Работа содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 314 источников. Материалы диссертации изложены на 177 страницах машинописного текста и иллюстрированы 30 рисунками и одной таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 255 самках крыс породы Вистар (Рапполово) весом 240-250 грамм. ЭАЭ вызывали однократной инокуляцией энцефалитогенной смеси из расчета 100 мг гомогената гомологичного спинного мозга, 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда (содержание убитых микобактерий 5 мг/мл) (ПАФ) и 0,2 мл физиологического раствора на одно животное. Эцефалитогенную смесь в объеме 0,4 мл вводили подкожно (в основание хвоста) под легким эфирным наркозом. Контрольным животным инъецировали аналогичный объем ПАФ. Ежедневно животных взвешивали и оценивали наличие клинических симптомов ЭАЭ по методу, разработанному Абдурасуловой И.Н. (Отдел физиологии им. И.П. Павлова, ГУ НИИЭМ РАМН). Для этого регистрировали время начала заболевания, его продолжительность и тяжесть, которую оценивали в баллах по наличию у животных мышечной слабости (0,5 балла), стойких парезов (1 балл) и параличей (1,5 балла). При поражении нескольких конечностей баллы суммировались для расчета клинического индекса (КИ). Отсутствие видимых клинических проявлений оценивалось как КИ =0, летальный исход — КИ = 6. Животных с КИ = 0,5-2,0 считали легко болеющими, животных с КИ = 2,5-3,5 -средней тяжести заболевания, животных с КИ = 4,0-5,0 - тяжело болеющими, КИ= 5,5-6,0 - крайне тяжело болеющими. Рассчитывали кумулятивный КИ -сумма всех КИ на протяжении заболевания.

На 3, 5, 7 сутки после индукции ЭАЭ (индуктивная фаза) декапитировали по пять животных опытной и контрольной групп; на 14 день (пик заболевания) декапитировали пять животных контрольной группы и по пять животных с различной тяжестью течения ЭАЭ. В качестве пассивного контроля (контрольная группа I) использовали интактных животных; вторую контрольную группу составили животные, получившие инъекцию ПАФ в день индукции ЭАЭ у животных экспериментальных групп (контрольная группа II). Выделяли спинной мозг, мозжечок, селезенку, лимфатические узлы брыжейки. За день до индукции и на 7, 14, 21 день после индукции ЭАЭ из мозжечково-мозговой цистерны отбирали до 100 мкл СМЖ у 5 контрольных и 25 опытных животных, СМЖ хранили при -20°С.

Для исследования экспрессии мРНК ц- и m-кальпаина, кальпастатина и GAP-43 из полученных тканей выделяли тотальную мРНК в соответствии со стандартным протоколом (Sambrook et al., 1989) с использованием гуанидина тиоционата (Promega, США). Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на полученных кДНК использовали уникальные праймеры, подобранные по программе Primer 3.0. Детали проведения анализа описаны ранее (Карпенко и др., 2008). Активность кальпаина измеряли с помощью коммерческого набора, с

использованием флуоресцентно меченного синтетического субстрата кальпаина (BioVision, США). Все процедуры проводили согласно инструкции производителя. Результаты представляли в оптических единицах флюоресценции на мкг белка.

Выделение белка GAP-43 осуществляли с помощью экстракции 1%-ным тритоном Х-100 и 5%-ной хлорной кислотой из гомогенатов тканей спинного мозга (Mosevitsky et al., 1994). Электрофоретическое разделение белков проводили в системе уксусная кислота/мочевина по методике Панима и Чокли (Panyim, Chalkley, 1969). Перенос белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозный мембранный фильтр (Synpore, Chemapol, размер пор 0,1-0,4 мкм) осуществляли методом "поверхностного отпечатка" (Plekhanov, 1996). В качестве первых антител использовали моноклональные антитела к белку GAP-43 (Sigma, США); в качестве вторых антител использовали антимышиные козьи гамма-иммуноглобулины, конъюгарованные с пероксидазой хрена. Иммунные комплексы визуализировали хемшпоминесцентным методом. Иммуноферментный анализ проводили по стандартной схеме (Егоров и др., 1991).

Значимость различий между уровнями мРНК кальпаинов, кальпастатина и GAP-43 в сравниваемых группах животных устанавливали с использованием одномерного дисперсионного анализа с последующим применением критерия Тьюки. Достоверность различий длительности латентного периода и клинической фазы ЭАЭ, а также значимость различий клинического и кумулятивного индекса у тестируемых групп крыс по сравнению с контролем устанавливалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение. Характеристика развития ЭАЭ.

Однократное подкожное введение гомогената гомологичного спинного мозга в ПАФ вызывало у самок крыс породы Вистар развитие монофазного ЭАЭ различной тяжести. По результатам трех независимых экспериментов (п=90) заболеваемость животных составила 93,3%. Легкое течение заболевания (КИ = 0,5-2,0) наблюдалось у 14,3% крыс; средней тяжести (КИ = 2,5-3,5) - у 28,5%; тяжелое (КИ = 4,0-5,0) - у 12,5%; крайне тяжелое (КИ = 5,5-6,0) - у 44,7% крыс, из них у 9,8 % заболевание окончилось летально. Клинические симптомы ЭАЭ у крыс появлялись через 6,9±0,8 суток, это наблюдение позволило ограничить латентную фазу заболевания первыми семью днями после индукции ЭАЭ. Максимальный КИ у животных экспериментальной группы наблюдался на 14-й д.п.и. (дней после индукции ЭАЭ), поэтому этот день считали пиком заболевания. Длительность заболевания различалась при легком и тяжелом течении и составила 5,2±2,3 и 21,4±1,8 суток соответственно. В дальнейшем у большинства животных наступало полное или частичное спонтанное выздоровление, поэтому весь период наблюдения был ограничен 30 днями. У животных контрольной группы II (введение ПАФ) в течение указанного периода симптомы ЭАЭ не выявлялись.

Различная тяжесть заболевания у самок крыс Вистар, по-видимому, отражает генетическую разнородность используемых нами животных,

подтверждая роль генетических факторов в предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям.

Проведенные нами исследования, а также данные, полученные коллегами ранее, показали, что используемая модель ЭАЭ является адекватной для изучения аутоиммунных нейродегенеративных процессов. На это указывает несколько фактов. Во-первых, выявлено сходство клинических симптомов ЭАЭ и аутоиммунного нейродегснеративного заболевания человека - рассеянного склероза (мышечная слабость, парезы и параличи конечностей). Во-вторых, показана общность патогенетических механизмов при ЭАЭ и при нейродегенеративных заболеваниях аутоиммунного генеза человека, которая доказывается сходством морфологических и метаболических изменений в ЦНС (Абдурасулова и др., 2004).

Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу ЭАЭ.

Анализ экспрессии мРНК компонентов кальпаиновой системы в клетках селезенки крыс в индуктивную фазу ЭАЭ показал, что процесс развития заболевания сопровождается изменением уровня экспрессии мРНК ц-, т-кальпаина и кальпастатина, причем динамика экспрессии ц- и т-кальпаинов у крыс с ЭАЭ оказалась сходной, но отличалась от контрольной группы II (введение ПАФ). Действительно, на 3-й д.п.и. отмечалось увеличение экспрессии мРНК обеих протеаз по сравнению с животными контрольных групп. На 5-й д.п.и. уровень экспрессии мРНК кальпаинов у животных экспериментальной группы снижался до уровня контрольной группы I (рис. 1А). На 7-й д.п.и. наблюдалось достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК кальпаинов по сравнению с контрольной группой I, однако, достоверных отличий от контрольной группы II не наблюдалось. Динамика экспрессии мРНК кальпастатина у крыс с ЭАЭ и крыс, получавших ПАФ, была сходной: на всех анализируемых сроках уровень экспрессии мРНК кальпастатина был

контроль Зд-п.и. 5 д.п.и 7 д.п.и. Зд-п.и. 5д.п.и. 7д.п.и.

ПАФ ПА® ПАФ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ

Рис. А, ■

!кальпастатин 0т-кальпаии Щц-кальлаин

1. Экспрессия мРНК (А) и активность (Б) кальпаинов в клетках селезенки крыс в

индуктивную фазу ЭАЭ. • - р<0,05 по отношению к соответствующему контролю (А).

- р<0,05 по отношению к соответствующему контролю в группе ПАФ (А).

- р<0,05 по отношению к контролю (Б).

достоверно выше, чем в контрольной группе I, однако на 3-й д.п.и. у экспериментальных крыс увеличение экспрессии мРНК кальпастатина было менее выражено, чем у крыс контрольной группы II.

Анализ активности кальпаинов в клетках селезенки выявил высокую базовую активность кальпаинов у интактных животных (рис. 1Б). Стимуляция иммунной системы с помощью ПАФ не вызвала изменений активности кальпаинов в этих клетках. В клетках селезенки экспериментальных животных на 3-й и 5-й д.п.и. активность кальпаинов также была высокой и не отличалась от контрольных групп. Однако к 7-му д.п.и. активность кальпаинов достоверно снизилась по сравнению с интактными животными.

В клетках лимфатических узлов брыжейки крыс с ЭАЭ динамика экспрессии ц- и ш-кальпаинов, как и в клетках селезенки, оказалась сходной (рис. 2А). На 3-й д.п.и. отмечалось достоверное увеличение экспрессии мРНК обеих протеаз по сравнению с животными контрольной группы I. На 5-й д.п.и. экспрессия мРНК кальпаинов экспериментальной группы оставалась на повышенном уровне, а на 7-й д.п.и. уже не отличалась от контрольной группы I. Однако в клетках лимфатических узлов брыжейки крыс контрольной группы II (животные, получившие инъекцию ПАФ) также наблюдалось увеличение экспрессии мРНК ц- и т-кальпаинов, а на 7-й д.п.и. уровень экспрессии т-кальпаина в этой группе был даже достоверно выше, чем у крыс с ЭАЭ. Динамика экспрессии мРНК кальпастатина у крыс с ЭАЭ и крыс, получавших ПАФ, совпадала: у животных обеих групп выявлялось достоверное увеличение экспрессии мРНК кальпастатина на 3-й и 5-й д.п.и., а на 7-й д.п.и. уровень экспрессии кальпастатина не отличался от контрольной группы I (интактные животные).

Анализ активности кальпаинов в клетках лимфатических узлов брыжейки крыс с ЭАЭ показал, что на 3-й д.п.и. уровень активности кальпаинов был сравним с базовым, но к 5-му д.п.и. активность кальпаинов достоверно увеличилась по отношению к пассивному контролю (контрольная группа I).

I 3000

контроль 3 д.п.и. 5 д.п.и. 7 д.п.и. Зд.п.и. 5 д.п.и. 7 д.п.и.

ПАФ ПАФ ПАФ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ

Нкальпастатин Цт-кадьпаин Иц-кальпаин Рис. 2. Экспрессия мРНК (А) и активность (Б) кальпаинов в клетках лимфатических

узлов брыжейки крыс в индуктивную фазу ЭАЭ. А, ■, • . р<0,05 по отношению к соответствующему контролю (А).

* - р<0,05 по отношению к соответствующему контролю в группе ПАФ (А).

* - р<0,05 по отношению к контролю (Б).

Однако уже к 7-му д.п.и. активность снизилась до уровня контрольной группы II, но была достоверно выше, чем у интактных животных (рис. 2Б).

В клетках ЦНС животных с ЭАЭ нами была выявлена иная динамика изменения уровня экспрессии мРНК и активности кальпаинов. Так, в клетках ЦНС уровень экспрессии мРНК ц-кальпаина практически не изменялся. Увеличение экспрессии мРНК ц-кальпаина отмечалось лишь в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс экспериментальной группы, причем исключительно на 7-й д.п.и. При этом экспрессия мРНК т-кальпаина у крыс с ЭАЭ по сравнению с животными контрольных групп I и II усиливалась уже на 3-й д.п.и. и сохранялась на повышенном уровне вплоть до 7-го д.п.и. Экспрессия мРНК кальпастатина, напротив, увеличивалась только у крыс группы ПАФ (рис. ЗА).

Протеолитическая активность кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс с ЭАЭ также была повышена, причем достоверное увеличение активности кальпаинов наблюдалось уже на 3-й д.п.и. В этих клетках гиперактивация кальпаиновой системы и повышенный уровень экспрессии мРНК ш-кальпаина выявлялись на протяжении всего латентного периода (рис. ЗБ).

Различий в уровне экспрессии мРНК кальпаинов и кальпастатина, а также в уровне протеолитической активности кальпаинов в грудном, шейном отделе спинного мозга крыс с ЭАЭ выявлено не было. Таким образом, в индуктивную фазу ЭАЭ в иммуноцитах и клетках поясничного отдела спинного мозга крыс наблюдается дисбаланс экспрессии мРНК компонентов кальпаиновой системы; в клетках поясничного отдела спинного мозга также выявляется гиперактивация кальпаинов.

Полученные нами данные указывают на различную динамику вовлечения кальпаиновой системы иммуноцитов и клеток ЦНС в развитие ЭАЭ на ранних стадиях формирования патологии. Так, в клетках селезенки и лимфатических узлов брыжейки уже на 3-й д.п.и. происходит увеличение уровня экспрессии

Цкальпастатин Ц т-кальпаин | ц-калышш Рис. 3. Экспрессия мРНК (А) и активность (Б) кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс в индуктивную фазу ЭАЭ. • - р<0,05 по отношению к соответствующему контролю (А). * - р<0,05 по отношению к контролю (Б).

мРНК всех анализируемых представителей кальпаиновой системы, включая кальпастатин, что, вероятно, обеспечивает поддержание базовой активности кальпаинов в этих клетках. В клетках поясничного отдела спинного мозга, напротив, при увеличении уровня экспрессии мРНК m-кальпаина изменение уровня экспрессии мРНК кальпастатина не наблюдается. Это, возможно, и приводит к гиперактивации кальпаинов в клетках ЦНС уже на 3-й д.п.и.

Обнаруженное повышение уровня экспрессии кальпаинов и гиперактивация кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс в индуктивную фазу ЭАЭ, вероятнее всего, характерны для резидентных и мигрировавших в ЦНС клеток иммунной системы. В пользу этого предположения свидетельствует показанное нами отсутствие увеличения степени протеолиза кальпаином нейроспецифического белка GAP-43, а также обнаружение в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс многократного увеличения уровня экспрессии ц-кальпаина (на 7-й д.п.и.), который в норме в нейронах и клетках глии практически не экспрессируется, но экспрессируется активированными Т-лимфоцитами (Schaecher et al., 2002). Известно, что одним из субстратов ц-кальпаина является ингибитор транскрипционного фактора NF-kB - белок 1кВ, расщепление которого способствует перемещению транскрипционного фактора NF-kB из цитозоля в ядро, где он активирует транскрипцию многих генов, в том числе гена индуцибельной NOS, циклооксигеназы-2а, ФНО-а, ИЛ-ip (Ruetten, Thiemermann, 1997). Активация транскрипции этих генов приводит к повышению уровня продукции соответствующих белков, которые индуцируют развитие в ЦНС воспалительной реакции (Baumann, Pham-Dinh, 2001). Таким образом, сверхэкспрессия и гиперактивация ц-кальпаина в клетках поясничного отдела спинного мозга может способствовать созданию пермиссивной среды для развития воспалительной реакции в ЦНС.

Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС животных с различной тяжестью течения ЭАЭ

Анализ уровня экспрессии мРНК ц- и m-кальпаина, а также кальпастатина в клетках селезенки и лимфатических узлов брыжейки крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ показал, что на 14-й д.п.и. уровень экспрессии анализируемых компонентов кальпаиновой системы не отличался от базового; протеолитическая активность кальпаинов также была на уровне контрольных значений. Следовательно, вне зависимости от тяжести течения заболевания экспрессия мРНК ц-, m-кальпаина и кальпастатина, а также уровень активности кальпаинов к 14-му д.п.и. возвращаются к исходному базовому значению.

Анализ экспрессии мРНК компонентов кальпаиновой системы в клетках ЦНС показал преимущественное вовлечение в процесс развития ЭАЭ т-кальпаина и кальпастатина. Действительно, в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ и у животных контрольных групп обнаружен практически одинаковый уровень экспрессии мРНК ц-кальпаина. Однако уровень экспрессии мРНК m-кальпаина и

кальпастатина у крыс экспериментальных групп заметно различался. Так, на 14-й д.п.и. у животных контрольной группы II (введение ПАФ) в клетках поясничного отдела спинного мозга выявлялось достоверное увеличение экспрессии мРНК т-кальпаина по сравнению с интактными животными при сохранении базового уровня экспрессии мРНК кальпастатина. У животных без видимых клинических проявлений заболевания и животных с легкой формой ЭАЭ уровень экспрессии мРНК т-кальпаина был достоверно выше, чем в контрольной группе I, но не отличался от контрольной группы II. При развитии ЭАЭ средней тяжести, а также при тяжелых формах заболевания, уровень экспрессии мРНК т-кальпаина увеличивался и был достоверно выше, чем в обеих контрольных группах. Экспрессия т-кальпаина достигала наибольшего значения в группе с крайне тяжелой формой ЭАЭ (КИ= 5,5-6,0). Напротив, экспрессия мРНК кальпастатина достоверно увеличивалась только у крыс с легкой формой заболевания (рис. 4А).

Протеолитическая активность кальпаина в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс экспериментальных групп также различалась. У животных без видимых неврологических нарушений и крыс с легким течением ЭАЭ активность кальпаинов сохранялась на базовом уровне. Однако даже у этих животных мы наблюдали повышение экспрессии мРНК т-кальпаина, которое сопровождалось увеличением уровня экспрессии мРНК кальпастатина (эндогенного ингибитора кальпаина). Вероятно, поэтому уровень протеолитической активности кальпаинов практически не отличался от интактных животных. Повышенная ферментативная активность кальпаина наблюдалась только у животных со стойкими неврологическими нарушениями в виде парезов и параличей одной или нескольких конечностей, причем активность кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга увеличивалась с повышением тяжести течения заболевания и достигала наибольшего значения у животных с крайне тяжелой формой ЭАЭ (рис. 4Б).

2000

| 1600 з

11600 11400 -& 1200 11000

I А:

Рис. А, •

коктрош, ПАФ

ЭАЭ 0,5-2,0

ЭАЭ 2,5-3,5

|каяьпастатин

Я т-калыиин

| ^-кальпаин

Экспрессия мРНК (А) и активность (Б) кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ (14-й д.п.и.).

- р<0,05 по отношению к соответствующему контролю (А).

- р<0,05 по отношению к соответствующему контролю в группе ПАФ (А).

- р<0,05 по отношению к контролю (Б).

- р<0,001 по отношению к контролю (Б).

В клетках грудного отдела спинного мозга уровень экспрессии мРНК т-кальпаина у животных без признаков ЭАЭ, у крыс с легкой и средней формой ЭАЭ не отличался от контрольных групп. Однако при тяжелых формах заболевания (КИ>4) экспрессия ш-кальпаина достоверно увеличилась, при этом протеолитическая активность кальпаинов также была повышена. Следует отметить, что у крыс с КИ = 0,5-2,0 и КИ = 2,5-3,5 наблюдалось увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина, что, вероятно, привело к снижению протеолитической активности кальпаина. Действительно, у животных с легкой формой ЭАЭ экспрессия мРНК ц- и ш-кальпаина сохранялась на базовом уровне, однако, экспрессия мРНК кальпастатина была повышена, в результате чего протеолитическая активность кальпаинов снизилась и стала даже ниже, чем у животных контрольных групп (рис. 5).

В шейном отделе спинного мозга крыс на пике ЭАЭ повышенный уровень экспрессии мРНК т-кальпаина наблюдался только у экспериментальных животных с крайне тяжелым течением заболевания. Однако у этих животных уровень экспрессии мРНК кальпастатина был также повышен, что, вероятно, предотвратило гиперактивацию кальпаинов. Высокая протеолитическая активность кальпаинов наблюдалась лишь у животных с КИ = 4,0-5,0, причем у этих крыс экспрессия мРНК кальпаинов сохранялась на базовом уровне, зато уровень экспрессии мРНК кальпастатина значительно снизился (данные не показаны).

Таким образом, в клетках спинного мозга животных с ЭАЭ наблюдается сверхэкспрессия т-кальпаина и гиперактивация кальпаинов, причем с усилением тяжести течения заболевания повышение протеолитической активности кальпаинов выявляется не только в нижних, но и в верхних отделах спинного мозга. Поскольку в клетках ЦНС животных с ЭАЭ обнаружено повышение экспрессии мРНК т-, но не ц-кальпаина, по-видимому, наблюдаемое увеличение протеолитической активности кальпаинов в этих клетках в большей степени опосредовано гиперактивацией именно ш-

0.80 ; 1400 ;

« А к

0'70 ! 1 | | | 1 1200 | X

111кШ 111 ■ I

I ; контроль ПАФ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ '"„"I контроль ПАФ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ | А КИ- 0 0,5-2,0 2,5-3,5 4,0-5,0 5,5-6,0 | Б ] КИ= 0 0,5-2,0 2,5-3,5 4,0-5,0 5,5^,0

Щкальпастатин йт-кальпаин Иц-кальпаин Рис. 5. Экспрессия мРНК (А) и активность (Б) кальпаинов в клетках грудного отдела

спинного мозга крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ (14-й д.п.и.). А. • - р<0,05 по отношению к соответствующему контролю (А). * - р<0,05 по отношению к контролю (Б). ** - р<0,001 по отношению к контролю (Б).

кальпаина.

Известно, что кальпастатин является единственным известным на сегодняшний день эндогенным ингибитором кальпаинов, повышение экспрессии которого, как правило, приводит к подавлению протеолитической активности кальпаинов (Göll et al., 2003). Действительно, анализ уровня экспрессии мРНК кальпастатина и активности кальпаинов в одних и тех же образцах выявил подавление активности кальпаинов при повышении уровня экспрессии кальпастатина. В этом отношении особый интерес представляет обнаруженное нами увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина в клетках различных отделов спинного мозга крыс с бессимптомным и легким течением ЭАЭ. Таким образом, одним из факторов, определяющих тяжесть течения ЭАЭ у крыс породы Вистар, является степень и распространенность сверхэкспрессии, а также гиперактивации кальпаинов клеток ЦНС; способность клеток ЦНС сверхэкспрессировать кальпастатин обеспечивает развитие легких форм ЭАЭ.

Выявленная нами связь распространения сверхэкспрессии и гиперактивации m-кальпаина с тяжестью течения ЭАЭ согласуется с данными об объеме нейродеструктивных повреждений ЦНС, что позволяет предположить вовлеченность m-кальпаина в процессы инициации гибели нейронов и клеток глии в условиях развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса. Действительно, развитие воспалительной реакции сопровождается высвобождением в межклеточную среду провоспалительных цитокинов, лейкотриенов, активных форм кислорода и азота, эйкозаноидов (глутамата, аспартата) и других биологически активных молекул. Повышение во внеклеточном пространстве концентрации этих веществ вызывает нарушение регуляции гомеостаза различных ионов, в том числе, ионов кальция и приводит к гиперактивации кальпаинов в клетках ЦНС. Активированный кальпаин, в свою очередь, расщепляет кальпаин-чувствительные белки (белки клеточной адгезии, белки миелина, некоторые белки клеточного цитоскелета и транскрипционные факторы), вызывая тем самым необратимые повреждения в клетке и в итоге - ее гибель (Göll et al., 2003).

Влияние интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина I на выраженность ЭАЭ.

ЭАЭ индуцировали у 35 самок крыс Вистар как описано ранее. За несколько дней до индукции заболевания животных случайным образом распределили на две группы. Численность контрольной группы составила 20 животных, экспериментальной группы - 15 животных. Ингибитор кальпаина I растворили в 2% этиловом спирте. Со 2-го по 16-й д.п.и. крысам экспериментальной группы интраназально вводили ингибитор кальпаина I в дозе 1 мкг/животное в день; крысам контрольной группы аналогичным образом вводили 2% этиловый спирт.

В контрольной группе у 100% крыс наблюдались клинические признаки ЭАЭ, причем у 30% животных заболевание протекало в тяжёлой форме с развитием параличей нескольких конечностей (клинический индекс на пике

болезни от 4,0 до 5,5 баллов). У остальных животных этой группы наблюдалось легкое и среднетяжелое течение заболевания, а именно, развивался паралич хвоста и парезы задних лап (клинический индекс на пике болезни от 1,5 до 3,5 баллов). Первые признаки ЭАЭ у животных контрольной группы с тяжёлым течением ЭАЭ проявлялись через 7,2±0,7 дня, у остальных животных через 11,4±1,2 дня; пик болезни наблюдался на 14-й д.п.и. На пике ЭАЭ у животных контрольной группы средний клинический индекс составил 3,4 балла, средний кумулятивный индекс - 23,1 балла; длительность ЭАЭ составила 11,0±0,8 дней (табл. 1.).

Курсовое введение ингибитора кальпаина I предупреждало развитие ЭАЭ у 33% животных (р<0,009), при этом у заболевших животных в среднем отмечалось более легкое течение ЭАЭ: в 2,2 раза снизился средний клинический индекс на пике заболевания по сравнению с контрольной группой; кумулятивный индекс уменьшился в 1,8 раза (табл. 1.). Несмотря на то, что доля тяжело болеющих животных сохранилась, КИ на пике заболевания у этих крыс снизился. У животных, получавших ингибитор кальпаина I, сократилась длительность заболевания, хотя продолжительность латентного периода не изменилась. Следовательно, интраназальное введение ингибитора кальпаина I в дозе 1 мкг/животное в день в течение 16 дней после индукции ЭАЭ снижало выраженность заболевания.

Таким образом, подавление активности кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина I предотвращает развитие или снижает выраженность ЭАЭ у крыс, что подтверждает вовлеченность кальпаиновой системы в патогенез ЭАЭ и указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаинов для клинического применения при лечении аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний.

Табл. 1. Влияние курсового введения ингибитора кальпаина I в дозе 1,0 мкг/животное по лечебно й схеме (с 1 по 1 6 день по ше индукции ЭАЭ) на тяжесть и продолжительность ЭАЭ.

Вещество Число заболевших животных (%) Длительность латентного периода ЭАЭ у заболевших крыс (дни)2 Средний клинический индекс на пике ЭАЭ (баллы)2 Средний кумулятивный индекс (баллы)2 Длительность ЭАЭ (дни)2

Всего1 Тяжело1

лёгкое течение тяжёлое течение

Контроль (2% этанол) 100 30 11,4±1,2 7,2±0,7 3,4 23,1 11,0±0,8

Ингибитор кальпаина I 67ь 20 13,5±1,9 8,1±1,3 1,5* 12,8* б,7±1,4а

1 Тест Фишера. 2 Непараметрический Манн-Уитни тест. а р<0,05 по сравнению с контролем ь р<0,009 по сравнению с контролем

Экспрессия мРНК ОАР-43, распределение белка ОАР-43 и его фрагмента ОАР-43-3 в клетках ЦНС в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни.

На 7-ой д.п.и. ЭАЭ в клетках поясничного отдела спинного мозга нами было выявлено значительное усиление экспрессии мРНК ОАР-43. Поскольку усиление экспрессии ОАР-43, наблюдаемое после повреждения клеток ЦНС, является маркером регенеративных процессов (Coggins, 2\У1егз, 1991), обнаруженный нами факт свидетельствует об инициации регенеративных процессов в поясничном отделе спинного мозга крыс с ЭАЭ уже в индуктивную фазу заболевания.

Исследование степени протеолиза белка ОАР-43 кальпаином в гомогенате клеток различных отделов спинного мозга показало, что во всех анализируемых образцах присутствовал целый белок ОАР-43 и его протеолитический фрагмент ОАР-43-3. Несмотря на обнаруженную нами гиперактивацию кальпаина в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс с ЭАЭ, выявляющуюся уже на 3-й д.п.и., доля протеолитического фрагмента ОАР-43-3 в этих клетках по сравнению с контрольной группой I и II не увеличилась. Обнаруженный факт имеет следующее объяснение. Мы анализировали активность кальпаина в гомогенате тканей, поэтому не могли определить в каких именно клетках (нейронах, клетках глии или других) наблюдалась гиперактивация кальпаина. Поскольку ОАР-43 экспрессируется нейронами и в меньшей степени клетками глии (ОевйтасЬег й а1., 1997), весьма вероятно, что гиперактивированный кальпаин и ОАР-43 не были солокализованы.

Анализ экспрессии мРНК ОАР-43 в клетках поясничного отдела спинного мозга животных с различной тяжестью течения ЭАЭ показал, что уровень экспрессии мРНК ОАР-43 связан с тяжестью течения заболевания: у крыс с бессимптомным ЭАЭ (КИ=0) в поясничном отделе спинного мозга наблюдалось достоверное увеличение экспрессии мРНК ОАР-43, а при крайне тяжелой форме заболевания (КИ=5,5-6,0), напротив, уровень экспрессии ОАР-

43 снижался (рис. 6). Поскольку при бессимптомном течении заболевания (Кй=0) повреждено минимальное количество клеток ЦНС, мы полагаем, что эти повреждения могут компенсироваться за счет регенеративных процессов,

сопровождающихся выявленным нами усилением экспрессии белка ОАР-43. При крайне тяжелом течении ЭАЭ (КИ=5,5-6,0) в поясничном отделе спинного мозга наблюдается массовая гибель нейронов и клеток глии, что приводит к снижению уровня экспрессии мРНК ОАР-43.

контроль ПАФ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ ЭАЭ КИ- 0 0,5-2,0 2,5-3,5 Д.0-5.0 5,5-6,0

Рис. 6. Уровень экспрессии мРНК ОАР-43 в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ (п=5). * - р<0,05 по отношению к контролю.

При развитии ЭАЭ в грудном и шейном отделе спинного мозга нейродегенеративные изменения выявляются только у животных с крайне тяжелой формой ЭАЭ (Steinbrecher et al., 2005). Это согласуется с результатами нашего исследования: уровень экспрессии мРНК GAP-43 в клетках грудного и шейного отдела спинного мозга увеличивается при КИ<5,0; остается неизменным или снижается при КИ=5,5-6,0.

Исследование степени протеолиза белка GAP-43 в гомогенате клеток спинного мозга крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ показало, что у всех животных с видимыми неврологическими нарушениями (КИ>0) в клетках поясничного отдела спинного мозга доля GAP-43-3 увеличилась по сравнению с контролем (рис. 7). Так, у интактных животных и крыс контрольной группы II (введение ПАФ) в клетках поясничного отдела спинного мозга в среднем 37 % белка GAP-43 находилось в форме GAP-43-3 (здесь и далее степень протеолиза белка GAP-43 кальпаином вычислена с помощью денситометрирования иммуноблотов; данные представлены в виде процентной доли белка GAP-43-3 от общей интенсивности зон, соответствующих белку GAP-43 и GAP-43-3, п=5). У животных с легким и среднетяжелым течением ЭАЭ доля GAP-43-3 составила уже 60 %, а при тяжелых формах заболевания - 85 %. Это неудивительно, ведь GAP-43 является субстратом кальпаина (Zakharov et al., 2005), а развитие ЭАЭ, как было нами установлено, приводит к гиперактивации кальпаина клеток спинного мозга, причем наибольшая протеолитическая активность кальпаина наблюдается именно в клетках поясничного отдела спинного мозга животных с тяжелым течением ЭАЭ.

В грудном и шейном отделах спинного мозга процентное содержание GAP-43-3 увеличилось по сравнению с контролем лишь в группе животных с тяжелыми формами ЭАЭ, то есть при КИ>4,0. Действительно, в клетках грудного и шейного отдела спинного мозга в норме около 40 % белка GAP-43 находилось в форме GAP-43-3; при развитии легкой и среднетяжелой формы заболевания доля GAP-43-3 не изменялась, а при тяжелых и крайне тяжелых формах ЭАЭ доля GAP-43-3 составила уже 65 % и 85 % соответственно (рис. 7). Эти данные полностью согласуются с выявленными нами ранее

изменениями уровня активности кальпаинов в клетках грудного и шейного отделов спинного мозга крыс с ЭАЭ. Полученные данные позволяют заключить, что гиперактивация кальпаина,

наблюдаемая в клетках различных отделов спинного мозга животных с индуцированным ЭАЭ, приводит к протеолитическому расщеплению белка GAP-43. В зависимости от тяжести течения ЭАЭ степень протеолиза GAP-43 кальпаином увеличивается, причем не только в

Рис. 7. Иммуноблоты, проявленные с помощью коммерческих антител к белку ОАР-43 крысы.

поясничном отделе спинного мозга, но и в его верхних отделах.

Таким образом, при развитии бессимптомного ЭАЭ в спинном мозге крыс наблюдается повышение уровня экспрессии мРНК ОАР-43, при этом доля ОАР-43-3 сохраняется на уровне контрольного значения. Это означает, что в клетках спинного мозга таких животных возрастает содержание целой молекулы ОАР-43. У животных с тяжелым течением заболевания в клетках всех отделов спинного мозга, напротив, уровень САР-43 уменьшается за счет снижения экспрессии мРНК ОАР-43 и увеличения степени протеолитического расщепления ОАР-43 кальпаином с образованием ОАР-43-3.

Белок САР-43 в СМЖ крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ

Исследование проб ликвора, взятых до индукции ЭАЭ, показало наличие базового уровня белка ОАР-43 в ликворе крыс, составившего в среднем 0,45 нг/мл. Общее содержание белка ОАР-43 и его протеолитического фрагмента ОАР-43-3 у животных без видимых неврологических нарушений в процессе развития ЭАЭ не изменялось и оставалось на базовом уровне на всех исследованных сроках. У заболевших животных выявлено изменение содержания белка ОАР-43 и его протеолитического фрагмента в ликворе в процессе развития ЭАЭ. На 7-й д.п.и. в СМЖ всех впоследствии заболевших животных уровень белка ОАР-43 практически не изменился по сравнению с базовым уровнем. В дальнейшем у заболевших животных наблюдалось увеличение общего количества белка ОАР-43 и ОАР-43-3 в СМЖ, причем у тяжело болевших животных подъем был более выражен, чем у легко болевших крыс. На пике заболевания (14-й д.п.и.) у животных с тяжелыми неврологическими нарушениями общее количество белка ОАР-43 и ОАР-43-3 в СМЖ составило 0,62 ± 0,02 нг/мл, т.е. уровень белка возрос в 1,4 раза по сравнению с базовым (рис. 8). У крыс с более легким течением заболевания

содержание белка составило 0,57 ± 0,01 нг/мл. К 21-му д.п.и. у всех животных, имевших симптомы ЭАЭ на пике заболевания, видимых неврологических нарушений уже не отмечалось, однако в ликворе животных наблюдалось дальнейшее увеличение общего уровня белка ОАР-43 и его протеолитического фрагмента. Ранее выявленная тенденция сохранялась: более высокий уровень белка ОАР-43 в ликворе имели тяжело болевшие (на 14-й д.п.и.) животные по сравнению с легко болевшими - 0,93±0,03 нг/мл и 0,65±0,02 нг/мл, соответственно.

Общий уровень белка ОАР-43 и ОАР-43-3 в СМЖ крыс увеличивался

Рис. I

Общее содержание белка ОАР-43 и его протеолитических фрагментов в СМЖ крыс в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни (п=5-14).

- р<0,05 по сравнению с интактными животными.

- р<0,001 по сравнению с интактными животными.

при появлении клинических симптомов заболевания и продолжал возрастать в период выздоровления, достигая наибольшего значения при исчезновении видимых клинических проявлений. По-видимому, наличие высокого уровня белка GAP-43 и/или его протеолитического фрагмента GAP-43-3 в СМЖ крыс с ЭАЭ отражает течение двух противоположно направленных процессов: на пике заболевания - дегенерации клеток ЦНС и в период выздоровления -регенерации аксонов. Мы полагаем, что в результате гибели нейронов путем апоптоза или некроза в СМЖ попадает не только целая молекула белка GAP-43, но и его фрагмент GAP-43-3. Регенерация аксонов сопровождается регулируемым процессом секреции белка GAP-43 или GAP-43-3, возможно, опосредованным кальпаином. Действительно, при развитии нейродегенеративных процессов у крыс в СМЖ обнаруживаются некоторые внутриклеточные нейроспецифические белки (tau и спектрин) и их протеолитические фрагменты, являющиеся продуктами расщепления кальпаином (Siman et al., 2004).

Таким образом, уровень белка GAP-43 в СМЖ крыс с ЭАЭ отражает тяжесть и фазу течения болезни, что может служить диагностическим и/или прогностическим критерием развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса.

выводы

1. В индуктивную фазу ЭАЭ в иммуноцитах и клетках поясничного отдела спинного мозга крыс наблюдается дисбаланс экспрессии мРНК компонентов кальпаиновой системы; в клетках поясничного отдела спинного мозга выявлена гиперактивация кальпаинов.

2. Степень и распространенность сверхэкспрессии, а также гиперактивации кальпаинов клеток ЦНС является одним из факторов, определяющих тяжесть течения ЭАЭ у крыс; способность клеток ЦНС сверхэкспрессировать кальпастатин обеспечивает развитие легкой формы ЭАЭ.

3. Подавление активности кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина I предотвращает развитие или снижает выраженность ЭАЭ у крыс, что указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаина для лечения аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний.

4. Бессимптомное развитие ЭАЭ сопровождается повышением уровня экспрессии мРНК САР-43 в клетках спинного мозга; степень протеолиза белка САР-43 сохраняется на уровне контрольного значения. У животных с тяжелым течением заболевания в клетках всех отделов спинного мозга уровень САР-43 уменьшается за счет снижения экспрессии мРНК ОАР-43 и увеличения степени протеолитического расщепления ОАР-43 кальпаином.

5. Повышение уровня белка ОАР-43 в СМЖ крыс с ЭАЭ отражает тяжесть и фазу течения болезни, что может служить диагностическим и/или прогностическим критерием развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Карпенко М.Н., Абдурасулова И.Н., Житнухин Ю.Л., Клименко В.М. Экспрессия мРНК кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ). Медицинский академический журнал, 2008, т.8, №4, с. 56-56.

2. Захаров В.В., Богданова М.Н., Мосевицкий М.И. Специфический протеолиз нейронального белка ОАР-43 кальпаином. Характеристика, регуляция, физиологическая роль. Биохимия, 2005, т.70, с. 1086-1098.

3. Карпенко М.Н. Абдурасулова И.Н. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в клетках ЦНС крыс с различной тяжестью течения экспериментального аллергического энцефаломиелита. Материалы конференции Политехнического симпозиума, 9 декабря 2008 г, Санкт-Петербург, Сборник тезисов, с. 117.

4. Афанасьев П.В., Карпенко М.Н. Влияние ингибитора кальпаина I на выраженность экспериментального аллергического энцефаломиелита. ХЬУП неделя науки Санкт-Петербургского государственного политехнического

университета (2008). Ч. IV: Материалы межвузовской научной конференции. СПб.: Изд-во СПбГПУ, стр. 4.

5. Карпенко М.Н. Абдурасулова И.Н. Клименко В.М. Экспрессия кальпаина в клетках различных отделов ЦНС и на периферии в процессе развития экспериментального аллергического энцефаломиелита. Объединенный иммунологический форум, Санкт-Петербург, 30 июня -5 июля 2008 г., Российский иммунологический Ж., 2008, т. 2(11), № 2-3, с. 216.

6. Карпенко М.Н., Абдурасулова И.Н., Клименко В.М. Изменение уровня экспрессии кальпаина в латентный период развития экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс. VI Сибирский Физиологический съезд, 25-27 июня 2008 г. Барнаул. Тезисы докладов. Том I, с. 236.

7. Карпенко М.Н., Абдурасулова И.Н., Клименко В.М. Изменение уровня экспрессии кальпаина в клетках различных отделов ЦНС и на периферии в процессе развития экспериментального аллергического энцефаломиелита. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г, Новосибирск, Сборник тезисов, с. 468.

8. Karpenko M.N., Abdurasulova I.N., Klimenko V.M. Calpain expression in CNS and peripheral cells associated with experimental allergic encephalomyelitis. 11-th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference "Stress and behavior", St-Petersburg, 2008, may 16-20, p. 64.

Marina N. Karpenko

Summary of the PhD-thesis "Calpain system involvement into autoimmune neurodegenerative processes (on the model of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) " (carried out at the Department of Physiology named after I.P. Pavlov, Research Institute for Experimental Medicine, St.-Petersburg, Russia) Background. The calpain system is a system of cellular cysteine proteases that require calcium and are functionally active at neutral pH. Calpain activation takes place in two models: controlled activation under physiological conditions (only a few molecules of calpain are activated per cell), and hyperactivation under pathological conditions that involves sustained calcium overload (all available calpain molecules are activated). Regulated activation of calpain may be critical for function of many cells because of various structural proteins, enzymes and transcription factors are calpain substrate. Hyperactivation of calpain was revealed on the pathophysiology of many neurological disorders, including spinal cord injury, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, brain ischemia, optic neuritis and on inflammatory diseases such as sepsis, pancreatitis etc. We believe that calcium influx mediates an increase of calpain activity that may cause inflammation and neurodegeneration in the spinal cord of rats with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) - an animal model of autoimmune neurodegenerative process. Thus, the aim of the investigation was to establish the calpain system involvement of immunocytes and CNS cells into autoimmune neurodegenerative processes on the model of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.

Methods. EAE induction and tissue sampling, RNA and protein extraction, RT-PCR, electrophoresis of nuclear acids and proteins in agarose and polyacrylamide gels, immunoblot analysis, calpain activity analysis, ELISA. Data are expressed as mean ± S.E.M. Statistical comparisons were made using one way ANOVA, Tukey's post hoc test and Fisher's test. Differences were considered significant at p<0.05.

Result. At the present study, the calpain expression at transcriptional level and calpain activity were evaluated in splenic, mesenteric lymph nodes inflammatory cells and spinal cord cells of Wistar rats with EAE before or after the onset of clinical symptoms. We observed an increased calpain expression in spleen and mesenteric lymph nodes of animals with EAE prior to symptomatology compared to normal control. The calpain activity of these cells did not differ from the control. Calpain expression was decreased up to normal control in spleen and mesenteric lymph nodes of animals with clinical symptoms (paralysis of tail and limbs). Calpain expression and activity was significantly increased prior to the onset of clinical symptoms in lumbar section of spinal cord. We observed an increase of m-calpain expression and activity in the cells of lumbar, thoracic and cervical spinal cord sections of rats with complete paralysis of forelimb on the peak of the disease. The increase of m-calpain expression and activity was not found out among the rats without signs of the disease. However the calpastatin expression increased.

The inhibition of enhanced calpain activity can be target for the treatment of autoimmune neurodegenerative process probably. We tested calpain inhibitor I as a potential therapeutic agent in autoimmune neurodegenerative processes as it readily cross the BBB. The prodrug was administered intranasaliy (treatment with a total of l^g calpain inhibitor I per rat a day from 1st to 16lh day post immunization). This treatment demonstrated that the onset of EAE signs reduced. In this case the symptoms were limited to the flaccid tail and minimal hind limb weakness. Calpain inhibitor I also reduced the progression of the disease (p<0.009). The results showed calpain inhibitor I could be beneficial in the treatment of patients with neurodegenerative disorder of autoimmunity genesis.

Then we investigated the calpain capability to cleave GAP-43 (growth associated protein 43). The neuron specific protein GAP-43 is one of important proteins involved to basic nervous system specific processes such as neuroplasticity, regeneration and apoptosis. Proteolysis of GAP-43 by calpain brakes down the same properties. We observed an increase of GAP-43 proteolysis by calpain in the cells of lumbar, thoracic and cervical spinal cord sections of rats with complete paralysis of the forelimb on the peak of disease. We supposed that proteolysis of GAP-43 disrupts capability of axons to regeneration. An addition we detected an increase of GAP-43 level in cerebrospinal fluid (CSF) of rats with forelimb complete paralysis. Thus, the level of GAP-43 in CSF may be considered as a marker of autoimmune neurodegenerative processes development.

Подписано в печать 29.01.2009г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 1070.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izdjema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпенко, Марина Николаевна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Аутоиммунный нейродегенеративпый процесс и его моделирование на животных

1.1.1. Патогенетические механизмы аутоиммунного нейродегенеративного процесса на примере PC и ЭАЭ.

1.1.2. Разработка новых подходов к лечению аутоиммунной нейродегенеративной патологии.

1.2. Кальпаиновая система внутриклеточных протеаз.

1.2.1. Структура кальпаинов.

1.2.2. Тканевая локализация кальпаинов.

1.2.3.Регуляция активности кальпаинов.

1.2.4. Физиологические функции кальпаиновой системы.

1.2.5. Участие кальпаиновой системы в патологических процессах.

1.3. БЕЛОК GAP-43 (Growth Associated Protein-43).

1.3.1 .Структурные и биохимические свойства белка GAP-43.

1.3.2.Физиологическая роль белка GAP-43.

1.3.3.Участие белка GAP-43 в патологических процессах.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.2. Индукция ЭАЭ.

2.3. Оценка клинического течения заболевания.

2.4. Препарат.

2.5. Забор материала.

2.6. Выделение тотальной мРПК.

2.7. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

2.8. Электрофорез РНК и ДНК в агарозном геле.

2.9. Экстракция белка GAP-43.

2.10. Измерение концентрации белка.

2.11. Одномерный электрофорез белков в полиакриламидном геле в системе уксусная кислота/мочевина.

2.12. Окраска белков в ПААГ.

2.13. Препаративный электрофорез белков.

2.14. Иммуноблоттинг белков.

2.15. Иммуноферментный анализ.

2.16. Определение активности кальпаинов.

2.17. Методы математической статистики.

2.18. Используемые реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика развития ЭАЭ.

3.2. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу ЭАЭ.

3.3. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС животных с различной тяжестью течения ЭАЭ.

3.4. Влияние интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина 1 на выраженность ЭАЭ.

3.5. Экспрессия мРНК ОАР-43, распределение белка ОАР-43 и его фрагмента ОАР-43в клетках ЦНС в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни

3.6. Белок ОАР-43 в СМЖ крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс)"

Актуальность проблемы.

Ограниченный протеолиз белков и пептидов в живых тканях и клетках является особой формой физиологической регуляции и считается универсальным механизмом, ответственным за образование и модификацию ферментов. Реакции ограниченного протеолиза лежат в основе функционирования важнейших физиологических систем, в частности, ренин-ангиотензиновой, калликреин-кининовой, иммунитета, гемостаза, комплемента, апоптоза, регуляции экспрессии генов (Соловьева и др., 1995). Поэтому для понимания принципов регуляции физиологических систем необходимо детальное изучение внутриклеточных регуляторных протеаз и тех реакций, которые они катализируют.

2002). С этой точки зрения особый интерес вызывает Ca -зависимая кальпаиновая система внутриклеточных протеаз, гиперактивация которой приводит к нарушению регуляции многих физиологических функций организма (Göll et al., 2003). Так, гиперактивация кальпаинов, наблюдаемая в клетках ЦНС при развитии ряда нейродегенеративных заболеваний, способствует накоплению в клетке неупорядоченных нейрофибрилл и ß-амилоидных бляшек, а также вызывает запуск процесса апоптоза (Göll et al.,

2003).

В единичных научных работах показано изменение уровня экспрессии компонентов кальпаиновой системы в post mortem образцах тканей пациентов с рассеянным склерозом (наиболее распространенное и социально значимое нейродегенеративное заболевание аутоиммунного генеза) (Banik N. et al., 1999а). Однако роль кальпаиновой системы в условиях развития данного патологического процесса до сих пор не установлена. Гиперактивация кальпаинов при развитии рассеянного склероза может иметь значение на всех этапах патогенеза: от регуляции миграции активированных Т-лимфоцитов и расщепления белков миелина до активации проапоптотических ферментов. Действительно, расщепление кальпаином основного белка миелина, белка нейрофиламентов может стимулировать образование энцефалитогенных пептидов; расщепление прокаспаз до каспаз способствует запуску апоптотических каскадов; расщепление белков клеточной адгезии увеличивает миграционную способность клетки (Göll et al., 2003). Кроме этого, выявление новых субстратов кальпаина расширяет представление о функциональной роли кальпаиновой системы. Так, недавно было показано, что нейроспецифический белок GAP-43 (growth associated protein) является субстратом кальпаина (Захаров с соавт., 2005). Поскольку белок GAP-43 известен как маркер конусов роста, пластических и регенеративных процессов, протекающих в нервной ткани (Oestreicher et al., 1997), весьма вероятно, что протеолитическое расщепление белка GAP-43 кальпаином может, существенно изменяя его свойства, подавить регенеративную способность клеток ЦНС.

Поскольку спектр возможных исследований на пациентах с рассеянным склерозом достаточно узок, очевидна перспектива исследования вовлечения кальпаиновой системы в нейродегенеративные процессы аутоиммунного генеза на модели данной патологии у лабораторных животных. Действительно, модель на лабораторных животных обладает тем преимуществом, что за относительно короткое время воспроизводит различные стадии развития болезни и позволяет уточнить механизмы формирования патологии данного типа, а также выявить новые мишени для фармакологического воздействия с целью эффективного лечения нейродегенеративных заболеваний аутоиммунного генеза.

Наиболее адекватной моделью рассеянного склероза считается экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) (для обзора Gold et al., 2006). Многочисленные исследования показали, что основные механизмы поражения ЦНС в экспериментальных моделях аутоиммунного энцефаломиелита, сходны с таковыми у пациентов с рассеянным склерозом (Smith et al., 1999 и мн. др.). У животных с индуцированным ЭАЭ, как и у людей при рассеянном склерозе, наблюдается аутоиммунный ответ на компоненты миелина, приводящий к демиелинизации, а затем и к дегенерации аксонов и, в итоге, к гибели нервных клеток; проявляется патологическая цепь событий с развитием парезов, параличей и другими симптомами болезни. Интересно, что у некоторых видов лабораторных грызунов наступает супрессия патологических процессов и регенерация поврежденных тканей даже при повреждении обширных областей ЦНС. У таких животных неврологические и двигательные нарушения сглаживаются, и наступает частичное или полное выздоровление, после которого животные резистентны к повторной индукции ЭАЭ (Gold et al., 2006). К сожалению, молекулярные механизмы, лежащие в основе спонтанного выздоровления животных, остаются практически неизученными. В этом отношении экспериментальное исследование протеолитического расщепления белка GAP-43 кальпаином позволит выявить новые аспекты регуляции регенераторной способности клеток ЦНС в условиях развития патологии данного типа.

Цели и задачи исследования.

Цель работы: показать включение кальпаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие аутоиммунных нейродегенеративных процессов на модели ЭАЭ у крыс.

Задачи исследования были сформулированы следующим образом:

3. Исследовать действие ингибитора кальпаина I на выраженность клинических проявлений ЭАЭ.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна работы.

В проведенном исследовании впервые получены данные о включении кальиаиновой системы клеток лимфатических узлов брыжейки и верхних отделов спинного мозга в процесс формирования и развития неиродегенеративной патологии аутоиммунного генеза. Выявлено, что распространенность гиперактивации и сверхэкспрессии ш-кальпаина по различным отделам спинного мозга крыс связана с тяжестью течения ЭАЭ. Впервые показано увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина и нейроспецифического белка ОАР-43 в клетках различных отделов спинного мозга крыс с бессимптомным и легким течением ЭАЭ, а также обнаружено увеличение степени протеолитического расщепления белка рАР-43 кальпаином в клетках различных отделов спинного мозга крыс с тяжелой формой ЭАЭ. Установлено увеличение содержания белка ОАР-43 и его протеолитических фрагментов в ликворе крыс с симптомами ЭАЭ на пике заболевания. Впервые продемонстрировано, что подавление активности кальпаинов с помощью интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина I предотвращает развитие или снижает выраженность ЭАЭ.

Нау^но-практнческое значение полученных результатов.

• 1 - . . > . .1 . , . . >; . .1 .,„.-.

Выявленное в данном исследовании включение кальиаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие ЭАЭ у крыс углубляет представление о физиологических функциях кальпаинов и раскрывает ряд неизвестных ранее звеньев механизма формирования аутоиммунных нейродегенеративных процессов.

Предотвращение развития или снижение выраженности ЭАЭ| у крыс в результате подавления активности кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина I указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаина для лечения аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний и других форм патологии ЦНС, связанных с деструкцией нервных клеток.

Данные о протеолизе белка ОАР-43 под действием кальпаина существенно расширяют и дополняют сложившиеся к настоящему времени представления о механизмах функционирования белка ОАР-43 в условиях развития нейродегенеративного процесса. На основе полученных данных об изменении уровня белка ОАР-43 и его протеолитических фрагментов в ликворе могут быть разработаны новые подходы для диагностики и прогнозирования течения аутоиммунного нейродегенеративного процесса в клинике.

Личный вклад соискателя.

Соискатель проанализировал литературу по теме исследования, осуществил планирование экспериментов и получил основную часть результатов, которые представил в докладах на конференциях и в статьях. Экспериментальная часть исследования полностью выполнена на базе Физиологического Отдела им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН. Индукция ЭАЭ и оценка клинического течения заболевания проводилась совместно с к.б.н. И.Н. Абдурасуловой (Физиологический Отдел им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН) и к.м.н. Ю.Л. Житнухиным (Отдел Иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН).

STI-'Si1- U '»

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. АУТОИММУННЫЙ НЕЙРрДЕГЕНЕРАТИгаЫЙ ПРОЦЕСС И ЕГО МОДЕЛИРОВАНИЕ НА ЖИВОТНЫХ

Как известно, головной мозг обладает частичной иммунной автономией, основы которой закладываются еще в эмбриональный период. В связи с этим попадающие в кровоток из-за нарушения целостности гематрэнцефалическрго барьера (ГЭБ) специфические белки мозга воспринимаются иммунной системой организма как чужеродные, что приводит к образованию аутоантител, способных вызывать повреждение и разрушение клеток центральной нервной системы (ЦНС). Если в результате аутоиммунной атаки происходит поражение нервной ткани, сопровождающееся нарушениями функций различных структур нервной системы, вследствие массовой гибели нервных и глиальных клеток, то говорят о развитии нейродегенеративного процесса аутоиммунного генеза. Необходимость детального изучения этиологии и патогенеза этих форм патологии, разработки эффективных диагностических методов и лекарственных средств стимулировала разработку экспериментальных моделей аутоиммунного нейродегенеративного процесса на лабораторных животных. Наиболее адекватной моделью данного процесса является экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) (Gold et al., 2006).

ЭАЭ может быть индуцирован у различных видов животных (обезьян, морских свинок, кроликов, собак, мышей, крыс, сирийских хомячков, овец, кур) с помощью подкожного введения энцефалитегенных компонентов с полным адъювантом Фрейнда или адоптивным переносом активированных к мозговым антигенам Т-клеток (АП-ЭАЭ) (для обзора Gold et al., 2006). Недавно появились данные о возможности индуцировать так называемое «прицельное» ЭАЭ (П-ЭАЭ) у крыс, в результате которого развивается локальное повреждение спинного мозга. Это достигается путем подкожной инъекции рекомбинантного миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) в полном адъюванте фрейнда с последующим введением провоспалительного цитокина фактора некроза опухолей -а (ФНО-а) в определенный отдел спинного мозга (Kerschensteiner et al., 2004). Разработка такой модели позволяет изучать динамику распространения повреждения, что дает новые возможности для выявления механизмов формирования патологии данного типа.

Аутоаллергические нейродегенеративные заболевания могут индуцироваться нейротропными вирусами - вирусом Theiler's, вирусом мышиного гепатита, вирусом Semliki Forest (Mokhtarian et al., 1994), что свидетельствует о возможной вирусной этиологии подобных форм патологии. В литературе также описаны токсические модели ЭАЭ, в которых наиболее часто используется введение этидиума бромида (Yajima, Suzuki, 1979) и купризона (Blakemore, 1973).

Таким образом, существует несколько видов ЭАЭ, отличающихся способом индукции заболевания, который выбирается исследователями в зависимости от цели эксперимента.

Многочисленные исследования показали, что основные механизмы поражения ЦНС в экспериментальных моделях аутоиммунного энцефаломиелита, сходны с таковыми у пациентов с рассеянным склерозом (PC) (Smith et al., 1999 и мн. др.). У животных с идуцированным ЭАЭ, как и у людей при PC, наблюдается аутоиммунный ответ на компоненты миелина, приводящий к демиелинизации, а затем и к дегенерации аксонов и, в итоге, к гибели нервных клеток; проявляется патологическая цепь событий с развитием парезов, параличей и другими симптомами болезни.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Карпенко, Марина Николаевна

4. ВЫВОДЫ

4. Бессимптомное развитие ЭАЭ сопровождается повышением уровня экспрессии мРНК ОАР-43 в клетках спинного мозга; степень протеолиза белка ОАР-43 сохраняется на уровне контрольного значения. У животных с тяжелым течением заболевания в клетках всех отделов спинного мозга уровень ОАР-43 уменьшается за счет снижения экспрессии мРНК ОАР-43 и увеличения степени протеолитического расщепления ОАР-43 кальпаином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачей современной физиологии является выявление молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в основе физиологических реакций организма на воздействие экзогенных и/или эндогенных патогенных факторов, и причин, обусловливающих переход нормальной реакции в патологическую. Одно из необходимых условий для понимания этих механизмов — поиск новых участников и расширение имеющихся знаний о ферментативных системах и регуляторных белках, вовлекаемых в эти процессы. Выявленное в данном экспериментальном исследовании включение кальпаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие аутоиммунных нейродегенеративных процессов на модели ЭАЭ у крыс дополняет представление о физиологических функциях кальпаинов и уточняет механизмы формирования патологии данного типа, а также открывает новые мишени для фармакологического воздействия с целью лечения нейродегенеративных заболеваний аутоиммунного генеза.

Проведенные исследования показывают включение кальпаиновой системы клеток иммуннокомпетентных органов (в данном случае клеток селезенки и лимфатических узлов брыжейки) уже на начальном этапе развития ЭАЭ. Об этом свидетельствует выявленное нами повышение уровня экспрессии мРНК |1- и т-кальпаина, а также кальпастатина и, кроме этого, изменение уровня протеолитической активности кальпаинов в первые дни после индукции заболевания. Поскольку кальпаиновая система относится к классу внутриклеточных регуляторных протеаз (протеолитическое расщепление кальпаинами своих субстратов приводит к образованию функционально активных молекул), мы полагаем, что активация кальпаинов в условиях развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса имеет важное физиологическое значение. В частности, есть все основания полагать, что кальпаины клеток иммуннокомпетентных органов способствуют миграции активированных энцефалитогенных Т-лимфоцитов из вторичных иммунных органов в ЦНС (см. п. З.2.). По-видимому, повышение уровня

145 экспрессии мРНК кальпастатииа в этих клетках является защитно-приспособительным механизмом, направленным на предотвращение развития воспалительной реакции в ЦНС. Действительно, повышение экспрессии кальпастатина способствует восстановлению базовой активности кальпаинов и, как следствие, вызывает снижение скорости миграции энцефалитогенных Т-лимфоцитов. Однако уже через несколько дней после индукции ЭАЭ мы обнаружили повышение уровня экспрессии мРНК ш-кальпаина и гиперактивацию кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга. При этом на протяжении индуктивной фазы заболевания в других отделах ЦНС дисбаланса экспрессии анализируемых компонентов кальпаиновой системы и повышения уровня активности кальпаинов выявлено не было. Это согласуется с данными литературы и нашими наблюдениями, указывающими на преимущественное повреждение именно поясничного отдела спинного мозга, где уже в индуктивную фазу ЭАЭ выявляются воспалительные инфильтраты и сопряженные с ними области демиелинизации и нейродегенерации (Абдурасулова и др., 2004). Обнаруженное повышение уровня экспрессии кальпаинов и гиперактивация кальпаинов в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс в индуктивную фазу ЭАЭ, вероятнее всего, характерны для резидентных и мигрировавших в ЦНС клеток иммунной системы. В пользу этого предположения свидетельствует показанное нами отсутствие увеличения степени протеолиза кальпаином нейроспецифического белка GAP-43, а также обнаружение в клетках поясничного отдела спинного мозга крыс многократного увеличения уровня экспрессии ц-кальпаина (на 7-й д.п.и.), который в норме в нейронах и клетках глии практически не экспрессируется, но экспрессируется активированными Т-лимфоцитами (Shields et al., 1999а; Schaecher et al., 2002). Одним из субстратов ц-кальпаина является ингибитор транскрипционного фактора NF-kB — белок 1кВ, расщепление которого вызывает перемещение транскрипционного фактора NF-kB из цитозоля в ядро, где он активирует транскрипцию многих генов, в том числе гена индуцибельной NOS, циклооксигеназы-2а, ФНО-а, ИЛ-ip (Ruetten, Thiemermann, 1997). Активация транскрипции этих генов приводит к повышению уровня продукции соответствующих белков, которые вызывают развитие в ЦНС воспалительной реакции (Baumann, Pham-Dinh, 2001). Таким образом, сверхэкспрессия и гиперактивация (х-кальпаина в клетках поясничного отдела спинного мозга может способствовать созданию пермиссивной среды для развития воспалительной реакции в ЦНС.

В поясничном отделе спинного мозга крыс с ЭАЭ уже в индуктивную фазу заболевания детектируется межнуклеосомная деградация ДНК - признак необратимой фазы апоптоза (Das et al., 2008). Следовательно, уже на ранней стадии развития патологии данного типа часть клеток поясничного отдела спинного мозга погибает путем апоптоза (по нашим данным это процесс сопровождается гиперактивацией кальпаинов). Выявленное в данном исследовании повышение уровня экспрессии мРНК GAP-43 свидетельствует о наличии в этом отделе ЦНС регенеративных процессов. Действительно, усиление экспрессии белка GAP-43 во взрослом организме, наблюдаемое после повреждения нейронов и клеток глии, является маркером регенеративных процессов (Coggins, Zwiers, 1991; Oestreicher et al., 1997).

Данные литературы и наши собственные наблюдения показывают, что на пике заболевания клинические проявления ЭАЭ (парезы и параличи конечностей) преимущественно вызваны нейродеструктивными изменениями в ЦНС, поэтому величина клинического индекса на пике ЭАЭ использовалась в качестве показателя степени нейродегенерации. Анализ экспрессии и активности кальпаинов в клетках ЦНС и иммуннокомпетентных органов у животных с различной тяжестью заболевания (степенью нейродеструктивного процесса) в эту фазу ЭАЭ выявил вовлечение в данный процесс только кальпаиновой системы клеток ЦНС. Действительно, в клетках иммуннокомпетентных органов уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы не зависел от тяжести ЭАЭ и не отличался от базового. Повышенная протеолитическая активность кальпаинов отмечалась исключительно в клетках лимфатических узлов брыжейки, причем как у крыс с ЭАЭ, так и у животных, получивших инъекцию ПАФ. Данный факт свидетельствует о вовлечении кальпаиновой системы клеток лимфатических узлов брыжейки на этом этапе развития патологии в неспецифические для ЭАЭ процессы.

Анализ экспрессии мРНК компонентов кальпаиновой системы в клетках ЦНС показал преимущественное вовлечение в процесс развития ЭАЭ т-кальпаина и кальпастатина. Действительно, в клетках ЦНС животных с различной тяжестью течения ЭАЭ обнаружен практически одинаковый уровень экспрессии мРНК |И-кальпаина. Уровень экспрессии мРНК ш-кальпаина и кальпастатина, а также степень активации кальпаинов были связаны с тяжестью течения заболевания: при бессимптомном и легком течении ЭАЭ ни в одном из анализируемых отделов спинного мозга, а также в мозжечке гиперактивации и сверхэкспрессии т-кальпаина не выявлено (в грудном отделе, напротив, обнаружено даже подавление активности кальпаинов); у животных с ЭАЭ средней тяжести в поясничном отделе спинного мозга выявляется сверхэкспрессия т-кальпаина и повышение протеолитической активности кальпаинов; при тяжелой и крайне тяжелой форме заболевания сверхэкспрессия и гиперактивация т-кальпаина наблюдается не только в клетках поясничного отдела, но также в грудном и шейном отделах спинного мозга. В клетках мозжечка ни у одного животного с ЭАЭ гиперактивации кальпаинов выявлено не было. Таким образом, в клетках спинного мозга животных с ЭАЭ наблюдается сверхэкспрессия т-кальпаина и гиперактивация кальпаинов, причем с усилением тяжести течения заболевания повышение протеолитической активности кальпаинов выявляется не только в нижних, но и в верхних отделах спинного мозга. Поскольку в клетках ЦНС животных с ЭАЭ обнаружено повышение экспрессии мРНК т-, но не [д.-кальпаина, по-видимому, наблюдаемое увеличение протеолитической активности кальпаинов в этих клетках в большей степени опосредовано гиперактивацией именно т-кальпаина.

Известно, что кальпастатин является единственным известным на сегодняшний день эндогенным ингибитором кальпаинов, повышение экспрессии которого, как правило, приводит к подавлению протеолитической активности кальпаинов (для обзора Göll et al., 2003). Действительно, анализ уровня экспрессии мРНК кальпастатина и активности кальпаинов в одних и тех же образцах выявил подавление активности кальпаинов при сверхэкспрессии кальпастатина. В этом отношении особый интерес представляет обнаруженное нами увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина в клетках различных отделов спинного мозга крыс с бессимптомным и легким течением ЭАЭ. Вероятно, способность клеток ЦНС некоторых крыс породы Вистар сверхэкспрессировать кальпастатин является одним из факторов, способствующих легкому течению ЭАЭ у этих животных. Таким образом, мы полагаем, что одним из факторов, определяющих тяжесть течения ЭАЭ у крыс породы Вистар, является степень и распространенность сверхэкспрессии, а также гиперактивации кальпаинов клеток ЦНС; способность клеток ЦНС сверхэкспрессировать кальпастатин, напротив, обеспечивает развитие легких форм ЭАЭ.

Выявленное нами распространение гиперактивации и сверхэкспрессии т-кальпаина по различным отделам спинного мозга крыс в зависимости от тяжести течения болезни согласуется с данными о протяженности нейродеструктивных изменений в ЦНС (см п. 3.3.), что позволяет предположить вовлеченность m-кальпаина в процессы инициации гибели нейронов и клеток глии в условиях развития патологии данного типа. Развитие воспалительной реакции сопровождается высвобождением в межклеточную среду провоспалительных цитокинов, лейкотриенов, активных форм кислорода и азота, эйкозаноидов (глутамата, аспартата) и других токсических молекул. Повышение во внеклеточном пространстве концентрации этих веществ вызывает нарушение регуляции гомеостаза различных ионов, в том числе, ионов кальция и приводит к гиперактивации кальпаинов в клетках ЦНС. Активированный кальпаин, в свою очередь, расщепляет кальпаинчувствительные белки (белки клеточной адгезии, белки миелина, некоторые белки клеточного цитоскелета и транскрипционные факторы), вызывая тем самым необратимые повреждения в клетке и в итоге - ее гибель (Göll et al., 2003). Помимо вышеперечисленного, гиперактивация кальпаинов в клетках ЦНС может препятствовать регенерации нервной клетки после ее повреждения, вследствие развития ЭАЭ. Действительно, недавно было показано, что белок GAP-43, сверхэкспрессия которого необходима для успешной регенерации нейронов, является субстратом кальпаина (Захаров и др., 2005). Расщепление белка GAP-43 кальпаином происходит внутри важного функционального домена и, следовательно, нарушает его физиологические функции, что, вероятно, негативно сказывается на регенераторной способности нервных клеток. Полученные нами данные показывают, что гиперактивация кальпаина, наблюдаемая в клетках различных отделов спинного мозга животных с индуцированным ЭАЭ приводит к протеолитическому расщеплению белка GAP-43, причем степень протеолиза GAP-43 кальпаином связана с тяжестью течения ЭАЭ.

Ввиду генетической разнородности крыс породы Вистар, по-видимому, не все животные обладают способностью сверхэкспрессировать белок GAP-43 в ответ на повреждение клеток нервной системы. Мы полагаем, что это является одной из причин развития у крыс породы Вистар ЭАЭ различной тяжести. Так, при бессимптомной и легкой форме заболевания необходимый для успешной регенерации уровень белка GAP-43 в клетках ЦНС поддерживается за счет выявленного нами усиления экспрессии мРНК GAP-43, при этом доля GAP-43-3 сохраняется на уровне контрольного значения. Следовательно, в клетках спинного мозга таких животных возрастает содержание целой молекулы GAP-43, и клетки, вероятно, приобретают способность к регенерации. У животных с тяжелым течением заболевания в клетках всех отделов спинного мозга содержание GAP-43 уменьшается, причем как за счет снижения уровня экспрессии мРНК GAP-43, так и за счет повышения степени протеолитического расщепления ОАР-43 кальпаином с образованием фрагмента ОАР-43-3.

На наш взгляд, экспериментальное подавление активности кальпаиновой системы клеток ЦНС с помощью интраназального введения ингибитора кальпаина I, терапевтическое действие которого было показано в данном исследовании, преимущественно снижало именно степень нейродеструктивных изменений в ЦНС, а также, препятствуя протеолитическому расщеплению белка ОАР-43 кальпаином, способствовало регенерации уже поврежденных клеток. Следует отметить, что выбранный нами интраназальный способ введения препарата позволил использовать низкую концентрацию действующего вещества (1 мкг/животное/день) и тем самым минимизировать нежелательные системные реакции.

Эффективность применения ингибитора кальпаина I, показанная нами на модели ЭАЭ, является дополнительным подтверждением вовлеченности кальпаиновой системы в патогенез нейродегенеративных заболеваний аутоиммунного генеза и указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаинов для клинического применения.

Выявленное в данном исследовании увеличение общего содержания белка ОАР-43 и его молекулярных форм в ликворе крыс с выраженными симптомами ЭАЭ на пике заболевания позволяет рассматривать этот показатель в качестве возможного биомаркера развития патологии данного типа. Однако количество ОАР-43 (и/или его молекулярных форм) в ликворе животных с ЭАЭ продолжает возрастать и в период выздоровления, достигая наибольшего значения при исчезновении видимых клинических проявлений, что осложняет трактовку полученных результатов. По-видимому, наличие высокого уровня белка ОАР-43 и/или его протеолитического фрагмента ОАР-43-3 в СМЖ крыс с ЭАЭ отражает течение двух противоположно направленных процессов: на пике заболевания - дегенерации и в период выздоровления - регенерации нейронов (см. п. З.6.). Мы полагаем, что в результате гибели нейронов путем апоптоза или некроза в СМЖ попадает не только целая молекула белка ОАР-43, но и ОАР-43-3. Регенерация нейронов сопровождается регулируемым процессом секреции белка ОАР-43 или ОАР-43-3. Таким образом, общее содержание белка ОАР-43 и его молекулярных форм в СМЖ крыс с ЭАЭ, вероятно, отражает не только тяжесть, но и фазу течения болезни.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпенко, Марина Николаевна, Санкт-Петербург

1. Ford M.L., Evavold B.D. (2005) Specificity, magnitude, and kinetics of MOG-specific CD8+ T cell responses during experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol. 35(1), 76-85

2. Franco S.J., Iluttenlocher A. (2005) Regulating cell migration: calpains make the cut. J Cell Sci. 118(Pt 17), 3829-38

3. Frey D., Laux T., Xu L., Schneider C., Caroni P. (2000) Shared and unique roles of CAP23 and GAP43 in actin regulation, neurite outgrowth, and anatomical plasticity. J Cell Biol. 149(7), 1443-54

4. Neumar R.W., Xu Y.A., Gada H., Guttmann R.P., Siman R. (2003) Cross-talk between calpain and caspase proteolytic systems during neuronal apoptosis. J Biol Chem. 278(16), 14162-7

5. Biochem Biophys. 130(1), 337-46 Papadopoulos D., Pham-Dinh D., Reynolds R. (2006) Axon loss is responsible for chronic neurological deficit following inflammatory demyelination in the rat. Exp Neurol. 197(2), 373-85

6. Pardridge W.M. (2005) The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2(1),3-14

7. Soc Lond B Biol Sci. 354(1390), 1641-7 Peterson C., Vanderklish P., Seubcrt P., Cotman C., Lynch G. (1991) Increased spectrin proteolysis in fibroblasts from aged and Alzheimer donors. Neurosci Lett. 121(1-2), 239-43

8. Shields D.C., Banik N.L. (1998) Upregulation of calpain activity and expression in experimental allergic encephalomyelitis: a putative role for calpain in demyelination. Brain Res. 794(1), 68-74

9. Smith T., Groom A., Zhu B., Turski L. (2000) Autoimmune encephalomyelitis ameliorated by

10. Tompa P., Emori Y., Sorimachi II., Suzuki K., Fricdrich P. (2001) Domain III of calpain is a ca2+-regulated phospholipid-binding domain. Biochem Biophys Res Commun. 280(5),1333-9

11. Wang K.K., Yuen P.W. (1997) Development and therapeutic potential of calpain inhibitors. Adv Pharmacol. 37, 117-52

Информация о работе

Карпенко, Марина Николаевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс) - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы