Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Восстановление цитохрома Р-450 на поверхности катода и его каталитическая активность и электрохимической системе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Восстановление цитохрома Р-450 на поверхности катода и его каталитическая активность и электрохимической системе"

г- и у

г. 1 ? .' V I.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Институт биологической и медицинской химии

На правах рукописи УДК 377.15.-018.1.-35

РЕМИЗОВ Владимир Александрович

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЦИТ0ХР0КА Р-450 НА ПОВЕРХНОСТИ КАТОДА

И

ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ В ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОМ СИСТЕМЕ

03.00.04 - Биологическая химия '

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1592

Работа выполнена в Институте биологической и медицинской химии Российской академии медицинских наух.

Научный руководитель -

акад. РАМН, проф. Арчаков А.И.

Научный консультант -

д.5.я. Карякин A.B.

Официальные оппоненты:

- доктор химических наук Кузнецов Б.А.

- доктор биологических наук Уваров В.Ю.

Ведущая организация - Институт биоорганической химии Академии наук Беларуси

II . vUOA

Защита диссертации состоится "....." ... .. .......1992 г.

на заседании специализированного ученого ссаета Д.001.10.01 при Институте биологической и медицинской химии РАИН.

Адрес! 113832, Косква, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке.Института

.15

Ааторефэрат разослан •.'«.« . . ГГ___1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук ПАЗЛИХИНА Л.В.

j

J

: ^ СБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКЛ PAoOTU

ЛКТУгЭ.оSНОСТЧ ППОблаКЫ . Фериентн г-шкрссокалькой MOHOOKCUPS-

н.азкой системы С ПИ С > , локализованной l» зндоплаггнатическом ретикулине; ге=:патацитса, ответстоенкы биотраксформвцию целого

рддз гидрофсбнчгх погдинеиий, гезк гн^агенкого, тэк и ггксог^ннсго характера. Интерес к изучения 1ШС, не ослабяааяпий во всем мире гзот уже несколько девятилетий САрчзкон Л.И., 19S3, Va-fcsis at al., 19S01 Archakov and Dacnir.anov3, 1930) , обусловлен, с едкой старое, заменой рольгэ г»той системы н осует^столекии дъггоксици-ругсщей функции ерганиома, я с другой - ' воэг.о:таастып исследовать на примере цитохрома Р-450 и других компонентов монооксигенаэной системы общие принципы механизма функционирования ферментов данного типа.

Одним из па^кнсСших направлений при изучении этой системн, таг. же как и при изучении других сложных многокс^плонентных систем, кплязтея создание упрощенных моделей исследуемого объекта.

Неоднократно-? попытки создать простую систему не<реркекта-типногс пссстанозленип цитохрома Р-450» способную работать п кг*а~:истационарнсм режиме, излпягся характерньи-ги примерами такого подхода :с изучению МКС.

Однако изэетгные до настоящего времени неферментатикные системы восстаногзллнигт цитохрема Р-450 способны работать лис.ь п ах:»;?рабных условиях CLipcocomb et al. , 1976, Sligar et аД.. , 1932>. По этой причине созданные на их основе гидроксилируючие систем« работают г режиме одного каталитического акта, когда сначала происходит восстановление фермента о анаэробных условиях, а затем б систему подают кислород.

!1ссл£гдозе*гсия по катодному восстановления ки крссс. 1ПЛЬ KMX белков,. интенсивно проЕодиасиесг» а конце ?0-х - начале 80-х годоз СКускецсз и сеаэт., 197Э, Лрчаксэз и сочзт., 1931а, Лрчлкоа и ссг?эт. г 19216, Sch-iior- et ¿»Л.. 1977?, так хсе не приколи к согзд£ни*э с л с i гидроксилиросакип, ссноЕггнной' на эл1» ктрохичи-чг?г:ко?? гзосстановл5?кш1 иитохрома Р-450. Дальнсйии-? рабоги о ^»той

области, несмотря на их перспективность, сдерживались отсутстгиек нешых подходоз к решении проблемы.

Таким образом, разработка косых методов неерерментсП'ивного Ср частности электрохимического) восстановления цитохрела Р-450 и исслг£оваки<з каталитической активности данного фермента в таг.шс системах, являются актуальными научными эадсчаки, ре синие которых представит несомненный интерес как в области изучения мехышзггоп функционирования ферментов KMC, так и в области создания биотехнологических систем на основе цитохрома Р-450.

Цель и задачи исслелопзния. Цель настоящего исследовании заключалась в разработке метода элехтрохимичесхсго посстановления цитохрома Р-450, позволяющего ссухцестзлять реакции гидроксилиро-вания субстратов на цитохроне Р-450 в кваэистационарком р&улиме.

Б качестве конкретным задач исследования били еыбраны следующие

1. Разработать экспериментальную установку для изучения процесса электрохимического восстановления цитохрома Р-450, включаюцук» в себя а) герметичную электрохимическую ячейку, встроенную э спектрофотометр и С) систему программных средств для михроЭВЛ, соединенной со спектрофотометром, необходимую для регистрации спектральных изменений, происходящих в исследуемых смесях а процессе электролиза.

2. Исследовать э онаэробнь»х уолоеиях электрохимическое.» восстановление ка ншеелевом катоде а) изолированного цитохрома Р-450 и цитохрома Р-450, находящегося в ссхзтазг» кикросок.

3. Применить систему электрохимического восстановления цитохрома Р-450 для осуществления цитохрон P-450-ззсисимых реакций окисления диметиланолина и анилина.

4. Исследопать возможность проведения реакций гидроксилирования rs системе непрямого электрохимического восстановления цитохрома Р-450 с метилЕиолсгенок в качестве ррдокс-перглосчика.

Наум мая новизна, и практическая зна чимпсть ргбрты. 3 результате проведенных исследований показано, что п анаэробных услсзиях цитохром Р-450 * как изолированный, так и находящийся в составе кихросом, при потенциале -1 В от?». НгСЭ восстанавлисается ка поверхности никелевого квгода. Электрохшгическсе восстановление цитохрсма Р-450 в такой системе сопрсвот^дается инахтипацией гемопротеина.

Однако обнаружить протеханиэ з отсй системе цитохром р-450-эависикой реакции демэтилирования диметиланалина не /далось, что связана в первую очередь сз низкой скоростью прямого электрохимического восстановления цитохрама Р-450.

Использование непрямого Сопосредованного редокс-переносчиком метилвиологеном) электрохимического воссталовления делает

возможным протекание цитохром Р-450-зависимых реакций окисления диметиланалина и анилина в квазистационарном режиме я отсутствии естественных доноров электронов МКС - МЛПРН и НЛГН.

Ряд экспериментов - исключение отдельных компонентов, добаглениэ ингибитора цитохром Р-450-зависикых реакций -доказывают участие цитохрама Р-450 в наблюлз«?кых реакциях.

Полученные результаты демонстрирует способность цитохрома Р-450 аосстпкаслийаться на некодисрицирсвапног* никелевом :сатоде. Креме того результатом работы стала разработка системы непрямого электрохимического восстановления, в которой могут протгкать цитохром Р-450-зависимыэ реакции окисление гидрофобных субстратов. Обе эти системы должны представлять несомненный интерес для широкого круга исследователей, так как , с одной сторона, могут служить инструментом для исследования МГТС Снаприкер, реакций переноса электронов кехеду ое компонентами), а с другой - предлагают новый подход к создания биотехнологических систем, осиазанны/ на цито:грсме Р-450.

Апробпция работы. Основные положения диссертации были далзжен:_г и о6су?<1«?1-сы' ка объединенной научной конференции кафедры бисхикии 2-го ГчОЛГСЕЛ им. V.. И. Пирогопа и лаборатории ?4и кросомаль -

- с -

наго окисления И:-«ститутс физико-химической медицины СМосква, 1988). Апробация работы состоялась ка научной конференции лабораторий Института биологической и медицинской хи;-:ии РАИН СМосква, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ЮС страница:: машинописного текста и состоит иэ введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и обсуждения собственных- исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, иключаицьго IOS ссылок. Диссертация содерхсит 4 таблицы и 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Микросомы выделяли иэ печени беспародньо* кроликов самцов по методу Карузинсй и соавт. С1975). Цитохром Р-450 выделяли иэ михроссм по методу, описанному в той .же работе. Цитохром Ь^ выделяли иэ микросоя по методу Spatz and S-tri/timat/ter С1971).

Автор выражает благодарность сотрудникам препаративной группы кафедры биохимии МЕГ? '2-го МОЛГМК им. Н.И.Пирогова за предоставленные препараты изолированных цитохромоз Р-450 и Ь,_.

Эксперименты по катодному восстановления белков проводились» в электрохимической ячейке, встроенной в спектрофотометр. Келгсд представлял собой полированную никелевую пластину размером 30x9 мм, вибрирующую с частотой 25 Гц и амплитудой 2 мм. Анодом служил хлорсарабряный "электрод, а электродом сравнения - насыщенный каломельный (kadelkis, Венгрия). Стабилизация потенциала катода осуществлялась при помогай разработанного и изготовленного гштсрсг: потенциэстата.

Спектрофотометричесхие измерения проводили на спектрофотометр ркэ DW2 UV-VIS CAminco, США), к которому через еналогосо-цифроаой преобраэоаатель была подключена микроЭБМ "Sailing 11+*. Регистрацию споктроп и кинетических кривых вели h¿ микроЭВП при

помсщи сзазрабат-нкой азтором г.рсг*р«ммы я3р-=св.

Концентрацию цитохрсмэ Р-450 в хикросохах измерили по методу Опига ."гпс! С 1954). Ксчцеектрз.цип =юсстакогзленного иитохрои-з Ь=

иг?:-:орл.<и1 па методу, списанному в ргботэ Кузне? цозух и сочат. С19Т9>.

Хспигзчтраци» ¡рсркальдегидг определили при покоаи реактива НзсЬ СНа^Ь, 1952, с нодипнлсацияки^. Концентрация п-амикосренолз определили по кетоду ШИюп апсд Sart.oreI.iy С1970). Концентрацию электрохимически эосстакоэленнсго метилвиологгн« исгмерчли спектрс^отометрически, испольэуг* коэффициент экстинкции 12,18 си ^ при 604 нм.

Электрохимическое восстановление цитохрзхоз Р-450 и Ь^ проводили з ячейке обьеком 3,5 мл, которая содержала 50 мК калий-срссфа^гый бусрэр, рН 7,4, 150 мМ хлсрид калия, 1000 ЕД/мл каталазы, 100 ЕД/мл глгагсозааксидаэы, 90 мИ В-глюкозу и либо 0,5 мкК изолированного цитохрома р-450, либо 200 мкл макросом, либо 2,2 мкН детергентного цитохрома Ь^. Восстановление зели при потенциале катода -1 В отк. Н1СЭ при комнатной С20+2°С) температуре в анаэробных условиях.

Опыты по гидроксилирозанио проводили в кгспоте объемом 3 мл, которая содерэ:сала растзоренные в 50 кМ калий-<росфс»тком буфере СрН 7,4), 150 мМ хлорид калия, 2,2 мкМ цитохрок Р-450 кикросом, 230 мкМ кетилвиолагеи и 2,5 мМ диметиланилин или анилин С если не указано инача) . Потенциал катода подлер>;сизали равным -1 3 отк. Н1СЭ при температуре +37°С. Бремя проведения реакции - 30 минут или указано на рисунках.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Конструирование» рдрке^ти ч нпй электрохимической я^ики

Цитсхрсм Р-450 является' аутооксидабольнь'м белком СЕсЬаЬгоок а1. , 1^8, ЬхресстЬ .-=1 а1 . г 1975). Поэтспу невозможно точно измерить скорость яга насстаноэлстнигг на ¿атоде *з присутствии

- В -

кислорода. Кроме того, при потенциалах катода нихсе -0,6 В отн. НКЭ наминается восстановление ыолэкулярного кислорода на катоде, на которое расходуется значительная часть тока, протекаюоего через рпствор. . .

В связи с этим, изучение процесса электрохимического восстановления цитохрока Р-450 мы начали с создания экспериментальной установки - герметичной электрохимической ячейки, оборудованной системой продувки инертным газам.

На рисунке 1 представлена схема -разработанной и изготовленной нами герметичной электрохимической ячейки.

Рисунок 1. Схема герметичной электрохимической ячейки (разрез, вид со стороны ФЭУ спектрофотометра)

I — вывод хлорсеребряного электрода, 2 — вывод каломельного электрода, 3 — каломельный электрод, 4 — хлсрсеребряный електрод, 5 — фторопластовая изолирующая □ставка, £> — держатель электродов, 7 - гкэдвеска катода (никелгаак проволока), 8 — оптическая ккаста, 9 -кюеетсдграатель спектрофотометра, 10 — никелевый катод,

II — герметизация (пластилин), 12 — фиксатор «гатода, 13 — экснеигрик, 14 — электродвигатель, 15 — г-сройчатая пружина, 1(л — вывод катода.

Реакционной камерой ячейки служит стандартная спектрофотомгт рическая кивета. Эта хизвта помещается з киветодерхсатель спектрофотометра Ат±псо Сверху на к ювето держатель

устанавливается стальной держатель электродов * имекзиий специальный прямоугольный вьгрез для оерязагй, аьлгтупающей из ккшетодерлсателя, части кюветы.

В держателе электродов над кюэетой запрессована теерлоновая вставка, имеющая четыре отверстия* два диаметром 4 мх для кплсмельного и хлорсеребрянсго электродов и дэз диаметром 1 км -едно для никелевой проволоки, к которой приварен точечной сваркой никелевый электрод, а другое - для трубки, через которуа кхшету можно продувать инертным газом или монооксидом углерода.

Никелевый электрод через проволоку, на которой он подвешен, снаружи закреплен на конце коробчатой пружины, другой конец которой зафиксирован на держателе электродов. Вибрация никелевого электрода осуществляется путем воздействия нз пружину эксцентрика, насаженного на вал электродвигателя.

Для того, чтобы оценить соответствие реальней конструкции предъявляемым к ней требованиям, мы использовали а качестве индикатора присутствия кислорода з электрохимической ячейке рэакциго окисления электрохимически генерируемого катион-радикала метилЕиологена, имеющего значительное сродство к кислороду.

Испытания описанной выше конструкции показали, что после ЗО-.чинутной продувки коаеты очищенным от кислорода азотом» скорость окисления катион-радикала мстилвиологена составляла всего 0,17 мкМ/мин, что на 2 порядка ниже соответствующего показателя для системы, аналогичной той, которую использовали наси предшественники САрчзкоз и соазт., 1931, Кузнецов и соавт., 1979^.

Зя^стт^охщгццдсгсод пргтетд но я л дни е изолигуэ^антагп иитохрзма Р--350

На рисунке 2 сплошной линией представлег^ кривая восстановление; иитсхрома Р-450 при потенциал:? катода -1 13 отн. НКЭ.

Оптическая плотность при 4Ы) гаг

о' 20

40 60 ЕО

Вреия (ыкк)

Рисунок 2. Кинетическая криз а г: электрохимического восстановлений изолированного цитохоома Р-450

— Стрелкой показан номент включения потенииалз. Пунктиром показана алроксимация экспериментальных данных зкелонентой.

Кинетическая кривая восстановления достаточно хорла Сс коэффициентом корреляции 0,953 апроксинируется экспонентой, которая на рисунке 2 показана пунктиром. По апрохеимирулкей кривой нояно определить начальную сксрость реакции восстановления, которая с данном случае составляла 4,9 нК/мин.

Дифференциальный спектр поглоаеник продукта электрохимического восстановления цитохрома Р-450 после 80-и минутного электролиза в присутствии нонооксида углерода представлен на рисунке 3. Ка::синуя оптической плотности при 450 им, характерный, для СО-комплекса восстановленного цито;<ро!;а Р-450, свидетельствует о присутствии последнего в инкуйациоигай среде. Концентрация восстановленного цитохрома Р-450 составляет 0,19 нхК или 41Х от исходной концентрации. Наличие полосы поглоаекия при <20 ни говорит о присутствии в инку&ацискиой снеси такжо продукта

инпктиаации цитохрома Р-450 - цитсхро.ча Р-420.

Сптичгсгсая плотг;остг>

-0.01

/\

/ \

■ / \

/

У

100 420 440 '160 420 500 Длина золим (ни)

Рисунок 3. Дифференциальный спектр поглощения продукта электрохимического засстансзления цитахрома Р—450 (в присутствии монооксида углерода)

Восстановление вели при потенциала —1Г5 в точение 80 г.инут.

Электрохимическое восстанозлдние цитохрома Р—450, находящегося в составе микгосом

Обнаружив способность изолированного цитохрома Р-450 восстанавливаться на катода, мы переали к изучении я электрохимической системе иитохрама Р-450, находящегося з составе хикросом.

Цитохрсм Р-450, находящийся э составе никросом» так >*:э как и и:>алирсэ?чккь:й, оьгт'и восстановлен ка £шке/еяом катоде.

На рисуккс 4 придстэБлегга кинетическая тсривэя хзпсстамозлекия ::ик"росог:а./"2-кого цитгахрома F--450. По cinpcKCU?fLipy7JUJeú кинетическую •cpi'gyo эксг.очскте» ксхко рассчитать к:?чальнуг> скорссть репкиии,

которая составляет в данной случае 4.3 нМ/мин.

Оптическая плотность при 450 ни

40 60 80 100 Время (шш)

Рисунок 4. Кинаткческая криоая электрохимического восстановления цитохрома Р-450 в микросомах.

Крестиками показаны экспериментальное данный, сплошная линия показывает апроксимацию экспериментальных данмых экспонентой.

На рисунке 5 представлены дифференциальные спектры поглощения продукта электролиза иикросон через 20, 40 и £0 кинут после включения потенциала -1 В отн. НКЭ (кривые А, Б и В соответственно). Электролиз проводили в присутствии лонооксида углерода в анаэробных условиях. На кривой Г представлен спехтр поглощения продукта довосстакавления инкубационной смеси дитиониюм натрия. Характерный спектральный пик при 450 нм доказывает присутствие с инкубационной смеси восстановленного цито>;рона Р-450.

Второй пик на этих спехтрая Св области 410 - 430 нн) может свидетельствовать о присутствии в инкубационной среде либо электрохимически восстановленного цитохрома С содержащегося

наряду с цитсхронсм Р-450 в микросонах), либо инактивирозаннаго цитокрома Р-450 (в форме цитохрома р-4205, либо, что наийолес

вероятна, и того, и другого одновременно.

Способность цитохрома Ь^ восстанавливаться на катоде при потенциалах ниже* -1 В отн. НКЭ била показана Кузнецовых и соавт. еи*е,з 1979 г.

0.4

Оптическая плотность

-0.4

г А

/

У /г

400

440 460 <30 500 Длина волпы (нм)

Рисуно«с 5. Дифференциальный спе?стр поглощения продукта электролиза никросом (а присутствии монооксида углерода)

А, Б, и В — соответственно через 20,40 и 60 минут после вьсяючекия потенциала, Г — та же проба, доаасстанов— ленная дитионитон нг'.трия-

В наших условиях восстановление цитохро«еа Ь^ протекало со скоростью 0,55 мкН/мин. Из рисунка 6 видно, что менее, чем через 10 минут после начала электролиза концентрация восстановленного цитохрома Ьд выходит на стационарный уровень, составляющий около 95 % от обчей концентрации цитохрска Ь^- Следовательно, в эксперименте, результаты которого были^предстголеня на рисунке 5, цитохром Ь^ к. 20 минутам элэктролиза долзссн восстановиться практически полностью.

0.2

Исходя из отого допущения, можно считать, что спо::тр поглоцекип СО-кемплакса продукта ка70ДН0Г0 восстановления цитохроча Р-450 к никросонах должен представлять собой разность спектров продукта элехтрохиничосхого' восстановления никросон в присутствии нснсохсида углерода и и его отсутствии.

Вреиа (иин)

Рисунок 6. Кинетическая кризая электрохимического восстановления цитохрома Ь«. в мигсросомах.

Стрелкой указан момент включения потенциала.

РазраЬотанная нами программа "Spec" позволила произвести такое преобразование спектров. Результат вычитания вместе с исходными спектргии представлен на рисунхе 7.

На рисунке видно, что пик в области 410 - 430 ни реальна включает в себя не только пик 424 нм, характерный для восстановленного цитохрока Ьц, но тгкхе и полосу поглощения около 420 нм, свидотельствуищую о процессе инактивации цитохрогш Р-450 в ходе электролиза, о его перехода в неактивную форму цитохром Р-420.

Длина волны (ни)

Рисунок 7. А - дифференциальный спектр поглощения продукта АО минутного элз:строхимимеского тзосстановлгния микроссм в присутствии монооксида углерода, Б — то за, в отсутствии мснооксида углерода, В - разность спе!Ктроз А и

Начальная скорость поссганозления цитохрома Р-450 составила 43 нМ/мин, что в Б, 7 раз больше скорости восстановления изолированного цитохрома Р-450. Такое повысение скорости реакции катодного восстаноылзния цитохрома Р-450, находящегося в составе микроссм, по сравнению с изолированным цитохромом, нельзя объяснить лить разницей концентраций их в инкубационной среда, так как дамн соотношение припзденных к концентрациям скоростей их восстановления составляет 2,3 раза. По-видимому, входячий в состав макросом цито>сром Ь<_ в данном случае служит

р^докс-перэкосчихом ке:кду катодом и цитохромом Р-450 и тем езкнм способствует ус.тор^нию реакции электрохимического восстановления цитохрома р-450.

Гцдроксилазная активность цитохрома Р-450 в системе pro прямого катодного посстаноолекия

Убедившись о ток, что цитохрам Р-450 способен восстанавливаться на никелевом катоде, ми перешли к изучению его гидраксилаэной активности в электрохимической система, испсльэовав н качестве субстрата диметиланилин - субстрат первого типа.

При изучении гидрсксилазной активности цитохрома Р-450 И электрохимической системе схака экспериментальной установки была изменена так, чтобы обеспечить свободный доступ в инкубационную ячейку кислорода воздуха, без которого реакции окисления, катализируемые цитохромом Р-450, невезмояшы.

В таблице 1 предстаэлены концентрации формальдегида в инкубационной среде к концу 30-минутного электролиза трех систем - не содержащей цитохрок Р-450, содержащей изолированный фермент и содержащей микросоны. Из представленных■результатов видно, что в электрохимической системе образуется лиаиь незначительное (сравнимое с концентрацией фермента) количество формальдегида. Разница между специфической Сто есть а присутствии изолированного цитохрома Р-450) и неспецифической Скогда электролизу подвергался раствор субстрата в буфере) реакциями недостоверна.

При использовании н ■ электрохимической системе цитохрома Р-450, находящегося в составе кикросом, концентрация формальдегида, образовавшегося в ферментативной реакции . превышает концентрацию формальдегида, образовавшегося с не^еркентативной реакции всего на 50 % и, за вычетом последней, составляет 0,02 каталитических акта на молекулу фермента в минуту или всего 0,6 каталитического акта на молекулу фермента за всю реакции. Таким образом, активность фермента о системе его прямого электрохимического восстановления по крайней мера на 2 перядка ниже, чем в

реакции, инициируемой добавлением NADPH С2,27 каталитических акта

I

нз молекулу фермента в нинуту).

Таблица 1. Концентрация формальдегида, образовавшегося за 30 минут в электрохимической системе, Н5 содержащей ни 2 кок о леку .л яр них редокс—переносчиков.

Условия проведение опыта

Концентрация цитохрома Р—450 (м-сМ)

Концентрация формальдегида (мк*1)

Без цитохрома Р-450

С изолированным . цитохромом Р—450

С цитохромом Р-450 в составе микросом

0

1

2,2

2,3+0,2 2,8+0,5

3,6±0,сз

Полученные результаты не представляются неожиданными, если сравнить их с описанными выае результатами по катодному восстановлен изо цитсхрс:'п Р-450. Скорость зосстановления цитохрома Р-450, дзусэ находящегося з составе макросом, составляла всего 0,043 ккМ/мин, или 1,3 мкК за те 30 минут, в течение которых проводилась реакция гидроксилироэиния. Последняя цифра достаточно близко совпадает с величиной концентрации продукта реакции гидроксилирования.

Гидроксилгэзная активность цитохрома Р-450 д системе его непрямого электрохимического восстановления

Псказав таким образом невозможность осуществлять с достаточной скорость» реакции гидроксилирования субстратов на цитохроме Р-450, восстановленном непосредственно на никелевом катоде, было решено заменить•прямое катодное восстановление на непрямое, использоваз в качестве редокс-переносчика метилвиоло-ген.

^заестно, > что при потенциалах низхо -0,75 В, отн * НКЭ, мстилзиологен претерпезает одноэлектронное восстановление,

образуя при этой катисн-р^дикал. Этот катион-радикал способен восстанавливать очень многие соединения, имегэ-дие. более высокий, чем он, потенциал восстановления, а том числе и цитохром Р-450.

Нами была зарегистрирована разность спактроа поглощения продукта 10-минутного электролиза прабы, содержащей микросомы ' и кгтиляиологен, и тсй жв пробы, ко через которую после окон*;акия электролиза в течение одной кинуты пропускали монооксид углерода. Полученный таким образам спектр поглощения комплекса цитсхрама Р-450 и монооксида углерод» Срисунок 3), во-пэрыых, докасызаат, что в данной система происходит электрохимическое аосстанозлегнис-цитохрама Р-450, а, во-втерых, позволяет оценить скорость стога

400 420 440 460 480 500

Длина волны (нм)

Рксунок О. Дифференциальный спектр поглощения СО-комплекса • ».итохро^а Р—450, восстановленного ¿электрохимически в пр^сутстоии нетилзиалогсна-

Босстано^л^н'^с вели в 10 минут. На рисунке

предст£*.слен:а разность спегстрсп поглощения продукта гглегстро^имичаскогс ао .и • после

пропускания через ^нкубац^ом^/^э смесь ^снооксида уг.пс:рс<£»а.

процесса. Так как электролиз проводился з течение 10 минут, конечная концентрации восстановленного цитсхрома Р-4?0 при этом составила 2,09 мкИ, то скорость восстановления была больше или рав:»а 0,2 мк?!/>:ин.- Таким образом, непрямое электрохимическое Ессстаковлские цитохрома Р-4!50 протекает по крайней мере в 4,3 рааа "6ь'стре.е, чем прл.чос и, кап мок>:о предположить, должно быть более гф^ективхс £ гидроксилиэузссщх системах.

Длп тестиросанил гидрпксилазной активности цитохрсма р-450 в системе его непрямого электрохимического восстановления, так как и для тестирования системы его прямого катодного зпостановление: , а качестве субстрата был использован диметилакилин.

На рисунке 9 представлена зависимость концентрации образовавшегося с электрохимической системе формальдегида от времени инкубации. Яэ кривей, представленной па рисунке видно, что после 30 минут инкубации накопления поодукта практически не происходит. Так как рН среды к этому хсе времени существенно сдаигасэтся в щелочнуя сторону, а цитохром Р-450 в значительной мере инактиэируется, была репеко в дальнейших экспериментах раа^ци» гидроксилирсвчнип проводить в течение 30 кинут.

Время (иии)

Рисунок: 9. Най^оление формалъдэгида при злс»стролизе смеси, сар.ермащ'гй микросому, диметиланидин и метилаиалогсч.

Для выяснения роли цитохрома Р-4.50 в процессе окисления д им ет ила нилина в электрохимической ячейке был поставлен р^д контрольных опытов.

Из таблицы 2 видно, что в отсутствие одного иэ элементов искусственной цепи переноса электронов Сто есть, " электрода с потенциалом -1В отн. НКЭ, метилвиологена или цитохромгл Р-450) гидроксилирование не наблюдается. Снижение' выхода продукта в присутствии ингибитора цитохрома Р-450 £КР-525а свидетельствует об участии данного гемопротеина в реакции денетилирования.

Таблица 2.

Количество формальдегида, образующегося в алектрохимической системе за 30 минут.

Полная система 40^8 мкМ

Без ми!Сросом 2,1+0,21 икМ

Без метилаиолпгена 3,&£0,£» мкМ

При потенциале ~0,3 В отн. Н*СЭ 4+0,5 мкМ

В присутствии 1мМ 5КР-525а 24+4 мкМ

Без диметиланилина 18+2 мкМ

Для того, что бы исключить притекание реакиии деметилирования по гидраперехисному- механизму за сч,зт перекиси 'водорода, образующейся . при окислении катион - радикала метилвиологена кислородом, в среду инкубации была добавлена каталаса. Поскольку каталаза - гемсодержащий фермент, нельзя было исключить, что в электрохимической ячейке протекает инактивация фермента, связанная с восстановлением *сзлеза гема каталаэы кетилпиологеном или на электроде.

Поэтому мы контролировали каталасную активность в терние хода реакции и вьысиили, что к 30 минутам инкубации сохраняете« до 10 'А ее первоначальной актизкости» Однако даже такой

каталазнои активности оказалось достаточно для того, чтобы концентрация перекиси водорода в среде инкубации не превышала 3 мгМ, что примерно на 3 порядка менъае той концентрации экзогенной перекиси водорода, при которой уже не удается наблюдать на цитохроме Р-450 гидраперекисъ-зависикые реакции гидроксилироза-ния.

Вибор :<етилриологена в качестве переносчика электроноэ бил основан на предположении о ег-о малом сродстве к каталитическому центру цитохрома Р-450. Такое предположение базировалось на установленном нами факте отсутствия реакции деметилирования метилаиологена цитохрояом Р-450 никросом э присутствии МАСРН.

Однако о электрохимической системе образование формальдегида идет и а отсутствие дикетиланилина, когда единственным субстратом реакции деметилирования мож^т быть метилвиологен. Количество образовавшегося при этой формальдегида составляет до 50 54 от количества, образовавшегося а системе с диметиланилинон Сем. таблицу 2Э. При этом нельзя исключить возможность того, что увеличение выхода продукта в системе, содержащей диметилзнилин, связано не с окислением этого субстрата, а окислением самого р*?яокс-переносчика мэтилзиологена.

Для того, чтобы исключить вклад продуктов окисления рздокс-перекссчика в исследуемую реакцию, в наших дальнейших экспериментах был использован другой субстрат - анилин -продуктом реакции окисления которого является - не формальдегид, как у метилЕиологена и диметиланилина, а п-аминофенол.

Результаты экспериментов по окислению анилина в электрохимической системе представлены в таблице 3. Концентрация образовавшегося в электрохимической системе п-аминофенола -продукта гидроксилирования анилина - существенно ниже, чем концентрация формальдегидз,• образовавшегося в аналогичной системе•

Однако подобное соотношение наблюдается и в случае ВДИРН -зависимого гидроксилирования. Кроме того, количество

п-смиксфзнола, образаяаошегося б системе, содержащей «зсьэ р^»докс цепь - электрод с потенциалам -1 В отк. Н5СЗ, метилзиологеп и цитохрок Р-450, значительно иышсг? чем в контрольных опытах. Таким образом па крайней мере» а случае да! ¿кого субстрата всзиожиу реакция гидроксилирования, катализируемая цитсжрог.ом Р-450, восстановленным электрохимически б присутствии метилсиологена.

Таблица 3.

Образование п—аминосенсла а алеклрохим'^ческай системе с цигокромом Р-450,

Полная система Без микросам Бея анилина

2,1+0,3 мкг1 0,6+0,2 мкМ 0,2+0,2 мкМ

пывады

1. Цитохрсм Р-450 , кнк изолированный, так и находящийся в составе микросом, восстанаолигпется на никелевой катоде и анаэробных услепипх при потенциале катода -1В отн. НКЭ.

2. В системе* прямого электрохимического эосстанозлсния цитохрома Р-450 его ги^.роксилпзная активность Сна примере диметиланилина п качсг-стсе стубстрата) не обнаружена.

3. Использование нетилвиолзгена в качества редокс-першгасчика между катодом и цитохромом Р-450 пезэоляет ускорить эосгстановление последнего более, чем з 3 раз»а по сраэненип с прямым катодным восстановлением.

4. В системе непрямого Сс у^астие-м редокс-переносчика метилзиологена) электрохимического восстановления цитохрома Р-450 могут г.оотекать реакции деметилироэания диметиланилина и гидроксилировзния анилина. Наблюдаемые реакции протекают с участием цитохрома Р-450 и ингибируютсл его специфическим ингибитором 5KF-525a.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. " В.А.Ремизов, - А.И.Арчакон, А.В.Карякин, Н. А. Еьсзоаа, Оксигенаэная активность иитохрома Р-450, восстановленного электрохимически в присутствии мстилвиалогэна // Биохимия, Т. 55, С.37-42, 1990.

2. Ремизов В.А., Карякин А.В. , . Испал>»зог;ание белковых редокс-переносчиков для переноса электронов с никелевого катода на цитохром Р-450 // Сборник тезисов V Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялте, 10-15 ноября 1989, С. 147.

3. Re;.iizov, V. А., Karyakin, А. V. , Nickel cathode as a sourse of electrons in cytochrome P-450 dependent hydrodilation reactions // Abstracts of 7th International Conference "Biochemistry 8 Biophysics of Cytochrome P-450; Structure S Function, Biotechnological S Ecological Aspects", Moscow, August 4-9, 1991, P. 127.

4. Remizov, V. A. , Karyakin, A. V. , Nickel cathode as a sourse of electrons in cytochrome P-450 dependent hydroxilation reactions // in! Cytochrome P-450I Biochemistry and Biophysics, Proceedings of 7th International Conference "Biochemistry £ Biophysics of Cytochrome P-450; "Structure Б Function, Biotechnolcgicr.l £ Hcological Aspects* , Moscow, August 4-9, IS;91,eds. Archakov, A.X., Bachmanova, G.X. , ItlCQ-TKC Joint -Stoclc company, Mosccs, Russia, 1992. P. £23.