Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мобильность холинорецепторов командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Мобильность холинорецепторов командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания"

На правах рукописи

МАХНОВСКИЙ Денис Александрович

МОБИЛЬНОСТЬ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ КОМАНДНЫХ НЕЙРОНОВ ОБОРОНИТЕЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ НА КЛЕТОЧНОМ АНАЛОГЕ ПРИВЫКАНИЯ

03.03.01 — физиология 03.03.06 — нейробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

2 9 (ТН 2011

4855044

Работа выполнена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Заведующий - профессор В.В. Шульговский

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Аркадий Саулович Пивоваров

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Ольга Петровна Балезина,

доктор биологических наук Игорь Сергеевич Захаров.

Ведущая организация

Научный центр неврологии РАМН.

Защита состоится "3" октября 2011 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 3 сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поведение является результатом взаимодействия большого числа нервных клеток, образующих центральную нервную систему. В простых нервных системах, таких, например, как нервные системы моллюсков, кольчатых червей, активность достаточно несложных систем нейронов может лежать в основе определенных простых форм поведения, которые у животных с относительно небольшим набором реакций легко идентифицируемы. Использование клеточных аналогов простых форм поведения беспозвоночных, в частности, привыкания, позволяет подробно изучить клеточные механизмы, лежащие в основе элементарных видов поведения, характерных для всех животных.

В основе той или иной формы приобретенного поведения лежит нейронная пластичность, суть которой заключается в изменении эффективности передачи сигналов от нейрона к нейрону. Изучение механизмов различных видов синаптической пластичности на клеточном уровне, прежде всего, заключается в исследовании сенситизации/десенситизации рецепторов, трансдукции сигналов от рецепторов, вторичных посредников, процессов

фосфорилирования/дефосфорилирования, внутриклеточного транспорта.

Наша работа посвящена изучению механизмов, лежащих в основе подавления оборонительной реакции Helix lucorum (виноградной улитки) в ответ на повторную неповреждающую тактильную стимуляцию. Это очень удобная модель привыкания, так как данная форма поведения улитки обеспечивается ослаблением возбудимости крупных нейронов париетального и плеврального ганглиев, в том числе второго левого (ЛПа2), третьего левого (ЛПаЗ), второго правого (ППа2), третьего правого (ППаЗ) париетальных нейронов, на которых проведено данное исследование (Balaban, 2002). Повторяющаяся аппликация ацетилхолина на дорсальную поверхность указанных нейронов приводит к депрессии вызванного трансмембранного тока (АХ-тока). При этом динамика депрессии тока сходна с динамикой ослабления оборонительной реакции, которой управляют нейроны париетальных ганглиев (Нистратова, Пивоваров, 2004). В

данной работе мы исследуем постсинаптический механизм кратковременной (то есть не зависящей от синтеза белка) депрессии.

Цели и задачи исследования. Целью работы было исследование роли мобильности ацетилхолиновых рецепторов командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Исследовать роль эндо- и экзоцитоза ацетилхолиновых рецепторов в молекулярном механизме обратимой депрессии холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки.

2. Исследовать роль микротрубочек и актиновых филаментов в механизме обратимой депрессии холиночувствительности командных нейронов.

3. Установить роль основных протеинкиназ - РКА (Protein kinase А), РКС (Protein kinase С), PKG (Protein kinase G), p38 МАРК (p38 mitogen-activated protein kinase), CaMKII (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II), тирозиновых протеинкиназ (TyrPK) - в механизме кратковременной депрессии холиночувствительности.

Положения, выносимые на защиту.

1. Депрессия холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания обусловлена динамин-зависимой интернализацией ацетилхолиновых рецепторов.

2. В молекулярный механизм депрессии холиночувствительности командных нейронов вовлечены элементы цитоскелета - актиновые филаменты и микротрубочки.

3. Кратковременная депрессия холиночувствительности командных нейронов зависит от активности РКА, PKG, р38 МАРК, CaMKII и тирозиновых протеинкиназ.

Научная новизна. В работе впервые показано, что динамин-зависимая интернализация ацетилхолиновых рецепторов лежит в основе механизма привыкания на клеточном уровне, то есть ослабления оборонительной реакции виноградной улитки в ответ на повторяющийся неповреждающий стимул.

Впервые продемонстрирована важная роль элементов цитоскелета (микротрубочек и актиновых филаментов) в механизме кратковременной постсинаптической депрессии на клеточном аналоге привыкания.

Два вышеприведенных факта подтверждают сходство механизмов, лежащих в основе нейронной пластичности в нервных системах позвоночных и беспозвоночных животных, и подтверждают оправданность использования клеточных аналогов простых форм поведения, исследования механизмов нейронной пластичности беспозвоночных как удобных и универсальных моделей в нейробиологии.

В нашем исследовании уточнена роль клеточных сигнальных каскадов, связанных с активностью основных протеинкиназ, вовлеченных в различные формы синаптической пластичности, в частности, - в кратковременную депрессию холиночувствительности нейронов. Ранее также исследовалась роль некоторых протеинкиназ и связанных с ними вторичных посредников в механизме кратковременной пластичности исследуемых нейронов (Пивоваров и др., 1989; Пивоваров и др., 1990; Пивоваров, 1992; Pivovarov, 1995). В настоящее время появилась возможность исследовать механизмы пластичности, применяя более селективные ингибиторы.

Научно-практическая ценность работы. Проведенное исследование имеет важное теоретическое значение - результаты данной работы существенно дополняют представления о механизме кратковременного привыкания.

Полученные результаты исследования могут быть использованы для поиска лекарственных средств, влияющих на обучение.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на научной конференции IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, Simpler Nervouus Systems (Санкт-Петербург, 2009); XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); на заседании кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 4 статьи и тезисы 4 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из списка использованных сокращений, введения, обзора литературы, методики, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 86 страницах, содержит 21 рисунок. Список цитируемой литературы включает 122 источника, из них 13 отечественных.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный объект. Эксперименты проведены на идентифицированных командных нейронах ЛПа2, ЛПаЗ, ППаЗ и ППа2 оборонительного поведения виноградной улитки (Иерусалимский и др., 1992) (Helix lucorum), на препарате изолированных ганглиев.

Препарат изолированных ганглиев. Предварительно животное анестезировали, охлаждая в течение 30 мин в смеси воды со льдом. Затем из тела улитки извлекали нервное окологлоточное кольцо ганглиев, которое фиксировали стальными микроиглами в проточной камере к подложке, изготовленной из полимерного материала силгарда (Dow-Corning). Объем камеры составлял 1 мл, она была заполнена физиологическим раствором (мМ): NaCl - 100; КС1 - 4; СаС12 -10; MgCl2 - 4; трис-НС1 - 10; рН 7.5-7.7. После обработки нервного окологлоточного кольца ганглиев ферментом, раствором дигестазы (Seatec, Россия-Люксембург; 8 мг/1.2 мл, 20-70 мин при комнатной температуре), удаляли соединительнотканные оболочки, покрывающие ганглии.

Регистрация трансмембранных ионных токов. Для регистрации трансмембранных токов нейронов использовали методику двухэлектродной фиксации потенциала на мембране по схеме заземления объекта на «виртуальную землю». Для этого применяли микроэлектродный усилитель MEZ-8201 и усилитель фиксации потенциала CEZ-1100 (оба прибора фирмы Nihon Kohden, Япония). Внутриклеточные электроды для двухэлектродной фиксации потенциала, изготовленные из стекла «пирекс» (Harvard Apparatus, США), заполняли 2 М ацетатом калия (сопротивление электродов 4-118 МОм (29.1±1.5 МОм; среднее арифметическое ± S.E.M.). Регистрируемые токи подавали через аналого-цифровой интерфейс L-154 (АО «L-CARD», Россия) на персональный компьютер и

записывали на жесткий диск с помощью программы CONAN 3.0 (Рис. 1). Одновременно токи записывали на чернильном самописце КСП-4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

5 НА

30 с

Рис. 1. Пример экспериментальной серии без фармакологического воздействия на нейроне ЛПаЗ. Представлены АХ-токи в ответ на ритмические аппликации АХ с интервалом 3 мин; интервалы между 10-13 стимулами - 5 мин. Потенциал фиксации составлял-75 мВ.

Тестирующая стимуляция. Применяли локальную ионофоретическую аппликацию ацетилхолина (АХ) на дорзальную поверхность сомы нейрона из стеклянной микропипетки, заполненной 1 М хлоридом АХ (Sigma, США). Сопротивление форетических пипеток составляло 12-25 МОм. Индифферентная пипетка в цепи микроионофореза была заполнена физиологическим раствором (сопротивление 1-5 МОм). Катионные форетические токи (478-767 нА, 0.05-3.0 с) подавали с выхода электростимулятора ЭСЛ-2 (10-60 В) через изолирующее от земли устройство.

Для оценки изменения проводимости и сопротивления мембраны нейрона измеряли амплитуду тока утечки, вызванного гиперполяризующим смещением фиксируемого потенциала на 10 мВ. Прямоугольный импульс тока длительностью 5 с подавался от электростимулятора ЭСЛ-2 за 10 с перед аппликацией АХ. Входное сопротивление нейронов составляло 0.5-22.2 МОм (4.3±0.2 МОм).

Вещества. Ингибиторы эндоцитоза. Для исследования роли эндоцитоза холинорецепторов нейронов в депрессии холиночувствительности сомы командных нейронов использовали два соединения - 1) пептид, тормозящий динамин (Dynamin inhibitory peptide, DIP, состоящий из 10 аминокислот -QVPSRPNRAP, встречается также под названием Р4; Tocris, Великобритания) -конкурентный ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза, блокирующий связывание ОТРазы динамина с амфифузином; и 2) динасор (Sigma, США) -сравнительно недавно открытый, низкомолекулярный, проникающий через мембрану, обратимый конкурентный ингибитор динамин-зависимого эндоцитоза, ингибитор СТРаз динамин 1 и динамин 2 (Thomson, McNiven, 2006).

DIP (500 мкМ) растворяли в 2 М ацетате калия, и нагружали нейроны методом пассивной диффузии в течение 60 мин до начала тестирования из внутриклеточного микроэлектрода, регистрирующего потенциал. DIP, инъецируемый в гиппокампальные нейроны методом пассивной диффузии, эффективно блокирует эндоцитоз при концентрации блокатора 50 мкМ во внутриклеточной пипетке (Jordan et al., 1998). Поскольку в цитируемой работе сопротивление внутриклеточных электродов в 10 раз меньше, чем сопротивление микроэлектродов в наших экспериментах, мы заполняли их DIP в концентрации 500 мкМ, что в 10 раз превышало концентрацию, использованную в указанной статье.

Динасор растворяли в 0.4% диметилсульфоксиде (ДМСО, Sigma) и применяли внеклеточно, добавляя 30 или 40 мкл 1 мМ раствора динасора в раствор, окружающий препарат ганглиев (расчетная концентрация динасора - 30 или 40 мкМ, экспозиция 60 мин до начала тестирования, максимальная расчетная концентрация ДМСО в проточной камере - 0.016%). По данным литературы, динасор ингибирует везикулярный эндоцитоз в синапсах гиппокампальных нейронов дозозависимым образом: его полная блокада наступала при концентрации 80 мкМ, полумаксимальная концентрация (IC50) - составляла 30 мкМ (Newton et al, 2006). В контрольных экспериментах показано, что 0.016% ДМСО не блокирует эндоцитоз.

Ингибиторы микротрубочек. Для исследования участия микротрубочек цитоскелета в депрессии холиночувствительности командных нейронов

использовали проникающие через мембрану колхицин и винбластин (оба препарата от Sigma), которые, связываясь с белком тубулином, (из него состоят стенки микротрубочек) препятствуют его полимеризации и разрушают, таким образом, микротрубочки цитоскелета, вызывая их деполимеризацию (Jordan et at., 1998). Колхицин и винбластин применяли внеклеточно, добавляя их в раствор, окружающий препарат ганглиев (расчетная концентрация колхицина 10 мкМ, винбластина - 0.1 мкМ). По данным литературы, колхицин и винбластин разрушают микротрубочки цитоскелета в концентрациях, соответственно, 0.1-1 мМ и 1-100 нМ (Wiest et al., 1993).

Колхицин (10 мкМ) и винбластин (0.1 мкМ) растворяли в физиологическом растворе и применяли внеклеточно, добавляя маточные растворы указанных соединений непосредственно в раствор, окружающий препарат ганглиев в проточной камере. Экспозиции колхицина до начала тестирования составляла 3060 мин, винбластина - 45 мин.

Ингибиторы полимеризации и деполимеризации актина. Для исследования участия актинового цитоскелета в депрессии холиночувствительности использовали цитохалазин В из Helminthosporium dematioideum, разрушающий микрофиламенты за счет ингибирования полимеризации актина, и фаллоидин из Amanita phalloides, который связывается с F-актином и стабилизирует его (оба соединения от Sigma).

Цитохалазин В проникает через клеточную мембрану (Cooper, 1987). Его растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, Sigma) и применяли внеклеточно, добавляя маточный раствор (1 мМ) в проточную камеру с препаратом ганглиев. Расчетная концентрация цитохалазина В в проточной камере составляла 5 мкМ. Максимальная расчетная концентрация ДМСО в проточной камере составляла 0.05%.

Фаллоидин не проникает через клеточную мембрану (Cooper, 1987). Поэтому его вводили непосредственно в цитоплазму нейрона методом пассивной диффузии в течение 60 мин до начала тестирования из внутриклеточного микроэлектрода, регистрирующего потенциал. Электрод был заполнен 500 мкМ фаллоидином в 2 М ацетате калия.

Экспозиция веществ до начала тестирования составляла 60 мин.

Ингибиторы протеинкиназ. Для исследования роли протеинкиназ в депрессии холиночувствительности использовали следующие соединения: 1) Rp-cAMPS (Rp-Adenosine 3',5'-cyclic monophosphorothioate triethylammonium salt, Sigma) проникающий через мембрану специфический ингибитор активации сАМР-зависимой протеинкиназы I и II вторичным посредником сАМР; 2) H-Arg-Lys-Arg-Ala-Arg-Lys-Glu-OH (H-RKRARKE-OH, Calbiochem, США), ингибитор cGMP-зависимой протеинкиназы; 3) KN-93, проникающий через мембрану эффективный и селективный ингибитор мозговой CaMKII (Calbiochem); 4) хелеритрина хлорид (Calbiochem), проникающий через мембрану селективный ингибитор протеинкиназы С; 7) PD 169316 (Sigma), проникающий через мембрану селективный ингибитор р38 МАРК, 8) генистеин (Sigma), ингибитор тирозиновых протеинкиназ.

Rp-cAMPS и хелеритрин растворяли в физиологическом растворе. Эти соединения применяли внеклеточно, добавляя их маточные растворы непосредственно в проточную камеру. Расчетная концентрация Rp-cAMPS во внеклеточном растворе составляла 200 мкМ, хелеритрина - 10 мкМ.

H-RKRARKE-OH (500 мкМ) растворяли в 2М ацетате калия. Этим блокатором нагружали нейроны методом пассивной диффузии в течение 60 мин до начала тестирования из внутриклеточного микроэлектрода, регистрирующего потенциал.

KN-93, PD 169316, генистеин и растворяли в ДМСО и применяли внеклеточно, добавляя маточные растворы указанных соединений непосредственно в раствор, окружающий препарат ганглиев в проточной камере. Расчетная концентрация KN-93 в проточной камере составляла 5 мкМ, PD 169316 - 10 мкМ, генистеина - 20 мкМ. Максимальные расчетные концентрации ДМСО в проточной камере составляли: после аппликации KN-93, PD 169316 и генистеина - 0.1%.

Использованные вещества растворяли до конечной концентрации в один этап (до 10 мМ: Rp-cAMPS; до 500 мкМ: H-RKRARKE-OH; до 50 мМ: генистеин) или в два этапа (сначала - до 5 мМ: KN-93, или до 10 мМ: хелеритрин, PD 169316; а затем - до 1 мМ).

Экспозиции веществ до начала тестирования составляли 30-60 мин. Серии проводили при остановленном протоке физиологического раствора.

Ингибитор экзоцитоза. Для исследования роли экзоцитоза в депрессии холиночувствительности командных нейронов использовали ингибитор белка Arfl Exol (Sigma). Exo 1 (2 мМ) растворяли в 6.7% диметилсульфоксиде и 0.2 М ацетате калия. Указанным раствором заполняли внутриклеточный микроэлектрод, которым регистрировали потенциал. Нейроны нагружали Exol + ДМСО, а в контрольных экспериментах 6.7% ДМСО методом пассивной диффузии в течение 60-80 мин до начала тестирования.

Серии проводили при остановленном протоке физиологического раствора.

Экспериментальные серии. АХ апплицировали постоянно в ходе эксперимента с интервалом 5 мин до и после серии ритмической подачи АХ. В качестве клеточного аналога привыкания использовали серию из 10 повторных аппликаций одинаковых порций АХ с постоянным интервалом (3 мин) в серии, которая вызывала подавление АХ-тока. После 10-й аппликации подавали 3 аппликации АХ той же величины, что и в серии, но с большими временными интервалами (5 мин) для оценки степени и скорости спонтанного восстановления сниженного АХ-тока (Рис. 1). Кинетика изменения АХ-тока в серии включала три фазы: 1) фазу спада: снижение амплитуды трансмембранного тока, 2) фазу плато: стабилизация амплитуды тока на сниженном уровне, и 3) фазу спонтанного восстановления.

Серию ритмических аппликаций АХ начинали на фоне стабильной амплитуды стационарного тока, вызванного аппликациями АХ. Измеряли амплитуду тока (% относительно ответа на первый стимул в серии).

Для исследования динамики депрессии холиночувствительности применяли парные аппликации АХ на дорсальную поверхность нейронов с меняющимся интервалом между стимулами. Интервал между аппликациями при фоновом тестировании составлял 10 мин. По достижении стабильности амплитуды вызванного аппликациями АХ тока начинали серию тестирующих парных стимулов с интервалами 10 мин, 5 мин, 2.5 мин, 1 мин 15 с, 40 с, 20 с и 10 с. Интервал между парами аппликаций составлял 10 мин.

Измерение амплитуды вызванных АХ-токов и токов утечки проводили после окончания эксперимента на персональном компьютере в программе CONAN 3.0.

Статистические методы. Вычисляли среднее арифметическое выборки и стандартную ошибку среднего арифметического. Достоверность эффектов веществ оценивали по непарному критерию Вилкоксона. Использовали статистические программы STADIA 6.3/базовая (НПО "Информатика и компьютеры", Россия).

Результаты получены на 189 нейронах (18 ЛПа2, 95 ЛПаЗ, 60 ППаЗ, 16 ППа2) в 189 препаратах. Мембранный потенциал клеток составлял (-80) - (-33) мВ (-55,6±0,7 мВ); потенциал фиксации -75 мВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Контрольные серии.

DIP, колхицин, винбластин, фаллоидин, Rp-cAMPS и хелеритрин растворяли в физиологическом растворе, поэтому к сериям с этими веществами проведена контрольная серия без фармакологических воздействий (п=9, для серии с фаллоидином п=11). Для серии с динасором проведена контрольная серия с ДМСО (0.016%, п=10). Для серии с Exol проведена контрольная серия с 6.7% ДМСО в микроэлектроде, регистрирующем потенциал (п=10). Для серий с KN-93, PD 169316 и генистеином проведена контрольная серия с 0.1 % ДМСО (n= 11).

Влияние ингибиторов динамина (DIP и динасора) на депрессию холиночувствительности командных нейронов на клеточном аналоге привыкания.

После внутриклеточной спонтанной диффузии DIP (п=11) выявлено, что это соединение вызывало уменьшение скорости депрессии и ослабление уровня депрессии, которое сменялось во второй половине серии более медленным изменением достигнутой степени депрессии до уровня, не отличающегося от полученного в контрольной серии.

Динасор (n=l 1) ослаблял скорость и уровень депрессии трансмембранного тока (Таблица 1).

DIP и динасор не оказывали достоверного влияния на степень и скорость спонтанного восстановления сниженной в серии амплитуды тока, вызванного аппликациями ацетилхолина.

Зависимость депрессии АХ-зависимого трансмембранного тока от активности динамина говорит о том, что в механизме исследуемого нами

клеточного аналога привыкания лежит десенситизация АХ-рецепторов путем их динамин-зависимой интернализации. Возможно, более выраженный эффект динасора связан с тем, что это вещество способно подавлять повышение концентрации Са2+ в цитоплазме (Тяа1 е! я/., 2009).

Таблица 1. Эффекты ингибиторов на депрессию АХ-тока на клеточном аналоге привыкания.__

Вещество Ингибируемын белок Условия применения Эффект (скорость депрессии/уровень плато депрессии)

DIP (Dynamin inhibitory peptide) Динамик (эндоцитоз) 500 мкМ, внутриклеточно 4.86%/мин 87.68+1.68%»*

Динасор Динамин (эндоцитоз) 40 мкМ, внеклеточно + 0.016% ДМСО 1.13%/мин 85.81±1.17%«**

Колхицин Тубулин (в микротрубочках) 10 мкМ, внеклеточно 3.11%/мин 90.65+1.14%»**

Винбластин Тубулин (в микротрубочках) 0.1 мкМ, внеклеточно 1.60%/мин 71.17+0.79%

Цитохалазин В И-актин 5 мкМ, внеклеточно + 0.05% ДМСО 5.70%/мин 68.04±1.85%

Фаллоидин Р-актин 500 мкМ, внутриклеточно 3.67%/мин Не достигнут

Rp-cAMPS РКА 200 мкМ, внеклеточно 2.84%/мин 74.35±3.70%

H-RKRARKE-OH РКД 500 мкМ, внутриклеточно 2.20%/мин 84.57±1.26%»*»

Хелеритрин РКС 10 мкМ, внеклеточно 6.09%/мин 74.72+1.74%

KN-93 СаМКН 5 мкМ, внеклеточно + 0.1% ДМСО 1.16%/мин 65.31+4.21%

PD 169316 р38 МАРК 10 мкМ, внеклеточно + 0.1% ДМСО 5.03%/мин 71.80+2.02%

Генистеин Тирозиновые протеинкиназы 20 мкМ, внеклеточно + 0.1% ДМСО 5.67%/мин 63.20+1.78%

ДМСО 0.1% -(контроль) - 7.24%/мин 68.38+1.92%

ДМ СО 0.016% -(контроль) - 5.27%/мин 69.98+0.95%

Физиологический раствор -(контроль) 9.47%/мин 71.49+1.59%

ДМСО 6.7% -(контроль) - 1.55%/мин 88,65+1,98

Exol АгП (зкзоцитоз) 2 мМ, внутриклеточно + 6.7% ДМСО 5.96%/мин 71.31+3.30**»

Примечание: * - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001.

Влияние ингибиторов полимеризации микротрубочек (колхицина и винбластина) на депрессию холиночувствительности на клеточном аналоге привыкания.

Колхицин (п=10) и винбластин (п=9) изменяли депрессию АХ-тока во время серии ритмических аппликаций АХ, но неодинаково. Колхицин ослаблял скорость и уровень депрессии трансмембранного тока. Причем достигнутый уровень депрессии не был стационарным: в нем выделяется подъем (правда, недостоверный), с максимумом на 5-6 ответах (через 15-18 мин после начала серии), затем уровень депрессии возвратился к 9-10 стимулам до значения, достигнутого в ответе на 3-й стимул в серии. Винбластин снижал только скорость депрессии вызванного АХ тока без изменения ее уровня.

Винбластин не влиял на восстановление АХ-тока. Колхицин вызывал возрастание амплитуды АХ-тока после ритмических аппликаций АХ (в ответах на 11-13 стимулы) по сравнению с контрольным значением в ответ на первый стимул в серии. Это возрастание не было следствием увеличения амплитуды стационарного АХ-тока до серии вследствие действия колхицина. Колхицин вызывал в период фонового тестирования через 20-25 мин после его введения в проточную камеру падение амплитуды стационарного АХ-тока в 2 раза (до 53.4±9.7% от контрольной величины), затем ответ стабилизировался. Серию ритмических аппликаций АХ, вызывавших депрессию АХ-тока, начинали только после стабилизации амплитуды стационарного АХ-тока.

Микротрубочки участвуют как в кластеризации, так и в транспорте везикул с медиаторными рецепторами. Подавление депрессии трансмембранного тока на клеточном аналоге привыкания при применении колхицина и винбластина согласуется с нашим предположением о том, что для депрессии холиночувствительности необходима интернализация и активный направленный транспорт ацетилхолиновых рецепторов.

Влияние ингибиторов полимеризации и деполимеризации актина цитохалазина В и фаллоидина на депрессию трансмембранного тока на клеточном аналоге привыкания.

В качестве контроля к серии с цитохалазином В использовали контрольную серию с 0.1%. ДМСО В экспериментах после аппликации

цитохалазина В в проточную камеру расчетная концентрация в ней ДМСО составляла 0.05%. Мы считаем, что если ДМСО в концентрации 0.1% не вызывает эффекта на кривую депрессии АХ-тока, то и в 2 раза меньшей концентрации эффекта также не будет.

Цитохалазип В (п=11) уменьшал начальную скорость депрессии трансмембранного тока, вызванного аппликациями ацетилхолина и увеличивал время выхода кривой на плато, не изменяя его уровня, и не влиял на латентность и уровень спонтанного восстановления сниженной в серии амплитуды тока.

Фаллоидин (п=13) уменьшал скорость депрессии трансмембранного тока, увеличивал время выхода кривой на плато (фаза плато не достигнута во время серии) и недостоверно снижал уровень спонтанного восстановления амплитуды АХ-тока.

Данные, полученные на клеточном аналоге привыкания в нашей лаборатории, и данные о модуляции холиночувствителыюсти нейронов позвоночных подтверждают центральную роль актинового цитоскелета в синаптической и нейронной пластичности, связанной с ацетилхолиновыми рецепторами. Функциями актинового цитоскелета являются локальный транспорт и стабилизация рецепторов на мембране. Например, актин, взаимодействуя с актинином и рапсином, предотвращает латеральное перемещение и участвует в кластеризации и начальной стадии интернализации никотиновых рецепторов (Dobbins etal., 2008, Fernandes et al., 2010, Kneussel, 2010).

Влияние ингибитора экзоцитоза Exol на депрессию холиночувствительности на клеточном аналоге привыкания.

После внутриклеточной спонтанной диффузии Exol (п=12) выявлено, что это вещество вызывало усиление депрессии тока на клеточном аналоге привыкания по сравнению с контролем. Достоверно не установлено, что Exol влиял на уровень спонтанного восстановления амплитуды трансмембранных токов после серии тестирующих стимулов.

Интернализация и рециклирование медиаторных рецепторов - это динамические процессы, имеющие противоположные эффекты по отношению к чувстительности нейрона к медиатору. Таким образом, при неизменной скорости

интернализации и подавленном Exol рециклировании рецепторов происходило усиление депрессии трансмембранных токов.

Влияние_ингибиторов_протеинкиназ_на_депрессию

холиночувствительности на клеточном аналоге привыкания.

РКА. Rp-cAMPS (я=9), ингибитор РКА, уменьшал начальную скорость депрессии вызванного аппликациями АХ тока, увеличивал время выхода кривой на плато, не изменяя его уровня и не влиял на время и уровень его спонтанного восстановления.

Одним из наиболее вероятных вариантов участия РКА в интернализации ацетилхолиновых рецепторов заключается в фосфорилировании и активации GRK2 (G-protein receptor kinase 2) - киназы, фосфорилирующей и запускающей эндоцитоз рецепторов (Penela et al., 2003). Возможно также влияние РКА и на состояние микротрубочек, в основном, в результате фосфорилирования белков, ассоциированных с тубулином в микротрубочках и регулирующих их динамику.

PKG. H-RKRARKE-OH («=12), ингибитор PKG, уменьшал начальную скорость депрессии вызванного аппликациями АХ тока и уровень его депрессии в серии и предотвращал спонтанное восстановление тока при более редкой частоте тестирования, которая была до серии (Рис. 2).

Участие PKG в механизме кратковременной пластичности командных нейронов подтверждают ранее полученные результаты об участии cGMP в пластичности нейронов ПГТа4, ППаЗ и ЛПаЗ - активаторы гуанилатциклазы усиливали эффект депрессии холиночувствительности (Пивоваров и др., 1989). Вероятно, эффект связан с ролью PKG в регуляции цитоскелета и внутриклеточного транспорта. В различных клетках и тканях показано, что PKG-зависимый сигнальный .каскад необходим для реорганизации актиновых микрофиламентов (Lincoln et al., 2001, Boran, Butt et al., 2003, Garcia, 2007)

CaMKII. KN-93 (n=l 1), ингибитор CaMKII уменьшал начальную скорость депрессии АХ-тока и увеличивал время выхода кривой на плато, не изменяя его уровня, и повышал (недостоверно) время спонтанного восстановления сниженной в серии амплитуды АХ-тока, не влияя на уровень его восстановления.

Уменьшение скорости депрессии холиночувствительности командных нейронов при применении KN-93 согласуется с полученными ранее данными о

том, что кратковременное подавление вызванного аппликацией АХ трансмембранного тока нейронов ЛПаЗ и ППаЗ виноградной улитки подавляется при применении блокаторов кальмодулина (Пивоваров и др., 1990) и при ингибировании высвобождения Са2+ из внутриклеточных депо и его проникновения через каналы на плазматической мембране (Pivovarov, Kotlyar, 1991). Возможно, CaMKII участвует в интернализации ацетилхолиновых рецепторов путем как их непосредственного фосфорилирования, так и регулируя перестройку актинового цитоскелета (Andersen et al., 2005).

РКС. Хелеритрин (л=8), ингибитор РКС, не изменял депрессию АХ-тока, а также время и уровень его спонтанного восстановления. В раннее проведенной работе (Пивоваров и др., 1989) на нейронах ЛПаЗ и ППаЗ использование активатора и ингибитора РКС также не влияло на кратковременную пластичность данных нейронов.

PD 169316 (п=9), ингибитор р38-МАРК, и генистеин («=11), ингибитор тирозиновых протеинкиназ, уменьшали скорость депрессии АХ-тока и увеличивали время выхода кривой на плато, не изменяя его уровня, и не влияли на латентность и уровень спонтанного восстановления сниженной в серии амплитуды АХ-тока.

р38 МАРК. Ингибитор р38 МАРК PD 169316 вызывал достоверное, но не значительное по сравнению влиянием других ингибиторов подавление депрессии трансмембранных токов, что, возможно, связано с относительно косвенным участием р38 в депрессии холиночувствительности. Тем не менее, в определенных случаях показано участие этой киназы в интернализации мембранных рецепторов, а именно - регуляция перестройки актинового цитоскелета и активности белков, участвующих в процессе эндоцитоза рецепторов (Cavalli et al., 2001, Luttrell, Lefkowitz, 2002; Hou et al., 2004; McLaughlin et al., 2006, Tan et al., 2009).

TyrPK. Применение генистеина - блокатора тирозиновых протеинкиназ -привело к подавлению скорости депрессии тока, вызванного повторяющейся ритмичной стимуляцией АХ, что, возможно, говорит о Src-зависимой активации динамина в исследуемом нами механизме. Киназа c-Src, относящаяся к подсемейству Src и семейству тирозиновых киназ связывается p-аррестином и активируется им. После этого киназа c-Src фосфорилирует динамин и,

соответственно, активирует его. Этот механизм показан, например, для интернализации ряда мускариновых рецепторов позвоночных (Werbonat et al., 2000, van Koppen, Kaiser, 2003). Киназа c-Src фосфорилирует и увеличивает каталитическую активность GRK2. Вполне возможно, что этот механизм также задействован в механизме депрессии холиночувствительности командных нейронов (Penela et al., 2003).

В нашей лаборатории мы применяли блокатор, специфичный только к семейству Src (Махновский и др., 2011). В данном случае ингибитор Src РР2 не только подавлял депрессию холиночувствительности, но и приводил к сенситизации холиночувствииельности в серии.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

5 нА

30с

Рис. 2. Пример влияния пептидного ингибитора РКС на динамику АХ-тока командных нейронов на клеточной модели привыкания. Представлены АХ-токи в ответ на ритмические аппликации АХ с интервалом 3 мин; интервалы между 10-13 стимулами - 5 мин. Цифры - порядковый номер аппликации АХ в серии. А - серия без фармакологического воздействия на нейроне ЛПаЗ, Б - серия после внутриклеточной инъекции Н-Аг£-Ьу5-Аг§-А1а-А^-Ьу5-С1и-ОН в нейрон ППаЗ. Потенциал фиксации: -75 мВ.

Депрессия холиночувствительности командных нейронов после однократной аппликации ацетилхолина.

При парной аппликации АХ на дорсальную поверхность командных нейронов с меняющимся интервалом между кондиционирующим и тестирующим стимулами минимальная амплитуда АХ-тока (54.5±4.83%) наблюдалась при интервале между стимулами 40 с (недостоверно). При минимальном интервале (10 с) амплитуда АХ-тока в ответ на тестирующий стимул по отношению к первому стимулу в паре составляла 57.5±5.5% (Рис. 3). Практически полное восстановление амплитуды трансмембранного тока происходило при интервале между стимулами равному 10 мин (99.2±1.%%). Результаты эксперимента с парными аппликациями АХ демонстрируют динамику подавления холиночувствительности в ответ на воздействие агониста ацетилхолиновых рецепторов. В зависимости от типа рецепторов и типа клетки, на мембране которой представлены эти рецепторы, время интернализации варьирует от 1,7 с (постоянная времени) (Wang et al., 2006) до нескольких минут (Kennedy and Ehlers, 2006). Таким образом, агонист-зависимая интернализация ацетилхолиновых рецепторов происходит относительно быстро.

= X

га Ф £ §

ь I

° о 2 О о =

а ^

0 54 н ш

и

II

g га

1 £

< с

с с га

100 200 300 400 500

Интервал между стимулами, с

Рис. 3. Зависимость амплитуды трансмембранного тока в ответ на второй стимул по отношению к амплитуде тока в ответ на первый стимул (%) при парных аппликациях АХ от величины интервала между стимулами, (с) (п=10).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе полученных в настоящей работе результатов и имеющихся литературных данных, предполагаем один из возможных постсинаптических механизмов поведенческого привыкания виноградной улитки (Рис. 4). Повторные аппликации ацетилхолина приводят к снижению числа мембраносвязанных рецепторов в результате преобладания их интернализации над рециклированием. Интернализация осуществляется путем динамин-зависимого эндоцитоза везикул с расположенными на их мембране рецепторами. Этот процесс сопровождает перестройка актинового цитоскелета, вовлеченного в локальный транспорт и заякоривание ацетилхолиновых рецепторов. Далее, с помощью миротрубочек, везикулы с интернализованными рецепторами транспортируются во внутриклеточный пул. В снижение числа рецепторов, расположенных на плазматической мембране, вовлечена активация ряда серин/треониновых протеинкиназ (РКА, РКО, СаМКН, р38 МАРК) и тирозиновых протеинкиназ. Прекращение ритмической аппликации ацетилхолина приводит к возрастанию числа холинорецепторов на мембране за счет восстановления соотношения скоростей их интернализации и рециклирования. На уровне поведения депрессия холиночувствительности командных нейронов, в основе которой лежит описанный выше механизм, приводит к подавлению оборонительной реакции в ответ на повторяющийся неповреждающий стимул, и развивается привыкание.

Повторные локальные аппликации АХ на мембрану командного неГфона

О

/ ч

Активация

внесинаптических

холинорецепторов

Активация РКА, РКЭ, СаМКН, р38 МАРК и ТугРК

1}

Усиление динамин-зависимого эндоцитоза и ослабление экзоцитоза ацетилхолиновых рецепторов с участием актиновых филаментов и микротрубочек

»

Снижение холиночувствительности мембраны командного нейрона

Ослабление эффективности несинаптического холинергического входа командного нейрона

Рис. 4. Предполагаемая схема формирования депрессии холиночувствтвительности командного нейрона оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

ВЫВОДЫ

1. Ингибиторы динамина (dynamin inhibitory peptide, динасор) ослабляют, а ингибитор экзоцитоза Exol усиливает кратковременную обратимую депрессию холиночувствительности командных нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Это указывает на снижение числа мембраносвязанных холинорецепторов в результате изменения баланса внутриклеточных транспортных процессов в сторону преобладания интернализации рецепторов над их рециклированием.

2. Ингибиторы актиновых микрофиламентов (цитохалазин В, фаллоидин) и микротрубочек (колхицин, винбластин) ослабляют депрессию холиночувствительности командных нейронов, что свидетельствует об участии указанных элементов цитоскелета в снижении числа мембранных холинорецепторов на клеточном аналоге привыкания.

3. Ингибиторы серин/треониновых протеинкиназ: протеинкиназы A (Rp-cAMPS), протеинкиназы G (H-Arg-Lys-Arg-Ala-Arg-Lys-Glu-OH), кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (KN-93), р38 митогенактивируемой протеинкиназы (PD 169316), и тирозиновых протеинкиназ (генистеин) ослабляют депрессию холиночувствительности командных нейронов. Ингибитор протеинкиназы С хелеритрин не влияет на депрессию холиночувствительности командных нейронов.

4. Активация нескольких серин/треониновых протеинкиназ: протеинкиназы А, протеинкиназы G, кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II, р38 митоген-активируемой протеинкиназы (без участия протеинкиназы С), а также тирозиновых протеинкиназ вовлечена в снижение числа мембраносвязанных холинорецепторов, вызывающее обратимую депрессию холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах.

1. Махновский Д.А, Третьякова М.С., Мурзина Г.Б., Пивоваров А.С. Эвдоцитоз холинорецепторов в механизме депрессии холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточной модели привыкания // Журн. высш. нерв. деят. 2010. Т. 60. №2. С. 206-216.

2. Махновский Д.А., Мурзина Г.Б., Третьякова М.С., Пивоваров А.С. Роль серин/треониновых и тирозиновых протеинкиназ в депрессии холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания // Журн. высш. нервн. деят. 2011. Т. 61. № 4. С. 459475.

3. Махновский Д.А., Мурзина Г.Б., Пивоваров А.С, Экзоцитоз холинорецепторов при депрессии вызванного ацетилхолином тока в нейронах виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания // Бюл. экспер. биол. мед. (принята в печать).

4. Пивоваров А.С., Васильева Н.А., Мурзина Г.Б., Махновский Д.А. Роль актиновых микрофиламентов в депрессии вызванного ацетилхолином тока в нейронах виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания // Журн. высш. нервн. деят. (принята в печать).

Тезисы докладов.

5. Makhnovsky DA, Tretyakova MS, Murzina GB, Pivovarov AS. Inhibitors of endocytosis and microtubules decrease depression of cholinosensitivity in command helix lucorum neurons in cellular analogue of habituation. Simpler Nervous Systems: Abstracts of the IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology. (St. Petersburg, Russia, September 9-13, 2009) St. Petersburg: Pavlov Institute of Physiology of the Russian Academy of Sciences, 2009. P. 61.

6. Махновский Д.А., Третьякова M.C., Васильева H.A., Мурзина Г.Б. Пивоваров А.С. Участие эндоцитоза внесинаптических холинорецепторов и

роль цитоскелета нейронов виноградной улитки в депрессии вызванного ацетилхолином тока на клеточном аналоге привыкания. XXI Съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Тезисы докладов. - М. -Калуга: Типография ООО "БЭСТ-принт", 2010, С.388-389. Третьякова М.С., Махновский Д.А., Мурзина Г.Б., Пивоваров A.C. Эффекты блокаторов серин-треониновых и тирозиновых протеинкиназ на кинетику холиночувствительности нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды. Конференция молодых ученых, посвященная 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. (СПб-Колтуши, 21-22 декабря 2010 г.). Тезисы докладов. СПб: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2010, С. 109-110.

Третьякова М.С., Махновский Д.А., Мурзина Г.Б., Пивоваров A.C. Роль серин/треониновых и тирозиновых протеинкиназ нейронов виноградной улитки в депрессии вызванного ацетилхолином тока на клеточном аналоге привыкания. XXI Съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Тезисы докладов. - М. - Калуга: Типография ООО "БЭСТ-принт", 2010, С. 617.

Подписано в печать 30.08.2011 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1128 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Махновский, Денис Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Цель и задачи исследования.

1.2. Положения, выносимые на защиту.Ю

1.3. Научная новизна и практическая значимость.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Привыкание - простая форма адаптивного поведения. Клеточный аналог.

2.2. Ацетилхолиновые рецепоторы моллюсков.

2.3. Постсинаптические механизмы привыкания.

2.3.1. Роль интернализации и рециклирования постсинаптических рецепторов.

2.3.2. Эндоцитоз медиаторных рецепторов в механизме депрессии синаптической передачи.

2.3.3. Латеральная мобильность медиаторных рецепторов и синаптическая пластичность.

2.3.4. Белки цитоскелета и регуляция их активности в механизмах синаптической пластичности.

2.4. Фосфорилирование/дефосфорилирование и синаптическая пластичность.

2.4.1. Роль протеиникназы А в синаптической пластичности.

2.4.2. Роль МАР-киназ в синаптической пластичности.

2.4.3. Роль протеинкиназы С и Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы в синаптической пластичности.

2.4.4. Роль протеинкиназы О в синаптической пластичности.

2.4.5. Роль тирозиновых протеинкиназ в синаптической пластичности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мобильность холинорецепторов командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания"

Поведение является результатом взаимодействия большого числа нервных клеток, образующих центральную нервную систему. В простых нервных системах, таких, например, как нервные системы моллюсков, кольчатых червей, активность достаточно несложных систем нейронов может лежать в основе определенных простых форм поведения, которые у животных с относительно небольшим набором реакций легко : идентифицируемы. Использование клеточных аналогов простых форм

• поведения беспозвоночных, в частности, привыкания, позволяет подробно изучить клеточные механизмы, лежащие в основе элементарных видов поведения, характерных для всех животных.

В основе той или иной формы приобретенного поведения лежит ; нейронная пластичность, суть которой заключается в изменении эффективности передачи сигналов от нейрона к нейрону. Изучение механизмов различных видов синаптической пластичности на клеточном

• уровне, прежде всего, заключается в исследовании ' сенситизации/десенситизации рецепторов, трансдукции сигналов от рецепторов, вторичных посредников, процессов фосфорилирования/дефосфорилирования, внутриклеточного транспорта.

Наша работа посвящена изучению механизма, лежащего в основе . подавления оборонительной реакции Helix lucorum (виноградной улитки) в ответ на повторную неповр еж дающую тактильную стимуляцию. Это очень удобная модель привыкания, так как данная форма поведения улитки обеспечивается ослаблением возбудимости крупных нейронов париетального и плеврального ганглиев, в том числе второго левого (ЛПа2), третьего левого (ЛПаЗ), второго правого (1111а2), третьего правого (ППаЗ) париетальных нейронов, на которых проведено данное исследование (Рис. 1) (Balaban, 2002). Повторяющая аппликация ацетилхолина на дорсальную поверхность указанных нейронов вызывает депрессию трансмембранного тока (АХ-тока), вызванного аппликациями ацетилхолина. При этом динамика депрессии тока сходна с динамикой ослабления оборонительной реакции, которой управляют нейроны париетальных ганглиев (Нистратова, Пивоваров, 2004).

В данной работе мы исследуем постсинаптический механизм кратковременной (т.е. не зависящей от синтеза белка) депрессии.

Рис. 1. Ганглии подглоточного комплекса, вид сверху. LPaG — левый париетальный ганглий, RPaG — правый париетальный ганглий, LP1G — левый плевральный ганглий, RP1G — правый плевральный ганглий. (Balaban, 2002).

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Махновский, Денис Александрович

6. ВЫВОДЫ

1. Ингибиторы динамина (dynamin inhibitory peptide, динасор) ослабляют, а ингибитор экзоцитоза Exol усиливает кратковременную i обратимую депрессию холиночувствительности командных нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Это указывает на снижение числа мембраносвязанных холинорецепторов в результате изменения баланса внутриклеточных транспортных процессов в сторону преобладания интернализации рецепторов над их рециклированием.

2. Ингибиторы актиновых микрофиламентов (цитохалазин В, фаллоидин) и микротрубочек (колхицин, винбластин) ослабляют депрессию холиночувствительности командных нейронов, что свидетельствует об участии ' указанных элементов цитоскелета в снижении числа мембранных холинорецепторов на клеточном аналоге привыкания.

3. Ингибиторы серин/треониновых протеинкиназ: протеинкиназы А (Rp-cAMPS), протеинкиназы G (H-Arg-Lys-Arg-Ala-Arg-Lys-Glu-OH), кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (KN-93), р38 митоген-активируемой протеинкиназы (PD 169316), и тирозиновых протеинкиназ (генистеин) ослабляют депрессию холиночувствительности командных нейронов. Ингибитор протеинкиназы С хелеритрин не влияет на депрессию холиночувствительности командных нейронов.

4. Активация нескольких серин/треониновых протеинкиназ: протеинкиназы А, протеинкиназы О, кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II, р38 митоген-активируемой протеинкиназы (без участия протеинкиназы С), а также тирозиновых протеинкиназ вовлечена в снижение числа мембраносвязанных холинорецепторов, вызывающее обратимую депрессию холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Махновский, Денис Александрович, Москва

1. Кэндел Э. Клеточные основы поведения. М.: Изд-во Мир, 1980. 598 с.

2. Нистратова B.JL, Пивоваров A.C. Рецепторы инозитолтрифосфата и рианодиновые рецепторы в регуляции Na,K-HacocoM холиночувствительности нейронов виноградной улитки при привыкании // Журн. высш. нерв. деят. 2004. Т. 54. №4. С. 554-564.

3. Палихова Т.А., Абрамова М.С., Пивоваров A.C. Холинергическиеие сенсорные входы к командным нейронам виноградной улитки // Бюлл. эксп. биол. мед. 2006 Т. 142. №3. С. 275-278.

4. Пивоваров A.C., Дроздова Е.И. Идентификация холинорецепторов на соме нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки // Нейрофизиология. 1992. Т. 24. № 1. С. 77-86.

5. Пивоваров A.C. Активаторы G-белков повышают пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки // Журн. высш. нерв, деят. 1994. Т. 44. № 6. С. 1070-1076.

6. Пивоваров A.C. Холинорецепторы нейронов виноградной улитки: идентификация, пластичность и ее регуляция опиоидами и вторичными посредниками // Журн. высш. нерв. деят. 1992. Т. 42. № 6. С. 1271-1286.

7. Пивоваров A.C., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Блокаторы кальмодулина ослабляют кратковременную пластичность холинорецепторовнейронов виноградной улитки // Журн. высш. нерв. деят. 1990. Т. 40. № 1.С. 535-542.

8. Пивоваров А.С., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Роль цГМФ в угашении реакций идентифицированных нейронов виноградной улитки на ацетилхолин // Журн. высш. нерв. деят. 1989. Т. 39. № 4. С. 728-736.

9. Пивоваров А.С., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Протеинкиназа С не вовлечена в регуляцию кратковременной пластичности холинорецепторов нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки // Биол. науки. 1989. № 10. С. 54-58.

10. Пивоваров А.С., Эхидо-Вилларреаль У. Ингибиторы NO синтазы и гуанилатциклазы блокируют модуляцию пластичности холинорецепторов нейронов виноградной улитки 15-гидроксиэйкозатетраеновой кислотой // Журн. высш. нерв. деят. 1995. Т. 45. №3. С. 558-564.

11. Пивоваров А.С., Саганелидзе Г.Н. Модуляция ионами кальция кратковременной пластичности холинорецептивной мембраны нейронов моллюска// Журн. высш. нерв. деят. 1986. Т. 36. № 5. С. 947955.

12. Andersen R, Li Y, Resseguie M, Brenman JE. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters structural plasticity and cytoskeletal dynamics in Drosophila // J. Neurosci. 2005 V. 25(39) P. 8878-8888.

13. Antonov I, Kandel ER, Hawkins RD. Presynaptic and postsynaptic mechanisms of synaptic plasticity and metaplasticity during intermediate-term memory formation in Aplysia // J. Neurosci. 2010. V. 30. P. 57815791.

14. Balaban PM. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail //Neurosci. Biobehav. Rev. 2002. V. 26. P. 597-630.

15. Baratier J, Peris L, Brocard J, Gory-Faur6 S, Dufour F, Bosc C, Fourest-Lieuvin A, Blanchoin L, Salin P, Job D, Andrieux A. Phosphorylation ofmicrotubule-associated protein STOP by calmodulin kinase II // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 19561-19569.

16. Barnes EM Jr. Intracellular trafficking of GABA(A) receptors // Life Sci. 2000. V. 66. P. 1063-1070.

17. Bie B, Pan ZZ. Trafficking of central opioid receptors and descending pain inhibition // Mol. Pain. 2007. V. 3. P. 37.

18. Boran MS, Garcia A. The cyclic GMP-protein kinase G pathway regulates cytoskeleton dynamics and motility in astrocytes // J. Neurochem. 2007. V. 102. P. 216-230.

19. Borroni V, Barrantes FJ. Cholesterol modulates the rate and mechanism of acetylcholine receptor internalization // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 17122-17132.

20. Bruneau EG, Esteban JA, Akaaboune M. Receptor-associated proteins and synaptic plasticity // FASEB J. 2009. V. 23. P. 679-688.

21. Burns RG, Islam K, Chapman R. The multiple phosphorylation of the microtubule-associated protein MAP2 controls the MAP2: tubulin interaction//Eur. J. Biochem. 1984. V. 141. P. 609-615.

22. Butt E, Gambaryan S, Gottfert N, Galler A, Marcus K, Meyer HE. Actin binding of human LIM and SH3 protein is regulated by cGMP- and cAMP-dependent protein kinase phosphorylation on serine 146 // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 15601-15607.

23. Cai C, Li H, Rivera C, Keinanen K. Interaction between SAP97 and PSD-95, two Maguk proteins involved in synaptic trafficking of AMP A receptors // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 4267-4273.

24. Castellucci VF, Kandel ER. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 5004-5008.

25. Cavalli V, Vilbois F, Corti M, Marcote MJ, Tamura K, Karin M, Arkinstall S, Gruenberg J. The stress-induced MAP kinase p38 regulates endocytic trafficking via the GDI:Rab5 complex // Mol. Cell. 2001. Y. 7. P. 421-432.

26. Cingolani LA, Goda Y. Actin in action: the interplay between the actin cytoskeleton and synaptic efficacy // Physiology (Bethesda). 2009. V. 24. P. 357-366.

27. Chang Q, Fischbach-GD. An acute effect of neuregulin 1 beta to suppress alpha 7-containing nicotinic acetylcholine receptors in hippocampal interneurons // J. Neurosci. V. 44. P. 11295-11303.

28. Chaudhury D, Manella L, Arellanos A, Escanilla O, Cleland TA, Linster C. Olfactory bulb habituation to odor stimuli // Behav. Neurosci. 2010. V. 124.- P: 490-499.

29. Choi B, Park YS, Cho NJ. Agonist-induced internalization of the Caenorhabditis elegans muscarinic acetylcholine receptor GAR-3 in Chinese hamster ovary cells //Neurochem. Res. 2006. V. 31. P. 719-725.

30. Collins RN. Rab and ARF GTPase regulation of exocytosis // Mol. Membr. Biol. 2003. V. 20. P. 105-115.

31. Cooper J.H. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin // J. Cell. Biol. 1987. V. 105. P. 1473-1478

32. Dave RH, Saengsawang W, Yu JZ, Donati R, Rasenick MM. Heterotrimeric G-proteins interact directly with cytoskeletal components to modify microtubule-dependent cellular processes // Neurosignals. 2009. V. 17. P. 100-108.

33. Davidkova G, Carroll RC. Characterization of the role of microtubule-associated protein IB in metabotropic glutamate receptor-mediated endocytosis of AMPA receptors in hippocampus // J. Neurosci. 2007. V. 48. P. 13273-13278.

34. Davis CN, Bradley SR, Schiffer HH, Friberg M, Koch K, Tolf BR, Bonhaus DW, Lameh J. Differential regulation of muscarinic Ml receptors by orthosteric and allosteric ligands // BMC Pharmacol. 2009. V. 9. P. 14.

35. Delaney KA, Murph MM, Brown LM, Radhakrishna H. Transfer of M2 muscarinic acetylcholine receptors to clathrin-derived early endosomes following clatlirin-independent endocytosis // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 33439-33446.

36. Dobbins GC, Luo S, Yang Z, Xiong WC, Mei L. alpha-Actinin interacts with rapsyn in agrin-stimulated AChR clustering // Mol. Brain. 2008. V. 1. P. 18.

37. Feng Y, Yu S, Lasell TK, Jadhav AP, Macia E, Chardin P, Melancon P, Roth M, Mitchison T, Kirchhausen T. Exol: a new chemical inhibitor of the exocytic pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 64696474.

38. Ferguson GD, Storm DR. Why calcium-stimulated adenylyl cyclases? // Physiology (Bethesda). 2004. V. 19. P. 271-276.

39. Fernandes CC, Berg DK, Gomez-Varela D. Lateral mobility of nicotinic acetylcholine receptors on neurons is determined by receptor composition, local domain, and cell type // J. Neurosci. 2010. V. 30. P. 8841-8851.

40. Galletta BJ, Mooren OL, Cooper J A. Actin dynamics and endocytosis in yeast and mammals // Curr. Opin. Biotechnol. 2010. V. 21. P. 604-610.

41. Guo ML, Fibuch EE, Liu XY, Choe ES, Buch S, Mao LM, Wang JQ. CaMKIIalpha interacts with M4 muscarinic receptors to control receptor and psychomotor function // EMBO J. 2010. V. 29. P. 2070-2081.

42. Heine M, Groc L, Frischknecht R, Bei'que JC, Lounis B, Rumbaugh G, Huganir RL, Cognet L, Choquet D. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission // Science. 2008. V. 5873. P. 201-205.

43. Hirai H. Modification of AMPA receptor clustering regulates cerebellar synaptic plasticity //Neurosci. Res. 2001. V. 39. P. 261-267.

44. Hirling H. Endosomal trafficking of AMPA-type glutamate receptors // Neuroscience. 2009. V. 158. P. 36-44.

45. Hong MH, Xu C, Wang YJ, Ji JL, Tao YM, Xu XJ, Chen J, Xie X, Chi ZQ, Liu JG. Role of Src in ligand-specific regulation of delta-opioid receptor desensitization and internalization // J. Neurochem. 2009. V. 108. P. 102-14.

46. Hou Y, Ye RD, Browning DD. Activation of the small GTPase Racl by cGMP-dependent protein kinase // Cell Signal. 2004. V. 16. P. 1061-1069.

47. Howe AK. Regulation of actin-based cell migration by cAMP/PKA // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1692. P. 159-174.

48. Jacob TC, Moss SJ, Jurd R. GABA(A) receptor trafficking and its role in the dynamic modulation of neuronal inhibition // Nat. Rev. Neurosci. 2008. V. 9. P. 331-343.

49. Jones KT, Echeverry M, Mosser VA, Gates A, Jackson DA. Agonist mediated internalization of M2 mAChR is beta-arrestin-dependent // J. Mol. Signal. 2006. V. l.P. 7.

50. Jordan A., Hadfield J.A., Lawrence N.J., McGown A.T. Tubulin as a target for anticancer drugs: agents which interact with the mitotic spindle // Med. Res. Rev. 1998. V. 18 P. 259-296.

51. Kehoe J. Three acetylcholine receptors in Aplysia neurons // J. Physiol. 1972. V. P. 115-146.

52. Kehoe J, Mcintosh JM. Two distinct nicotinic receptors, one pharmacologically similar to the vertebrate alpha7-containing receptor, mediate CI currents in aplysia neurons // J. Neurosci. 1998. V. 18. P. 81988213.

53. Kennedy M.J., Ehlers M.D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity // Annu.Rev.Neurosci. 2006. V. 29 P. 325-362.

54. Kumari S, Borroni V, Chaudhry A, Chanda B, Massol R, Mayor S, Barrantes FJ. Nicotinic acetylcholine receptor is internalized via a Racdependent, dynamin-independent endocytic pathway // J. Cell. Biol. 2008. V. 181. P. 1179-1193.

55. Lavezzari G, Roche KW. Constitutive endocytosis of the metabotropic glutamate receptor mGluR7 is clathrin-independent // Neuropharmacology. 2007. V. 52. P. 100-107.

56. Lee KB, Pals-Rylaarsdam R, Benovic JL, Hosey MM. Arrestin-independent internalization of the ml, m3, and m4 subtypes of muscarinic cholinergic receptors // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 12967-12972.

57. Leil T.A., Chen Z.W., Chang C.S., Olsen R.W. GABAA receptor-associated protein traffics GABAA receptors to the plasma membrane in neurons // J.Neurosci. 2004. V. 24. P. 11429-11438.

58. Liedtke WB, Heller S, editors. TRP Ion Channel Function in Sensory Transduction and Cellular Signaling Cascades // Boca Raton (FL): CRC Press; 2007. Chapter 23. Frontiers in Neuroscience.

59. Liles WC, Hunter DD, Meier KE, Nathanson NM. Activation of protein kinase C induces rapid internalization and subsequent degradation of muscarinic acetylcholine receptors in neuroblastoma cells // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 5307-5313.

60. Lin YC, Redmond L. CaMKIIbeta binding to stable F-actin in vivo regulates F-actin filament stability // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 15791-15796.

61. Lincoln TM, Dey N, Sellak H. Invited review: cGMP-dependent protein kinase signaling mechanisms in smooth muscle: from the regulation of tone to gene expression // J. Appl. Physiol. 2001. V. 91. P. 1421-1430.

62. Lodish H., Matsudaira P., Scott M.P. Molecular cell biology. London: Freeman, 2003. 973 p.

63. Luttrell LM, Lefkowitz RJ. The role of beta-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled. receptor signals // J. Cell. Sci. 2002. V. 115(Pt 3). P. 455-465.

64. Madziva MT, Bai J, Bhalla A, Chapman ER, Edwardson JM. Effects of synaptotagmin reveal two distinct mechanisms of agonist-stimulated internalization of the M4 muscarinic acetylcholine receptor // Br, J. Pharmacol. 2005. V. 144. V. 761-771.

65. Marsden KC, Beattie JB, Friedenthal J, Carroll RC. NMDA receptor activation potentiates inhibitory transmission through GABA receptor-associated protein-dependent exocytosis of GABA(A) receptors // J Neurosci. 2007. V. 27. P. 14326-14337.

66. Martinez-Pena y Valenzuela I, Mouslim C, Akaaboune M Calcium/calmodulin kinase II-dependent acetylcholine receptor cycling at the mammalian neuromuscular junction in vivo // J. Neurosci. 2010. V. 30. P. 12455-12465.

67. Mettlen M, Pucadyil T, Ramachandran R, Schmid SL. Dissecting dynamin's role in clathrin-mediated endocytosis // Biochem. Soc. Trans. 2009. V. 37(Pt 5). P. 1022-1026.

68. Mohamed AS, Swope SL. Phosphorylation and cytoskeletal anchoring of the acetylcholine receptor by Src class protein-tyrosine kinases. Activation by rapsyn // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 20529-20539.

69. Molina-Holgado E, Khorchid A, Liu HN, Almazan G. Regulation of muscarinic receptor function in developing oligodendrocytes by agonist exposure // Br. J. Pharmacol. 2003. V. 138. P. 47-56.

70. Murray JW, Wolkoff AW. Roles of the cytoskeleton and motor proteins in endocytic sorting // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2003. V. 55. 1385-1403.

71. Nathanson NM. Synthesis, trafficking, and localization of muscarinic acetylcholine receptors // Pharmacol. Ther. 2008. V. 119. P. 33-43.

72. Newton A. J., Kirchhausen T., Murthy V.N. Inhibition of dynamin completely blocks compensatory synaptic vesicle endocytosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 17955-17960.

73. Nguyen PV, Woo NH. Regulation of hippocampal synaptic plasticity by cyclic AMP-dependent protein kinases // Prog. Neurobiol. 2003. V. 71. P. 401-437.

74. Nikitin VP. A new mechanism of synapse-specific neuronal plasticity // Neurosci Behav Physiol. 2007. V. 37. P. 559-570.

75. Nishizaki T, Sumikawa K. Effects of PKC and PKA phosphorylation on desensitization of nicotinic acetylcholine receptors // Brain. Res. 1998. V. 812. P. 242-245.

76. Nishizuka Y. Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses // FASEB J. 1995. V. 9. P. 484-496.

77. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. The roles of CaMKII and F-actin in the structural plasticity of dendritic spines: a potential molecular identity of a synaptic tag? // Physiology (Bethesda). 2009. V. 24. P. 357-366.

78. Pals-Rylaarsdam R, Gurevich VV, Lee KB, Ptasienski JA, Benovic JL, Hosey MM. Internalization of the m2 muscarinic acetylcholine receptor. Arrestin-independent and -dependent pathways // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 23682-23689

79. Parkar NS, Akpa BS, Nitsche LC, Wedgewood LE, Place AT, Sverdlov MS, Chaga O, Minshall RD. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling // Antioxid. Redox. Signal. 2009. V. 11.P. 1301-1312.

80. Penela P, Ribas C, Mayor F Jr. Mechanisms of regulation of the expression and function of G protein-coupled receptor kinases // Cell. Signal. 2003V. 15. P. 973-981.

81. Pirger Z, Laszlo Z, Kiss T. G-protein coupled receptor kinase-like immunoreactivity in the snail, Helix pomatia, neurons // Brain Res. 2006. V. 1122. P. 10-17.

82. Pivovarov AS, Drozdova EI, Kotlyar BI. The role of cGMP in the extinction of the reactions of identified neurons of the edible snail in response to acetylcholine // Neurosci. Behav. Physiol. 1990. V. 20. P. 323330.

83. Pivovarov AS, Kotlyar BI. Regulation by calcium of short-term plasticity of the cholinoreceptors of RPa3 and LPa3 neurons of the edible snail // Neurosci. Behav. Physiol. 1991. V. 21. P. 1-7.

84. Premont RT. Once and future signaling: G protein-coupled receptor kinase control of neuronal sensitivity // Neuromolecular Med. 2005. V. 7. P. 129147.

85. Purcell AL, Carew TJ. Tyrosine kinases, synaptic plasticity and memory: insights from vertebrates and invertebrates // Trends Neurosci. 2003. V. 26. P. 625-630.

86. Purcell AL, Sharma SK, Bagnall MW, Sutton MA, Carew TJ. Activation of a tyrosine kinase-MAPK cascade enhances the induction of long-term synaptic facilitation and long-term memory in Aplysia // Neuron. 2003. V. 37. P. 473-484.

87. Sánchez C, Díaz-Nido J, Avila J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function // Prog. Neurobiol. 2000. V. 61. P. 133-168.

88. Serrano P, Yao Y, Sacktor TC. Persistent phosphorylation by protein kinase Mzeta maintains late-phase long-term potentiation // J. Neurosci. 2005. V. 25. P. 1979-1984.

89. Seralle Y, Arancio O, Ziff EB. A role for cGMP-dependent protein kinase II in AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity // Channels (Austin). 2008. V. 2. P. 230-232.

90. Sharma SK, Carew TJ. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: facilitatory effects and inhibitory constraints // Learn. Mem. 2004. V. 11. P. 373-378.

91. Sharma VM, Litersky JM, Bhaskar K, Lee G. Tau impacts on growth-factor-stimulated actin remodeling // J. Cell. Sci. V. 120(Pt 5). P. 748-757.

92. Shmuel M, Nodel-Berner E, Hyman T, Rouvinski A, Altschuler Y. Caveolin 2 regulates endocytosis and trafficking of the Ml muscarinic receptor in MDCK epithelial cells // Mol. Biol. Cell. 2007. V. 18. P. 15701585.

93. St John PA. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors // Acta Pharmacol. Sin. 2009. V. 30. P. 656-662.

94. St John PA, Gordon H. Agonists cause endocytosis of nicotinic acetylcholine receptors on cultured myotubes // J. Neurobiol. 2001. V. 49. P. 212-223.

95. Stenmark H, Olkkonen VM. The Rab GTPase family // Genome Biol. 2001. V. 2.

96. Swope SL, Qu Z, Huganir RL. Phosphorylation of the nicotinic acetylcholine receptor by protein tyrosine kinases // Ann. N Y Acad, Sci. 1995. V. 757. P. 197-214.

97. Tan M, Walwyn WM, Evans CJ, Xie CW. p38 MAPK and beta-arrestin 2 mediate functional interactions between endogenous micro-opioid and alpha2A-adrenergic receptors in neurons // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 6270-6281.

98. Thompson H.M., McNiven M.A. Discovery of a new 'dynasore' // Nature Chem. Biol. 2006. V. 2. P. 355-356.

99. Tsai CC, Lin CL, Wang TL, Chou AC, Chou MY, Lee CH, Peng IW, Liao JH, Chen YT, Pan CY. Dynasore inhibits rapid endocytosis in bovine chromaffin cells // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2009. V. 297. P. 397-406.

100. Vassilieva EV, Nusrat A. Vesicular trafficking: molecular tools and targets // Methods Mol. Biol. 2008. V. 440. P. 3-14.

101. Vogler O, Nolte B, Voss M, Schmidt M, Jakobs KH, van Koppen CJ. Regulation of muscarinic acetylcholine receptor sequestration and function by beta-arrestin // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 12333-12338.

102. Waltereit R, Weller M. Signaling from cAMP/PKA to MAPK and synaptic plasticity // Mol. Neurobiol. 2003. V. 27. P .99-106.

103. Wang JQ, Arora A, Yang L, Parelkar NK, Zhang G, Liu X, Choe ES, Mao L. Phosphorylation of AMPA receptors: mechanisms and synaptic plasticity // Mol. Neurobiol. 2005. V. 32. P. 237-249.

104. Werbonat Y, Kleutges N, Jakobs KH, van Koppen CJ. Essential role of dynamin in internalization of M2 muscarinic acetylcholine and angiotensin AT1A receptors // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 21969-21974.

105. Wiest P.M., Johnson J.H., Flanigan T.P. Microtubule inhibitors block Cryptosporidium parvum infection of a human enterocyte cell line. Infect. Immun // 1993. V. 61. P. 4888-4890.

106. Wolfe BL, Trejo J. Clathrin-dependent mechanisms of G proteincoupled receptor endocytosis // Traffic. 2007. V. 8. P. 462-470.

107. Yamauchi T. Neuronal Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II -discovery, progress in a quarter of a century, and perspective: implication for learning and memory // Biol. Pharm. Bull. 2005. V. 28. P. 1342-1354.