Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Воспроизведение информации мозгом. Механизмы нарушений при фармакологических воздействиях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Воспроизведение информации мозгом. Механизмы нарушений при фармакологических воздействиях"

[ Г о С .1

На правах рукописи УДК 557.25; 557.35

АРХИПОВ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ИНФОРМАЦИИ МОЗГОМ. МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЙ ПРИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.

03.0Q.Q2- Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Пущина 1997

¡М7

Работа выполнена в Институте Теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино Московской области.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор

. О.С. Виноградова доктор биологических наук,

В.И. Новоселов чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор

К.С. Раевский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимической физики РАН им. М.Н. Эмануэля, г. Москва

Защита состоится " 2-3 " О/Н-рдЦ 1997 г. в {3 часов на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино Московской области, проспект Науки, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН (г. Пущино, ИТЭБ РАН).

Автореферат разослан 1997 года.

Ученый секретарь I »

диссертационного совета, , /// {' * П. А. Нелипович

кандидат биологических наук "Т/Х^- ¿¿С0Сс^-^г '

//

/)

- Л

и Общая характеристика работы.

.1 Актуальность проблемы.

Нейрологическая память образует исключительную по сложности истему, включающую все уровни организации мозга - от целостного до юлекулярного. При этом на разных уровнях память представляет собой цепь еоднородных динамических процессов, определяя структурно-функциональные базовые механизмы важнейшей способности мозга -оспринимать, фиксировать и воспроизводить информацию Настоящая работа освящена исследованию одного из этапов информационных процессов, ротекающих в мозге - процесса воспроизведения следов памяти (энграмм), зторые, несомненно, заслуживают постоянного внимания и осмысления с «том новых экспериментальных результатов. При этом наряду с налитическим подходом, позволяющим углубить понимание клеточных и олекулярных механизмов воспроизведения, необходимы усилия, зправленные на синтез полученных фактов, исследование их значимости для эятельности нервной системы в целом. Прямолинейный редукционизм грозит ратой в ходе исследования качественной специфики процессов памяти, вот )чему изучение элементарных механизмов должно быть ориентировано на ¡постное понимание этой функции мозга.

Изучение фундаментальных механизмов нарушений воспроизведения 1едов памяти приобретает особую актуальность ввиду постоянного роста во ем мире числа заболеваний, одним из ведущих симптомов которых является сфункция памяти. Возможными причинами такого роста могут быть епичение числа сосудистых заболеваний, мозговые травмы, старение селения /см Шабанов, Бородкин, 1989/, что вызывает потребность в тальном изучении информационных процессов, протекающих в мозге в рме и в условиях патологии, ! Цель и задачи исследования.

Успехи изучения фундаментальных основ памяти во многом эеделяются разработкой адекватных моделей для изучения молекулярно-гточных процессов, с однозначной характеристикой функциональных эушений конкретных форм памяти. Среди важных проблем можно выделить

установление стуктурно-функциональных взаимоотношений в мозге на разны; этапах формирования, хранения и воспроизведения энграммы, в том числе исследование процессов селекции, оценки, поведенческого выражения следо! долговременной памяти.

рсновной целью диссертационной работы является выявление и изучена основных закономерностей нарушений воспроизведения информации мозгов позволяющих углубить понимание механизмов воспроизведения следо долговременной памяти, Основные задачи исследования:

1. Изучение типов нарушений долговременной памяти при фармакологически воздействиях.

2. Поиск оптимальной экспериментальной модели селективных нарушени воспроизведения информации мозгом. Исследование явления диссоциаци памяти с точки зрения возможностей использования этого феномена дг изучения механизмов воспроизведения следов долговременной памяти.

3. Изучение энергетического метабрлизма в отдельных структурах мозга пр нарушении воспроизведения следов памяти.

4. Изучение молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в осное функциональных состояний мозга, воспроизведение информации в которь нарушено.

5. Исследование возможности вовлечения генетических процессов механизмы действия фармакологических агентов, нарушающ! воспроизведение информации мозгом.

1.3 Научная новизна работы

• В работе впервые было применено явление диссоциации памяти д. анализа воспроизведения мозгом информации.

• Впервые выявлено значение декларативной (эксплицитной) формы памя™ механизмах диссоциации памяти, отмечена ключевая роль гиппокампа процессе возникновения диссоциированного состояния мозга к селективного нарушения воспроизведения информации.

• Впервые получены экспериментальные результаты, характеризуют молекулярно-клеточные процессы мозга при возникновен диссоциированных состояний: регуляция активности холинергической ГАМК-ергической медиаторных систем, энергетический метаболизм

отдельных структурах, транспортные процессы и фосфорилирование белков в синаптических мембранах, метилирование ДНК в клетках мозга. Показано вовлечение каскада молекулярно-клеточных процессов, включая геном, в ответ на воздействие, приводящее к нарушению воспроизведения информации.

1.4 Теоретическое и практическое значение работы.

Одной из главных целей исследования процессов памяти в жспериментах на животных является поиск базовых механизмов запоминания 1 воспроизведения информации для разработки способов предотвращения и :оррекции различных форм амнезий у человека. Моделирование дисфункций шмяти человека в экспериментах на животных в последнее время получило гавый импульс в связи с успехами в понимании природы ряда заболеваний, ¡атрагивающих процессы памяти, таких как болезнь Альцгеймера. Сорсаковский синдром и др /Advokat, Pellegrin, 1992: Dickson, Vanderwolf, 1990; îamzu, 1985/. Некоторые практические результаты фундаментальных юследований в этой области связаны с фармакотерапией.

Принципы извлечения информации мозгом представляют несомненный |нтерес и при создании технических информационных систем. Несмотря на 1алую ценность прямых аналогий между функционированием искусственных и ютественных информационных систем, неисчерпаемое богатство типов вязей, тонкой координированное™ сложных процессов, протекающих в мозге, юразительная пластичность и компенсаторные возможности этого самого ложного из органов живого организма будет всегда служить источником новых |ешений при теоретических разработках и конструировании различных ехнических комплексов. .5 Положения, выносимые на защиту.

Работа представляет собой первое изучение селективного нарушения оспроизведения информации при использовании феномена диссоциации амяти. На защиту выносятся: Результаты использования диссоциированных состояний мозга в качестве модели селективного нарушения воспроизведения информации. Результаты фармакологического анализа механизмов нарушения воспроизведения информации.

• Результаты изучения энергетического метаболизма неокортекса и гиппокампа при нарушении воспроизведения следов долговременной памяти.

« Результаты изучения мопекулярно-клеточных механизмов длительно продолжающегося нарушения воспроизведения информации, возникающего в ответ на введение карбахолина в гиппокамп: свойств синаптически> мембран, фосфорилирования синаптических белков. ® Результаты изучения метилирования ДНК мозга при фармакологичес^

вызванных нарушениях воспроизведения следов долговременной памяти. 1.6 Апробация работы и публикации.

Результаты исследований, вошедшие в диссертацию, представлялись на:

• семинарах Лаборатории структуры и функции синапсов ИБФ АН СССР ь Группы по изучению механизмов синаптической передачи ИТЭБ РАН;

• заседаниях Пущинского отделения Физиологического общества;

• Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов (Москва, 1976, 1990),

• Всесоюзном семинаре по развитию общей теории функциональных систем (Москва, 1978),

• IV Всесоюзной конференции "Память и следовые процессы" (Пущино, 1979);

• Всесоюзном симпозиуме "Нейрохимические механизмы регуляции памяти" (Пущино, 1984);

• XXVII совещание по проблемам высшей нервной деятельности (Ленинград, 1984),

• X Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы (Горький, 1987);

• Всесоюзной конференции "Сравнительная физиология высшей нервно! деятельности человека и животных" (Москва, 1988);

• НГВсесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1989);

• Симпозиуме "Signal molecules and mechanisms of animal behavior" (Пущине 1989);

• IX Международном нейробиологическом симпозиуме "Learning and memory synaptic and systemic views" (Магдебург, 1995).

• Международном симпозиуме "Learning and memory". (Cold Spring Harbc Laboratory. 1996).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 работа, в том числе 4 обзора в центральных журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 2}§ страница машинописного текста и состоит из "Введения", "Обзора литературы", описанй экспериментальных исследований, состоящего из восьми глав, "Общег обсуждения результатов исследований", "Выводов", "Материалов и методов", списке литературы содержится 400 наименований. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 11 таблицами.

Благодарности.

Представленная работа была начата в Лаборатории структуры и функции синапсов Института биологической физики АН СССР (зав. Лаб. проф. А.Ю.Буданцев), весь дружный коллектив которой искренне благодарю за постоянную поддержку и помощь. Особую признательность выражаю моему первому научному руководителю и учителю А.А. Азарашвили, а также соавторам и коллегам, с которыми посчастливилось сотрудничать на разных этапах выполнения представленной работы: Г.В. Архиповой (ИХФ РАН), А.Ю. Буданцеву (ИТЭБ РАН), АД. Жариковой (ИБКРАН), И.Б. Федотовой (МГУ), Т.Г. Щипакиной (ИТЭБ РАН), а также В. Шлектареву за помощь при сканировании гелей.

Искренне благодарен за обсуждение нейробиологических проблем и полезные советы в работе В.Безлепкину, Л.В. Бочаровой, О.С. Виноградовой, О.В. Годухину, Р.Я. Гордон, В.А. Иванову, Д. Овертону (США). Часть работы выполнена при поддержке: РФФИ № 96-04-48142. и ИЧТАЭ 933269.

2. Воспроизведение следов долговременной памяти как один из этапов информационных процессов.

Результаты многолетних исследований привели к представлению о нейрологической памяти как о сложной, активной многокомпонентной функциональной системе, которая объединяет ряд последовательных стадий, реализующихся на разных уровнях организации нервной системы. Структурно-функциональной основой следов долговременной памяти, по-видимому, служит система межнейрональных взаимодействий, в обеспечении которых принимают участие сложнейшие нейрохимические и генетические процессы. Детальные механизмы хранения следов долговременной памяти (энграмм), к настоящему времени неизвестны, однако установлено, что они широко распределены по мозгу и организованы на разных структурных уровнях нервной системы: молекулярном, мембранном, синаптическом, клеточном, клеточных популяций. Формирование памяти и ее воспроизведение включает в гебя несколько разнородных процессов, не прекращающихся и после непосредственного "ввода" информации. Одним из доказательств существования разных стадий обучения и памяти служит возможность избирательного влияния на них при помощи фармакологических или иных зоздействий на мозг (Рис.2-1).

Минуты,часы

ОБУЧЕНИЕ I ПЕРИОД ПОСЛЕ ОБУЧЕНИЯ

5

Часы, дни, месяцы

консолидации

Подвержено влияиию мши их

центрально и периферически действующих агентов

ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ]

хранение

Нарушается некогорм мм центрально действующими агентами. ' >111

Изменяется под влиянием многих иентралыю и периферически действующих агентов

Рисунок 2-1 Последовательные стадии формирования и воспроизведения следов долговременной памяти.

Обзор существующей литературы позволяет отметить некоторые закономерности этапа воспроизведения информации мозгом.

1.) Нарушения в процессах извлечения информации в большинстве случаев связаны с нарушением специфических механизмов воспроизведения. Механизмы воспроизведения следов долговременной памяти могут функционировать относительно независимо от других информационных процессов, протекающих в мозге.

2.) Некоторые специальные приемы, фармакологические или физические воздействия в период тестирования, влияя на отдельные элементы извлечения и реализации следов долговременной памяти, могут ослабить забывание (феномен напоминания). Принципы. определяющие эффективность напоминающих стимулов, твердо не установлены.

3 ) Разные нейротрансмиттеры, взаимодействуя сложным образом, активируют определенные популяции рецепторов и регулируют различные функции мозга, в частности и такие, как воспроизведение следов памяти. Степень участия различных нейромедиаторов в воспроизведении неодинакова и зависит от ряда факторов, среди которых, например, модальность подкрепления. 4.) Структурно-функциональные особенности процессов воспроизведение информации мозгом определяются типом воспроизводимой информации. Е зависимости от принадлежности к форме памяти (оперативной, семантической эксплицитной, имплицитной и др.) формируется функциональная система включающая различные образования мозга.

5.) Успешность воспроизведения для каждого типа памяти существенно зависит от контекста (обстановки), в котором оно происходит. Чем ближе условия теста к условиям процедуры обучения и чем более уникален контекст для специфических следов памяти, тем лучше воспроизведение.

3. Экспериментальные исследования.

¡Материалы и методы исследования.

Эксперименты проводили на самцах крыс линии Вистар, массой 150-200 г. Животных содержали в стандартных условиях по 2-3 крысы в клетке. Воду всегда давали без ограничений. Пищевой режим определялся экспериментальными условиями: крыс кормили один раз в сутки во время поведенческого эксперимента и сразу после него. Представленные результаты получены более чем на 700 животных.

У жиеотнь/х вырабатывали условную реакцию с пищевым подкреплением в течение 5 дней в специальной экспериментальной камере /'Семенова, 1978/, состоящей из стартового отсека и 4-х целевых полок, расположенных на разной высоте После привыкания к экспериментальной обстановке у крыс вырабатывали побежку к одной из полок камеры: после зыхода из стартового отсека животному необходимо было выбрать правильное направление, подойти к лесенке, взобраться на нее и получить пищевое подкрепление. Критерием обучения служило время достижения целее ой полки (динамика выработки в норме показана в левой части Рис. 3-1). В работе изучали воспроизведение одного и того же стандартного чавыка после различных фармакологических воздействий.

Для того, чтобы убедиться в селективности действия рармакологического вещества на этап воспроизведения информации, у животных проверяли сохранение способности к восприятию и фиксации ювой информации. Для этого у животных вырабатывали другой навык на роне действия вещества в виде побежки к полке N32 той же экспериментальной камеры.

'Латериалы и методы для изучения действия карбахолина. введенного в лруктуры мозга.

Крыс обучали е течение 5 дней совершать побежки к полке №1 в юрме. После этого животным под нембуталовым наркозом имплантировали :тальные направляющие канюли (внутренний диаметр 0,4 мм, длина 10 мм) I следующие структуры мозга /РеНедппо е/.а/., 1979/:

:енсомоторная область неокоотекса - 2-3 мм каудально от брегмы, 1-2 мм 1атерально от сагиттального шва, 0,7 мм вентрально от черепной кости; шппокамп - 2,0 мм каудальнее брегмы, 1,8 мм латеральнее сагиттального ива, 2,0 мм вентрально от черепной кости;

•тоиатум - 2,2 мм рострально от брегмы, 2,5 латерально от •агиттапьного шва, 2-3 мм вентрально от черепной кости; латеральный желудочек мозга - 2,0 мм каудально от брегмы, 3,0 мм гатерально от сагиттального шва, 3,0 мм вентрально от черепной кости.

Канюлю с мандреном крепили к черепной кости норакрилом. Через 7 -О дней после операции производили упрочение навыка в течение 1-2 дней.

Для воздействия на холинергическую систему гиппокампа (что, как показали исследования, обеспечивает нарушение воспроизведения информации) был выбран м-холиномиметик карбахолин. Вещество, растворенное в изотоническом растворе NaCI, вводили под легким хлороформным наркозом в объеме 2 мкл. В большинстве случаев делали инъекцию в одно полушарие, в ряде случаев - в оба. В контрольных экспериментах вводили изотонический раствор NaCI. После окончания экспериментов проводили контроль локализации направляющей канюли, для чего через канюли вводили бромфеноловый синий, через 20 мин мозг выделяли и делали его серийные срезы при замораживании.

Материалы и методы для изучения энергетического метаболизма неокортекса и гиппокампа.

Опыты проведены на семи самцах крыс линии Вистар массой 200 г. Сравнивали поглощение 2-дезоксиглюкозы в сенсомоторной коре и гиппокампе крыс, находящихся в различных функциональных состояниях:

1.) контроль - крысам вводили изотонический раствор NaCI;

2.) введение пентобарбитала - животным вводили за 15 мин до декапитации пентобарбитал (этаминал-натрий) в дозе, вызывающей диссоциированное состояние (15мг/кг, внутрибрюшинно);

3.) введение карбахолина в гиппонамп - животных декапитировали через 3 суток после введения крысам карбахолина в дорсальную область гиппокампа (20мкг, унилатерально)

2-Дезокси-0-1-['"С]гпюкозу (удельная активность 60 мкКи/ммоль, "Amersham"] вводили внутрибрюшинно, 50жКи на крысу. Через 45 мин крыс декапитировали, мозг выделяли и охлаждали сухим льдом. После этогс замороженный мозг помещали е криостат (t= -15°С) на 20 часов l приготовляли срезы толщиной 20 мкм Из мозга каждой крысы брали 4С фронтальных срезов на уровне гиппокампа. Стекла со срезами подсушивали при комнатной температуре и помещали в кассеты с рентгеновской пленкой РТ-1. Через 10-12 дней проявляли пленку, полученные радиоавтографы денситометрировали, измеряя оптическую плотность участков, соответствующих неокортексу, мозолистому телу и гиппокампу Показателем функциональной активности коры и гиппокампа служилс отношение оптических плотностей радиоавтографов

соответствовавших серому веществу мозга (кора, гиппокамп) и беломj веществу. В структурах серого'вещества для промеров выбирали наиболе( плотные участки в пределах данной структуры, в мозолистом теле наиболее светлые. Оптическую плотность структуры на каждом cpe3t замеряли 20 раз, вычисляя среднее значение.

Материалы и методы для изучения обратного захвата глутамата и ГАМЕ синаптосомами.

После обучения животных в течение 5 дней, используя предварительм имплантированную канюлю, животным в дорсальный гиппокамп унилатерально вводили карбахолин в дозе 25 мкг/крысу или изотонически1 раствор NaCI контрольным животным. После теста на амнезию животны. декапитировали через 1, 2 (при наличии амнезии) или 1 суток (когда амнези: закончилась) после инъекции. Из неокортекса и гиппокампа были выделень синаптосомы по методу /Hajos, 1975/. Аликвоты суспензии синаптосом по 5t цМ, содержащие 200 цМ синаптосомального белка (определяемого по /Lowr et al.,1951/), помещали в пробирки с инкубационной средой следующееi состава мМ: NaCI, 132; KCl, 5, MgCh , 1.2; NaH2PO<, 1,2; CaCh , 1,2 ; HEP Ei

глюкоза, 10 (pH 7,4)и преинкубировали в течение 5 мин при 37°С. Затем в зобы добавляли [3HjGABA (5х 106 М, 0,05 mCi/ml) или j3Н]глутаминовую Iслоту (9,5 х 10 s М, 0,05 mCi/ml).Конечный объем проб составлял 1 мл. Как знее было показано /Жарикова и др., 1988/, аккумуляция синаптосомами -i]GABA и [3Н]глутаминовой кислоты линейно возрастает в течение }рвых 2 мин и достигает насыщения к 10-й минуте. Аккумуляция меченых юротрансмиттеров синаптосомами останавливалась фильтрацией, ильтры промывали три раза инкубационной средой (5мл), высушивали и ■меряли активность на жидкостно-сцинтилляционном счетчике. Такие же юцедуры делали, используя инкубационную среду, в которой Nad замещали вимолярным количеством UCI. Величину захвата синаптосомами шротрансмиттеров, обусловленного механизмами №+-зависимого оанспорта подсчитывали как разность между величинами, полученными в шсутствии и при отсутствии Na*.

зтоды исследования эндогенного фосФорилиоования белков |наптических мембран.

У крыс вырабатывали навык в экспериментальной камере в течение 5 'ей, после чего животным однократно вводили карбахолин в боковой >лудочек мозга (40 мкг на крысу, растворенный в 4 мкл изотонического створа NaCI). контрольным животным вводили изотонический раствор iC/. Через 1, 2 и 5 суток после введения проводили тестирование навыка, нтрольных и опытных крыс декапитировали, выделяли синаптосомы из ппокампа и сенсомоторных областей коры по методу /Hajos, 1975/, торые затем подвергали фосфорилированию in vitro. Синаптосомы двергали гипоосмотическому шоку или пермеабипизировали сапонином % к суммарному протеину в пробе). Реакция фосфорилирования ициировалась добавлением в инкубационную среду f2P]AT0 - 10-15 мкК на обу. После инкубации, продолжавшейся 30 сек или 3 мин, в зависимости от овившейся задачи, реакцию останавливали добавлением SDS и пячением. Электрофорез проводили в 10% ПААГ, получали биоавтографы, которые сканировали по оптической плотности. ггериапы и методы изучения метилирования ДНК мозга.

Крысам (п-12) после обучения вводили унилатерально карбахолин в ос альную область гиппокампа. Контрольным животным вводили швалентный объем изотонического раствора NaCI. Проведя здварительно тест на воспроизведение условной реакции, животных <апитировали через 1 (амнезия) или 7 суток (отсутствие амнезии) после ьекции. Затем из неокортекса и гиппокампа выделяли геномную ДНК >ласно /Davis et at., 1980/. Для сравнительной оценки уровня 'пилирования ДНК были использованы эндонукпеазы рестрикции Msp / и э II. Эти'рестриктазы узнают один и тот же сайт на ДНК: CCGG и зют равную эффективность в его разрезании, если цитозины метилированы. Однако, только Msp I способна разрезать ДНК, если vuлupoвaн внутренний цитозин в указанной последовательности: CCGG lalwijk, Flavell, 1978/. ДНК, выделенную из структур мозга, подвергали :трикции в соответствующем буфере. Образовавшиеся фрагменты ДНК деляли в 1% агарозном геле, окрашивая этидиумом бромидом, и тографировали в отраженном свете через оранжевый светофильтр. Для ичественной оценки гель сканировали при Я=303 пм. В качестве маркеров ользовали фрагменты ДНК фага А, полученные после обработки триктазой /4sy I.

Результаты.

3.1 Выбор оптимальной модели для исследования нарушении воспроизведены» следов долговременной памяти.

Выбор экспериментальных моделей - адекватных, специфичных для отдельных сторон воспроизведения памяти, интерпретация полученных результатов - важнейший элемент исследования. Использование любых моделей требует рассмотрения многих факторов и не существует поведенческого теста, абсолютно специфичного в отношении извлечения следов памяти.

Анализ действия нейротропных соединений на обучение и память животных привел к выводу, что наиболее плодотворной экспериментально? моделью для изучения механизмов воспроизведения информации мозгш является феномен диссоциации памяти. Известно, что значительные сдвиги е функциональном состоянии мозга могут привести к нарушеник воспроизведения информации, вызвав особые "диссоциированные состояния" Они возникают под влиянием некоторых воздействий: фармакологических электрической стимуляции, холодового выключения структур мозга и др /Overton, 1964-1991; Азарашвили, 1981/.

Диссоциированные состояния - функциональные состояния мозга, npi

переходе к которым наблюдаются характерные изменения памяти

воспроизведение следов долговременной памяти, запечатленных ранее

становится невозможным, но способность к запоминанию ноэой информацщ

сохранена. В данном диссоциированном состоянии воспроизводится лишь т:

информация, которая в нем и запечатлевалась.

Возникновение этих функциональных состояний мозга можн

рассматривать как достаточно специфическое нарушение механизмо

воспроизведения информации, так как при этом не нарушаются други

процессы, связанные с ее восприятием и фиксацией. Это открывав новые возможности для использования явления диссоциации памяти в изу»

механизмов воспроизведения.

В настоящей работе была проверена возможность наруц воспроизведения выработанного навыка у животных под влиянием |

нейротропных веществ синаптического действия. Среди них были выделены экие, системное введение которых нарушало у животных процесс юспроизведения информации в наших экспериментальных условиях (Табл. И),

Таблица 3.1 Фармакологические агенты и дош. введение которых блокировало юспротведенне пншедобывателыюго навыка у крыс, вьпывая диссоциированные осюянпя.

ВЕЩЕСТВО ДОЗА (МГ/КГ) ПЕРИОД МЕЖДУ ВВЕДЕНИЕМ И ПЛЧЛ.'ЮМ ЭКСПЕРИМЕНТА

(еитобарбитал 15+2 15 мин

жснбутират-натрин 25(1 ± 20 30 мин

ишзепам 5+1 15 мин

танол 225(1 ±250 II) мин

иролин-сульфат 100+ К) 40 мин

кополампн 1.3 + 0.6 40 мин

игзостнгмпн 0.5 + 0.1 15 мин

шлокарпнн 5+ 1 20 мин

Фармакологические агенты, указанные в таблице, приводили к юзникновению диссоциированных состояний. то есть нарушали юспроизведение информации, существенно не затрагивая механизмы ее юсприятия и фиксации. На фоне их действия оказалась возможной выработка ювых навыков, что подтверждает селективность нарушения этапа юспроизведения информации при сохранении других информационных |роцессов в мозге относительно интактными Можно заметить, что вещества по чеханизму их действия делятся на две группы: влияющие преимущественно на 'АМК- рецепторы (пентобарбитал. диазепам. оксибутират натрия, этанол) и олинергическую систему мозга (атропин, скополамин, физостигмин. 1илокарпин). Среди проверенных нами фармакологических агентов были акже агенты, влияющие на дофаминергическую, норадренергическую и еротонинергическую медиаторные системы, однако, они не приводили к озникновению диссоциированных состояний.

Проведенные нами эксперименты по изучению влияния эармакологических веществ на воспроизведение выработанного навыка, с ^пользованием критерий возникновения диссоциированных состояний, озволяют сделать вывод, что вмешательство в деятельность ГАМК и

холинергической нейромедиаторных систем мозга позволяет селективь нарушить воспроизведения следов долговременной памяти.

Явление диссоциации памяти дает и другие возможности для изучен1 механизмов воспроизведения. Например, исследовать, какой из следов памя" извлекается в данной экспериментальной обстановке, предполагая, ч определяющим в этом процессе является состояние мозга животного в моме1 воспроизведения. Изучение воспроизведения диссоциированных навыков п| такой постановке экспериментов показало, что вмешательство в активное холинергической или ГАМК-ергической систем мозга приводит не только переключению из одного диссоциированного состояния в другое, но таю градуально регулирует доступность следов памяти для воспроизведения реализации. Это означает, что указанные нейромедиаторы являются важнып звеньями в системе регуляции воспроизведения информации в мозге. Анал действия веществ на отдельные этапы информационных процессов, а таю ■ сравнение с другими фармакологическими феноменами (например, нейрохимическим переключением условных реакций (см./Архипов, 1984 приводит к еще одному важному заключению - регуляция воспроизведен! осуществляется на уровне селекции и торможения энграмм.

Свойства диссоциации памяти дают возможность использовать любое веществ, перечисленных в Табл. 3.1, в качестве воздействия, селектив! нарушающего воспроизведение информации. Однако, есть способ бол< целенаправленного влияния на мозг, применяя его к отдельным структур: мозга.

Фармакологическая стимуляция структур мозга и воспроизведение условных реакций.

Была проведена также серия экспериментов с использовани<

фармакологической стимуляции отдельных структур мозга с целью поис более оптимальной модели для исследования механизмов нарушен воспроизведения. Для локального воздействия применяли карбахолин, агону м-холинорецепторов (в наибольшей степени М2-типа), влияние которого рецепторы более продолжительно по сравнению с ацетилхолином, так как эт агент не гидролизуется ацетилхолинэстеразой. Схема проведен поведенческих экспериментов была такая же как при изучении действ фармакологических агентов при периферическом введении: у кр

вырабатывали навык, затем производили инъекцию, после которой изучали воспроизведение навыка.

Наиболее значительные изменения в поведении животных наблюдались после введения карбахолина (15-20 мкг/крысу) в гиппокамп, а также более высокой дозы (до 40-50 мкг/крысу) в латеральный желудочек мозга, Часть животных под влиянием однократного введения в гиппокамп или в желудочек мозга не воспроизводила выработанный навык в течение нескольких суток (от 2 до 7 у разных крыс), после чего навык спонтанно восстанавливался. Животные при помещении в экспериментальную камеру не воспроизводили побежку к полке №1, но проявляли ориентировочную реакцию. У них оказалась возможной выработка нового навыка на фоне развившейся амнезии. Динамика обучения при этом существенно не отличалась от контроля (Рис. 3-1). Важно отметить, что период непосредственного действия карбахолина, введенного в гиппокамп, ограничен 1-2 часами /Мс Lean, 1957; Grossman, 1964/. Тем не менее, полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о значительно более длительных эффектах на поведение - до нескольких суток. Это означает, что амнезия, наблюдаемая при введении карбахолина в гиппокамп, является результатом процессов, которые лишь запускаются веществом.

Обучение в норме побежке к попке №1 Обучение под влиянием карбахолина

побежке к полке №2

90 80

8 ™ 60 so 40 30 20 10 0

День Л»нь День День День День День День День

1 2 3 4 5 1 2 3 4

'исунок 3-1. Обучение крыс в двух диссоциированных состояниях, в норме юбежке к попке 1 и в диссоциированном состоянии побежке к полке 2 Ассоциированное состояние возникло после однократного введения арбахолина в дорзальную область гиппокампа (отмечено стрелкой). Указано реднее значение времени выполнения реакции у 5 крыс.

Детальный каскад нейрохимических реакций, приводящий к столь длительным изменениям функции мозга до сих пор остается неясным, видимо, в каждом конкретном случае могут вовлекаться специфические механизмы для конкретного воздействия на холинергическую систему. Так, например, установлено существование в центральной нервной системе пяти подтипов м-холинорецепторов, которые различаются последовательностью аминокислот, связью с другими молекулами мембраны, сопряжением с эффекторами, г также фармакологическими свойствами. Они способны как активировать, так у инактивировать сопряженные с ними эффекторы через в-белки. Активация м-холинорецепторов приводит к образованию вторичных посредников, которые участвуют в трансдукции сигнала и влияют на функции клетки: фосфорилирукп белки, изменяют проницаемость мембран для ионов, вызывают высвобождение из депо ионов Са2* внутри клетки и т.д. При активации м холинорецепторов происходит также гидролиз фосфолипидов фосфоинозитидов или фосфатидилхолина, изменение активность аденилатциклазы, что, в свою очередь, влечет за собой изменение в клеш активности протеинкиназы А Большое разнообразие физико-химически: процессов, изменяющихся в клетках в результате действия н; холинорецепторы, затрудняет анализ механизмов действия карбахолина приводящего к длительным изменениям протекания информационных явлени! в мозге. Тем не менее, можно сделать некоторые предположения о том, каки! из клеточных процессов могут быть вовлечены в реализацию эффектов этоп вещества. Они могут касаться различных элементов каскада вторичны мессенджеров, обмена фосфолипидов в мембранах, изменения активност протеинкиназ и др.

Таким образом, в качестве основной поведенческой модели дл последующих экспериментов было выбрано функциональное состояние мозгг возникающее в ответ на однократное введение карбахолина в гиппокамп, характеризующееся длительным (несколько суток) селективным нарушение) этапа воспроизведения информации. В последующих частях работы буду представлены результаты исследования, характеризующие механизмы этог функционального состояния мозга.

3.2 Исследование энергетического метаболизма структур мозга при нарушении воспроизведения условной реакции.

Для характеристики процессов, происходящих при нарушении воспроизведения, нами было проведено исследование энергетического состояния мозговых структур. Для этого был использован "2-дезоксиглюкозный метод" /Эоко^ е( а1., 1977/. Он основан на свойстве нервной ткани использовать в качестве энергетического источника практически исключительно глюкозу. Выявление распределения по структурам мозга печеной 2-дезоксиглюкозы позволяет оценить их физиологическую активность тосле фармакологических воздействий.

'исунок 3-2. Радиоавтографы фронтальных срезов мозга крыс. [14С]2-езоксиглюкозу вводили крысам в норме (А) и при нарушении воспроизведения авыка, вызванного системным введением пентобарбитала (Б) и нтрагиппокампальной инъекцией карбахолина (В). Затемненные участки на адиоавтографе соответствуют местам большей интенсивности нергетического метаболизма.

Как видно из Рисунка 3-2, локальное поглощение меченой 2-езоксиглюкозы тканью мозга значительно варьирует от структуры к структуре, ¡ожно видеть, что в сером веществе накапливается значительно больше еченой 2-дезоксиглюкозы, чем в белом. Это свидетельствует о более нтенсивном энергетическом метаболизме в структурах, содержащих серое эщество: неокортексе, гиппокампе и таламусе. При сравнении поглощения 'С]2-дезоксиглюкозы мозгом контрольных и опытных животных было энаружено, что под влиянием пентобарбитала происходит заметное снижение 1ергётического метаболизма практически по всему срезу. При количественной

обработке значений оптической плотности на радиоавтографе на участках, соответствующих сенсомоторной области неокортекса и гиппокампу, получено достоверное снижение поглощения [14С]2-дезоксиглюкозы этими структурами (Рис. 3-3). В отличие от пентобарбитала, введение карбахолина в гиппокамп не повлияло на энергетический метаболизм изученных структур мозга' (Рис. 3-2 и . 3-3). Подчеркнем, что пентобарбитал вводился внутрибрюшинно за 15 мин, а карбахолин в дорсальный гиппокамп за 3 суток до декапитации животных и определения поглощения меченой 2-дезоксиглюкозы в их мозге.

£ 3

U

S « 2,5

* I 2

5 "

° ° и с

ei с 1,5

М 1

а 5

о 0,5

Ь 0

■к

-17' i. ¡fjj §Шр§Ё * -2J' 1« RnütStit, ----

Неокортекс

Гиппокамп

□ Норма

□ Пентобарби тал 15 мг/кг

Ш Карбахолин в гиппокамп

Рисунок 3-3. Изменение поглощения [МС] 2-дезоксиглюкозы в неокортексе и гиппокампе крыс под влиянием пентобарбитала и карбахолина. Значения оптической плотности (М±т) подсчитывали в 20 точках каждой структуры на 10 срезах от каждой крысы.

* - достоверность отличия от контроля по критерию Стьюдента: Р< 0,05.

Полученные результаты показали снижение энергетического метаболизма в мозге под влиянием пентобарбитала, но не выявили различий после введения карбахолина в 'гиппокамп. Однако, и в том и другом случаях наблюдалось нарушение воспроизведения информации, из чего следует, что между возникновением диссоциированных состояний и изменением энергетического обмена в рассмотренных структурах мозга нет корреляции. Процессы, ответственные за нарушение воспроизведения информации, видимо, не столь интенсивны, чтобы изменить энергетический метаболизм структур мозга.,

3.3 Обратный чахват ГАМК и глутамата еииаптосомами, выделенными т мона крыс после введения карбахолина в гиппокамп.

Продолжительность периода, при котором наблюдается

нарушение процессов воспроизведения информации в ответ на введение

сарбахолина в гиплокамп, позволяет предположить, что изменения, происходящие при этом, локализованы не только в холинергической иедиаторной системе мозга, но затрагивают и другие нейротрансмиттеры. Проверке этого предположения посвящена часть работы, где оценивалось вовлечение основной тормозной системы мозга - ГАМК и возбуждающей "лутаматергической медиаторной системы. Известно, что оба нейротрансмиттера после высвобождения в синаптическую щель активно тоглощаются пресинаптической терминалью при помощи высокоаффинного Ча+-зависимого обратного захвата. Этот процесс транспорта -юйротрансмиттеров изучали, используя синаптосомы, выделенные из мозга. Они представляют собой пресинаптические окончания, содержащие, как травило, внутренние компоненты.

Величина Ма+-зависимого транспорта через мембраны синаптосом, выделенных из мозга контрольных крыс через 1, 2 или 7 суток после введения изотонического раствора NaCI, составляла: для глутамата - в гиппокампе 470 ± 70 пМ/мг белка за 10 мин, в неокортексе 570 ±100 пМ/мг белка за 10 мин; для ГАМК - в гиппокампе 380 ±120 пМ/мг белка за 10 мин, в неокортексе 370 ±150 пМ/мг белка за 10 мин.

Карбахолин, введенный в гиппокамп, оказал воздействие на процессы захвата нейротрансмиттеров пресинаптическими терминалями, что отразилось на скорости поглощения меченых ГАМК и глутамата синаптосомами. На Рис. 34 и 3-5 приведены значения поглощения глутамата и ГАМК в опыте по отношению к контролю.

250%

200%

150%

100%

50%

Irfl

В Неокортекс □ Гиппокамп

1 2 3 4 5 6 7 8 Дни после введения карбахолина

Рисунок 3-4 Средние значения (в % от контроля) №+-зависимого поглощения [3Н]глутаминовой кислоты синаптосомами, выделенными из неокортекса и гиппокампа крыс после однократного введения карбахолина в гиппокамп. Контролем служило среднее значение №+-зависимого поглощения нейротрансмиттера (см. текст) синаптосомами, выделенными из мозга крыс через 1, 2 или 7 суток после введения в гиппокамп изотонического раствора №С1. *- достоверное отличие (Р < 0,05) от контроля по критерию Стьюдента.

Через 1 сутки после введения карбахолина в гиппокамп способность пресинаптических терминалей поглощать как 1_-глутамат, так и ГАМК заметно повысилась. Через 2 суток Ыа-зависимый захват находился уже в пределах нормы, так же как и через 7 суток. Динамика изменения транспорта нейротрансмиттеров была подобной как в неокортексе, так и гиппокампе, хотя можно было отметить, что в неокортексе активация захвата более значительна.

Рис. 3-5 Среднее значение (в % от контроля) №+-зависимого поглощения [3Н]ГАМК синаптосомами, выделенными из неокортекса и гиппокампа крыс, через 1,2 или 7 суток после однократного введения карбахолина в гиппокамп. Контролем служило среднее значение Ма-зависимого поглощения нейротрансмиттера (см. текст) синаптосомами, выделенными из мозга крыс через 1, 2 или 7 суток после введения в гиппокамп изотонического раствора №С1. '-достоверное отличие (Р <0,05) от контроля по критерию Стьюдента.

Полученные результаты означают, что активация м-холинорецепторов карбахолином инициирует многоступенчатый каскад молекулярно-клеточных событий в мозге. Среди них - активация транспортных систем захвата нейротрансмиттеров - ГАМК и глутамата. Их обратимость и нормализация до возвращения к норме информационных процессов, позволяет предположить, что наблюдавшиеся изменения в транспортных процессах отражают

400%

Ш Неокортекс □ Гиппокамп

2 3 4 5 6 7 8 Дни после введения карбахолина

промежуточные звенья в механизмах поддержания изучаемого функционального состояния мозга.

3.4 Исследование эндогенного фосфорилирования синаптнческнх белков при введении карбахолмна в гиппокамп.

Фосфорилирование белков является широко распространенным механизмом регуляции их активности в клетках эукариот, причем эти механизмы могут обеспечивать как быстрые, так и длительные процессы, ответственные за пластические изменения в нервной системе /ЯозаЫ е1 а1 , 1995; Уатада1а е( а1, 1995/. Вполне допустимым является участие клеточных систем фосфорилирования белков в механизмах, длительно поддерживающих изучаемое нами функциональное состояние мозга.

После проведенных экспериментов были получены радиоавтографы, показывающее поглощение [32Р]АТФ отдельными группами белков. Пример радиоавтографа показан на Рис. 3-9. Среди полос с наиболее значительным поглощением [1<С]АТФ особое внимание было уделено полосам, которые, соответствуют нейроспецифическому белку синапсину I судя по значению молекулярной массы и хорошо выраженной активации фосфорилирования соответствующих полос при добавлении в реакционную смесь цАМФ. Название "синапсин I" объединяет два тесно связанных между собой пептида: синапсин 1а и синапсин 1Ь, немного отличающихся между собой по молекулярной массе -80 кД и 86 кД, определенной в ПААГ - геле /\Л/а1ааз,Сгеепдагс1, 1991/. Это семейство нейроспецифических белков составляет 0,3-0,4% от суммарного количества белков в мозге и 9% от количества белков в везикулах. Известно, что синапсин I связан с поверхностью везикул, содержащих нейротрансмитттеры и модулирует экзоцитоз, регулируя связывание небольших синаптических везикул с цитоплазматической поверхностью и элементами цитоскелета при фосфорилировании /РоэаЫ е1 а1., 1995/. Кроме того, показано, что после фосфорилирования Са2*/кальмодулин-зависимой протеинкиназой этот протеин транслоцируется в цитозоль /Р1епЬопе е1 а1., 1995; ЭНтга е1а!., 1989/.

т

•ii-ь ¿ ■

Неокортекс Гиппокамг»

конт. 1 день конт. 1 день

4-► «-►

II fji

^buBliMy

•'ti t •' •• i

if 13 Ё P

: г

СИ11АНСИН t

r~ г-

т***Ф- fbfcHi

„I

с AMi- «»* «м*

Рисунок 3-6. Радиоавтографы, полученные с гелей белкового электрофореза.

При количественной оценке включения меченого фосфата в белковые полосы соответствующие синапсину I. было обнаружено снижение егс фосфорилирования in vitro в синаптосомах, выделенных из мозга животных которым вводили карбахолин (Рис. 3-7).

I 1 120%

2 2

5 s5

Ш О

Неокортекс

Гиппокамп

□ Контроль

Е2 Через 1 сут после введения В! Через 2 сут после введения □ Через 5 сут после введения

Рисунок 3-7. Включение меченого фосфата в белковые полосы на радиоавтографах, соответствующие синапсину I (в % по отношению к

контролю). Сравнивали данные, полученные на одной пластине, нормализуя по отношению к контрольным значениям.

*- достоверное отличие от контроля по критерию Стьюдента (!=5,77; у= 10; Р< 0,01).

Достоверное отличие от контроля наблюдалось в гиппокампе на 2 день после введения карбахолина, когда у животных наблюдалась амнезия. Через 5 дней после инъекции, когда действие карбахолина на память, как показало поведенческое тестирование, закончилось, фосфорилирование синапсина I in vitro также нормализовалось. Обратимое снижение включения меченого АТФ в полосу, соответствующую синапсину I in vitro в гиппокампе указывает на то, что in vivo в ответ на стимуляцию м-холинорецепторов карбахолином в этой структуре мозга произошло усиление фосфорилирования синапсина I. Так как процесс фосфорилирования синапсина I отражает активацию экзоцитоза, полученный результат может свидетельствовать о длительно поддерживающемся высоком уровне процесса выброса нейротрансмиттеров в синаптическую щель в гиппокампе.

Полученные результаты показали закономерные изменения синаптической активности в гиппокампе при длительной амнезии. Важно подчеркнуть, что под воздействием карбахолина, при неизменном энергетическом метаболизме, в мозге произошли более тонкие физико-химические сдвиги, которые проявляются, в частности, перестройкой систем фосфорилирования синаптических белков в гиппокампе. Это дает дополнительные аргументы в пользу утверждения о ключевой роли гиппокампа в механизмах возникновения диссоциированных состояний и дает основание предполагать, что длительные диссоциированные состояния обеспечиваются молекулярно-клеточными процессами, способными продолжительное время поддерживать измененную активность этой структуры мозга.

3.5 Метилирование ДНК мозга крыс при введении карбахолина в гиппокамп.

Функциональное состояние мозга, возникающее в ответ на фармакологическую стимуляцию гиппокампа, как это ясно из полученных ранее результатов, обеспечивается многообразными процессами, включающими регуляцию экзоцитоза нейротрансмиттеров и их обратный захват. Однако, есть

основания предполагать, что в реализацию действия агентов, вызывающих такие состояния мозга, вовлекаются и генетические механизмы. Известно, например, что гены "раннего реагирования" (c-fos, c-jun, zif/268 и др.) способны обратимо активироваться под влиянием на клеточную мембрану самых разных внешних стимулов. Предполагая возможность вовлечения генетических механизмов в обеспечение длительных изменений в процессах воспроизведения следов долговременной памяти, изучали один из показателей активности генома в клетке - метилирование ДНК.

Уровень метилирования ДНК является важным фактором, влияющим на эффективность экспрессии генетической информации и, следовательно, участвующим в регуляции многих важных клеточных процессов. /Sryf, 1994; Мазин, 1993/. Понимание функциональной роли процесса метилирования ДНК в клетках мозга далеко от завершения, однако накоплены факты, свидетельствующие о его вовлечении в регуляцию активности мозга. Известно, например, что уровень метилирования ДНК в клетках мозга может изменяться под влиянием фармакологических агентов или в онтогенезе /Razin, Cedar, 1991/. При выработке условных реакций содержание 5-метилцитозина (единственного метильного основания, обнаруживаемого в мозге позвоночных) достоверно меняется, причем - тканеслецифично, обратимо, и зависит от сложности вырабатываемого навыка, коррелируя с активностью мозговых структур на разных стадиях обучения /Ванюшин и др., 1977/.

После обработки геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции, оказалось, что степень ее разрезания эндонуклеазой Msp I значительно больше, чем Нра II Об этом свидетельствует наличие большого количества фрагментов малой длины при обработке ДНК рестриктазой Msp I. Различие обусловлено тем, что Нра II, в отличие от Msp I, не способна разрезать сайт С CGG, в котором содержится метилцитозин /Waalwijk, Flavell, 1978/. Для проведения количественной оценки степени метилирования ДНК, выделенной из мозга крыс, находящихся в разных функциональных состояниях, были введены индексы, характеризующие степень фрагментированности ДНК; после обработки эндонуклеазой Нра II, - "а"; после обработки Msp I - "б". Оба индекса характеризуют соотношение длинных и коротких фрагментов после обработки рестриктазами.

Результаты оценки степени фрагментированности ДНК показали, что индекс б (показывающий эффективность MSP I) практически не менялся при возникновении диссоциированного состояния. В отличие от этого, индекс а (показывающий эффективность Нра II) претерпел значительное изменение при возникновении диссоциированного состояния. В гиппокампе наблюдалось увеличение числа коротких фрагментов через 1 сут после введения карбахолина, которое возвращалось к норме через 7 дней. Отсюда следует, что причина увеличения числа фрагментов ДНК в гиппокампе после обработки Нра И у опытных животных связана, очевидно, со снижением метилированности ДНК при возникновении диссоциированного состояния. Исходя из данных литературы, снижение метилирования ДНК ведет к активации экспрессии генов, поэтому можно предположить, что воздействие на мозг, приводящее к амнезии, вызвало в гиппокампе изменения конформации ДНК и дерепрессию специфических генов.

□ Контроль ■ Через 1 сут

□ Через 7 сут

Неокортекс

Гиппокамп

140%

ю 120%

п и к с 100%

<У «5 X о а * 80% 60%

о * 40%

3 X 5 20%

о У 0%

Неокортекс

□ Контроль ■ Через 1 сут

□ Через 7 сут

Гиппокамп

Рисунок 3-11. Относительная величина фрагментов ДНК после разрезания эндонуклеазами рестрикции Нра II (А) и MSP I (Б), выделенной из неокортекса и гиппокампа крыс в контроле, в диссоциированном состоянии (через 1 сутки после введения карбахолина в дорсальную область гиппокампа) и после выхода из диссоциированного состояния (через 7 суток после введения карбахолина). Определение индексов а и б указано на Рис. 3.8-4. * - Р < 0,05 (по критерию Стьюдента).

Вовлечение генома клеток гиппокампа в реализацию действия карбахолина, подтверждает вывод, сделанный нами ранее: гиппокамп является ключевой структурой, регулирующей воспроизведение информации.

4. Обсуждение результатов исследования.

Поиск механизмов, ответственных за нарушение воспроизведения следов долговременной памяти в мозге позвоночных, не должен преследовать цель отыскания единого молекулярно-клеточного процесса, исключительно и специфично регулирующего эту функцию мозга. Современное состояние знаний о протекании информационных процессов в мозге, дает основание утверждать, что такого единого механизма не существует. Воспроизведение любого, даже относительно простого, навыка вовлекает множество физико-химических процессов, локализованных в разных частях мозга. Поэтому важно оценить скоординированность тех структурно-функциональных и клеточных процессов в мозге, которые являются ключевыми в реализации исследуемой способности мозга: воспроизводить информацию, запечатленную ранее.

Анализ механизмоа действия фармакологических агентов, нарушающих воспроизведение информации, позволяет заключить, что ГАМКд-рецепторы (ГАМК/бензодиазепиновый комплекс) и ацетилхолин, по-видимому, относятся к основным регуляторам извлечения следов долговременной памяти Холинергическая и ГАМК-ергическая системы при различных экспериментальных и теоретических подходах многими авторами выделяются как наиболее существенные для реализации информационных процессов в мозге/Азарашвили, 1981; Ильюченок. Филипьева, 1990, Крутиков, 1981; Крауз и др., 1988; Wishow, Nakagawa et al.. 1995/. Холинергическая медиаторная система, по-видимому, регулирует декларативную (эксплицитную), но не процедурную форму памяти /Nissen et al, 1987/, что вполне согласуется с выводами, сделанными нами на основании анализа возникновения диссоциированных состояний мозга

Возникновение диссоциированных состояний относится к случаям обратимого нарушения воспроизведения информации, которые позволяют судить о закономерностях его организации. Воспроизведение следов долговременной памяти - многостадийный процесс, включающий в себя как

«лекцию энграмм, так и торможение тех следов памяти, которые не «ответствуют данному "запросу" и обстановке. Стадия селекции в наибольшей тепени, хотя и не исключительно, подвержена влиянию внешнего воздействия |ри возникновении диссоциированных состояний.

Предложенный нами в настоящей работе методический подход ^следования стадии воспроизведения следов долговременной памяти не (вляется универсальным. Мы концентрируем внимание лишь на тех случаях крушений воспроизведения следов долговременной памяти, когда эти крушения обратимы и существенно не влияют на способность к восприятию и эиксации новой информации. Однако, эти случаи, еидимо нередки, если |ризнать существование разной степени выраженности диссоциации памяти. ;хема проведения эксперимента при таком подходе:

ЫРАБОТКА=> ВОЗДЕЙСТВИЕ =Ф ТЕСТ НА => ПОВТОРНАЯ ТЕСТ НА

НАВЫКА ВОСПРОИЗ- ВЫРАБОТКА ВОСПРОИЗ-

ВЕДЕНИЕ НАВЫКА ВЕДЕНИЕ

(того же или ДИССОШ1И-

иного) РОВАННЫХ

НАВЫКОВ

Диссоциация памяти, особенно при наиболее четкой форме ее ыражения, выявляет ряд свойств следов долговременной памяти. . Зависимость воспроизведения информации не только от комплекса стимулов 1кружаюшей обстановки, но и от функционального состояния мозга. (еобходимо подобие состояния мозга в моменты запечатления и оспроизведения. Этот принцип является подтверждением представления, огласно которому для воспроизведения запечатленной информации юобходимо активировать те же нейронные сети, в которых произошла зиксация информации. Вместе с тем, необходимо помнить, что энграмма не ранится в неизменном, стабильном состоянии, следы долговременной памяти о временем модифицируются и, кроме того, могут изменять локализацию в юзге /Бианки, 1989; Роуз, 1995; Fletcher et al., 1995/. Это означает, что в 1ногоэтапном процессе селекции и извлечения нужной информации необходим юханизм, выполняющий функции, аналогичные тем, что нужны при апечатлении информации. В частности, необходима оценка адекватности звлеченных энграмм наличной ситуации.

2. Феномен диссоциации памяти выявляет своеобразную кластеризации знграмм. Действительно, многообразие вариантов диссоциации памя™ (асимметричные, частичные, с разным нейрохимическим статусом) свидетельствует о необходимости реализации целого набора знграмм дл! выполнения конкретного навыка. Уязвимость к внешним воздействиям и: некоторой части сочетается с резистентностью остальных. 3 Результаты, полученные при изучении явления диссоциации памяти, могу определить, в каких случаях нарушение информационных процессов в мозге можно корректировать, путем "разрушения" диссоциации. Для этого, судя п< результатам, полученным, в частности, в настоящей работе, достаточн« применить агент в дозе, вполовину меньшей, чем та, что вызвала амнезию Возможно, при этом реализуются механизмы, аналогичные "феномен* напоминания". Во всяком случае, возможность нарушений памяти. по тип; диссоциации необходимо учитывать при клиническом использовани! фармакологических агентов. Известно, например, что терапевтические дозь бензодиазепинов способны нарушить память человека, вызвав диссоциации /Jensen et al., 1989/.

В представленной работе для изучения молекулярно-клеточны: механизмов нарушения воспроизведения мозгом информации была выбран; поведенческая модель длительного, но обратимого нарушена воспроизведения информации после однократного введения карбахолина i гиппокамп. Карбахолин посредством стимуляции м-холинорецепторо! запускает каскад молекулярно-клеточных процессов в клетках гиппокампг обеспечивающих поддержание измененного функционального состояния i течение длительного времени. Известно, что непосредственные эффет карбахолина на холинорецепторы ограничиваются сроком 1-2 часа следовательно в дальнейшие события вовлекаются и другие нейромедиаторь Это подтверждают эксперименты по изучению захвата глутамата и ГАМ1 синаптосомами. Использование синаптосом в экспериментах оправданс прежде всего тем, что на пресинаптических окончаниях локализован! большинство М2-холинорецепторов, на которые преимущественн воздействует карбахолин /см. Долго-Сабуров, Шорохов, 1989/. Через 24 час после воздействия на гиппокамп обнаруживается значительная активаци высокоаффинного транспорта нейромедиаторов через мембран!

эесинаптических терминален Отметим, что такая активация происходит как в тпокампе. так и в неокортексе, что указывает на распространение исходного «действия на другие области мозга Изучение фосфорилирозания 1наптических белков подтвердили вовлечение внутриклеточных сигнальных эханизмов в реализацию эффектов карбахолина Через 2 суток после •1ъекции вещества обнаруживается поеышенный уровень осфорилированного синапсина I в пресинаптических окончаниях нейронов ппокампа, что отражает измененное состояние клеточных систем осфорилирования. Из синаптических окончаний сигнал способен гредаваться в ядерные структуры нейронов (например, посредством 1анспорта каталитических субъединиц протеинкиназ / Goda. 1995/) гйствительно. изучение метилирования ДНК мозга показало, что нетические механизмы также вовлечены в обеспечение длительных ¡рушений воспроизведения. Обратимое снижение метилирования ДНК, по-щимому. отражает активацию синтеза белков, необходимых для длительного удержания измененного функционирования клеток мозга и, прежде всего, ппокампа.

Отмеченные изменения в захвате нейромедиаторов'пресинаптическими ончаниями, фосфорилировании синапсина 1. метилировании ДНК, ¡сомненно, не исчерпывают нейрохимических сдвигов в этой структуре Они !шь показывают, что разные уровни организации гиппокампа: и мембранные гханизмы, и генетические процессы - реагируют и перестраиваются в ответ i примененное воздействие, нарушившее воспроизведение следов шговременной памяти.

Результаты, полученные в работе, позволяют предположить важную >ль гиппокампа в механизмах воспроизведения следов долговременной мяти. В этой структуре мозга наблюдаются закономерные изменения оцессов фосфорилирования синаптических белков и метилирования ДНК, торые, видимо, обеспечивают поддержание ее в измененном состоянии в чение длительного промежутка времени Роль гиппокампа исключительно ¡сока при формировании и реализации кратковременной рабочей памяти, но роятно, этим она не исчерпывается. Можно полагать, что гиппокамп аствует и в регуляции этапа воспроизведения следов долговременной мяти, который во многом совпадает с ситуацией их запечатления,

формирования. При воспроизведении декларативной формы памяти требуете участие когнитивных процессов, избирательного внимания, а следовательно активации гиппокампа Однако, это внимание и оценка гиппокампом пото! информации из долговременной памяти з данном случае уже направлено не ^ стимулы окружающей среды, а на внутреннее "мнемоническое пространств' /Соколов, 1996/ Некоторые фармакологические агенты, воздействуя ► гиппокамп в этой ситуации производят нарушение стадии селекции торможения энграмм, вызывая специфическое функциональное состояж мозга - диссоциированное.

5. Выводы.

1. Извлечение следов долговременной памяти, соответствующих конкретно? навыку, зависит не только от ряда внешних факторов, но также и I функционального состояния мозга. Воспроизведение информации происход наиболее успешно при соответствии состояния мозга в период запечатлен! информации и период воспроизведения. Изменение функционально состояния мозга (переход в диссоциированное состояние) может привести нарушению воспроизведения информации, в основном, за счет процес селекции следов долговременной памяти (энграмм).

2. В работе проведен анализ факторов, определяющих возникновем диссоциированных состояний и показана важная роль в этих процесс элементов памяти, относящихся к декларативной (эксплицитной) фор& Декларативная память может подвергаться диссоциации, то есть проявля явную зависимость от функционального состояния мозга.

3. Анализ механизмов действия фармакологических агентов, приводящих возникновению диссоциированных состояний, позволяет заключить, что ГАМ и холинергическая медиаторные системы мозга относятся к механизм; регуляции селекции следов декларативной памяти.

4. Введение м-холиномиметика карбахолина в дорсальную область гиппокам приводит к длительным (продолжительностью несколько суток) нарушени воспроизведения следов долговременной памяти.

5 Энергетический метаболизм гиппокампа и неокортекса, оцениваемый поглощению 2-дезоксиглюкозы, существенно не изменяется после введен карбахолина в гиппокамп, несмотря на нарушения информационных процесс!

Механизмы, ответственные за длительное поддержание функционального ютояния мозга с измененными процессами воспроизведения, помимо ■рвоначальной активации м-холинорецепторов включают и другие элекулярно-кпеточные процессы: а.) изменение транспортных систем >есинаптических терминалей для глутамата и ГАМК под влиянием рбахолина в неокортексе и гиппокампе; б.) активацию фосфорилирования (йроспецифического белка синапсина I в гиппокампе; в.) обратимое снижение овня метилирования ДНК в гиппокампе.

При нарушениях воспроизведения следов долговременной (декларативной) ¡мяти под влиянием нейротропных веществ происходят глубокие изменения в стельности гиппокампа, включая ряд молекулярно-клеточных и генетических оцессов,

писок опубликованных работ по теме диссертации.

Азарашвили A.A., Архипов В.И.. Буданцев А.Ю., Жариков С.И. Влияние рониазида на уровень биогенных аминов, выработку и воспроизведение щевых условных рефлексов. Журн.высш.нервн.деят., 1976, т.26, N 1, с. 1040.

Жариков С И., Буданцев А Ю., Архипов В.И.. Азарашвили A.A. Влияние рониазида на моноаминергические системы мозга и обучение )личественно-гистохимическое исследование). Докл.Акад.наук СССР, 1975. >23, N 6, с. 1492-1494.

Азарашвили A.A., Буданцев А.Ю., Жариков С.И., Архипов В.И.. Калмыков П. Влияние повышенного уровня биогенных аминов на выработку и спроизведение условных рефлексов. В сб.: Физиология и биохимия щиаторных процессов. Тезисы докл. Всесоюзной конференции, ЬЛ:. 1976, с.4-

Буданцев А.Ю., Жариков С.И., Калмыков В.Л., Азарашвили A.A., Архипов И. Нейрохимическое изучение изменения уровня биогенных аминов в 1ноаминергических системах мозга при введении их предшественников и рониазида В сб.: Физиология и биохимия медиаторных процессов. Тезисы кл. Всесоюзной конференции, М/ 1076, с.21.

Архипов В. И.. Азарашвили A.A. Роль биогенных аминов в процессах жсации и воспроизведения информации. В сб.: Нейрохимия и физиология диаторных процессов. Отв. ред. А.Ю. Буданцев, Пущино, 1976, с.157-168.

Буданцев А.Ю., АзарашвилиА А., Жариков С И., Архипов В.И. жоаминергические системы мозга и поведение. Успехи физиол. наук, 1977, т. N 2, с. 53-74.

Аохипов В. И. Диссоциированное обучение как метод для изучения зимовлияния медиаторных систем мозга. В сб.: Системные механизмы оциональных реакций. Тез. докл. IV Всесоюзного семинара по развитию щей теории функциональных систем. М., 1978, с. 121.

8. Гуськова Л.В., Азарашвили А.А., Архипов В И. Метилирование ДНК разных структур мозга при диссоциированном обучении. Журн.высш.нервн.деят., 1978 т. 28, N 4, с.836-838.

9. Архипов В.И. Диссоциированное обучение и медиаторы. В сб.: Память и следовые процессы. Тез.докл. IV Всесоюзн.конф., Пущино, 1979, с.44-46.

10. Архипов В.И.. Азарашвили А.А. Роль холинергической и моноаминергическнх систем мозга в диссоциированном обучении. Журн.высш.нервн.деят., 1979, т.29, N4, с.745-750.

Translated in English:

Arkhipov V.I.. Azarashvili A A. Role of cholinergic and monoaminergic brain systems in dissociated learning. Neuroscience and Behavioral Physiology, 1981, v.11,N3, p. 226-229.

11. Архипов В.И.. Азарашвили А.А. Взаимовлияние медиаторных систем в центральной нервной системе. Влияние уровня биогенных аминов на диссоциацию, вызванную эзерином. В сб.: Катехоламинергические нейроны. M : Наука, 1979, с. 105-110.

12. Архипов В.И.. Азарашвили А.А. Диссоциированное обучение с натрия оксибутиратом. Фармакология и токсикология, 1981, т. 44, N 6, с. 667-669.

13. Аохипов В.И.. АзарашвилиА.А. Влияние бикукуллина на диссоциированно обучение с пентобарбиталом. Деп. ВИНИТИ, N 4246-83.

14 Архипов В И. Нейрохимическое переключение условных реакций. Успехи физиол.наук , 1984., т. 15, N 1, с. 115-125.

15. Архипов В.И.. Азарашвили А.А Диссоциированное обучение крыс при введении карбахолина в гиппокамп. В сб.: Нейрохимические механизмы регуляции памяти. Тезисы докл. Всесоюзного симпозиума, Пущино, 1984, с. 101.

16. Азарашвили А.А.. Архипов В.И. Исследование роли холинергической системы мозга в механизмах диссоциированного обучения В сб.' Нейрохимические механизмы регуляции памяти. Тезисы докл., Пущино, 1984,

с.98-99

17. Архипов В И. Диссоциированное обучение и явление переключения в условнорефлекторной деятельности. В сб.: XXVII совещание по проблемам высшей нервной деятельности. Тезисы и рефераты. Л.: Наука, 1984, с. 274.

18 Архипов В И. Азарашвили А.А. Возникновение диссоциированного состояния у крыс при введении карбахолина в гиппокамп. Журн.высш.нервн. деят., 1985, т. 35, N 5, с. 920-925.

19 Azarashvili А А., Arkhipov V.I. Participation of Neurotransmission in the mechanisms of dissociated learning. In: 2nd international simposium pharmacology of transmitter interaction. Abstracts. Sofia, 1986, p. 6.

20 Архипов В И, Буданцев А.Ю., Азарашвили А.А. Исследование энергетического метаболизма сенсомоторной коры и гиппокампа [14С] 2-дезоксиглюкозным методом при возникновении диссоциированных состояний Журн.высш.нервн деят., 1986, т. 36, N 3, с. 576-578.

21. Аохипов В.И.. Буданцев А Ю. Изменение энергетического состояния структур мозга при фармакологических воздействиях. Фармакология и токсикология, 1986, т. 49, N 3, с. 115-119.

22 Азарашвили А.А , Аохипов В.И.. Буданцев А.Ю., Прозоровский В.Б. Исследование способности обратимых ингибиторов холинэстеразы обеспечивать диссоциированное обучение крыс. Фармакология и токсикологи 1987, т. 50, N 3, с. 27-29.

3. Архипов В.И.. Азарашвили А А., Буданцев А.Ю. Нейрохимические аспекты иссоциированных состояний мозга. В сб.: Фундаментальные достижения ейрохимии - медицине. Тезисы докл. X Всесоюзной конф. по биохимии ервной системы, Горький, 1987, с 28.

4. Архипов В. И.. Азарашвили А.А. Амнезия и диссоциированные состояния юзга. В сб.: Сравнительная физиология высшей нервной деятельности еловека и животных. Материалы Всесоюзной конф., М., 1988, с. 10-11.

5 Архипов В И.. Архипова Г.В., Федотова И Б., Бурлакова Е.Б Влияние интетического антиоксиданта фенозана-К на диссоциированное обучение и остав липидов в структурах головного мозга у крыс линии КМ. В сб.: |Иоантиоксидант.Тезисы III Всесоюзной конф. т. 1, М., 1989, с. 146.

6. Архипов В И, Азарашвили А А. О механизмах возникновения иссоциированных состояний мозга Успехи физиол.наук, 1989, т. 20, N 2, с. 634.

7. Azarashvili A.A., Arkhipov V.I Effect of neuroactive substances on dissociated jarning in rats In. Signal molecules and mechanisms of animal behavior. Abstracts f symposium Puschino, 1989, p.7.

8 Архипов В И.. Архипова Г В., Федотова И Б. Влияние синтетического нтиоксиданта фенозана-К на эффекты пентобарбитала при иссоциированном обучении Журн высш нервн деят., 1990, т. 40, N 6, с. 1140144.

9 Щипакина Т Г., Архипов В И. Изменение фосфорилирования белков инаптических мембран в различных структурах мозга крыс при диссоциации амяти, вызванной карбахолином. В сб : Физиология и биохимия медиаторных роцессов Тезисы докл. V Всесоюзной конференции, М., 1990, с. 335.

0 Архипов В И.. Щипакина Т.Г Фосфорилирование белков синаптических юмбран при возникновении длительных диссоциированных состояний, ызванных карбахолином Журн.высш.нервн.деят., 1991, т. 41, N 1, с. 162-167. ranslated in English:

\rkhipov V. I, Shchipakina T.G. Protein phosphorylation of synaptic membranes in эпд-term dissociated states induced by carbacholine. Neuroscience and Behav. 'hysiology, 1992, v. 22, N 1.

1. Azarashvili A A., Arkhipov V.I. Effect of neuroactive substances on dissociated sarning in rats. In Signal molecules and behaviour. Ed. W.Winlow, ).S Vinogradova, D A. Sacharov. Manchester, New York, Manchester University ■ress, 1991, p. 306-310.

i2. Архипов В.И Диссоциация памяти у человека. Успехи соврем.биологии, 991, т. 111, N 1, с. 83-94.

(3. Arkhioov V.I Learning of rats under amnesia caused by pentobarbital.

lehavioral and Neural Biology, 1992, v. 57, N 3, p. 244-247.

14. Архипов В И.. Архипова Г.В., Федотова И.Б. Влияние синтетического

нтиоксиданта фенозана-К на воспроизведение диссоциированных условных

!еакций и состав фосфолипидов у крыс линий Вистар и КМ.

Курн.высш.нервн.деят., 1994, т. 44, N 3, с. 569-574.

¡5. Arkhipov V.I.. Shchipakina T.G., Zharikova A.D. Dissociated states of brain and lippocampus. In: IXth Magdeburg international neurobiological symposium on Learning and memory: synaptic and systemic views", 1995, Abstracts, p.5. ¡6. Zharikova A.D., Arkhipov V.I. Reversible activation of GABA and l-glutamate iptake into synaptosomes isolated from the rat brain in responcse to a single :arbacholine injection into hippocampus. Behav. and Neural Biology, 1994, v.61, 1.214-217..

37. ShchipakinaT.G., Zharikova A.D., Arkhipov V.I. Protein phosphorylation of synaptic membranes isolated from the brain of ground squirrels during hibernation. Neuroreport, 1995, v.7, 278-280.

38. Аохипов В И.. Щипакина Т.Г. Влияние судорожной активности, индуцированной пикротоксином, на цАМФ-зависимое фосфорилирование синапсина-1 у крыс. Физиол.журн.им. И.М.Сеченова, 1996, т.82, N 7, 74-77.

39. Ечиков С.Н., Щипакина Т.Г., Архипов В.И. Сапонин в системе фосфорилирования//? vitro. Бюллетень эксперим.биол.мед., 1996, т.122, №10, 453-456.

40. Kapustina Е.А., Arkhipov VI. Godukhin O.V. Picro'toxin kindling and memory. Ii Learning and memory. Abstracts, 1996, Cold Spring Harbor Laboratory, p.62.

41. Arkhipov V.I. State-dependent memory storage and retrieval: which process is the key?

In: Learning and memory. Abstracts, 1996,Cold Spring Harbor Laboratory, p.28.

Ш02Л7 Зак.7427P._ Тир. 100 экз. .Усл.печ.л. 2,0 Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ПНЦ РАН