Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние янтарной кислоты на токсическое действие витамина D2 при экспериментальном гипервитаминозе D2 у животных и при лечении витакин D-резистентного рахита у детей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние янтарной кислоты на токсическое действие витамина D2 при экспериментальном гипервитаминозе D2 у животных и при лечении витакин D-резистентного рахита у детей"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГб ол

На правах рукописи

о h MAP 1996

САФРОНОВА Ольга Николаевна

УДК 616.523:616.24-008.4-053 31-084-092:6127015

ВЛИЯНИЕ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ НА ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВИТАМИНА Ю2 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ШЕРЕИТА1Ш03Е У МВОТНЫХ И ПРИ ЛЕЧЕНИИ ВИТАМИН О-РЕЗИСТЕНГНОГО РАХИТА У ДЕТЕЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1996 г.

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности России

Научные руководители - доктор медицинских наук, профессор А.А.Ананенко - доктор биологических наук, профессор H.H.Крндрашова

Официальные оппоненты -

доктор медицинских наук, профессор А.Л.Терентьев доктор биологических наук Ю. Г. Каминский

Ведущее учреждение: Институт педиатрия РАМН

Защита состоится " " _ 1996 года

в " и часов на заседании Специализированного Совета К 0841405 в Российском Государственном Медицинском Университете (117869, г. Москва, ул. Островитянова,1). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного Медицинского Университета.

Автореферат разослан " " ';__ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доцент

Т. II. Клузаша

Актуальность проблемы.

Более полувека прошю о тех лор, когда-бьш открыт витамин D . получивший широкоо признанна в медицине в качества эффективного антирахигичесгсого сродства.

В педиатрии ватеиннИ применяется ае только при витамин Ц -дефицитном рахате, ио и у детей о наследственными фортами рахитоподобшх заболеваний - витамин 1) -резистентный и витамин D -зависший рахит и ряда других заболеваний (Ю.И.Ба-рашией и соавт., 1977, Ю.Е.Водмицвв, М.С,Игнатова, 1992, П.В.Новиков И соавт., 1993, ¡I.Huller , 1973, Т.Saino et.al. 1980, a.Sagsese et.al. , 1387). использование Шсоких ДОЗ витамина D при наследственных формах рахита иожат вызвать развитие гипорпитаииноза J& (В.Б.Спиричев, 1974, Н.А.Барлы-баова, И. Стругов, 2979).

Клиническая картина гидорвитащшоза Д) проявляется в интоксикации, нарушении обмена кальция, фосфора, поражении нервной, сердечно-сосудистой сисю«, золудочно-кшечного тракта, но особенно часто и тякело страдаэд почин, вплоть до т язю лого нойрокашцшоза и почечной недостаточности (В. Б. Спнрич ез, ISG3, В.К. Бауман. 1971, 1989, В.Н.Титов, 1992).

Кал установлено, витамин Э обладает прооксиданткши

свойствами. Гицорвагаашюэ J3 сопровождается повшониом коц-

*

цснградии свободных радикалов в организма ч о лов ока к ¡швогшх, усиление!-! процессов псрекисного озяслбняя дипвдов. Это'приводит к новрегдешга цомбр&н, нарушению структурной и Функциональной активности митохондрий, разобцешт окислительного фос$ори-лзровагсш в линях дочея, сердца и других органов (В.Б.Соири-чев, X97G, 1287).

Избыток витамша D и его метаболитов молот оказывать прямое повревдшощео действие на ыамбраш и клетки (В.Б.Сшгри-чев, Н.А.Блакеевкч, 1968, J.Silver et.al. , 1978).

К факторам, смягчающим шш ослаблявщим гипарвигаминозЬ откосятся глжокортнконды, кальвдтошш, витамины А и Е, бифос-фэиаха. Однако» одновременно эти препараты, устраняя те шш инне нарушения обмана, могут оказывать побочные действия ( W.i.Strek et.al, , 1979, A.b.Melz et.el. . 1986, D.Eubiager et.al.» 1387, В.К.Бауман, 1339).

Полагаем, что препаратом вибора при гипервнтшиноэе В мошт бить янтарная кислота (C^HgO^). Янтарная кислота является нормальным клвточцьс.1 ыегайолдтом» играет болыдув роль в обеспечении энергетического баланса клетки, обладает анти-окевдангша! ц анхигипоксачвеквл деЙствнзи, участвует в переноса электронов, 'поддоргиваот транспорт кальция, устраняет метаболический ацидоз, стулируот стеровдогенез, ослабляет токсическое действие лекарсгвоншх веществ я др. Ш.Н.Ковдра-шова и соавг., 1973,1976,1934, В.И.Вдовкченко и соавт.,1976, Л.Г.Менагадзе п соавт.,1985, И.Р.Саакяя.и соавт., 1994, В.Chanco , 1963, а.Б.Beyer, 1990, K.Hofcutan ot.al. , 1991).

Работай М.Н.Кондрашовой (1976, 1990, 1994) и ее школы установлено большое значение янтарной кислоты, как важного фактора адаптации. Влияние-во на организм состоит б усаленил бзяхлмичасгож и физиологических восотанопЕтольинх процзссов, что является основой нормализующего влияния янтарной кислоты иа декгельность «алого ряда вцугрзшко. органов к тканей.

ú связи <: вшлеазложандаи, целью рабогн язилссг установление ;>лк:шкя янтарной. кислоты на токсическое дойспмю вата-

шша 3) g вксперимостальном гшхервитаотноза D 2 У яш-.вотных и 'пра лечении витамин D -резистентного paznia у детой.

В работе были доставлены следующие задачи:

1. Исследовать процессы первкисюго окисления липидоб

в тканях, плазиэ крови, эритроцитах и антиокислительдуи-активность плазма крови при гипорвиташшозэ D 2 У крыс.

2. Проанализировать возмоаша морфо-биохимические параллели мейду содераалиом продуктов шрекисного -окисления лшидов, антиокислительной активность» длазш крови и структурными изменениями исаыаЁ и эритроцитов пра экспериментальном гилер-вптаминозе J) 2»

3. Определить возможность использования янтарной кислоты, как энаргопротектора развития гшервитаминоза D ^ У экспериментальных аивогных.

4. Выявить влияние витамин D g-repanmi иа показатели системы пврекисноо окисление лиапдов - гштиоксодаятяая защита, фосфэрно- и оксалатно-кзлъциевого метаболизма, структуру эритроцитов у дохай с витамин D -розаствкгньм рангом.

5. Установить эффективность влияния янтарной кислота в вида шздзвой добавки па показатели системы 'порокислоа окисле-jffie ляпидоз - аятиоксидантная залита, фосфэрнокальциевого матаЗолизиа» структуру эритроцитов ■ у детей, получавшие buco- _ кие дозы витамина 3 g»

Работа вшюлнепа в Московском нцучно-пселодовательскои института педиатрии к детской хирургии ¡Лагздракледпроиа Р5 (директор -академик РАМН, проф. Ю.Е.Вальтищов).

Реализация поставленных задач к цели осуществлялась в лаборатории патология сб:лека зощэств (рук.лзборатории- про-

фа с сор Э. А. Юрьева) и в отдела радиационной экопатологии детского возраста (рук.отдела - докгор мед.наук Л.С.Бажова). Клинические наблоденая проводились водуирм научшш сотрудников П.В.Новиковым в отдела вровдешшх и наследственных заболеваний института (рук.отдела - профессор Я.3.Казанцева). Морфологические исследования осуществлялись совместно со ст.науч.сотр.' Н.В.Клэйменовой, ст.науч.сотр. А.В.Брыдуном в отдела клинической патоиорфэлэгик (рук.отдела - профессор А. И. КлембовскиЁ).

Научная новизна

Впервые установлено влияние янтарной кислоты на токсическое действие высоких доз ввтемшза I) при экспериментальном гипорвиталинозе 3) у аивотннх и при лечении витамин I) -резистентного рахита у детой.

Показано, что применение янтарной кислоты при введения массивных доз витамина В 2 экспериментальным яивоткш оказц-ваат шлиоксвдантный эффект, предотвращает повреждение клеточных и внутриклеточных мембран почек и мембран эритроцитов и развитие иоф?окальциназа. В основа мембраностабилизирующего и антиокевдантного эффекта янтарной кислоте левах ее действие, как энергопротектора.

Выявлено, что у детой с витамин I) -резистентным рахитом на фоне нарушокгя фосфорно-кальциевогс обмена» обнарукены гипероксалурия и повышенная экскреция дерокисшас соединений

с мочой.

Использование высоких доз ват амида ,Ь у этих детей с лечебной целъа приводит к дальнейшему нарастанию почечной окскре—

цаи оксалагов и повшешт продуктов парекиспого окисления лилидов в крови и моче.

Применение естественного метаболита - янтарной кислоты в виде пищевой добавки аа фоне комплексной терапии детей о витамин ]) -резистентным рахатом, получавших высокие дози витошша X) 2> оказывает, наряду с клиническим, алтноксп-даятшй эффект, стабилизирующее действие на мембраны эритроцитов, сникает экскрецию оксалагов с мочой.

Практическая паггпость пабоуы

Дано экспериментальное обоснование для клинических испытаний препарата "янтарная кислота" я проведено его испытание с цольа смягчения токсического воздействия высоких доз вига-шша и £ У Детей с , витамин I) -резистентным рахитом.

. Прадлогепо использовать метода биохшкчоского контроля за проявлением токсического воздействия высоких доз витамина ]) 2 путем количественной оценка почечной экскреции оксалатов и перекисных соединений в крови и иочо у детей с витамин I) -резистентшм рахитом.

Внедрение работы

В работу отдела вровдепшос и наслэдсгвзнша заболеваний Московского НИИ педиатрии и детской хирургки'ИЗШ РФ внедрены и исподьзозани метода биохимического з^овгроля за проявленной токсического воздействия высоких доз вжгааина Х>2 У Дотай о виташш Б-розцсгввтшм рзхжтоа. Проведены клишнескно испытания препарата "янтарная кислота" . п показана ого эффективность у детей с витамин])-резистентный рахита*.

На основании проведенных исследований оформлена рационализаторские иредлоаеыия: "Способ определения антпоксидант-пой активности янтарной кислоты ин витро " ('5 702 от 27.07. 1989 г.); "Способ диагностики токсического воздействия высоких доз. витамина В 2 на метаболизм у детей с фосфат-диабетом" (й 1006 от 11.05.1994 г.),- "Способ смягчения токсического воздействия высоких доз вита". л;а Ь 2 7 детей с фефат-диабе-тои путем применения янтарной кислоты" (й 1025 от 4.01.1995 г.).

Получена приоритетная справка & 95106404 от 4.05.1995 г. на изобретение "Способ смягчения токсического воздействия высоких доз витамина £ 2 У дотей с витамин I) -розистонгиыи .рахитом путем применения янтарной кислот".

Аяробадия паботн д публикации

Наторкали диссертации долокенн:

- на рабочем сововдлии "Применение янтарной кислоти в медицине, микробиологии и растениеводство" (Цувдшо, 1992);

- на Российском съезде медицинских генотипов (Москва, 19Э4);

- на объединенном методической заседании отдела радиационной экопатолоиш датского возраста, лаборатории патологии обмена взлоогв и отдела врожденных и наследственная заболеваний МНКИ педиатрии и детской хирургии (1995).

Диссертация излокона ьа 153 стр. малшшикеного текста, состоит из з'с?даю;н, обзора лнгоратури, чотирох глав собствен-кас исвледээациК, заткешь вино доз, практических рэкоиенца-х,;ш, улазагвлд ллтаратлк». вшившего кеточнпкоь

( отсчасчЕзлкых л ю;; срубодп^:: агглчюг?. •/гб'га

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Уярацтерпстиха эксперимента.

В эксперимента использованы белне нелинейные крыс« массой 120-150 г. Гилорвитамякоз I) 2 У крас вызывали по методу Э.А.Юрьевой (1979). Экспериментальные яивотше составили три группы: .

1-я груша - контрольная (интактные тавотные),

П-я и Ш-ья грушш - опытные.

П-й группе аивотшпс вводили спиртовой раствор витамина ц 2 ро? м а дозе 75000 МЕ/кг масса тела I раз в сутки в течение трех дней.

Ш-ой группе крыс вводили ту яо дозу витамина I» ^ и '¿$ раствор фармакопейной янтарной кислоты рог« о.г в дозе 50 иг/кг массы I раз з сутки в точение трех дней. Янтарная кислота бала ярэдоставлона Краснодарским полягехтяесккм институтом.

На 6-7 день о пита еивотньсс докашиировали.

Маге риалом для исследования слуаш! эритроциты, плазма яровн, ткащ, почек и пвчони,

Хярах?нт»'готст',.п детей с дир^тд^Д) .гд^лстридим ра^нт^ч. ■

Под надет найпздошми било 47 детей з возрасте от 3-х до II лот, обоего пола с гшшчшаи ялшвиескгли прошшшшша ввтачна Л> грознстенгного раина (Н)РР). Больнке находились на сбследовгаак и дзчоцик в отдала прогдошиа л насладс!вен-ню: улсгпгута.

Дети распределена на три группы: первая группа ыилнала сильных о ШРР, нелечешых, диагноз которым установлен в специализированной клинике;

вторая и третья группы - дети с ЕБРР, получавшие высокие дозы витамина Ц^» которые превыиалп профилактические и обычные лечебные протнворахитическке в 2-19 раз и составляли 10000-96000 )<Ш/сутки. Дети третьей группы одновременно с витамином получали фармакопэйиую янтариуэ кислоту в дозе 100-200 ыг один раз в сутки в течение 10 даой. Янтарная кислота разрешена для использования в качестве пищевой добавки из СССР на основании экспертного заключения института питания АМН СССР К 72-163 от 18.02.1391 г.

Контрольную группу для оценки почечной экскреции оксала-тов и перекисных соединений составили 10 практически здоровых детей того жэ возраста.

Материалом для исследования сдугили эритроциты, плазма крови, ыоча.

шггода ШСВДОВАЕ',:

Бпохвдичеисио метод» исследование: О состоянии фосфорно-калвдиевого обмана судили по определению стандартными методами содержания неорганического $ос-£ора, кальция в щзови и моча, активности щелочной фосфатазы, клиренса фосфатов. Исследования выполнены в лаборатории клинической биохимии (рук.лаборатория - Т.В.Плаксняа).

Определение экскреции оксалагов с иочон проводили по методу Г.В.Сиворщювского (1569), при этом оцаюизаик как суточную, так и относительную экскреция оксалагов на.мкколь креатшшна. '

Для оценки состояния процессов перекисного окислония липпдов (ПОI) определяли в плазме крови, эритроцитах и тканях порвичныо продукты ПОД - гидроперекиси (ТП) (В.Б.Гаврилов и соавг., 1983), днедовыо коньюгатн (ДК) (Н.К.Шилияа и соавт., 1978); вторичный продукт ПОЛ - малоновий д^адогдд (МДА) ( Ishlhara Ulr.ora , 1978); конечные продукты ПОД - основания &4$а (ШО) С vi.Blülak <¡t. al. , 1973). Почечную экскрецию перекисай определяли по методу S.A.Graí (1988) в модификации ' Э.А.Юрьевой (1982) в внражали в относительных единицах на мкмоль кроамнина.

Дет оценки общего анткокислиельного потовдкала плазмы крови использовала определение антиокделитольпой акттшости(АОА) (Г,И.Клебанов и соавг., 1985). Активность анткоксидантшго форманта плазмы кровп суггороксвдцисцугазы (СОД) определяла по методу В.II,Чумакова и соавг. (1979), прооксидантного фермента ксангиноксздазц (КО) - по методу Э.А.Юрьевой и соавт. (1991).

Общао дтццц определяли гравиметрический методом. Всего выполнено 2280 биохимических исследований.

МоуТютагг^чпскчд ^втодч исс^дщш-тя;

Световая икхроскопия.

Кусочна тканей дочки а лочоиа кассировали в 10% раствора нейтрального ^врмалика а в 80$ спзрте, органы после фиксация поиогшя в парафин. Среза, яолучэгшые с парафиновых блоков, 'окрашивали геглатоксихшом, эозином, шасро&укщшом по Ваи-Гизону, применяли Шик-^ошедпо на гликоген и аойтральныо полисахариды с соответствующий контроля:,!;:. Для обнаружения соодинонкй кальция использовали мэтод Косса с цитратом соробра.

Метод подутотсшс срезов.

Кусочки тканей и отмытые из крови эритроциты фиксировали в 2,5/5 растворе глитараладегида на 0,2 41 фосфатном буфоре СрН 7,2) с посгфаксацией в 1% раствором четырехокиои осыия, дегидратировали этиловым спиртом возрастающей концентрации, заливали в эпон-аралдит. Срезы окрашивали толувдино-

ВЦГ.1 СИНИМ.

Электронная микроскопия.

Фиксации органов проводили раствором 2% глитараладегида о постфиксацией 1% раствором четырехокиси осмия. Ткань заключали в аралдит. Ульграгошсие срезы контрастировали уранил-ацотатоц и цитратом свинца по Рейноладсу. ■

При подсчете различных форм эритроцитов за основу брали методику, предлокенную Н. И. Моче новой (1991).

Материалы обработаны статистически. Достоверности различия одноименных показателей вычисляли по формулам параметрической вариационной статистики о использований'.: критерия Стывдента.

РЕЗУЛЬТАТ!! КССВДОВАНШ. И ИХ ОБСУЕДШШЕ .

Экспериментальные, исследовании

Развитее гшервигаыияоза 3) 2 У крыо характеризовалось интенсификацией процессов ПО! в крови, о чау свидетельствовало достоверное повышение в ыопбранах эритроцитов первичных и коночных продуктов ПОЛ на 40-47/: по сравнения с контролем. Достоверно изменилось содержание продуктов ПОД в плазме крови: ГП и Дд увеличились на ВО-00%, Ь5ДА - на 40;$, Ю - на 60^ по сравнении о контролем. Ото сопровождалось сшженлом АСА и актив-

нооги фориопга антлоксвдантной защиты супор^иссвдщюдутйзи-(СОД) (K.S. 1,15.1.1.). Наблвдалась говдншш к повышнию активности прооксвдантного фермоита ксангиноксвдазы- (КО) (K.S. 1.2,3.2.) (рио. I).

Одновременно происходило накопление продуктов ПОЛ в ткани почек и печени в сроднен на 35-40/3 (табл. I), Вмосто с накопленной продуктов ПОЛ найлздалось сшшониа обцэго количества дппздов как з плазме крови, Tait и в тканях почек а печена. Образцот на себя внимание тот фаж?, что интенсификации процессов ПОЛ в ткани почек и почет вдет параллельно с накоплением продпгтов ПОЛ в крови. Это находит лодгвэрвденив в литературе. Taie, по данньы П.К.И'илшгой, Г.ВЛорнавиной (i960), повышение продуктов ПОЛ плазмы иогет бить связано с их поступлением в кровь из тканой. Липопорокиси, образующиеся при инициации ИОЛ в тканях а, в частности, в клеточных мембранах, становясь боло и полярными, легко из шве выходят (А.В.Алоксоешсо, 1901, А.А.Сюршг и соавт., 1991). В физиологических условиях возможность перо-хисного окисления ограничена наличие« «ощшх антиог.сидантных систем» разрушающих укэ образовавшиеся перекиси ила обрывающих процесс пероокислош'л на свободнораднкальшсс стадиях (Ю, А.Владимиров, А.П.Арчаков, 1972),

Каши дашшо об интенсификации процессов'ДОЛ при гипор-витамикозо II 2 находятся в соответствии о данными литературы. Так, В.Б.Слиричов (1975) показал, что повроздаащоо действао высоких доз витамина J) 2 заклэтг.згея в увеличения! концентрации свободная: рцдккалэз и усилении процессов ПОЛ,

».ор^дьэгичсскпо нсслодовалия ткани ночок' и аочони J) ггдгевызирсиашшх при? лтесазалы, что бояоо тгрожшио

лаЗлгиоллсь a uo-i;::ix.

ПЛАЗМА

малонозый ДИЛЛЬАЕГИД

ГИДРОПЕРЕКИСИ

ШИОООЕЫ / ОСНОВАНИЕ

АНТИОКИСЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ

С/ПЕРОКСИДЛИСМУТЛ2Л

ЭРИТРОЦИТЫ

нмоль/мг липидоз

ОПГК ЕДУМГ липидоз

кслнтиноксндлал

ДИЕНОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ

ШИФФОЕЫ ОСНОВАНИЯ

Контроль ш Гкиервитсюш:» К (ГЦ Ммхкзкыа Д01Ы мтккиа Ы + гагарз&я (Ш)

Достоверно ао етлотеаяю * I группе - Достоверно по отношекк» »о П группе

Ряс. I. ЕЛИЯНИЕ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ПОЛ-АОЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ И ЭРИТРОЦИТОВ ЖИВОТНЫХ. ПОЛУЧАЙ ив о; МАССИВНЫЕ ДОЗЫ ВИТАМИНА 02.

Таблица I

Содарзаниэ продуктов ПОЛ в тканях почек а печени крис при гипврвитаминозо Б £ л вдияниа сочотанпого аримнаниа виге-лша Ц 2 а янтарной кислоты на зтн

показателя

----I---1 1 ..............

показателя ; Почки_|_П 9 ч е н^ь

Г'гтгпч ! ДК ; Ш | Дд ; Ш

чГиютша I вяш/иг липвдов ! отн.ед./иг } !

} люздов I -я™1«03

■ -■- ■■ —- ■ - ■ .......................* ................* I .- - и _г ■■• ■ * ' I

•-4

1. Контроль 4,6 £ 0,2 0.27 £ 0.02 6.13 £ 0,41 0,35 £ 0,02 "

0 = 9

2. Опыт 8,3 £ 0,19 ^ 0,об £ 0.0-1 12,3 £ 0,33 ^ 0.4Э £ 0,03 ^ п = 3 ' - 0,05

3. Ооит + 5,4 £ 0,230,3 £ 0,01 9.5 - 0,79 ^ 0,4 £0.012,^ янтарная кислота :.

а 3

х)

достоверно по отношении к контроле

• ^ достоверно по отноззш» ко 2-й группе

Результаты исследований свидетельствуют о накоплении депозитов кальция в корковом олоо почек а эпителии дисталь-Ш1х канальцев и появлении зон некроза в интерстиции почечной ткани. Страдают клэточние органеллы, особенно митохондрии, для которых характерным являются накопления кальция и деструкция мембран. Обнаружены округлые, значительного размера каль-цифицировашше лизосомы. Такие изменения в почках рассматриваются, как развивавшийся нефрокальцикоз.

Результаты морфологического исследования позволяют считать, что гилервитаминоэ ]) 2 может быть использован для создания модели тяжелого поражения почек, обусловленного ионами кальция.

Бодунам регулятором в балансе кальция в клетках эпителия почки являются митоховдриа. Они служат кальциевым буфером, особенно в ¡слетках, не имеющих обширного резервуара кальция в виде эвдонлазматического ротикулума (М.Н.Кондрапгава, 1989, Ы-ИЛопаглаИота , 1982, А.Ц.ВаЬэку , 1986),

При активном состоянии клетки митохоадрии подвергаются усиленному притоку кальция в связи с гормональной стимуляцией. При хорошем состоянии функций энергообеспечения в митохондриях (синтез АТЗ и генерация потенциала), они оперативно аккумулируют входящий в клетку кальций в период активности. Это обеспечивает хорошее протокакие восстановительных процессов при деятельности. В дальнейшем в период покоя митохондрии мохут высвобоздать накопленный кальций, согласно некоторым дашшм, дажз , но вкеклеточноо пространство. При ослаблении процессов ;?Н'мя'эобоояочои;и в иитохоцдрвях, их способность а^адаулировать калхц.:/: значительно сниглетсл или торяотся. Бра »том кальций

заполняет другие возмошше депо, в частности, лнзосош, как показано выше. Однако, этот механизм аккумуляции кальция более медленный и меньше защищает мембранные структуры от воздействия кальция. Такко известно', что кальций пцдуцируег' активнобть липаз и перекисное окисление С S.Tomaa at.al., 1994).

Для печени характерным признаком нарушения ее структуры служа г появление отдельных двуядерных клеток, а также обнаружение гепагоцигов в состоянии белковой дистрофии.

При морфологическом исследовании эритроцитов установлено, что у клвотных с гипарвигамииозом В 2 происходит трансформация дискоцитов в эхиноциты 1-1У порядков (85% от общего числа эритроцитов при норме 10-12$). Среди эхиноцитов больший процент выпадает на долга эхиноцитов Ш порядка, представляющих собой клетки о конусовидными выростами с явления.«! микровези-куляции. По данным литературы ( Andoreon , Lovorien , 1981) этот этап трансформации эритроцитов является грань» обратимости, поскольку в дальнейшем из-оа массивной потери мембранного материала обратная трансформация становится невозможной. В результате микроввзикуляции и гликроклазматоза эритроциты теряют до 30—105? мембранного материала, превращаясь в микро-сфероциты диаметром 3-4 ммл. Повышение количества трансформированных эритроцитов связано с уменьшением АТЗ, накоплением кальция и изменением внутреннего слоя мембран ( P.l.ieCoiie , 1976).

Таким образом, на основании проведанных исследований установлено, что гилерзлгамичоз J) , у экспериментальных животных приводит к :шгенс;цаг.апдк процессов ИОЛ в плазме крови. мембрзиах эрахроакгоз, гюии почок « печени, сиежошуэ ЛОЛ, агтавяосг:: антзояогдактиои» J^cuohra, fKAimwv;.) еэдио-

кания обилх липвдов, развитию нефрокальциноза и трансформации эритроцитов.

С цалио продунровдешш развития гипервитоминоза В 2 в данной работе использована фармакопейная янтарная кислота одновременно о введенном токсических доз витамина I) 2 и дрослокюна еффоктипность ео воздействия на организм кивотах. Сначала были проведены исследования ин витро, в которых показано влияние различных концентраций янтарной кислоты на со-дорьлнае продуктов ПОЛ в ыомбранах эритроцитов. Эти опыты свидетельствовали о наличии антаоксвдантного зффокта янтарной кислоты, нарастающего с повышенной ее концентрации. Ангиокси-дантный эффект выражался в достоверном снижении содержания ДК и ШО на 60-6 б'*. Эти данные явились осноьаниом для последующи

исследовшый влияния янтарной кислоты на организм животных, о

подумавших токсический дозы ьитшина

При сочеталкои использовании янтарной кислоты и витамина X) 2 У кшзоишх установлено протекторное действие янтарной кислоты, которое проявилось в положительной динамике биохима-ческих и морфологических показателей. В частности, применение янтарной кислоты способствовало достоверному снклвшш уровня продуктов ПОЛ в плазм о крови юаюгишс: Ш и ДК - почти в два раза, МДА и ЕЮ - на '¿0% по отноиани» к группо кивотши о гилервиташшозоы £> -¿, Первичные и вторичные продукты ПОЛ плазмы, а г акта ДК и ШО зритроцатов достигли дорьш.' Одновременно нарастала АОА плазмы крови, однако оставалась есэд ниео норлш. Нормализовалась активность антаоксидантного фермонта СОД, а актпзность дрооксидантного (¿ермонта КО сш'.з;:дась па 40^ (рис. I).

В ткани почек и почани также умоньаилось содеркаяио продуктов ПОЯ в сродном на 20% по отношении к показателям группы животных о гшервитаминозом D ^ (табл. I). Однако, тенденция к нормализации процессов ПОД а тканях била вира-кона меньше, чем в плазма н эритроцитах.

Применение янтарной кислоты привело к достоверному повышению содержания общих липвдов в крови и тканях ночек к печени.

Подтворздениеи биохимических данных об эффективности сочстаниого применения витамина D g й янтарной кислоты являются результаты морфологических исследований. Под воздействием янтарной кислоты количество эритроцитов с необратимыми изменениями снизилось о два раза. Пршенонио янтарной кислоты способствовало защита эритроцитарных мембран и нормализации их структуры. Патологические изменения в ткани почек и печени менее выраконы, особешю в почках. Наблвдалось значительное утленьшенио накоплений кальция, отсутствие зон некроза. Отмечалась больная сохранность клеточных органелл. Янтарная кислота предотвращает развитие патологического процесса в почках, ее применение приводит к заздте внутриклеточных и клеточных мембран. сохранности 1Слеточ!шх органелл, особенно митохондрий, предотвращает огложошш кальция п клетках и развитие тяглого поражения почек. Следовательно, янтярная кислота оказывает прогекториоэ действие на организм животных, получавших токсические дозы витамина L В основе мембрало-стабилизирующего и ангиокепдантного влияния янтарной кислоты легат ее действие как энергопрогоктора. IIa исследованной подели повротдогшл почек попами кальция янтарная кислота проявила

свое специфическое действие активатора энергетического обмена и при ого нарушении выступила в роли корректора энергетического метаболизма ив: энергопротектора.

Но дашшм-М.Н.Коццрашовой (1889, 1994) .янтарная кислота является уникальным субстратом, обоспочившощжл энергией активную деятельность ткани и транспорт кальция в митохондрии. По-видимому, специфическое усиление янтарной кислотой энергетических процессов и транспорта кальция в митохондрии является основным механизмом нормализующего действия при кальциовом повревдонии почек. Антиоксидантноо действие янтарной кислоты, показанное в данной работе и известное ранее (М.Н.Коцдргшова, 1991, П.Р.Саакян и согшт.., 1994, к.Поки^ап , 1991), является следствием ускорения ею таких энергетических (функций ыиго-ховдрнй, как генерация протонов, электронов, синтез АТФ.

Результаты проведенных исследований шляются экспериментальным обоснованием использования янтарной кислоты в клинико с целью смягчения действия высоких доз витамина Л

Клинико-биоуимичоскиа исследования

Витамин В-резистенпшй рахит являотся тем сшым заболеванием, при лечонии которого широко применяется высокие дозы витамина 1)2, а следовательно, возмонно развитие гипераигами-лоза X) 2< В соответствии с результатами экслоряаангаллной части работы у больных ДВРР в динауико наблвдения нроводеш . исследования показателей системы ПОЛ-АОА, оксалаа'ко-кальциевого гоиеостаза, ^осфорно-кальцлсвого обмена и дана оценка влияния на эти процессы как од!:ого витамина I) п> так и сочеташюго г.риионешш витамина Д) о и яитапно!. кислоты. Параллельно проводили монологическое исслодовгааш эсагрс • -.'ов.

Дата о HDPP наблвдались до применения витамин Б 2-терапии и на фоне ее применения через 10-14 дней.

Клинические наблюдения больных. ДОРР показали наличие общих признаков заболевания (скелетные аномалии) и специфических - сцепленный с Х-хромосомой тип наследования, а также варусный характер костных деформаций, задержка ежегодных темпов роста, нарушение походки и искривление нижних конечностей.

Биохимическими признаками HDPP явились: пшофосфатомия (0,4-0,7 ммоль/л при норме 0,65-1,6 ммоль/л), повышенный клиренс фосфатов (0,57-2,1 мд/с при норма 0,1-0,25 mVc) , гиперфосфатезия (380-650 шолц/л"^с~^ 'при норме 83-250 н>,юл1/л~^с"^) при сохранении нормокальциемии (2.3-2,8 нмоль/л). Одновременно с этим установлена умеренно повыиенная экскреция оксалатов с мочой как по абсолютным показателя,! (Р<0,01), так и в пересчете на I мкмоль экскретируемого креатшшна (р-й 0,001).

При анализе результатов исследования показателей ПОД установлено, что заболевание сопрововдается значительной экскрецией перакисных соединений с мочой (p^O.OOI) и менее повышенным содержанием юс в плазме крови.

Морфологическое исследование эритроцитов у больных о EDPP показало, что 20>i эритроцитов от общего числа (в норме 10-12;») составили эхиноциты 1-Я порядков с преобладанием эхкноцитов I порядка. Такая трансформация эритроцитов является незначительной и считается обратимой.

Таким образом, у детей о ШРР на фона нарушения фос^орно-чсальциевого обмена обнаружены гилерокездури i, повниимшая экскреция перехисиих соединений с мочой, нарушение сг;о'ксуры эритроцитов.

Показанием к назначению высоких доз витамина I) £ сдували нарушения фосфорно-кальциевого обмена, явления остео-пороза и остеомаляции, отсутствие эффекта от применения терапевтических (антпрахитглеских) доз препарата. Высокие дозн витамина Д) 2 в Дшшои исследовании но достигали максимально высоких доз, применяемых при этой патологии. За период проведения витамин I) 2-горапин но возникало побочных клинических явлений к дополнительных изменений фосфорно-кальциевого обмена, свидетельствующих, о развитии пшервитшшюза Л

На фоне применения витамина X) 2 в «оченно 10-14' дней .показатели минерального оба ела существенно но изменились. Оставались повышенными значения активности «елочной фосфагазц и клиренса фосфатов. Под'влиянием высоких доз витамина ])% увеличилась почечная экскреция оксалатов и после 10-14 дней применения препарата оксалурия превышала норму в два раза, Обпаруаоше отого факта имеет вагноо клхшчоское значопио, та:: как увеличение почечной окскреции оксалатов до. гкперокса-дурии в сочетании с пшеркальциур130^ представляет потенциальную опасность формирования оксалатно-кальциевого нефрокашщ-поза. Дашшо о нарастании оксалурин у нзЗлвдасакс вами больных с ШРР при введении высоких дез витамина $2 находятся в соответствии с результатами экспериментальных исследований Э.А.Юрьовой (1979). Автором было показано, что увеличение почечной окскреции оксалатов при йшгоксЕкацда витамином I) % сопровождалось разрушением большого кодиюства §осфолшщдов, содорЕащшс предшественники оксалатов (серии, зтаноламия). ■ Последнее является результатом активации фосфолшаз А и С. (М.-Я.А.Цусаев, 1930).

Проведанный анализ состояния процессов пероксидацил у детей с BDPP после курса витамин Г^-горапии показал повышение продуктов ПОЛ в плазме крови (ДК и 1Ю) (рис. 2) и в ыоче в 1.5-2 раза (табл. 2), а такке снияонло антиокислитвДь-лой активности плазмы крови. Обращает на себя внимание тот факт, что нарастание пэрекисных соединений в мочо более выра-seno, чем в крови. Моано предположить, что процессы ПОЛ налбо-лео интенсифшофовахш в почках, г.огорпо, как показали нала экспериментальные исследования, значктольно попрощаются при пшорвпгашшо з о D

Морфологическое исследование эритроцитов показало, что применение высоких доз витамина D 2 приводит к дальнейяой трапейориацки эритроцитов. Зхиноццгн 1-1У порядков составляла 50/i от обгдаго числа эритроцитов с преобладанием эхиноцитов 1-П порядков.

Таким образом, применение высоких доз витамина J) 2 У болышх Щ)РР с лечебной целью в течение короткого времени не оказало существенного влияния на фосфорпо-кальциовый обмен, однако, приводило к далыюГгсо'.г/ нарастанию почечной экскроцпи оксалатов, интенсификации процессов пероксидации, а также увоякчешт повревдония эрпгроцитарных мембран.

Изменения, происходящие у больных Щ)РР под действием высоких доз витамина X)2> эффективность применения янтарной кислоты при экспериментальном гипорвнтачишозо J) 2,явились патогенетическим;обоснованием применения этого препарата в Инде пиэдвэй добавки у больных 5DPP. В данной работе янтар-нуЯ кислоту Пр!г.!оняли для силкения токсического воздействий высоких доз вжгдаяпз Х> ? У детей с BDPP.

Рис. 2. ВЛИЯНИЕ ВЫСОКИХ ДОЗ ВИТАМИНА 02 И СОЧГТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ВИТАМИНА И ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ПОЛ-АОА ПЛАЗМЫ КРОВИ У ДЕТЕЙ С ВИТАМИН С-РЕЗИСТЕНТНЫМ РАХИТОМ,

—— Норма На фсаа юташш 02-торапци ............ До питании ОЗ-терашш --------— Витшаи В2-терааал 4- янтаршя кислота

При сочеганнш использовании этих препаратов у 23 детей о ЯЗРР но наблэдалось каких-либо токсических проявлений со стороки клинических данкш:, биохимических и иорфологпчосккх показателей. Клинический наблодзния свидетельствовали об уизнь-сшнкн Егиоцкопалхло-волэвю: наругюпдА: швшюнио активности, работоспособности, внимания, удучгзкпо панятк, Включение яяхар-вой кислоты в рацион дотай с ВДРР пр£ьод,иш к достоверно;?/ ешадшш содержался продуктов П01 и плазла крови и шче по огювэшш к иоказагаюхл до ее промокания ь среднаг ка 15-20^'.

Таблица 2

Влияние высоких доз витамина И 2 и сочотанкого применения витамина I) 2 и янтарной кислот на почечную гкскрецшо оксалатоз п перекисей,у детой с витамин

1>-розпотангным рахитом

|_Оксалаты_

! мкмоль/сутки {мкмолг/икмоль 1 | креатишша

; Перекиси"} огн.ед./мкмоль | креатанпна

1, До витамин ])о-т аралии 145 * ю,2 4,93 £ 0,39 4,9 £0,58

д .= 15 Р1-1 <0,01 <0,001 -10,001

:1а такз зшсшц ^-терапии

л - 13 230,4 ± 12,7 7,3 £ 0,39 7,6 £ 0,39

<0,01 <0,05 . <0,001

.ам&ган и2-Фврая2й + янтарная 178,7 - 13,4 6,4 £ 0,24 6,7 £ 0,125

^2-3 <0,01 >0,05 <0,05

лонгроль, и - 10 96,6 £ 1,8 2,2 £ 0,16 ' 0,27 £ 0,04

зчсс^е: р-г_, - достоверность различий кэзду показателями I а 1У групп ■ Рт_'> - достоверность различий ме'вду показателями I и П групп р ^„3 _ дсотоверность различай мевду показателями П и Ш групп

Одновременно нарастала АОА плазмы крови (р<0,01) (рис. 2, табл. 2). Сникало сь суточное количество оксалатов мочи (р<0,01), а тглзе их содераашш в пересчете на кроати-шщ, однако оставалось еще выше норш.' Применение янтарной кислоты способствовало улучшению показателей фосфорно-кальциевого обмена. Увеличилось содерхание неорганического фосфора в крови на 20/5 при нормальном уровне кальция, активность молочной фосфатазы снизилась, но оставалась еще высокой по сравнению с нормой. Высоким был клиренс фосфатов, хотя произошло его снижение на ЗО/о. Почечная экскреция фосфатов увеличилась и достигла нижней границы нормы, экскреция кальция возросла на 40$, однако оставалась ниае нормальных значений.

При .морфологическом исследовании эритроцитов установлено, что большинство -эритроцитов составляли.дискоциты (80-£8#). На долю эхиноцитов 1-Ш порядков приходилось до-12$. Сфероэхида-циты 1У порвдка отсутствовали. Эти данные свидетельствуют о мембршюстабшшз.црующшл эффекте янтарной кислоты.

/ Кроме того, в данной работе была проелекена эффективность воздействия янтарной кислоты.на метаболизм детей через 15-30 дней после окончания ее применения. Несмотря на то, что фактор, отрицательно действующий на метаболизм сохранялся (введение витамина В 2), эффект от применения пищевой добавки янтарной кислоты продолжал действовать в точение месяца. По-зидамоцу, повшеняе эффективности действия янтарной кислоты ыоезт быть . достигнуто применением лечебных доз, увеличением продолжительности курса и предварительным применением янтарной кислоты до назначения витамин Д^-горапии, что следует использовать в дальнейшем при клинических испытаниях препарата.

Следовательно, на основании проведенных исследований установлено, что одновременное применение витамин Е^-^зршш1 и янтарной кислоты у детей с В])РР способствовало снижению интенсификации процессов пероксвдации, повыяению ангиоксидантзой защиты, уменьшению почечной экс1феции оксалатов, улучшению структуры эритроцитов. Результаты клшшко-бпохкмических исследований подтверждают данные, получешше в экспериментальной части работы.

Проведенные исследования позволили дать патогенетическое обоснование применении янтарной кислоты у детей с ШРР с целью с«ягчош1я токсического воздействия высоких доз витамина Х^.

'/•ВЫВОДЫ

I. Введение массивных доз витамина Д)з экспериментальным яивотныгд приводит к развитию нефрокальцкноза и трансформации эритроцитов, в основе которых лежит интенсификация процессов ПОЛ, меибрано-деструктивный процесс и нарушение кальциевого обмона.

2. Применение янтарной кислоты при введении массивных доз витамина I) 2 экспериментальны.; животные оказывает антиокси-дантный эффект, предотвравдет развитио нефрокальциноза и пов-ревдоние клеточных и впутриклетоишх мембран почек к мембран эритроцитов. В основе мсмбраностабилизкрующего и антиоксвдант-ного эффекта янтарной кислоты лекит оо действие как энергопротектора. Зги данные послумли оксиоримэнтатьнш обоснованием для примояеиил янтарной кислоты в клинической практике.

3. На фойе нарушения фэсфорно-кальциевого обмена у детей с ЕОРР обнаружены гинероксалурия и повышенная экскреция нарекисных соединений с мочой.

4. Высокие дозы витамина Х>2« применяемые с лвчебной цельи у детей с ЕОРР, приводят к интенсификации перекисного окисления лшидов, дальнейшему нарастанию почечной экскреции оксалатов и изменению структуры эритроцитов.

5. Введение естественного метаболита - янтарной кислоты в виде пищевой добавки на фоно комплексной терапии детей с ЕБРР, получавших высокие дозы витамина X) 2 • улучшает клинические (эмоционально-волевой статус), биохимические (снихе-1ше продуктов перекисного окисления липидов крови и мочи, экс1среции(оксалатов ыочи) и морфологические (стабилизация мембран эритроцитов) показатели, что послуаило основанием для применения этого препарата с цольз смягчения токсического воздействия высоких доз витамина Ь

Ппактич а скиэ векоманлации X. Проведанные клинические испытают эффективности пищевых добавок янтарной кислоты у больных ЕВРР позволяет рекомендовать этот препарат о цольа смягчения токсического действия высоких доз витамина В 22. Рекомендуется использовать методы биохимического контроля для выявления токсического воздействия высоких доз витамина Д) 2 путеы количественной оценки почечной экскреции оксалатов и перекпошх соодшонпй в крови и моче у детей с ЕОРР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Особенности фосфорно- и оксалагно-кальциевого метаболизма и процессов порекисного окисления яипвдов у дотей с фосфат-диабетом// Тезисы доклад. - Первый (третий) Российский съезд медицинских генетиков. Москва» 1994. - С.49-60. (Соавт. П.В.Новиков, А.А.Аяанекко, Н: В. Клейменова).

2. Влияние высоких доз витамина 1> 2 на показатели фосфорно- • -кальциевого обмена, почечной экскреции оксалатов и процессов пероксидации у детей о фосфат-диабетом// Тезисы доклад. - Конгресс педиатров России "Новые технологии в педиатрии". Москва, 1995. - С.333. (Соавт. А.А.Ананенко, П.В.Новиков, Н.А.Федшкина).

3. Влияние высоких доз витамина Д)2 на показатели фосфорно-и оясалатно-калъциевого обмена и процессов пероксидации

у детей с витамин 3)-резистентным рахитом// Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 1995. - .15 4. - С.54. (Соавт. П.В.Цозихов, А.А.Ананонко, Э.А.Юрьева, О.Д.Видута).

4. Ранняя диагностика токсического поздойотвия высоких доз витамина X) % при наследственном витамин И -резистентном рахите у догеД// Тезисы доклад. - У Российский Съезд специалистов ¡Ю лабор.диагностика, Москва, 1995. - С.260-261. (Соавт. А.Л.Анано:псо, П. ¡3,Новиков).