Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль глутаматных и дофаминовых рецепторов в угашении памяти о страхе у мышей с депрессивноподобным состоянием, высокой тревожностью и агрессивным стереотипом

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль глутаматных и дофаминовых рецепторов в угашении памяти о страхе у мышей с депрессивноподобным состоянием, высокой тревожностью и агрессивным стереотипом"

На правах рукописи.

Зиновьева Дарья Владимировна

Роль глутаматных и дофаминовых рецепторов в угашении памяти о страхе у мышей с депрессивноподобным состоянием, высокой тревожностью и агрессивным стереотипом

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

.! ¿1113

005538529 Новосибирск 2013

005538529

Работа выполнена в лаборатории механизмов регуляции памяти Федерального

государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института физиологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Дубровина Нина Ивановна ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН, Заведующая лабораторией механизмов регуляции памяти

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Альперина Елизавета Лазаревна ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН,

гл.н.с. лаборатории механизмов нейрохимической модуляции

доктор биологических наук

Шишкина Галина Трифоновна

Институт цитологии и генетики СО РАН,

в.н.с. лаборатории функциональной нейрогеномики

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет»

Защита диссертации состоится «10> /2- 2013 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 001.014.01 при ФГБУ «НИИ ФФМ СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 4, тел. (383)-334-89-61, e-mail: dissovet@physiol.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ физиологии и фундаментальной медицины» СО РАМН

Автореферат разослан v2~9y, iO 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.014.01 кандидат биологических наук

И.И. Бузуева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Аффективные расстройства типа депрессии, высокой тревожности, агрессии являются серьезной медико-биологической проблемой, связанной с высоким процентом больных и отсутствием избирательных корректирующих средств. Эта проблема обусловлена недостаточностью фундаментальных знаний о нейрохимических механизмах данных нарушений и, в первую очередь, когнитивных дефектов при таких состояниях.

Сейчас не вызывает сомнений существование связи между обучением и особенностями поведенческого статуса животных, хотя предпосылки относительно роли предварительной установки, рассматриваемой как состояние готовности к определенной деятельности на основе потребностей организма и объективной ситуации ее удовлетворения, намечались еще в 60-х годах (Дубровина, Лоскутова, 2003; Balogh, Wehner, 2003; Bush et al., 2007). Но анализ только обучаемости не всегда позволяет оценить такую взаимосвязь. Важным представляется исследование способности к сохранению следа памяти и устойчивости к амнезирующим воздействиям, так как степень доступности следа памяти к воспроизведению непосредственно связана с адаптивным поведением индивидуума, основанного на сравнении оценки внешних стимулов при повторяющихся встречах с ними и информации, хранящейся в памяти. Снижение адекватности при оценке окружающей обстановки является основным фактором развития нарушений в психоэмоциональной сфере. От исходного состояния организма зависит эффективность нейрофармакологических воздействий на память и с этой точки зрения в современной медицине разработка дифференцированного подхода к' применению лекарственных средств и психологической коррекции в зависимости от индивидуального психоэмоционального статуса организма стала одной из ключевых. В этой связи очевидна актуальность и значимость выявления нейрохимических механизмов сохранения памяти при разных аффективных состояниях с использованием экспериментальных моделей на животных.

Неспособность к быстрому восстановлению к исходному состоянию после аверсив-ного события является ключевым элементом индивидуальной уязвимости к индуцированным эмоциональным стрессом расстройствам. Не случайно основным когнитивным симптомом болезней, обусловленных стрессом, является неспособность пациентов тормозить проявления памяти о неприятных событиях (Hofmann, 2008; Tronson et al., 2008; Clark et al., 2009; Davis, 2011; Graham et al., 2011; Hong et al., 2011). В экспери-

ментальных исследованиях научный поиск механизмов такого нарушения осуществляется с помощью соответствующих биологических моделей, с учетом главной причины психопатологий - неспособности торможения угашения памяти о страхе. Следует отметить, что нарушение угашения памяти о страхе не является симптомом только депрессии. Данный признак наблюдали исследователи в экспериментальной модели болезни Альцгеймера на мышах в тесте условной реакции (УР) страха и в клинике у шизофреников.

Ранее дефицит угашения условной реакции пассивного избегания (УРПИ) выявлен у мышей с агрессивным стереотипом поведения, сформированным в результате ежедневных конфронтаций, у мышей линии AS С (Antidepressant Sensitive Catalepsy), рассматриваемой как генетическая модель депрессии, у мышей линии DBA/2J, рассматриваемой в качестве модели шизофрении, а также у высокотревожных мышей (Дубровина, Лоскутова, 2003; Дубровина, Томиленко, 2006; Дубровина, 2011; Дубровина, Редь-кина, 2012).

Угашение представляет собой результат измененной иерархии выученных ответов, когда вновь приобретаемое поведение замещает ранее сформированный условный рефлекс, то есть это один из примеров интерференционного торможения, когда новое обучение тормозит старое (Bouton et al., 2008; Quirk, Mueller, 2008; Davis, 2011; Myers et al., 2011). Исследователи отмечали, что ассоциации условного и безусловного стимулов, специфические по своему сенсорному содержанию, полностью сохраняются во время угашения. Параллельно, во время многократного тестирования в отсутствии безусловного раздражения, происходит обучение тормозным ассоциациям, когда условный стимул не свидетельствует о наказании. Угашение представляет собой форму эмоциональной регуляции, которая имеет прямое отношение к лечению- болезней, обусловленных повышенными страхом и тревожностью (Blechert et al., 2007; Hofmann, 2008; Tronson, 2008; Sotres-Bayon et al., 2009; Hong et al., 2011). Протокол использования процедуры угашения хорошо известен клиницистам, специализирующимся в лечении болезней, обусловленных длительным сохранением реакций страха. Она заключается в предъявлении объектов или ситуаций, ранее сопряженных с появлением страха, при отсутствии какой либо угрозы. В опытах на животных поведенческой парадигмой служит угашение выработанной УР страха, в том числе и УРПИ, результатом которого является снижение воспроизведения следа памяти при многократном тестировании без наказания.

Не секрет, что классические антидепрессанты и анксиолитики при всех положительных эффектах, мало корректируют нарушения в когнитивной сфере при аффективных

4

состояниях, связанных с нарушением угашения памяти о страхе, и остается достаточно много пациентов с хроническими симптомами. Что касается участия нейромедиатор-ных систем, то мировые исследования последних лет выделяют работу глутаматных рецепторов, нарушение функционирования которых может оказаться ключевым фактором развития расстройств когнитивных процессов при аффективных состояниях, поскольку они регулируют активность дофамина и ГАМК в нейронных цепях (Schechter et al., 2005; El-Ghundi et al., 2007; Davis, 2011; Hashimoto, 2011; Abraham et al., 2012; Dunlop et al., 2012). Поэтому в качестве потенциальных источников препаратов для ускорения угашения памяти о страхе начали активно анализировать вклад глутаматерги-ческой, как возбуждающей, и дофаминергической, как модулирующей, медиаторных систем в механизмы нарушения угашения. Но фундаментальных исследований на биологических моделях аффективных состояний разного генеза чрезвычайно мало, хотя проведение их позволит приблизиться к пониманию рецепторных механизмов развития аффективных расстройств и внести конкретные предложения для разработки новых индивидуально-адаптированных средств терапии и профилактики. В связи с этим значимость выявления нейрохимических механизмов, обеспечивающих длительное сохранение воспроизведения аверсивных событий у животных с разным исходным психоэмоциональным статусом и возможности ускорения угашения памяти о страхе очевидна. Решение этих задач позволит расширить представления о центральной регуляции адаптивного поведения и наметить пути повышения эффективности корригирующих воздействий.

Цель и задачи исследования:

Целью работы был нейрофармакологический анализ влияний активации и блокады N-MeTnn-D-аспартатных (NMDA) и дофаминовых (ДА) рецепторов разных типов на процесс угашения следа памяти о страхе у мышей с депрессивноподобным состоянием, с высоким уровнем тревожности и агрессии.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вклад NMDA-рецепторов в модуляцию обучения, угашения УРПИ у мышей в норме и с разным психоэмоциональным статусом.

2. Изучить влияния активации и блокады дофаминовых D1- и D2-peuenTopoB на выработку и угашение УРПИ у агрессивных и субмиссивных мышей и у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния».

3. Поиск повышения эффективности фармакологических воздействий при сочетан-ном изменении активностей дофаминовых и NMDA-рецепторов в ускорении угашения памяти о страхе при депрессивноподобном состоянии у мышей.

5

Положения, выносимые на защиту:

В доклинических исследованиях на экспериментальных моделях аффективных состояний (депрессия, высокая тревожность, агрессия) с когнитивным симптомом нарушения угашения памяти о страхе показана избирательность фармакологической коррекции при изменениях активности NMDA-, дофаминовых D1- и 02-рецепторов.

Ускорение угашения УРПИ достигалось активацией NMDA-, активацией и блокадой D1-рецепторов у мышей с депрессивноподобным состоянием. У высоко-тревожных и агрессивных особей с дефектом угашения воздействия на NMDA- и дофаминовые D1-, 02-рецепторы оказались не эффективными.

Показано повышение эффективности коррекции нарушения угашения памяти о страхе у «депрессивных» мышей при одновременной активации NMDA- и D1-рецепторов по сравнению с одиночными введениями D-циклосерина и SKF 38393.

У мышей с депрессивноподобным состоянием антиамнестическое действие вызывают агонисты и антагонисты NMDA-рецепторов, а также антагонист D1-рецепторов, а у интактных особей - агонисты NMDA- и D1-рецепторов.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые показано следующее:

- зависимость модуляции обучения и угашения УРПИ при нейрофармакологических воздействиях на глутаматные NMDA-, дофаминовые D1- и Э2-рецепторы от вида аффективного состояния на экспериментальных моделях с когнитивным симптомом нарушения угашения памяти о страхе;

- выработка УРПИ ослаблялась при блокаде NMDA- и Б2-рецепторов независимо от исходного психоэмоционального статуса, а также у низко-тревожных мышей при активации NMDA-рецепторов и у агрессоров при активации D1-рецепторов;

- у интактных и субмиссивных мышей процесс угашения УРПИ замедлялся при блокаде NMDA-рецепторов и активации 02-рецепторов и ускорялся у интактных и средне-тревожных мышей при активации NMDA рецепторов;

- возможность ускорения угашения УРПИ активацией NMDA-рецепторов у мышей с депрессивноподобным состоянием, но не у высоко-тревожных особей, а также активацией и блокадой D1-рецепторов у «депрессивных» мышей, но не у агрессоров;

- антиамнестические влияния активации и блокады NMDA- и блокады D1-рецепторов у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния»;

- повышение эффективности коррекции нарушения угашения памяти о страхе у мышей с депрессивноподобным состоянием при одновременной активации NMDA- и Dl-рецепторов.

Научно-практнческая ценность. Результаты работы существенно расширяют фундаментальные представления об избирательности вклада глутаматных NMDA-, дофаминовых D1- и Б2-рецепторов в процесс'угашения памяти о страхе при депрессив-ноподобном состоянии, высоком уровне тревожности и агрессии. Исследование представляется важным в попытках конструирования нейрохимической мозаики мозга, характерной для аффективных расстройств разного генеза. Полученные в доклинических исследованиях данные о дифференцированной фармакологической коррекции нарушения угашения памяти о страхе при разных аффективных состояниях будут способствовать выбору стратегии в создании индивидуально адаптированных препаратов направленного действия. Показано повышение эффективности фармакологических воздействий при одновременной активации NMDA- и D1-рецепторов для предотвращения нарушения угашения памяти о страхе при депрессии.

Апробация работы

Материалы диссертации обсуждались на VI Физиологическом съезде (Барнаул, 2008), на Конференции молодых ученых Института физиологии СО РАМН (2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 7 статей в отечественных рецензируемых журналах и 3 статьи за рубежом (перевод).

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, методы, результаты исследования, заключение, выводы, список литературы из 227 источников. Работа изложена на 102 страницах, содержит 16 рисунков и 5 таблиц.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен и проанализирован лично.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Эксперименты проводилась на мышах самцах C57BL/6J в возрасте 2 - 3.5 мес, содержавшихся по 5 особей в клетке при естественном освещении и обычной диете лабораторных животных. В группах использовано по 9 - 15 мышей.

Исследование проведено с использованием ряда экспериментальных моделей аффективных состояний. 1. Формирование агрессивного и субмиссивного типов поведения по методу сенсорного контакта (Кудрявцева, 1999) заключалось в закреплении опыта побед и поражений при повторных столкновениях в течение 20 дней. 2. Модель депрес-сивноподобного состояния (Urani et al., 2001; Alcaro et al., 2002) — формирование реакции «поведенческого отчаяния» как результат принудительного плавания в водном бассейне (3 дня по 5 мин, температура воды 20-22°С). 3. Мыши с высоким уровнем тре-

1

вожности были выбраны по основному показателю в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) - малому времени нахождения на открытых рукавах (24,3 ± 6,1).

Методы для анализа поведения

Исследование двигательно-исследовательского, тревожного, депрессивноподобного поведения и реакции на новизну осуществляли в тестах ПКЛ, принудительного плавания и «свет/темнота». Установка ПКЛ состояла из двух закрытых и двух открытых рукавов, расположенных крестообразно. Мышь помещалась в центр лабиринта носом к закрытому рукаву. Анализировали следующие показатели: время нахождения на открытых рукавах и в центре, число выходов на открытые рукава и свешиваний с них, количество выглядываний из закрытых рукавов, переходов из одного закрытого рукава в другой и вертикальных стоек, а также уровень дефекаций в течение 5 мин теста. Тест «свет/темнота» проводили при ознакомлении мышей с экспериментальной камерой для выработки рефлекса пассивного избегания. Регистрировали латентный период (ЛП) первого перехода в темный отсек, время пребывания в светлом отсеке, число переходов из отсека в отсек, вертикальных стоек, заглядываний в темный отсек, выглядываний из него и уровень дефекаций в течение 180 с. В тесте принудительного плавания регистрировали время полной неподвижности.

Методы для анализа процессов воспроизведения следа памяти.

Условная реакция пассивного избегания (УРПИ) использовалась нами в качестве экспериментальной парадигмы при анализе процессов обучения и угашения памяти о страхе. Выработка УРПИ в одном сочетании (Jarvik, Kopp, 1967) проводилась в камере с темным и светлым отсеками. Пол камеры выполнен из двух металлических пластин, на которые в темном отделении подавался электрический ток. Каждую мышь помещали в светлый отсек хвостом к отверстию. В день выработки рефлекса, когда мышь разворачивалась и входила в темный отсек четырьмя лапами, отверстие закрывалось, и она получала электрокожное раздражение интенсивностью 0,5мА и длительностью 1 с. Для проверки обучения мышь через 24 часа после выработки УРПИ помещалась в светлый отсек. Основным показателем выработки условного рефлекса служил ЛП перехода в темное отделение. Критерием хорошей выработки считался ЛП перехода, превышавший 80 с. Максимальное время наблюдения за животным - 180 с.

Угашение условной реакции пассивного избегания представляло поведенческую процедуру, которая включала повторное многократное предъявление контекста экспериментальной установки без болевого стимула. При многократном тестировании в норме происходило снижение уровня воспроизведения выработанного навыка, когда

мыши обучаются игнорированию темного отсека установки как «опасного». Процедура угашения длилась 13-25 дней после однократной выработки УРПИ.

Амнезия вызывалась задержкой животного в темном, «опасном» отсеке сразу же после болевого безусловного раздражения при выработке УРПИ (Robustelli, Jarvik, 1968; Дубровина, Лоскутова, 2003). Мы использовали пятиминутную задержку, которая полностью блокировала воспроизведение УРПИ у интактных мышей.

Фармакологический анализ

Использовались селективные для отдельных типов рецепторов глутаматной и до-фаминергической систем мозга препараты фирмы «Sigma», США. Агонисты NMDA-рецепторов - D-циклосерин - частичный агонист глицинового участка NMDA-рецепторов в дозе 20 мг/кг; N-метил-Р-аспарагиновая кислота (глутамат связывающий участок) в дозе 25 мг/кг. Антагонисты: дизоцилпин (МК-801) - блокатор ионных каналов NMDA-рецепторов в дозе 0,15 мг/кг; chlorokvnurenic acid (7KYN, модулирующий глициновый участок) в дозе 10 мг/кг. Агонисты дофаминовых рецепторов - D2-рецепторов квинпирол в дозе 1 мг/кг и D1 -рецепторов SKF38393 в дозе 5 мг/кг. Антагонисты - Р2-рецепторов S-(-) сульпирид в дозе 10 мг/кг и Dl-рецепторов SCH23390 в дозе 1 мг/кг. Все препараты вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл на мышь за 30 — 60 мин до выработки УРПИ.

Результаты поведенческих исследований обработаны статистически с помощью дисперсионного однофакторного ANOVA. Сравнение динамики обучения и угашения УРПИ проводили с помощью двухфакторного ANOVA для повторных наблюдений с последующим post hoc анализом по Ньюмену-Кейслу и использованием теста множественных попарных сравнений LSD.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

Роль NMDA-рецепторов в обучении и угашенни следа памяти у мышей с разным психоэмоциональным статусом

При анализе эффективности активации и блокады NMDA-рецепторов на обучение и угашение УРПИ мышей с разным исходным уровнем тревожности оценивали влияние однократного введения D-циклозерина и дизоцилшша у высоко-, средне- и низкотревожных мышей. Двухфакторный анализ вариаций ЛП перехода при обучении и угашении УРПИ у мышей 9 групп выявил значимость факторов группы (F8,68 = 11.31, pO.OOOl) и времени (F9j6i2 = 77.13, pO.OOOl), а также их взаимодействия (F72,6i2 = 4.13, pcO.OOOl).

У средне-тревожных мышей, угашение которых сходно по динамике с интактными особями, агонист NMDA-рецепторов D-циклозерин вызывал более быстрое развитие

угашения, а антагонист №ЛОА-рецепторов дизоцилпин замедлял этот процесс (рис. 1). У высоко-тревожных мышей со стабильным воспроизведением УРПИ без признаков снижения его уровня при тестировании без наказания В-циклозерин существенно не менял динамики угашения. Дизоцилпин значимо снижал способность к обучению, но при этом воспроизведение УРПИ оставалось стабильным на уровне выработанной реакции, т. е. как и в контроле не отмечалось угашения. У низко-тревожных мышей О-циклозерин вызывал ухудшение обучения и ускорение угашения, а дизоцилпин полностью блокировал обучение УРПИ, и процесс угашения проследить было невозможно.

-,-т--1-1-г--—I-1-1-1

О 1 2 3 5 7 9 11 13 15

Рис. 1. Влияние активации и блокады ЫМИА-рецепторов на динамику угашения условной реакции пассивного избегания у мышей с разным уровнем тревожности. 1- контроль; 2 - введение О-циклосерина в дозе 30 мг/кг за 1 ч до выработки рефлекса; 3 - дизоцилпин (МК-801) в дозе 0.15 мг/кг. По оси абцисс - время тестирования, сут (0 - день выработки рефлекса); по оси ординат - латентный период перехода, с. * р< 0.05 - достоверные различия относительно первых суток тестирования.

Принципиальным результатом данного эксперимента была обнаруженная избирательность влияний активации и блокады ЫМОА-рецепторов на обучение и угашение УРПИ у высоко-, средне- и низко-тревожных мышей.

У агрессивных мышей с дефицитом угашения дизоцилпин ухудшил выработку УРПИ, но существенно не изменил угашения. У субмиссивных мышей с ускоренным угашением дизоцилпин снижал уровень обучения и блокировал процесс угашения.

У мышей с реакцией "поведенческого отчаяния" (модель депрессии) с нарушенным угашением выработанного рефлекса пассивного избегания при оценке двигательно-эмоциональных компонентов поведения в тестах приподнятого крестообразного лабиринта (рис. 2) и свет/темнота получены свидетельства исходной повышенной тревожности.

12 10 8 6 4 2 О

80 70 60 50 40 30 20 10 О

Рис. 2. Показатели поведения мышей в тесте приподнятого крестообразного лабиринта. Светлые столбики - контроль; штриховка - мыши с реакцией "поведенческого отчаяния" 1 - вертикальные стойки; 2 - переходы из одного закрытого рукава в другой; 3 -выглядывания из закрытых рукавов; 4 - уровень дефекаций; 5 - свешивания с открытых рукавов; 6 - время нахождения на открытых рукавах, 7 - время нахождения в центре. По оси абцисс - показатели поведения, по оси ординат: слева - число, справа - время, с. * р< 0,05 и ** р< 0,001 по сравнению с контролем.

При оценке влияний активации и блокады ЫМОА-рецепторов на обучение и угашение УРПИ показано, что О-циклосерин ускорял угашение у интактных мышей и способствовал развитию этого процесса у мышей с депрессивноподобным состоянием при неизменности выработки условного навыка (рис. 3). Это влияние отразилось в уменьшении времени (с 9-ти до 5-ти суток) до начала угашения в норме и в более низких значениях ЛП перехода при тестировании на 7 - 21-ые сутки относительно 1-х суток (р<0,05) у «депрессивных» мышей. Блокада ММОА-рецепторов дизоцилпином ухудшала обучение мышей в обеих ситуациях, но нарушала угашение у интактных мышей и в незначительной степени способствовала развитию этого процесса у мышей с реакци-

ей «поведенческого отчаяния», что прослеживалось по снижению уровня воспроизведения сформированной УРПИ, начиная с 17-ых суток.

А

О 1

7 9 11 13 15 17 19 21

дни

сек

200 150 100

50

! % 0 т

0 1

-. *

■и., V

*

♦ 5

■.....

* *

4 * 6

7 9 11 13 15 17 19 21

дни

Рис. 3. Влияния активации и блокады ЫМОА-рецепторов на обучение и угашение УРПИ у мышей в норме (А) и при депрессивноподобном состоянии (Б).

1 - контроль, норма; 5 - контроль, депрессивноподобное состояние; 2 и 6 - введение агони-ста ЫМБА рецепторов О-циклосерина в дозе 20 мг/кг за 30 мин до выработки рефлекса интакт-ным и «депрессивным» мышам; 3 и 4 - введение антагониста ЫМЭА рецепторов дизоциппина в дозе 0,15 мг/кг. По оси абсцисс - время тестирования, сут (0 - день выработки рефлекса); по оси ординат - латентный период перехода, сек. * р<0.05 - достоверные различия относительно первых суток тестирования.

Таким образом, разный психоэмоциональный статус мышей определяет избирательность вовлечения КМОА-рецепторов в механизмы, обеспечивающие обучение и угашение УРПИ. Представляется важным результат о способности О-циклосерина облегчать формирование нового рефлекса, заключающегося в игнорировании темного отсека установки как «опасного», у «депрессивных» мышей.

Роль дофаминовых рецепторов в обучении и угашешш следа памяти у мышей с разным психоэмоциональным статусом

Вовлечение дофаминергической системы в формирование поведенческого статуса, в процессы обучения и памяти не вызывают сомнения (Попова и др., 1996; Castellano et al., 1999; Дубровина, Лоскутова, 2003; Bemaerts, Tirelli, 2003; Wood, Anagnostaras, 2009). Получены достаточно противоречивые данные о дифференцированной роли Dipt D2-peuetrropoB в этих процессах и практически ничего не известно о зависимости их вклада в модуляцию воспроизведения УРПИ при угашении от базового поведенческого статуса и при депрессивноподобном состоянии.

Анализ влияния активации Dl-рецепторов на обучение и угашение УРПИ у агрессивных и субмиссивных мышей показал следующее. У агрессивных мышей при введении SKF 38393 регистрировалось существенное и длительное угнетение воспроизведения УРПИ, но при этом не наблюдалось угашения навыка, то есть увеличение функционирования Dl-рецепторов не корректирует характерный для «победителей» дефект угашения памяти о страхе. У субмиссивных мышей с ускоренным типом угашения активация Dl-рецепторов, не влияя на выработку УРПИ, привела к нарушению угашения, что отразилось в увеличении времени сохранения памяти о страхе перед темным отсеком установки (12 дней по сравнению с 5 днями у контрольных мышей, р<0.05).

Развитие симптомов депрессивноподобного состояния сопровождалось изменением уровней дофамина и его метаболитов в мезолимбикокорковой системе и нарушением баланса 01/02-рецепторов (Августинович и др., 2004; Perona et al., 2008; Sarkisova, van Luijtelaar, 2011). Однако роль ДА рецепторов в процессе угашения памяти о страхе исследована мало (Borowski, Kokkinidis, 1998; Espejo, 2003; Ponnusamy et al., 2005; El-Ghundi et al., 2007). И не рассматривался вопрос о возможности ускорения угашения памяти о страхе при активации и блокаде D1- и 02-рецепторов в модели депрессивно-подобного состояния, что послужило предметом следующей серии экспериментов.

У интактных мышей активация 02-рецепторов квинпиролом существенно нарушала угашение УРПИ, не оказывая влияния на выработку. У мышей с депрессивноподобным состоянием, характеризующихся задержкой угашения, квинпирол не вызывал изменений выработки и угашения УРПИ. Это может быть обусловлено искажением восприятия окружающих стимулов или усилением персеверации паттернов выученного поведения (Kurylo, 2004; Ponnusamy et al., 2005). Блокада 02-рецепторов сульпиридом у интактных мышей снижала обучение без изменения динамики угашения. У мышей с реакцией «поведенческого отчаяния» сульпирид ухудшил обучение и способствовал уга-

13

шению, что отразилось в достоверно более низких значениях ЛП перехода по сравнению с показателем воспроизведения УРПИ в 1-й день.

Активация и блокада Б1-рецепторов введением 5КТ38393 и 8СН23390 у интактных мышей не вызвали достоверных изменений выработки и угашения УРПИ. У «депрессивных» мышей 8КТ38393 и 5СН23390, не изменяя обучения, способствовали развитию процесса угашения, то есть снижению уровня воспроизведения по мере тестирования без наказания (рис. 4).

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

1;::

■г

-I.

-I-

-1-.

"г

"Ч

г

л

*

I......щ

* л. Ш

ж;

а ♦

1

и

13

Рис. 4. Изменения выработки и угашения УРПИ у мышей с депрессивноподобным состоянием при активации и блокаде -дофаминовых рецепторов.

1 - контроль, мыши с реакцией «поведенческого отчаяния»; 2 - введение агониста Ш-рецепторов 5КР38393 (5 мг/кг, внутрибрюшинно, за 30 мин до выработки рефлекса); 3 -антагониста 01-рецепторов 5СН23390 (1 мг/кг). *-р<0.05 - достоверные различия относительно первых суток тестирования.

Этот эффект отчетливо виден по низким значениям ЛП перехода относительно обучения - начиная с 5-х суток у 8КР38393-инъецированных и с 7-х суток у 8СН23390-инъецированных мышей, р<0.05. Следует отметить, что полного угашения выработанного навыка при активации 01-рецепторов не произошло, так как и на 13-й день тестирования ЛП достоверно превышал значения, регистрируемые до выработки УРПИ (р<0.05). Более выраженные изменения угашения у мышей с депрессивноподобным состоянием, безусловно, связаны с важной ролью ДА системы в развитии депрессии (Уа-сШе1а1., 2001; \VilIner, 2005).

Так как скорость угашения памяти о страхе является важным доклиническим маркером посттравматических стрессовых болезней и депрессии (МуиЫге е1 а1., 2007; В1е-сЬеП е1 а1., 2007; Вигтз ег а1., 2008), то несомненный интерес вызывают полученные в нашем исследовании данные об ускорении угашения УРПИ при действии на 0114

рецепторы. Факт однонаправленного влияния агониста и антагониста D1-рецепторов, заключающийся в ускорении угашения памяти о страхе, выглядит парадоксальным. Скорее всего для обеспечения адаптивных перестроек при.изменении стрессовых условий окружающей обстановки требуются оптимальные уровни функционирования D1-рецепторов в мезолимбических и мезокортикальных структурах мозга.

Итак, при анализе угашения УРПИ показан различный характер взаимосвязи между эффективностью воздействия на определенный тип ДА рецепторов и исходным поведенческим статусом мышей. В норме лишь при активации D2-, но не D1-рецепторов развивался дефицит угашения, а при депрессивноподобном состоянии активация и блокада D1-, но не D2-peuenTopoB восстанавливали процесс угашения.

Взаимодействие NMDA- и Dl-рецепторов в модуляции угашения УРПИ мышей с депрессивноподобным состоянием

Поскольку было показана возможность коррекции когнитивного симптома депрес-сивноподобного состояния при активации NMDA- и Dl-рецепторов, то представлялось целесообразным попытаться повысить эффективность положительного влияния на дефицит угашения памяти об аверсивных событиях при одновременной активации этих рецепторов. Признается, что анализ характеристик NMDA/D1 взаимодействий может быть критичным для поиска новых атьтернативных фармакологических подходов в лечении ряда нейропсихиатрических болезней (Missale et al., 2006; Javitt, 2007; Del Arco, Mora, 2009).

Использовано 8 групп мышей (интактные и с депрессивноподобным состоянием) с одиночными и совместными введениями D-циклосерина и SKF 38393 в норме и депрессивноподобным состоянием. Статистический анализ ЛП перехода мышей всех групп выявил значимость факторов группы (F7,72 = 8.41, р<0,0001), времени (FIZ,gs4 = 103.63, р<0,0001) и их взаимодействия (F84>864 = 3.82, р<0,0001).

У интактных мышей при одновременной активации NMDA- и Dl-рецепторов наблюдалась динамика угашения УРПИ, сходная с одиночным введением D-циклосерина, когда достоверно меньшие значения ЛП перехода отмечались на 5 - 7-е сутки тестирования относительно контроля.

У мышей с реакцией «поведенческого отчаяния» при совместной активации NMDA-и Dl-рецепторов наблюдалась иная последовательность изменений ЛП перехода по сравнению с модификациями этого параметра у D-циклосерин- и SKF 38393-инъецированных особей при их изолированных введениях (рис. 5).

Рис. 5. Влияния отдельной и совместной активации NMDA- и Dl-рецепторов на выработку и угашение УРПИ у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния».

1 - контроль депрессивноподобного состояния, физиологический раствор; 2 - введение D-циклосерина за 1 час до выработки рефлекса в дозе 20 мг/кг, 3 - SKF 38393 - за 30 мин до выработки в дозе 5 мг/кг; 4 - введение D-циклосерина + SKF38393. * р<0.05 - достоверные различия между мышами групп 4 и 2, х р<0.05 - достоверные различия между мышами групп 4 и 3.

Выявлены две особенности влияния этих препаратов при их совместном введении.

Во-первых, отмечено ускорение начала угашения. Снижение уровня воспроизведения следа памяти у мышей с активацией NMDA- и Dl-рецепторов относительно 1-х суток (показатель выработки рефлекса) начиналось с 3-х суток тестирования без наказания по сравнению с 5-ми сутками у SKF 38393-инъецированных и 7-ми сутками у D-циклосерин-инъецированных мышей. Второй отличительной особенностью влияния одновременной активации NMDA- и Dl-рецепторов явилось развитие полного угашения УРПИ, начиная с 7-х суток тестирования, чего не наблюдалось при отдельных введениях D-циклосерина и SKF 38393. О повышении эффективности влияния одновременной активации NMDA- и Dl-рецепторов также свидетельствуют достоверные различия в значениях ЛП перехода между группами мышей 4 и 2 на 7 - 11-е сутки (р<0.05) и между группами 4 и 3 - на 9 - 13-е сутки (р<0.05) тестирования.

Возможно, что коррекция дефицита угашения у «депрессивных» мышей при активации NMDA- и Dl-рецепторов происходит через механизм повышения тормозного контроля над аверсивностью окружения при тестировании без наказания, приводящего к проявлениям сформированной в процессе угашения новой ассоциации «контекст + нет наказания». Косвенным подтверждением возможности такого механизма служат дан-

ные о кардинальной роли взаимодействия NMDA- и D1-рецепторов в сенсомоторном сопряжении при анализе препульсового торможения акустической реакции вздрагивания (Bortolato et al., 2005; Bubenikova-Valesova et al., 2009). Еще одной причиной ускорения угашения при активации NMDA- и D1-рецепторов может быть снижение ситуативной тревожности во время процедуры тестирования без наказания. Однако в литературе не удалось найти убедительных экспериментальных доказательств анксиолитиче-ских эффектов D-циклосерина и SKF 38393. Из представленных данных трудно определить нейрональный субстрат, лежащий в основе взаимодействия двух медиаторных систем, модулирующих процесс угашения. В то же время известно, что угашение памяти о неприятных событиях вовлекает новое обучение, приводящее к торможению экспрессии первоначально выработанной аверсивной УР, которое опосредуется преимущественно амигдалой и медиальной префронтальной корой (Sotres-Bayon et al., 2009). При учете доказанного существования NMDA/D1 рецепторных комплексов в этих структурах (Pickel et al., 2006; Kruse et al., 2009) можно предположить, что активация Dl-рецепторов потенцирует пластичность NMDA синапсов, способствуя ускоренному угашению УРПИ у «депрессивных» мышей. Итак, выявлены дополняющие друг друга влияния одновременной активации D1 и NMDA рецепторов в блокаде длительного сохранения страха у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния». Эти данные можно рассматривать как доклинический этап при разработке фармакологических способов ускорения угашения памяти об аверсивных событиях при психопатологических нарушениях типа депрессии.

В отдельных экспериментах в модели «психогенной» показана зависимость антиам-нестических влияний препаратов, активирующих и тормозящих активность NMDA- и Dl-рецепторов, от исходного функционального состояния мышей. У мышей с реакцией «поведенческого отчаяния» агонисты (N-метил-О-аспарагиновая кислота и D-циклосерин) и антагонисты (дизоцилпин и 7-chlorokynurenic acid) NMDA-рецепторов, а также антагонист Dl-рецепторов SCH23390 оказывали выраженное антиамнестическое действие, а у интактных особей лишь активация NMDA-рецепторов и Dl-рецепторов улучшала воспроизведение УРПИ.

Заключение

Суммируя полученные результаты, следует отметить несколько важных моментов:

1. Отсутствие существенных дефектов в обучении УРПИ у мышей с различным психоэмоциональным статусом. Показана вариабельность угашения выработанной УРПИ при длительном предъявлении обстановочного условного стимула (экспериментальной камеры), не сигнализирующего об опасности. У интактных мышей процесс

17

угашения развивался постепенно по мере тестирования и к 7 - 9-м суткам УРПИ не воспроизводилась. В этот период происходит формирование нового следа памяти о безопасности темного отсека. У низкотревожных мышей обнаружена задержка, а у субмиссивных - ускорение угашения УРПИ по сравнению с интактными особями. У мышей с депрессивноподобным состоянием, высокой тревожностью и агрессивным стереотипом зарегистрировано нарушение угашения, когда след памяти о страхе перед темным отсеком воспроизводился вплоть до 21-х суток тестирования без наказания. То есть у таких мышей нарушены механизмы, обеспечивающие торможение сохранения нежелательной памяти и блокаду нового обучения. Дефицит угашения памяти о страхе рассматривается как когнитивный симптом болезней стресса, в том числе депрессии.

2. Экспериментально обосновано, что исходный поведенческий статус существенно детерминирует влияние фармакологических воздействий. Выявлены достаточно сложные взаимоотношения мишени действия препарата и эффективности его влияния.

Относительно влияний на обучение показано ухудшение выработки УРПИ при блокаде ЫМЛА-рецепторов независимо от предварительных воздействий на поведение. В-циклосерин (агонист ММОА-рецепторов) снижал обучение только у низко-тревожных мышей, а 8КР 38393 (агонист Б1-рецепторов) - у агрессоров. Сульпирид (антагонист 02-рецепторов) ухудшал выработку УРПИ как у интактных мышей, так и у мышей с депрессивноподобным состоянием.

Что касается нейрофармакологических влияний на сохранение УРПИ у мышей без явных признаков дефекта угашения, то получены следующие данные. У интактных мышей активация ЫМЛА-рецепторов вызывала ускорение угашения, а блокада этих рецепторов вызывала дефект развития этого процесса; активация 02-рецепторов квин-пиролом полностью блокировала процесс нового обучения, нарушая угашение УРПИ; активация и блокада 01-рецепторов (8КТ 38393 и 8СН23390), а также блокада 02-рецепторов сульпиридом не изменяли угашения. У средне- и низко-тревожных мышей, О-циклосерин вызывал незначительное ускорение этого процесса, а у субмиссивных особей не имел влияния. Дизоцилпин задерживал угашение у средне-тревожных и субмиссивных мышей. У субмиссивных мышей такой же эффект регистрировался при активации 01-рецепторов БКР 38393.

3. Поскольку классические антидепрессанты не купируют симптом длительного сохранения памяти о неприятных событиях у пацентов с индуцированным эмоциональным стрессом расстройствами психики, то представляют интерес данные о влиянии веществ, изменяющих активность ЫМОА-, 01- и 02-рецепторов с точки зрения возможных фармакологических корректоров нарушения угашения памяти о страхе. У вы-

18

соко-тревожных мышей ни активация, ни блокада активности ЫМЛА-рецепторов существенно не изменяли стабильности воспроизведения УРПИ, то есть дефицит угаше-ния сохранялся. Ранее в лаборатории была показана неэффективность агонистов 01- и Б2-рецепторов (ЭКБ 38393 и квинпирол) на угашение у таких особей. У агрессивных мышей также обнаружена неспособность коррекции дефицита угашения памяти о страхе при фармакологических воздействиях на КМОА- и 01 -рецепторы.

Совершенно иная картина модификаций угашения УРПИ при изменении активности №»ЮА-, 01- и В2-рецепторов получена у мышей с депрессивноподобным состоянием. Дефицит угашения сохранялся при введении агониста 02-рецепторов квинпиро-ла. Блокада же Б2-рецепторов сульпиридом у таких особей способствовала развитию угашения, но при снижении обучаемости УРПИ. Такой же слабый позитивный эффект на угашение показан при блокаде ЫМИА- рецепторов. Более сильными корректорами симптома нарушения угашения памяти о страхе у «депрессивных» мышей оказались циклосерин, 5КР 38393 и 5СН23390.

Для более наглядного представления фармакологически-вызванных возможностей

купирования симптома длительного сохранения памяти о страхе у мышей представлена

качественная картина эффективностей ЫМОА и ДА препаратов (таблица).

Таблица. Эффективность активации п блокады ММОА-, 01- п П2-рецепторов в ускорении угашения памяти о страхе при аффективных состояниях.

Депрессия Агрессия Тревожность

Активация ККТОА-рецепторов, Э-циклосерин (2) 15

Блокада ЫМОА-рецепторов, дизоцилпин 30 0 6

Активация 01-рецепторов, БКР 38393 (2) 0 0

Блокада Б1-рецепторов БСН 23390 ©

Активация 02-рецепторов, квинпирол 0 0 0

Блокада 02-рецепторов, сульпирид, галоперидол 34 30

0-циклосерин+ БЫ7 38393 ©

Эффективность препарата по ускорению угашения УРПИ определялась в процентах как разность между уровнем воспроизведения у мышей с нарушенным угашением, который оставался 100%-ым и средним уровнем воспроизведения в процедуре угашения. Средний уровень воспроизведения высчитывался как сумма уровней воспроизведения в каждый день тестирования без подкрепления относительно обучения (1-й день после выработки рефлекса, который принимался за 100%) и делился на количество дней, начиная со 2-го.

Таким образом, результаты данного исследования показали, что фармакологические препараты с воздействием на NMDA-, D1- и D2-peueiiTOpbi не могут рассматриваться при поиске путей эффективных стратегий лечения патологической тревожности и агрессии. В то же время из таблицы видно, что один из подходов целенаправленной коррекции когнитивного симптома депрессивноподобного состояния заключается в поиске селективных веществ, повышающих активность NMDA-рецепторов или обеспечивающих баланс функционального состояния ДА системы через активацию/торможение D1-рецепторов. В качестве другого подхода можно рассматривать взаимодополняющие положительные влияния при взаимодействии NMDA- и D1-рецепторов. Показано повышение эффективности коррекции дефицита угашения памяти о страхе при депрес-сивноподобном состоянии мышей при одновременной активации NMDA- и D1-рецепторов до 67% по сравнению с 45% и 43% при отдельном введении D-циклосерина и SKF 38393.

Итак, представленные данные могут рассматриваться как доклинический этап при разработке способов ускорения угашения памяти о страхе и помочь в поиске перспективных средств фармакотерапии и профилактики психопатологических нарушений. Представляется ясной перспективность дальнейших исследований не только вклада разных типов и подтипов рецепторов, но и их взаимодействия для поиска путей снижения сохранения памяти о негативных событиях при психоэмоциональных нарушениях разного генеза.

ВЫВОДЫ

1. В доклинических исследованиях на экспериментальных моделях аффективных состояний (депрессия, высокая тревожность, агрессия) с когнитивным симптомом нарушения угашения памяти о страхе показана избирательность фармакологической коррекции при нейрофармакологических изменениях активности Ы-метил-Б-аспартатных (NMDA), D1- и D2- типов дофаминовых рецепторов.

2. Показана зависимость влияния активации и блокады 1М-метил-0-аспартатных (МШЗА) рецепторов на обучение и угашение УРПИ от уровня тревожности и выработанного поведенческого стереотипа мышей. Активация. ЫМЭА рецепторов ускоряла развитие угашения у средне- и низко-тревожных мышей, а их блокада, ухудшая выработку рефлекса, задерживала угашение у средне-тревожных и субмиссивных особей. У агрессивных мышей блокада Ы1УГОА рецепторов снижает способность к обучению, не изменяя процесс угашения условного рефлекса пассивного избегания.

3. У мышей с реакцией «поведенческого отчаяния» (модель депрессии) обнаружены положительные влияния по ускорению угашения памяти о страхе при активации 1\ГМОА рецепторов О-циклосерином. Блокада ЫМОА рецепторов нарушала угашение у интактных мышей, но частично купировала симптом длительного сохранения УРПИ у «депрессивных» мышей.

4. Выявлена избирательность угашения УРПИ, обусловленная нейрофармакологи-ческими воздействиями на 01- и В2- типы дофаминовых рецепторов у интактных мышей и при депрессивноподобном состоянии. Активация Б2-рецепторов квинпиролом нарушала угашение УРПИ у интактных мышей и сохраняла резистентность к угаше-нию при депрессивноподобном состоянии. У «депрессивных» мышей с нарушением угашения, активация -рецепторов и их блокада вызывали позитивный эффект ускорения угашения памяти о страхе.

5. Влияние агониста В1-рецепторов определялось поведенческим стереотипом. У субмиссивных мышей 8КР 38393 увеличивал длительность сохранения воспроизведения следа памяти, свидетельствующую о нарушении угашения. У агрессивных мышей

- препарат ухудшал выработку УРПИ, .но не изменял дефицита угашения, характерного для агрессоров.

6. Установлено, что у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния» наиболее выраженное антиамнестическое действие оказывают активация и блокада ЫМЛА-рецепторов и блокада 01-рецепторов, а у интактных особей - активация ЫМБА- и 01-рецепторов.

7. Впервые у мышей с депрессивноподобным состоянием обнаружены взаимодополняющие влияния одновременной активации ИМЛА- и 01-рецепторов по ускорению начала угашения и развитию полного угашения УРПИ по сравнению с одиночными введениями О-циклосерина и 8КР 38393, что свидетельствует о повышении эффективности коррекции нарушения угашения памяти о страхе.

Публикации по теме диссертации

1. Дубровина Н.И., Зиновьев Д Р., Зиновьева Д.В. Ы-метил-О-аспартатныс рецепторы и амнезия у мышей с депрессивноподобным состоянием // Бюлл. экспер. мед. биол. 2007,- Т. 144, №11.- С.484-486.

2. Дубровина Н.И., Зиновьев Д.Р., Зиновьева Д.В., Куликов А.В. Обучение и угаше-ние реакции пассивного избегания у мышей с высокой предрасположенностью к каталепсии // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова 2008. - Т. 94, №6. - С. 609-616.

3. Дубровина Н.И., Зиновьева Д.В. Влияния активации и блокады дофаминовых рецепторов на угашение реакции пассивного избегания у мышей с депрессивноподобным состоянием // Журн. высш. нервн. деят. 2008. - Т. 58, №5. - С. 626-631.

4. Дубровина Н.И., Зиновьева Д.В. Флумазенил восстанавливает амнезированный след памяти у мышей с депрессивноподобным состоянием // Экспер. клин, фармакол. 2009.-Т. 72, №5.-С. 8-10.

5. Дубровина Н.И., Зиновьева Д.В. Фармакологическая коррекция нарушений уга-шения памяти о страхе при депрессивноподобном состоянии // Бюлл. СО РАМН 2010. -Т. 30, №4. - С. 25-30.

6. Дубровина Н.И., Зиновьев Д.Р., Зиновьева Д.В. Угашение условной реакции пассивного избегания у мышей разных линий // Журн. высш. нервн. деят. 2010. - Т. 60, № 6.-С. 712-718.

7. Дубровина Н И., Зиновьева Д.В. Взаимодействие N-метил-О-аспартатных и дофаминовых D1 рецепторов в модуляции угашения условной реакции пассивного избегания мышей с депрессивноподобным состоянием // Росс, физиол. ж. им. И.П.Сеченова 2011. - Т. 97, №7. - С. 700-707.

8. Dubrovina N.I., Zinov'ev D.R., Zinov'eva D.V., Kulikov A.V. Learning and extinction of a passive avoidance response in mice with high level of predisposition to catalepsy // Neu-rosci. Behav. Physiol. 2009. - Vol. 39, № 5. - P. 475-480.

9. Dubrovina H.I., Zinov'eva D.V. Effects of activation and blockade of dopamine receptors on the extinction of a passive avoidance reaction in mice with a depressive-like state // Neurosci. Behav. Physiol. 2010. - Vol. 40, № 1. - P. 55-59.

10. Dubrovina H.I., Zinov'eva D.V. Interaction of N-methyl-D-aspartate and dopamine D1 receptors in modulating the extinction of a conditioned passive avoidance reflex in mice with a depression-like state // Neurosci. Behav. Physiol. 2013. - Vol. 43, № 3. - P. 416-421.

подписано к печати 20.10.2013 г. Формат бумаги 60x90 1/16 Печ.л. 1. Уч.изд. п. 0,7 Тираж 80 экз. Заказ №12

Полиграфика 630055, Новосибирск ул. Бульвар Молодежи 36Б т. 3750117

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зиновьева, Дарья Владимировна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СО РАМН

На правах рукописи

ЗИНОВЬЕВА ДАРЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ ГЛУТАМАТНЫХ И ДОФАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В УГАШЕНИИ ПАМЯТИ О СТРАХЕ У МЫШЕЙ С ДЕПРЕССИВНОПО-ДОБНЫМ СОСТОЯНИЕМ, ВЫСОКОЙ ТРЕВОЖНОСТЬЮ И АГРЕССИВНЫМ СТЕРЕОТИПОМ

03.03.01 - физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Н.И. Дубровина

Новосибирск 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Обучение, угашение аверсивных условных реакций и амнезии..............................9

1.2. Т^-метил-О-аспартатные рецепторы в поведении и памяти..................................14

1.3. Значимость дофаминергической системы мозга в регуляции поведения и

памяти...........................................................................................................22

1.4. Взаимодействие NMDA и дофаминовых рецепторов в регуляции обучения и

сохранения памяти об аверсивных событиях...........................................................33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Животные..................................................................................................36

2.2. Экспериментальные модели ...........................................................................36

2.3. Поведенческие исследования..........................................................................37

2.4. Методы для анализа процессов воспроизведения следа памяти ..............................37

2.5. Фармакологический анализ............................................................................38

2.6. Статистическая обработка данных...................................................................39

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. РОЛЬ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ В ОБУЧЕНИИ, УГАШЕНИИ СЛЕДА ПАМЯТИ

У МЫШЕЙ С РАЗНЫМ ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНЫМ СТАТУСОМ

3.1.1. Влияние активации и блокады NMDA-рецепторов на угашение условной реакции

пассивного избегания у мышей с разным уровнем тревожности..................................40

3.1.2. Влияние блокады ЫМОА-рецепторов на угашение следа памяти агрессивных и суб-миссивных мышей.............................................................................................48

3.1.3. Влияние активации и блокады КМОА-рецепторов на обучение и угашение

УРПИ у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния» ............................................51

3.2. РОЛЬ ДОФАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ОБУЧЕНИИ, УГАШЕНИИ СЛЕДА ПАМЯТИ У МЫШЕЙ С РАЗНЫМ ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНЫМ СТАТУСОМ

3.2.1. Роль дофаминовых Б1-рецепторов в угашении УРПИ у агрессивных и субмиссивных мышей.............................................................................................................58

3.2.2. Влияние активации и блокады дофаминовых рецепторов на угашение

УРПИ мышей с депрессивноподобным состоянием ...................................................62

3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Ы-МЕТИЛ-Э-АСПАРТАТНЫХ И ДОФАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В МОДУЛЯЦИИ УГАШЕНИЯ УСЛОВНОЙ РЕАКЦИИ ПАССИВНОГО ИЗБЕГА-

НИЯ МЫШЕЙ С ДЕПРЕССИВНОПОДОБНЫМ СОСТОЯНИЕМ ...............................69

3.4. ОСОБЕННОСТИ АНТИАМНЕСТИЧЕСКИХ ВЛИЯНИЙ АКТИВАЦИИ И БЛОКАДЫ NMDA- И D1-РЕЦЕПТОРОВ У МЫШЕЙ С ДЕПРЕССИВНОПОДОБНЫМ

СОСТОЯНИЕМ....................................................................................................76

Заключение....................................................................................................82

ВЫВОДЫ .....................................................................................................87

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................88

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Аффективные расстройства типа депрессии, высокой тревожности, агрессии являются серьезной медико-биологической проблемой, связанной с высоким процентом больных и отсутствием избирательных корректирующих средств. Эта проблема обусловлена недостаточностью фундаментальных знаний о нейрохимических механизмах данных нарушений и, в первую очередь, когнитивных дефектов при таких состояниях.

Сейчас не вызывает сомнений существование связи между обучением и особенностями поведенческого статуса животных, хотя предпосылки относительно роли предварительной установки, рассматриваемой как состояние готовности к определенной деятельности на основе потребностей организма и объективной ситуации ее удовлетворения, намечались еще в 60-х годах (Дубровина, Лоскутова, 2003; Balogh, Weimer, 2003; Bush et al., 2007). IIo анализ только обучаемости не всегда позволяет оценить такую взаимосвязь. Важным представляется исследование способности к сохранению следа памяти и устойчивости к амнезирующим воздействиям, так как степень доступности следа памяти к воспроизведению непосредственно связана с адаптивным поведением индивидуума, основанного на сравнении оценки внешних стимулов при повторяющихся встречах с ними и информации, хранящейся в памяти. Снижение адекватности при оценке окружающей обстановки является основным фактором развития нарушений в психоэмоциональной сфере. От исходного состояния организма зависит эффективность нейрофармакологических воздействий на память и с этой точки зрения в современной медицине разработка дифференцированного подхода к применению лекарственных средств и психологической коррекции в зависимости от индивидуального психоэмоционального статуса организма стала одной из ключевых. В этой связи очевидна актуальность и значимость выявления нейрохимических механизмов сохранения памяти при разных аффективных состояниях с использованием экспериментальных моделей на животных.

Неспособность к быстрому восстановлению к исходному состоянию после аверсивного события является ключевым элементом индивидуальной уязвимости к индуцированным эмоциональным стрессом расстройствам. Не случайно основным когнитивным симптомом болезней, обусловленных стрессом, является неспособность пациентов тормозить проявления памяти о неприятных событиях (Hofmann, 2008; Tronson et al., 2008; Clark et al., 2009; Davis, 2011; Graham et al., 2011; Hong et al., 2011). В экспериментальных исследованиях научный поиск механизмов такого нарушения осуществляется с помощью соответствующих биологических моделей, с учетом главной причины психопатологий - неспособности торможения угашения памяти о страхе. Следует отметить, что нарушение угашения памяти о

страхе не является симптомом только депрессии. Данный признак наблюдали исследователи в экспериментальной модели болезни Альцгеймера на мышах в тесте условной реакции (УР) страха и в клинике у шизофреников.

Ранее дефицит угашения условной реакции пассивного избегания (УРПИ) выявлен у мышей с агрессивным стереотипом поведения, сформированным в результате ежедневных конфронтации, у мышей линии ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy), рассматриваемой как генетическая модель депрессии, у мышей линии DBA/2J, рассматриваемой в качестве модели шизофрении, а также у высокотревожных мышей (Дубровина, Лоскутова, 2003; Дубровина, Томиленко, 2006; Дубровина, 2011; Дубровина, Редькина, 2012).

Угашение представляет собой результат измененной иерархии выученных ответов, когда вновь приобретаемое поведение замещает ранее сформированный условный рефлекс, то есть это один из примеров интерференционного торможения, когда новое обучение тормозит старое (Bouton et al., 2008; Quirk, Mueller, 2008; Davis, 2011; Myers et al., 2011). Исследователи отмечали, что ассоциации условного и безусловного стимулов, специфические по своему сенсорному содержанию, полностью сохраняются во время угашения. Параллельно, во время многократного тестирования в отсутствии безусловного раздражения, происходит обучение тормозным ассоциациям, когда условный стимул не свидетельствует о наказании. Угашение представляет собой форму эмоциональной регуляции, которая имеет прямое отношение к лечению болезней, обусловленных повышенными страхом и тревожностью (Blechert et al., 2007; Hofmann, 2008; Tronson, 2008; Sotres-Bayon et al., 2009; Hong et al., 2011). Протокол использования процедуры угашения хорошо известен клиницистам, специализирующимся в лечении болезней, обусловленных длительным сохранением страха. Она заключается в предъявлении объектов или ситуаций, ранее сопряженных с появлением страха, при отсутствии какой либо угрозы. В опытах на животных поведенческой парадигмой служит угашение выработанной УР страха, в том числе и условной реакции пассивного избегания (УРПИ), результатом которого является снижение воспроизведения следа памяти при многократном тестировании без наказания.

Не секрет, что классические антидепрессанты и анксиолитики при всех положительных эффектах, мало корректируют нарушения в когнитивной сфере при аффективных состояниях, связанных с нарушением угашения памяти о страхе, и остается достаточно много пациентов с хроническими симптомами. Что касается участия нейромедиаторных систем, то мировые исследования последних лет выделяют работу глутаматных рецепторов, нарушение функционирования которых может оказаться ключевым фактором развития расстройств когнитивных процессов при аффективных состояниях, поскольку они регулируют активность дофамина и ГАМК в нейронных цепях (Schlechter et al., 2005; El-Ghundi et al., 2007; Davis,

2011; I-Iashimoto, 2011; Abraham et al., 2012; Dunlop et al., 2012). Поэтому в качестве потенциальных источников препаратов для ускорения угашения памяти о страхе начали активно анализировать вклад глутаматергической, как возбуждающей, и дофаминергической, как модулирующей, медиаторных систем в механизмы нарушения угашения. Но фундаментальных исследований на биологических моделях аффективных состояний разного генеза чрезвычайно мало, хотя проведение их позволит приблизиться к пониманию рецепторных механизмов развития аффективных расстройств и внести конкретные предложения для разработки новых индивидуально-адаптированных средств терапии и профилактики. В связи с этим значимость выявления нейрохимических механизмов, обеспечивающих длительное сохранение воспроизведения аверсивных событий у животных с разным исходным психоэмоциональным статусом и возможности ускорения угашения памяти о страхе очевидна. Решение этих задач позволит расширить представления о центральной регуляции адаптивного поведения и наметить пути повышения эффективности корригирующих воздействий.

Цслыо данной работы был нейрофармакологический анализ влияний активации и блокады М-метил-О-аспартатных (NMDA) и дофаминовых (ДА) рецепторов разных типов на процесс угашения следа памяти о страхе у мышей с депрессивноподобным состоянием, с высоким уровнем тревожности и агрессии.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать вклад NMDA-рецепторов в модуляцию обучения и угашения УРПИ у мышей в норме и с разным психоэмоциональным статусом.

2. Изучить влияния активации и блокады дофаминовых D1- и 02-рецепторов на выработку и угашение УРПИ у агрессивных и субмиссивных мышей и у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния».

3. Поиск повышения эффективности фармакологических воздействий при сочетанном изменении активностей дофаминовых и NMDA-рецепторов в ускорении угашения памяти о страхе при депрессивноподобном состоянии у мышей.

4. Выявить возможность предотвращения амнезии у мышей с депрессивноподобным состоянием при воздействиях на NMDA- и D1-рецепторы.

Положения, выносимые на защиту:

В доклинических исследованиях на экспериментальных моделях аффективных состояний (депрессия, высокая тревожность, агрессия) с когнитивным симптомом нарушения угашения памяти о страхе показана избирательность фармакологической коррекции при изменениях активности NMDA-, дофаминовых D1- и 02-рецепторов.

Ускорение угашения УРПИ достигалось активацией NMDA- , активацией и блокадой D1-рецепторов у мышей с депрессивноподобным состоянием. У высоко-тревожных и агрессив-

ных особей с дефектом угашения воздействия на NMDA- и дофаминовые D1- и D2-рецеиторы оказались не эффективными.

Показано повышение эффективности коррекции нарушения угашения памяти о страхе у «депрессивных» мышей при одновременной активации NMDA- и D1-рецепторов по сравнению с одиночными введениями D-циклосерина и SKF 38393.

У мышей с депрессивноподобным состоянием антиамнестическое действие вызывают агонисты и антагонисты NMDA-рецепторов, а также антагонист D1-рецепторов, а у ин-тактных особей — агонисты NMDA- и D1-рецепторов.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые показано следующее:

- зависимость модуляции обучения, угашения УРПИ и амнезии при нейрофармакологи-ческих воздействиях на глутаматные NMDA-, дофаминовые D1- и 02-рецепторы от вида аффективного состояния на экспериментальных моделях с когнитивным симптомом нарушения угашения памяти о страхе;

- выработка УРПИ ослаблялась при блокаде NMDA- и 02-рецепторов независимо от исходного психоэмоционального статуса, а также у низко-тревожных мышей при активации NMDA-рецепторов и у агрессоров при активации D1-рецепторов;

- у интактных и субмиссивных мышей процесс угашения УРПИ замедлялся при блокаде NMDA-рецепторов и активации 02-рецепторов и ускорялся у интактных и средне-тревожных мышей при активации NMDA рецепторов;

- возможность ускорения угашения УРПИ активацией NMDA-рецепторов у мышей с депрессивноподобным состоянием, но не у высоко-тревожных особей, а также активацией Dili блокадой D1-рецепторов у «депрессивных» мышей, но не у агрессоров;

- повышение эффективности коррекции нарушения угашения памяти о страхе у мышей с депрессивноподобным состоянием при одновременной активации NMDA- и D1-рецепторов.

- антиамнестические влияния активации и блокады NMDA- и блокады D1-рецепторов у мышей с реакцией «поведенческого отчаяния» и активации D1-рецепторов у субмиссивных мышей;

Научно-практическая ценность. Результаты работы существенно расширяют фундаментальные представления об избирательности вклада глутаматных NMDA-, дофаминовых D1- и 02-рецепторов в процесс угашения памяти о страхе при депрессивноподобном состоянии, высоком уровне тревожности и агрессии. Исследование представляется важным в попытках конструирования нейрохимической мозаики мозга, характерной для аффективных расстройств разного генеза. Полученные в доклинических исследованиях данные о дифференцированной фармакологической коррекции нарушения угашения памяти о страхе при

разных аффективных состояниях будут способствовать выбору стратегии в создании индивидуально адаптированных препаратов направленного действия. Показано повышение эффективности фармакологических воздействий при одновременной активации ИМБА- и 01-рецепторов для предотвращения нарушения угашения памяти о' страхе при депрессии.

Апробация работы

Материалы диссертации обсуждались на VI Физиологическом съезде (Барнаул, 2008), на Конференции молодых ученых Института физиологии СО РАМН (2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 7 статей в отечественных рецензируемых журналах и 3 статьи за рубежом.

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, методы, результаты исследования, заключение, выводы, список литературы из 227 источников. Работа изложена на 102 страницах, содержит 16 рисунков и 5 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Обучение, угашенне аперенвных условных реакции и амнезии.

Память - это многоступенчатый процесс, включающий восприятие информации, её фиксацию, формирование следа памяти и сохранение энграммы на уровне воспроизведения. Известно достаточное количество обзоров по разным аспектам памяти (Spear et al., 1990; Miller, Matzel, 2006; Sara, Ilars, 2006; Gold, 2008; Nader, Hardt, 2009). Способность отвечать эмоционально на окружающие стимулы является критичным для адаптивного поведения человека. Термин «эмоциональная регуляция» включает разные типы регуляторных процессов, которые контролируют физиологические, поведенческие и опытные компоненты аффективных ответов. В регуляции страха основными типами регуляторных процессов являются угашенне, реконсолидация, когнитивная регуляция эмоций (использование разных ментальных психотерапевтических стратегий для модификации реакций страха), активная борьба (выполнение поведенческих действий для уменьшения встречи со стимулами, вызывающими страх) (Ilartley, Phelps, 2010). Последние две характерны для человека. Экспериментально обосновано представление, что сохранение воспроизведения следа памяти зависит от динамического равновесия двух процессов - реконсолидации и угашения (Lin et al., 2003; Riccio et al., 2006; Sara, Ilars, 2006; Hong et al., 2011). При этом реконсолидация действует, чтобы стабилизировать, а угашение - ослаблять экспрессию выработанного условного рефлекса. Угашение - это форма нового обучения, а реконсолидация - это атрибут воспроизведения.

В последние годы актуальным стало исследование значимости индивидуальных особенностей организма в сохранении памяти о негативных событиях (Дубровина, Лоскутова, 2003; Balogh, Wehner, 2003; Ammassari-Teule, Castellano, 2004; Bush et al., 2007; Brinks et al., 2008; Camp et al., 2012). Большой интерес к этой проблеме обусловлен тем, что при психопатологических расстройствах типа депрессии, патологической тревожности, агрессии отмечается неспособность пациентов тормозить проявления памяти о таких событиях, чаще всего происходит длительное сохранение памяти о страхе (Hofmann, 2008; Tronson et al., 2008; Clark et