Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ГАМК- и NMDA-рецепторов мозга крыс в модуляции латентного торможения: значение эмоционального и генетического факторов

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль ГАМК- и NMDA-рецепторов мозга крыс в модуляции латентного торможения: значение эмоционального и генетического факторов"

На правах рукописи

Редькина Ангелина Владимировна

Роль ГАМК- и NMDA-peцeптopoв мозга крыс в модуляции латентного торможения: значение эмоционального и генетического факторов

о!

03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005547496

Томск-2014

2 4 АПР 2014

005547496

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет» на кафедре физиологии человека и животных.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Замощина Татьяна Алексеевна

Научный консультант: доктор биологических наук

Лоскутова Лилия Владимировна

Официальные оппоненты: Ласукова Татьяна Викторовна,

доктор биологических наук, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Томский государственный педагогический университет», кафедра медико-биологических дисциплин, профессор

Суслов Николай Иннокентьевич,

доктор медицинских наук, профессор, федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Голь-дберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория фитофармакологии, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» Российской академии медицинских наук, г. Москва

Защита состоится 28 мая 2014 г. в 10-00 на заседании диссертационного совета Д 212.267.10, созданного на базе федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 36 (конференц-зал НИИ ББ).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет» www.tsu.ru.

Материалы по защите диссертации размещены на официальном сайте ТГУ: http://wvm.tsu.ru/content/news/announcement_of_the_dissertations_in_the_tsu.php

Автореферат разослан «О^ » апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Просекина Елена Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Латентное торможение (ЛТ) — важный физиологический механизм подавления внимания к незначимой информации. ЛТ является проактивной формой внутреннего торможения и характеризуется задержкой формирования условного рефлекса, если обучению предшествует угашение новизны условного в будущем стимула (Lubow R., 1989). Показано, что ЛТ вырабатывается во всех классических и инструментальных процедурах, а также у всех видов млекопитающих, включая человека. Нарушение ЛТ обнаружено у больных психическими расстройствами с нарушениями когнитивной и эмоциональной сфер (Lubow R., 2005; Giakoumaki S., 2012; Debbané M. et al., 2012). Участие в ЛТ моноаминергиче-ских систем мозга показано во многих исследованиях (Weiner I., 2003). В то же время экспериментальные работы с анализом вовлечения в этот процесс ГАМК-ергической и глутаматергической систем не столь обширны, а их данные противоречивы (Harris I., Westbrook R., 1998; Lacroix L. et. al, 2000). Глутаматные NMDA рецепторы играют центральную роль в некоторых формах нейрональной пластичности, включая индукцию долговременной потенциации. Что касается экспериментальных данных по вовлечению NMDA-рецепторов в формирование ЛТ, то в последнее время их число увеличивается, что вызвано фактом появления симптомов шизофрении при введении неконкурентных антагонистов кетамина и фенциклидина здоровым людям (Javitt D., 2007). Аналогичные поведенческие изменения у грызунов (гиперактивность, затруднение социального взаимодействия и нарушение пре-пульсового торможения (PPI) популярны в качестве модели шизофрении (Weiner I., 2003). Необходимо отметить, что в цитированных исследованиях не учитывался эмоциональный статус животных. Однако установлено (Дубровина Н.И., Лоскутова Л.В., 2003), что выраженность ЛТ может зависеть не только от стандартных условий эксперимента (число преэкспозиций, параметры подкрепления, неизменность контекста), но и от индивидуальной детерминированности эмоционального статуса. Это хорошо продемонстрировано на генетически тревожных крысах линии OXYS, у которых нарушение формирования ЛТ обусловлено трудностью габитуации к условному стимулу на стадии преэкспозиции (Лоскутова Л.В., Зеленкина Л.М., 2002). Кроме того, имеются данные о нарушении ЛТ у людей с признаками как ситуативной, так и личностной тревожности (Braunstein-Bercovitz H. et. al., 2002).

Цель исследования — оценить значение ГАМК- и NMDA-рецепторов мозга в формирование латентного торможения у крыс с различным эмоциональным статусом, в том числе и генетически детерминированным.

Задачи исследования:

1. Установить связь уровня тревожности со способностью формировать латентное торможение и оценить влияние активации и блокады ГАМК-ергических рецепторов мозга на развитие данного процесса у крыс Вистар с разными уровнями тревожности.

2. Исследовать особенности формирования латентного торможения у мышей линий DBA2J и C57BL6J с различным базовым уровнем тревожности.

3. Выявить особенности взаимодействия ГАМК-рецепторов и глициновых сайтов глутаматных рецепторов в приобретении навыков на новый и нерелевантный стимулы у высокотревожных крыс линии НИСАГ.

4. Исследовать зависимость способности к обучению и формированию латентного торможения у крыс линий БНЯ и Вистар от их психоэмоционального статуса и активности №у/ГОА-рецепторов.

5. Проанализировать особенности взаимодействия дофаминергических терми-налей вентрального гиппокампа с ГАМК- и глутаматергической системами переднего мозга крыс Вистар при обучении и формировании латентного торможения.

Положение, выносимое на защиту. Особенности формирования латентного торможения у крыс определяются психо-эмоциональным статусом животного, который генетически детерминируется балансом ГАМК-, глутаматергической и дофами-нергической систем переднего мозга.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые получены экспериментальные доказательства:

— влияния психо-эмоционапьного статуса крыс линий Вистар, НИСАГ, БИЯ, а также мышей линий С57ВЬ/61 и БВА/21 на выработку латентного торможения, которые зависят от генетически детерминированного баланса ГАМКд и ЫМБА рецепторов мозга;

— вклада КМБА-рецепторов глутамата и дофаминергических терминалей системы гиппокамп-префронтальная кора в реализацию феномена латентного торможения;

— модулирующей роли дофаминергических терминалей вентрального гиппокампа в отношении КМЭА-зависимой системы, участвующей в формировании латентного торможения;

— независимости уровня тревожности и скорости приобретения условного рефлекса от сохранности дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа, как в период пубертатной реорганизации мозга, так и у взрослых особей.

Научно-практическая значимость. Результаты работы расширяют представления современной фундаментальной физиологии о неоднозначной роли тревожной эмоциональной компоненты в формировании условных рефлексов и латентного торможения. Представленная в материалах диссертации доказательная база об избирательном значении ГАМК-а и КМОА-глутаматных рецепторов в решении постановочных задач при обучении крысами линий Вистар, НИСАГ, БНЯ и мышей линий С57ВЬ/61 и БВА/21 с разным индивидуальным и генетически детерминированным уровнем тревожности указывает на прямое участие данных систем в формировании латентного торможения. Выявленная селективная роль ДА терминалей вентрального гиппокампа в отношении ЫМЛА-зависимой системы при торможении нерелевантной информации позволяет, с одной стороны, понять нейрохимические и нейрофизиологические механизмы некоторых психопатологий человека, а с другой стороны, определяет необходимость поиска в этом направлении фармакологических корректоров. В этой связи, нарушения поведения молодых и взрослых крыс, возникающие после повреждения в пубертатном периоде дофаминергических проекций вентрального гиппокампа можно использовать в качестве модели когнитивного типа шизотипии у подростков с повышенной стресс-чувствительностью.

Результаты работы могут быть использованы при чтении лекций по физиологии ЦНС и патологической физиологии ЦНС в медицинских вузах и классических университетах.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012), на IV съезде фармакологов России (Казань, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 статьи в отечественных журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в зарубежной печати, остальные в материалах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, методов, результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы из 201 источников, в том числе 179 иностранных. Работа изложена на 105 страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен и проанализирован автором самостоятельно.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность зав. лабораторией механизмов регуляции памяти Института физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск) д.б.н. Н. И. Дубровиной и кандидату медицинских наук Н.В. Костюниной за помощь в выполнении диссертации и полезные советы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Работа проводилась на 260 половозрелых крысах-самцах 3-4 месячного возраста линий — Вистар, SHR, НИСАГ и ювенильно-го возраста 82 крысах самцах линии Вистар, 52 мышах линий DBA/2J и C57BL/6J. Животные получены из питомника разведения животных Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск).

Опыты проведены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).

Поведенческие исследования основаны на естественном предпочтении грызунами темных мест. Для определения тревожности животных использовали приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) и темно-светлую камеру (Crawley J., 1981).

Условные рефлексы вырабатывали на: 1. новизну условного стимула; 2. на угашенную новизну многократной преэкспозицией условного стимула до обучения для получения феномена латентного торможения. Получение феномена латентного торможения определяли путем сравнения выработки УР преэкспозированных и непреэкспозированных животных. Для обучения животных применяли установки УРПИ для выработки условной реакции пассивного избегания и УРАИ для получения условной реакции активного избегания. Установка УРПИ представляет собой камеру с металлическим полом, имеющую два отсека - освещенный (безопасный) и темный (опасный). Для выработки УРПИ в одном сочетании использовали модифицированную для крыс методику (Дубровина Н., Лоскутова Л., 2003). Во время обучения при завершенном переходе крыс в темный отсек подавали электрический ток (0,75мА, 2 с) на пол. Через 24 часа тестировали наличие УРПИ в течение 180 с. Для

угашения новизны условного стимула до обучения использовали методику (Лоску-това Л., 1985) - в течение 5 дней 4 раза в день в течение 3 минут предъявляли экспериментальную камеру - 20 преэкспозиций. Установка УРАИ это автоматическая челночная камера с программным обеспечением (ИФТ-04), оснащенная монитором, на экран которого транслируется поведение животных. Обучение в одной сессии -подавали 100 сочетаний УС и БС, интервал 22-30 с. Автоматически регистрировали: время сессии, переходы между стимулами, число сочетаний «свет + ток» до закрепления условной реакции избегания, латентный период (ЛП) перехода при избавлении от тока в первой фазе обучения. Все параметры фиксировались и обрабатывались с помощью программы. Для получения эффекта латентного торможения, за сутки до обучения, животных высаживали в экспериментальную камеру с подачей УС (свет) без подачи безусловного сигнала (ток) в режиме, аналогичном дню обучения.

Нейрофармакологический анализ. Для фармакологического анализа применяли селективные и смешанные агонисты и антагонисты ГАМК, NMDA и дофаминовых рецепторов: мусцимол (1 мг\кг), бикукуллин (1 мг\кг), диазепам (0,2-0,5 мг\кг), D-циклосерин (8, 15, 20 мг/кг), дизоцилпин (2 мг\кг), дезипрамин (15 мг\кг), галоперидол (0,5 мг\кг). Препараты, вводимые внутрибрюшинно или локально, растворяли непосредственно перед использованием и вводили в объеме 0,2 мл за 30-40 мин до начала эксперимента. Все внутримозговые микроиъекции осуществлялись билатерально при использовании координат атласа мозга крысы для вентрального гиппокампа: Bregma: - 4.7; Н= 6.5; L= 5.0 (Paxinos, Watson, 1998).

Стереотаксический метод использовали для разрушения дофаминовых терми-налей гиппокампа с помощью нейротоксина 6-гидроксидофамин (6-OHDA). Крыс оперировали под общим наркозом с использованием пентобарбитала (40 мг\кг), атропина сульфата (1 мг\кг), золетила (1 мг\кг).

Статистическая обработка данных

Результаты исследований оценивали с помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA, STATISTICA 6.О.), используя в качестве независимых факторов генотип (Вистар, SHR), преэкспозицию (0, 20, 100) и фармакологические воздействия (растворитель, препарат). Влияние каждого фактора оценивали по критерию Фишера, а достоверность различий между групповыми средними определяли в тесте posthoc (критерий Ньюмена-Кейса или LSD). Результаты представлены в виде средних арифметических значений со средней стандартной ошибкой (М±ш).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В первой серии экспериментов решалась задача - выявить вклад ГАМК-ергической системы в особенности формирования латентного торможения у крыс Вистар с разными уровнями тревожности. В таблице 1 представлены результаты тестирования крыс в приподнятом крестообразном лабиринте. Однофакторный ANOVA указывает на высокую статистическую значимость различий между группами низкотревожных (НТ) и высокотревожных (ВТ) животных относительно главного из показателей - процента времени нахождения на открытых рукавах (Fi,67 = 52.04, р<0,001). Такие же значимые различия касаются количества переходов на открытые рукава (Fi,67 = 68.11, р<0,001).

Показатели Группы

высокотревожные (п=38) низкотревожные (п=31)

Число выходов на открытые рукава Время на открытых рукавах (с) % времени 0.3±0.1 1.1±0.5 0.4±0.1 3.9±0.3* 26.7±3.3* 7.8±1.3*

*р<0,001 при межгрупповом сравнении ВТ и НТ крыс Вистар

Через 48 ч для животных, отобранных по данным ПКЛ, проводился тест «темно-светлая» камера. В течение 3 минут регистрировали два показателя: общее число переходов из одного отсека в другой и время нахождения в светлом отсеке. Эмоциональный статус, выявленный в тесте ПКЛ, полностью подтвердился в этом тесте, что видно на рисунке 1. Как и следовало ожидать НТ крысы значительно чаще посещали светлый отсек и проводили в нем больше времени по сравнению с ВТ крысами.

Ш высокотревожные (ВТ) СШ низкотревожные (НТ)

60 Я 50 40

30 -

CD

и

I-

о 5

о £

ш

о

m 20 к 2 0> Q. Ш

10

0

6

5 ■

■

X

to о ч о

х щ

а. а с о t; о

4 -

3 -

1 -

0

Рисунок 1 — Показатели поведения высокотревожных и низкотревожных крыс линии Вистар при первом ознакомлении с темно-светлой камерой; * р<0.01 при межгрупповых сравнениях для каждого показателя

Исходя из данных обоих тестов, были выделены две совокупности животных с разной базовой тревожностью - низкотревожные (НТ) и высокотревожные (ВТ), каждую из которых в случайном порядке разделили на четыре экспериментальные группы (п=8-10). В качестве контроля была использована смешанная совокупность крыс, состоящая из двух групп (п=8-12) с преэкспозицией (ПЭ) и без нее. Из рисунка 2 видно, что как обучение, так и формирование ЛТ зависят от уровня тревожности. Низкотревожные крысы показали хорошую способность к формированию ЛТ, а высокотревожные - нарушение формирования ЛТ.

сек

контроль НТ ВТ

Рисунок 2 — Влияние уровней тревожности на выработку УРПИ и формирование ЛТ у крыс линии Вистар; по вертикали — ЛП перехода в опасный отсек (с); *р<0.01 по сравнению с собственными группами без ПЭ; # р<0.05 по сравнению с аналогичной группой контроля

бикукуллин мусцимол

Рисунок 3 - Влияние блокады и активации ГАМКа рецепторов на формирование ЛТ у низкотревожных (1) и высокотревожных (2) крыс Вистар соответственно; *р<0.01 по сравнению с группами без ПЭ

На рисунке 3 показана эффективность ГАМК-ергических воздействий на величину воспроизводимого навыка (ЛП перехода) у ВТ и НТ крыс. Активация мусци-молом (1 мг/кг) ГАМКл-рецепторов нормализовала способность ВТ крыс к формированию ЛТ. В то же время, блокада ГАМКа рецепторов бикукуллином (1 мг\кг) у НТ крыс привела к увеличению ЛП перехода, сохранив при этом значимые внутригруп-повые различия (Fi. 19= 9.53, р<0.01 по сравнению с собственной подгруппой ОПЭ).

Выявленная корректирующая эффективность агониста и антагониста ГАМКа рецепторов относительно исходного высокого или низкого уровня тревожности указывает на прямое участие данной системы в формировании ЛТ, нарушение или чрезмерная экспрессия которого может быть связана либо с ослаблением, либо с повышением ГАМК-ергического торможения. То есть, оптимальный уровень ГАМКа рецепторной активности необходим для нормального функционирования ЛТ. Однако это не исключает вовлечения в этот процесс и другого механизма с участием глу-таматергической системы, поскольку обе системы находятся во всех отделах мозга в тесном взаимодействии.

В следующей серии экспериментов исследовали особенности формирования латентного торможения у мышей линий ОВА/21 и С57ВЬ/6.Г с различным базовым уровнем тревожности.

Опыты проводили на 52 самцах мышей в возрасте 2-3 мес. Были проведены 2 эксперимента. Первый заключался в проверке развития угашения УРПИ, выработанной на новый УС (без преэкспозиции). Процедура угашения выработанной УР длилась 15 дней после обучения. Второй эксперимент выполнялся с целью выяснения особенностей формирования латентного торможения и последующего угашения УР. В этом случае, обучению предшествовала стадия преэкспозиции (8-кратное непод-крепляемое предъявление экспериментальной камеры по 2 в течение 4 дней).

В опыте выработки эффекта ЛТ (рисунок 4) двухфакторный дисперсионный анализ ЛП перехода мышей С57ВЬ/61 и ВВА/21 выявил значимые эффекты группы (Р\,22 = 62.14, р<0.001), времени (р8.17б = 6.10, р<0.01) и взаимодействия факторов (Рв.пб = 2.76, р<0.05).

Таким образом, у мышей С57ВЬ^ преэкспозиция камеры значительно снизила ЛП перехода мышей. То есть, латентное торможение у этих мышей успешно формировалось. Что касается процесса угашения рефлекса, то в обеих экспериментальных ситуациях он успешно реализовался, начиная с 5 суток тестирования. У мышей ВВА/2.Г после преэкспозиции к условному стимулу уровень воспроизведения УР не снизился через 1 сутки (р=0.19), что свидетельствует о нарушении латентного торможения. Вместе с тем, они демонстрируют достаточно высокую возможность выработки УРПИ на новый условный стимул, что отмечалось и другими авторами (Ваагепске Р. й. а1„ 2008).

160 140

120 - т Рисунок 4 - Формирование латентного

юо -I К торможения и последующего угашения

условной реакции пассивного избегания у 60 " \ мышей линий DBA/2J и C57BL/6J; ромбы

\г1 _ обучение на преэкспозированный услов-

ный стимул и угашение у мышей 1 2 з s 7 9 и и is " C57BL/6J, треугольники - мыши DBA/2J

Полученные нами данные демонстрируют зависимость развития интерференционных процессов от генотипа. Фенотипический анализ этих процессов может быть подходом для идентификации генетически связанных вариаций морфофункциональной и нейрохимической организации мозга, имеющей отношение к фактору риска появления психопатологий, обусловленных нарушением тормозных аспектов внимания (Bush D. et al., 2007).

В следующих сериях экспериментов решалась задача - выявить особенности взаимодействия ГАМК-рецепторов и глициновых сайтов глутаматных рецепторов в приобретении навыков на новый и нерелевантный стимулы у высокотревожных крыс линии НИСАГ.

Исходя из различий между НИСАГ и SHR по эмоциональному статусу и дефицитам в обучении и ЛТ, наша задача состояла в поиске индивидуальных корректирующих мероприятий, влияющих на уровень тревожности. Для чувствительных к

9

стрессу гиперреактивных крыс НИСАГ предполагалась оценка влияния диазепама на формирование условной реакции активного избегания, выработка которой сопровождалась у них высоким уровнем тревожности панического типа (Лоскутова Л. и др., 2006).

На рисунке 5 представлены результаты ГАМК-ергической коррекции нарушений обучения у крыс НИСАГ в УРАИ. Использованы две группы крыс - линия НИСАГ (п=21) и для контроля - группа Вистар (п=20). В обеих группах половина крыс получала физиологический раствор, а половина — диазепам (0,5 мг/кг) — аго-нист ГАМКд-бензодиазепин-рецепторного комплекса.

Как видно из рисунка 5 наибольшее число сочетаний условного и безусловного стимулов, предшествующих появлению первого правильного ответа потребовалось контрольным крысам НИСАГ. У контрольных крыс НИСАГ выявлены высоко достоверные различия как с обеими группами Вистар (р<0.001), так и с крысами НИСАГ, получившими диазепам перед обучением (Б1,19=27.16; р<0.001). Такие же различия были зарегистрированы для основного показателя - числа сочетаний до приобретения УРАИ (рис. 56). Следовательно, диазепам сработал только в высоко тревожной группе НИСАГ, никак не влияя на группу Вистар. Диазепам блокировал развитие поведенческих признаков гиперреактивности у крыс НИСАГ, сократил время избавления от тока и ускорил приобретение УРАИ. Можно предполагать и нейрохимическую природу базовой тревожности НИСАГ, связанную с изменениями в системе ГАМК-бензодиазепинового комплекса.

а б

1 2 3 4 1 2 3 4

Рисунок 5 - Влияние диазепама на обучение УРАИ крыс Вистар и НИСАГ: а - число сочетаний условного и безусловного стимулов до появления первого правильного ответа; б — число сочетаний до закрепления условной реакции. Светлые столбики - крысы Вистар (контроль), заштрихованные - Вистар (диазепам), темные - крысы НИСАГ(контроль), серые - НИСАГ (диазепам);* р<0.05 достоверность отличий с группой 3

Кроме того, у крыс НИСАГ (Костюнина Н., Лоскутова Л., 2012) обнаружено нарушение ЛТ в обеих условно-рефлекторных задачах (УРПИ и УРАИ), хотя в приобретении УРПИ, они не отличались от крыс Вистар. И это явилось поводом для

ю

дальнейшего поиска механизма, дефект которого лежит в основе когнитивных нарушений у крыс НИСАГ. Для анализа фармакологической коррекции JIT нами была выбрана УРАИ, наиболее уязвимая у крыс НИСАГ, как относительно обучения на новизну, так и торможения внимания к незначимому (преэкспозированному) стимулу.

Для выполнения исследования были выбраны соответствующие специфические препараты и дозы, не эффективные в обучении у крыс Вистар: агонист глициновых сайтов D-циклосерин (DCS) (8 мг/кг) и диазепам (0,2 мг/кг). На рисунке 6 представлены результаты экспериментов по изучению особенностей обучения УРАИ крыс НИСАГ на новый и угашенный стимулы при введении указанных препаратов. Соче-танное введение препаратов значительно улучшило приобретение УРАИ (Fi.49 =11.60; р<0.01 по сравнению с группой ОПЭ+физ.р-р), что обеспечило выделение эффекта JIT. Следовательно, диазепам в сочетании с D-циклосерином способствовал функциональному балансу между синаптическим возбуждением и торможением.

На рисунке 7 представлены результаты анализа динамики избавления от наказания под действием препаратов у крыс НИСАГ с ПЭ и без нее. Контрольные подгруппы (растворитель) не показаны ввиду отсутствия различий с подгруппами «диазепам».

число свет+ток

контроль диазепам диазепам+D-

циклосерин

Рисунок 6 - Средние значения числа сочетаний стимулов у крыс НИСАГ, обученных при разных фармакологических воздействиях: диазепам (0.2 мг/кг) и диазепам (0.2 мг/кг)+0-циклосерин (DCS) (8 мг/кг); *р<0.01 между подгруппами ОПЭ и 100ПЭ

Статистический Post hoc анализ показал достоверные различия ЛП перехода между подгруппами 3 и 4 для блоков 3, 4 и 5 (р<0,01). Это значит, что время реакции на болевой стимул значительно увеличилось после ПЭ, что обеспечило формирование ЛТ. У крыс в подгруппах 1 и 2 с низкой дозой диазепама межгрупповые различия не найдены. При сравнении подгрупп без ПЭ (1 и 3) с разными фармакологическими воздействиями (диазепам и диазепам+DCS) обнаружены высогодосто-верные различия для всех пяти блоков (р<0,01).

сек

4 -

2 -

6 -

О

7 -

3 -

5 -

4

3

2

3

4

5

номер блока

Рисунок 7 - Динамика изменения ЛП избавления от наказания в пяти первых блоках тренировочной сессии при фармакологических воздействиях у крыс НИСАГ. Подгруппы: диазепам - 1-ОПЭ и 2-100ПЭ; диазепам+Б-циклосерин - 3-ОПЭ и 4-100ПЭ; *р<0.05 между подгруппами 3 и 4; # - различия внутригрупповые между первым и последующими блоками

Таким образом, обнаруженная возможность коррекции когнитивных нарушений при использовании двух препаратов может предполагать взаимодействие ГАМКа и глициновых рецепторов. Причем положительный эффект может быть результатом снижения высокой чувствительности крыс НИСАГ к стрессу, поскольку показано, что D-циклосерин способен усиливать угашение условной реакции страха у этой линии (Richardson R. et al., 2004).

Имеется достаточно доказательств, что антагонисты NMDA-рецепторов ухудшают обучение и память у грызунов в большом ранге поведенческих задач (Riedel G. et al., 2003). Блокада NMDA-рецепторов снижает способность переключаться с одной поведенческой реакции на другую (Svensson Т., 2000; Jentsch J., Taylor J., 2001) и вызывает поведенческие нарушения такие, как импульсивность и гиперактивность (Bardgett М. et al., 2006). Все перечисленные изменения, вызываемые блокадой NMDA-рецепторов у нормальных крыс, напоминают генетически обусловленные характеристики крыс линии SHR (низкая способность к переключению внимания, гиперактивность и импульсивность).

Что касается роли глутамата и его рецепторов в когнитивных дефицитах крыс SHR, то она остается в значительной степени неясной. Поэтому в план наших дальнейших исследований входила сравнительная оценка особенностей вовлечения NMDA-рецепторов в развитие ЛТ у крыс Вистар и SHR в УРПИ и УРАИ.

На рисунке 8 показано влияние блокады NMDA-рецепторов на выработку условной реакции пассивного избегания и формирование латентного торможения у крыс Вистар (п=20). В качестве антагониста NMDA- рецепторов использовали дизо-цилпин (МК-801). Из рисунка 8 видно, что как обучение, так ЛТ ухудшались на фоне блокады NMDA- рецепторов у крыс линии Вистар. Полученные результаты напоминали нарушения, выявленные у крыс SHR.

Сочетанное введение дюоцилпина (0,2 мг\кг) и агониста глициновых сайтов D-циклосерина (15 мг/кг), предотвратившего действие блокады NMDA рецепторов, может свидетельствовать о специфичности их вовлечения в процесс фильтрации стимулов по их новизне и значимости у крыс линии Вистар, что подтверждается литературными данными. Известно, что активация глицином переднего мозга предотвращает нарушение внимания, вызываемое блокадой NMDA рецепторов (Lipina Т. et al., 2005).

Физиологический Дизоцилиии

раствор

Рисунок 8 - Средние значения ЛП перехода в опасный отсек камеры при тестировании УРПИ, выработанной у преэкспозированных и непреэкспозированных крыс Вистар с системной блокадой ЫМОА-рецепторов; * р<0.01 между контрольными группами ОПЭ и 20ПЭ+физ. раствор

В следующем эксперименте анализировали влияние О-циклосерина на обучение и формирование ЛТ у крыс БНЯ в задаче УРАИ.

На рисунке 9 представлены результаты приобретения УРАИ у крыс БНЯ с преэкспозицией и без нее при системном введении 15 мг/кг О-циклосерина. Как видно из рисунка 9, межгрупповые сравнения обнаружили достоверное снижение числа сочетаний «свет+ток» у крыс 8Н11 без преэкспозиции под влиянием О-циклосерина, а также значительные различия между группами ОПЭ и 100ПЭ с препаратом. Полученный результат указывает на коррекцию обучения без ПЭ, и вместе с тем демонстрирует возможность реализации ЛТ в этих условиях, хотя значимых различий между подгруппами ЮОПЭ+Э-циклосерин и 100ПЭ+ физиологический раствор не выявлено.

Таким образом, сравнительный анализ влияния О-циклосерина на процессы внимания крыс Вистар с блокадой ММОА рецепторов и крыс БНИ. с возможным, генетически обусловленным снижением их активности, выявил положительное действие препарата в обеих причинно-следственных ситуациях. Сходство эффектов О-циклосерина в обеих моделях когнитивных нарушений предполагает, что у крыс БН!^ имеется дефект глутаматергической системы, возможно связанный с недостаточной активностью ИМИА-рецепторного субстрата в вентральном гиппокампе.

13

число п «светЬток»

I-1 ОПЭ

rzza юопэ

Физ. раствор D-циюгосерин

Рисунок 9 - Количество сочетаний стимулов до приобретения УРАИ у преэкспозированных и непреэкспозированных крыс БНЯ при воздействии Б-циклосерина на КМБА-рецепторы; * р<0.01 по сравнению с группами ОПЭ+физиол. раствор и 1 ООПЭ+О-циклосерин

Глутамат и ГАМК являются основными синаптическими нейромедиаторами во взрослом гиппокампе, который вовлечен как в когнитивные процессы, так и эмоциональную сферу. Помимо глутамата и ГАМК в гиппокампе обнаружены и другие нейромедиаторы, которые не вовлекаются непосредственно в синаптическое возбуждение или торможение, но оказывают на них модулирующее влияние. Таковым, например, является дофамин (Varela J. et. al., 2009), а сбалансированная работа си-наптического возбуждения/торможения и нейромодуляторных систем гиппокампа лежит в основе передачи, обработки и сохранения информации (Vinogradova, 2001). Что касается участия гиппокампа в латентном торможении, то оно показано в исследованиях на крысах (Weiner I., 2003). Установлено, что реорганизация мозга в период полового созревания является фактором риска для появления симптомов психопатологий. В исследованиях на человеке показано, что именно в этом возрасте появляются признаки шизотипии (Giakoumaki S., 2012).

Все выше сказанное и отсутствие работ, сочетающих исследование участия дофаминовых рецепторов гиппокампа с фактором возраста при формировании JIT, определили задачу следующего эксперимента, которая заключалась в анализе влияния хронической блокады дофаминовых рецепторов гиппокампа на формирование латентного торможения у крыс Вистар в период полового созревания и половозрелого возраста.

В нашей работе были использованы крысы Вистар в возрасте 28-30 дней к началу операции. В первой части исследования половине всех животных вводили нейротоксин 6-OHDA (оперированные крысы, п=42), остальным - растворитель (ложнооперированные или контрольные, п=40). Через 1 неделю после операции (завершение дегенерации) было проведено тестирование поведения в приподнятом крестообразном лабиринте. Дисперсионный анализ уровней спонтанной тревожности, показал отсутствие различий между оперированными и контрольными крысами, как по общему времени нахождения на открытых рукавах (р>0.05), так и по числу выходов на них.

Еще через 48 ч у половины оперированных и контрольных крыс вырабатывали УРПИ в двух ситуациях - новизны условного обстановочного стимулам после уга-шения новизны 20-кратной преэкспозицией экспериментальной установки перед обучением. Таким образом, в опыте участвовало 4 группы крыс: оперированные без преэкспозиции (ОПЭ, п=8) и с преэкспозицией (20ПЭ, п=8), и две аналогичные группы контрольных крыс.

На рисунке 10 представлены результаты выработки реакции пассивного избегания оперированных и контрольных пубертатных крыс.

Статистический анализ показал достоверные различия между контрольными группами с преэкспозицией и без нее, что свидетельствует об успешном формировании латентного торможения у ложнооперированных крыс. Однако аналогичные группы оперированных крыс не различались между собой, что свидетельствует о нарушении ЛТ. Подтверждением нарушения этого процесса также служат различия между контрольной и оперированной преэкспозированными группами. В то же время блокада ДА терминалей вентрального гиппокампа не повлияла на обучение в отсутствие стадии преэкспозиции.

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

*#

растворитель

6-гидроксидофамин

Рисунок 10 - Влияние разрушения дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа на приобретение УРПИ и развитие эффекта ЛТ у пубертатных крыс линии Вистар: а - контрольные крысы, б - оперированные крысы; * р<0.01 по сравнению с группой 0ПЭ; # р<0.01 по сравнению с оперированной группой 20ПЭ

У другой половины оперированных и контрольных крыс, достигших половозрелого возраста вырабатывали условную реакцию активного избегания. В эксперименте участвовало 4 группы животных: оперированные (0ПЭ, п=12; 100ПЭ, п=14) и контрольные (0ПЭ, п=12; 100ПЭ, п=14).

Из этого эксперимента мы установили, что контрольные непреэкспозирован-ные крысы показали достаточно высокую скорость приобретения условной реакции и значительное замедление этой скорости у преэкспозированных крыс. Таким образом, крысы с интактными ДА терминалями гиппокампа успешно обучались без преэкспозиции и были способны формировать латентное торможение при ее наличии. Проведение межгрупповых сравнений показало, что оперированные крысы без ПЭ обучались также хорошо, как и ложнооперированные. Однако процедура преэкспозиции не повлияла на формирование навыка активного избегания оперированных крыс, то есть ЛТ было нарушено.

Проведенное исследование показало, что блокада дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа в период пубертатной реорганизации мозга препятствует формированию латентного торможения как у 42-дневных, так и у взрослых крыс.

Если представить, что блокада ДА терминалей в гиппокампе крыс могла привести к активации NMDA рецепторов и выбросу ДА в прилежащем ядре, то согласно литературным данным (Joseph М. et al, 2000), нарушенное ЛТ инвертируется как локальным, так и системным введением галоперидола.

В нашем опыте системное введение галоперидола (0,5 мг\кг)не устранило нарушение ЛТ у оперированных крыс Вистар (п=6) в УРАИ. Полученный результат может предполагать другой механизм нарушения ЛТ, вызванного у крыс дисфункцией активности вентрального гиппокампа с вовлечением глутаматергической или ГАМК-ергической систем, и другой структуры мозга, например префронтальной коры, с которой гиппокамп имеет прямую связь.

число

"свет+ток" О ОПЭ

120 И100ПЭ

100

80

60

40

20

0

6-OHDA (v.Hipp) мусцимол (в/бр) D-циклосерин (в/бр)

Рисунок 11 - Средние значения числа сочетаний стимулов с ПЭ и без ПЭ оперированных крыс Вистар, обученных в разных условиях фармакологических воздействий: контроль, мусцимол и D-циклосерин; * р<0, 01 между группами ОПЭ и 100ПЭ при системном введении D-циклосерина

Учитывая возможность синаптических контактов ДА терминалей, как с ГАМК, так и глутаматными нейронами, а также нарушение ЛТ у крыс Вистар в условной реакции страха активацией вентрального гиппокампа локальной инъекцией N-метил-О-аспартата перед обусловливанием (Pouzet В. et al., 2004), при попытке коррекции ЛТ мы использовали агонист ГАМК-рецепторов мусцимол (1 мг/кг) (п=8) и глициновый агонист NMDA-рецепторов - D-циклосерин (20 мг/кг) (п=6) (см. рисунок 11).

Post hoc анализ показал достоверные различия между количествами условного стимула преэкспозированных и непреэкспозированных крыс, вызванные введением D-циклосерина (р<0.01), но не мусцимола (р>0,05). При этом в группе, получавших D-циклосерин, понизилось среднее значение ЛП перехода у крыс без ПЭ, и увеличилось у преэкспозированных крыс, что привело к необходимому балансу между подгруппами с выделением эффекта нормального ЛТ.

Полученные нами результаты показали, что разрушение дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа в период полового созревания нарушает формирование латентного торможения, которое фармакологически корректируется активацией глициновых сайтов NMDA-рецепторов. При этом фармакологическая актива-

ция ГАМК-рецепторов и блокада Д2-рецепторов не приводит к восстановлению эффекта JIT.

Выводы

1. Формирование латентного торможения зависит от уровня базовой тревожности у крыс линии Вистар. Нарушение латентного торможениия у высокотревожных крыс связано с ослаблением ГАМК-ергической системы мозга, а экспрессия латентного торможения у низкотревожных животных определяется чрезмерной активацией системы ГАМК. Для нормального функционирования латентного торможения необходим оптимальный уровень ГАМКа -рецепторной активности.

2. Мыши линии DBA/2J, имея исходно повышенную базовую тревожность, демонстрируют нарушение формирования JIT. Мыши линии C57BL/6J с пониженной тревожностью успешно реализуют данный феномен. Это указывает на значимость генетически детерминированного уровня тревожности в способности животных формировать латентное торможение.

3. У высокотревожных крыс линии НИСАГ одновременная активация ГАМКа рецепторов и глициновых сайтов NMDA-рецепторов обеспечивает баланс между синаптическим возбуждением и торможением, что сопровождается улучшением формирования как условных рефлексов, так и латентного торможения.

4. У крыс линии SHR и крыс Вистар с блокадой NMDA-рецепторов активация глициновых участков NMDA-рецепторов улучшает выработку условных рефлексов и способствует формированию латентного торможения.

5. Разрушение дофаминергических терминалей вентрального гиппокампа, не влияя на уровень тревожности, нарушает формирование латентного торможения, которое корректируется агонистом глициновых сайтов NMDA-рецепторов D-циклосерином, но не агонистом ГАМК-рецепторов мусцимолом или антагонистом Ог-рецепторов галоперидолом.

6. Дофаминергические терминали вентрального гиппокампа выполняют селективное тормозящее влияние на нерелевантные стимулы через модулирующие воздействия на NMDA-рецепторы глутаматных нейронов при повторении условного стимула.

Публикации по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией при Минобрнауки России:

1. Костюнина Н.В., Редькина A.B. Участие №метил-0-аспартатных рецепторов в торможении внимания к незначимой информации у крыс // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии наук. - 2009. - № 2 (136). - С. 55-58. -0,37 п.л.

2. Лоскутова Л.В., Костюнина Н.В., Редькина A.B. Нарушение латентного торможения у взрослых крыс после блокады дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа в период пубертатного развития // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2010. - Т. 96, № 5. - С. 455-464. -0,9 пл.

3. Дубровина Н.И., Редькина A.B. Латентное торможение и угашение условной реакции пассивного избегания у мышей линий C57BL/6J и DBA/2J // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2012. - Т. 98, № 4. - С. 488-496. - 0,8 пл.

4. Редькина А.В., Лоскутова Л.В., Замощина Т.А. Влияние агонистов и антагонистов ГАМКд рецепторов на формирование латентного торможения у крыс с разными уровнями тревожности // Бюллетень сибирской медицины / Bulletin of Siberian medicine. -2012,- № 1. - С. 66-70. - 0,48 п.л.

Статьи, опубликованные в журналах, включенных в библиографические базы данных цитирования Web of Science и Scopus:

5. Loskutova L.V, Kostyunina N.V, Red'kina A.V. Impairment of latent inhibition in adult rats after blockade of dopaminergic terminals in the ventral hippocampus during the period of pubertal development // Neuroscience Behavioral Physiology. - 2011. -Vol. 41, № 9. - C. 986-991. - 0,5 пл. - DOI: 10.1007/sl 1055-011-9520-8

6. Dubrovina N.A., Red'kina A.V. Latent inhibition and extinction of a conditioned passive avoidance reaction in C57BL/6J and DBA/2J mice // Neuroscience Behavioral Physiology.-2014.-Vol. 44, № l.-P. 107-112.-0,5 пл.

Публикации в других научных изданиях:

7. Редькина А.В. Влияние медазепама на формирование латентного торможения у высокотревожных крыс // Человек и лекарство : XIX Российский национальный конгресс. - М., 2012. - С. 560. - 0,06 п.л.

8. Редькина А.В., Замощина Т.А., Лоскутова Л.В. Агонисты ГАМКа-рецепторов и латентное торможение // Инновации в современной фармакологии : материалы IV съезда фармакологов России. - Казань : Фолиум, 2012. - С. 158. -0,05 пл.

Список сокращений

БС - безусловный стимул

УС - условный стимул

ВТ - высокотревожные

ГАМК —гамма-аминомасляная кислота

ГАМК-БД - ГАМК-бензодиазепиновые

рецепторы

ДА - дофамин

DCS - D-циклосерин

NMDA -N-mctmi-D-acnapxat

6-OHDA - 6-гидроксидофамин

PPI - препульсовое торможение

МК-801 — дизоцилпин ЛП - латентный период JIT - латентное торможение НТ - низкотревожные

ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт

ПФК, PFC - префронтальная кора

ПЭ - преэкспозиция

УРАИ - условная реакция актив, избег.

УРПИ - условная реакция пассив, избег.

УР - условный рефлекс

Подписано в печать 18.03.2014 г.

Формат А4/2. Ризография . л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 3/03-14 Отпечатано в ООО «Позитив-НБ» 634050 г. Томск, пр. Ленина 34а

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Редькина, Ангелина Владимировна, Томск

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет»

04201459850

На правах рукописи

Редькина Ангелина Владимировна

РОЛЬ ГАМК- И МУГОА-РЕЦЕПТОРОВ МОЗГА КРЫС В МОДУЛЯЦИИ ЛАТЕНТНОГО ТОРМОЖЕНИЯ: ЗНАЧЕНИЕ ЭМОЦИОНАЛЬНОГО

И ГЕНЕТИЧЕСКОГО ФАКТОРОВ

03.03.01 - Физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.А. Замощина

Научный консультант: доктор биологических наук Л.В. Лоскутова

Томск-2014

Содержание

Общая характеристика работы.............................................................4

Глава 1. Литературный обзор..............................................................9

1.1. Феномен латентного торможения.................................................9

1.1.1. Краткая характеристика латентного торможения..............................9

1.1.2. Условия, необходимые для выработки латентного торможения.........10

1.1.3. Структурно-нейрохимическая организация латентного торможения....11

1.1.4. Прикладное значение исследования латентного торможения............14

1.2. Тревожность и ее связь с когнитивными процессами и латентным торможением..........................................................................................15

1.3. Нейрохимические механизмы тревожности и латентного торможения..............................................................................................18

1.3.1. Участие ГАМК-ергической системы в формировании латентного торможения...........................................................................................19

1.3.2. Участие КМБА-рецепторов глутаминовой кислоты в формировании латентного торможения........................................................................21

Глава 2. Материалы и методы исследования.....................................................24

2.1. Характеристика экспериментального материала................................24

2.2. Методы исследования поведения животных.....................................24

2.2.1. Тест приподнятый крестообразный лабиринт................................24

2.2.2. Тест темно-светлой камеры.........................................................25

2.2.3 Методы для анализа процессов внимания и обучения УРГШ, УРАИ.....25

2.3. Методы нейрофармакологического анализа....................................28

2.4. Техника внутриструктурных инъекций нейротоксина 6-оксидофамина...29

2.5. Статистическая обработка данных..................................................30

Глава 3. Результаты собственных исследований........................................31

3.1. Особенности обучения УР пассивного избегания у крыс Вистар с разными

уровнями базовой тревожности...........................................................32

3.1.1. Эффекты активации и блокады ГАМК(А) рецепторов на формирование латентного торможения у крыс Вистар с разными уровнями тревожности.....34

3.1.2. Роль М-метил-Б-аспартатных рецепторов в торможении внимания к незначимой информации у крыс Вистар.................................................40

3.2 Нарушения развития латентного торможения у крыс и мышей разных линий с генетически детерминированной тревожностью...........................45

3.3 Особенности когнитивных нарушений и их фармакологической коррекции у крыс линий НИСАГ и 8НЯ.......................................................49

3.3.1. Фармакологическая коррекция нарушений обучения и латентного торможения у крыс НИСАГ в УР активного избегания. Вовлечение ГАМК и ИМЭА рецепторов........................................................................50

3.3.2. Латентное торможение и отсутствие чувствительности к изменению

контекста в условной реакции пассивного избегания у крыс БНЯ............56

3.4. Участие И-метил-О-аспартатных рецепторов в формировании латентного торможения у крыс Вистар и БНЯ. Сравнительный анализ..................57

3.4.1. Влияние блокады ЫМБА-рецепторов на формирование латентного торможения у крыс Вистар в реакции пассивного избегания.......................58

3.4.2. Корректирующий эффект глицина при нарушениях обучения и латентного торможения у крыс БНЯ в задаче УР активного избегания.....................60

3.4.3. Нарушение латентного торможения при блокаде мезогиппокампаль-ных дофаминовых терминалей у крыс Вистар. Фармакологическая коррекция..............................................................................................64

Заключение..................................................................................77

Выводы........................................................................................81

Список использованной литературы....................................................83

Список сокращений.......................................................................105

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Латентное торможение (ЛТ) - важный физиологический механизм подавления внимания к незначимой информации. ЛТ является проактивной формой внутреннего торможения и характеризуется задержкой формирования условного рефлекса, если обучению предшествует угашение новизны условного в будущем стимула [Lubow R., 1989]. Показано, что ЛТ вырабатывается во всех классических и инструментальных процедурах, а также у всех видов млекопитающих, включая человека [Lubow R., 1989; Lubow R., Gewirtz J., 1995]. Нарушение ЛТ обнаружено у больных психическими расстройствами с нарушениями когнитивной и эмоциональной сфер [Lubow R., 2005]. Участие в ЛТ моноаминергических систем мозга показано во многих исследованиях [Weiner I., 2003]. В то же время экспериментальные работы с анализом вовлечения в этот процесс ГАМК-ергической и глутаматергической систем не столь обширны, а их данные противоречивы. Сообщается [Harris I., Westbrook R., 1998] об отсутствии какого-либо эффекта антагониста бензодиазепиновых рецепторов FG7142 на развитие ЛТ у крыс линии Вистар или о наличие [Lacroix L. et. al, 2000] как положительной, так и негативной ГАМК-ергической модуляции ЛТ у крыс той же линии. Глутаматные NMDA рецепторы играют центральную роль в некоторых формах нейрональной пластичности, включая индукцию долговременной потенциации. Что касается экспериментальных данных по вовлечению NMDA-рецепторов в формирование ЛТ, то в последнее время их число увеличивается, что вызвано фактом появления симптомов шизофрении при введении неконкурентных антагонистов кетамина и фенцикли-дина здоровым людям [Javitt D., 2007]. Аналогичные поведенческие изменения у грызунов (гиперактивность, затруднение социального взаимодействия и нарушение препульсового торможения) популярны в качестве модели шизофрении [Weiner I., 2003]. Необходимо отметить, что в цитированных исследованиях не учитывался эмоциональный статус животных. Однако установле-

но [Дубровина Н.И., Лоскутова Л.В., 2003], что выраженность ЛТ может зависеть не только от стандартных условий эксперимента (число преэкспозиций, параметры подкрепления, неизменность контекста), но и от индивидуальной детерминированности эмоционального статуса. Это хорошо продемонстрировано для генетически тревожных крысах линии OXYS, у которых нарушение формирования ЛТ обусловлено трудностью габитуации к условному стимулу на стадии преэкспозиции [Лоскутова Л.В., Зеленкина Л.М., 2002]. Кроме того, имеются данные о нарушении ЛТ у людей с признаками как ситуативной, так и личностной тревожности [Braunstein-Bercovitz Н. et. al., 2002]. Кроме того, данные литературы указывают на то, что тревожность и ЛТ имеют общий морфо-нейрохимический субстрат [Jessa М. et. al., 1996; Талалаенко А.Н. и др.,1997; Joseph М. et. al., 2000]. Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования - оценить значение ГАМК- и NMDA- рецепторов мозга в формировании латентного торможения у крыс с различным эмоциональным статусом, в том числе и генетически детерминированным.

Задачи исследования:

1. Установить связь уровня тревожности со способностью формировать латентное торможение и оценить влияние активации и блокады ГАМК-ерги-ческих рецепторов мозга на развитие данного феномена у крыс Вистар с разными уровнями тревожности.

2. Исследовать особенности формирования латентного торможения у мышей линий DBA2J и C57BL6J с различным базовым уровнем тревожности.

3. Выявить особенности взаимодействия ГАМК-рецепторов и глициновых сайтов глутаматных рецепторов в приобретении навыков на новый и нерелевантный стимулы у высокотревожных крыс линии НИСАГ.

4. Исследовать зависимость способности к обучению и формированию латентного торможения у крыс линий БНИ и Вистар от их психоэмоционального статуса и активности NMDA-peцeптopoв.

5. Проанализировать особенности взаимодействия дофаминергических терми-налей вентрального гиппокампа с ГАМК- и глутаматергической системами переднего мозга крыс Вистар при обучении и формировании латентного торможения.

Положение, выносимое на защиту

Особенности формирования латентного торможения у крыс определяются психо-эмоциональным статусом животного, который генетически детерминируется балансом ГАМК-, глутаматергической и дофаминергической систем переднего мозга.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые получены экспериментальные доказательства:

— влияния психо-эмоционального статуса крыс линий Вистар, НИСАГ, БНЯ, а также мышей линий С57В176.Г и ЭВА/21 на выработку латентного торможения, которое зависит от генетически детерминированного баланса ГАМК-А и И^ГОА рецепторов мозга.

— вклада КМОА-рецепторов глутамата и дофаминергических терминалей системы гиппокамп-префронтальная кора в реализацию феномена латентного торможения.

— модулирующей роли дофаминергических терминалей вентрального гиппокампа в отношении ММОА-зависимой системы, участвующей в формировании латентного торможения.

— независимости уровня тревожности и скорости приобретения условного рефлекса от сохранности дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа,

как в период пубертатной реорганизации мозга, так и у взрослых особей.

Научно-практическая значимость

Результаты работы расширяют представления современной фундаментальной физиологии о неоднозначной роли тревожной эмоциональной компоненты в формировании условных рефлексов и латентного торможения. Представленная в материалах диссертации доказательная база об избирательном значении ГАМК-А и КМОА-глутаматных рецепторов в решении постановочных задач при обучении крысами линий Вистар, НИСАГ, БНИ. и мышей линий С57ВЬ/6.Г и БВА/21 с разным индивидуальным и генетически детерминированным уровнем тревожности указывает на прямое участие данных систем в формировании латентного торможения. Выявленная селективная роль ДА терминалей вентрального гиппокампа в отношении ИМОА-зависимой системы при торможении нерелевантной информации позволяет, с одной стороны, понять нейрохимические и нейрофизиологические механизмы некоторых психопатологий человека, а с другой стороны, определяет необходимость поиска в этом направлении фармакологических корректоров. В этой связи, нарушения поведения молодых и взрослых крыс, возникающие после повреждения в пубертатном периоде дофаминергических проекций вентрального гиппокампа можно использовать в качестве модели когнитивного типа шизотипии у подростков с повышенной стресс-чувствительностью.

Результаты работы могут быть использованы при чтении лекций по физиологии ЦНС и патологической физиологии ЦНС в медицинских вузах и университетах.

Апробация работы

Материалы диссертации обсуждались на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012), на IV съезде фармакологов России (Казань, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 статьи в отечественных журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в зарубежной печати, остальные в материалах конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, методов, результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы из 201 источников, в том числе 179 иностранных. Работа изложена на 105 страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен и проанализирован автором самостоятельно.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность зав. лабораторией механизмов регуляции памяти Института физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск) д.б.н. Н. И. Дубровиной и кандидату медицинских наук Н.В. Костюниной за помощь в выполнении диссертации и полезные советы.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Феномен латентного торможения

Решение проблемы нейрофизиологии и нейромедиаторной организации процессов торможения в ЦНС необходимо для понимания ее работы, патологии и коррекции. Инструментом для исследования тормозных аспектов внимания уже в течение нескольких десятилетий служит так называемый феномен «латентного торможения», который по своей сути является отражением внутреннего торможения, детально изученного школой И. П. Павлова [Павлов И.П., 1975].

1.1.1. Краткая характеристика латентного торможения

Латентное торможение (ЛТ) является проактивной формой внутреннего торможения и характеризуется задержкой формирования условного рефлекса, если обучению предшествует угашение новизны условного в будущем стимула [Lubow R., 1989]. Поэтому процедура формирования ЛТ состоит из двух стадий: 1-многократной преэкспозиции (ПЭ) условного стимула, 2- обусловливания (сочетания условного стимула с безусловным подкреплением) и последующего тестирования эффекта задержки при сравнении с контрольной группой без преэкспозиции. Проведение каждой стадии начинается через 24 часа после предыдущей.

Показано, что ЛТ вырабатывается во всех классических и инструментальных процедурах, а также у всех видов млекопитающих, включая человека [Lubow R., 1989; Lubow R., Gewirtz I., 1995]. Эффект неподкрепляемой стадии ПЭ является показателем способности субъекта не уделять внимание стимулам, которые не предсказывают значимых последствий. То есть, ЛТ является механизмом исключения нерелевантной (не относящейся к делу) информации, что помещает задачу его исследования в ряд актуальных проблем, связанных с изучением механизмов внимания и его патологий у человека. Здесь необходимо привести пример и другого инструмента - препульсового торможения

стартл-рефлекса (prepulse inhibition - PPI), которое по существу ближе к внешнему торможению реакции вздрагивания (startle reflex), если ему предшествует (50-500 мсек) менее интенсивный акустический раздражитель. Однако PPI также интенсивно изучается при обследовании людей и в эксперименте на животных для понимания нейрофизиологических основ психических заболеваний, основанных на дефектах внимания [Braff D. et al, 2001].

Надо отметить, что наиболее физиологичным из двух феноменов является JIT, и по длительности привыкания к условному в будущем стимулу, и по временному разнесению всех стадий его выработки. Это позволяет отделить когнитивную составляющую ответа от моторной реакции, при анализе эффектов препаратов через 24 ч после их применения. Весь процесс формирования PPI вместе с введением препарата и анализом его эффекта ограничивается одной пробой. Оба феномена также имеют разную морфофункциональную и нейрохимическую организацию.

В то же время, на базе экспериментального материала по изучению нарушений как JIT, так и PPI, создаются модели, имитирующие разные формы психопатологий человека, которые включают нарушения и когнитивной и сенсомоторной составляющих функции внимания. При этом используются как психостимуляторы (ДА-ергическая активация), так и наркозные средства (глу-таматергическая блокада). Ранее предполагалось, что дефицит обоих процессов может привести к сенсорной перегрузке и когнитивной фрагментации, дезорганизации и нарушению мышления [Cadenhead К. et. al., 1993].

1.1.2. Условия, необходимые для выработки латентного торможения

Показано, что JIT чувствительно к изменению ряда параметров во время его формирования и реализации. Так, важнейшим условием его приобретения является число ПЭ условного стимула и интенсивность безусловного стимула [Lubow R. et. al., 1975]. Не менее важным условием является постоянство контекста (экспериментальной обстановки) в течение всего эксперимента, поскольку его изменение влечет за собой восстановление ориентировочной pelo

акции и нарушает JIT [Gray N. et. al., 2001]. То есть, JIT является прямой функцией ассоциации УС-контекст, так как формирование JIT нарушается, когда ПЭ условного в будущем стимула дается в одном окружении, а стадия обусловливания или тестирования - в другом [Westbrook R. et. al., 2000; Gray N. et. al., 2001; Bailey G., Westbrook R., 2008; Gershman S. et. al., 2010]. Важно, что отсутствие чувствительности JIT к изменению контекста является показателем дефицита внимания, особенно связанного с нейродегенеративными изменениями в гиппокампальных регионах [Hemsley D., 2005].

1.1.3. Структурно-нейрохимическая организация латентного торможения

Относительно нейробиологической и нейрохимической организации J1T имеется большое количество исследований, включающих в основном моно-аминергические системы [ Weiner I., 2003] и их субстраты в ряде мозговых образований: прилежащем ядре, гиппокампе, фронтальной коре и миндалевидном комплексе из которых особое место занимает прилежащее ядро (n.accumbens, АСС) и его дофаминергический субстрат.

Установлено, что J1T усиливается системным введением нейролептиков [Feldon J., Weiner I., 1991; We