Внеклеточная ДНК - фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля

Конькова, Марина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внеклеточная ДНК - фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточная ДНК - фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля"

На правах рукописи Я-

Конькова Марина Сергеевна

ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК - ФАКТОР СИГНАЛИЗАЦИИ ПРИ РАДИАЦИОННОМ ЭФФЕКТЕ СВИДЕТЕЛЯ

03.02.07 - Генетика

4845469

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

Москва-2011

4845469

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Вейко Наталья Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Копорова Ирина Львовна

доктор медицинских наук, Писарев Владимир Митрофанович

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП "ГосНИИгенетика")

Защита состоится ^о ОХОоЛ 2011г. в\0 часов на заседании диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

С диссертацией можпо ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН то адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

Автореферат разослан ^^ СРлДУАдАД 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор

Зинченко Р.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Ещё два десятилетия назад эффекты радиации изучались у клеток, непосредственно подвергшихся действию частиц высоких энергий, и сводились к последствиям нерепарированных или неправильно репарированных повреждений ядерной ДНК после взаимодействия её с продуктами радиолиза воды. Эффекты в клетках, которые непосредственно не подверглись облучению, как правило, не рассматривались. Однако в последние годы ушедшего столетия начали появляться сообщения о способности клеток, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения в малых дозах, передавать сигнал необлучённым клеткам (клеткам-свидетелям), в результате и в тех, и в других индуцируются одинаковые эффекты (Nagasawa H., Little J.В., 1992). Эффект воздействия облучённых клеток популяции на необлучённые клетки получил название "bystander effect" или "эффект свидетеля" (ЭС) (Lehnert В.Е., Goodvin Е.Н., 1997; Seymour C.B., Mothersill С., 1997).

Эффект свидетеля наблюдается преимущественно в интервале малых доз от 1 до 50 сГр (Morgan W.F., Sowa М.В., 2007). Для рентгеновского излучения ЭС тестируется уже при дозе 5 мГр, при этом уровень повреждений ДНК клетки-мишени включает всего пять однонитевых разрывов, 10-15 повреждённых оснований и один двунитевой разрыв ДНК в 20% клеток. Показано, что ЭС может передаваться от облучённых клеток потомству и проявляться в ряду нескольких последующих поколений клеток (Lyng F.M. et al., 2002, Mothersill С. et al., 2002).

Механизмы передачи клеткам-свидетелям информации о повреждающем воздействии активно изучаются, однако природа всех факторов сигнального пути до конца не известна. Основное внимание исследователей было сосредоточено на факторах белковой природы (Mothersill С., Seymour C.B., 2001; Nikjoo H., Khvostunov I.K., 2003), прежде всего, на различных цитокинах (Natarajan Р.К. et al., 2007). Предполагалось также участие в передаче сигнала в ЭС активных форм кислорода и азота (Azzam E.I. et al., 2002; Matsumoto H. et al., 2007, 2010; Morgan W.F., 2010). В 2007 году сотрудниками лаборатории молекулярной биологии МГНЦ РАМН было впервые высказано предположение о возможной роли внеклеточной ДНК в реализации эффекта свидетеля (Ермаков А.В. и соавт., 2007).

Цель исследования. Цель проведенного исследования - проверка гипотезы: внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых клеток (вкДНКк) переносит информацию о радиационном воздействии от облучённых клеток - необлучённым, т.е. выступает в роли фактора сигнализации при реализации эффекта свидетеля.

Задачи исследования.

1. Выделить из среды культивирования облучённых лимфоцитов человека вкДНКк и охарактеризовать её свойства;

2. Определить возможный источник вкДНКк;

3. Сравнить эффекты, индуцируемые в лимфоцитах человека ионизирующей радиацией в малых дозах и депротеинизированной вкДНКк;

4. Обозначить сигнальные пути, связанные с рецепторами, опознающими вкДНКк;

5. Исследовать возможность моделирования свойств вкДНКя с целью направленного изменения индуцируемых ею эффектов.

Научная новизна. Впервые показано, что вкДНКя выполняет функцию сигнального фактора в реализации эффекта свидетеля, индуцируемого ионизирующим

излучением в малых дозах. Определены два условия, которые должны выполняться в клетках для поддержания данной функции вкДПКк: (1) синтез активных форм кислорода и азота и (2) апоптоз повреждённых радиацией клеток. Установлено, что вкДНКк стимулирует в лимфоцитах вторичный окислительный стресс. Впервые показано, что рецепторы "врождённого" иммунитета семейства TLR (TLR9) принимают непосредственное участие в ответе лимфоцитов на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах и в реализации эффекта свидетеля. Впервые показана принципиальная возможность моделирования клеточного ответа на действие радиации путем направленного изменения свойств внеклеточной ДНК.

Научно-практическая значимость работы. Данные о влиянии свойств вкДНК на клеточный ответ, индуцированный излучением, могут быть положены в основу для разработки предклинических моделей индивидуальных схем радиотерапии. Моделируя содержание GC-богатых последовательностей (GC-ДНК) во вкДНК можно блокировать развитие адаптивного ответа и снизить летальную для клеток опухоли дозу радиации. С другой стороны, анализ индивидуальных свойств вкДНК и их направленное изменение может способствовать повышению радиорезистентности клеток (в перспективе, организма).

Положения, выносимые на защиту.

1. Внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых лимфоцитов человека -фактор сигнализации при развитии эффекта свидетеля в клеточной популяции.

2. Для проявления сигнальной функции вкДНК, в облучённых лимфоцитах должны соблюдаться два условия: синтез активных форм кислорода/азота и апоптоз облучённых клеток.

3. В реализации сигнальной функции вкДНК в облучённых лимфоцитах принимают участие рецепторы TLR9.

4. Ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения в малых дозах можно изменить путем варьирования содержания во вкДНК GC-богатых последовательностей ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на V и VI международных конференциях "Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Sérum" (Москва, 2007; Гонконг, 2009); на II Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007); на Российской научной конференции "Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии" (Санкт-Петербург, 2008); на 37 международной конференции "37th Annual Meeting of the Européen Radiation Research Society" (Прага,

2009); на международной конференции "Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды" (Сыктывкар, 2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); на XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург,

2010); на VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010); на 4 международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 2010); на IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2011).

Диссертационная работа прошла апробацию на семинаре Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического центра РАМН, протокол № 3 от 16.03.2010.

Личный it клал автора. Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, определены задачи исследования и планирование экспериментов. Основная часть исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 печатная работа. Из них 6 статей опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 261 источников, из них 30 отечественных и 231 зарубежных авторов. Работа изложена на 154 листах машинописи. Текст содержит 39 рисунков и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

В исследовании принимали участие 23 здоровых добровольца в возрасте от 19 до 55 лет. Лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования в системе фиколл-верографин, облучали на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Облучённые и необлучённые лимфоциты, а также обработанные перекисью водорода (10 мкМ), инкубировали в течение 3 ч при 37°С (среда содержала 10% эмбриональной телячьей сыворотки). ВкДНК выделяли из среды культивирования стандартным методом экстракции органическими растворителями. Концентрацию фрагментов ДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре "LS 55" ("PerkinElmer", Англия) с использованием красителей Hoechst 33528 или PicoGreen. Для анализа действия вкДНК на интактные клетки в среду культивирования последних добавляли выделенные фрагменты вкДНК в различной концентрации и инкубировали в течение 3 ч при 37°С.

Активность каспазы-3 (Акасп3) в белковых экстрактах клеток определяли с использованием флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC (Лвоз6=400нм, ХфЛу=490нм). Активность нормировали на количество клеток. Для этого определяли количество ДНК в образце, из которого получали белковый экстракт. ЛкаспЗ=А1лрс,1мии-' 1 мкгДНК, где Д1 - увеличение интенсивности флуоресценции субстрата (в стандартизованных единицах). Нуклеазную активность (НА) в белковых экстрактах определяли с использованием модельного субстрата - комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом, содержащим на 5'-конце флуоресцентную группу (FAM), а на 3'-конце тушитель флуоресценции. Для калибровки использовали стандартный раствор ДНКазы-1. НА=Л1глм /1 мин,-1 мкгДНК. Активность TNF-a в супернатантах определяли по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток мышиной фибросаркомы L-929 (Fish Н., Gifford J.E., 1989), анализ выполнен к.б.н Е.А. Калашниковой. Концентрацию нитрита в среде определяли колориметрическим стандартным методом Грисса с использованием набора Griess Reagent Kit ("Invitrogen").

В работе использовали ингибиторы: (1) активности каспазы-3 (2 мкМ Biotin-DEVD-FMK ("Sigma")); (2) активных форм кислорода (АФК) (100 мкМ а-токоферол ацетат ("Галено Фарм", Санкт-Петербург)); (3) рецепторов TLR9 (3 мкг/мл

олигодезоксирибонуклеотид 2088 (ТСС TGG CGG GGA AGT, "Синтол", Москва) или 2 мкг/мл хлорокин ("Boots Company PLC", Англия)).

Нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH). Лимфоциты обрабатывали гипотоническим раствором (0.075 М KCl), фиксировали смесью метанол/ледяная уксусная кислота (3:1). Использовали биотинированный зонд на прицентромерный локус 1-й хромосомы (lql2). Гибридизацию осуществляли в термостате "ThermoBrite" ("StatSpin", США). Биотин выявляли конньюгатом авидин-ФИТЦ. Использовали микроскоп "Axioplan" ("Opton", Германия) и цифровую камеру "RETIGA 2000R" ("IMAGING", Канада). Определение параметров клеток проводили с помощью компьютерной программы анализа изображений ("ИнтерЭВМ", Москва). Для построения распределения параметров использовали данные для 300-500 клеток.

Селективная окраска азотнокислым серебром фиксированных ядер лимфоцитов проводилась к.б.н. H.A. Еголиной (лаборатория общей цитогенетики МГНЦ РАМН). Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь в 150 - 200 интерфазных ядрах.

Содержание повторяющихся последовательностей генома (рибосомный и теломерный повторы человека и сателлит III) в ДНК определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации с биотинированными зондами (Вейко H.H. и соавт., 2003).

Оценка уровня экспрессии генов TLR9 и MyD88 методом ПЦР в реальном времени. РНК выделяли с использованием реагента Trizol. Концентрацию выделенной РНК определяли флуориметрически с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), Явозб=487 нм, Хфлу=524 нм. Обратную транскрипцию проводили с помощью реактивов фирмы "Силекс" по стандартной методике. Для оценки уровня экспрессии TLR9 и MyD88 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по принципу TaqMan. В качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. ПЦР проводили на приборе "Rotor Gene 300" ("Corbett", Австралия). Полученные данные обрабатывали методом калибровочного графика и прямым сравнением данных с использованием программы прибора. Ошибка измерения составила ~ 2%.

Количество гиподиплоидных клеток в популяции лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии (окраска клеток пропидий йодидом) сотрудники ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА РФ.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics, Statistica 6.0 и StatPlus.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Свойства вкДНК облучённых и интактных лимфоцитов

Концентрация вкДНК в среде культивирования лимфоцитов (-0,5-106 клеток/мл среды) 23-х здоровых людей (вкДНКк) через 3 часа культивирования варьировала от 2 до 398 нг/мл среды. Данные о количестве вкДНК целесообразно выражать в процентах от суммарного количества ДНК, которая содержится в клетках и среде культивирования (Мвкднк)- Для 22 образцов необлучённых лимфоцитов МБКднк варьирует от 0.04 до 3.1% (среднее 1.3 ± 1.0%, N = 22). Для образца №23 наблюдалось аномально высокое

количество вкДНКк (Мвкднк = 8%). Для лимфоцитов двух доноров (№23 и №5) была определена концентрация вкДНК соответственно 7 раз и 4 раза в течение 2-х лет. Для донора №23 количество вкДНК в среде культивирования оставалось на протяжении этого периода стабильно высоким (5 - 10%), для донора №5 - стабильно низким (от 0.1 -0.3 %).

После облучения лимфоцитов концентрация вкДНКк варьировала от 5 до 130 нг/мл среды (N = 23) или от 0.1 до 2.6 % от общего количества ДНК. Сравнение распределений М^дик* и МвкДНкК по критерию Манна-Уитни не выявило достоверных различий (р = 0.4; N = 23). Для лимфоцитов 4-х доноров отношение MBKüHKR/MtKMHKK достоверно больше 1 (от 2.5 до 7.1; 4.4 ± 2.2), для 4-х образцов концентрации вкДНК" и вкДНКк примерно одинаковы (р > 0.05). Для ~ 65% образцов детектировано достоверное снижение концентрации вкДНК после облучения (р < 0.05). Отношение вкднк Для этих образцов варьировало от 0.3 до 0.8 (0.6 ± 0.2; N - 15). Таким образом, облучение по-разному влияет на определяемые количества вкДНК" в среде культивирования лимфоцитов здоровых людей.

Содержание повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК* по сравнению с вкДНКк было проанализировано методом сравнительной дот-гибридизации для лимфоцитов двух доноров (№5 и №23). Использовали ДНК-зонды на теломерный. рибосомный повторы и на повтор сателлит III (Iql2). Содержание всех трёх повторов во вкДНК не отличается от такового во

вкДНКк (р > 0.1). Таким

образом, не происходит существенного изменения состава последовательностей вкДНК после облучения лимфоцитов.

Размеры фрагментов вкДНК

и вкДНК . На рис. 1 приведена типичная для образцов вкДНК электрофореграмма. ВкДНК представлена фрагментами от 180 до 20000 п.н. Чётко детектируются длинные фрагменты (~20000 п.н.) и фрагменты длиной 180, 360 п.н. и т.д., соответствующие моно- и олигонуклеосомам.

К 10 сГр 50 сГр

20000—фт:

360- %im mm тш 180 — МЦ Щк

Рис. I Пример электрофореграммы Рис. 2. Линейная корреляция между образцов вкДНКк и вкДНК . Слева изменением количества гиподиплоидных цифрами указана длина фрагментов. клеток (МгкК/МгкК) и уровня активности

каспазы-3 (Акасп. зк/Акасп. Зк).

Д КМ

^кжп. 5 ;-"Ч'жп 3

3.4 t-

4 6 8

мгкК/мпсК

После облучения количество коротких фрагментов увеличивается. "Нуклеосомная лесенка" на электрофореграммах вкДНКк и вкДНКк позволяет предположить, что большая часть вкДНК появляется в среде из апоптотических клеток.

2. Ионизирующее излучение индуцирует апоптоз лимфоцитов

Количество гиподиплоидных клеток, определенное методом проточной цитометрии в необлучённых лимфоцитах (Мгкк), варьирует от 0.6 до 9.3% всех клеток (3.7 ± 2.5%; N = 23). После облучения (10 сГр) MrKR варьирует от 0.7 до 18.9% от общего количества клеток и возрастает для 22 образцов лимфоцитов (р < 0.05 по критерию Манна-Уитни). Увеличение для большинства образцов после облучения количества гиподиплоидных клеток в среднем в 1.5 раза показывает, что получившие повреждение клетки гибнут при последующем культивировании.

Активность каспазы-3 в белковых экстрактах необлучённых лимфоцитов варьирует от 1.5 до 4.9 ед. акт. (3.1 ± 0.9; N = 14). После облучения активность каспазы-3 варьирует от 1.7 до 9.7 ед. акт. (4.4 ± 1.9; N = 14). Сравнение двух распределений по методу Манна - Уитни показало, что при облучении происходит увеличение активности каспазы-3 (р < 0.05). Сопоставление двух параметров', изменение количества гиподиплоидных клеток (MrKR/MrllK) и изменение уровня активности каспазы-3 (Акасп.зК/Акасп,зК) после облучения клеток выявило линейную зависимость (рис. 2). Таким образом, гиподиплоидные клетки - это, прежде всего, апоптотические клетки.

Нуклеазная активность в белковых экстрактах необлучённых лимфоцитов НАК варьирует от 1.4 до 5.2 ед. акт. (3.1 ± 1.5; N = 10). После облучения HAR увеличивается (р > 0.05 для каждой пробы) во всех клетках и варьирует от 1.8 до 7.8 ед. акт. (4.0 ± 1.9; N = 10). Показатель HAR/HAK изменяется от 1.1 до 1.5 (среднее 1.3 ± 0.1), что позволяет сделать вывод об увеличении НА в небольшой субпопуляции клеток культуры после облучения.

Апоптотические клетки - источник вкДНКк. Апоптоз облучённых лимфоцитов играет значительную роль в появлении в среде фрагментов вкДНКк (Choi J.J. et ai, 2005). Блокирование апоптоза ингибитором каспазы-3 (Biotin-DEVD-FMK, 2 мкМ) приводит к снижению в несколько раз концентрации вкДНКк. Для необлучённых клеток количество вкДНКк практически не зависит от присутствия ингибитора (рис. 3).

300

и а

5 200 Э S

Рис. 3. Зависимость концентрации вкДНК от присутствия в среде облучённых клеток ингибитора апоптоза (ВюЦп-ОЕУО-РМК). Приводятся данные для донора №23. Опыт повторён для 4-х доноров.

f ё 100' Т

И о

ингибитор апоптоза

- + 10 сГр

Таким образом, облучение (10 сГр) стимулирует апоптоз в небольшой субпопуляции клеток культуры. Апоптоз сопровождается увеличением НА в клетках и "выщеплением" моно- и олигонуклеосомных фрагментов ДНК из апоптотических клеток. В клеточной популяции увеличивается количество гиподиплоидных клеток, а в среде увеличивается относительное содержание "нуклеосомных" фрагментов.

3. ВкДНКк — фактор сигнализации при радиационном ЭС

Для анализа ответа лимфоцитов на действие малой дозы радиации и для доказательства участия вкДНК в ЭС изучены четыре эффекта, ранее описанные для облучённых клеток. Кроме того, в качестве аналога радиации, который вызывает окислительный стресс без прямого повреждения ДНК (Lubrich А. et а/., 2010), была использована перекись водорода в концентрации 10 мкМ.

1) Перемещение локусов гомологичных хромосом. Известно, что начальная стадия клеточного ответа на действие рентгеновского излучения в малых дозах сопровождается транспозицией центромерных локусов гомологичных хромосом из примембранных областей ядра во внутреннюю и их сближением (Спитковский Д.М. и соавт., 2000, 2003: Abdel-Halim H.l. et al., 2004). Перемещение участков хроматина в ядре многие авторы связывают с регуляцией генной экспрессии в ответ на стресс (Tanabe Н. et al., 2002; Zimber А. et al., 2004; Grattarola M. et al., 2006; Strasak L. et al., 2009). Для регистрации перемещения хроматина использовали маркерный локус lqI2, поскольку ранее было показано, что данный локус в норме располагается примембранно, но при различных повреждающих воздействиях перемещается внутрь ядра (Leger I. et al., 1994; Rupa D.S. et al., 1997; Barki-Celli L. et al., 2005). Использование данного эффекта позволяет количественно проанализировать ранний ответ всей популяции клеток на действие облучения. Положение локусов 1 q 12 в ядрах Go-лимфоцитов человека были определены с помощью метода FISH (см. рис. 4).

А Б

• Л Л ( > ®

Рис. 4. Препарат ядер лимфоцитов после FISH с зондом на участок lql2, общий вид (А). Иллюстрация определяемых параметров: радиус-вектора меток (rl и г2) и радиуса клеточного ядра (Б).

Основной параметр - значение нормированного к радиусу ядра радиус-вектора метки (г). Результат представляли в виде гистограмм кумулятивного частотного распределения сигнала (для 300-500 ядер) по значению г (рис. 5). Большая часть ядер интактных лимфоцитов и лимфоцитов, инкубированных в присутствии среды культивирования интактных клеток или в присутствии вкДНКк, характеризуется максимальными значениями г. Подобный профиль распределения изменяется при воздействии ионизирующего излучения (10 сГр), среды культивирования облучённых лимфоцитов, 10 мкМ Н202, вкДНКк или вкДНК клеток, обработанных Н202 (вкДНКох): уменьшается количество ядер с примембранной локализацией зонда (0.8 < г < 1) и увеличивается число ядер с г < 0.8. Помимо гистограмм распределения, эффект более наглядно может быть охарактеризован табличной величиной (Fr), отражающей частоту встречаемости значений г от 0.8 до 1 в процентах (рис. 6).

ТО 60

й «

: А 100

R , А / / i / ■ V - Ff 80 се" 60 о о 40 ГО

У. 20

—, " 1 ; 0

о 0.2 0.4 0.6

Рис. 5. (А) Кумулятивное частотное распределение гибридизационного сигнала локуса Ц12 по нормированному радиус-вектору г (0 - центр ядра), полученное для контрольных Оо-лимфоцитов (К), подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (Я) и Н202 в концентрации 10 мкМ (Н202). Распределения г для (Я) и (Н202) отличаются от (К): Б = 0.58; а « 10"5, О = 0.55; (х « 10" соответственно. (Б) Распределения г для клеток, обработанных вкДНКк, вкДНКк, вкДНК0Х (50 нг/мл, 3 часа). Распределения г для (вкДНК*) и (вкДНКох) отличаются от вкДНКк (Э = 0.42; а « 10"5) и (Л = 0.44; а « 10"5) соответственно. Использован тест Колмогорова-Смирнова.

40-

К ЮсГрГЬСь 10 ыкМ

[ ÎSD

г ±SD

10й 10° 10' НГ вкДНК

Число кчеюк

вкДНКК-вкДНКох -130 нглш

Гпдрошв ДНКачон-1

п: 21 21 3 1111 7 ' 3 2

Рис. 6. Изменение значений Fr после воздействия на лимфоциты рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (R), Н202 (10 мкМ), среды культивирования облучённых и интактных клеток, а также фрагментов вкДНК из среды интактных (вкДНКк), облучённых (вкДНКк) и обработанных Н202 (вкДНКох) клеток (12 - 130 нг/мл, 3 часа), п - число независимых экспериментов.

В контрольных лимфоцитах Fr составляет - 60. После облучения или воздействия Н202 Fr уменьшаем ся до 10-20 %. При культивировании интактных лимфоцитов в среде облучённых клеток Fr уменьшается до 12-13%, величина эффекта не зависит от количества инкубированных клеток (0.5 - 1.0 • 10". 10' и 104 клеток/мл) которые продуцировали в среду факторы стресс-сигнализации после облучения. Среда интактных клеток не влияет на величину Fr. Таким образом, мы показали, что рассматриваемая клеточная реакция передается необлучённым клеткам по механизму ЭС, благодаря факторам, присутствующим в среде культивирования облучённых клеток. Добавление к интактным клеткам фрагментов вкДНКк и вкДНК0Х вызывает те же эффекты, что и среда культивирования облучённых клеток, а также прямое действие радиации и Н202, величина данного эффекта практически не зависит от концентрации вкДНК1* и вкДНК0Х в интервале 12 - 130 нг/мл. В то же время в присутствии вкДНКк в среде культивирования интактных клеток, описываемые эффекты не наблюдаются. Эти эффекты также отсутствуют, если вкДНКк, обработать ДНКазой-1 ("исчерпывающий" гидролиз).

2) Изменение площади Ag-окраски ядрышка. Ранний ответ лимфоцитов человека на действие радиации в малой дозе (Вейко H.H. и соавт., 2004) и других стимулирующих факторов сопровождается увеличением транскрипции рибосомных генов, что отражается в увеличении площади окрашиваемого серебром материала ядрышка, где локализованы рибосомные гены (Leger I. et al., 1994; Derenzini M., Trere D., 2001). Данный вариант регистрации увеличения активности рибосомных генов позволяет проанализировать поклеточно ответ всей популяции лимфоцитов. После воздействия рентгеновского излучения на лимфоциты в 2-3 раза увеличивается средняя суммарная площадь окрашиваемых серебром ядрышек и их число (рис. 7). Причем величина средней суммарной площади (SAg) более адекватно отражает увеличение активности ядрышка.

п = 1 п =3 п = 3

Рис. 7. Анализ активации рибосомных генов в Оо-лимфоцитах человека, (а) Общий вид окрашенного AgNOз препарата фиксированных ядер лимфоцитов. Примеры анализа ядер с одним (б) и несколькими ядрышками (в, г).

На рис. 8 для сравнения представлены значения 8Аё для ядер лимфоцитов, подвергшихся "прямому" воздействию ионизирующего излучения или Н202, культуральной среды интактных и облучённых клеток, а также вкДНК среды культивирования. В клетках-свидетелях при инкубации в среде облучённых лимфоцитов (независимо от концентрации в ней облучённых клеток-мишеней) в 1.5- 1.7

раза по сравнению с контролем увеличивается 5д«. аналогичные изменения происходят при добавлении вкДНКк и вкДНК0Х.

W <

в! <

ОТ 1-

10 сГр Н2СЬ 10 ыкМ

106 10й 105 104 вкДНК'квкДНК'Кв1ДНКох Число клеток 12-130 нг, мл

п: 12 12 2 1111 S S 4

Рис. 8. Изменение SAg в Go-лимфоцитах человека после воздействия радиации в малой дозе (10 сГр), 10 мкМ Н2С>2, среды культивирования облучённых (0.5 - 1.0 ■ 106, 103 и 104 клеток/мл) и интактных клеток, а также фрагментов вкДНКк, вкДНКк и вкДНК (12 - 130 нг/мл, 3 часа), п - число независимых экспериментов.

(3, 4) Изменение активности TNF-a и концентрации нитрита. В связи с тем, что некоторые исследователи предполагают, что цитокин TNF-a (Morgan W.F., 2003; Natarajan М. et al., 2007; Luce A., 2009) и молекула окиси азота (NO) (Azzam E.I. et a!., 2002; Matsumoto H. et al., 2007, 2010; Morgan W.F., 2010) являются сигнальными факторами в ЭС, было проанализировано изменение активности TNF-a и концентрации метаболита NO - нитрита после воздействия рентгеновского излучения и вкДНК. При прямом действии радиации, как и при добавлении вкД1ТКк, происходит значительное увеличение концентрации цитокина TNF-a. Ионизирующее излучение и фрагменты вкДНК также стимулируют увеличение концентрации нитрита в среде культивирования (рис. 9).

п:

6 К

6 10 сГр

-} вкДНКк

у вкДНК'К-

Активность, TNF-a. отн. ед. 0 12 3 4

[no2]-1

отн. ед.

11:

3- ÍSD

3- +SD

10 сГр вкДНКк вкДНКК

ÍSD

Ц- +SD

Рис. 9. Относительные изменения активности ТЫР-я и концентрации нитритов в среде культивирования после воздействия на лимфоциты радиации в малой дозе (10 сГр) и фрагментов вкДНК из среды интактных (вкДНКк) и облучённых клеток (вкДНКк). п - число независимых экспериментов.

Таким образом. вкДНК, выделенная из среды культивирования облучённых клеток, вызывает те же изменения в интактных лимфоцитах, что и ионизирующее излучение:

(1) перемещение участков гетерохроматина первой хромосомы из примембранных областей ядра во внутреннюю;

(2) активацию транскрипции рибосомных генов;

(3) увеличение активности цитокина TNF-«;

(4) увеличение концентрации метаболита окиси азота.

ВкДНКк можно рассматривать как фактор сигнализации в ЭС, который переносит информацию о повреждающем воздействии от облучённых лимфоцитов -необлучённым.

4. Роль апоптоза в раннем ответе лимфоцитов на действие радиации

Основной источник вкДНКк - апоптотические клетки (Choi J.J. el al., 2005; Ермаков A.B. и соавт., 20076). Блокирование апоптоза облучённых клеток сопровождается снижением концентрации вкДНКк (см. п. 2). Чтобы показать, что свойство вкДНКк быть фактором сигнализации в ЭС зависит от её происхождения из апоптотических облучённых клеток, было исследовано влияние блокирования апоптоза на это свойство. Введение ингибитора (Biotin-DEVD-FMK, 2 мкМ) в среду за 30 мин. до облучения снижает в клетках активность каспазы-3 в 3 раза. Ингибирование апоптоза облучённых лимфоцитов приводит к полной блокировке раннего ответа клеток на действие облучения: локусы 1 q 12 не изменяют своего положения в ядре (рис. 10), и не происходит увеличения площади SAg ядрышка (рис. 11).

0.2 0.4 0.6 0.3

К 10 сГр

п: 21

К 10 сГр +1 о-тгопгор каспазы-3 4 4

7 iSD

вкДНК* ыДНК'К вцЦНК&,г вкДНК^

+ иншошгор каспачы-3

Рис. 10. А - кумулятивное частотное распределение гибридизационного сигнала локуса 1ц12 по нормированному радиус-вектору г полученное для контрольных Оо-лимфоцитов (К) и подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (Я) в отсутствии и присутствии ингибитора каспазы-3. Распределения (К) и (Я) достоверно различаются (О = 0.47; а <<10"5). Б - изменение значений Рг после воздействия на лимфоциты радиации, вкДНКк, вкДНКк (12 нг/мл, 3 часа), а также вкДНК из среды культивирования лимфоцитов, в которых ингибирован апоптоз.

■м, 1 й < со

л.

К 10сГр К 10сГр вкДНКк вкДНК^вкДНК&г вьДНК'Ь,

+ тшгноптор каспагзы-З

+ пнгпопгор каошы-З

и: 12

Рис. 11. Изменение 5дв после воздействия на лимфоциты радиации, вкДНКк, вкДНКк (12 нг/мл, 3 часа), а также вкДНК из среды культивирования лимфоцитов, в которых ингибирован апоптоз.

Если из среды, в которой культивировались облучённые лимфоциты с ингибитором апоптоза, выделить фрагменты вкДНКк и добавить их к интактным клеткам, то они не будут обладать стимулирующей активностью: локусы 1ц12 не меняют своего положения, и не происходит активации ядрышка (рис. 10-11).

Также было показано, что процесс апоптоза важен не только для ответа клеток на действие радиации, но и для развития ЭС в присутствии вкДНКк. Если к клеткам, в которых заблокирован апоптоз, добавить вкДНКя, то, как и при "прямом" действии радиации, не происходит изменения положения локусов Ц12 и увеличения 5д8 (табл. 1).

Таблица 1.

Изменение положения локуса Ц12 и величины 8Кае в ядрах лимфоцитов, культивируемых в присутствии вкДНКк, вкДНК и ВкШп-ОКХТММК

Варианты опытов Ег, % 8 Аа / ^ а£

Контроль Вюйп-ОЕУО-ЕМК Контроль Вюйп-ОЕУО-ЕМК

вкДНКк (12 нг/мл) 66 ±2 69 ±3 1.0± 0.1 1.1 ± 0.1

вкДНКк(12 нг/мл) 12 ±2* 69 ±1 2.7 ±0.3** 1.2 ± 0.1

(*) а « 10-; (**)р < 0.001 (Шест)

Активность. ЮТ-а, отн. ед.

К Н

[Ш2] . отн. ед 1 5 3

4.5

}

вкДНК'К

Бю(ш-ШЛФ-ИШС

К*

вкДНК'К-

ВюВи-галтз-шк вкДНК^

Рис. 12. Изменение активности Т№-а: и концентрации нитрита в среде культивирования, после воздействия на лимфоциты вкДНКк, вкДНКа, а также при добавлении вкДНК8' к лимфоцитам, в которых заблокирован апоптоз ингибитором ВюНп-ОЕУЭ-РМК. (*) р < 0.05 (СГ-тест).

Блокирование апоптоза при действии вкДНКк на лимфоциты сопровождается также блокированием другого эффекта - синтеза дополнительных количеств N0, который наблюдается в отсутствии ингибитора апоптоза. Активность цитокина TNF-a при таких условиях (вкДНК11 + ингибитор) по-прежнему возрастает (рис. 12) по сравнению с контролем. Таким образом, апоптоз облучённых клеток является важной составляющей в реализации эффекта свидетеля и в появлении у вкДНК способности быть фактором сигнализации в ЭС.

5. Роль АФКиА в раннем ответе лимфоцитов иа облучение

Ионизирующая радиация может оказывать прямое воздействие на ДНК, вызывая одно- и двунитевые разрывы при непосредственном попадании частицы в её макромолекулу, и непрямое, опосредуемое активными формами кислорода и азота (АФКиА), возникающими в процессе ионизации (Leach J.К. et al., 2001; Morgan W.F., Hartmann A., 2002; Slupphaug G., 2003: Lubrich A. et ai, 2010). Чтобы понять значение синтеза АФКиА в раннем ответе клеток на радиацию, было исследовано сравнительное действие на лимфоциты радиации в малых дозах и Н202 в малых концентрациях (см. рис. 5 и 6). Дополнительно была исследована реакция лимфоцитов на перечисленные выше воздействия в присутствии ингибитора АФКиА - а-токоферола (Меньшикова Е.Б. и соавт. 2006).

Рис. 13. Кумулятивное распределение гибридизационного сигнала локуса 1 q 12 по радиус-вектору г, полученное для Go-лимфоцитов в присутствии а-токоферола (10 мкМ): контрольных (К), подвергнутых воздействию радиации в дозе 10 сГр (R) и 10 мкМ Н202 (Н202). Распределения значений г для (R) и (Н202) статистически не отличаются от (К): D = 0.05; а = 0.8.

40-

К 10 сГрН^СЬ ВКДНККВКДНКЕВКДНК°Х 10 шМ

+ «-токоферол + а-мкоферод 3 3 3 2 2 2

К 10 сГрН2<:ь Екднт^вкднжквкдш;1'« 10 мкМ

+ «-токоферол + «-токоферол

+ «-токоферол

Рис. 14. Отсутствие достоверных изменений значений рг и 5де после воздействия на лимфоциты радиации, Н202, вкДНКк, вкДНКк, вкДНК0Х (12 нг/мл, 3 часа) в присутствии а-токоферола (100 мкМ). и - число независимых экспериментов.

После воздействия и радиации и 10 мкМ Н202 уменьшается количество ядер с примембранным расположением локусов и возрастает суммарная площадь SAg в ядре. Такие же изменения происходят при добавлении в среду интактных клеток вкДНК* и вкДНКох (см. рис. 5, 6, 8). Блокирование АФКиА а-токоферолом полностью подавляет обе клеточные реакции как в случае прямых повреждений, так и при действии вкДНКк или вкДНКох (рис. 13, 14). Таким образом, синтез АФКиА - одна из главных составляющих ответа лимфоцитов и на "прямое" действие радиации и в реализации ЭС, опосредуемом вкДНКк.

6. ДНК-узнающие рецепторы, опосредующие действие вкДНК11

Возникает вопрос, каким образом фрагменты вкДНК& (вкДНКох) влияют на клетки-свидетели? Для развития в клетках-свидетелях аналогичных с облучёнными лимфоцитами эффектов необходим контакт реципиентов с факторами сигнализации. Можно предположить, что в передаче сигнала при ЭС участвуют известные клеточные рецепторы TLR9, которые могут взаимодействовать с некоторыми из фрагментов вкДНК*. (Hemmi Н. et al., 2000; Ahmad-Nejad Р. et al., 2002; Latz E. et al., 2004; Tobias P., Curtiss L.K., 2005; Krieg A.M., 2008; Hennessy E.I. et al., 2010; Barber G.N., 2011). Образование комплекса "ДНК-Т1Л19" инициирует клеточный сигнальный путь, связанный с активацией фактора транскрипции NF-xB посредством участия адаптерной молекулы MyD88, что сопровождается, в том числе, и синтезом АФКиА. Чтобы проверить предположение об участии TLR9 в развитии ответа клеток на облучение, проведены два эксперимента. В первом опыте измерялись относительные количества мРНК TLR9 и MyD88. Во втором опыте TLR9 блокировали двумя типами ингибиторов: хлорокином (изменяет pH в эндосомах, где и реализуется взаимодействие ДНК с TLR9) и олигонуклеотидом-супрессором 2088 (конкурент за связывание лигандов с TLR9, (Duramad О. et al., 2005)). Для оценки изменения количества мРНК TLR9 и MyD88 с помощью обратной транскриптазы из клеточной РНК была получена кДНК. Количество кДНК определяли методом количественной ПЦР (вариант TaqMan), внутренний стандарт - ген GAPDH, рис. 15.

Ионизирующая радиация в малой дозе стимулирует в лимфоцитах экспрессию генов TLR9 и MyD88 в 3-4 раза. В присутствии П202 также увеличивается количество мРНК этих генов в 1.5 - 4 раза в зависимости от концентрации агента (рис. 15, А). Аналогичное действие на экспрессию генов TLR9 и MyD88 в лимфоцитах оказывает вкДНКк (12 нг/мл), рис.15, Б. Для сравнения использовался классический лиганд для TLR9 - ДНК E.coli. (Hemmi Н. et al., 2000). Во всех перечисленных случаях наблюдается достоверное увеличение в несколько раз количества мРНК TLR9 и MyD88. При блокировании TLR9 олигонуклеотидом 2088 (3 мкг/мл) или хлорокином (2 мкг/мл) в лимфоцитах-свидетелях не происходит изменений примембранной локализации локусов lql2 после добавления фрагментов вкДНКк (табл. 2). Однако активация ядрышка имеет место: после внесения в инкубационную среду вкДНКк, средняя площадь окрашенных серебром участков в ядрах возрастает в 2.3 и 2.7 раза при использовании соответственно хлорокина или олигонуклеотида. Добавление в культуральную среду необлучённых лимфоцитов олигонуклеотида или хлорокина не приводит к транспозиции локусов хромосом или активации ядрышка.

TLR9MyD88 TLR9 MyD88 TLR9 MyD88 TLR9 MyD88

К ЮсГр НдСЬ H;0;

10 ыкМ IOOmkM

TLR9 MyD88 TLR9 MyD88 TLR9 MyD88 TLR9MyD88

К виДНКк ei<IHKk ДНК E noli

12 нг мл 7

12 НГ Ш

1 fl НГ МЛ

Рис. 15. Изменение количества мРНК 7ХД9 и МуЮ88 при действии на лимфоциты радиации, Н2О2 (А), а также при воздействии разных образцов ДНК (Б). Значения нормированы на величину в контроле. Время инкубации - Зчаса. Все варианты достоверно отличаются от контроля (К и вкДНКк), р < 0.05. п - число независимых экспериментов.

Таблица 2.

Изменение значений Рг и 5Лц при культивировании лимфоцитов с вкДНК в присутствии

ингибиторов ТЫ*9

Опыт F„ % ^ Ац ' J Ае

контроль хлорокин onnroN 2088 контроль хлорокин олиг-oN 2088

вкДНКк 66 ±2 66 ± 1 68 ±3 0.8 ±0.1 1.2± 0.1 1.3 ± 0.1

вкДНКк 12 ±2* 63 ±2 69 ± 1 2.7 ±0.2 ** 2.3 ±0.2 ** 2.7 ±0.2 **

(*) а « 10'6; (**) р < 0.001 (t-mecm)

При блокировке рецепторов TLR9 не происходит увеличения активности TNF-a и увеличения концентрации нитрита в присутствии вкДНКя по сравнению с контролем (рис. 16). Очевидно, в реализации стимулирующего действия вкДНКк на синтез TNF-a и окиси азота лимфоцитами-свидетелями задействован клеточный сигнальный путь, связанный с рецепторами TLR9.

Активность, TNF-П, MEмл О J 8

вкДНКк вкДНКК-

хпороыш вкДНК11 OJHITON

ЕКДНЬК

[N03]". мкМ

10 20

Рис. 16. Влияние ингибирования Т1П9 хлорокином (2 мкМ) и олигонуклеотидом 2088 (3 мкг/мл) на способность вкДНКк стимулировать увеличение активности ТОТ-а и концентрации нитритов в среде культивирования (вкДНКк, 50 нг/мл, 3 часа). (*) - обозначены варианты, которые достоверно отличаются от контроля (р < 0.05) (У-тест). п = 3.

Таким образом, в ответе клеток на действие радиации и вкДНКк (ЭС) участвуют известные ДНК-узнающие рецепторы TLR9. 11оскольку некоторые из реакций (активация ядрышка) не блокируются ингибиторами TLR9 в облучённых лимфоцитах и лимфоцитах-свидетелях, то можно предположить наличие дополнительных ДНК-узнающих рецепторов иной природы.

7. Состав вкДНК влияет на эффекты, индуцируемые ионизирующей радиацией в

лимфоцитах человека

Для ответа на вопрос о возможности моделирования клеточного ответа на воздействие радиации путём изменения состава последовательностей вкДНК, была проведена серия опытов, в которых на лимфоциты одновременно действовали ионизирующим излучением (10 сГр) и модельными фрагментами CpG-ДНК. В качестве источника CpG-ДНК использовали линеаризованную плазмиду, содержащую фрагмент ТОрДНК (участок от -515 до 5321 нуклеотидов в соответствии с HSU 13369, "GeneBank") и встроенную в вектор pBR322. Препарат вводили в конечной концентрации 50 нг/мл. После облучения клеток и последующего их культивирования в среде, содержащей CpG-ДНК, профиль распределения г приближается к таковому для неэкспонированных лимфоцитов (рис. 17, А). Также не происходит увеличения площади серебрящегося материала (рис. 17, Б).

800

600

Йч

toi. 1- 400 со '

200

К 10 сГр ТОрДНК.

10 сГр

Рис. 17. Изменение положения прицентромерного гетерохроматина локусов lq 12 и площади SAg в ядрах Go-лимфоцитов человека после облучения (10 сГр) или совместного воздействия радиации и рибосомного повтора (10 сГр + ТОрДНК). Распределения значений г для (10 сГр) и (10 сГр + ТОрДНК) статистически отличаются от (К): D = 0.61; а « 10"5 и D = 0.51; а « 10'4 соответственно; (*) р < 0.05 (U-тест), п=3.

Совместное действие радиации и рибосомного повтора значительно снижает экспрессию 7ХЛ9 и МуВ88 (рис. 18, А). После совместного действия радиации и рибосомного повтора на лимфоциты уровень активности ТОТ-а значительно возрос по сравнению с контрольным (рис. 18, Б).

I 4

о о

Активность. Т№-я. отн ед О 12 3 4 5

ТШ9Му088 ТЫ9МуБ88 ТШ9МуВ88

К 10 сГр

10 сГр

ТОрДНК. 10 сГр

Рис. 18. А - изменение количества мРНК Т1Л9 и Муй88 при действии рентгеновского излучения (10 сГр) или совместного действия радиации и рибосомного повтора (10 сГр + ТОрДНК). Значения нормированы на величину в контроле. Все варианты достоверно отличаются от контроля, р < 0.05, п = 3. Б - изменение активности ТЫБ-а в инкубационной среде при аналогичных условиях. (*) - (р < 0.05) (и-тест), и = 3.

Таким образом, ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения может быть различным, при изменении состава вкДНК в среде облучённых клеток, например, путем введения последовательностей, содержащих Срв-повторы.

8. Заключение

В ходе проведённой работы были проанализированы эффекты, сопровождающие ранний (3 часа) клеточный ответ на повреждающее воздействие, которые сравнивались с клеточными реакциями на действие депротеинизированных образцов внеклеточной ДНК, выделенной из среды культивирования клеток. Анализ этих результатов позволил предложить схему развития раннего ответа всей клеточной популяции на действие ионизирующего излучения в малой дозе (рис. 19). Интактные лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, исходно содержат поврежденные/апоптотические клетки. Культивирование этих клеток приводит к потере части хроматина. Фрагменты хроматина из таких клеток переходят в среду культивирования и образуют пул вкДНКк (рис. 19, клетка №4). Через 3 часа от начала культивирования количество гиподиплоидных клеток составляет в среднем 3% от числа клеток всей популяции, количество вкДНКк в среде - около 1% от суммарного количества ДНК клеток.

Частицы высоких энергий при облучении проходят через определённое количество клеток популяции (зависящее от дозы излучения) и вызывают первичные эффекты - повреждение биомолекул, в том числе индукцию одно- и двунитевых разрывов ДНК, и окислительный стресс (ОС). В экспонированных клетках активируются системы репарации. Повреждения, связанные с двунитевыми разрывами и окислительной модификацией ДНК, будут удалены, при этом есть вероятность, что в геноме такой клетки возникнут мутации (рис. 19, клетка №1). При невозможности репарации серьезных повреждений клетка гибнет по механизму апоптоза (рис. 19, клетка №3), и в среде появляются фрагменты вкДНКк. Основное отличие этих фрагментов от вкДНКк - это повреждение ДНК. Химическая природа повреждений

ДНК в условиях окислительного стресса, вызванного радиацией или другим индуктором ОС (например, перекисью водорода), очень хорошо изучена (Dizdaroglu М.. 1992; Breen А.Р.. Murphy J.A.. 1995; De Bont R.. van Larebeke N., 2004; Radulescu I. et al., 2004; Shi S. et al., 2007; Falk M. et al., 2008). Основная модификация - это образование 8-оксогуанозина и. в меньшем количестве, тимидингликоля. Кроме того, образуются внутри- и межмолекулярные сшивки, одно- и двунитевые разрывы. Очевидно, именно благодаря окислительной модификации, вкДНКк (а также вкДНК0Х из среды клеток, обработанных перекисью) приобретает особые, по сравнению с вкДНКк, свойства - она становится фактором стресс-сигнализации в клеточной культуре.

Рис. 19. Гипотетическая схема развития раннего ответа лимфоцитов на ионизирующее излучение в малых дозах.

Чтобы в популяции лимфоцитов наблюдались эффекты, связанные с облучением, необходимо обязательное соблюдение двух условий: (1) присутствие в клетке активных форм кислорода и азота (т.е. возможность окислительной модификации клеточной ДНК) и (2) протекание процесса апоптоза повреждённых клеток (т.е. переход ДНК апоптотической клетки в среду культивирования). Блокирование хотя бы одного из процессов - увеличения количества АФКиА (а-токоферолом) или апоптоза (ингибитором каспазы-3) приводит к тому, что вся клеточная популяция перестает отвечать развитием реакций раннего ответа на действие радиации. Таким образом, с точки зрения рассматриваемых в представленной работе клеточных реакций

(перемещение локуеов хромосом, активация ядрышка, увеличение активности в среде TNF-a и количества N0), "ранний ответ" лимфоцитов на облучение обязательно включает в себя эффект свидетеля, опосредуемый фрагментами "окисленной" вкДНК. Показано, что способность вкДНКк стимулировать в интактных клетках эффекты, сходные с действием радиации, не является результатом существенного изменения её состава по сравнению с вкДНКк. Не обнаружено изменения содержания трёх повторов генома во вкДНКк и вкДНКкпо сравнению с геномной ДНК, выделенной из клеток.

Фрагменты вкДНКк "выщепляются" эндонуклеазами из хроматина апоптотических клеток в среду культивирования, где взаимодействуют с ДНК-узнающими рецепторами интактных клеток (рис. 19, III). В литературе рассматривают несколько вариантов взаимодействия вкДНК с клеткой (Vlassov V.V. et ai, 2007). Наиболее изучено взаимодействие вкДНК с рецепторами хорошо охарактеризованного семейства TLR (TLR9). Оказалось, что три исследованных эффекта (перемещение локуеов хромосом, увеличение активности в среде TNF-a и количества N0) зависят от активности этих рецепторов. Введение в клетки двух известных ингибиторов TLR9 (хлорокин и олиго(М 2088) приводит к блокированию перечисленных эффектов. Стимуляцию сигнального пути, связанного с активацией TLR9 при действии радиации (опосредованном вкДНК11), дополнительно подтверждают данные об увеличении экспрессии на уровне транскрипции двух основных участников ответа: белка TLR9 и белка-адаптора этого сигнального пути (MyD88). Но один эффект - активация транскрипции рибосомных генов - не зависит от присутствия ингибиторов TLR9. Таким образом, можно предположить, что имеются альтернативные пути воздействия вкДНКк на интактные лимфоциты. Существование других типов рецепторов, опознающих фрагменты ДНК, было уже показано в ряде недавних работ других авторов (Wang L. et al., 2008; Barber G.N., 2011).

Достаточно трудно, при имеющихся неполных наших и литературных данных, ответить на вопрос о причинах появления у окисленной ДНК (вкДНК"' и вкДНК0Х) свойства выступать в роли лиганда TLR9. Этот вопрос требует дальнейшего исследования. Возможно, что TLR9 активируются не в результате связывания с лигандом, а в результате стимуляции другого клеточного каскада, звеном которого является путь, связанный с TLR9. Более вероятным, однако, кажется следующее объяснение. Окислительная модификация ДНК может приводить к нарушению баланса последовательностей лигандов и последовательностей ингибиторов TLR9 в составе геномной ДНК. Известно, что окисление гуанозина до 8-оксогуанозина идет преимущественно в составе последовательностей G„ (Murata M., Kawanishi S., 2002; Oikawa S. et al., 2002), но именно эти повторы являются эффективными ингибиторами связывания лигандов с TLR9 (Peter M. et al., 2008). В интактной ДНК в среднем, по очень заниженным подсчетам, на 1 последовательность-лиганд приходится 10-15 последовательностей-ингибиторов (Костюк C.B. и соавт., 2010). Реально это соотношение для геномной ДНК млекопитающих ещё выше, поскольку лигандом для TLR9 является только неметилированная CpG-содержащая последовательность, которой немного в ДНК вследствие высокого уровня её метилирования. Если ингибиторы G„ будут преимущественно модифицированы окислением и не смогут связаться с TLR9, чтобы их заблокировать, то способность ДНК к взаимодействию с TLR9 должна возрасти. Эта очень интересная гипотеза будет проверена в ближайшее время.

Взаимодействие Т1Л9 с лигандами запускает в клетке каскад событий, сопровождающийся синтезом АФКиА. Стимуляция рецепторов ТЬЯ9 сопровождается образованием радикала 02'" (Неппеке Р. с( а!., 2002), выделением N0' и АФК (А<ЗасЫ У. е1 а!., 2006), в том числе пероксинитрита ^огэеГ Ь. еI а!., 2006). Образующиеся малоактивные 02'", N0' или Н202 в результате последовательных ферментативных процессов с участием металлосодержащих комплексов могут давать начало высокореакционным соединениям: 'ОН, гипогалогенным кислотам и Ч_)2. N0* и N0/ (Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006). На возможное участие в ЭС реакции Фентона указывают также в работе (Ма1зшпо1о Н. е! а!., 2007).

Таким образом, взаимодействие белков-рецепторов ТЬЯ9 с фактором стресс-сигнализации в составе вкДНКк сопровождается вторичным ОС в клетках-свидетелях, в отличие от первичного ОС, вызванного прямым действием радиации. Очевидно, что вторичный ОС индуцирует в небольшом числе клеток те же события, что и первичный ОС - окислительную модификацию ДНК и гибель клеток с высоким уровнем повреждений продуктами ОС. Уровень гибели клеток при вторичном ОС будет ниже, чем при первичном действии радиации, т.к. повреждение клеток не осложняется наличием двунитевых разрывов. По-видимому, в результате активации в клетках антиокислительных систем со временем ответ на однократное действие радиации будет уменьшаться, поскольку будет снижаться уровень окислительной модификации ДНК и количество апоптотических клеток, которые являются донорами активных фрагментов вкДНК. Данные, полученные в предыдущих исследованиях, показывают, что наблюдаемые эффекты детектируются спустя 1-6 часов после облучения, а через 24 часа уменьшаются (Спитковский Д.М., 2005). Важно отметить, что способность вкДНКк индуцировать в клетках-свидетелях наблюдаемые эффекты не зависит от концентрации вкДНКк (в проверенном диапазоне от 12 нг/мл до 130 нг/мл), но зависит от синтеза АФКиА и апоптоза. Это подтверждает предположения о "третичном" окислительном стрессе и апоптозе, который посредством вкДНКох "поддерживает" сигнал от первичного (радиация) и вторичного (вкДНКк) воздействия.

Таким образом, в ходе данного исследования показано, что внеклеточная ДНК, донором которой служат погибшие вследствие первичного повреждающего воздействия апоптотические клетки, действительно является растворимым фактором стресс-сигнализации в реализации эффекта свидетеля, вызванного действием ионизирующей радиации в малой дозе.

Описанная схема развития раннего ответа на ионизирующее излучение в популяции лимфоцитов была подтверждена для других типов культивируемых клеток человека в работах, проведенных в лаборатории молекулярной биологии МГНЦ РАМН. Эта схема справедлива для эндотелиальных клеток культуры НиУЕС (Егтакоу А.У. е1 а!., 2011) и для мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (Егтакоу А.У. е1 ей., 2011а; Ермаков А.В. и соавт., 2010).

Очевидно, предложенная схема может объяснить не только действие радиации на популяцию лимфоцитов, но и некоторые другие эффекты, связанные с индукцией окислительного стресса в клеточных культурах и в организме. Например, недавно было показано, что вкДНК больных острым инфарктом миокарда (который всегда сопровождается высоким уровнем ОС) оказывает сильное биологическое действие на культивируемые клетки (нейроны крысы (ЕГгетоуа Ь.У. е1 а!., 2010)) и клетки НиУЕС (Алексеева А.Ю. и соавт., 2010). ВкДНКох из апоптотических (вследствие ОС) клеток

может выступать в организме в роли агента, непрерывно поддерживающего ОС. Это особенно актуально при патологии, сопровождающейся высоким уровнем ОС, а также при старении. В рамках настоящей работы показано, что изменение свойств вкДНК (например, добавление последовательностей ингибиторов или лигандов TLR9) может существенно изменить эффекты, индуцируемые ионизирующей радиацией.

ВЫВОДЫ

1. Действие ионизирующего излучения в малой дозе на лимфоциты человека сопровождается увеличением в среднем в 1.5 раза количества апоптотических клеток и увеличением эндонуклеазной активности клеток. В результате в среде культивирования появляется внеклеточная ДНК с изменёнными свойствами.

2. Внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых лимфоцитов - значимый фактор стресс-сигнализации при развитии эффекта свидетеля в клеточной популяции.

3. Для проявления сигнальной функции вкДНК, в облучённых лимфоцитах должны соблюдаться два основных условия: синтез активных форм кислорода/азота и апоптоз облучённых клеток.

4. В реализации сигнальной функции вкДНК в облучённых лимфоцитах принимают участие рецепторы TLR9.

5. Ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения в малых дозах зависит от содержания во вкДНК GC-богатых последовательностей генома.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. M.S. Konkova, A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, N.A. Egolina, E.M. Malinovskaya, N.N. Veiko. The cell-free DNA fragments are factors of stress-signaling from irradiated to non-irradiated human lymphocytes after exposure by low doses of the X-radiation. // CNAPS-V ("Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum"): Abstracts. - Moscow. - 2007. - P. 16.

2. A.B. Ермаков, M.C. Конькова, C.B. Косткж, H.A. Еголина, H.A. Ляпунова, H.H. Вейко. Ранние изменения пространственной организации хроматина лимфоцитов человека при действии повреждающих факторов. // Цитология - 2007. - Т.49, № 9 - С. 744-745.

3. A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, Е.С. Ершова, H.A. Еголина, H.H. Вейко. Фрагменты внеклеточной ДНК из среды инкубирования лимфоцитов человека, облученных в малых дозах, запускают развитие окислительного стресса и адаптивного ответа в необлученных лимфоцитах-свидетелях. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48, № 5. - С. 553-564.

4. A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, H.A. Еголина, H.H. Вейко. Значение окислительного стресса для развития адаптивного ответа в облученных лимфоцитах человека и необлученных лимфоцитах-свидетелях после воздействия ионизирующей радиации в малых дозах. // Сборник трудов 1Усъезда Рос. Общества биохимиков и мол. биологов. - Новосибирск. - 2008, - С. 201.

5. A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, M.S. Konkova, N.A. Egolina, E.M. Malinovskaya, N.N. Veiko. Factors of stress signaling X-irradiated and noniradiated human lymphocytes. // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2008 -V. 1137. - P. 41-46.

6. M.S. Konkova, A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, L.V. Efremova, N.A. Egolina, N.N. Veiko. Low-dose X-ray induces an adaptive response in unirradiated bystander lymphocytes by DNA-signaling pathway. // 37ts Annual Meeting of the European Radiation Research Society: Abstracts. - Prague. - 2009. - P. 109.

7. M.C. Конькова, A.B. Ермаков, С.В. Костюк, Л.В. Ефремова, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко. После воздействия рентгеновского излучения в малой дозе на лимфоциты человека посредством ДНК-сигнального пути в необлучённых лимфоцитах-свидетелях начинает развиваться адаптивный ответ. // Материалы Международной конференции "Биологические эффекты малых доз радиации и радиоактивное загрязнение среды". -Сыктывкар. - 2009. - С. 69-70.

8. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко. CpG-ДНК ингибирует клеточные реакции, сопровождающие развитие адаптивного ответа в лимфоцитах человека после воздействия рентгеновского излучения в малых дозах. // Радиационная биология. Радиоэкология - 2009. - Т. 49, № 1. - С. 34-41.

9. A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, N.A. Egolina, L.V. Efremova, N.N. Veiko. Oxidative stress as a significant factor for development of an adaptive response in irradiated and nonirradiated human lymphocytes after inducing the bystander effect by low-dose X-radiation. // Mutation Research. - 2009. - V. 669, № 1-2. - P. 155-161.

10. M.S. Konkova, A.V. Ermakov, L.V. Efremova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko. Low-doses x-ray induces an adaptive response in human mesenchymal stem cells. // CNAPS-VI ("Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum"): Abstracts. - Hong Kong. - 2009. - P. 23.

11. A.B. Ермаков, M.C. Конькова, A.B. Ермаков, С.В. Костюк, E.C. Ершова, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Л.В. Ефремова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко. Реакция раковых стволовых клеток человека на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах. // Радиационная биология. Радиоэкология - 2009. - Т. 49, № 5. - С. 528-537.

12. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Р.Н. Вейко, И.Ю. Кубасова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко. Развитие эффекта свидетеля в мезенхимальных стволовых клетках человека после воздействия рентгеновского излучения в адаптирующей дозе.// Радиационная биология. Радиоэкология - 2010. -Т. 50, № 1.-С. 42-51.

13. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Н.Н. Вейко. Развитие эффекта свидетеля индуцированного малой дозой ионизирующего излучения в мезенхимальных стволовых клетках человека. // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. - Медицинская генетика. - 2010. - С. 90.

14. С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Ефремова, М.С. Конькова, А.Ю. Алексеева, Л.В. Каменева, Н.Н. Вейко. Увеличение экспрессии INOS в эндотелиальных клетках человека при длительном культивировании с фрагментами внеклеточной ДНК. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 9. - С. 151-156.

15. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Н.Н. Вейко. Структурно-функциональные изменения хроматина, индуцированные воздействием радиации, сопровождают развитие эффекта свидетеля в разных типах клеток человека. // Материалы XVI Всероссийского симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Цитология. - 2010. - Том 52, № 8. - С. 664.

16. М.С. Конькова, Л.В. Ермаков, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, J1.B., Н.Н. Вейко. Фрагменты внеклеточной геномной ДНК - фактор стресс-сигнализации при радиационном эффекте свидетеля, развивающегося в моиослойной культуре клеток человека. // Материалы VI съезда по радиационным исследованиям. Москва. - 2010. -С. 37.

17. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Н.Н. Вейко. Реакция эндотелиоцитов человека на воздействие рентгеновского излучения в малой дозе. // Материалы 4 международной школы молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки". - Москва. - 2010. - С. 118-120.

18. M.S. Konkova, A.V. Ermakov,L.V. Efremova, S.V. Kostyuk, N.N. Veiko. Influence of X-ray and/or CpG-DNA induced oxidative stress on adaptive response in human lymphocytes. // International Journal of Low Radiation. -2010. - Vol. 7, № 6. - P. 446-452.

19. A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Efremova, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko. Development of the adaptive response and bystander effect induced by low-dose ionizing radiation in human mesenchymal stem cells. // in book: Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. Springer. - 2011. - P. 225-231.

20. E.M. Malinovskaya, S.V. Kostyuk, A.V. Ermakov, M.S. Konkova, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, L.V. Efremova, A.Yu. Alekseeva, L.N. Lyubchenko, N.N.Veiko. Fragments of cell-free DNA (cfDNA) enhance transcription activity in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and inhibit their in vitro differentiation. // in book: Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. Springer. - 2011. - P. 199-205.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФКиА - активные формы кислорода и азота; ;

вкДНК - внеклеточная ДНК;

вкДНКк- фрагменты вкДНК, выделенные из среды необлучённых клеток; вкДНКк - фрагменты вкДНК, выделенные из среды облучённых клеток; НА - нуклеазная активность; ОС - окислительный стресс;

ТОрДНК - транскрибируемая область рибосомного повтора;

ЭС - эффект свидетеля;

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ;

MyD88 - миелоидный фактор дифференцировки;

TLR9 - "toll-like" receptor 9;

TNF-a - фактор некроза опухоли.

Подписано в печать:

11.04.2011

Заказ № 5303 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Конькова, Марина Сергеевна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Малые дозы радиации.!.

1.2. Радиационно-индуцированный адаптивный ответ.

1.3. Эффект свидетеля.

1.4. Окислительный стресс.

1.5. Апоптоз.

1.6. Внеклеточная ДНК человека.

1.6.1. Происхождение внеклеточной ДНК в организме человека.

1.6.2. Концентрация внеклеточной ДНК.

1.6.3. Изменение содержания различных последовательностей во вкДНК.

1.6.4. Модификация оснований внеклеточной ДНК.

1.6.5. Взаимодействие фрагментов внеклеточной ДНК с клетками.

1.7. Рецепторы ТЬЯ9.

1.7.1. Природные и синтетические лиганды для белков ТЬЯ9.

1.7.2. Ингибиторы взаимодействия СрС-ДНК с ТЬЫ9.

1.7.3. Пути передачи сигнала через ТЫ19.

1.8. Белки нуклеоскелета.

1.9. Формулировка задач исследования.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.1.1. Выделение лимфоцитов.

2.1.2. Облучение, обработка и инкубирование лимфоцитов для выявления эффекта свидетеля.

2.1.3. Ингибирование активности каспазы-3.

2.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода.

2.1.5. Ингибирование окислительного стресса.

2.1.6. Приготовление клеточных препаратов.

2.2. Цитохимические методы.

2.2.1. Нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH).

2.2.2. Анализ конформации ядрышка.

2.2.3. Анализ изображений.

2.3. Определение свойств внеклеточной ДНК.

2.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК из среды инкубации лимфоцитов и их электрофорез.

2.3.2. Определение концентрации повторяющихся последовательностей генома человека в образцах вкДНК.

2.3.3. Обработка образцов вкДНК ДНКазой-1.

2.4. Биохимические методы.

2.4.1. Выделение РНК из культивируемых лимфоцитов.

2.4.2. Определение концентрации РНК.

2.4.3. Определение ферментативной активности каспазы-3.

2.4.4. Определение нуклеазной активности клеточных лизатов.

2.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде

2.5. Иммунологический метод.

2.5.1. Оценка активности фактора некроза опухоли (TNF-a).

2.6. Ингибирование рецепторов.

2.7. Оценка уровня экспрессии генов TLR9 и MyD88 методом ПЦР в реальном времени.

2.8. Определение количества гиподиплоидных клеток.

2.9. Статистическая обработка.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Ионизирующее излучение в малых дозах стимулирует апоптоз лимфоцитов в культуре.

2.1.3. Ингибирование активности каспазы-3.

2.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода.

2.1.5. Ингибирование окислительного стресса.

2.1.6. Приготовление клеточных препаратов.

2.2. Цитохимические методы.

2.2.1. Нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH).

2.2.2. Анализ конформации ядрышка.

2.2.3. Анализ изображений.

2.3. Определение свойств внеклеточной ДНК.

2.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК из среды инкубации лимфоцитов и их электрофорез.

2.3.2. Определение концентрации повторяющихся последовательностей генома человека в образцах вкДНК.

2.3.3. Обработка образцов вкДНК ДНКазой-1.

2.4. Биохимические методы.

2.4.1. Выделение РНК из культивируемых лимфоцитов.

2.4.2. Определение концентрации РНК.

2.4.3. Определение ферментативной активности каспазы-3.

2.4.4. Определение нуклеазной активности клеточных лизатов.

2.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде.

2.5. Иммунологический метод.

2.5.1. Оценка активности фактора некроза опухоли (TNF-a).

2.6. Ингибирование рецепторов.

2.7. Оценка уровня экспрессии генов TLR9 и MyD88 методом ПЦР в реальном времени.

2.8. Определение количества гиподиплоидных клеток.

2.9. Статистическая обработка.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Ионизирующее излучение в малых дозах стимулирует апоптоз лимфоцитов в культуре.

3.1.1. Концентрация вкДНКк и вкДНКк в среде культивирования

3.1.2. Количество гиподиплоидных клеток.

3.1.3. Активность каспазы-3 в белковых экстрактах.

3.1.4. Размеры фрагментов вкДНКк и вкДНКк.

3.1.5. Нуклеазная активность в белковых экстрактах.

3.1.6. Содержание некоторых повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК11 по сравнению с вкДНКк.

3.2. Эффекты, индуцируемые ионизирующей радиацией в малых дозах в лимфоцитах человека.

3.2.1. Изменение положения локусов гомологичных хромосом в ядрах облучённых лимфоцитов.

3.2.2. Изменение

§^ЯОР после действя ионизирующей радиации.

3.2.3. Роль апоптоза в раннем ответе лимфоцитов на действие радиации.

3.2.4. Роль активных соединений кислорода и азота в раннем ответе клеток на облучение.

3.2.5. Увеличение активности ТЫ-а и количества метаболита N0 в среде культивирования облучённых лимфоцитов.

3.2.6. Среда облучённых лимфоцитов индуцирует в лимфоцитах ЭС.

3.3. ВкДНК облучённых клеток - фактор стресс сигнализации в ЭС.

3.3.1. ВкДНКк индуцирует в лимфоцитах человека ЭС.

3.3.2. Окислительный стресс и апоптоз облучённых лимфоцитов

- причина появления у вкДНКя новых свойств.

3.3.3. Роль АФКиА и апоптоза в ответе интактных клеток на действие вкДНКа.

3.4. ДНК-узнающие рецепторы, опосредующие действие вкДНКк.

3.4.1. Изменение количества мРНК белков ТЬЯ9 и МуБ88 при действии радиации, Н2О2 и вкДНК

3.4.2. Влияние блокировки TLR9 в лимфоцитах на эффекты, вызываемые вкДНК*.

3.5. Влияние изменения состава вкДНК на эффекты, индуцируемые ионизирующей радиацией в лимфоцитах человека.

3.5.1. Изменение положения локусов lql2 и площади А^ОР при совместном действии ионизирующего излучения и ТОрДНК.

3.5.2. Изменение количества мРНК TLR9 и MyD88.

3.5.3. Определение активности TNF-a в среде культивирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеклеточная ДНК - фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля"

Актуальность проблемы. Ещё два десятилетия назад эффекты радиации изучались у клеток, непосредственно подвергшихся действию частиц высоких энергий, и сводились к последствиям нерепарированных или неправильно репарированных повреждений ядерной ДНК после взаимодействия её с продуктами радиолиза воды. Эффекты в клетках, которые непосредственно не подверглись облучению, как правило, не рассматривались. Однако в последние годы ушедшего столетия начали появляться сообщения о способности клеток, подвергнутых ' воздействию ионизирующего излучения в малых дозах, передавать сигнал необлучённым клеткам (клеткам-свидетелям), в результате и в тех, и в других индуцируются одинаковые эффекты [Nagasawa, Little, 1992]. Эффект, воздействия облучённых клеток популяции на необлучённые клетки получил название bystander effect" или "эффект свидетеля" (ЭС) [Lehnert, Goodvin, 1997; Seymour, Mothersill, 1997].

Эффект свидетеля наблюдается преимущественно в интервале малых доз от 1 до 50 сГр [Morgan, Sowa, 2007]. Для рентгеновского излучения ЭС тестируется уже при дозе 5 мГр, при этом уровень повреждений ДНК клетки-мишени включает всего пять однонитевых разрывов, 10-15 повреждённых оснований и один двунитевой разрыв ДНК в 20% клеток. Показано, что ЭС может передаваться от облучённых клеток потомству и проявляется в ряду нескольких последующих поколений клеток [Lyng et al., 2002, Mothersill el al., 2002].

Matsumoto et al., 2007; 2010; Morgan, 2010]. В 2007 году сотрудниками лаборатории молекулярной биологии МГНЦ РАМН было впервые высказано предположение о возможной роли внеклеточной ДНК в реализации эффекта свидетеля [Ермаков и соавт., 2007а].

Цель проведенного исследования — проверка гипотезы: внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых клеток (вкДНК переносит информацию о радиационном воздействии от облучённых клеток — необлучённым, т.е. выступает в роли фактора сигнализации при реализации эффекта свидетеля.

Задачи исследования

1. выделить из среды культивирования облучённых лимфоцитов человека вкДНК и исследовать её свойства;

2. сравнить эффекты, индуцируемые в лимфоцитах человека ионизирующей радиацией в малых дозах и депротеинизированной вкДНК*;

3. определить возможный источник вкДНКя;

4. обозначить сигнальные пути, связанные с рецепторами, опознающими вкДНКк;

5. исследовать возможность моделирования свойств вкДНК11 с целью направленного изменения индуцируемых ею эффектов.

Научная новизна. Впервые показано, что вкДНКк выполняет функцию сигнального фактора в реализации эффекта свидетеля, индуцируемого ионизирующим излучением в малых дозах. Определены два условия, которые должны выполняться в клетках для поддержания данной функции вкДНКк: (1) синтез активных форм кислорода и азота и (2) апоптоз повреждённых радиацией клеток. Установлено, что вкДНКа стимулирует в лимфоцитах вторичный окислительный стресс. Впервые показано, что рецепторы "врождённого" иммунитета семейства TLR (TLR9) принимают непосредственное участие в ответе лимфоцитов на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах и в реализации эффекта свидетеля. Впервые показана принципиальная возможность моделирования клеточного ответа на действие радиации путём направленного изменения свойств внеклеточной ДНК.

Научно-практическая значимость работы. Данные о влиянии свойств вкДНК на клеточный ответ, индуцированный излучением, могут быть положены в основу для разработки предклинических моделей индивидуальных схем радиотерапии. Моделируя содержание вС-богатых последовательностей (ОС-ДНК) во вкДНК можно блокировать развитие адаптивного ответа и снизить летальную для клеток опухоли дозу радиации. С другой стороны, анализ индивидуальных свойств вкДНК и их направленное изменение может способствовать повышению радиорезистентности клеток (в перспективе, организма).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых лимфоцитов человека - фактор сигнализации при развитии эффекта свидетеля в клеточной популяции.

3. В реализации сигнальной функции вкДНК в облучённых лимфоцитах принимают участие рецепторы Т1Л19.

4. Ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения в малых дозах можно изменить путем варьирования содержания во вкДНК ОС-богатых последовательностей ДНК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Конькова, Марина Сергеевна

ВЫВОДЫ

Действие ионизирующего излучения в малой дозе на лимфоциты человека сопровождается увеличением в среднем в 1.5 раза количества апоптотических клеток и увеличением эндонуклеазной активности клеток. В результате в среде культивирования появляется внеклеточная ДНК с изменёнными свойствами.

Внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых лимфоцитов -значимый фактор стресс-сигнализации при развитии эффекта свидетеля в клеточной популяции.

Для проявления сигнальной функции вкДНК, в облучённых лимфоцитах должны соблюдаться два основных условия: синтез активных форм кислорода/азота и апоптоз облучённых клеток. В реализации сигнальной функции вкДНК в облучённых лимфоцитах принимают участие рецепторы ТЬЯ9.

Ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения в малых дозах зависит от содержания во вкДНК ОС-богатых последовательностей генома.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цель проведенного исследования - доказательство гипотезы о возможной роли внеклеточной ДНК среды облученных клеток в реализации эффекта свидетеля, индуцированного ионизирующим излучением в малых дозах. Проанализирован ряд эффектов, сопровождающих ранний (1-3 часа после воздействия) клеточный ответ на ионизирующее излучение, и сравнены данные эффекты с клеточными реакциями на действие депротеинизированных образцов внеклеточной ДНК, выделенной из среды культивирования облучённых клеток. В таблице 3-11 суммированы все полученные результаты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Конькова, Марина Сергеевна, Москва

1. Ермаков A.B., Конькова М.С., Костюк C.B., Ершова Е.С., Еголина

2. П.Ермаков A.B., Конькова М.С., Костюк C.B., Ершова Е.С., Смирнова Т.Д., Каменева JI.B., Ефремова JI.B., Любченко JI.H., Вейко H.H.

3. Реакция раковых стволовых клеток человека на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах. // Радиац. биология. Радиоэкология. 20096. - Т. 49, №5. - С. 528-537.

4. Керова Н.И., Пухова Г.Г., Чеботарев Е.Е. Естественные ингибиторы нуклеаз. // Киев: Наукова думка. 1974. - 141 с.

5. Костюк C.B., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Ермаков A.B., Ефремова Л.В., Конорова И.Л., Вейко H.H. Внеклеточная ДНК влияет на функциональную активность клеток эндотелия. // Медицинская генетика. 2010. - №1. С. 38-46.

6. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). // М.: ФИЗМАТ ЛИТ. 2004. - 448 с.

7. Иванов В.И., Лысцов В.Н. Основы микродозиметрии. // М.: Атомиздат, 1979. - 192 с.

8. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс: Прооксиданты и антиоксиданты. // М.: Фирма "Слово". — 2006. 556 с.

9. Москалев A.A., Шапошников М.В. Генетические механизмы воздействия ионизирующих излучений в малых дозах. // СПб.: Наука. -2009.- 137 с.

10. Пел евина И.И., и др. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах. // Радиац. биол. Радиоэкология. 2003. - Т. 43, № 2. - С. 161166.

11. Спитковский Д.М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и её возможные последствия к трактовке медико-биологических последствий. // Радиац. биол. Радиоэкология. 1992. -Т. 32, №. 3.- С. 382-400.

12. Томилин Н.В., Подгорная О.И., Абрамян Д.С., Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. // Цитология. — 1984. Т. XXVII, №5. - С.554-564.

13. Туаева Н.О., Абрамова З.И., Мустафина Д.М. Внеклеточная ДНК в кровотоке человека. II. Биологическая роль внеклеточной ДНК. // Учебные записки Казанского государственно университета. — 2008. — Т. 150, №2.-С. 59-70.

14. Челобанов Б.П., Лактионов П.П., Власов В.В. Белки, участвующие в связывании и поглощении клетками нуклеиновых кислот. // Биохимия. 2006. - Т. 71, № 6. - С. 725-741.

15. Ярилин А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии // Актуальные проблемы патофизиологии. // Под ред. Морозова. М. 2001. - С. 13-56

16. Abdel-Halim H.I., Imam S.A., Badr F.M., Natarajan A.T., Mullenders L.H., Boei J.J. Ionizing radiation-induced instant pairing of heterochromatin of homologous chromosomes in human cells. // Cytogenet. Genome. Res. 2004. - Vol. 104, № i4. p. 193-199.

17. Adams D.H., Mcintosh A.A. Studies on the cytosolic DNA of chick embryo fibroblasts and its uptake by recipient cultured cells. // Int. J. Biochem.- 1985.-Vol. 17, № 10.-P. 1041-1051.

18. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signaling. // Nat. Rev. Immunol. -2004. Vol. 4, № 7. - P. 499-511.

19. Andrés V., González J.M. Role of A-type lamins in signaling, transcription, and chromatin organization. // J. Cell Biol. 2009. - Vol. 187, №7.-P. 945-957.

20. Anker P., Mulcahy H., Stroun M. Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? // Int. J. Cancer. 2003. - Vol. 103, № 2. - P. 149-152.

21. Antonatos D., Patsilinakos S.,Spanodimos S., Korkonikitas P.,Tsigas D. Cell-free DNA levels as a prognostic marker in acute myocardial infarction. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. - Vol. 1075, № 9. - P.278-281.

22. ApoAlert ™CPP32/Caspase 3 Protease assey Kits. CLONTECHniques XII.- 1997.-P. 4-6.

23. Armant M.A., Fenton M.J. Toll-like receptors: a family of pattern-recognition receptors in mammals. // Genome Biol. 2002. - Vol. 3, № 8. -P. 3011-3016.

24. Ashman R.F., Goeken J.A., Drahos J., Lenert P. Sequence requirements for oligodeoxyribonucleotide inhibitory activity. // Int. Immunol. 2005. -Vol. 17, №4. -P. 411-420.

25. Atamaniuk J., Ruzicka K., Stuhlmeier K.M., Karimi A., Eigner M., Mueller M.M. Cell-free plasma DNA: a marker for apoptosis during hemodialysis. // Clin. Chem. 2006. - Vol. 52, № 3. - P. 523-526.

26. Azzam E.I., de Toledo S.M., Little J.B. Stress signaling from irradiated to non-irradiated cells. // Current Cancer Drug Target. 2004. - Vol. 4, № 1. -P. 53-64.

27. Barber G.N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. // Curr. Opin. Immunol. -2011. -Vol. 23, № l.-P. 10-20.

28. Baskar R., Balajee A.S., Geard C.R., Hande M.P. Isoform-specific activation of protein kinase c in irradiated human fibroblasts and their bystander cells. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2008. - Vol. 40, № 1. - P. 125-134.

29. Bauer G. Reactive oxygen and nitrogen species: efficient, selective, and interactive signals during intercellular induction of apoptosis. // Anticancer Res. 2000. - Vol. 20, № 6B. - P. 4115-4139.

30. Belyakov O.V., Malcomson A.M., Folkard M., Prise K.M., Michael B.D. Direct evidence for a bystander effect of ionizing radiation in primary human fibroblasts. // Br. J. Cancer. 2001. - Vol. 84, № 5. - P. 674-679.

31. Bennett R.M., Gabor G.T., Merritt M.M. DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA. // J. Clin. Invest. 1985. - Vol. 76, № 6. -P.2182-2190.

32. Bhattacharjee D. Role of radioadaptation on radiation-induced thymic lymphoma in mice. // Mutat. Res. 1996. - Vol. 358, № 2. - P. 231-235.

33. Bird A.P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation. // Nature. 1986.-Vol. 321, № 6067.-P. 209-213.

34. Boum A. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968. - Vol. 21, № 97. - P. 2833.

35. Breen A.P., Murphy J.A. Reactions of oxyl radicals with DNA. // Free Radic. Biol. Med.-1995.-Vol. 18, №6.-P. 1033-1077.

36. Brenner D.J., Little J.B., Sachs R.K. The bystander effect in radiation oncogenesis: II. A quantitative model. // Radiat. Res. 2001. - Vol. 155, № 3.-P. 402-408.

37. Brown D., Sun X.M., Cohen G. Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268, № 15. - P. 3037-3039.

38. Buys C.H., Osinga J. Abundance of protein-bound sulfhydryl and disulfide groups at chromosomal nucleolus organizing regions: a cytochemical study on the selective silver staining of NORs. // Chromosoma. 1980. - Vol. 77,№ l.-P. 1-11.

39. Byczkowski J.Z., Gessner T. Biological role of superoxide on-radical. // Int. J. Biochem. 1998. - Vol. 20, № 6. - P. 569-580.

40. Bystander effects and the dose response. // Belle Newsletter/Biological Effects of Low Level Exposure. 2003. - Vol. 11. - 36 p.

41. Chakraborty A., Held K.D., Prise K.M., Liber H.L., Redmond R.W. Bystander effects induced by diffusing mediators after photodynamic stress. //Radiat. Res. 2009. - Vol. 172. № l.-P. 74-81.

42. Chan K.C., Yeung S.W., Lui W.B., Rainer T.H., Lo Y.M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. // Clin. Chem. 2005. - Vol. 51, № 4. - P.781 -784.

43. Cheda A., Nowosielska E.M., Wrembel-Wargocka J., Janiak M.K. Production of cytokines by peritoneal macrophages and splenocytes after exposures of mice to low doses of X-rays. // Radiat. Environ. Biophys. -2008. Vol. 47, № 2. - P. 275-283.

44. Chen Z., Sakai K. Enhancement of radiation-induced apoptosis by preirradiation with low-dose X-rays in human leukemia MOLT-4 cells. // J. Radiat. Res. (Tokyo). 2004. - Vol. 45, № 2. - P. 239-243.

45. Choi J.J., Reich C.F., Pisetsky D.S. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. // Immunology.-2005.-Vol. 115, № 1.-P. 55-62.

46. Cole L.J., Ellis M.E. Radiation-induced changes in tissue nucleic acids; release of soluble deoxypolynucleotides in the spleen. // Radiat Res. -1957.-Vol. 7, № 5.-P. 508-517

47. Collins M.K., Furlong I .J., Madle P., Ascaso R., Oliver J., Lopez Rivas A. An apoptotic endonuclease activated either by decreasing pH or by increasing calcium. // J. Cell Sei. 1996. - Vol. 109, № 9. - P. 2393-2399.

48. Collins L.V., Hajizadeh S., Holme E., Jonsson I.M., Tarkowski A. Endogenously oxidized mitochondrial DNA induces in vivo and in vitro inflammatory responses. // J. Leukoc. Biol. 2004. - Vol. 75, № 6. - P. 995-1000.

49. Cortez-Gonzalez X., Pellicciotta i., Gerloni M., Wheeler M.C., Castiglioni P., Lenert P., Zanetti M. TLR9-independent activation of B lymphocytes by bacterial DNA. // DNA Cell Biol. 2006. - Vol. 25, № 5. - P. 253-261.

50. Crawford D.R., Davies K.J. Adaptive response and oxidative stress. // Environ. Health Perspect. 1994. - Vol. 102, №. 10. - P. 25-28.

51. Dabrowska A., Gos M., Janik P. "Bystander effect" induced by photodynamically or heat-injured ovarian carcinoma cells (OVPIO) in vitro. // Med. Sei. Monit. 2005. - Vol. 11, № 9. - P. 316-324.

52. Dahl K.N., Ribeiro A.J., Lammerding J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. // Circ. Res. 2008. - Vol. 102, № 11. - P. 13071318.

53. Dahle J., Kvam E., Stokke T. Bystander effects in UV-induced genomic instability: antioxidants inhibit delayed mutagenesis induced by ultraviolet A and B radiation. // J. Carcinog. 2005. - Vol. 9, № 4. - P. 11-16.

54. De Bont R., van Larebeke N. Endogenous DNA damage in humans: a review of quantitative data. // Mutagenesis. 2004. - Vol. 19, № 3. - P. 169-185.

55. Dechat T., Pfleghaar K., Sengupta K., Shimi T., Shumaker D.K., Solimando L., Goldman R.D. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. // Genes Dev. 2008. - Vol. 22, № 7. - P. 832-853.

56. Derenzini M., Trere D. Silver-stained Nucleolar Organizer Regions (AgNOR). // Pathologica. 2001. - Vol. 93, № 2. - P. 99-105.

57. Deshpande A., Goodwin E.H., Bailey S.M., Marrone B.L., Lehnert B.E. Alpha-particle-induced sister chromatid exchange in normal human lung fibroblasts: evidence for an extranuclear target. // Radiat. Res. 1996. -Vol. 145, №3.-P. 260-267.

58. DeVeaux L.C., Durtschi L.S., Case J.G., Wells D.P. Bystander effects in unicellular organisms. // Mutat. Res. 2006. - Vol. 597, № 1-2. - P. 78-86.

59. Di X., Bright A.T., Bellott R., Gaskins E., Robert J., Holt S., Gewirtzl D., Elmore L.W. A chemotherapy-associated senescence bystander effect in breast cancer cells. // Cancer. Biol. Ther. 2008. - Vol. 7, № 6. - P. 864872.

60. Dunjic A., Maisin J., Maldague P., Maisin H. Incidence of mortality and dose-response relationship following partial-body x-irradiation of the rat. // Radiat. Res. 1960. - Vol. 12.-P. 155-166.

61. Duvall E., Whyllie A.H. // Immunology today. 1986. - Vol. 7, № 4. p. 115-117.

62. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases-6 structure, activation, substrates and functions during apoptosis. // Annu. Rev. Biochem. 1999. - Vol. 68. - P. 383-424.

63. Ebert S., Gerber J., Bader S., Miihlhauser F., Brechtel K., Mitchell T.J., Nau R. Dose-dependent activation of microglial cells by Toll-like receptor agonists alone and in combination. // J. Neuroimmunol. 2005. - Vol. 159, № 1-2.-P. 87-96.

64. Ermakov A.V., Konkova M.S., Kostyuk S.V., Smirnova T.D., Malinovskaya E.M., Efremova L.V., Veiko N.N. An extracellular DNA mediated bystander effect produced from low dose irradiated endothelial cells. // Mutat. Res. 20115. - Epub ahead of print.,

65. Essmann F., Pohlmann S., Gillissen B., Daniel P.T., Schulze-Osthoff K., Janicke R.U. Irradiation-induced translocation of p53 to mitochondria in the absence of apoptosis. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280, № 44. p. 37169-37177.

66. Ewald J.A., Desotellel J.A., Almassi N., Jarrard D.F. Drug-induced senescence bystander proliferation in prostate cancer cells in vitro and in vivo. // Br. J. Cancer. -2008. Vol. 98, № 7. - P. 1244-1249.

67. Falk M., Lukásová E., Kozubek S. Chromatin structure influences the sensitivity of DNA to gamma-radiation. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. -Vol. 1783, № 12.-P. 2398-2414.

68. Fish H., Gifford J.E. //J. Immunol. Meth. 1989. - Vol. 57. - P. 311-325.

69. Fleischmann R., Shealy D. Developing a new generation of TNFalpha antagonists for the treatment of rheumatoid arthritis. // Mol. Interv. 2003. -Vol. 3, № 6. - P. 310-318.

70. Fritz R., Bol J., Hebling U., Angermüller S., Volkl A., Fahimi H.D., Mueller S. Compartment-dependent management of H202 by peroxisomes. // Free Radie. Biol. Med. 2007. - Vol. 42, № 7. - P. 1119-1129.

71. Goodpasture C., Bloom S.E. Visualization of nucleolar organizer regions im mammalian chromosomes using silver staining. // Chromosoma. 1975. -Vol. 53, № l.-P. 37-50.

72. Gopalakrishnan K., Low G.K., Ting A.P., Srikanth P., Slijepcevic P., Hande M.P. Hydrogen peroxide induced genomic instability in nucleotide excision repair-deficient lymphoblastoid cells. // Genome Integr. 2010. Vol. 1. № l.-P. 1-16.

73. Goyanes-Villaescusa V. Chromosomal abnormalities in lymphocytes of children and baby rabbits born from mothers treated by X-irradiation before pregnancy. A transplacentary plasmatic chromosome damage factor? // Blut. 1971. - Vol. 22, № 2. - P. 93-96.

74. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J., Skipper P.L., Wishnok J.S. Tannenbaum S.R. Analysis of nitrate, nitrite, and 15N. nitrate in biological fluids.//Anal. Biochem. 1982. - Vol. 126, № l.-P. 131-138.

75. Grifalconi M., Celotti L., Mognato M. Bystander response in human lymphoblastoid TK6 cells. . Mutat. Res. 2007. - Vol. 625, № 1-2. - P. 102-111.

76. Gutteridge J.M., Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. -Vol. 899.-P. 136-147.

77. Hacker H. J., Zhang W., Tokus M., Bock T., Schroder C.H. Patterns of circulating hepatitis B virus serum nucleic acids during lamivudine therapy. // Ann. N. Y. Acad. 2004. - Vol. 1022. - P. 271-281.

78. Haddad J.J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. // Respir. Res. 2002. - Vol. 3, № 1. - P. 26-53.

79. Hajizadeh S., DeGroot J., TeKoppele J.M., Tarkowski A., Collins L.V. Extracellular mitochondrial DNA and oxidatively damaged DNA insynovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. // Arthritis Res. Ther. -2003. Vol. 5, № 5. p. 234-240.

80. Harewood L., Schiitz F., Boyle S., Perry P., Delorenzi M., Bickmore W.A., Reymond A. The effect of translocation-induced nuclear reorganization on gene expression. // Genome Res. 2010. - Vol. 20, № 5. -P. 554-564.

81. Hartmann G., Krieg A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. // J. Immun. 2000. - Vol. 164, № 2. - P. 944-953.

82. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. // Nature. 2000. - Vol. 408, № 6813. -P. 740-745.

83. Hickman A.W., Jaramillo R.J., Lechner J.F., Johnson N.F. Alpha-particle-induced p53 protein expression in a rat lung epithelial cell strain. // Cancer Res. 1994. - Vol. 54, № 22. - P. 5797-5800.

84. Hollowell J.G., Littlefield L.G. Chromosome damage induced by plasma of x-rayed patients: an indirect effect of x-ray. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968. - Vol. 129, № 1. - P. 240-244.

85. Howell W.M., Hsu T.C. Chromosome core structure revealed by silver staining. // Chromosoma. 1979. - Vol. 73, № 1. — P. 61-66.

86. Hu B., Wu L., Han W., Zhang L., Chen S., Xu A., Hei T.K., Yu Z. The time and spatial effects of bystander response in mammalian cellsinduced by low dose radiation. // Carcinogenesis. 2006. - Vol. 27, № 2. -P. 245-251.

87. Huang L.Y., Ishkii K.J., Akira S., Aliberti J., Golding B. Thl-like cytokine induction by heat-killed Brucella abortus is dependent on triggering of TLR9. // J. Immunol. 2005. - Vol. 175, № 6. - P. 39643970.

88. Ishikawa H., Barber G.N. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signaling. // Nature. — 2008. Vol. 455, №7213. -P. 674-678.

89. Ishikawa H., Ma Z., Barber G.N. STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity. // Nature. -2009. Vol. 461, № 7265. - P. 788-792.

90. Janssens S., Beyaert R. A universal role for MyD88 in TLR/IL-1R-mediated signaling. // Trends Biochem. Sci. 2002. - Vol. 27, № 9. - P. 474-482.

91. Jiang H., Li W., Li X., Cai L., Wang G. Low-dose radiation induces adaptive response in normal cells, but not in tumor cells: in vitro and in vivo studies. // J. Radiat. Res. (Tokyo). 2008. - Vol. 49, № 3. - P. 219230.

92. Joiner M.C., Marples B., Lambin P., Short S.C., Turesson I. Low-dose hypersensitivity: current status and possible mechanisms. // Radiation oncology. 2001. - Vol. 49, № 2. - P. 314-320.

93. Jozsef L., Khreiss T., El Kebir D., Filep J.G. Activation of TLR-9 induces IL-8 secretion through peroxynitrite signaling in human neutrophils. // J. Immunol. 2006. - Vol. 176, № 2. - P. 1195-1202.

94. Kaisho T., Takeuchi O., Kawai T., Hoshino K., Akira S. Endotoxin-induced maturation of MyD88-deficient dendritic cells. // J. Immunol. -2001. Vol. 166, № 9. - P. 5688-5694.

95. Kanasugi Y., Hamada N., Wada S. Funayama T, Sakashita T, Kakizaki T, Kobayashi Y, Takakura K. Role of DNA-PKcs in the bystander effect after low- or high-LET irradiation. // Int. J. Radiat. Biot. -2007. Vol. 83, № 2. - P. 73-80.

96. Kawai T., Akira S. TLR signaling. // Cell Death Differ. 2006. -Vol. 13, №5.-P. 816-825.

97. Kellerer A.M. A survey of approaches to radiation biophysics. // Fifth Symposium on Microdosimetry, EUR 5452, ed. by J.Booz et. al., Luxemburg: Commission of the European Communities. 1976. - P. 409442.

98. Kerr J., Searle J. // Radiation Biology in Cancer Research. 1980. — P. 367-384.

99. Klein LA, Ackermann SL Oxidative stress, cell cycle and neurodegeneration. // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 111, № 6. - P. 785793.

100. Kleinbongard P., Rassaf T., Dejam A., Kerber S., Kelm M. Griess method for nitrite measurement of aqueous and protein containing sample. // Methods Enzymol. 2002. - Vol. 359. - P. 158-168.

101. Kotval J.P., Gray L.H. Structural changes produced in microspores of Tradescantia by a-particles. // J. Genet. 1947. - Vol. 48, № 2. - P. 135-154.

102. Kozubek S., Bartova E., Kozubek M., Lukasova E., Cafourkova A., Koutna I., Skalnikova M. Spatial distribution of selected genetic loci in nuclei of human leukemia cells after irradiation. // Radiat. Res. 2001. -Vol. 155, №2.-P. 311-319.

103. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. // Nature. 1995. - Vol. 374, № 6522. - P. 546-549.

104. Krieg A.M. The role of CpG motifs in innate immunity. // Curr. Opin. Immunol. 2000. - Vol. 12, № 1.-P. 35-43.

105. Leach J.K. Van Tuyle G., Lin P.S., Schmidt-Ullrich R., Mikkelsen R.B. Ionizing radiation-induced, mitochondria-dependent generation of reactive oxygen/nitrogen. // Cancer Res. 2001. - Vol. 61, № 10. - P. 3894-3901.

106. Lee T.H., Montalvo L., Chrebtow V., Busch M.P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. // Transfusion. 2001. -Vol. 41, №2.-P. 276-282.

107. Léger I., Guillaud M., Krief B., Brugal G. Interactive computerassisted analysis of chromosome 1 colocalization with nucleoli. // Cytometry. 1994.-Vol. 16, № 4. - P. 313-323.

108. Lehnert B.E., Goodvin E.H. Extracellular factor(s) following exposure to alpha particle can cause sister chromatid exchanges in normal human cells. // Cancer Res. 1997. - Vol. 57, № 11. - P. 2164-2171.

109. Lenert P., Yi A.K., Krieg A.M., Stunz L., Ashman R.F. Inhibitory oligonucleotides block the induction of AP-1 transcription factor by stimulatory CpG oligonucleotides in B cells. // Antisense Nucleic Acid. Drug. Dev.-2003.-Vol. 13, №3.-P. 143-150.

110. Lenert P.S. Targeting Toll-like receptor signaling in plasmacytoid dendritic cells and autoreactive B cells as a therapy for lupus. // Arthritis Res. Ther. -2006. Vol. 8, № 1. - P. 203-216.

111. Levitz S.M. Interactions of Toll-like receptors with fungi. // Microbes Infect. 2004. - Vol. 6, № 15.-P. 1351-1355.

112. Li J.Z., Steinman C.R. Plasma DNA in systemic lupus erythematosus. Characterization of cloned base sequences. // Arthritis Rheum. 1989.-Vol. 32, № 6.-P. 726-733.

113. LiebertM.R.//Amer. J. Pathol. 1998.-Vol. 153.-P. 1323-1332.

114. Liu S.Z., Cai L., Sun S.Q. Induction of a cytogenetic adaptive response by exposure of rabbits to very low dose-rate gamma-radiation. // Int. J. Radiat. Biol. 1992. - Vol. 62, № 2. - P. 187-190.

115. Liu W., Wu S. Differential roles of nitric oxide synthases in regulation of ultraviolet B light-induced apoptosis. // Nitric Oxide. 2010. -Vol. 23, №3.-P. 199-205.

116. Liu Y., Hu N: Electrochemical detection of natural DNA damage induced by ferritin/ascorbicacid/H202 system and amplification of DNA damage by endonuclease Fpg. // Biosens. Bioelectron. 2009. - Vol 25, № l.-P. 185-190.

117. Lu W., Ogasawara M.A., Huang P. Models of reactive oxygen species in cancer. Drug Discov. Today Dis. Models. 2007. - Vol. 4, № 2. -P. 67-73.

118. Lukas J., Bohr V.A., Halazonetis T.D. Cellular responses to DNA damage: Current state of the field and review of the 52nd Benson Symposium. // DNA repair. 2006. - Vol. 5, № 5. - P. 591-601.

119. Lyng F.M., Seymour C.B., Mothersill C. Initiation of apoptosis in cells exposed to medium from the progeny of irradiated cells: a possible mechanism for bystander-induced genomic instability? // Radiat. Res. -2002. Vol. 157, № 4. - P. 365-370.

120. Majewska M., Szczepanik M. The role of Toll-like receptors (TLR) in innate and adaptive immune responses and their function in immune response regulation. // Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). 2006. - Vol. 60. -P. 52-63.

121. Mandel P., Metais P. Les acids nucleiques du plasma sanguine chez Homme. // CR Acad. Sci. Paris. 1948. - Vol. 142. - P. 241-243.

122. Mason K.A., Neal R., Hunter N., Ariga H., Ang K., Milas L. CpG oligodeoxynucleotides are potent enhancers of radio- and chemoresponses of murine tumors. // Radiother. Oncol. 2006. - Vol. 80, № 2. - P. 192198.

123. Matsumoto H., Hamada N., Takahashi A., Kobayashi Y., Ohnishi T. Vanguards of paradigm shift in radiation biology: radiation-induced adaptive and bystander responses. // J. Radiat. Res. 2007. - Vol. 48, № 2. -P. 97-106.

124. Matsumoto H., Tomita M., Otsuka K., Hatashita M., Hamada N. Nitric oxide is a key molecule serving as a bridge between radiation-induced bystander and adaptive responses. // Curr. Mol. Pharmacol. 2010. Epub ahead of print.

125. McMahon L.W., Sangerman J., Goodman S.R., Kumaresan K., Lambert M.W. Human a spectrin II and the FANCA, FANCC, and FANCG proteins bind to DNA containing psoralen interstrand cross-links. // Biochemistry. 2001. - Vol. 40, № 24. - P. 7025-7034.

126. Meng Y., Carpentier A.F., Chen L., Boisserie G., Simon J.M., Mazeron J.J., Delattre J.Y. Successful combination of local CpG-ODN and radiotherapy in malignant glioma. // Int. J. Cancer. 2005. — Vol. 116, № 6. - P. 992-997.

127. Miggin S.M., O'Neill L.A. New insights into the regulation of TLR signaling. // J. Leukoc. Biol. 2006. - Vol. 80, № 2. - P. 220-226.

128. Miller D.A., Dev V.G., Tantravahi R., Miller O.J. Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. // Exp. Cell Res. 1976. - Vol. 101, № 2. - P. 235-243.

129. Miura M., Chen X.-D., Allen M.R. A crucial role of caspase-3 in osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells. // J. Clin. Invest. 2004. - Vol. 114, № 12.-P. 1704-1713.

130. Morgan W.F., Hartmann A., Limoli C.L., Nagar S., Ponnaiya B. Bystander effects in radiation-induced genomic instability. // Mutat. Res. -2002. Vol. 504, № 1-2. - P. 91-100.

131. Morgan W.F., Sowa M.B. Non-targeted bystander effects induced by ionizing radiation. // Mutat. Res. 2007. - Vol. 616, № 1-2. - P. 159-164.

132. Morgan W.F. Communicating non-targeted effects of ionizing radiation to achieve adaptive homeostasis in tissues. // Curr. Mol. Pharmacol. 2010. Epub ahead of print.

133. Mothersill C., Stamato T.D., Perez M.L. Cummins R, Mooney R, Seymour CB. Involvement of energy metabolism in the production of 'bystander effects' by radiation. // Br. J. Cancer. 2000. - Vol. 82, № 10. -P. 1740-1746.

134. Mothersill C., Seymour C.B. // Radiat. Res. 2001. - Vol. 155. - P. 759-767.

135. Mothersill C., Seymour C.B. Bystander and delayed effects after fractionated radiation exposure. // Radiat. Res. — 2002. — Vol. 158, № 5. -P. 626-633.

136. Mothersill C., O'Malley K., Seymour C.B. Characterisation of a bystander effect induced in human tissue explant cultures by low let radiation. //Radiat. Prot. Dosim. 2002. - Vol. 99, № 1-4. - P. 163-167.

137. Mothersill C., Salbu B., Heier L.S., Teien H.C., Denbeigh J., Oughton D., Rosseland B.O., Seymour C.B. Multiple stressor effects of radiation and metals in salmon (Salmo salar). II J. Environ. Radioact. -2007. Vol. 96, № 1-3. - P. 20-31.

138. Murata M., Kawanishi S. Oxidation of 5'-site guanine at GG and GGG sequences induced by a metabolite of carcinogenic heterocyclicamine PhIP in the presence of Cu(II) and NADH. // Carcinogenesis. -2002. Vol. 23, № 5. - P. 855-860.

139. Nagasawa H., Little J.B. Induction of sister-chromatid exchanges by extremely low doses of alpha particles. // Cancer Res. 1992. - Vol. 52, № 22.-P. 6394-6396.

140. Nagasawa H., Little J.B. Unexpected sensitivity to the induction of mutations by very low doses of alpha-particle irradiation: Evidence for a bystander effect. // Radiat. Res. 1999. - Vol. 152, № 2. - P. 552-557.

141. Nagasawa H., Little J.B. Bystander effect for chromosomal aberrations induced in wild-type and repair deficient CHO cells by low fluences of alpha particles. // Mutat. Res. 2002. - Vol. 508, № 1-2. - P. 121-129.

142. Narayanan P.K., Goodwin E.H., Lehnert B. Alpha particles initiate biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells. // Cancer Res. 1997. - Vol. 57, № 18. - P. 3963-3971.

143. Nelms B.E., Maser R.S., MacKay J.F., Lagally M.G., Petrini J.H. In situ visualization of DNA double-strand break repair in human fibroblasts. // Science. 1998. - Vol. 280, № 5363. - P. 590-592.

144. Nikjoo H., Khvostunov I.K. Biophysical model of the radiation-induced bystander effect. // Int. J. Radiat. Res. 2003. - Vol. 79, № 1. - P. 43-52.

145. O'Neill L.A., Fitzgerald K.A., Bowie A.G. The Toll-IL-1 receptor adaptor family grows to five members. // Trends Immunol. 2003. - Vol. 24, № 6.-P. 286-290.

146. Ohlbaum A., Csuzi S., Antoni F. Binding of exogenous DNA by human lymphocytes and by their isolated plasma membranes. // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1979. - Vol. 14, № 3. - P. 165-176.

147. Okabe Y., Kawane K., Akira S., Taniguchi T., Nagata S. Toll-like receptor-independent gene induction program activated by mammalian DNA escaped from apoptotic DNA degradation. // J. Exp. Med. — 2005. -Vol. 202, № 10.-P. 1333-1339.

148. Olert J., Sawaitzki G., Kling H., Gebauer J. Cytological and histochemical studies on the mechanism of the selective silver staining of nucleolus organizer regions (NORs). // Histochemistry. — 1979. — Vol. 60, №1.-P. 91-99.

149. Olivieri G., Bodycote J., Wollf S. Adaptive response of human lymphocytes to low concentration of radioactive thimidine. // Science. -1984. Vol. 223, № 4636. - P. 594-597.

150. Ondrej V., Lukasova E., Krejci J., Kozubek S. Intranuclear trafficking of plasmid DNA is mediated by nuclear polymeric proteins lamins and actin. // Acta Biochim. Pol. 2008 - Vol. 55, № 2. - P. 307315.

151. Pall M.L. Post-radiation syndrome as a NO/ONOO- cycle, chronic fatigue syndrome-like disease. // Med. Hypotheses. 2008. - Vol. 71, № 4. -P. 537-541.

152. Parsons W.B., Watkins C.H., Pease G.L. and Childs D.S. Changes in sternal bone marrow following roentgen-ray therapy to the spleen in chronic granulocytic leukaemia. // Cancer. 1954. - Vol. 7, № 1. - P. 179189.

153. Pederson T., Aebi U. Actin in the nucleus: what form and what for? // J. Struct. Biol. 2002. - Vol. 140, № 1-3. - P. 3-9.

154. Peter M., Bode K., Lipford G.B., Eberle F., Heeg K., Dalpke A.H. Characterization of suppressive oligodeoxynucleotides that inhibit Toll-like receptor-9-mediated activation of innate immunity. // Immunology. — 2008. -Vol. 123, № l.-P. 118-128.

155. Peters D.L., Pretorius P.J. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA A new paradigm in genetic behaviour. // Clin. Chim. Acta. - 2011. - Vol. 412, № 11 -12. - P. 806-811.

156. Polyak K., Xia Y., Zweier J.L., Kinzler K.W., Vogelstein B. The model for p53-induced apoptosis. // Nature. 1997. - Vol. 389, № 6648. -P. 300-305.

157. Portess D.I., Bauer G., Hill M.A., O'Neill P. Low-dose irradiation of nontransformed cells stimulates the selective removal of precancerous cells via intercellular induction of apoptosis. // Cancer Res. — 2007. Vol. 67, №3.-P. 1246-1253.

158. Prise K. M., Schettino G., Folkard M., Held K. D. New insights on cell death from radiation exposure. // Lancet Oncol. 2005. - Vol. 6, № 7. -P. 520-528.

159. Puerto S., Ramirez M.J., Marcos R., Creus A., Surrallés J. Radiation-induced chromosome aberrations in human euchromatic (17cen-p53) and heterochromatic (lcen-lql2) regions. //Mutagenesis. 2001. - Vol. 16, №4.-P. 291-296.

160. Purschke M., Laubach H.J., Anderson R.R., Manstein D. Thermal injury causes DNA damage and lethality in unheated surrounding cells:active thermal bystander effect. // J. Invest. Dermatol. 2010. - Vol. 130, № l.-P. 86-92.

161. Radulescu I., Elmroth K., Stenerlow B. Chromatin organization contributes to non-randomly distributed double-strand breaks after exposure to high-LET radiation. // Radiat. Res. 2004. - Vol. 161, № 1. -P. 1-8.

162. Rayburn E.R., Wang W., Zhang R., Wang H. Experimental therapy for colon cancer: anti-cancer effects of TLR9 agonism, combination with other therapeutic modalities, and dependence upon p53. // Int. J. Oncol. -2007.-Vol. 30, №6.-P. 1511-1519.

163. Rhee S.G., Chae H.Z., Kim K. Peroxiredoxins: a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling. // Free Radic. Biol. Med. 2005. - Vol. 38, № 12. - P. 1543-1552.

164. Rogers J.C. Identification of an intracellular precursor to DNA excreted by human lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. -Vol. 73, №9.-P. 3211-3215.

165. Rupa D.S., Hasegawa L.S., Eastmond D.A. Detection of chromosomal alterations affecting the lcen-lql2 region in irradiated granulocytes and lymphocytes by multicolour FISH with tandem DNA probes. // Mutagenesis. 1997. - Vol. 12, № 4. - P. 195-200.

166. Samson L., Cairns J. A new pathway for DNA repair in Escherichia coli. //Nature. 1977. - Vol. 267, № 5608. - P. 281-283.

167. Sano H., Morimoto C. DNA isolated from DNA/anti-DNA antibody immune complexes in systemic lupus erythematosus is rich in guanine-cytosine content. // J. Immunol. 1982. - Vol. 128, № 3. - P. 1341-1345.

168. Sano H., Takai O., Harata N., Yoshinaga K., Kodama-Kamada I., Sasaki T. Binding properties of human anti-DNA antibodies to cloned human DNA fragments. // Scand. J. Immunol. 1989. - Vol. 30, № 1. - P. 51-63.

169. Schaffer M., Schwarz S.B., Kulka U., Busch M., Duhmke E. Adaptive doses of irradiation-an approach to a new therapy concept for bladder cancer? // Radiat. Environ. Biophys. 2004. - Vol. 43, № 4. - P. 271-276.

170. Schwarz S.B., Schaffer P.M., Kulka U., Ertl-Wagner B., Hell R., Schaffer M. The effect of radio-adaptive doses on HT29 and GM637 cells. //Radiat. Oncol. 2008. - Vol. 23, № 3. - P. 12-18.

171. Seymour C.B., Mothersill C. Delayed expression of lethal mutations and genomic instability in the progeny of human epithelial cells that survived in a bystander-killing environment. // Radiat.Oncol. Investig. -1997. — Vol. 5, № 3. P. 106-110.

172. Shadley J.D., Afzal V., Wolff S. Characterization of the adaptive response to ionizing radiation induced by low doses of X rays to human lymphocytes. // Radiat. Res. 1987. - Vol. 111, № 3. - P. 511 -517.

173. Shao C., Furusawa Y., Aoki M., Ando K. Role of gap junctional intercellular communication in radiation-induced bystander effects in human fibroblasts. // Radiat. Res. 2003. - Vol. 160, № 3. - P. 318-323.

174. Shao C., Folkard M., Michael B.D., Prise K.M. Targeted cytoplasmic irradiation induces bystander responses. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2004. Vol. 101, № 37. - P. 13495-13500.

175. Sharma S., tenOever B.R., Grandvaux N., Zhou G.P., Lin R., Hiscott J. Triggering the interferon antiviral response through an IKK-related pathway. // Science. 2003. - Vol. 300. - P. 5622. P. 1148-1151.

176. Shaulian E., Karin M. AP-1 as a regulator of cell life and death. // Nat. Cell Biol. 2002. - Vol. 4, № 5. - P. 131-136.

177. Sies H. // Oxidative stress: from basic research to clinical application. Am. J. Med. 1991. - Vol. 91, № 3. - P. 31-38.

178. Sloter E.D., Marchetti F., Eskenazi B., Weldon R.H., Nath J., Cabreros D., Wyrobek A.J. Frequency of human sperm carrying structural aberrations of chromosome 1 increases with advancing age. // Fertil. Steril. 2007. - Vol. 87, № 5. - P. 1077-1086.

179. Slupphaug G., Kavli B., Krokan H.E. The interactive pathways for prevention and repair of oxidative DNA damage. // Mutat. Res. 2003. -Vol. 53, № 1-2.-P. 231-251.

180. Squier M., Sehnert A., Cohen J. Apoptosis in leukocytes. // J. Leukoc. Biol. 1995.-Vol. 57, № l.-P. 2-9.

181. Stoilov L.M., Mullenders L.H., Darroudi F., Natarajan A.T. Adaptive response to DNA and chromosomal damage induced by X-rays in human blood lymphocytes. // Mutagenesis. 2007. - Vol. 22, № 2. - P. 117-122.

182. Strasak L., Bartova E., Harnicarova A., Galiova G., Krejci J., Kozubek S. H3K9 acetylation and radial chromatin positioning. // J. Cell Physiol. 2009. - Vol. 220, № l.-P. 91-101.

183. Surralles J., Darroudi F., Natarajan A.T. Low level of DNA repair in human chromosome 1 heterochromatin. // Genes Chromosomes Cancer. -1997.-Vol. 20, №2.-P. 173-84.

184. Tan E.M., Schur P.H., Carr R.H., Kunkel H.G. Deoxyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus. // J. Clin. Invest. 1966. - Vol. 45, № 11. - P. 17321740.

185. Tanabe H., Habermann F.A., Solovei I., Cremer ML, Cremer T. Non-random radial arrangements of interphase chromosome territories: evolutionary considerations and functional implications. // Mutat. Res. -2002. Vol. 504, № 1-2. P. 37-45.

186. Tateishi Y., Sasabe E., Ueta E., Yamamoto T. Ionizing irradiation induces apoptotic damage of salivary gland acinar cells via NADPH oxidase 1-dependent superoxide generation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. - Vol. 366, № 2. - P. 301-307.

187. Thomas C.H., Collier J.H., Sfeir C.S., Healy K.E. Engineering gene expression and protein synthesis by modulation of nuclear shape. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, № 4. - P. 1972-1977.

188. Tobias P., Curtiss L.K. Thematic review series: The immune system and atherogenesis. Paying the price for pathogen protection: toll receptors in atherogenesis. // J. Lipid Res. 2005. - Vol. 46, № 3. - P. 404-411.

189. Tsuru K., Horikawa T., Budiyanto A., Hikita I., Ueda M., Ichihashi M. Low-dose ultraviolet B radiation synergizes with TNF-alpha to induce apoptosis of keratinocytes. // J. Dermatol. Sci. 2001. - Vol. 26, № 3. - P. 209-216.

190. Vasilyeva I.N. Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation. // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2001.-Vol. 945.-P. 221-228.

191. Veal E.A., Day A.M., Morgan B.A. Hydrogen peroxide sensing and signaling. // Mol. Cell. 2007. - Vol. 26, № 1. - P. 1 -14.

192. Vernon S.D., Shukla S.K., Conradt J., Unger E.R., Reeves W.C. Analysis of 16S rRNA gene sequences and circulating cell-free DNA fromplasma of chronic fatigue syndrome and non-fatigued subjects BMC // Microbiol. 2002. - Vol. 23. - P. 2-39.

193. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Extracellular nucleic acids. // Bioessays. 2007. - Vol. 29, № 7. - P. 654-667.

194. Vogel S.N., Fitzgerald K.A., Fenton MJ. TLRs: differential adapter utilization by toll-like receptors mediates TLR-specific patterns of gene expression. // Mol. Interv. 2003. - Vol. 3, № 8. - P. 466-477.

195. Wagner H., Bauer S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. // J. Exp. Med. 2006. - Vol. 203, № 2. - P. 265-268.

196. Wang Z., Zhou Y. Effects of sodium salicylate on the expression of HSP27 protein during oxidative stress in tissue-cultured human lens epithelial cells. // J. Huazhong. Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2006. -Vol. 26, №6.-P. 753-755.

197. Wen B., Wu H., Shinkai Y., Irizarry R.A., Feinberg A.P. Large histone H3 lysine 9 dimethylated chromatin blocks distinguish differentiated from embryonic stem cells. // Nat. Genet. — 2009. — Vol. 41, №2.-P. 246-250.

198. Wollf S. The adaptive response in radiobiology: evolving insights and implications. // Environ. Health. Perspect. 1998. - Vol. 106, №1. - P. 277-283.

199. Wu L.J., Randers-Pehrson G., Xu A., Waldren C.A., Geard C.R., Yu Z., Hei T.K. Targeted cytoplasmic irradiation with alpha particles inducesmutations in mammalian cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. -Vol. 96, № 9. - P. 4959-4964.

200. Yang H., Asaad N., Held K.D. Medium-mediated intercellular communication is involved in bystander responses of X-ray-irradiated normal human fibroblasts. // Oncogene. 2005. - Vol. 24, № 12. - P. 2096-2103.

201. Yaung J., Jin M., Barron E., Spee C., Wawrousek E.F., Kannan R., Hinton D.R. Alpha-Crystallin distribution in retinal pigment epithelium and effect of gene knockouts on sensitivity to oxidative stress. // Mol. Vis. 2007. - Vol. 13. - P. 566-577.

202. Zimber A., Nguyen Q.D., Gespach C. Nuclear bodies and compartments: functional roles and cellular signalling in health and disease. // Cell Signal. 2004. - Vol. 16, № 10. - P. 1085-1104.

203. Zhong X.Y., Hahn S., Kiefer V., Holzgreve W. Is the quantity of circulatory cell-free DNA in human plasma and serum samples associated with gender, age and frequency of blood donations. // Ann. Hematol. -2006. Vol. 86. № 2. - P 139-143.

204. Zhou H., Randers-Pehrson G., Waldren C.A., Vannais D., Hall E.J., Hei T.K. Induction of a bystander mutagenic effect of alpha particles in mammalian cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97, № 5. -P. 2099-2104.

Информация о работе

Конькова, Марина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Внеклеточная ДНК - фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы