Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутриклеточные механизмы регуляции NA+,K+-насосом холиночувствительности нейронов виноградной улитки при привыкании

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточные механизмы регуляции NA+,K+-насосом холиночувствительности нейронов виноградной улитки при привыкании"

На правах рукописи

НИСТРАТОВА Виктория Леонидовна

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ NA+,K+-HACOCOM ХОЛИНОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ НЕЙРОНОВ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ ПРИ ПРИВЫКАНИИ

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ ! БьСПЛАГПЫЙ I ЭКЗЕМПЛЯР !

Работа выполнена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук А. С. Пивоваров

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор П. М. Балабан,

кандидат биологических наук Т. А. Палихова

Ведущая организация

Институт нормальной физиологии им. ^^ Анохина РАМН

Защита состоится " 13 " декабря 2004 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 12 ноября 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Уабаин, специфический ингибитор Na+,K+-Hacoca, известен благодаря его влиянию на формирование кратковременной памяти и на приспособительное поведение животных (Robertson et al, 1977; Mark, 1979; Xia, 1997; Gibbs, Andrew, 2003; Zhan et al., 2004). Интерес к этому соединению обусловлен еще и тем, что он, являясь эндогенным веществом (Goto et al, 1992), может выступать в качестве паракринного гормона, секретироваться некоторыми нейронами ЦНС (Blaustein, 1993), оказывать влияние на высвобождение нейромедиаторов (Cousin et al., 1995).

В литературе отсутствуют данные о влиянии уабаина на такие простые формы обучения, как привыкание и сенситизация. Привыкание (габитуация) - особый приспособительный процесс (Шмидт, 1996). У этой простой формы научения есть клеточный аналог, на котором воспроизводятся все основные особенности поведенческого привыкания (Кэндел, 1980). Использование клеточных аналогов обучения позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов научения. При обучении нейрон проявляет пластические свойства - способность к изменению реактивности под влиянием последовательных раздражений (Конорски, 1970) или при ассоциировании с другими факторами (Котляр, 1986).

Одним из механизмов регуляции пластичности электрогенных мембран при обучении является изменение свойств рецепторов с участием систем вторичных посредников (Котляр, Пивоваров, 1989). Здесь особенно важную роль играет Са2+-универсальный вторичный посредник.

Наиболее значительные физиологические эффекты уабаина связаны с его действием на концентрацию внутриклеточного Са2+ (Blaustein, 1993). Показано, что ингибирование Na+,K+-Hacoca уабаином повышает уровень Са2+ в нейронах (Fujino S., Fujino M., 1982; Deitmer et al., 1987; Meyer-Lehnert, 2000). Происходит это благодаря как минимум двум механизмам - активации №+/Са2+-обмена в обратном режиме работы, а также усилению высвобождения Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо (Balduini, Costa, 1990; Condrescu et al., 1995; Saghian et al., 1996; Rakovic et al., 1999). В свою очередь уровень внутриклеточного Са2+ влияет на чувствительность холинорецепторов нейронов. Повышение концентрации свободного Са2+ в диализированных нейронах прудовика и виноградной улитки снижает амплитуду вызванного ацетилхолином (АХ) входящего тока С1--природы (Chemeris et al., 1982; Arvanov et al., 1992). Исследование тормозящего влияния уабаина на соматические

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

«

холинорецепторы нейронов виноградной улитки показало, что оно зависит от концентрации свободного Са2+ (Пивоваров, Богуславский, 2000).

Уабаин модифицирует динамику снижения амплитуды вызванного АХ входящего тока при ритмическом подведении медиатора к соме. Направление эффекта зависит от базальной концентрации внутриклеточного Са2+ (Пивоваров, Богуславский, 2000). Эти данные получены на командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки, на клеточном аналоге привыкания. При участии этих командных нейронов осуществляется оборонительный рефлекс виноградной улитки, включающий втягивание щупалец, закрытие дыхательного отверстия и уход в раковину (Максимова, Балабан, 1983). Это нейроны левого и правого париетальных ганглиев - ЛПаЗ и ППаЗ, обладающие обширным рецептивным полем, все точки которого характеризуются только одним знаком реакции - возбуждением, образованным ВПСП (Балабан, Литвинов, 1977).

В связи с этим представляет интерес выяснить эффект уабаина на привыкание улитки к повторяющимся тактильным раздражителям, сравнение характера этого эффекта с влиянием уабаина на снижение холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания и внутриклеточные механизмы таких эффектов.

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование участия Na+,K+-Hacoca в привыкании виноградной улитки к тактильной стимуляции. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выяснение влияния уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции.

2. Изучение вероятного участия №+/Са2+-обмена в регуляции Na+,K+-HacocoM снижения холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

3. Изучение вероятного участия мобилизованного внутриклеточного кальция в регуляции Na+,K+-HacocoM снижения холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

4. Исследование участия рецепторов инозитолтрифосфата (Щ) и рианодиновых рецепторов Са2+-депо в регуляции Na+,K+-HacocoM снижения холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

Научная новизна работы

Впервые показано влияние уабаина, специфического ингибитора Na+,K+-насоса, на простейшую форму научения - на привыкание улитки к повторяющимся тактильным раздражителям и исследованы внутринейрональные механизмы такого влияния с участием Ка+/Са2+-обмена и мобилизованного Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибитор Na+,K+-Hacoca уабаин модифицирует привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции и холиночувствительность командных нейронов оборонительного поведения на клеточном аналоге привыкания, увеличивая разброс глубины подавления оборонительной реакции улитки при привыкании и глубины подавления вызванного ацетилхолином тока нейронов на клеточном аналоге привыкания.

2. Уабаин регулирует привыкание виноградной улитки к ритмической тактильной стимуляции посредством влияния на Na+/Ca2+-обмен и мобилизацию внутриклеточного депонированного кальция через рецепторы инозитолтрифосфата в командных нейронах оборонительного поведения.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты существенно дополняют современные представления о влиянии Na+,K+-Hacoca на адаптивное поведение животных. Эти сведения могут быть использованы при поиске лекарственных средств, влияющих на обучение.

Апробация диссертации

Апробация результатов представленного диссертационного исследования успешно прошла на 30-м всерос. совещ. по пробл. высш. нервн. деят. посв. 150-летию со дня рожд. И.П.Павлова (С-Пб, 2000); 6th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, Simpler Nervous Systems (September, 2000, Moscow-Puschino); 8-й всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АН Арм.ССР, чл.-корр. АН СССР Х.С.Коштоянца (Москва, 2000); 18-м съезде физиологического общества им. ИХШавлова (Казань, 2001); 4-м съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); научной конференция молодых ученых (Москва, 2002); международных чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР, академика АН АрмССР Э.ААсратяна (Москва, 2003).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ: из них 2 статьи и 7 тезисов докладов.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методики, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и списка использованных сокращений. Работа изложена на 106 страницах, содержит 15 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 116 источников, из них 35 отечественных.

В поведенческой части работы бесконтактно регистрировали интегральную оборонительную реакцию улитки (втягивание щупалец, головы и ноги в раковину, вызываемое раздражением касалкой кожи головы между глазными щупальцами) с помощью оригинального устройства (Москвитин, Пивоваров, 2003). Серия выработки привыкания улитки к тактильной стимуляции включала 10 повторных тактильных раздражений постоянной силы, которые наносили с постоянным межстимульным интервалом, составляющим 20-30 с. (рис. 1). То же тактильное раздражение (стимулы 11-й, 12-й и 13-й) наносили с большим интервалом (10-15 мин) для выявления спонтанного восстановления сниженной оборонительной реакции (рис. 1).

Всего привыкание зарегистрировано у 48 улиток в четырех поведенческих сериях: без фармакологического воздействия (контроль 1, 13 улиток, п=13), после введения физиологического раствора (контроль 2, п=13), после введения уабаина (опыт, п=13), отдельная серия посвящена выявлению растормаживания угашенной оборонительной реакции (п=9). Каждая серия включала два последовательных блока из 12-13 тактильных стимулов. Первый блок стимулов служил контролем ко второму. Второй блок стимулов (в серии 2 и 3) подавали спустя 30-60 мин после первого, после инъекции в висцеральный мешок, соответственно, физиологического раствора (100 мкл) и раствора уабаина (100 мкл, 1 мМ).

Материалы и методы исследования

Рис 1. Пример изменения оборонительной реакции виноградной улитки в процессе привыкания к повторяющимся тактильным раздражителям. Цифры - порядковый номер тактильного раздражителя.

12 3456789 10 11

60 с

В электрофизиологической части работы эксперименты проведены на идентифицированных командных нейронах ЛПа2, ЛПаЗ, ППаЗ и ППа2 оборонительного поведения виноградной улитки на препарате изолированных ганглиев. Для регистрации трансмембранных токов нейронов использовали методику двухэлектродной фиксации потенциала на мембране. Внутриклеточные электроды заполняли 2 М ацетатом калия. Применяли локальную ионофоретическую аппликацию АХ на дорзальную поверхность сомы нейрона. Для оценки изменения проводимости и сопротивления мембраны нейрона измеряли амплитуду тока утечки, вызванного гиперполяризующим смещением фиксируемого потенциала на 10 мВ (рис. 2).

1 2 3 4 6 6 7 « 9 10 11

Рис. 2. Пример изменения вызванного ацетилхолином входящего тока (АХ-тока) нейрона ЛПа2 на клеточном аналоге привыкания. Цифры - порядковый номер аппликации АХ в серии. Перед каждым АХ-током регистрировали ток утечки в ответ на негативное смещение (10 мВ, 5 с) потенциала фиксации (-75 мВ).

В электрофизиологических экспериментах в качестве клеточного аналога привыкания использовали серию из 10 повторных аппликаций одинаковых порций АХ с постоянным интервалом в серии (1.5-4.5 мин; рис. 2) (Пивоваров, Саганелидзе, 1986). После серии подавали 3-4 аппликации АХ с большим временным интервалом (10 мин) для оценки степени восстановления сниженного АХ-тока. Результаты получены на 186 нейронах в 12 экспериментальных схемах, включавших по две серии повторных аппликаций АХ: одну контрольную (до воздействия уабаина) и одну опытную (через 30-60 мин после аппликации уабаина). Экспериментальные схемы отличались фармакологическими воздействиями перед аппликацией уабаина. Схема 1 включала внеклеточное добавление в проточную камеру 100 мкл физиологического раствора (контроль), а схемы 2-12 - внеклеточную аппликацию уабаина (100 мкМ). Во 2-й экспериментальной схеме отсутствовало фармакологическое воздействие перед аппликацией уабаина. Схемы 3-12 включали предварительные воздействия: схема 3 - снижение в 5 раз концентрации внеклеточного Са2+ (до 2 мМ); схема 4 -внеклеточное действие бензамила (специфического ингибитора №+/Са2+-обмена, 15-35 мкМ); схема 5 - внутриклеточную инъекцию циклопиазоновой кислоты

(обратимого ингибитора Са2+-АТРазы саркоплазматического и эндоплазматического ретикулума, 0.1 мМ); схема 6 - внутриклеточную инъекцию тапсигаргина (необратимого ингибитора Са2+-АТРазы саркоплазматического и эндоплазматического ретикулума, 0.1 мМ); схема 7 - внутриклеточную инъекцию 5%-го DMSO (растворитель для циклопиазоновой кислоты и тапсигаргина) (контроль к схемам 5 и 6); схема 8 включала внутриклеточную инъекцию гепарина (ингибитора Щ-рецепторов, 0.1 мМ); схема 9 - внутриклеточную инъекцию Щ (0.1 мМ); схема 10- внутриклеточную инъекцию рианодина (агониста/антагониста рианодиновых рецепторов, 0.1 мМ); схема 11 - внутриклеточную инъекцию рианодина (1.0 мМ); схема 12 - внутриклеточную инъекцию дантролена (антагониста рианодиновых рецепторов, 0.1 мМ). АХ апплицировали с интервалом 10 мин до и после серии ритмической подачи АХ.

Для статистической обработки результатов поведенческих и электрофизиологических экспериментов применяли программы MS EXCEL 97, 2000, STADIA 6.2 и STATISTICA 4.3.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Влияние уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции

В ответ на действие тактильного раздражителя возникала оборонительная реакция. Ритмическая тактильная стимуляция вызывала ослабление оборонительной реакции животного (n=48) на 49.86 ± 1.32% (р=0.0000, критерий Стьюдента; рис. 1). Сниженная оборонительная реакция спонтанно восстанавливалась после перерыва (10-15 мин) в стимуляции (n=48) и составляла 78.89 ± 5.40% (р=0.0000, критерий Стьюдента; рис. 1). Выявлено такое свойство поведенческого привыкания как растормаживание уменьшенной реакции животного на повторяющийся раздражитель. Действие экстрастимула приводило к достоверно большему на 33.02 ± 10.53% (р=0.0087, критерий Стьюдента) увеличению амплитуды оборонительной реакции улитки по сравнению с контролем, в котором действие экстрастимула отсутствовало.

Изменения оборонительной реакции виноградной улитки, вызванные ритмической тактильной стимуляцией, удовлетворяли основным критериям поведенческого привыкания (Pinsker et al., 1970; Кэндел, 1980).

Инъекция уабаина (100 мкл) изменяла привыкание интактной улитки к действию повторяющихся тактильных стимулов по сравнению с контрольными сериями (р<0.001, критерий Фишера; по сравнению с контрольной серией 1; р<0.05, критерий Фишера; по сравнению с контрольной серией 2), достоверно увеличивая выборочную дисперсию, характеризующую разброс глубины подавления

оборонительной реакции улитки. При этом уабаин не изменял средние значения сравниваемых выборок (рис. 3). Между двумя контрольными сериями (1 - без фармакологического вмешательства и 2 - с инъекцией физиологического раствора) не обнаружено достоверных различий (рис. 3, А, Б),

Изменение глубины депрессии оборонительной реакцииулитки, %

Рис 3. Влияние уабаина на глубину подавления

оборонительной реакции улитки в процессе привыкания к

повторяющимся тактильным раздражителям. Представлены суммарные результаты всех

экспериментов. По оси абсцисс - интервалы разниц подавления оборонительных реакций улитки в ответ на 2-10-й стимулы в серии ритмических тактильных стимуляций по сравнению с оборонительной реакцией, возникающей в ответ на 1-й стимул в серии до и после действия уабаина (%); по оси ординат - число улиток, % от общего числа в выборке. А - без фармакологического воздействия (контроль 1), Б- после инъекции

физиологического раствора (контроль 2, 100 мкл), Л-после инъекции уабаина (100 мкМ).

В литературе отсутствуют данные о влиянии уабаина на такие простейшие формы обучения как привыкание. В настоящей работе обнаружено влияние ингибитора Na+,K+-Hacoca уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции, вызывающей оборонительную реакцию.

2. Изменения амплитуд АХ-тока и тока утечки на клеточном аналоге привыкания

На клеточном аналоге привыкания средняя амплитуда АХ-тока в ответ на 5-й стимул в серии ритмических аппликаций АХ в контрольной схеме (аппликация физраствора, п=9) уменьшалась на 52.49 ± 4.56%, а амплитуда 5-го тока утечки достоверно не изменялась: ее снижение составляло 2.60 ± 1.72% по сравнению с 1-й амплитудой токов. Для подсчета коэффициента корреляции между изменениями амплитуд тока утечки и АХ-тока взята схема с внеклеточным действием уабаина, поскольку в этой схеме выборка самая многочисленная (п=25). Коэффициент линейной корреляции Пирсона составлял 0.0311, значимость коэффициента составляла 0.8799 (п=25). Средние амплитуды 5-го АХ-тока и тока утечки составляли 48.94 ± 2.30% и 94.51 ± 3.91% соответственно (п=25). Таким образом, не выявлено корреляции между изменениями амплитуд токов утечки и АХ-токов на клеточном аналоге привыкания.

3. Влияние уабаина на депрессию АХ-тока на клеточном аналоге привыкания

Ингибитор Na+,K+-Hacoca уабаин модифицировал депрессию АХ-тока проанализированных нейронов по сравнению с контрольной серией, когда вместо уабаина в проточную камеру с препаратом ганглиев вводили физиологический раствор (100 мкл), что подтверждает полученный ранее результат (Пивоваров, Богуславский, 2000). Уабаин (100 мкМ) достоверно увеличивал выборочную дисперсию (р<0.001, критерий Фишера), отражающую разброс (рассеяние) величин глубины депрессии АХ-тока в серии повторных аппликаций АХ, не изменяя средние значения сравниваемых выборок (рис. 4, А).

Обнаруженное влияние ингибитора Na+,K+-Hacoca уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции оказалось идентичным эффекту уабаина на холиночувствительность нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Исследуемые нейроны вовлечены в реализацию оборонительного поведения виноградной улитки (Максимова, Балабан, 1983). Поэтому идентичность действия уабаина на поведенческое привыкание и на его клеточный аналог позволяет перенести обнаруженные внутриклеточные механизмы с аналога привыкания на соответствующее поведение животного.

Na+,K+-Hacoc регулирует депрессию холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания, поскольку ингибитор насоса уабаин модифицирует динамику снижения амплитуды АХ-тока при ритмическом подведении медиатора к соме. Направление эффекта зависит от базальной концентрации внутриклеточного Са2+(Пивоваров, Богуславский, 2000).

[-40,-35) [-30;-2S)

Изменение глубины депрессии АХ-тока, %

£40;-35) [-30,-25) [-20;-15) [-10;-5] [0;+5) [10;15) Изменение глубины депрессии АХ-тока,%

Н0;-35) Е-30;-25) [-20;-15) £-10;-5] [0;+6) 1«;15) [2025) Изменение глубины депрессии АХ-тока, %

Изменение глубины депрессии АХ-тока, %

Рис. 4. Влияние уабаина на глубину депрессии АХ-тока нейронов на клеточном аналоге привыкания. Представлены суммарные результаты всех экспериментов. По оси абсцисс - интервалы разниц депрессии АХ-тока в ответ на 2-10 стимулы в серии ритмических аппликаций АХ по сравнению с АХ-током в ответ на 1-й стимул в серии до и после действия уабаина (%); по оси ординат - число нейронов, % от общего числа в выборке. А-Л: незапприхованные столбики - влияние внеклеточной аппликации в камеру уабаина (100 мкМ) без предварительных фармакологических воздействий, заштрихованные столбики - влияние внеклеточной аппликации в камеру физиологического раствора (100 мкл, А), влияние уабаина на фоне пониженной (2мМ) концентрации внеклеточного Са2+ (Б), внеклеточного действия бензамила (15-35 мкМ, 5), внутриклеточных инъекций циклопиазоновой кислоты (0.1 мМ, Г), тапсигаргина (0.1 мМ, Д), DMSO (0.1 мМ, Е), гепарина (0.1 мМ, Ж), ГРз (0.1 мМ, 3), рианодина (0.1 мМ, И), рианодина (1 мМ, К) и дантролена (0.1 мМ, Л).

Физиологическая роль влияния уабаина на увеличение дисперсии глубины подавления амплитуды АХ-тока и оборонительной реакции улитки при привыкании может состоять в повышении тем самым чувствительности системы (нейрона, нервной системы или целого организма) к факторам внешней среды. Это отражается в адаптивном поведении животных.

На разных клетках, в том числе и на командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки, получены данные, свидетельствующие о повышении уабаином концентрации внутриклеточного Са2+ за счет его проникновения из внеклеточной среды (Fujino S., Fujino M., 1982; Deitmer et al., 1987; Meyer-Lehnert et al., 2000; Пивоваров и др., 2001). Повышение уровня Са2+ в нейронах при ингибировании Na+,K+-Hacoca уабаином происходит благодаря, как минимум, двум механизмам - активации №+/Са2+-обмена в обратном режиме работы, а также усилению высвобождения Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо (Balduini, Costa, 1990; Condrescu et al., 1995; Saghian et al., 1996; Rakovic et al., 1999).

Роль мобилизованного из внутриклеточных депо Са2+ во влиянии уабаина на депрессию холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания должны были выявить результаты серий, в которых действие уабаина оценивали на фоне внутриклеточных инъекций ингибиторов Са2+-насоса эндоплазматического ретикулума, закачивающего свободный цитоплазматический Са2+, циклопиазоновой кислоты и тапсигаргина. Оба блокатора должны были опустошить Са2+-депо и поэтому препятствовать влиянию уабаина на концентрацию свободного Са2+ в цитоплазме через его мобилизацию. Циклопиазоновая кислота и тапсигаргин нарушали действие уабаина (рис. 4, Г, Д) (р<0.05 для обоих блокаторов, критерий Фишера), что позволяет считать повышение уабаином внутриклеточной концентрации Са2+ в результате активации мобилизации Са2+ одним из возможных клеточных механизмов модификации уабаином холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания.

Из данных литературы известно, что уабаин может вызывать высвобождение кальция из внутриклеточных Са2+-депо как через 1Р3-рецепторы (Balduini, Costa, 1990; Calvino et al., 2002), так и через рианодиновые рецепторы (Micci, Christensen, 1998; Racovic et al, 1999), повышая концентрацию свободного внутриклеточного Са2+. Оба типа рецепторов внутриклеточных Са2+-депо присутствуют в нейронах виноградной улитки (Kostyuk, Kirischuk, 1993). Для того чтобы выяснить, какой путь мобилизации кальция (1Р3- или рианодин-зависимый) задействуется Na+,K+-HacocoM в регуляции холиночувствительности нейрона на клеточном аналоге привыкания, были проведены серии, в которых действие уабаина оценивалось на фоне внутриклеточных инъекций антагонистов 1Р3- и рианодиновых рецепторов Са2+-депо.

Гепарин, ингибитор 1Р3-рецепторов, и 1Р3, агонист 1Р3-рецепторов, нарушали способность уабаина модифицировать депрессию холиночувствительности нейрона на клеточном аналоге привыкания (рис. 4, Ж, 3) (р<0.05, р<0.01, критерий Фишера, соответственно). Антагонист Щ-рецепторов, гепарин, блокировал Са2+-каналы IРз-рецепторов, и поэтому препятствовал мобилизации Са2+ по этому пути. Спонтанная диффузия агониста Щ-рецепторов 1Р3 из микроэлектродов на протяжении всего эксперимента приводила к мобилизации Са2+ через Щ-рецепторы, повышая уровень свободного Са2+ в клетке. В результате действия уабаина концентрация свободного внутриклеточного Са2+ в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки повышается (Пивоваров и др., 2001). Это повышение концентрации внутриклеточного Са2+ после действия уабаина в сумме с предшествующим в результате действия 1Р3 повышением уровня Са2+ значительно превышает, как мы предполагаем, тот уровень Са2+, при котором активность Са2+-каналов 1Р3-рецепторов максимальна (0.2 мкМ) (Bezpгozvanny et а1., 1991). И, поскольку форма кривой зависимости вероятности открытия каналов 1Р3-рецепторов от цитозольной концентрации Са2+ имеет быстрый подъем и спад (Bezpгozvanny et а1., 1991), то в области предполагаемых концентраций внутриклеточного Са2+ мобилизация Са2+ по 1Р3-пути задействуется слабо. Поэтому 1Рз в использованной нами концентрации действовал, вероятно, как инактиватор Са2+-каналов 1Р3-рецепторов, ослабляя мобилизацию Са2+ через этот путь, препятствовал влиянию уабаина на изменение концентрации свободного Са2+ в цитоплазме. Нарушение эффекта уабаина гепарином и 1Р3 дает основание считать повышение уабаином внутриклеточной концентрации Са2+ в результате активации мобилизации Са2+ через 1Р3-рецепторы одним из клеточных механизмов регуляции уабаином холиночувствительности нейронов улитки при привыкании. Роль 1Р3-рецепторов в эффекте уабаина, выявленная в нашей работе, подтверждается данными, полученными другими авторами о способности эндогенного ингибитора №+,К+-АТФазы, названного эндобаином Е, усиливать фосфоинозитидный гидролиз. Влияния эндобаина и уабаина на аккумуляцию инозитолтрифосфата совпадали (СаМпо et а1., 2002).

Мы предполагали, что антагонисты рианодиновых рецепторов рианодин и дантролен должны были ослабить мобилизацию Са2+ через рианодиновые рецепторы, препятствуя влиянию уабаина на повышение концентрации свободного Са2+ в цитоплазме через его мобилизацию по рианодин-зависимому пути. Рианодин ни при одной из двух испытанных концентраций не влиял на эффект уабаина (рис.Д К) (р>0.05, критерий Клотца; р>0.05, критерий Фишера, соответственно), что не дает нам возможности считать путь рианодин-зависимой мобилизации Са2+

одним из нейронных механизмов регуляции уабаином холиночувствительности нейронов улитки при привыкании. Дантролен препятствовал эффекту уабаина на депрессию холиночувствительности нейрона на клеточном аналоге привыкания (рис. 4, Л) (р<0.05, критерий Фишера). Различия в действии рианодина и дантролена могут быть связаны с тем, что сайты связывания рианодина и дантролена на саркоплазматическом ретикулуме являются фармакологически независимыми, не взаимодействуют между собой и могут находиться на разных молекулах (Palnitkar et al., 1997). Это подтверждают данные, полученные на культуре нейронов мозжечка, где были обнаружены внутриклеточные пулы Са2+, чувствительные к дантролену, но не чувствительные к рианодину (Rosa et al., 1997). Можно предположить, что существует дополнительная «мишень» (не связанная с рианодиновыми рецепторами) для дантролена, участвующая в Са2+-зависимой регуляции Na+,K+-HacocoM привыкания.

Неучастие рианодин-зависимой мобилизации Са2+ в повышении уабаином (100 мкМ) внутриклеточного уровня Са2+ подтверждается в работе Nishio с соавторами (2004): эффект уабаина (100 мкМ) на выбросы Са2+ из саркоплазматического ретикулума был незначительным.

Участие Са2+, высвобождаемого из депо по №з-зависимому пути, и неучастие рианодиновых рецепторов в изменении уабаином уровня Са2+, выявленное в нашей работе, может быть связано с пространственной и функциональной разобщенностью пулов Са2+, ассоциированных с двумя различными путями мобилизации Са2+ (Golovina et al., 1996; Golovina, Blaustein, 2000). Имеются данные, свидетельствующие о существовании ингибитор-резистентных Са2+-насосов (не чувствительных к тапсигаргину и циклопиазоновой кислоте, СРА), которые связаны с кофеин- и рианодин-чувствительными пулами Са2+, но не связаны с Щ-чувствительными депо (Blaustein, Golovina, 2001; Tanaka Y., Tashjian; 1993). СРА- и тапсигаргин-чувствительные Са2+-насосы ассоциированы с Щ-чувствительными компартментами, которые могут мобилизовывать Са2+ независимо от кофеин-чувствительных пулов (Golovina et al., 1996; Golovina, Blaustein, 2000). Использованные в нашей работе ингибиторы Са2+-насоса (тапсигаргин и СРА) отменяли эффект уабаина на изменение холиночувствительности нейронов, что может служить косвенным подтверждением участия Щ-зависимого пути мобилизации Са2+ в эффекте уабаина.

4. Влияние уабаина на стационарную амплитуду АХ-тока и тока утечки

АХ-ток и ток утечки, регистрируемые после аппликации уабаина, но до начала опытной серии названы стационарными. Уабаин (100 мкМ) снижал стационарную амплитуду АХ-тока в среднем на 22.72 ± 0.36 % (число нейронов n= 48) и увеличивал

ток утечки за этот же период в среднем на 52.55 ± 9.02% (п=24) по сравнению с контрольным введением физиологического раствора (100 мкл) в окружающий препарат изолированных ганглиев раствор (рис. 5)

1 2 3 4

80 с

Рис. 5. Влияние уабаина на амплитуду стационарного АХ-тока и тока утечки. Слева направо: 1-й стимул - перед добавлением уабаина, последующие три - через 10,20 и 30 минут после добавления уабаина.

У командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки ингибитор Na+,K+-Hacoca уабаин вызывает метаболические (торможение холинорецепторов) и электрогенные (твышение входной проводимости, снижение входного сопротивления) изменения. Эти результаты подтверждают данные, полученные ранее на нейронах моллюска (Кононенко, 1976; Ayгapetyan, Arvanov, 1988; Айрапетян, 1990; Арванов, 1990; Пивоваров, Дроздова, 1992; Aгvanov et al, 1992; Пивоваров, Богуславский, 2000). Метаболический эффект уабаина проявляется в обратимом снижении СГ-зависимого тока нейронов виноградной улитки, вызванного подведением к соме АХ. Этот эффект уабаина является Са2+-зависимым (Ayгapetyan, Aгvanov, 1988; Арванов, 1990; Пивоваров, Дроздова, 1992; Пивоваров, Богуславский, 2000). Изучаемые эффекты уабаина тесно связаны с изменением цитоплазматического Са2+.

Удалось конкретизировать обнаруженную ранее Са2+-зависимость тормозящего влияния уабаина на соматические холинорецепторы командных нейронов виноградной улитки (Пивоваров, Дроздова, 1992; Пивоваров, Богуславский, 2000). Ослабление необратимым ингибитором Са2+-насоса эндоплазматического ретикулума действия уабаина на стационарный АХ-ток позволяет предположить, что повышение

уабаином уровня свободного Са2+ за счет активации его высвобождения из внутриклеточных Са2+-депо обеспечивает торможение уабаином соматических холинорецепторов. Однако отсутствие влияния агонистов и антагонистов 1Р3- и рианодиновых рецепторов на эффект уабаина на стационарный АХ-ток свидетельствует о том, что 1Р3- и рианодиновые рецепторы не участвуют в снижении уабаином холиночувствительности нейронов улитки. Поэтому остается неизвестным, какие рецепторы Са2+-депо вовлечены в торможение уабаином соматических холинорецепторов нейронов виноградной улитки.

Ослабление роста тока утечки под действием уабаина на фоне пониженного внеклеточного Са2+, а также на фоне действия ингибитора №+/Са2+-обмена бензамила свидетельствуют об участии №+/Са2+-обмена в снижении уабаином входного сопротивления нейрона. Отсутствие влияния циклопиазоновой кислоты, инозитолтрифосфата, дантролена и рианодина на рост тока утечки под действием уабаина позволяет сделать вывод о неучастии мобилизованного Са2+ в электрогенном эффекте уабаина.

5. Корреляция между изменениями стационарных АХ-тока и тока утечки после действия уабаина

Не выявлено корреляции изменения стационарной амплитуды АХ-тока и стационарной амплитуды тока утечки через 30 мин после введения в камеру физиологического раствора (п=9), а также уабаина (изолированное действие, «=24) и на фоне фармакологических воздействий.

Отсутствие корреляции между изменениями амплитуд стационарных тока утечки и АХ-тока, а также этих токов в фазе плато клеточного аналога привыкания позволяет исключить изменение входного сопротивления нейрона как причину снижения уабаином стационарной холиночувствительности и ее модификации на клеточном аналоге привыкания.

Таким образом, влияние уабаина на поведенческое привыкание виноградной улитки к повторяющимся тактильным раздражителям оказалось идентичным эффекту уабаина на депрессию АХ-тока на клеточном аналоге привыкания. Са2+-зависимая модификация ингибитором Ка+,К+-Ыасоса уабаином глубины депрессии холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания реализуется с участием двух исследованных систем гомеостаза Са2+ - Ка+/Са2+-обмена и Са2+, мобилизованного из внутриклеточных Са2+-депо. В механизме регуляции №+,К+-ЫасосоМ привыкания виноградной улитки участвует Са2+, мобилизованный из внутриклеточных депо через рецепторы 1Р3. Са2+, мобилизованный из внутриклеточных депо через

рианодиновые рецепторы, скорее всего, не участвует в регуляции Na+,K+-HacocoM привыкания виноградной улитки. Возможно, подобные клеточные механизмы влияния уабаина на привыкание виноградной улитки участвуют в изменении синаптической предачи, лежащем в основе известной регуляции Na+,K+-HacocoM адаптивного поведения животных (Gibbs, Barnet, 1976; Mizumori et al., 1987; Xia et al., 1997; Gibbs, Andrew, 2003; Zhan et al., 2004).

Выводы

1. Ингибитор Na+,K+-Hacoca уабаин модифицирует привыкание виноградной улитки к ритмической тактильной стимуляции и холиночувствительностъ командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания сходным образом, увеличивая выборочную дисперсию глубины подавления оборонительной реакции улитки и амплитуды вызванного ацетилхолином тока нейронов на клеточном аналоге привыкания.

2. Na+,K+-Hacoc регулирует привыкание виноградной улитки к ритмической тактильной стимуляции посредством влияния на Ка+/Са2+-обмен и мобилизацию внутриклеточного депонированного кальция в командных нейронах оборонительного поведения.

3. В механизме регуляции Na+,K+-HacocoM привыкания виноградной улитки участвует кальций, мобилизованный из внутриклеточных депо через рецепторы инозитолтрифосфата. Регуляция Na+,K+-HacocoM привыкания виноградной улитки не связана с рианодин-зависимой мобилизацией кальция.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пивоваров А.С., Нистратова В.Л. Участие №+/Са2+-обмена в регуляции №+,К+-насосом депрессии холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания// XXX Всерос. совещ. по пробл. высш. нервн. деят. поев. 150-летию со дня рожд. И.П.Павлова [С-Пб,15-18 мая 2000] Тез. докл. Том 1,С-Пб, 2000, с. 187-188.

2. Nistratova V.L., Pivovarov A.S. Na+,K+-pump regulates cholinosensitivity in Helix lucorum neurones via Na+/Ca2+-exchange and mobilized calcium// VI East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology. Abstracts. Простые нервные системы. Simpler Nervous Systems. [September 22-25, 2000, Moscow-Puschino, Russia]. Moscow, 2000,89.

3. Пивоваров А.С., Нистратова В.Л. Кя+/Ся2+-обмен в регуляции Ка+,К+-насосом снижения холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания// Физиология нейротрансмиттеров. Тез. докл. VIII Всерос. конфер., посв. 100-летию со дня рожд. акад АН Арм.ССР, чл.-корр. АН СССР Х.С.Коштоянца [М., 25-27 окт 2000]. М., 2000,67.

4. Дроздова Е.И., Нистратова В.Л., Богуславский Д.В., Пивоваров А.С. Регуляция Na+,K+-HacocoM холиночувствительности нейронов на клеточных аналогах обучения// XVIII Съезд физиол. об-ва им. И.П.Павлова [Казань, 24-28 сен 2001], Тезисы докладов, Казань, 2001, С. 80.

5. Пивоваров А.С, Нистратова В.Л., Богуславский Д.В. Участие Ка+/Са2+-обмена и внутриклеточного мобилизованного Са2+ в регуляции №+К+-насосом депрессии холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания// Журн. высш. нервн. деят. 2001. Т. 51. Na 6. С. 723-732 (Neurosci. Behav. Physiol. 2003. Vol. 33. No. 2. P. 113-121).

6. Нистратова В.Л., Пивоваров А.С. Роль рецепторов внутриклеточных Са2+-депо в регуляции Na+,K+-HacocoM привыкания виноградной улитки к тактильной стимуляции// 4 Съезд физиологов Сибири. Тезисы докладов, Новосибирск, 2002, С. 204.

7. Нистратова В.Л., Пивоваров А.С. Механизмы регуляции Na+,K+-HacocoM холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге обучения. Научная конференция молодых ученых (Институт ВНД РАН, МГУ им. М.В.Ломоносова 9-10 октября 2002). Москва, 2002, С. 22-23.

8. Нистратова В.Л., Пивоваров А.С. Роль рецепторов внутриклеточных Са2+-депо в регуляции №+,К+-насосом холиночувствительности нейронов виноградной улитки при привыкании// Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга. Материалы Международных чтений, поев. 100-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР, академика АН АрмССР Э.А.Асратяна. Изд-во Макс-Пресс, 2003, С. 167-168.

9. Нистратова В.Л., Пивоваров А.С. Рецепторы инозитолтрифосфата и рианодиновые рецепторы в регуляции Na+,K+-HacocoM холиночувствительности нейронов виноградной улитки при привыкании // Журн. высш. нервн. деят. 2004. Т. 54. Na 3. С. 430-440.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 02.11.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усллеч.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 1103. Тел. 939-3890, 939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова. 2-й учебный корпус, 627 к.

w ? rt Q 77 fc

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нистратова, Виктория Леонидовна

1. Введение.

1.1. Актуальность исследования.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Положения, выносимые на защиту.

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы.

1.6. Апробация диссертации.

1.7. Структура и объем работы.

2. Обзор литературы.

2.1. Иа,К-насос в клетке.

2.1.1. Строение и функционирование Ыа,К-насоса.

2.1.2. Воздействие №,К-насоса на мембранный потенциал и объем клетки.

2.1.3. Насос-вызванное изменение внутриклеточного ионного состава.

2.1.4. ИаД-насос и холиночувствительность нейронов.

2.1.5. Уабаин как гормон.

2.2. Роль Ыа,К-насоса в обучении.

2.3. Привыкание как простая форма обучения.

2.4. Изучение пластичности нейрона на клеточном аналоге привыкания.

2.4.1. Снижение холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

2.4.2. Регуляция холинорецепторов нейронов виноградной улитки внутриклеточным Са2+.

2.4.3. Роль вторичных посредников и №,К-насоса в изменении холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

2.5. Пути гомеостаза внутриклеточного Са2+.

2.5.1. Плазматические электроуправляемые Са2+ -каналы.

2.5.2. Внутриклеточные депо Са2+.

2.5.3. Са2+-связывающие белки.

2.5.4. Ыа+/Са2+-обмен.

3. Методика.

3.1. Поведенческая часть.

3.2. Электрофизиологическая часть.

3.3. Статистические методы.

4. Результаты.

4.1. Влияние уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции

4.2. Изменения амплитуд АХ-тока и тока утечки на клеточном аналоге привыкания

4.3. Влияние уабаина на депрессию АХ-тока на клеточном аналоге привыкания.

4.4. Влияние уабаина на стационарную амплитуду АХ-тока и тока утечки.

4.5. Корреляция между изменениями стационарных АХ-тока и тока утечки после действия уабаина.

5. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутриклеточные механизмы регуляции NA+,K+-насосом холиночувствительности нейронов виноградной улитки при привыкании"

Уабаин, специфический ингибитор Na+,K+-Hacoca, известен благодаря его влиянию на формирование кратковременной памяти и на приспособительное поведение животных (Robertson et al, 1977; Mark, 1979; Xia, 1997; Gibbs, Andrew, 2003; Zhan et al., 2004). Интерес к этому соединению обусловлен еще и тем, что он, являясь эндогенным веществом (Goto et al, 1992), может выступать в качестве паракринного гормона, секретироваться некоторыми нейронами ЦНС (Blaustein, 1993), оказывать влияние на высвобождение нейромедиаторов (Cousin et al., 1995).

В литературе отсутствуют данные о влиянии уабаина на такие простые формы обучения, как привыкание и сенситизация, хотя изучение механизмов самой простой и, вероятно, самой распространенной формы научения у человека и животных, такой как привыкание, является необходимым для понимания тонких механизмов более сложных форм обучения. Привыкание (габитуация) - особый приспособительный процесс (Шмидт, 1996). У этой простейшей формы научения есть клеточный аналог, на котором воспроизводятся все основные особенности поведенческого привыкания (Кэндел, 1980). Использование клеточных аналогов обучения позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов научения. При обучении нейрон проявляет пластические свойства - способность к изменению реактивности под влиянием последовательных раздражений (Конорски, 1970) или при ассоциировании с другими факторами (Котляр, 1986).

Одним из механизмов регуляции пластичности электрогенных мембран при обучении является изменение свойств рецепторов с участием систем вторичных посредников (Kotlyar, Pivovarov, 1990). Здесь особенно важную роль играет Са2+ - универсальный вторичный посредник.

Наиболее значительные физиологические эффекты уабаина связаны

У Ас его действием на концентрацию внутриклеточного Са (Blaustein, 1993).

Показано, что ингибирование Na+,K+-Hacoca уабаином повышает уровень

Са2+ в нейронах (Fujino S., Fujino M., 1982; Deitmer et al., 1987; Meyer

Lehnert, 2000). Происходит это благодаря как минимум двум механизмам 2+ активации Na /Са -обмена в обратном режиме работы, а также усилению высвобождения Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо (Balduini, Costa, 1990; Condrescu et al., 1995; Saghian et al., 1996; Rakovic et al., 1999). В свою очередь, уровень внутриклеточного Са2+ влияет на чувствительность

2+ холинорецепторов нейронов. Повышение концентрации свободного Са в диализированных нейронах прудовика и виноградной улитки снижает амплитуду вызванного ацетилхолином (АХ) входящего тока СГ-природы (Chemeris et al., 1982; Arvanov et al., 1992). Исследование тормозящего влияния уабаина на соматические холинорецепторы нейронов виноградной улитки показало, что оно зависит от концентрации свободного Са (Пивоваров, Богуславский, 2000).

Уабаин модифицирует динамику снижения амплитуды вызванного АХ входящего тока при ритмическом подведении медиатора к соме. Направление эффекта зависит от базальной концентрации внутриклеточного Са2+ (Пивоваров, Богуславский, 2000). Эти данные получены на командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки, на клеточном аналоге привыкания. При участии этих командных нейронов осуществляется оборонительный рефлекс виноградной улитки, включающий втягивание щупалец, закрытие дыхательного отверстия и уход в раковину (Максимова, Балабан, 1983). Это нейроны левого и правого париетальных ганглиев - ЛПаЗ и ППаЗ, обладающие обширным рецептивным полем, все точки которого характеризуются только одним знаком реакции - возбуждением, образованным ВПСП (Балабан, Литвинов, 1977).

В связи с этим представляет интерес выяснить эффект уабаина на привыкание улитки к повторяющимся тактильным раздражителям, сравнение характера этого эффекта с влиянием уабаина на снижение холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания и внутриклеточные механизмы таких эффектов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Нистратова, Виктория Леонидовна

Выводы

1. Ингибитор Ка+,К+-насоса уабаин модифицирует привыкание виноградной улитки к ритмической тактильной стимуляции и холиночувствительность командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания сходным образом, увеличивая выборочную дисперсию глубины подавления оборонительной реакции улитки и амплитуды вызванного ацетилхолином тока нейронов на клеточном аналоге привыкания.

2. Ыа+,К+-насос регулирует привыкание виноградной улитки к 2+ ритмической тактильной стимуляции посредством влияния на Ыа /Са -обмен и мобилизацию внутриклеточного депонированного кальция в командных нейронах оборонительного поведения.

3. В механизме регуляции Ка+,К+-насосом привыкания виноградной улитки участвует кальций, мобилизованный из внутриклеточных депо через рецепторы инозитолтрифосфата.

4. Регуляция Ма+,К+-насосом привыкания виноградной улитки не связана с рианодин-зависимой мобилизацией кальция.

Заключение

Влияние уабаина на поведенческое привыкание виноградной улитки к повторяющимся тактильным раздражителям оказалось идентичным эффекту уабаина на депрессию АХ-тока на клеточном аналоге привыкания. Обнаруженная ранее Са -зависимая модификация ингибитором Na+,K+-Hacoca уабаином глубины депрессии холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания (Пивоваров, Богуславский, 2000) реализуется с участием двух

I | ^ 11 ^ | [ исследованных систем гомеостаза Са - Na /Са -обмена и Са ,

О Амобилизованного из внутриклеточных Са -депо. Как показано в нашей работе, в механизме регуляции Na+,K+-HacocoM привыкания виноградной улитки участвует Са2+, мобилизованный из внутриклеточных депо через рецепторы 1Р3. Са2+, мобилизованный из внутриклеточных депо через рианодиновые рецепторы, скорее всего, не участвует в регуляции Ыа+,К+-насосом привыкания виноградной улитки. Возможно, подобные клеточные механизмы влияния уабаина на привыкание виноградной улитки участвуют в изменении синаптической предачи, лежащем в основе известной регуляции Na+,K+-HacocoM адаптивного поведения животных (Gibbs, Barnet, 1976; Mizumori et al., 1987; Xia et al., 1997; Gibbs, Andrew, 2003; Zhan et al., 2004).

Обнаружено участие Ыа+/Са2+-обмена в снижении ингибитором Ыа+,К+-насоса уабаином входного сопротивления нейронов виноградной улитки. Снижение стационарной холиночувствительности нейронов под действием уабаина не связано с уменьшением входного сопротивления нейронов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нистратова, Виктория Леонидовна, Москва

1. Айрапетян С.Н. Новая теория метаболической регуляции функциональной активности мембраны. // Метаболическая регуляция функций мембраны. Ереван: Изд-во АН Арм. ССР, 1990, с.9-33.

2. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994.

3. Антипенко А.Е. Постсинаптическая трансформация сигнала. Вторичные посредники. G-белки и протеинкиназы нервной ткани // Нейрохимия / Под ред. Ашмарина И.П. 1996.

4. Арванов B.JI. Метаболическая регуляция хеморецепторных свойств мембраны. // Метаболическая регуляция функций мембраны. Ереван, Изд-во АН Арм. ССР, 1990, с. 214-219.

5. Балабан П.М., Литвинов Е.Г. Командные нейроны в дуге безусловного рефлекса виноградной улитки // Журн. высш. нервн. деят. 1977. Т. 27. С.538-544.

6. Вольский Г.Г., Ещенко Н.Д., Каразеева Е.П. Белки нервной системы // Нейрохимия / Под ред. Ашмарина И.П. 1996.

7. Греченко Т. Н. Нейрофизиологические механизмы памяти. М.: Наука, 1979.

8. Дудель И. Основы клеточной физиологии // Физиология человека / Под ред. Шмидта Р. и Тевса Г. в 3-х томах. Перевод с английского под ред. акад. Костюка П.Г. М., Мир., 1996.

9. Дьюсбери Д. Поведение животных, М., 1981.

10. Иерусалимский В.Н., Захаров И.С., Палихова Т.А., Балабан П.М. Нервная система и картирование нейронов брюхоногого моллюска Helix lucorum L. // Журн. высш. нервн. деят. 1992. Т. 42. № 6. С. 1075-1089.

11. Козловский В.Jl. Регуляция кальциевого гомеостаза в нервных клетках \ // Успехи физиологических наук. 1995. Т. 26. № 3. С. 14-24.

12. Кононенко Н.И. Электрогенный натриевый насос в нервных клетках // Молекулярная биология. Выпуск 13. Биологические мембраны. Киев, Наукова Думка, 1976, с.3-15.

13. Конорски Ю. Интегративная деятельность мозга. М.: Мир, 1970.

14. Костюк П.Г. Исследования механизмов гомеостаза Са2+ в нервных клетках и их нарушений при патологии мозга // Рос. Физиол. Ж. им. И.М. Сеченова. 1997. Т. 83. № 5-6. С. 2-18.

15. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. М., Наука, 1986.

16. Котляр Б.И. Нейробиологические основы обучения. М.: Наука, 1989.

17. Котляр Б.И. Пластичность нервной системы. М.: МГУ, 1986.

18. Кэндел Э. Клеточные основы поведения. М., Мир, 1980.

19. Максимова O.A., Балабан П.М. Нейронные механизмы пластичности поведения. М. Наука. 1983.

20. Москвитин A.A., Пивоваров A.C. Установка для регистрации оборонительной реакции наземной улитки на тактильную стимуляцию // Журн. высш. нерв. деят. 2003. Т. 53. № 2. С. 245-248.

21. Пивоваров A.C. Холинорецепторы нейронов виноградной улитки: идентификация, пластичность и ее регуляция опиоидами и вторичными посредниками // Журн. высш. нервн. деят. 1992. Т. 42. № 6. С. 12711286.

22. Пивоваров A.C., Богуславский Д.В. Na,K-Hacoc регулирует снижение холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания: роль внутриклеточного кальция // Журн. высш. нерв. деят. 2000. Т. 50. № 1. С. 855-866.

23. Пивоваров A.C., Дроздова Е.И. Са-зависимая регуляция Na,K-HacocoM посттетанической сенситизации внесинаптических холинорецепторовнейронов виноградной улитки // Журн. высш. нерв. деят. 2001. Т. 51. №3. С. 348-54.

24. Пивоваров A.C., Дроздова Е.И. Идентификация холинорецепторов на соме нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки // Нейрофизиология. 1992. Т. 24, № 1.С. 77-86.

25. Пивоваров A.C., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Вторичные посредники в регуляции пластичности нервной клетки при обучении // Биологические науки. 1989. № 3. С. 75-101.

26. Пивоваров A.C., Дроздова E.H., Котляр Б.И. Изучение роли циклического 3',5'-аденозинмонофосфата в угашении реакций идентифицированных нейронов виноградной улитки на ацетилхолин // Биологические науки. 1988. № 11. С. 54-61.

27. Пивоваров A.C., Саганелидзе Г.Н. Модуляция ионами кальция кратковременной пластичности холинорецептивной мембраны нейронов моллюска// Журн. высш. нерв. деят. 1986. Т. 36. № 5. С. 947955.

28. Скок В.И., Селянко A.A., Деркач В.А. Нейрональные холинорецепторы. М.: Наука, 1987.

29. О.Соколов E.H. Нейронные механизмы памяти и обучения. М.: Наука, 1981.31 .Сулейманян М.А. Авторегуляция электрогенного транспорта Na+ через мембрану // Метаболическая регуляция функций мембраны. Ереван: Изд-во АН Арм. ССР, 1990, с.99-110.

30. Титов С.А. Нейрохимические основы памяти // Нейрохимия / Под ред. АшмаринаИ.П. 1996.

31. Умарова Ф.Т., Белоногова О.В., Лихтенштейн Г.И. Влияние сердечных гликозидов на внутримолекулярную динамику Na/K-АТРазы // Биологические мембраны. 1995. Т. 12. № 1. С. 39-40.

32. Хухо Ф. Нейрохимия: Основы и принципы. Пер. с англ. М. Мир, 1990.

33. Шмидт Р. Физиология человека. Перевод с английского под ред. акад. Костюка П.Г. М., Мир., 1996.

34. Arvanov V.L., Stepanyan A.S., Ayrapetyan S.N. The effect of cAMP, Ca2+, and phorbol esters on ouabain-induced depression of acetylcholine responses in Helix neurons// Cell. Mol. Neurobiol. 1992. V. 12. N 2. P. 153-161.

35. Ayrapetyan S.N., Arvanov V.L. The metabolic regulation of membrane cholinosensitivity// Neurobiology of Invertebrates. Sympos. Biol. V. 36/ Ed. Shalanki J. Hungary, Tihany, 1988. P. 669-684.

36. Balduini W., Costa L.G. Characterization of ouabain-induced phosphoinositide hydrolysis in brain slices of the neonatal rat// Neurochem. Res. 1990. V. 15. N 10. P. 1023-1029.

37. Bastianelli E. Distribution of calcium-binding proneins in the cerebellum// Cerebellum. 2003. V. 2. N 4. P. 242-262.

38. Berridge M.J Inositol trisphosphate and calcium signaling // Nature. 1993. V. 361. P. 315-325.

39. Berridge M.J. Calcium: a universal second messenger // Triangle. 1985. V. 24. P. 79-90.

40. Berridge M.J. Neuronal calcium signaling// Neuron. 1998. V. 21. N 1. P. 1326.

41. Berridge M.J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signalling organelle// Cell Cal. 2002. V. 32. N. 5-6. P. 235-249.

42. Bezprozvanny I., Watras J., Ehrlich B.E. Bell-shaped calcium-response curves of Ins(l,4,5)P3- and calcium-gated channels from endoplasmic reticulum of cerebellum// Nature. 1991. V. 351. N 6329. P. 751-754.

43. Blaustein M.P. Physiological effects of endogenous ouabain: control of intracellular Ca2+ stores and cell responsiveness// Am. J. Physiol. 1993. V. 264. N 6 Pt l.P. 1367-1387.

44. Blaustein M.P., Golovina V.A. Structural complexity and functional diversity of endoplasmic reticulum Ca2+ stores// TRENDS in Neurosci. 2001. V. 24. N10. P. 602-608.

45. Bootman M.D., Berridge M.I. The elementary principles of calcium signalling // Cell. 1995. V. 83. P. 675-678.

46. Calvo S., Gonzales-Garsia C., Cena V. Axoplasmic transport of 3H. ouabain binding sites and catecholamine secretion from an adrenergic nerve trunk // J. Mol. Pharmacol. 1992. V. 42. P. 141-146.

47. Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis // Ann. Rev. Biochem. 1987. V. 56. P. 395-435.

48. Chemeris N.K., Kazachenko V.N., Kislov A.N., Kurchikov A.A. Inhibition of acetylcholine responses by intracellular calcium in Lymnaea stagnalis neurons// J. Physiol. (Engl.). 1982. V. 323. P. 1-19.

49. Christoffersen G.R.J. Steady-state contribution of the Na,K-pump to the membrane potential in identified neurons of a terrestrial snail, Helix pomatia //Acta Physiol. Scand. 1972. V. 86. P. 498-514.

50. Condrescu M., Gardner J.P., Chernaya G. et al. ATP-dependent regulation of sodium-calcium exchange in Chinese hamster ovary cells transfected withthe bovine cardiac sodium- calcium exchanger// J.Biol.Chem. 1995. V. 270. № 16. P. 9137-9146.

51. Cousin M.A., Nicholls D.G., Pocock J. M. Modulation of ion gradients and glutamate release in cultured cerebellar granule cells by ouabain// J. Neurochem. 1995. V. 64. P. 2097-2104.

52. Daut J. The living cell as an energy-transducing machine. A minimal model of myocardial metabolism // Biochem. Biophys. Acta. 1987. V. 895. P. 41-62.

53. Deitmer J.W., Eckert R., Schlue W.R. Changes in the intracellular free calcium concentration of Aplysia and leech neurones measured with calcium-sensitive microelectrodes// Canad. J. Physiol, and Pharmacol. 1987. V. 65. № 5. P. 934-939.

54. Demaurex N., Lew D.P., Krause K.-H. Cyclopiazonic acid depletes intracellular Ca2+ stores and activates an influx pathway for divalent cations in HL-60 cells // J. Biol. Chem. 1992. Y. 267. P. 2318-2324.

55. DiPolo R., Beauge L. Reverse Na+/Ca2+ exchange requires internal Ca and / or ATP in squid axons. Biochem. Biophys. Acta. 1986. V.854. P. 298-306.

56. DiPolo R., Berberian G., Delgado D., Rojas H., Beauge L. A novel 13 kDa cytoplasmic soluble protein is required for the nucleotide (MgATP) modulation of the Na+/Ca2+-exchange in squid nerve fibres // FEBS Lett. 1997. V. 401. No l.P. 6-10.

57. Fierro L., DiPolo R., Liano I. Intracellular calcium clearance in Purkinje cell somata from rat cerebellular slices // J. Physiol. 1998. V. 510. P. 499-512.

58. Fujino S., Fujino M. Ouabain potentiation and Ca release from sarcoplasmic reticulum in cardiac and skeletal muscle cells// Canad. J. Physiol, and Pharmacol. 1982. V. 60. № 4. P. 542-555.

59. Furman I., Rahamimoff H. The expression of rat brain synaptic plasma membrane Na+/Ca2+-exchange activity in Xenopus oocytes // Brain Res. 1990. V. 532. P. 41-46.

60. Garaschuk O., Yaari Y., Konnerth A. Release and sequestration of calcium by ryanodine-sensitive stores in rat hippocampal neurones // J. Physiol. (London). 1997. V. 502. P. 13-30.

61. Gibbs M.E., Andrew R.J., Ng K.T. Hemispheric lateralization of memory stages for discriminated avoidance learning in the chick// Behav. Brain Res. 2003. V. 139. N 1-2. P. 157-165.

62. Gibbs M.E., Barnett J.M. Drug effects on successive discrimination learning in young chickens// Brain Res. Bull. 1976. V. 1. № 3. P. 295-299.

63. Golovina V.A., Bambrick L.L., Yarowsky P.J., Krueger B.K., Blaustein M.P. Modulation of two functionally distinct Ca2+ stores in astrocytes: role of the plasmalemmal Na+/Ca2+ exchanger// Glia. 1996. V. 16. N 4. P. 296305.

64. Golovina V.A., Blaustein M.P. Unloading and refilling of two classes of spatially resolved endoplasmic reticulum Ca2+ stores in astrocytes// Glia. 2000. V. 31. N l.P. 15-28.

65. Goto A., Yamada K., Yagi N., Yoshioka M., Sugimoto T. Physiology and pharmacology of endogenous digitalis-like factors// Pharmacol. Rev. 1992. V.44. P. 377-399.

66. Hasselbach W. The Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticulum in skeletal and cardiac muscle// Ann. N. Y. Acad. Sci. 1998. V. 853. P. 1-8.

67. Juhaszova M., Blaustein M.P. Na+ pump low and high ouabain affinity alpha subunit isoforms are differenty distributed in cells // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1997. V. 94. P. 1800-1805.

68. Kaczorowski GJ, Barros F, Dethmers JK and Trumble MJ. Inhibition of Na+/Ca2+-exchange in pituitary plasma membrane vesicles by analogues of amiloride. J. Biochemistry. 1985. V. 24. P. 1394-1403.

69. Kleyman T.R. and Cragoe E.J. Amiloride and its analogs as tools in the study of ion transport. J. Membrane biol. 1988. V. 105. P .1-21.

70. Kostyuk P., Verkhratsky A. Calcium stores in neurons and glia // Neuroscience. 1994. V. 63. P. 381-404.

71. Kostyuk P.G., Kirischuk S.I. Spatial heterogeneity of caffeine- and inositol 1,4,5-trisphosphate-induced Ca2+ transients in isolated snail neurons// Neurosci. 1993. V. 53. N 4. P. 943-947.

72. Kotlyar B.I., Pivovarov A.S. Molecular mechanisms of neuronal plasticity during learning: the role of secondary messengers// Neurosci Behav. Physiol. 1990. V. 20. N2. P. 118-135.

73. Lahue R., Kokkinidis L., Corning W. Telson reflex habituation in Limulus polyphemus// J. Comp. Physiol. Psychol. 1975. V. 89. N 9. P. 1061-1069.

74. Mark R. Sequential biochemical steps in memory formation: evidence from the use of metabolic inhibitors // Brazier M.A., ed. Brain mechanisms in memory and learning. N.Y.: Raven Press. 1979. V. 4. P. 217-225.

75. Mark R.J., Hensley K., Butterfield D.A., Mattson M.P. Amyloid beta-peptide impairs ion-motive ATPase activities: evidence for a role in loss of neuronal Ca2+ homeostasis and cell death // J. Neurosci 1995. V. 15. P. 6239-6249.

76. McPherson P.S., Kim Y-K., Valdivia H., Knudson C.M., Takemura H., Franzini-Armstrong C., Coronado R., Campbell K.P. // The brain ryanodine receptor: a caffeine-sensitive calcium release channel. 1991. Neuron. V. 7. P. 17-25.

77. Micci M.A., Christensen B.N. Na+/Ca2+ exchange in catfish retina horizontal cells: regulation of intracellular Ca2+ store function// Am. J. Physiol. 1998. V. 274. N 6 Pt 1. P. 1625-1633.

78. Miller R.J. Multiple calcium channels and neuronal function // Science, v 1990. V. 235. P. 46-52.

79. Mizumori S.J., Sakai D.H., Rosenzveig M.R. et al. Investigations into the neuropharmacological basis of temporal stages of memory formation in mice trained in an active avoidance task// Behav. Brain Res. 1987. V. 23. № 3. P. 239-250.

80. Mulkey R.M., Zucker R.S. Posttetanic potentiation at the crayfish neuromuscular junction is dependent on both intracellular calcium and sodium ion accumulation // J. Neurosci 1992. V. 12. P. 5327-4336.

81. Nishio M., Ruch S.W., Kelly J.E., Aistrup G.L., Sheehan. K, Wasserstrom J.A. Ouabain increases sarcoplasmic reticulum calcium release in cardiac myocytes// J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004. V. 308. N 3. P. 1181-1190.

82. Orkand R.K., Thomas R.C. Effects of low doses of caffeine on Ca2+ .i in voltage-clamped snail (Helix aspersa) neurones // J. Physiol. (London). 1995. V. 489. P. 19-28.

83. Pinsker H., Kupfermann I., Castellucci V., Kandel E. Habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia// Science. 1970. V. 167. N926. P. 1740-1742.

84. Pivovarov A. Regulation of neuron cholinoreceptor plasticity of Helix lucorum by second messengers and opioids// J. Comp. Biochem. Physiol. 1995. V. 110. N 3. P. 229-240.

85. Rakovic S., Cui Y., lino S., Galione A. et al. An antagonist of cADP-ribose inhibits arrhythmogenic oscillations of intracellular Ca2+ in heart cells// J. Biol. Chem. 1999. V. 274. N 253. P. 17820-17827.

86. Rizzuto. R. Intracellular Ca2+ pools in neuronal signaling// Curr. Opin. in Neurobiol. 2001. V. 11. N3. P. 306-311.

87. Rizzuto. R. Calcium mobilization from mitichondria in synaptic transmitter release// J. Cell Biol. 2003. V. 163. N 3. P. 441-443.

88. Robertson S., Gibbs M.E., NG K.T. Sodium pump activity, amino acid ' transport and long-term memory// Brain Research. Bulletin. 1977. V. 3. P. 53-58.

89. Rodriguez de Lores Arnaiz G, Reines A., Herbin T., Pena C. Na+,K+-ATPase interaction with a brain endogenous inhibitor (endobain E)// Neurochem. Int. 1998. V. 33. N 5. P. 425-433.

90. Rosa R., Sanfeliu C., Rodriguez-Farre E., Frandsen A., Schousboe A., Sunol C. Properties of ryanodine receptors in cultured cerebellar granule neurons: effects of hexachlorocyclohexane isomers and calcium// J. Neurosci. Res. 1997. V. 47. N l.P. 27-33.

91. Rousseau E., Meissner G. Single cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-release channel: activation by caffeine // Am. J. Physiol. 1989. V. 256. P. H328-H333.

92. Rusch A., Kros C.J., Richardson G.P. Block by amiloride and its derivatives of mechanoelectrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. J. Physiology (London). 1994. V. 474 No.l. P. 75-86.

93. Saghian A.A., Ayrapetyan S.N., Carpenter D.O. Low concentrations of ouabain stimulate Na+/Ca2+ exchange in neurons// Cell. Mol. Neurobiol. 1996. V. 16. N4. P. 489-498.

94. Sakamoto K, Yamazaki J, Nagao T. 5-hydroxydecanoate selectively reduces the initial increase in extracellular K+ in ischemic guinea-pig heart// Eur. J. Pharmacol. 1998. V. 348. N 1. P. 31-35.

95. Schlue W.R. Effects of ouabain on intracellular ion activities of sensory neurons of the leech central nervous system // J. Neurophysiol. 1991. V. 65. P. 736-746.

96. Seidler N.W., Jona I., Vegh M., Martonosi A. Cyclopiazonic acid is a specific inhibitor of the Ca2+ -ATPase of sarcoplasmic reticulum // Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 17816-17823.

97. Smith J.S., Imagawa T., Ma J., Fill M., Campbell K.P., Coronado R., // J. Gen. Physiol. 1988. V. 92. P. 1-26.

98. Tanaka E., Yamamoto S., Kudo Y., Mihara S., Higashi H. Mechanisms underlying the rapid depolarization produced by deprivation of oxygen and glucose in rat hippocampal CA1 neurons in vitro // J. Neurosci. 1997. V. 78. P. 891-902.

99. Thomas R.C. Electrogenic sodium pump in nerve and muscle cells // v Physiol. Rev. 1972. V. 52. P. 563-594.

100. Thomas R.C. Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail '/ neurones // J. Physiol. 1972. V. 220. P. 55-71.

101. Thompson R.F., Spenser W.A. Habituation: a model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior // Psychol. Rev. 1966. V. 73. P. 16- V 43.

102. Trimmer J.S., Rhodes K.J. Localization of voltage-gated ion channels in mammalian brain// Ann. Rev. Physiol. 2004. V.66. P.477-519.

103. Verkhratsky A. The endoplasmic reticulum and neuronal calcium signaling// Cell Cal. 2002. V. 32. N 5-6. P. 393- 404.

104. Verkhratsky A., Toescu E.C. Endoplasmic reticulum Ca2+ homeostasis and neuronal death// J. Cell Mol. Med. 2003. V. 7. N 4. P.351-361.

105. Xia S., Liu L., Feng C., Guo A. Drug disruption of short-term memory in Drosofila melanogaster // Pharmacol. Biochem. Behav. 1997. V. 58. N 3. P. 727-735.

106. Xia S.Z., Feng C.H., Guo A.K. Multiple-phase model of memory consolidation confirmed by behavioral and pharmacological analyses of operant conditioning in Drosofila // Pharmacol. Behav. 1998. V.60. P. 809816.

107. Yang F., Russel J., Lu B. Ca influx independent synaptic potentiation mediated by mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger and protein kinase C// O. Cell Biol. 2003. V. 163. N 3. P. 511-523.

108. Yano S., Brown E.M., Chattopadhyay N. Calcium-sensing receptor in the brain// Cell Cal. 2004. V. 35. N 3. P.257-264.

109. Zhan H., Tada T., Nakazato F., Tanaka Y., Hongo K. Spatial learning transiently disturbed by intraventricular administration of ouabain// Neuronal. Res. 2004. V. 26. N 1. P. 35-40.