Внутривидовой полиморфизм фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного

Белов, Анатолий Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внутривидовой полиморфизм фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного
ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Внутривидовой полиморфизм фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного"

004615728

На правах рукописи

Белов Анатолий Алексеевич

ВНУТРИВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА CRYPHONECTRIA PARASITICA В ПРИЧЕРНОМОРСКОЙ ЧАСТИ АРЕАЛА КАШТАНА ПОСЕВНОГО (CASTANEA SATIVA)

03.02.08 - Экология (биологические науки).

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

" 2 ЛЕН 2010

Москва 2010

004615728

Работа выполнена на кафедре ботаники и основ сельского хозяйства Московского государственного областного университета и в лаборатории экологической биохимии Естественно-экологического института Московского государственного областного университета.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Коничев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: д.б.н. Топунов А.Ф. к.б.н. доц. Живухина ЕЛ.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН.

Защита состоится 16 декабря 2010 года в 15:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу 141014, Московская обл., г. Мьггшци, ул. Веры Волошиной, д 24

С диссертацией можно ознакомиться в. библиотеке Московского государственного областного университета по адресу: 105005, Москва, ул. Радио, д. 10а

Автореферат разослан « ' » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Т.А. Снисаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

С. parasitica как инфекционный агент на территории Северной Америки впервые был отмечен в 1904 году, а к 1950-м годам фактически уничтожил зубчатый каштан (Castanea dentata (Marsh.) Borkh.) -лесообразующий вид восточной части США (болезнь уничтожила порядка 3.5 миллиардов деревьев). В Европе, где основным растением-хозяином данного патогена является каштан посевной (С. sativa Mill.), гриб C.parasitica впервые был обнаружен в 1938 году в Италии. В течение нескольких последующих десятилетий он распространился почти на весь ареал произрастания каштана. В настоящий момент не тронутыми заболеванием остаются только рассеянные насаждения в северной Европе и Великобритании. Азиатские виды каштана (C.mollissima Blume., C.crenata Siebold & Zucc.) также подвержены крифонекрозу, однако погибают от него достаточно редко. Полагают, что они эволюционировали вместе с грибом-паразитом и, обладая достаточной толерантностью, являются естественным резервуаром инфекции. В частности, проникновение C.parasitica в США и Европу .-связывают с интродукцией азиатских каштанов, а последовавшее стремительное вымирание американского каштана - с его недостаточной устойчивостью к данному патогену.

Существенным моментом в истории исследований крифонекроза стало открытие в 1950-х годах явления гиповирулентности у С. parasitica. С этого времени большинство исследований, посвященных крифонекрозу, были связаны с этим явлением. Гиповирулентные штаммы обладают рядом характерных признаков: слабая пигментация (за что они получили

название «белые» штаммы), низкий уровень бесполого спороношения, слабый и замедленный рост мицелия; поражение подобным штаммом, как правило, не приводит к гибели дерева. Как впоследствии было выявлено, гиповирулентность С. parasítica обусловлена присутствием вируса, который представляет собой двуцепочечную молекулу РНК, лишенную капсида, что делает невозможным его активное распространение через внешнюю среду. Вирус способен проникнуть в нового хозяина только через гифальные анастомозы образуемые между штаммами гриба. Проникая в конидиоспоры, вирус поражает значительную часть бесполого поколения своего хозяина. Данный вирус получил название Cryphonectria Hypovirus (CHV) и выделен в отдельное семейство Hypoviridae, в котором на сегодняшний день обнаружено четыре вида: CHV1, CHV2, CHV3, CHV4.

На CHV возлагали большие надежды как на естественного агента, способного помочь справиться с агрессивным фитопатогеном, снизив его вирулентность. Однако опыты по искусственному внедрению CHV, за некоторыми исключениями, в большинстве случаев закончились неудачей [Robin et al. 2010]. В США лишь в лесничествах штата Мичиган удалось спасти местную популяцию американского каштана, заражая деревья гиповирулентными штаммами гриба, однако на остальной территории, даже по прошествии нескольких десятилетий, CHV так и не смог распространиться [Milgroom et al. 1999]. Как полагают, преобладание половой стадии в цикле размножения С. parasítica обуславливает высокий уровень его генетической гетерогенности в Северной Америке, что является существенной преградой на пути распространения гиповируса в местной популяции гриба. В Европе популяция C.parasitica характеризуется мальм аллельным разнообразием, а также низким уровнем рекомбинации, и несмотря на то, что опыты по искусственному заражению каштана гиповирулентными штаммами были успешными лишь в некоторых лесничествах на территории Италии, гиповирус сумел самостоятельно распространиться практически по всему ареалу европейского каштана. Таким образом, к настоящему моменту, большая часть выявляемых в Европе штаммов C.parasitica являются гиповирулентными [Robin et al. 2010]. Гиповирулентность штаммов С. parasítica, пораженных CHV, по праву считается одним из наиболее изученных, с точки зрения молекулярных основ, модельных объектов взаимодействия вирус-гриб, и по-прежнему представляет интерес для исследователей работающих в области популяционной и прикладной экологии.

parasitica, является ключевым факторам при рассмотрении возможных стратегий по борьбе с данным фитопатогеном. Сохранение каштана посевного в причерноморском ареале является актуальной научной и практической задачей защиты леса.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является проведение комплексного обследования распространенности и полиморфизма фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного, что позволит сравнить ситуацию с крифонекрозом на территории Кавказа РФ с общеевропейской и определить степень угрозы патогена для российской популяции каштана.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Провести обследование популяции каштана посевного на территории Северо-западного Кавказа в связи с крифонекрозом.

2. Провести анализ вирулентных свойств штаммов С. parasitica выявленных в причерноморской популяции каштана посевного.

3. Провести тесты на вегетативную совместимость с выявленными на Северо-Западном Кавказе пшовирулентными штаммами С. parasitica и дать оценку возможной роли CHV в качестве агента биологического контроля.

4. Выявить молекулярно-генетические особенности CHV, обнаруженных в штаммах С. parasitica на территории РФ и Турции.

Научная новизна работы. В результате проведенного комплексного обследования распространенности и полиморфизма возбудителя крифонекроза С. parasitica, впервые установлено, что фитопатоген распространен по всей причерноморской части ареала каштана посевного.

Проведенные тесты на вегетативную совместимость 99 штаммов С. parasitica, позволили выявить высокий уровень генетической гетерогенности С. parasitica на территории РФ, что позволило дать оценку перспективам использования CHV в качестве возможного агента способного ограничить распространите крифонекроза на территории РФ.

Впервые проведен анализ геномов гиповирусов, обнаруженных в выявленных на территории РФ и Турции штаммах С. parasitica, на основе чего определена их видовая принадлежность.

Практическая значимость работы. В рамках диссертационного исследования разработан метод идентификации С. parasitica в пораженной коре каштана с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР), позволяющий быстро и точно идентифицировать патоген в образце коры, не прибегая к фитопатологической экспертизе. Также, разработан метод идентификации CHV в изолированных штаммах С. parasitica, позволяющий оценить вирулентность гриба. В целом, результаты

исследования позволяют дать общую оценку состояния популяции каштана посевного на Северо-Западном Кавказе в связи с крифонекрозом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологи» (Москва, 21-24 октября 2008 г.), VI Международной научной конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности» (6-7 декабря 2007 г., Сумгаит, Азербайджанская Республика), научных семинарах кафедры ботаники и основ сельского хозяйства МГОУ в 2007 - 2010 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, из которых 4 в периодических изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора современных литературных сведений о крифонекрозе каштана и его возбудителе С. parasitica (глава 1); описания биологических объектов, материалов и методов исследования (глава 2); изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных (глава 3); заключения и выводов; списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 1 таблицу и 10 рисунков, включая фотографии и схемы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологический материал. В работе использованы образцы биологического материала, собранные на территории Северо-Западного Кавказа и севера Турции. Сбор образцов коры каштана посевного на территории РФ проводился нами в Сочинском национальном парке1. Выделение штаммов С. parasitica из образцов коры каштана проводили на твердой среде (картофельно-глюкозный агар — КГ А) в чашках Петри. Видовую идентификацию чистых культур осуществляли на основании культурально-морфологических признаков, основываясь на имеющихся в литературе рекомендациях, а также с помощью разработанной нами методики ПЦР-идентификации С. parasitica. Штаммы С. parasitica А2 и А9 были любезно предоставлены нам для исследований д.б.н., г.н.с. ГНУ «Адлерская опытная станция» ВИР им. Н.И.Вавилова Н.Н. Гринько.

Штаммы С. parasitica из Зонгулдакской и Бартинской областей Турции получены в рамках реализации проекта «Исследование «рака» каштана (Castanea sativa Mill.) в лесных массивах Зонгулдакской области

1 Работы ю исследованию С. рагшШса на Северо-Западном Кавказе выполнены при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (Государственный контракт № ГО24 от 07.08.2009 г.).

Турции и выращивание устойчивых саженцев»2 в 2005 - 2008 гг. Выделение штаммов С. parasitica в чистые культуры проводилось на базе института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН. Все выделенные пгтаммы помещены на хранение во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ).

Основные методы исследования. Тест на вегетативную совместимость проводили по модифицированной методике [Robin et al. 2000], в серии парных сращиваний оценивая совместимость каждого из выделенных штаммов С. parasititca с гиповирулентными штаммами (73.2, А2, А9). При этом, визуально и с помощью ПЦР-идентификации СНУ фиксировали передачу гиповируса вирулентным штаммам.

Для молекулярно-генетической идентификации С. parasitica нами были разработаны две пары праймеров, для которых в качестве мишени выступали гены белков-предшественников половых феромонов гриба Mfl/1, MJ2/1 (Virl) и Mfl/2 (Vir2). Определение гиповирулентных штаммов С. parasitica осуществляли путем идентификации СНУ в культуре гриба на основе специфических ПЦР-маркеров. В качестве молекулярных маркеров CHV использовали два консервативных участка вирусного генома, расположенные в районе мотивов вирусной РНК-полимеразы и хеликазы, которые остаются неизменными у всех представителей семейства Hypoviridae [Hillman et al., 1994].

Получение препаратов нуклеиновых кислот проводилось с использованием стандартных наборов реактивов «SILICA М» и «Diatom» (ООО «Компания «Биоком») с рядом модификаций. При выделении препаратов РНК также применялся фенол-хлороформный метод. Обратную транскрипцию и амплификацию проводили с помощью набора «RT-PCR-Core» (ООО «Компания «Биоком»), Детекцию продуктов ПЦР осуществляли при помощи гель-электорофореза.

Амплификацию целевых ПЦР-продуктов в препаративных целях проводили путем клонирования рекомбинантной плазмиды в трансформированных клетках E.coli. Приготовление компетентных клеток E.coli проводили кальциевым методом [Маниатис и др. 1984]. В работе использовался штамм С600 E.coli, любезно предоставленный ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ГосНИИгенетика). В качестве плазмидного вектора для трансформации E.coli нами использовался набор pGEM-T Vector System I («Promega», США). Трансформация клеток E.coli проводилась методом теплового шока. После процедуры трансформации клетки выращивались на селективной среде с добавлением ампицилина.

2 Автор выражает глубокую благодарность Д.6.Н., проф. Аллахвердиеву С.Р. и Д.6.Н. Гринысо Н Л. за предоставленный биологический материал.

Выделение плазмидной ДНК из трансформированных культур E.coli проводилось с применением стандартного набора для выделения плазмидной ДНК (ООО «Цитокин», С-Петербург, РФ). Секвенирование кДНК-копий участков генома CHV проводилось ЗАО «Евроген» (Москва, РФ) с использованием автоматаческого секвенатора ABI 3730 («Applied Biosystems 1пс», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Состояние популяции Castanea sativa на Северо-Западном Кавказе в связи с крифонекрозом. Обследование популяции каштана посевного было проведено в ходе экспедиции на территории Сочинского национального парка (СНП) (рис. 1). В лесничествах Лазаревской группы (Лазаревское, Головинское, Марьинское, Лыготхское, Макопсинское), где сосредоточены основные каштанники СНП [Придня М.В. 2005], нами отмечена близкая к 100%-ной пораженность каштана благородного крифонекрозом. Наиболее неблагополучна ситуация в Лазаревском лесничестве: здесь нами не встречено практически ни одного абсолютно здорового (без признаков заболевания крифонекрозом) каштана, все растения, начиная с 4-5-летнего возраста, имели в той или иной степени выраженные поражения стволов и ветвей. В лесничествах адлерской группы (Адлерское, Кепшинское, Краснополянское) отмечен более низкий процент заболевших деревьев. Тем не менее, С. parasitica обнаружен нами практически во всех обследованных каштановых рощах и даже на отдельно стоящих деревьях. Единственное исключение составляла небольшая каштановая роща около Красной Поляны (N 43 39.866 Е 40 10.421), где фитопатоген не был обнаружен. В целом, на основании полученных данных можно констатировать, что С. parasitica присутствует по всему ареалу каштана посевного на Северном Кавказе.

Отметим, что картина распространения крифонекроза в российской части ареала каштана посевного с самого начала обнаружения болезни отличалась крайним своеобразием. Первые очаги крифонекроза были найдены здесь в 1939 году, практически одновременно с обнаружением С. parasitica в Европе (1938 г.) [Иссинский ILA., 1968]. К рубежу 1970-х годов, несмотря на широкое диффузное распространение крифонекроза по всей кавказской части ареала каштана, активные его очаги занимали сравнительно небольшие площади. Как отмечается в работе [Придня М.В. 2004], за последние 50-60 лет популяция каштана оставалась в стабильном состоянии и очаги болезни занимали не более 4% от площади насаждений. К сожалению, в бывшем СССР и нынешней РФ исследования крифонекроза каштана не получили должного развития (в отличие от Европы и США). В связи с этим на данный момент трудно определить причины столь своеобразной истории распространения С. parasitica на Кавказе и отмеченной нами внезапной вспышки крифонекроза в последние годы.

Рисунок 1. Границы Сочинского национального парка. Точками показаны места сбора образцов. В границах парка темным цветом очерчены границы каштанников (по данным «Карты лесов Краснодарского края», 1962г.).

Анализ вирулентных свойств и исследование внутривидового полиморфизма штаммов С. parasitica выявленных на территории РФ и Турции.

При проведении данной работы нами изучено 99 штаммов С. parasitica, выявленных на территории Северо-Западного Кавказа, а также 25 штаммов из Бартинской и Зонгулдакской областей Турции.

Выделенные нами российские штаммы С. parasitica обнаружили выраженные различия по макроморфологическим признакам и скорости роста, в связи с чем их можно разделить на несколько групп. Первая -наиболее многочисленная - группа характеризовалась быстрым радиальным ростом, пигментацией от светло-желтой до красно-оранжевой и пурпурной, и обильным спороношением, то есть классическими признаками вирулентных штаммов. Выделенный нами штамм 73.2, а также штаммы А2 и А9, отличались более медленным ростом, отсутствием пигментации и спороношения, то есть демонстрировали признаки гиповирулентных морфотипов. Наконец, штаммы третьей группы (№№ 16, 25, 27, 59, 66, 80.2) обнаруживали в целом нормальный уровень пигментации и спороношения при крайне ослабленном росте; мицелий у них был тонким, недоразвитым.

По результатам ПЦР-анализа, CHV был идентифицирован только в штаммах 73.2, А2 и А9, то есть из 97 штаммов С. parasitica, выделенных нами на территории РФ, только у одного была диагностирована CHV-обусловленная гиповирулентность. Это соотносится с полученными ранее данными Н.Н. Гринько [Гринько, 2008], которая, проанализировав материал из 385 географических точек Кавказа РФ, выделила только единичные пшовирулентные («alb») морфотипы патогена, предположив наличие в них CHV. Это предположение было подтверждено нами в ходе выполнения данной работы: с помощью ПЦР-анализа штаммов С. parasitica пшовирус был идентифицирован именно (и исключительно) в морфотипах характеризовавшихся отсутствием пигментации и спороношения (штаммы А2 и А9). Столь низкая распространенность гиповирулентности в северокавказской популяции С. parasitica коренным образом отличается от ситуации в Европе, для которой характерно доминирование шповирулентных штаммов патогена, результатом чего, несмотря на большой процент пораженных крифонекрозом каштанов, является относительно низкий уровень смертности деревьев от этого заболевания.

Открытым остается вопрос о причинах гиповирулентности третьей группы российских штаммов С. parasitica. При сборе образцов было отмечено, что штаммы 16, 25, 27, 59, 66, 80.2 вызывали у каштанов поверхностные либо локализованные каллусом (заживающие) поражения. Не исключено, что их атипичный морфотип обусловлен инфицированием каким-либо другим вирусным агентом. Исходя из фенотипических проявлений гиповирулентности указанных пггаммов можно предположить, что она вызвана микореовирусами - относительно недавно обнаруженными патогенами С. parasitica, которые были выделены в отдельный род в составе семейства Reoviridae. Следует заключить, что атипичные штаммы С. parasitica из кавказского ареала каштана посевного требуют дальнейшего изучения, с целью выявления агента вызывающего их гиповирулентность.

Считается, что вегетативная несовместимость у грибов, выражающаяся в неспособности штаммов образовать гифальные анастомозы, выполняет функцию барьера, который препятствует распространению цитоплазматических агентов, способных нанести вред организму гриба [Caten, 1972]. Кроме того, вегетативная несовместимость изолятов является природным маркером генетической гетерогенности популяций грибов.

Главной целью проведения нами соответствующих тестов являлось оценить уровень генетической гетерогенности штаммов гриба и возможность распространения CHV в популяции С. parasitica на территории РФ. Для этого нами были взяты имеющиеся в нашем распоряжении гиповирулентные штаммы 73.2, А2 и А9, и проведено три

серии попарных сращиваний каждого из них с выявленными нами на территории РФ вирулентными штаммами С. parasitica. Проведенный тест на совместимость между гиповирулентными штаммами, показал, что штаммы А2 и А9 относятся к одной группе вегетативной совместимости (ВС) и оба несовместимы со штаммом 73.2. Благодаря этому штаммы А2 и А9 продемонстрировали идентичные реакции на совместимость с двумя штаммами (2.1 и 19.3), а со штаммом 73.2 положительную реакцию на совместимость показали шесть штаммов (3,29,49, 58, 62 и 69) (таблица 1).

Передача CHV вирулентным штаммам фиксировалась визуально и с помощью ПЦР. Визуально, передачу гиповируса можно определить в случае проявления вирулентными штаммами гиповирулентного фенотипа, после чего данные штаммы подвергаются ПЦР анализу, который дает окончательное подтверждение передачи CHV. В результате передача гиповируса была зафиксирована в шести случаях (штаммы 2.1,17,19.3,28, 31 и 36) от штамма А9 и А2, и в 11 случаях (штаммы 3, 29, 42, 43, 49, 55, 58, 62, 69, 80.1 и 100) от штамма 73.2 (таблица 1). Несмотря на то, что, как известно, передача CHV от гиповирулентного штамма к вирулентному штамму С. parasitica происходит беспрепятственно только в пределах одной группы ВС, случаев передачи гиповируса выявлено больше, чем совместимых пггаммов, поскольку в некоторых случаях она также возможна и между несовместимыми штаммами. На сегодняшний день выявлено семь генов vie, которые ответственны за вегетативную совместимость штаммов гриба, и штаммы, обладающие одинаковым набором аллелей всех семи генов, относят к одной группе ВС. При этом процент передачи CHV между несовместимыми штаммами определяется числом гетерогенных аллелей генов совместимости у сращиваемых штаммов: совместимость падает с увеличением гетероаллелизма и становится невозможной при различиях более чем по 4 аллелям vie [Дьяков Ю.Т., Долгова А.В. 1995].

Столь высокий уровень полиморфизма в северокавказской популяции С. parasitica не характерен для Европы, где за все время наблюдений была обнаружена 31 группа ВС, при этом 60% всех исследованных штаммов относились к одной группе [Milgroom et al., 2008]. В некоторых странах Европы, как например в Греции, все обнаруженные изоляты относились к одной группе ВС [Sotirovski et al. 2004]. Напротив, американская популяция С. parasitica отличается не только большим разнообразием групп ВС, но и более высоким уровнем рекомбинации, который в некоторых случаях настолько высок, что приближается по значениям к панмиксии. Высокая гетерогенность С. parasitica наблюдается даже в небольших локальных популяций каштана в США, где на одном или нескольких рядом растущих деревьях зачастую можно обнаружить штаммы гриба, принадлежащие к разным группам ВС [Milgroom & Cortesi, 1999].

Таблица 1. Результаты тестов на вегетативную совместимость российских штаммов Cryphonectria parasitica.

№ Место сбора (геогр. координ. / лесничество) А9, А2 Г3.2 № Место сбора (геогр. координ. / лесничество) А9, А2 Г3.2

1 СШ43 54.528 ВД39 25.229 /Л - 40 СШ43 51.551 ВД39 31.346 /Г - -

2.1 СШ43 54.528 ВД39 25.229 /Л +п - 47 СШ43 51.618 ВД39 31.936/Г - -

2.2 СШ43 54.528 ВД39 25.229 /Л - - 48 СШ43 51.718 ВД39 32.241 /Г - -

3 СШ43 55.172 ВД39 26.648 /Л - +п 49 СШ43 51.718 ВД39 32.241 /Г - +п

4 СШ43 55.172 ВД39 26.648 /Л - - 51 СШ43 51.692 ВД39 32.758 /Г - -

5 СШ43 55.172 ВД39 26.648 /Л - - 53 СШ43 51.744 ВД39 32.951 /Г - -

7 СШ43 55.080 ВД39 26.856 /Л - - 54 СШ43 51.984 ВД39 32.760 /Г - -

8 СШ43 55.080 ВД39 26.856 /Л - - 55 СШ43 51.984 ВД39 32.760 /Г - п

9 СШ43 55.080 ВД39 26.856 /Л - - 57 СШ43 51.835 ВД39 31.994 /Г - -

10 СШ43 54.689 ВД39 27.552 /Л - - 58 СШ43 52.038 ВД39 32.029 /Г - +п

И СШ43 54.689 ВД39 27.552 /Л - - 59 СШ43 52.038 ВД39 32.029 /Г - -

12 СШ43 54.689 ВД39 27.552 /Л - - 60 СШ43 52.038 ВД39 32.029 /Г - -

13 СШ43 54.689 ВД39 27.552 /Л - - 61 СШ44 00.332 ВД39 18.850 /Мк - -

14 СШ43 54.537 ВД39 27.915 /Л - - 62 СШ44 00.332 ВД39 18.850 /Мк - +п

15 СШ43 54.537 ВД39 27.915 /Л - - 63 СШ43 59.576 ВД39 25.031 М - -

16 СШ43 54.537 6Д39 27.915 /Л - - 64 СШ43 59.560 ВД39 25.244 /Лг - -

17 СШ43 54.498 ВД39 28.206 /Л - - 65 СШ43 59.560 ВД39 25.244 /Лг - -

18 СШ43 54.782 ВД39 28.514 /Л - - 66 СШ43 59.560 ВД39 25.244 /Лг н/о н/о

19.1 СШ43 54.782 ВД39 28.514 /Л - - 67 СШ43 59.560 ВД39 25.244 /Лг - -

19.2 СШ43 54.782 ВД39 28.514 /Л - - 71.1 СШ43 57.829 ВД39 27.176 М - -

19.3 СШ43 54.782 ВД39 28.514 /Л +п - 71.2 СШ43 57.829 ВД39 27.176 М - -

20 СШ43 55.204 ВД39 27.864 /Л - - 72 СШ43 57.858 ВД39 27.624 М - -

21 СШ43 55.204 ВД39 27.864 /Л - - 73.2 СШ43 57.858 ВД39 27.624 М - -

22 СШ43 55.594 ВД39 27.658 /Л - - 75 СШ43 57.606 ВД39 27.901 М - -

23.1 СШ43 56.415 ВД39 26.709 /Л - - 76 СШ43 57.379 ВД39 27.981 М - -

23.2 СШ43 56.415 ВД39 26.709 /Л - - 77 СШ43 56.958 ВД39 27.575 М - -

25 СШ43 56.415 ВД39 26.709 /Л - - 78 СШ43 57.828 ВД39 26.821 М - -

27 СШ43 56.652 ВД39 26.478 /Л - - 79 СШ43 57.828 ВД39 26.821 /М - -

28 СШ43 57.179 ВД39 26.359 /Л п - 80.1 СШ43 57.814 ВД39 25.926 /Л - п

29 СШ43 57.179 ВД39 26.359 /Л - - 80.2 СШ43 57.814 ВД39 25.926 /Л - -

30 СШ43 57.737 ВД39 26.164 /Л - - 81 СШ43 56.487 ВД39 22.934 /Л - -

31 СШ43 57.737 ВД39 26.164 /Л п - 82 СШ43 55.610 ВД39 21.651 /Л - -

32 СШ43 57.317 ВД39 24.885 /Л - - 83 СШ43 28.910 ВД39 58.602 /А - -

33 СШ43 57.317 ВД39 24.885 /Л - - 84 СШ43 30.406 ВД39 58.110/А - -

34 С1И43 57.123 ВД39 24.782 /Л - - 85 СШ43 30.406 ВД39 58.110 /А - -

35 СШ43 57.123 ВД39 24.782 /Л - - 86 СШ43 30.406 ВД39 58.110 /А - -

36 CU143 49.030 ВД39 28.638 /Г п - 91 СШ43 39.425 ВД40 09.508 /Кр - -

38 СШ43 51.450 ВД39 31.209 /Г н/с - 93 СШ43 38.136 ВД40 06.105 /К - -

39 СШ43 51.450 ВД39 31.209 /Г - - 94 CIII43 38.136 ВД40 06.105 /К - -

Продолжение таблицы 1

40 СШ43 51.551 ВД39 31.346/Г - - 95 СШ43 38.136 ВД40 06.105 /К - -

41 СШ43 51.845 ВД39 31.202 /Г - - 96 СШ43 39.132 ВД40 04.029 /К - -

42 СШ43 51.845 ВД39 31.202 /Г - п 97 СШ43 39.312 ВД40 03.925 /К - -

43 СШ43 51.415 ВД39 31.628/Г - +п 98 СШ43 39.922 ВД40 03.270 /291 - -

44 СШ43 51.404 ВД39 31.840 /Г - - 99 СШ43 39.922 ВД40 03.270 /291 - -

45 СШ43 51.404 ВД39 31.840 /Г - - 100 СШ43 40.265 ВД40 02.998 /304 - п

Примечание: «+» - пггаммы вегетативно совместимы, «-» - штаммы не совместимы, «п» - происходит передача CHV. Курсивом выделены пггаммы с пшовирулентным и атипичным фенотипами. Лесничества: А - Адлерское, Мк - Макопсинское, М -Марьинское, Л - Лазаревское, Лг - Лыготхское, Г - головинское, К - Кешпинское, Кр -Краснополянское.

Подобное явление в североамериканской популяции С. parasitica объясняют преобладанием в ней полового размножения [Махга & Milgroom, 2001]. Схожая картина выявлена нами при анализе вегетативной совместимости кавказских штаммов С. parasitica. Ряд штаммов, выделенных из образцов коры, взятых с одного дерева, оказались несовместимы друг с другом (2.1 и 2.2, 13.1 и 13.2, 23.1 и 23.2, 71.1 и 71.2, 73.1 и 73.2 (гиповирулентный штамм), 80.1 и 80.2 (гиповирулентный штамм), а также 19.1,19.2,19.3) (таблица 1).

Среди 25 турецких штаммов, по их макроморфологическим признакам, нами были выделены две группы: первая группа характеризовалась быстрым радиальным ростом, обильным спороношением и высоким уровнем пигментации (16 штаммов); вторая группа представлена штаммами с низким уровнем пигментации и отсутствием спороношения (9 штаммов). Указанные макроморфологические признаки турецких изолятов С. parasitica в целом позволяют довольно точно идентифицировать пораженные CHV штаммы (группа 2), что было подтверждено с помощью ПЦР. Полученные результаты, в целом, соответствуют картине, описываемой исследователями для европейской популяции С. parasitica, низкий уровень генетического разнообразия которой способствовал широкому распространению гиповируса, где в зависимости от района, число обнаруживаемых пшовирулентных штаммов колеблется от 30% до 90%. [Akilli et al., 2009; Milgroom & Cortesi, 1999; Cortesi & Milgroom, 1998; Milgroom etal., 2009].

Наличие большого количества вегетативно несовместимых штаммов С. parasitica является серьезной преградой для распространения гиповирулентности в популяции гриба на Северо-Западном Кавказе. Кроме того, математические модели «капгган-С./?агал7|са-СНУ» («дерево-паразит-гиперпаразит») показывают, что успешность распространения CHV среди С. parasitica при внедрении последней в популяции каштана во многом определяется начальными параметрами инвазии. Согласно

разработанным моделям [Morozov et al. 2007], доминирование гиповирулентной формы фитопатогена (ситуация, в целом характерная для Европы) возможно только в том случае, если на начальных этапах распространения крифонекроза зараженные CHV штаммы преобладали над вирулентными штаммами гриба. В противном случае CHV имеет мало шансов закрепиться в популяции С. parasitica, и высокая агрессивность патогена в конечном итоге приводит к деградации насаждений каштана.

Подводя итог, можно заключить, что тотальная пораженность популяции каштана посевного С. parasitica, высокая генетическая гетерогенность паразита и эпизодическая встречаемость гиповирулентных штаммов гриба определяют невозможность широкого естественного распространения гаповирулентности в популяции фитопатогена на Северо-Западном Кавказе. При этом успешное искусственное внедрение гиповирулентных штаммов С. parasitica не осуществимо на основных территориях каштанников, уже массово охваченных крифонекрозом. Не исключено, что единственно возможным вариантом спасения каштана в данном регионе остается интродукция азиатских видов каштана и гибридизация их с местными формами. Подобные работы, проводимые в США на протяжении нескольких десятилетий, дали положительные результаты - в результате селекционной работы и спонтанной гибридизации (происходившей в смешанных насаждениях разных видов и гибридов каштанов) были получены устойчивые к крифонекрозу гибридные формы.

Выявление молекулярно-генетических особенностей CHV, обнаруженных в штаммах С parasitica на территории Турции и РФ.

Организация генома четырех известных на сегодняшний день гиповирусов С. parasitica имеет ряд характерных особенностей. Так, на рисунке 2 приведена схема генома гиповируса CHV1, который содержит две открытые рамки считывания (open reading frame - ORF) ORF А и ORF В. Средняя длина генома CHV1 составляет 12700 пар оснований, при этом около 75% приходится на ORF В. Каждая ORF кодирует по одному полипептиду, которые в последующем распадаются, путем автокаталитического протеолиза, образуя ряд вирусных белков. Для ORF А это протеазы р29 и р40, из которых первая собственно и осуществляет автокатализ. Довольно массивный (300 кДа) белок-предшественник кодируемый ORF В, включает в себя гены протеазы р48, обладающей автокаталитическими свойствами, и мотивы вирусных РНК-зависимой РНК-полимеразы и хеликазы [Lin et al. 2007].

Для выявления пораженных CHV штаммов С. parasitica нами разработана методика идентификации гиповируса с помощью ОТ-ПЦР. Симптоматика, которую демонстрировали птовирулентные пггаммы из Турции (группа 2) и России (штаммы 73.2, А2 и А9), была наиболее

характерной для поражения гиповирусом CHV1. Исходя из этого, нами были разработаны две пары праймеров, для которых в качестве мишени выступают два участка вирусного генома расположенных на ORF В. Выбранные последовательности располагаются рядом с мотивами вирусной РНК-полимеразы и хеликазы, особенность которых состоит в том, что они являются консервативными и остаются практически неизменными у всех основных представителей семейства Hypoviridae.

ORF А ORF Б

р29 | р40 /JWÄ шшш \

•А»

Рисунок 2 - Схема генома пшовируса типа CHV1. ORF А и В - открытые рамки считывания (ORF - open reading frame); р29, р40 и р48 - гены вирусных протеаз; 5'-UTR и З'-UTR - 5'- и 3'-нетранслиремые области (untranslated region - UTR); Pol -РНК-зависимая РНК-полимераяа; Hel - хеликаза.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М

1000

500

300 200 100

Рисунок 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР на видоспецифичные для CHV праймеры (целевые фрагменты - 533 и 355 н.п.). 1 и 2 - отрицательные контроля; 3 и 13 - вирулентные штаммы; 4-12 - пшовирулентные штаммы (группа 2); М - маркер молекулярных масс.

Результаты проведенного нами ПЦР-анализа шповирулентных штаммов С. parasitica из Турции приведены на рисунке 3. Постановка ПЦР на CHV-специфические праймеры с вирулентными, турецкими (группа 1) и российскими (группы 1 и 3), штаммами давала одинаково отрицательный результат (рис. 3, 3 и 13). В результате, целевые продукты ПЦР, были получены только для тех штаммов, которые обладали выраженными симптомами CHV-обусловленной гиповирулентности. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что гиповирулентность девяти турецких штаммов, и трех российских, вызывается гиповирусом CHV1, что подтвердилось и при последующем анализе нуклеотидной последовательности полученных ПЦР-продуктов.

На сегодняшний день на территории Европы выделяют 7 подтипов гиповирусов CHV1 [Allemann, 1999]. В целом в европейской популяции С. parasitica наиболее распространены гиповирусы подтипа I, к которым относятся, в частности, менее агрессивные («слабые») вирусы CHVl-Euro7

и CHV1-EP721, тогда как вызывающий наиболее явные симптомы пшовирулентности («сильный») CHV1-EP713 (подтип F1) встречается эпизодически (Lanz, 2010]. У CHV1-EP713 и CHVl-Euro7 последовательности дцРНК в кодирующей области генома идентичны на 93% [Chen et al. 1999]. Сходство дцРНК вируса CHV1-EP721 с геномами CHVl-Euro7 и CHV1-EP713-составляет соответственно 99% и 90% [Lin et al. 2007].

Нами был проведен анализ нуклеотидной последовательности четырех участков генома гиповирусов (5-UTR - участок в 448 н.п; р29 -участок в 500 н.п., р48 - участок в 552 н.п.; мотив РНК-полимеразы -участок в 467 н.п.), выделенных из российских и турецких гиповирулентных штаммов (рис. 4). Гиповирусы, выделенные нами из турецких штаммов FW-3138 и FW-3143 продемонстрировали наибольшее сходство (99%) с гиповирусами CHV1-EP721 и CHVl-Euro7, по всем исследованным участкам. Однако у CHV, выделенных из российских штаммов С. parasitica, наблюдался ряд интересных особенностей. На участке 5'-1Ш1 и р29 гиповирусы из штаммов А9 и 73.2, так же как и турецкие штаммы, обнаружили наибольшее сходство (95% и 93% соответственно) с гиповирусами CHV1-I (рис. 4а,б). Однако на участках расположенных в ORF В наблюдалась кардинально иная картина. На участке р48 российские гиповирусы обнаружили сильное сходство (97%) с гиповирусом CHV1-EP713 (рис. 4в), а на участке мотива РНК-полимеразы показали наименьший процент сходства (87%) со всеми исследованными штаммами гиповирусов (рис. 4г). Последнее представляет особенный интерес в связи с тем, что как показали исследования [Chen et al. 2000], именно с отличиями в последовательности ORF В связывается разница в проявлении основных симптомов пшовирулентности. Тем не менее, у всех исследованных гиповирусов была обнаружена делеция двух и вставка одного нуклеотида на участке 5'-UTR, а также сайт автокатализа, разделяющий последовательности р29 и р40 на ORF А, расположен между кодонами глицина и аспарашна (рис. 46). Данные признаки являются характерными исключительно для подтипа CHV1-I, что и дает нам основание отнести обнаруженные на территории РФ и Турции штаммы гиповирусов в данную группу, несмотря на высокий процент отличий по нуклеотидной последовательности российских штаммов от европейских и турецких.

170 t |0o 190 ф 2)0 220 2J0 240

Send-732 ^CCGGGGCBSSCGCCCGGGGeTTTlaBTCCCGTTCAAGGTGAGSCCCTTGTABTAACCTCTCSCCGCTGCGCGGACGAATIiCii 5end-A9 ACCGGGGCIE5ACGCCCGGGGATTTHHTCC'CGTTCAAGGTGAGGCCCTTATA0TAACCTCTCGCCGCTGCGCGGACGA?.TACA 50IK1-FW3143 ACCGGGGCBTTCGCCCGGGGATTTCPJTCCC'GTTCAAIBGTGAGGCCATTGTAATAACCTCTCGCCGCTGCGCGGACGAATACA CHV1-Euro7 ACCGGGGCHUUCGCCCGGGGAUdUCAUCCCGUUCAAGGUGAGGCCCUilGDAAUAACCDCOCGCCGCUGCGCGGACGAAVACA CHV1-EP721 ACCGGGGCEOUCGCCCGGGGAUWUCA'UCCCGOUCAAGGlJGAGGCCCllTJGUAftuAACCUClJCGCCGCUGCGCGGACGAAUACA CHV1-EP713 ACCGGGGClmj-GCCCGGGGAUUUCADCCCGUyCAAGGUGAGGCCCUUGUABUAACCUCUCBCCGCUGCG*GABCGAAOACA

2$0 2S0 270 200 3^0 3^0 3]0 3?0

Send-732 GAATACATAAGBCCGBCCAGQACTGACAGAGTCAGCGCCGiACArGCGTGAAATGHGTGAATCGCAAACTGAA.GCGACCTAT 5end -A9 GAATACATAAGlCCGnCCAGSACTGACAGAGTCAGCGCCGCACATGCGTGAAATGBGTGAATCGCAAACTGAAGCGACCTAT 5end-FW3143GAATACATAAGncCGCCCAGTACTGACAGAGTCAGCGCCGCCCATGCGTGAAATGAGTGACTCGCAAACTGAAGCGACCTAT CHV1-Eiiro7 GAAilACAUAAGECC'GCCCAGUACUGACAGAGUCAGCGCCGCBCAUGCGUGAAAUGAGilGACilCGCAAACUGAAGCGACCUAl) CHV1-EP721 GAAlf ACAOAAGHCCGCCCAGOACUGACAGAGD CAGCGCCGCBCAUGCGTJGAAAUGAGDGACUCGCAAACUGAAGCGACCU AU CHV1-EP713 GAAUACAUAAGeCACCCAGUACUGACAGeGUCAGCGCCGCACBUGCGUGAAASGlGUGACUCGCABACUGJUVGCGACCIIAU

4?0 4?0 4$ 4$0 4$0 I 470 480 4^0

5«ld- 732 CAAACGGTTTCGTG1TTTGCGTGAAGAAXCACGGTCTCTAACGAGTACAT GTCCGGTTGGCCCCGAACSAGGCCCGATTa. 5end-A9 CAAACGGTTTCGTGBTTTGCGTGAAGAAACACGGTCTBAAACGAGTACET GTCCGGTTGGCCCCGAACGAGGCCCGATTA Send- FWS143 CABACSGTTTCGTGCTTTGCGTGBAGAAGCACGGTCTCTAACGAGTACAT- GTCCGGTTGGCCCCGAACGAGGCCCGATTi CHV1-Eur07 CABACGGUU OCGUGCtlUUGCGO GAAGAAGCACGGUCUCll AACGAGUACAO GUCCGGUU GGCCCCGAACGAGGCCCGAUU A CHV1-EP721 CAMACGGUUUCGDGCOUUGCGUGAAGAAGCACGGUCUCUAACGAGUACAU GUCCGGUUGGCCCCGAACGAGGCCCGAOUA CHV1-EP713 CAAACGG»0»CGOGCOUUGCGOGAAGAAGCACGeUC»C»BAAGAG«BCAO№GUACGG»UGACCCCGAACSAGGB:CGAAia

9?0 1ДОО 1fl!0 1.ф0 1,040 1,050 IflSO

732 CTCTC.GGCCATTGTOGAEAGCGCAAGATGGCGCGTEGCTCGTACCACCGGATGGTGTG^CGGGTGGCAGACTATC'.

A9 CTCTCGGCCATTGTHGACAGC'GCAAGATGGCGCWCGCTCGTACCACrGGATGGTGrGTRCGGGTGGCAGACTATC^

FW3143 CTCTCIJJGCCATTGTGGAEAGCGCAAGATGGCGCGTfflGCTCGTACCACCGGATGGTGTGTECGGGTGGCAGACTATC' CHV1-EUT07 CUCDG[D!GCCAUUGUSGAHAGCGCAAGAUGGCGrCGUBiGC13CGTlACCACCGGADGGyGUGUIJ3CGGGUGGCAGACUAyC! CHV1-EP721 CUCUCBSGCCAUUGUSGAITlAGCGCAAGAUGGCGCGUEGCUCGUACCACCGGAUGGUGUGUtOjCGGGUGGCAGACUAlICi CHV1-EP713CUCUCBGCCAUOGUI!GACAGCGCAAGA»GGCGCGli;CGCECGUACC,ACCGGnt)GGDGUGlieCG!SGOGGCAGACUABCl

i.cea 1,100 1,110 1,120 1,130 1,140 1,150 1.1,60

73.2 GECGATCCTTTGGnTCCTTCCGGAfTGAGGAAAG+GCCGTCGAACACGTTTATcAcGTGGTCGTCGACACCGAGTA:

БА9 GCCGATCCrTTGGCTCCTTCCGGATTGAGGAAAGTGCCGTCGAACACGTTTATCACGTGGTCGTCGACACCGAGTA:

FVV3143 GfflCGATCCTTTGGffiTCCTTCCAGATTGAGGAAAGTGCCGTCGAACACGTTTATCACGTGHTCGTCGACACCGAGTA1^ CHV1-EUfo7 GHCGAOCCODtlGGmcCOUCCAGAUUGAGGAAAGUBCCGOCGAACACGOUUAUCACGOGBOCGOCGAlIIACC&AGCA! CHV1-EP721 GnCGAUCCOU1iGGHUCCUUCCAGAUUGAGGAAAGUGCCGUCGAACASiGt]UUAUCACGUGHUCGUCGACACCGAGUAl CHV1-EP713GCCGSUCCU1JDGGCOCCUmcAGAUIJGAlSBAAA6CGCCGOCGAX:CAnGUUUADCACGUGEOCGOCGACGCIEGAGUA1

1320 1^30 GKmn t^so 1дао IOT 1 1

73.2 AGBAAGBGATCCCCTCGCCCGGATCGGCAACCAATieAATCCGCTCGCTGCCGAGTTfflGraSCCC'GGnAGtiGCCBSIT?

AS AGBAAGGGATCCCCTCGCCCGGATCGGCAACCAATTSeAATCCGCTCGCTGCCGAGTTBlGlCSCCCGGiOAGRjGCCiETT?

FW3143 AGaAAGeGATCCCCTCGCCCGGArCGGCAACCAATTGAATCCGCTCGCTGCEGAGTTmGGBCCHGeiAGCGCCCIGT? CHV1-&TO7 AGnAAGGGAITCCCC!iCGCCCGGA0CGGCAACCAAtIt1GAAtrCCGCIiCGCDGCPGAGUirCB!GiaCCCEGHAGCGCCCGUi CHV1-EP721 AGEAAGGGAUCCCCUCGCCCGGAUCGGCAACCAAOUGAAUCCGCOCGCyGCBJGAGirJSSiGCCCCISGEAGCGCCCGU? CHV1-EP713CGIIGABGGA0CCCCt!!!iGCCCGeAUDIGGCGGCCSAUUGAACCCGC0CGC0GCKGAG0Uffla3ECCCGGClAGCGCCC!llUi

3^10 3.320 3,330 3,340 3^50 3^60 ЭД70 3.3B

p48 - 732 CTAGGBGETCGACfflTTCGTBGAinABCCAniGAGGAGGlSGGTTGAGHTTGACBCGCTTCGGGTGCCGATCGAlSGAGGG' P48-A9 CTAGGHGffiTCGACffiTTCGTBGATCABCCAn!GAGGAGGBGGTTGAGBTTGACS£0CTTCGGGTGCCGA®CGA!8GAGGGr

D48-FW3143 CTAGGSGGTCCACHTTCGTGGAHAGCCAHGAGHAKGGGGTTGAGGTTGACBCffiCTTC'GSHGTJfiC'CGABC'GAGGAGGG1

CHV1-EUT07 CUAGGHGGUCCACaOOCGOGGABAGCCAHGAGBA»GGGGOTrGAGG1!UGACBCIECUUCGIIUIOGCCGAI3CGAGGAGGG' CHV1-EP721 COAGGaGGOCCACWIUCGDGGABAGCCABeAGBABeGGGUUGAGGOUGACnciicmiC&KSOeiCCGABCGAGGAGGG' CHV1-EP713 COAGGaGJIUCHACilEOUCGIIBGAJtABCCAMGAGGAGGBGGUlJGAGKOOGACracBClIUCGGGtlGCCGG'ltCGAIgGAGGG'

3^0 3.^00 3^10 3,^20 3,^30 3,440 3,<50 3,460

P48-732 GITTCGAGCTBTTGTTnAATAATCAAGTAACCCCaiGCBATTTTCGAeAAGAAGCCATTGCTlAWGAtJC-TCCTCGGC

BD48-A9 GffiTTCGAGCTBTTGTTaAATAATCAAGTAACCCCTGCBATTTTCGACAAGAAGCCATTGCTTAiSlGAEeTCCTCGGi p48- FWSWSGBTTCGAHCTJSTTGTTJUAATAATCAAGTAAC'bCCCBGCGATBTTCGACAAGAAHCCATTGCTGAGGGAIJGTICTC'GEi CHV1-Euro7 GauUCGABCUU.OUGUraiAAUAABCAAGOAACCCCHGCGAlHinilCGACAAGAAffiCCAUUGC'UGAGGGAHGOGCOGGBr CHV1-EP721 GBUUCGABCnBDUGOOEAAUAAUCAAGOAACJtCcaGCGAUUUUCGACAAGAAHCCAOUGCUGAGGGAaGBaCUCGEf CHV1-EP713 GKUUCGAGCUBUUGUOBAAUAAUCAAGUAACCCCB.GCBAUUUUCGACAAGAAGCCAOUGCUliAffiBiGASGlJCCUCGGC

г^а г spa 3sio 3jbа з$за з.ш з^бо з^ю

048 - 732 nUTffiGH6AACGATCCTGACATCCTBGTnGGGGCIlJGAGGAAGGTTCAGT0GCTGATTA!r,GTGAAAGCGGGCAAACAE1 Р48-А9 (rBTffiGffiGAACGATCCTGACATCCTBG10GGi|GCffiGAGGAAGGTTCAG,nHGCTGATTAnGTGAAAGCGGGCAAA':An,l p48-FW3143traTBj;GGAACGATCCTHACATCCTir,GTTGGTGCBGAGGAAGGTTCAB!TBiGCTGATTABGTaAAAGCGGGCAAACStB CHV1-ETO7 eBUHKGGAACGAIICCOHACAIJCCOMGIIOGGIIGCaGAGGAAGGlUJCABOiaGCilGAUUAiaGUBAAAGCGGGCAAACAIr.l OHV1-EP721liBlOHItGGAACGA»CCMBACAUCCtlHGOOGGUGCBGAGGAAGGlHICAHO!!:GCUGAUlJABGlJBAAAGCGGGCAAACAJI.l CHV1-EP7)3BB»i!i:G»GAACGAGCCirEACAOCC40G40GGSGCiliGABGAAGGU4CAGOTGC!7GAl7BA3£GlJGAAAGCGGGCAAACAnt

Рисунок 4. Секвенированные участки геномов CHV выделенных из российских (73.2 и А9) и турецкого (FW3143) штаммов С. parasitica (часть пояснений в тексте). (А) участок 5-UTR, стрелками показаны вставка одного и деления двух оснований у гиповирусов CHV1-подтип I; (Б) участок гена белка р29, вверху последовательность сайта ответственного за автокатализ, внизу стрелкой показал сайт автокатализа (Asn -аспарагин и Gly - глицин); (В) участок гена белка р48, вверху показан участок ответственный за автокатализ; (Г) участок мотива вирусной РНК-полимеразы.

9,310 8,320 В.330 8,340 8,350 8.Ж0 8,370 9,380

Pol-А9 GACMiGAXGTSAGGCGIGMCTGGAiTCAAGGTXCCCSMACACTimEGACXTTCAGCGXGmMTGG-ETCAEHA Pol-FW3M3GACGCTGAGGTTAGACGGGACCTGGAATC'AAAGTTCCCGAGACACTTTGTGACGTTCBCCGAATTGCTGGAACATAA 1 CHV1-EUT07 GACGCUGAGGUUAGACGGGACCUGGAAUCAAAGOUCCCGAGACACUUUGOGACGUUaltCCGAAlIOGCUGGAACAOAA CHV1-EP721GACGCOGAGeuUAGACGGGACCUGGAAUCAAAGOOCC'CGAAACACUl!«GOGACGUBajCCGAAlIOGCUGGAACAOAA CHV1-EP713GACSlISGEGG05AeGCAilGAACOGGAA!JCUAAGUiCCCEGEACACUUUGEGACGOUCAGCGAGSOlIC4GGiatCAEAA

Рисунок 4. Продолжение. Выводы:

1. Изучено распространение фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica (Murrill) Ватт, вызывающего крифонекроз каштана посевного (Castanea sativa Mill), что позволило установить практически полную пораженность каштана на территории Северо-Западного Кавказа.

2. Разработаны методики ПЦР-идентификации С. parasitica в образцах коры каштана посевного, позволяющие выявить возбудителя крифонекроза и диагностировать его вирулентные свойства, не прибегая к традиционным методам фитопатологической экспертизы.

3. В популяции каштана на территории Северо-Западного Кавказа выявлены лишь единичные гиповирулентные (пораженные CHV) штаммы, тогда как в исследованых районах Турции их доля составляла 40%.

4. Анализ отдельных участков генома гииовирусов, выявленных в штаммах С. parasitica на территории РФ и Турции, позволил установить, что данные гиповирусы принадлежат к виду CHV1.

5. Нами выявлены «атипичные» штаммы С. parasitica, обладающие гиповирулентным морфотипом, но при этом не пораженные CHV. Возможно, гиповирулентность этих штаммов вызвана не встречавшимся ранее на территории Европы вирусом.

6. Проведенные тесты на вегетативную совместимость выявили высокий уровень генетической гетерогенности в северокавказской популяции С. parasitica, что кардинальным образом отличается от ситуации в Европе, а также в причерноморских областях Турции. Общая картина внутривидового полиморфизма С. parasitica на территории Турции в целом соответствует общеевропейской.

7. Высокий уровень генетической гетерогенности С. parasitica и единичная встречаемость пораженных CHV штаммов гриба указывают на невозможность биологического контроля крифонекроза на Кавказе РФ на основе явления CHV-обусловленной гиповирулентности. В этой связи более перспективным методом борьбы с крифонекрозом в данном регионе может быть интродукция азиатских видов каштана и их гибридизация с местными формами.

Содержание работы в основном отражено в следующих

публикациях:

1 Пасечник В.В., Коничев А.С., Аллахвердиев С.Р., Цветков И.Л., Снисаренко Т. А., Попов А.П., Коничева А.П., Белов А. А. Рак каштана: история распространения, биохимические основы экспрессии и перспективы преодоления // Вестник МГОУ. Труды Центра фундаментальных научных исследований. 2006, №1, с. 5-12. (авторский клад-10%)

2 Коничев А.С., Попов А.П., Цветков И.Л., Белов А.А. Диагностика эндотиевого рака каштана методом ПЦР // Мат. VI Международ, научной конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности» (6-7 декабря 2007 г., Сумгаит, Азербайджанская Республика). Сумгаит. 2007. С. 17-18. (авторский клад - 20%)

3 Белов А.А., Попов А.П. РНК-вирусы как детерминанты гиповирулентности Cryphonectria parasitica - возбудителя рака коры каштана // Актуальные проблемы биоэкологи. Сб. мат. Международ, научно-практической конференции 21-24 октября 2008 г. М., 2008. С. 53-55. (авторский клад - 70%)

4 Коничев А.С., Белов А.А., Попов А.П. Молекулярно-биологическая идентификация CHV-вируса в штаммах Cryphonectria parasitica II Труды Института микробиологии НАН Азербайджана. 2009. Т. VII. С. 235-238. (авторский клад - 35%)

5 Аллахвердиев С.Р., Коничев А.С., Попов А.П., Цветков И.Л., Кырдар Э., Гюндюз Г., Атик А., Баязыт Ш.И., Белов А.А. Мониторинг грибковых заболеваний анатолийского (европейского) каштана (Costarica sativa Mill) в Турции // Труды Института микробиологии НАН Азербайджана. 2009. Т. VII. С. 30-36. (п.л., авторский клад - 10%)

6 Белов А.А. Идентификация CHV в штаммах Cryphonectria parasitica методом полимеразной цепной реакции // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2009. №2. С. 22-24. (авторский клад - 100%)

7 Попов А.П., Цветков И.Л., Белов А.А., Коничев А.С., Иванушкина Н.Е., Кочкина Г.А., Озерская С.М. Молекулярно-генетическая идентификация фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica II Микробиология. 2010. Т. 79. № 2. С. 246-251. (авторский клад - 20%)

8 Попов А.П., Белов А.А., Цветков И.Л., Коничев А.С. Исследование полиморфизма Cryphonectria parasitica - возбудителя крифонекроза каштана посевного - на Северо-Западном Кавказе // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2010. № 3. С. 92-97. (авторский клад -30%).

9 Попов А. П, Белов А. А., Иванушкина Н. Е., Цветков И Л., Коничев А. С. Молекулярно-генетические детерминанты внутривидового полиморфизма фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica II Генетика. 2011. (в печати), (авторский клад - 20%).

Подписано в печать: 11.11.2010 г. Бумага офсетная. Гарнитура «Times New Roman». Печать офсетная. Формат бумаги 60/84 í/16. Усл. п.л. 1,3.

_Тираж 100 экз. Заказ № 325._

Изготовлено с готового оригинал-макета в Издательстве МГОУ. 105005, г. Москва, ул. Радио, д. 10-а.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белов, Анатолий Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. КРИФОНЕКРОЗ КАШТАНА И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ЕГО ПРЕОДОЛЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Предыстория проблемы и современное состояние в мире и в России.

1.2 Особенности биологии Cryphonectria parasitica.

1.3 Cryphonectria hypovirus (CHV) и структура его генома.

1.4 Молекулярно-биологические механизмы действия CHV.

1.5 Вегетативная несовместимость.

1.6 Перспективы преодоления крифонекроза.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Биологический материал.

2.1.1 Сбор биологического материала.

2.1.2. Выделение и культивирование штаммов С. parasitica.

2.2. Методы.

2.2.1. Молекулярно-генетическая идентификация С. parasitica и CHV

2.2.1.1. Выделение нуклеиновых кислот.

2.2.1.2. Обратная транскрипция.

2.2.1.3. Амплификация.

2.2.1.4. Детекция продуктов амплификации.

2.2.2. Анализ геномов СНУ из гиповирулентных штаммов С. parasitica

2.2.2.1. Получение препарата вирусной дцРНК.

2.2.2.2. Синтез дц-кДНК-копии генома СНУ.

2.2.2.3. Детекция и очистка дц-кДНК.

2.2.2.4. Синтез рекомбинантной плазмиды.

2.2.2.5. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli.

2.2.2.6. Трансформация клеток Escherichia coli.

2.2.2.7. Выделение плазмидной ДНК и секвенирование генома CHV. 84 2.2.3. Анализ вегетативной совместимости штаммов С. parasitica.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Состояние популяции Castanea sativa на Северо-Западном Кавказе в связи с крифонекрозом.

3.2. Анализ вирулентных свойств и исследование внутривидового полиморфизма штаммов С. parasitica выявленных на территории РФ.

3.3. Выявление генетических особенностей CHV обнаруженных в штаммах С. parasitica на территории Турции и РФ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутривидовой полиморфизм фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного"

Актуальность темы. Одним из важнейших направлений популяционной и прикладной экологии является изучение влияния биологических факторов среды на состояние хозяйственно ценных видов растений. В этой связи, несомненный интерес представляет изучение воздействия фитопатогенных грибов на лесообразующие виды растений. Фитопатогенный гриб Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr, является одним из самых известных представителей аскомицетовых грибов относящихся к классу Sordariomycetes. Данный организм, поражая своих основных хозяев, представителей рода Castanea, нанес серьезный ущерб лесному хозяйству в странах Европы и США. Как считается, С. parasitica попал на территорию США и Европы вместе с саженцами азиатских каштанов, которые проявляя наибольшую устойчивость к патогену, не погибают от крифонекроза. На территории США, где каштан зубчатый (или американский, С. dentatä) выращивался в поистине промышленных масштабах в скученных монокультурных посадках (к началу XX века насчитывалось около 4 млрд. стволов), С. parasitica не встретил на своем пути практически ни каких естественных препятствий. Зубчатый каштан был одним из самых многочисленных и ценных пород каштана и, к сожалению, оказался наиболее чувствителен к поражению крифонекрозом. К 50-м годам его численность сократилась до 500 млн. стволов. В Европе^ крифонекроз впервые зафиксирован был в 1938 году в Италии и в течении последующих десятилетий заболевание распространилось по всей территории Европы и некоторых регионов бывшего СССР. Однако, С. parasitica не нанес такого сильного ущерба как в США, и в настоящий момент каштан посевной (С. sativa) продолжает сохранять статус лесообразующей породы в различных регионах Европы. Несмотря на то каштан в Европе в значительной степени сохранен, тем не менее, квазивымирание каштана зубчатого на территории США позволяет рассматривать данную эпидемию как одну из крупнейших ботанических катастроф.

Существенным моментом в истории исследований крифонекроза стало открытие в 1950-х годах явления гиповирулентности у С. parasitica. Произведенные исследования позволили уставить, что причиной пониженной вирулентности гриба является вирус, названный Cryphonectria hypovirus (CHV), и выделенный в отдельное семейство Hypoviridae. CHV поражая С. parasitica приводит к снижению уровня роста гриба, женской стерильности и снижению уровня бесполого спороношения. Если в случае поражения здоровым, вирулентным, щтаммом С. parasitica дерево погибало в течении нескольких лет, то при поражении гиповирулентным штаммом на дереве формировались заживающие язвы, которые не проводили к его гибели. В Европе популяция C.parasitica характеризуется малым аллельным разнообразием, а также низким уровнем рекомбинации, благодаря чему гиповирус сумел самостоятельно распространиться практически по всей европейской части ареала каштана. На сегодняшний день, ситуация с распространением крифонекроза в Европе остается стабильной, несмотря на то, что практически весь каштан поражен С. parasitica, большая часть выявляемых штаммов гриба являются гиповирулентными, в некоторых районах количество подобных штаммов может достигать 90% - 100%.

На CHV возлагали большие надежды как на естественного агента, способного помочь справиться с агрессивным фитопатогеном, снизив его вирулентность. Однако опыты по искусственному внедрению CHV, за некоторыми исключениями, в большинстве случаев закончились неудачей [Robin et al. 2010]. Так, в Европе, опыты по искусственному заражению; каштана гиповирулентными штаммами были успешными лишь в некоторых лесничествах на территории Италии. В США лишь в лесничествах штата Мичиган удалось спасти местную популяцию американского каштана, заражая деревья гиповирулентными штаммами гриба, однако на остальной территории, даже по прошествии нескольких десятилетий, CHV так и не смог распространиться [Milgroom et al. 1999]. Как полагают, преобладание половой стадии в цикле размножения С. parasitica обуславливает высокий уровень его генетической гетерогенности в Северной Америке, что является существенной преградой на пути распространения гиповируса в местной популяции гриба. Единственный действенный способ, благодаря которому, удалось сохранить американский каштан, был создание гибридов с азиатскими представителями рода. На сегодняшний день можно констатировать квазивымирание каштана зубчатого, поскольку аборигенные представители сохранились только в виде небольших изолированных посадок. Большая же часть каштана на территории США занята гибридными формами зубчастого и китайского (С. mollissimá) каштанов.

Вегетативная несовместимость между штаммами С. parasitica, выражающаяся в неспособности двух штаммов образовать гифальные анастомозы, как считается выполняет функцию барьера, который препятствует распространению цитоплазматических агентов, способных нанести вред организму гриба [Caten, 1972]. К таким агентам относится и CHV, геном которого представлен двуцепочечной РНК (дцРНК), лишенной капсида, и соответственно не способной поразить нового хозяина перемещаясь во внешней среде. На сегодняшний день, в Европе более 60% всех обнаруженных штаммов С. parasitica принадлежали к одной группе вегетативной совместимости (ВС), что с одной стороны является результатом поражения CHV, ввиду ингибирования полового процесса у гриба, а с другой способствует еще большему его распространению. Иная картина наблюдается в США, где обнаружено большое количество групп ВС и выраженность половой стадии у гриба настолько велика, что порой приближается к значениям панмиксии. За счет этого в Северной Америке обнаруживаются лишь единичные гиповирулентные изоляты, пораженные CHV1.

Вопрос о состоянии популяции каштана посевного на территории РФ в связи с крифонекрозом требует детального исследования, ввиду практически полного отсутствия работ по данной теме. Сохранение каштана посевного в причерноморском ареале является актуальной научной и практической задачей защиты леса. Особый интерес представляет рассмотрение перспектив гиповирулентных штаммов С. parasitica в качестве средства биологического контроля крифонекроза на территории РФ. Изучение взаимодействия в системе «растение-гриб-гиповирус» (или «хозяин-паразит-сверхпаразит»), представляющего собой один из наиболее изученных, с точки зрения молекулярных основ, модельных объектов взаимодействия вирус-гриб, по-прежнему представляет интерес для исследователей работающих в области популяционной и прикладной экологии. Оценка влияния сверхпаразита CHV на полиморфизм и вирулентные свойства штаммов С. parasitica, является ключевым фактором при рассмотрении возможных стратегий по борьбе с данным фитопатогеном.

Целью данной работы является проведение комплексного обследования распространенности и полиморфизма фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного, что позволит сравнить ситуацию с крифонекрозом на территории Кавказа РФ с общеевропейской и определить степень угрозы патогена для российской популяции каштана.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

3. Провести тесты на вегетативную совместимость с выявленными на Северо-Западном Кавказе гиповирулентными штаммами С. parasitica и дать оценку возможной роли CHV в качестве агента биологического контроля.

4. Выявить молекулярно-генетические особенности СНУ, обнаруженных в штаммах С. parasitica на территории РФ и Турции.

Научная новизна. Проведенное нами обследование популяции каштана посевного на территории Северо-западного Кавказа показало, что каштан, являясь одной из лесообразующих пород Сочинского национального парка, практически полностью поражен крифонекрозом. Данное обстоятельство сопровождалось еще и тем, что гиповирулентные штаммы, пораженные CHV, обнаруживались лишь в единичных случаях. Напротив, впервые проведенные исследования штаммов С. parasitica выявленных на территории Турции показали, что количество гиповирулентных штаммов там составляет около 40%, что в целом соответствует общеевропейской картине распространения крифонекроза.

Проведенные нами тесты на вегетативную совместимость, среди 99 штаммов С. parasitica собранных на территории РФ, позволили выявить высокий уровень генетической гетерогенности С. parasitica. Полученные данные позволяют дать оценку перспективам использования CHV в качестве агента биологического контроля в причерноморской части ареала каштана посевного.

Нами впервые описаны гиповирулентные штаммы С. parasitica не пораженные CHV. Из 97 выявленных нами на территории РФ штаммов С. parasitica шесть обладали атипичныым гиповирулентным фенотипом, что дает основания предполагать возможность использования данных штаммов в качестве нового, уникального для России, агента биологического контроля крифонекроза.

Проведенный нами анализ нуклеотидных последовательностей участков генома гиповирусов CHV, выявленных в штаммах С. parasitica на территории РФ и Турции, впервые позволил установить их видовую принадлежность, а также выявить ряд существенных отличий в нуклеотидной последовательности у российских штаммов гиповирусов в сравнении с турецкими и европейскими.

Практическая значимость. Разработанный нами в рамках диссертационного исследования метод идентификации С. parasitica в пораженной коре каштана с помощью ПЦР, позволяет быстро и точно идентифицировать патогена в образце коры, не прибегая фитопатологической экспертизе. Также, разработан метод идентификации CHV в изолированных штаммах С. parasitica, который позволяет эффективно и точно оценить вирулентность гриба. В целом, результаты исследования позволят более эффективно проводить санитарные мероприятия по оздоровлению популяции каштана.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора современных литературных сведений о крифонекрозе каштана и его возбудителе С. parasitica (глава 1); описания биологических объектов, материалов и методов исследования (глава 2); изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных (глава 3); заключения и выводов; списка цитированной литературы; приложения. Диссертация изложена на 142 страницах, содержит 1 таблицу и 11 рисунков, включая фотографии и схемы.

Заключение Диссертация по теме "Экология (по отраслям)", Белов, Анатолий Алексеевич

Выводы:

1. Изучено распространение фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr, вызывающего крифонекроз каштана посевного {Castanea sativa Mill), что позволило установить практически полную пораженность каштана на территории Северо-Западного Кавказа.

4. Анализ отдельных участков генома гиповирусов, выявленных в штаммах С. parasitica на территории РФ и Турции, позволил установить, что данные гиповирусы принадлежат к виду CHV 1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

В последние 15-20 лет на территории Северо-Западного Кавказа РФ наблюдается масштабная эпидемия крифонекроза каштана посевного. К сожалению, как констатируется в работе Иссинского [Иссинский П.А., 1968], в бывшем СССР и нынешней РФ исследования различных аспектов влияния С. parasitica на российскую часть популяции каштана посевного не получили должного развития, вследствие чего был упущен из вида огромный пласт информации в этой области. При этом, несмотря на столь сильную эпифитотию сегодня, в тех немногих опубликованных исследованиях, публиковавшихся в течении XX столетия, отмечались лишь локальные очаги крифонекроза.

Причины, столь отличной от мирового опыта, картины развития эпидемии крифонекроза каштана посевного установить довольно трудно. Возможно, что нынешняя эпифитотия может быть связана с проникновением в кавказский ареал каштана посевного более вирулентной расы патогена, ввиду своей агрессивности за короткое время охватившей всю причерноморскую часть ареала каштана. Или же местная форма патогена, в силу каких-либо причин, приобрела повышенную вирулентность, что привело к ее стремительному распространению. Также свою роль могло сыграть ухудшающееся общее санитарное состояние каштановых лесов. При этом нельзя исключать, что на все выше перечисленное может накладываться поражение каштана другими грибными и бактериальными паразитами.

Проведенные тесты на вегетативную совместимость штаммов С. parasitica, выявленных в российской части ареала произрастания каштана, позволяют говорить о высоком уровне генетической гетерогенности гриба. Это кардинальным образом отличается от картины наблюдаемой в Европе, а также на севере Турции, где генетическая гомогенность С. parasitica сопровождается широкой распространенностью штаммов пораженных гиповирусом. Если в Европе количество обнаруживаемых гиповирулентных штаммов варьирует от 30% до 90% от их общего числа, в исследованных нами районах Зангулдакской области Турции таковых выявлено 40%, то в России из 97 обнаруженных нами штаммов лишь один был поражен CHV. Исходя из этого можно констатировать значительное сходство протекания эпифитотии крифонекроза на Северо-Западном Кавказе с ситуацией сложившейся в США в течении первой половины XX столетия.

Исследование генома CHV обнаруженного в штаммах С. parasitica выявленных на территории РФ и Турции позволило установить, что как и в остальной Европе, в данных регионах встречается только гиповирус CHV 1. При этом, проведенное нами исследование ряда участков генома гиповируса позволяет с уверенностью говорить, что все исследованные нами штаммы CHV1 принадлежать к подтипу I. Однако, несмотря на наличие характерных признаков «слабых» штаммов CHV, штаммы из РФ и Турции продемонстрировали высоких процент отличий от европейских представителей семейства Hypoviridae.

Надежду на возможность развития естественного биологического контроля крифонекроза оставляет обнаружение на обследованных территориях СНП атипичных штаммов патогена. Данные штаммы С. parasitica демонстрировали пониженную агрессивность в отношении растения-хозяина, и если наше предположение о зараженности атипичных штаммов микореовирусами верно, то последние имеют хорошие шансы распространиться в местной популяции С. parasitica. Данные вирусы, в отличие от гиповирусов, не ингибируют половое и бесполое спороношение гриба-хозяина и свободно распространяются как с аскоспорами, так и с пикнидоспорами гриба [Deng et al. 2007].

Согласно проведенным ранее исследованиям эпидемиологических моделей системы «каштан-C.parasitica-CHV» («дерево-паразит-гиперпаразит») показывают, что успешность распространения CHV среди С. parasitica при внедрении последней в популяции каштана во многом определяется начальными параметрами инвазии [Morozov et al. 2007]. Полученные нами результаты позволяют заключить, что несмотря на то, что на территории РФ нами были выявлены штаммы CHV «слабого» подтипа, наличие высокого уровня генетической гетерогенности популяции С. parasitica и единичная встречамость гиповирулентных изолятов позволяет придти к выводу, что биологический (с помощью CHV-обусловленной гиповирулентности) контроль крифонекроза на СевероЗападном Кавказе невозможен.

Учитывая практическую невозможность контроля крифонекроза на Кавказе РФ с использованием CIiV-обусловленной гиповирулентности С. parasitica, не исключено, что единственно возможным вариантом спасения каштана в данном регионе остается интродукция азиатских видов каштана и гибридизация их с местными формами. Подобные работы, проводимые в США на протяжении нескольких десятилетий, дали положительные результаты [Придня М.В., 2004] - в результате селекционной работы и спонтанной гибридизации (происходившей в смешанных насаждениях разных видов и гибридов каштанов) были получены устойчивые к крифонекрозу гибридные формы, обладающие холодостойкостью американского каштана и показавшие свою конкурентоспособность в местных лесных сообществах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белов, Анатолий Алексеевич, Москва

1. Белов A.A. Идентификация CHV в штаммах Cryphonectria parasiticaметодом полимеразной цепной реакции // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2009. №2. С. 22-24.

2. Гринько H.H. Внутривидовое разнообразие возбудителя рака каштана съедобного на Северном Кавказе // Вестник РАСХН. 2009. № 4. С.29-33.

3. Гринько H.H. Внутривидовой полиморфизм возбудителя рака коры каштана {Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr.) на Северном Кавказе // Современная микология в России. Т.2. / Гл. ред. Дьяков Ю.Т. М.: Национальная академия микологии, 2008. С. 174-176.

4. Дьяков Ю.Т. Грибы: Индивидуумы, популяции, видообразование // Ж. Общ. Биол. 2008. Т. 1. № 1. С. 10-18.

5. Дьяков Ю.Т., Долгова A.B. Вегетативная несовместимость у фитопатогенных грибов. -М.: Изд. МГУ, 1995.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. / Пер. с англ. М.: Мир, 1984. 480с.

7. Методы экспериментальной микологии / ред. В.И. Билай Киев: Наукова думка, 1982.

8. Небел Б. Наука об окружающей среде // Как устроен мир.Т. 1 .М., «Мир», 1993, 420 с.

9. Попов А.П., Белов А.А., Цветков И.Л., Коничев А.С. Исследование полиморфизма Cryphonectria parasitica — возбудителя крифонекроза каштана посевного — на Северо-Западном Кавказе // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2010. № 3. С. 92-97.

10. Попов А.П., Коничев А.С., Цветков И.Л., Аллахвердиев С.Р., Кырдар Э., Гюндюз Г., Аттик Г.А. Разработка тест-системы для диагностики эндотиевого рака каштана методом ПЦР // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2007. №1. С. 7-11.

11. Попов А.П., Цветков И.Л., Белов А.А., Коничев А.С., Иванушкина Н.Е., Кочкина Г.А., Озерская С.М. Молекулярно-генетическая идентификация фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica II Микробиология. 2010. Т. 79. № 2. С. 246-251.

12. Придня М.В., Ромашин А.В., Пиньковский М.Д. Естественноисторические условия развития каштановых лесов России, их восстановление и сохранение // Электронный журнал «Исследовано в России». 2005.

13. Рекомендации по сохранению и восстановлению каштановых лесов /Чернышев М.П., Придня М.В. // Сочи: ФГУ «НИИгорлесэкол», 2004. -46с.

14. Сидорова И.И. и др. Класс Аскомицеты (Ascomycetes) // Мир растений, в 7 т. / Редкол. A.JI. Тахтаджян (гл. ред.) и др. Т. 2. Грибы. / Под ред. М.В. Горленко. 2-е изд., перераб. — М.: Просвещение, 1991. — 475 с.

15. Хохряков М.К., Доброзракова Т.Л., Степанов К.М., Летова М.Ф. Определитель болезней растений // Спб: Лань. 2003.

16. Akilli S., Katirciog Y. Z. and Maden S. Vegetative compatibility types of Cryphonectria parasitica, causal agent of chestnut blight, in the Black Sea region of Turkey // For. Path. 2009. Vol. 39. P. 390-396.

17. Allen T.D., Dawe A.L., Nuss D.L. Use of cDNA microarrays to monitor transcriptional responses of the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica to infection by virulence-attenuating hypoviruses // Eukaryot. Cell. 2003. V. 2. № 6. P. 1253-1265.

18. Allen T.D., Nuss D.L. Specific and common alterations in host gene transcript accumulation following infection of the chestnut blight fungus by mild and severe hypoviruses // J. Virol. 2004. V. 78. № 8. P. 4145-4155.

19. Anagnostakis S. L. Genetic analyses of Endothia parasitica: linkage data for four single genes and three vegetative compatibility types // Genetics. 1982. Vol. 102. P. 25-28.

20. Anagnostakis S. L. Hypovirulence and orchard management // Proceed. Of the World Chestnut Industry Conference. 1992. Sect. 3. P. 1-4.

21. Anagnostakis S. L., Hillman B. Evolution of chestnut tree and its blight //Arnoldia, 1992, Vol. 52. № 2. C. 4-10.

22. Biraghi A. Possible active resistance to Endotia parasitica in Castanea sativa. // Rep. Congr. Int. Union For. Res. Org. vol. 11. Rome. 1953.

23. Biraghi, A. II cancro del castagno causato da Endothia parasitica // L'ltalia Agricola. 1946. Vol. 7. P. 406.

24. Bisseger M., Rigling D., Heiniger U. Population structure and disease development of Cryphonectria parasitica in European chestnut forests in presence of natural hypovirulemce // Phytopatol. 1997. V. 87. № l.P. 50-59.

25. Caten C.E. Vegetative incompatibility and cytoplasmic infection in fungi //J. Gen. Microbiol. 1972. V. 72. № 2. P. 221-229.

26. Caten C.E., Jinks J.L. Heterokaryosis: its significance in wild homothallic ascomycetes and fungi imperfect! // Transactions of the British Mycological Society. 1966. Vol. 49. P. 81-93.

27. Chen B., Craven M.G., Choi G.H., Nuss D.L. cDNA-derived hypovirus RNA in transformed chestnut blight fungus is spliced and trimmed of vector nucleotides // Virology. 1994. Vol. 202. №l. p. 441-8.

28. Chen B., Gao S., Choi G.H., Nuss D.L. Extensive alteration of fungal gene transcript accumulation and elevation of G-protein-regulated cAMP levels by a virulence-attenuating hypovirus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 17. P. 7996-8000.

29. Chen B., Geletka L.M., Nuss D.L. Using chimeric hypoviruses to fine-tune the interaction between a pathogenic fungus and its plant host // J. Virol. 2000. V. 74. № 16. P. 7562-7567.

30. Chen B., Nuss D.L. Infectious cDNA clone of hypovirus CHVl-Euro7: a comparative virology approach to investigate virus-mediated hypovirulence of the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica // J. Virol. 1999. V. № 2. P. 985-992.

31. Choi G.H., Chen B., Nuss D.L. Virus-mediated or transgenic suppression of a G-protein a subunit and attenuation of fungal virulence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. № 1. P. 305-309.

32. Choi G.H., Pawlyk D.M., Nuss D.L. The autocatalytic protease p29 encoded by a hypovirulence-associated virus of the chestnut blight fungus resembles the potyvirus-encoded protease HC-Pro // Virology. 1991. Vol. 183 №6. P. 747-52.

33. Chung H.-J., Kim M.-J., Lim J.-Y. et al. A gene encoding phosphatidyl inositol-specific phospholipase C from Cryphonectria parasitica modulates the lacl expression // Fung. Genet. Biol. 2006. V. 43. № 5. P. 326-336.

34. Cortesi P., McCulloch E.C., Song H. et al. Genetic control of horizontal virus transmission in the chestnut blight fungus, Cryphonectria parasitica // Genetics. 2001. V. 159. № 1. P. 107-118.

35. Cortesi P., Milgroom M.G. Genetics of vegetative incompatibility in Cryphonectria parasitica // Appl. Envir. Microbiol. 1998. V. 64. № 8. P. 29882994.

36. Dawe A.L., McMains V.C., Panglao M. et al. An ordered collection of expressed sequences from Cryphonectria parasitica and evidence of genomic microsynteny with Neurospora crassa and Magnaporthe" grisea // Microbiol. 2003. V. 149. № 9. P. 2373-2384.

37. Dawe A.L., Nuss D.L. Hypoviruses and chestnut blight: exploiting viruses to understand and modulate fungal pathogenesis // Annu. Rev. Genet. 2001. V. 35. P. 1-29.

38. Deng F., Nuss D.L. Hypovirus papain-like protease p48 is required for initiation but not for maintenance of virus RNA propagation in the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica // J. Virol. 2008. V. 82. № 13. P. 63696378.

39. Deng Q.C., Ye Y., Miao M. et al. The horizontal transmission of Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) is affected by virus strains // Chinese Sci. Bull. 2009. V. 54. № 17. P. 3053-3060.

40. Ebhardt H.A., Thi E.P., Wang M.-B., Unrau P.J. Extensive 3' modification of plant small RNAs is modulated by helper component-protease expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 38. P.13398-13403.

41. Fahima T., Wu Y., Zhang L., Van Alfen N.K. Identification of the putative RNA polymerase of Cryphonectria hypovirus in a solubilized replication complex//J. Virol. 1998. V. 68. № 9. p. 6116-6119.

42. Gao S., Nuss D.L. Distinct roles for two G protein a subunits in fungal virulence, morphology, and reproduction revealed by targeted gene disruption // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 24. P. 14122-14127.

43. Gao S., Nuss D.L. Mutagenesis of putative acylation sites alters function, localization, and accumulation of a Gia subunit of the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica // Mol. Plant-Microbe Interact. 1998. V. 11. № 11. P. 1130-1135.

44. Gaumann E. Uber das Kastaniensterben im Tessin // Schweiz. Ztschr. f. Forstwesen. 1951. Bd. 1. S. 1-20.

45. Grente M.J. Les formes hypovirulentes d.Endotia parasitica et les espoirs de lutte contre le chancre du chataignier // Acad.Agric.France.1965. p. 1033-36.

46. Guerra D. Le mallatie parassitarie ed i castanegneti del Piemonte e della Ligura // Ital. For. Mont. 1948. Vol. 3. P. 266-87.

47. Gurer M., Turchetti T., Biagioni P., Maresi G. Assessment and characterisation of Turkish hypovirulent isolates of Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr. // Phytopathol. Mediterr. 2001. V. 40. № 3. P. 265-275.

48. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 669-672.

49. Hillman B. I., S. Supyani H. Kondo and N. Suzuki. A reovirus of the fungus Cryphonectria parasitica is infectious as particles and related to the Coltivirus genus of animal pathogens // J. Virol. 2004. Vol. 78. P. 892-898.

50. Hillman B.I., B. Halpern T., Brown M.P. A viral dsRNA element of the chestnut blight fungus with a distinct genetic organization // J. Virol. 1994. V. 201. №2. P. 241-250.

51. Hillman B.I., Suzuki N. Viruses of the chestnut blight fungus, Cryphonectria parasitica // Adv. Virus Res. 2004. V. 63. P. 423-472.

52. Hillman B.I., Tian Y., Bedker P.J., Brown M.P. A North American hypovirulent isolate of the chestnut blight fungus with European isolate-related dsRNA // J. Gen. Virol. 1992. V. 73. № 3. P. 681-686.

53. HV 7/45 (1) Cryphonectria parasitica // Bulletin OEPP/Bulletin EPPO. 2005. V. 35. P. 295-298.

54. Jacob-Wilk D., Turina M., Van Alfen N.K. Mycovirus Cryphonectria hypovirus 1 elements cofractionate with trans-Golgi network membranes of the fungal host Cryphonectria parasitica // J. Virol. 2006. V. 80. № 13. P. 65886596.

55. Kazmierczak P., Pfeiffer P., Zhang L., Van Alfen N.K. Transcriptional repression of specific host genes by the mycovirus Cryphonectria hypovirus 1 // J. Virol. 1996. V. 70. № 2. P. 1137-1142.

56. Kim M.J., Choi J.W., Park S.M. et al. Characterization of a fungal protein kinase from Cryphonectria parasitica and its transcriptional upregulation by hypovirus // Mol. Microbiol. 2002. V. 45. № 4. P. 933-941.

57. Koonin E.V., Choi G.H., Nuss D.L. et al. Evidence for common ancestry of a chestnut blight hypovirulence-associated double-stranded RNA and a group of positive-strand RNA plant viruses // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. №23. P. 10647-0651.

58. Krstin L., Novak-Agbaba S., Rigling D. et al. Chestnut blight fungus in Croatia: diversity of vegetative compatibility types, mating types and geneticvariability of associated Cryphonectria hypovirus 1 // Plant Pathol. 2008. V. 57. № 6. P. 1086-1096.

59. Lin H., Lan X., Liao H. et al. Genome sequence, full-length infectious cDNA clone, and mapping of viral double-stranded RNA accumulation determinant of hypovirus CHV1-EP721 // J. Virol. 2007. V. 81. № 4. P. 18131820.

60. Linder-Basso D., Dynek J.N., Hillman B. Genome analysis of Cryphonectria hypovirus 4, the most common hypovirus species in North America // J. Virol. 2005. V. 337. № 1. P. 192-203.

61. Liu F.X., Ding P., Xu C.X., Wang K.-R. Genetic Diversity of Cryphonectria hypovirus 1 in China, Japan and Italy // J. Phytopathol. 2007. V. 155. № 11-12. P. 662-669.

62. Liu Y.C., Milgroom M.G. High diversity of vegetative compatibility types in Cryphonectria parasitica in Japan and China // Mycologia. 2007. V. 99. № 2. P. 279-284.

63. Liu, Y.-C. and Milgroom, M. G. Correlation between hypovirus transmission and the number of vegetative incompatibility (vie) genes di€erentamong isolates from a natural population of Cryphonectria parasitica // Phytopathology. 1996.Vol. 86. P. 79-86.

64. Luisi, N., & Laviola, C. (). Sopravvivenza di Endothia parasitica (Mrr.) And. e And. in cancri indotti da Cytospora occulta Sacc. su Alnus cordata Desf// Atti della Giornata del Castagno, Caprese Michelangelo. 1977. P. 279-286.

65. Marra R.E., Milgroom M.G. The mating system of the fungus, Cryphonectria parasitica: selfmg and self-incompatibility // Heredity. 2001. V. 86. № 2. P. 134-143.

66. Mertens, P. P. C., et al. 2000. Family Reoviridae, p. 395-480. In M. H. V. van Regenmortel et al., Virus taxonomy. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, Calif.

67. Milgroom M.G., Cortesi P. Analysis of population structure of the chestnut blight fungus based on vegetative incompatibility genotypes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 18. P. 10518-10523.

68. Milgroom M.G., Cortesi P. Biological control of chestnut blight with hypovirulence: a critical analysis // Annu. Rev. Phytopathol. 2004. V. 42. P. 311-338.

69. Milgroom M.G., Sotirovski K., Risteski M., Brewer M.T. Heterokaryons and parasexual recombinants of Cryphonectria parasitica in two clonal populations in southeastern Europe // Fung. Genet. Biol. 2009. V. 46. № 11. P. 849-854.

70. Milgroom M.G., Sotirovski K., Spica D. et al. Clonal population structure in expanding ranges of the chestnut blight fungus in southeastern Europe // Mol. Ecol. 2008. V. 17. № 20. P. 4446^1458.

71. Milgroom MG, Sotirovski K, Spica D, Davis JE, Brewer MT, Milev M, Cortesi P. Clonal population structure in expanding ranges of the chestnut blight fungus in southeastern Europe // Mol. Ecol. 2008. Vol. 17. №20. P. 4446-58.

72. Morozov A. Y., Robin C., Franc A. A simple model for the dynamics of a host-parasite-hyperparasite interaction // J. Theor. Biol. 2007. Vol. 249. № 2. P. 246-253.

73. Morozov A., Robin C., Franc A. A simple model for the dynamics of a host-parasite-hyperparasite interaction // J. Theor. Biol. 2007. V. 249. № 2. P. 246-253.

74. Nuss D.L. Biological control of chestnut blight: an example of virusmediated attenuation of fungal pathogenesis.// Microbiol Rev. 1992. Vol. 56. №4. P. 561-76.

75. Nuss D.L. Hypoviruses // Encyclopedia of Virology. 3rd ed. / Eds. Mahy B.W.J., van Regenmortel M.H.V. Elsevier Ltd., 2008. P. 580-585.

76. Paillet F. L. Growth form and life histories of American chestnut and Alligheny and Ozark chinquapin at various North American sites // Bullet, of the Torrey Botanical Club. 1993. Vol. 120. №3. P. 257-268.

77. Parsley T.B., Chen B., Geletka L.M., Nuss D.L. Differential modulation of cellular signaling pathways by mild and severe hypovirus strains // Eukaryot. Cell. 2002. V. 1. № 3. P. 401-413.

78. Rigling D., Heiniger U. and Hohl H. Reduction of Laccase Activity in dsRNA-containing hypovirulent strains of Cryphonectria (Endothia) parasitica II 1989. Phytopathology. Vol. 79. P. 219-223.

79. Robin C., Heiniger U. Chestnut blight in Europe: diversity of Cryphonectria parasitica, hypovirulence and biocontrol // For. Snow Landsc. Res. 2001. V. 76. № 3. P. 361-367.

80. Rostagno L., Crivelli G., Turina M. Study of mRNA expression by real time PCR of Cpkkl, Cpkk2 and Cpkk3, three MEKs of Cryphonectria parasitica, > in virus-free and virus-infected isogenic isolates // J. Phytopathol. 2009. V. 158. №6. P. 409^116.

81. Schweizer P., Pokorny J., Schulze-Lefert P., Dudler R. Technical advance, double-stranded RNA interferes with gene function at the single-cell level in cereals // Plant J. 2000. V. 24. № 6. P. 895-903.

82. Segers G.C., Zhang X., Deng F., Sun Q., Nuss D.L. Evidence that RNA silencing functions as an antiviral defense mechanism in fungi // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. Vol. 104. p. 12902-12906.

83. Shapira R., Choi G.H., Nuss D.L. Virus-like genetic organization and expression strategy for a double-stranded RNA genetic element associated with biological control of chestnut blight // EMBO J. 1991. Vol. 10(4). P. 731-9.

84. Shapira R., Nuss D.L. Gene expression by a hypovirulence associated virus of the chestnut blight fungus involves two papain-like protease activities.

85. Essential residues and cleavage site requirements for p48 autoproteolysis // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266(4). P. 19419-25.

86. Sotirovski K., Papazova-Anakieva I., Grunwald N.J., Milgroom M.G. Low diversity of vegetative compatibility types and mating type in Cryphonectria parasitica in the southern Balkans // Plant Pathol. 2004. V. 53. P. 325-333.

87. Sun Q, Choi G.H., Nuss D.L. A single Argonaute gene is required for induction of RNA silencing antiviral defense and promotes viral RNA recombination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 42. P. 1792717932.

88. Sutton B.C. The Coelomycetes // Kew, UK: Commonwealth Mycological Institute, 1980.

89. Suzuki N., Chen B., Nuss D.L. Mapping of a hypovirus p29 protease symptom determinant domain with sequence similarity to potyvirus HC-Pro protease // J. Virol. 1999. V. 73. № 11. P. 9478-9484.

90. Suzuki N., Geletka L. M. and Nuss D. L. Essential and dispensable virus-encoded replication elements revealed by efforts to develop hypoviruses as gene expression vectors // J. Virol. 2000. Vol. 74. P. 7568-7577.

91. Suzuki N., Maruyama K., Moriyama M., Nuss D.L. Hypovirus papain-like protease p29 functions in trans to enhance viral double-stranded RNA accumulation and vertical transmission // J. Virol. 2003. V. 77. № 21. P. 1169711707.

92. Suzuki N., Nuss D.L. Contribution of protein p40 to hypovirusmediated modulation of fungal host phenotype and viral RNA accumulation // J. Virol. 2002. V. 76. № 15. P. 7747-7759.

93. Turchetti T., Ferretti F., Maresi G. Natural spread of Cryphonectria parasitica and persistence of hypovirulence in three Italian coppiced chestnut stands // Forest Pathol. 2008. V. 38. № 4. P. 227-243.

94. Turchetti T., Maresi G. Biological control and management of chestnut diseases // Integrated management of diseases caused by fungi, phytoplasma and bacteria / A. Ciancio, K.G. Mukerji (eds.). Springer Science+Business Media B.V. 2008. P. 85-118.

95. Turchetti, T., Maresi, G., & Santagada, A. Attacchi di Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr su differenti ospiti nel Cilento // Monti e Boschi. 1991. Vol. 5. P. 54-58.

96. Turina M., Zhang L., Van Alfen N.K. Effect of Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) infection on Cpkkl, a mitogen-activated protein kinase kinase of the filamentous fungus Cryphonectria parasitica // Fung. Genet Biol. 2006. V. 43. № 11. P. 764-774.

97. Washington W.S., Allen A.D., Dooley L.B. Preliminary studies on Phomopsis castanea and other organisms associated with healthy and rotted chestnut fruit in storage // Australasian Plant Pathology. 1997. Vol. 26. №1. P. 37-43.

98. Zhang L., Baasiri R.A., Van Alfen N.K. Viral repression of fungal pheromone precursor gene expression // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. № 2. P. 953-959.

99. Zhang X., Nuss D.L. A host dicer is required for defective viral RNA production and recombinant virus vector RNA instability for a positive sense RNA virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 43. P. 16749-16754.

100. Zhang X., Segers G.C., Sun Q. et al. Characterization of hypovirus derived small RNAs generated in the chestnut blight fungus by an inducible DCL-2-dependent pathway // J. Virol. 2008. V. 82. № 6. P. 2613-2619.

Информация о работе

Белов, Анатолий Алексеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.08

Диссертация

Внутривидовой полиморфизм фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Внутривидовой полиморфизм фитопатогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы