Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль бактериальных биопленок в этиопатогенезе мочекаменной болезни

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль бактериальных биопленок в этиопатогенезе мочекаменной болезни"

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Роль бактериальных биопленок в этиопатогенезе мочекаменной болезни

03.02.03.- микробиология

13 ФЕВ 2014

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

005545003

005545003

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Юлия Михайловна Романова Доктор медицинских наук Любовь Васильевна Диденко

Официальные оппоненты:

Раковская Ирина Валентиновна - доктор биологических наук, руководитель лаборатории микоплазм и Л-форм бактерий, ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Жуховицкил Владимир Григорьевич - кандидат медицинских наук, заведующий клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина департамента здравоохранения г. Москвы

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова" Российской Академии Медицинских Наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН)

Защита диссертации состоится « » 02 2014 г. в « 11 » часов на

заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, дом 18.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автореферат разослан « Л » 01 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного Совека ^ ¿1

Доктор медицинских наук, профессор % [ш В. Русакова

Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Проблема формирования бактериями биопленок широко изучается во всем мире. Огромное количество исследований, посвященных процессу образования биопленок, его генетическому контролю, выполненных на лабораторных моделях (на стекле или пластике, обеспечивающих экономичные подходы для широкомасштабных скрининговых экспериментов), позволили получить принципиальные знания о механизмах формирования биопленок патогенными бактериями.

Особенно важную роль биопленки играют в формировании очагов хронической инфекции при заболеваниях мочевыделительной системы. Мочекаменная болезнь (уролитиаз, МКБ) является одним из распространенных урологических заболеваний. По последним данным это заболевание встречается не менее чем у 3% населения всего мира (Лопаткин H.A. и соавт. 2000). Инфекционные заболевания мочевыводящих путей (ИМП), являются прямыми или косвенными провокаторами МКБ (Вощула В.И. и соавт. 2007). При ИМП отмечается высокий уровень рецидивов инфекции, которая принимает характер хронической с частыми обострениями. При лечении МКБ широко используется различный инструментарий в виде дренажных систем, катетеров, стентов, на поверхности которых могут формироваться биопленки, что приводит к развитию «катетер-ассоциированной ИМП», или «биофильм-инфекции». (Costerton J. 1999; Романова Ю.М. 2004, 2011; Перепанова Т.С. 2012). Бактерии, инфицирующие мочевыводящие пути также способствуют новому камнеобразованию (Лопаткин H.A. и соавт. 2000; Лопаткин H.A. и соавт. 2007; Казеко Н.И. и соавт. 2008).

Интенсивное развитие современной молекулярно-биологической и электронно-микроскопической методической базы сформировало качественно новый уровень исследований, позволяющий анализировать развитие инфекционного процесса, непосредственно используя клинически доступные биоматериалы от больных. Основной стратегией борьбы с инфекционными осложнениями МКБ является антибиотикотерапия, которая в ряде случаев оказывается безуспешной. Особый интерес вызывает проблема неэффективного превентивного (предоперационного) назначения антибиотиков при удалении камней из почечной лоханки, так как в 87,5% случаев развивается пиелонефрит, при отрицательных данных бактериологического анализа мочи. Очевидно, что в этих случаях результаты бактериологического анализа мочи могут не отражать истинного профиля и

состояния микрофлоры мочевых путей. Поэтому актуальной задачей остается проблема поиска альтернативной или дополнительной терапии инфекционных осложнений МКБ с помощью других антибактериальных препаратов, в механизме действия которых предусмотрено разрушение биопленок. Вышеизложенное, указывает на необходимость дальнейшего изучения патогенеза инфекционно-воспапительных осложнений при МКБ и поиска новых способов их лечения и профилактики.

Цель работы - Оценить роль бактериальных биопленок в хронизации инфекционного процесса при мочекаменной болезни и в развитии постоперационных инфекционных осложнений после удаления почечных камней.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

• Исследование мочевых камней различными методами: электронно-микроскопическими, микробиологическими и молекулярно-генетическими.

• Сравнение микрофлоры мочевых камней, удаленных оперативным путем, с микрофлорой мочи больных МКБ, взятой до проведения операции.

• Характеристика выделенной микрофлоры по следующим признакам: способности к продукции уреазы, наличию генов, кодирующих факторы патогенности, способности образовывать биопленки на поверхности полимеров медицинского назначения.

• Изучение процесса образования биопленок на поверхности мочевых камней в эксперименте in vitro.

• Изучение в эксперименте воздействия антибактериальных препаратов на биопленки, сформированные клиническими изолятами.

Научная новизна

• Впервые обнаружены бактериальные пленки на поверхности мочевых камней с помощью электронно-микроскопических методов исследований.

• Способностью к образованию биопленки обладают все, выделенные из мочевых камней микроорганизмы, независимо от их уреазной активности.

• Впервые выявлено, что интенсивность формирования биопленок уропатогенами на поверхности нативных мочевых камней зависит от рельефа и химического состава камня.

• Частота выделения микроорганизмов у пациентов с МКБ непосредственно из камня значительно выше, чем из мочи.

• Отрицательные бактериологические анализы мочи у больных с МКБ не являются доказательством стерильности мочевых камней.

Практическая значимость работы На основании полученных результатов в ходе выполнения диссертационной работы написаны и одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» методические рекомендации: «Способ определения способности микроорганизмов формировать биопленки на поверхности твердой фазы» (протокол №27 от 10 октября 2013г.). Метод запатентован (№ 2461631 от 20.09.2012 г).

По результатам диссертационной работы разработаны и внедрены практические рекомендации в научно-исследовательскую практику Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт урологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инфекционно-воспалительные осложнения и хронизация инфекционного процесса при мочекаменной болезни обусловлены существованием уропатогенных бактерий в составе биопленок на поверхности мочевых камней.

2. Интенсивность и скорость формирования биопленок на мочевых камнях зависят от рельефа и химического состава камней.

3. Субингибирующие концентрации антибактериальных препаратов стимулируют образование биопленок. Резистентные штаммы в присутствие антибактериальных препаратов также интенсивнее формируют биопленку.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы доложены на: Российских научно-практических конференциях с международным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии», Москва, Дом ученых, февраль 2011, 2012 и 2013гг; конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Гурзуф, Украина. 2011, 2012 гг; Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 26.04.2012 г; московской междисциплинарной научно-практической конференции «Современные подходы к лечению мочекаменной болезни в амбулаторной практике» (диагностика, метафилактика и реабилитация МКБ) в Научно-исследовательском центре, ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова МЗ

РФ, ноябрь 2012 г; научно-практической конференции «Мочекаменная болезнь: профилактика и метафилактика» в ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России 23.11.12 г; научно-координационном совете ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России 12.02.13 г; XIII Конгрессе Российского общества урологов. 07.11.13 г; 10th Multinational Congress on Microscopy. Urbino. Italy. 2011; 6,h ASM Conference on Biofilms. Miami. USA. 2012.

Исследование поддерживалось грантом РФФИ 10-04-01690.

Апробация диссертации состоялась 19 июня 2013 г. на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Публикации

По результатам исследований в рецензируемых изданиях опубликовано 7 научных статей, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 9 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов исследования», «Результатов собственных исследований», «Выводов» и «Списка литературы» (80 отечественных и 86 зарубежных источников). Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 5 таблицами, 22 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Материалом для исследований служили 203 мочевых камня, полученные за период с 2008 по 2013 г.г. из ФГУ «НИИ Урологии» Минздравразвития России, из городской клинической больницы №47 города Москвы и ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина департамента здравоохранения г. Москвы. Камни были удалены стандартными оперативными методами: перкутанная нефролитотрипсия, дистанционная литотрипсия, контактная уретеролитотрипсия и открытая нефролитотомия.

Бактериальные культуры выращивали в жидкой и агаризованной (1,5%) среде LB (Luria-Bertani Broth, Difco) при температуре 37°С в течение 24-48 час.

Возбудителей инфекций передающихся половым путем (ИППП) (Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis) определяли методом ПЦР. Использовали набор реагентов для проведения полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле

фирмы «ИнтерЛабСервис». Условия проведения ПЦР приведены в аннотации реагентов.

Бактериальные штаммы и клинические изоляты. Объектом исследований служили клинические изоляты, выделенные из мочевых камней, и референсные штаммы Pseudomonas aeruginosa PA 103 и РАО (предоставлений д.м.н. В.Н. Крыловым, ГНЦ ВНИИ-Генетика).

Уреазпую активность клинических изолятов определяли, используя твердую среду Кристенсена с мочевиной (производство фирмы ООО «Лабораторный мир»).

Гены, кодирующие факторы патогенности у выделенных клинических изолятов E.coli, определяли с помощью ПЦР. Дизайн праймеров для проведения ПЦР взят из статьи (Ruiz J., Simon К., Horcajada J.P. at al). Праймеры были синтезированы в ОАО «Синтол».

Тестирование выделенных микроорганизмов на способность к формированию бактериальных биопленок проводили по общепринятой методике в 96-ти луночных микротитровальных планшетах (O'Toole G.A. et al. 2000).

Оптическую плотность выросших за сутки планктонных клеток определяли на фотометре ¡EMS Reader MF (Labsystems, Швеция), при длине волны 540 нм.

Препараты, воздействие которых изучали: антибиотик группы фторхинолонов - ципрофлоксацин (II поколение); препарат «Лапрот» на основе лактоферрина человека, выделенного из женского молока (per. №ЛС-002374, производство ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена); коммерческий фаговый препарат «Секстафаг» (пиобактериофаг поливалентный) фирмы «Микроген»; комерческий фаговый препарат «Бактериофаг колипротейный» фирмы «Микроген НПО»; «Споробактерин жидкий» производства Бакорен ООО, Россия.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Исследование проводили в сканирующем двулучевом электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, USA) в режиме высокого вакуума. Мочевые камни для исследования фиксировали только в 10% формалине или методом Ito-Karnovsky (Ito S. and Karnovsky M.J. 1968).

Рентгеновский микроструктурный анализ химического (элементного) состава мочевых камней определяли с помощью приставки «EDAX» к сканирующему электронному микроскопу Quanta 200 3D.

Статические методы. Все эксперименты in vitro проводили в нескольких повторах, но не менее Зх раз. Средние значения и стандартные ошибки

подсчитывались в программе Excel, входящей в программное обеспечение Microsoft Office 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Микроорганизмы образуют биопленки на мочевых камнях.

При исследовании мочевых камней полученных непосредственно после оперативного вмешательства методом СЭМ были выявлены адгезированные на их поверхности бактерии и хорошо сформированные, с ярко выраженным экзоклеточным матриксом биопленки (рис.1).

Рис. 1. Бактерии под экзоматриксом.

а) Увеличение 2600Х.

б) Увеличение 4000Х.

Рельеф поверхности мочевых камней формировали различные по морфологии структуры с относительно гладкой поверхностью и кристалоподобными образованиями с острыми краями. Биопленки на гладкой поверхности практически не были обнаружены, в основном они были локализованы в расщелинах и углублениях камня.

Рис.2. Электроннограмма внешней поверхности мочевого камня.

а) Кристаллоподобные образования. Увеличение 8000Х.

б) Практически гладкая Т поверхность. Увеличение 1500Х.

Таким образом, с помощью электронного микроскопа Quanta 200 3D впервые было показано, что уропатогеные бактерии существуют в состоянии биопленок на поверхности мочевых камней.

Далее мы приступили к подробному микробиологическому, молекулярно-генетическому и электронно-микроскопическому исследованию мочевых камней, полученных в ходе оперативного метода лечения.

Микрофлора мочевых камней В исследования были включены 203 пациента с камнями в почках, которым были проведены различные плановые оперативные вмешательства. Около 51% (103) мочевых камней оказались инфицированными и в большинстве случаев с одного и того же камня выделялись микроорганизмы нескольких видов (рис.3). Мультикультура была выделена у 64 пациентов, а монокультура у 39. Обобщенные результаты высевов мочевых камней, полученных из двух больниц, показали, что наиболее часто выделялись бактерии Enlerococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Escherichia coli. Бактерии Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumanii, Candida albicans и Morganella morganii выделялись реже.

Рис. 3. Видовой и процентный состав микроорганизмов, выделенных из

мочевых камней.

Уреазная активность микроорганизмов, инфицирующих мочевыводящие органы, является фактором патогенности способствующим формированию мочевого камня. Проведенные тестирования показали, что все изоляты

Pseudomonas aeruginosa (22), Klebsiella pneumonia (13), Proteus mirabilis (22), Staphylococcus epidermidis(l 1), Staphylococcus aureus (4), Acinetobacter baumanii (4) и Morganella morganii (2) обладали уреазиой активностью. Из изученных нами 33 клинических изолятов Escherichia coli только три обладали уреазной активностью.

Уропатогенные Escherichia coli, не проявляющие уреазную активность по методу Кристенсена, были протестированы на наличие генов, кодирующих факторы патогенности: а-гемолизина (hly), фактора некроза 1 (cnfl), аэробактина (аег), протеолитического токсина sat (sat), фимбрий Р (рарС) и фимбрий 1 (fimA). Было установлено что, несмотря на отсутствие способности синтезировать бактериальную уреазу, эти микроорганизмы обладают широким набором генов различных факторов патогенности, что позволяет им колонизировать мочевой тракт и вызывать воспалительные заболевания мочеполовой системы.

Инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), часто являются причиной хронизации мочевых инфекций. Известно, что Ureaplasma urealyticum, является одним из главных продуцентов бактериальной уреазы среди микроорганизмов и может способствовать камнеобразованию. Из-за сложности культивирования на микробиологических средах, в стандартных условиях клинических лабораторий, в протокол обязательных исследований выявление ИППП при МКБ не включены. С целью выявления ИППП из смывов 15 мочевых камней была выделена ДНК и проведен ПЦР анализ. По результатам тестов в 30% образцах были обнаружены ДНК возбудителей: Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis.

Таким образом, показано, что мочевые камни у больных уролитиазом могут быть инфицированы широким спектром возбудителей, для выявления которых требуется проведение, как стандартных микробиологических исследований, так и молекулярно-генетических. В стандартные исследования, которые прописаны при диагностике уролитиаза, нужно

включать и исследования направленные на выявление возбудителей ИППП. Результаты таких исследований необходимо учитывать при выборе стратегии лечения МКБ.

Сравнительный анализ микробного пейзажа мочевых камней и мочи, забранной до оперативного вмешательства.

Для выявления истинного микробного пейзажа мочевых камней, были исследованы 49 пациентов, у которых мочевой камень удаляли чрезкожно (перкутанно), что исключало контаминацию инфекций нижних и верхних отделов мочевыделительной системы. Бактериологические исследования выявили несоответствие между результатами исследования мочи, взятых до проведения операции, и извлеченных мочевых камней. По данным бактериального посева мочи у 13 пациентов из 49 моча была инфицирована. По результатам же исследования извлеченных мочевых камней инфицированными оказались 28 образцов из 49. Важной находкой этих исследований было то, что у 16 пациентов со стерильной мочой мочевые камни оказались инфицированными.

Частота выделения микроорганизмов из камней оказалась значительно выше, чем из мочи: 57% против 26% соответственно. Таким образом, доказано, что отсутствие бактериурии у пациентов с камнями в мочевых путях не свидетельствует об отсутствии микроорганизмов в камне. Причиной этого может быть разная степень воздействия антибактериальных препаратов на микроорганизмы, находящиеся в составе биопленок на камнях и находящихся в планктонном виде в моче. После проведения антимикробной терапии микроорганизмы, находящиеся в планктонной форме погибают, в отличие от микроорганизмов интегрированных в биопленку. Поэтому после проведения антимикробной терапии микробиологическое исследование мочи не выявляет микробов или выявляет их в низких титрах. В дальнейшем возможно заражение нижних органов мочевыделительной системы восходящим путем новыми микробами. Особенно это вероятность увеличивается при использовании дренажных систем. В результате

формируется различная микробная флора верхних и нижних органов мочевыделительной системы. Поэтому нельзя руководствоваться только результатами микробиологических исследований мочи, забранной до операции, при назначении адекватной постоперационной антибиотикотерапии.

Влияние антибиотиков на сформированные биопленки и на процесс их

формирования.

Мочекаменная болезнь отличается тяжелым, упорным течением, с часто развивающимися обострениями. Болезнь, как правило, развивается в течение нескольких месяцев и даже лет. Обычно ход мочекаменной болезни осложняется на фоне хронических форм пиелонефрита, гломерулонефрита и цистита. Как правило, пациентам с такими осложнениями назначают антибиотикотерапию (чаще эмпирически). В эксперименте было изучено действие антибиотика ципрофлоксацина из группы фторхинолонов II поколения на сформированные биопленки. По рекомендациям Европейской Ассоциации Урологов (EUA) при неосложненных инфекциях мочевыводяших путей, часто сопутствующих уролитиазу, этот препарат назначают в дозе 125 мг/сут. При приеме препарата в такой дозе максимальная концентрация активного вещества через 60-90 мин составляет 0,6мкг/мл, а через 12 час - 0,05 мкг/мл. Для проведения опыта подобран, чувствительный к данному антибиотику, клинический изолят Pseudomonas aeruginosa (S) и использованы разные концентрации антибиотика.

Под воздействием антибиотика ципрофлоксацина оптическая плотность планктонных клеток существенно уменьшилась и при дозе антибиотика в 0,06 мкг/мл приблизилась к минимальной отметке (рис.4). Но при этом антибиотик практически не повлиял на сформированные биопленки. Именно потому, что антибиотик не действует на сформированную биопленку, микроорганизмы сохраняют жизнеспособность после антибиотикотерапии.

1,5 1

0,S О

Mi

iffllii j.....f.....|......:......j........... ¡J ti t^lL VM Säi.

J'. # . *' # . f „ f . f „ ?>' „ / . ** 1

* планктонные кл r

ш планктонные |:л ОЧКИ

SI окрдска биопленок

s<i 2<l час

добавлении цппрофлокслцнна

Рис.4. Действие разных доз ципрофлоксацина на биопленки, сформированные клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa (S) в течение 24 час.

Здесь и на последующих гистограммах по оси абсцисс количество исследуемых препаратов, а по оси ординат оптическая плотность (ОП).

Далее мы исследовали действие разных доз антибиотика ципрофлоксацина на процесс формирования биопленки клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa (S) (рис.5).

2,5 2 1,5

У// / / / / / /

<<> -У > „о- „>>• ^ v>- ,v

J ,Ü> J ,f? ^ J

/ ¿г/ if"

7///A

лклмки жКппппенк» мМцяг

Рис.5. Действие разных доз ципрофлоксацина на рост и формирование биопленки клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa (S) за 24 час.

Оказалось, что добавление антибиотика в дозах, ниже терапевтических, провоцирует образование биопленки.

Выше описанные исследования проводились с учетом чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. В медицинской практике (по разным причинам) нередко антибиотики назначают эмпирически - без предварительного получения антибиотикограммы. Мы проверили действие разных доз антибиотика ципрофлоксацина на процесс формирования биопленки резистентным к нему клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa (R) (рис.6).

3 2,5 2 1,5 1 0,5 О

ШШШ ■

/¿w

Jb ^ g JF с

* / jfJ^jfj" f f* S ■f & # & # #

& & Ф $ & (

J м ff S ж ö<? JF J" ^

Ш пя аиитонные клетки мгдчас яокраскэбионпенок и24чзс

Рис. 6. Действие разных доз антибиотика ципрофлоксацина на процесс

формирования биопленки резистентным клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa (R) за 24 час.

В результате показано, что антибиотики, к которым микроорганизмы резистентны, не подавляют рост и формирование биопленки, а наоборот провоцируют процесс ее формирования. Этот нежелательный эффект усиливается с увеличением дозы «неэффективного» антибиотика. Поэтому практикующие врачи урологи при обследовании больных обязательно должны включать исследования направленные на выявление микроорганизмов с определением их чувствительности к антибиотикам, а не эмпирически назначать «популярные антибиотики». Также после оперативного вмешательства, с целью профилактики формирования биопленок нельзя назначать больным низкие (ниже терапевтических) дозы антибиотиков.

Ультраструктура мочевых камней Уролитиаз часто сопровождается воспалительными осложнениями почек. Однако реакция макроорганизма на наличие в полости почки конкремента изучена недостаточно хорошо. Исследования методом СЭМ мочевых камней, показали, что на поверхности конкрементов помимо биопленок находятся форменные элементы крови (рис.7). В промежутках между биопленкой и форменными элементами крови были обнаружены множественные, идущие в разных направлениях, белковые нити (очевидно, фибрина), элементы соединительной ткани (фибробласты, межклеточный матрикс с коллагеновыми волокнами) в тесной анатомической связи с биопленками. , (рис 8).

Рис.7. Электроннограмма внешней поверхности мочевого камня. Форменные элементы крови и биопленка на мочевом камне.

а) Увеличение 6000 X. б) Увеличение 10000 X. в) Увеличение 10000 X.

Наличие форменных элементов крови и коллагеновых волокон на поверхности мочевых камней в тесной связи с биопленками свидетельствует о воспалительной реакции макроорганизма. Коллагеновые волокна ограничивают воспалительный очаг и вокруг инородного тела образуют капсулу из соединительной ткани. Питание капсулы осуществляется микрокапиллярами. Она защищает макроорганизм как от механического повреждения мочевым камнем, так и от инфекционного агента - биопленки. При удалении мочевого камня методом иссечения или ультразвуковым

Рис.8.

Электроннограмма внешней поверхности мочевого камня.

а) Бактериальная биопленка | и соединительнотканны й тяж|\ Увеличение 2000Х.

б) Соединительно-

I данный ТЯЖ.

Увеличение 6000Х.

в) Коллагеновые волокна на внешней поверхности мочевого камня. Увеличение 1000 X и 4000Х.

дроблением, происходит разрыв соединительнотканной капсулы и микрокапиляров, питающих ее. При этом открываются новые возможности для инфекций, источником которых служит биопленка, находящаяся на поверхности мочевого камня. Зависимость формирования биопленок от химического состава камня. При визуализации мочевого камня в Quanta 200 3D видно, что бактериальная пленка не полностью покрывает поверхность мочевого камня. Известно, что для микроорганизмов характерен тропизм к определенным химическим веществам. Приставка «Эдекс», установленная на микроскопе Quanta 200 3D, дает возможность определить химический состав разных участков мочевого камня (рис 9).

Рис.9. Рентгеновский микроструктурный анализ

а) Участок мочевого камня с биопленкой

б) Участок мочевого камня без биопленки.

В отдельные окна выведены названия химических элементов | и показана диаграмма в соответствии их количеству._

При изучении элементного состава участков мочевого камня, покрытого биопленкой, были выявлены кислород, углерод, магний, железо, натрий, кальций и фосфор в разных соотношениях. При изучении элементного

состава участков мочевого камня, свободного от биопленки, были выявлены только кислород, углерод и кальций в разных соотношениях (рис 9).

Таким образом, показано существование прямой зависимости между химическим составом мочевого камня и формированием биопленки уропатогенными бактериями. Основываясь на результатах этого исследования можно предположить, что любые мочевые камни потенциально могут служить субстратом биопленок, так как химический состав мочевых камней, как правило, разнообразен.

Способность выделенных микроорганизмов формировать биопленки на поверхностях различной природы.

Экспериментально изучена способность практически всех микроорганизмов, выделенных из мочевых камней, к формированию биопленки. Результаты количественного анализа биопленок, сформированных микроорганизмами за 24-48 час, выражены в виде диаграмм. На рис 10 показаны результаты типичного опыта.

ШШ

¿Г Л' & о> (Ч^ с<? .е. X3

чГ'

ж Биолляниа ч7Лнас

Я Ьиоп(1гм111Л(фермиро*ан1Ш1

Рис. 10. Количество биопленки,

сформированной клиническими изолятами разных видов, выделенных из мочевых камней.

Известно, что наибольшим фактором риска для возникновения хронических инфекций являются бактериальные пленки, сформированные на разных медицинских инструментах и на имплантированном оборудовании, которые используются при оперативном лечении урологических заболеваний. Проверена методом СЭМ способность некоторых уропатогенов формировать биопленки на поверхности

медицинских салфеток, пластика и разных видов урологических катетеров (рис 11).

Клинические изоляты, выделенные из мочевых камней, свободно прикрепляются к любой поверхности медицинских инструментов и оборудования, образуя биопленки. Скорость и характер роста микробной пленки зависит от структуры поверхности. Чем рельефнее поверхность, тем легче на ней формируется биопленка. Все это способствует хронизации заболевания. Поэтому для предотвращения формирования бактериальных пленок на поверхности медицинского материала, необходимо усиленное соблюдение всех правил септики и антисептики.

Экспериментальное моделирование процесса образования биопленки.

Для максимального приближения условий исследования к естественным, в ходе работы была разработана методика оценки способности микроорганизмов к формированию биопленок на биологическом субстрате, а именно непосредственно на мочевых камнях. Для сравнения эффективности разработанной методики, параллельно проводили аналогичный опыт в

Рис. 11. Биопленки на поверхности материалов разной природы.

а) Биопленка S. aureus на поверхности медицинской салфетки. Увеличение 6000 X.

б) Биопленка S. aureus на поверхности пластика (полипропилен). Увеличение

юооох.

в) Биопленка E.coli, на поверхности катетера Неяагона Увеличение 6000 X.

г) Биопленка E.coli на поверхности катетера Фолея. Увеличение 12000Х

лунках полистироловых микротитровальных планшет. Результаты представлены в рис 12.

з

2,5 2 1.5 1

0,5

xvvvvvv;

Ш 6ИОПЛ«! т Бивпл«!

мсформнрвгз» и сформироул»

»лохрхносгимочевык камней г пс»*рхно<,тн полистирол,-}

Рис. 12. Сравнение способности формирования биопленок на поверхности полистирола и на поверхности натуральных почечных камней.

Разработанный нами способ позволяет более объективно оценивать способность микроорганизмов формировать биопленки на биологическом субстрате — мочевых камнях и наглядно доказывает более высокую эффективность предлагаемого способа, в отличие от способа, использующего полистироловые лунки. Разработанный способ может быть использован для оценки эффективности воздействия на биопленки различных кандидатных средств борьбы с биопленками при мочекаменной болезни.

Поиск новых подходов к борьбе с биопленками.

Исследование роли мочевой инфекции и биопленок в этиологии и хронизации мочекаменной болезни имеет большое теоретическое и практическое значение, в то время как чисто практическое значение имеет поиск средств борьбы с ними. С этой целью экспериментально были испытаны уже сертифицированные средства, разрешенные к применению в медицинской практике, действие которых на процесс образования биопленок до этого не изучали.

Влияние препарата «Лапрот» и антибиотика ципрофлоксацина на процесс образования биопленок in vitro.

Препарат «Лапрот» производится на основе лактоферрина человека, выделенного из женского молока. Лактоферрин связывается с липополисахаридом бактериальной клеточной стенки, что приводит к изменению проницаемости клеточной стенки и этим увеличивает

антибактериальное действие других препаратов. Было установлено, что лактоферрин в определенных концентрациях может влиять на динамику процесса биопленкообразования у псевдомонад, но почти не влияет на уже сформированные биопленки.

Основываясь на результатах ранее проведенных исследований, в которых было показано, что действие низких концентраций антибиотика ципрофлоксацина провоцирует процесс формирования биопленок, мы решили проверить сочетанное действие этих препаратов на динамику процесса образования биопленок псевдомонадами (рис 13).

JJj.

* J J J Л a.

,<9J rf- ^^f

o^ ч"' «V^v» ^ ^

-^i1* -с?'"

Рис. 13. Совместное влияние лактоферрина и

ципрофлоксацина на

формирование биопленок клетками P.aeruginosa.

Комбинированный эффект воздействия ЛФ и АБ заключается в том, что при использовании низких концентраций антибиотика, интенсивность процесса формирования биопленок клетками культуры P.aeruginosa значительно уменьшается. Комбинация антибиотика в сниженных по сравнению с обычными терапевтическими дозами и ЛФ может оказаться эффективной альтернативой лечения после операции.

Влияние фаговых препаратов на процесс формирования биопленок клиническим изолятом Escherichia coli На фоне множественной резистентности патогенных бактерий перспективным направлением в терапии инфекционных заболеваний является использование препаратов бактериофагов. Нами было проверено действие двух препаратов отечественного производства на процесс формирования биопленки уропатогенным штаммом E.coli. К препарату «Бактериофаг колипротейный» испытуемый штамм был чувствителен, а к «Секстафагу» - резистентен.

Рис. 14. Действие фаговых препаратов на процесс формирования биопленок.

а) Процесс формирования биопленки под действием разных титров бактериофагового препарата «Бактериофаг колипротейный» клиническим изолятом Escherichia coli, который чувствителен к данному фаговому препарату.

б) Процесс формирования биопленки под действием разных титров бактериофагового препарата «Секстафаг» клиническим изолятом Escherichia coli, который резистентен к данному фаговому препарату.

В ходе проведенных исследований оказалось, что применение бактериофагового препарата, аналогично антибиотику, в низких титрах провоцирует формирование биопленки. Фаговый препарат, к которому исследуемый клинический изолят был резистентен, также послужил сильным провокатором к формированию биопленки. В испытанных нами коммерческих препаратах титр фаговых частиц не превышал 104-105 БОЕ. Так как под воздействием иммунной системы и кислой среды желудка титр фага в организме человека падает, препараты с низкими титрами фага являются не эффективными. В связи с полученными результатами в лечебных целях и в целях профилактики целесообразно использовать фаговые препараты с учетом чувствительности и только с высокими титрами фаговых частиц (не менее 107 БОЕ).

Бактериальные пленки создают большие проблемы при катетеризации пациентов. В связи с этим многие исследователи считают перспективным направлением заранее обрабатывать катетеры антибактериальными препаратами. Мы изучили эффективность обработки катетеров фаговыми препаратами «Бактериофаг колипротейный», к которому испытуемый

штамм Е.соН был чувствителен и «Секстафаг», к которому испытуемый штамм был резистентен. Электронные фото сформированных биопленок представлены на рис. 15.

Рис. 15. Бактериальные пленки, сформированные на поверхности катетера Нелатона.

а) Биопленка Escherichia coli за 24 час (3000 X).

б) Биопленка, Escherichia coli (S) на поверхности, обработанного фаговым препаратом «Бактериофаг колипротейный» за 24 час (1000 X).

в)Биопленка, Escherichia coli (R) на поверхности, обработанного фаговым препаратом «Секстафаг» за 24 час (увеличение 3000 X)

Таким образом, можно рекомендовать использование предварительной обработки катетеров подобранными к выделенным от больного или циркулирующим в стационаре возбудителям фаговыми препаратами. Эта процедура будет опробована на ограниченном контингенте больных в НИИ урологии.

Действие препарата «Споробактерин» при моделировании процесса образования биопленки на мочевых камнях.

Было испытано действие пробиотика споробактерина (штамм Bacillus subtilis 534) на способность к образованию биопленок бактериями Pseudomonas aeruginosa. Препарат рекомендован МЗ РФ с 1992 года для применения в клинической практике для лечения острых кишечных

инфекций (ОКИ), воспалительных процессов и ран различного генеза, профилактики гнойно-септических осложнений до и после хирургических операций. Однако действие препарата на бактериальные пленки ранее не было изучено. Исследование проведенное методом СЭМ показало, что бактерии предварительно обработанные фильтратом «Споробактерина» сохраняли способность прикрепляться на поверхности мочевого камня, но не образовали биопленку с матриксом. Обработка уже сформированной биопленки фильтратом, приводила к видимому уменьшению матрикса биопленки по сравнению с контролем (рис.16, а, б и в).

ттштттшштшшшшшш ' У*

а б в

Рис.16. Исследование методом СЭМ влияния фильтрата препарата «Споробактерин» на процесс формирования бактериальной биопленки клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa.

а) Биопленка сформированная за 48 час. (8000 X)

б) Биопленка с добавлением фильтрата препарата «Споробактерин» (увеличение 10000 X). Не разделенные бактериальные клетки

в) Суточная биопленка обработанная препаратом «Споробактерин» в течение24 час (увеличение 10000 X). Бактериальные клетки под матриксом _

Полученные нами в этой экспериментальной модели данные показали, что препарат «Споробактерин» способен не только значительно замедлять процесс образования биопленки, но и воздействовать на уже сформированную биопленку, ускоряя ее деградацию. В результате этих данных в настоящее время на ограниченном контингенте больных в урологической клинике проводятся испытания промывания полости почки препаратом «Споробактерин» после оперативного удаления мочевого камня из почки.

Выводы

1. Впервые, с помощью сканирующего электронного микроскопа, показано, что уропатогенные бактерии существуют в составе биопленок на мочевых камнях при МКБ.

2. Выделенные in vivo с поверхности мочевых камней уропатогены способны: формировать биопленку in vitro, продуцировать уреазу, обладают широким спектром генов, кодирующих факторы патогенности.

3. Рентгеновский микроструктурный анализ мочевых камней показал, что интенсивность и скорость формирования биопленок зависит не только от вида уропатогена, но и от рельефа и химического состава мочевого камня.

4. Отрицательные бактериологические анализы мочи у больных с МКБ не являются показателем стерильности мочевых камней.

5. Коммерческие фаговые препараты и антибиотики, применяемые в низких терапевтических концентрациях и назначаемые без учета чувствительности к ним уропатогенов, стимулируют формирование бактериальных биопленок.

6. Комбинированное применение антибиотика и препарата «Лапрот» оказывает ингибирующее действие на процесс формирования биопленок в эксперименте.

7. Разработанная экспериментальная модель формирования биопленок на мочевых камнях позволяет изучать эффективность воздействия различных препаратов на процесс формирования биопленок.

8. В разработанной экспериментальной модели показано ингибирующее влияние препарата «Споробактерин» на формирование бактериальных биопленок.

Список работ опубликованных по теме диссертационной работы.

1. Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толордава Э.Р., Гинцбург А.Л. «Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками» // Вестник РАМН. 2011. №10. С 31-39.

2. Толордава Э.Р., Тиганова И.Г., Алексеева Т.В., Степанова Ю.М„Терехов А.А., Егамбердиев Д.Л., Мулабаев Н.С., Шевлягина Н.В., Диденко Л.В., Ю.М.Романова Микрофлора почечных камней при мочекаменной болезни и поиск средств борьбы с биопленками уропатогенных бактерий. // Журнал микробиология. 2012. №4. С 56-62.

3. Диденко Л.В., Толордава Э.Р., Боровая Т.Г., Перепанова Т.С., Шевлягина Н.В., Романова Ю.М. Электронно-микроскопическое

исследование почечных камней больных нефролитиазом // Урология. 2012. No3. С 22-28.

4. Серегин A.B., Мулабаев Н.С., Толордава Э.Р. Современные аспекты этиопатогенеза мочекаменной болезни // Лечебное дело 2012. №4. С 4-11.

5. Алексеева Н.В., Степанова Т.В., Толордава Э.Р., Романова Ю.М. Разработка средств борьбы с биопленками: влияние препарата «Лапрот» (на основе человеческого лактоферрина) и антибиотика ципрофлоксацина на рост и процесс образования биопленок бактериями Pseudomonas aeruginosa in vitro. Медицинский алфавит. Лаборатория №3.2010. С 4-9.

6. Романова Ю.М., Толордава Э.Р., Навольнев С.О., Гинцбург А.Л. Влияние фага Ф KZ на образование биопленки бактериями Pseudomonas aeruginosa. Профилактическая медицина - практическому здравоохранению. Четвертый выпуск. Москва. 2010. С 239-243.

7. Перепанова Т. С., Хазан П.Л., Волкова Е.М., Эгамбердиев Д.К., Толордава Э.Р., Романова Ю.М. Проблемы лечения рецидивирующей инфекции нижних мочевых путей. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2011, Том 7, №2, С 38-43.

8. Романова Ю.М., Толордава Э.Р., Диденко Л.В. «Биопленки патогенных бактерий: роль в хронизации инфекционного процесса и поиск средств борьбы» // Труды международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Гурзуф. 2011. С 31-33.

9. Перепанова Т.С., Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толордава Э.Р., Эгамбердиев Д.К. К вопросу об инфекционном генезе мочевых камней. // Тезисы доклада в кн. «VII Всероссийская научно-практическая конференция с междунарлдным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии» 9-10 февраля 2012г.». Москва, 2012. С 8081.

Ю.Романова Ю.М., Толордава Э.Р., Диденко Л.В. «Биопленки патогенных бактерий: роль в хронизации инфекционного процесса и поиск средств борьбы» // Труды IX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Гурзуф. 2011. С 31-33.

П.Романова Ю.М., Перепанова Т.С., Диденко Л.В., Толордава Э.Р. «Инфекционная природа мочекаменной болезни» // Труды XX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Гурзуф. 2012. С 48-49.

12.Перепанова Т.С., Толордава Э.Р., Эгамбердиев Д.К., Диденко Л.В., Голованов С.А., Романова Ю.М. Связь инфекции мочевых путей и химической структуры камней почек. // Тезисы доклада в кн. «VIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным

участием «Рациональная фармакотерапия в урологии» 7-8 февраля 2013г.». Москва, 2013. С 12-13.

13.Перепанова Т.С., Толордава Э.Р., Диденко Л.В., Романова Ю.М., Эгамбердиев Д.К. Роль уреазопродукции и способности к биопленкообразованию уропатогенов в генезе камней почек. // Тезисы доклада в кн. «VIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии» 7-8 февраля 2013г.». Москва, 2013. С 10-11.

М.Перепанова Т.С., Эгамбердиев Д.К., Толордава Э.Р., Диденко Л.В., Романова Ю.М. Исследование бактериального состава на удаленных камнях почек. // Тезисы доклада в кн. «VIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии» 7-8 февраля 2013г.». Москва, 2013.С 8-9.

15.Didenko L.V., Shevlyagina N.V., Tolordava E.R., Perepanova T.S., Romanova J.M. // Scanning Electron Microscopy for structural analysis of renal concrements. Proceedings of 10th Multinational Congress on Microscopy. 2011. Urbino. Italy. P. 385.

16.Romanova Yu.M., Didenko L.V., Tolordava E.R., Egamberdiev D.K., Perepanova T.S. Biofilm and renal stone disease. // 6th ASM Conference on Biofilms. P.186. Miami. USA.2012.

Подписано в печать: 22.01.14

Объем: 1 усл.п.л. Тираж: 110 экз. Заказ № 1112 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Толордава, Этери Ромеовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

04201455Й95

Толордава Этери Ромеовна

«Роль бактериальных биопленок в этиопатогенезе мочекаменной

болезни»

03.02.03.- микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Юлия Михайловна Романовна Доктор медицинских наук Любовь Васильевна Диденко

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Классификация мочевых камней. 9

1.2. Эпидемиологические и этиологические факторы мочекаменной болезни. 10

1.3. Методы лечения мочекаменной болезни. 13

1.4. Роль микроорганизмов в камнеобразовании. 18

1.5. Биопленка: определение, методы исследования, формирование и средства борьбы с ними. 21

1.5.1. Методы исследования биопленок. 26

1.5.2. Роль биопленки в хронизации инфекционной болезни. 29

1.5.3. Современные подходы в борьбе с биопленками. 31

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 41

3.1. Микроорганизмы образуют биопленки на мочевых камнях. 41

3.2. Микрофлора мочевых камней. 47

3.2.1. Тестирование уропатогенов на наличие уреазной активности и генов, кодирующих факторы патогенности. 51

3.2.2. Сравнительный анализ микробного пейзажа мочевых камней и мочи, забранной до оперативного вмешательства. 59

3.3. Влияние антибактериальных препаратов на процесс формирования биопленок и на уже сформированные биопленки. 62

3.3.1. Влияние антибиотика. 62

3.3.2. Влияние препарата «лапрот» (на основе человеческого лактоферрина) и антибиотика ципрофлоксацина на рост и процесс образования биопленок клиническим изолятом Pseudomonas aeruginosa in vitro.

3.3.3. Влияние фаговых препаратов на процесс формирования биопленок клиническим изолятом

Escherichia coli. 11

3.4. Ультраструктура мочевых камней. 78

3.5. Зависимость формирования биопленок от химического состава камня. 81

3.6. Способность выделенных микроорганизмов формировать биопленки на поверхностях различной природы. 84

3.7. Экспериментальное моделирование процесса образования биопленки. 92

3.8. Действие препарата «споробактерин» при моделировании процесса образования биопленки на мочевых камнях. 94

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 100

ВЫВОДЫ 103

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ 104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105

Введение Актуальность темы

Проблема формирования бактериями биопленок широко изучается во всем мире. Огромное количество исследований, посвященных процессу образования биопленок и его генетическому контролю, выполненных на лабораторных моделях (на стекле или пластике, обеспечивающих экономичные подходы для широкомасштабных скрининговых экспериментов), позволили получить принципиальные знания о механизмах формирования биопленок патогенными бактериями (Costerton J.W. et al. 1999., Смирнова Т.А. и соавт. 2010., Романова Ю.М. и соавт. 2011). Особенно важную роль биопленки играют в формировании очагов хронической инфекции при заболеваниях мочевыделительной системы. Мочекаменная болезнь (уролитиаз, МКБ) является одним из распространенных урологических заболеваний. По последним данным это заболевание встречается не менее чем у 3% населения всего мира (Лопаткин H.A. и соавт. 2000). Инфекционные заболевания мочевыводящих путей (ИМП), являются прямыми или косвенными провокаторами МКБ (Вощула В.И. и соавт. 2007). При ИМП отмечается высокий уровень рецидивов инфекции, которая принимает характер хронической с частыми обострениями. При лечении МКБ широко используется различный инструментарий в виде дренажных систем, катетеров, стентов, на поверхности которых могут формироваться биопленки, что приводит к развитию «катетер-ассоциированной ИМП», или «биофильм-инфекции». (Costerton J. 1995, 1999; Романова Ю.М. и соавт. 2004, 2011; Перепанова Т.С. и соавт. 2011). Бактерии, инфицирующие мочевыводящие пути, также способствуют новому камнеобразованию (Лопаткин H.A. и соавт. 2000; Лопаткин H.A. и соавт. 2007).

Интенсивное развитие современной молекулярно-биологической и электронно-микроскопической методической базы сформировало качественно новый уровень исследований, позволяющий анализировать развитие инфекционного процесса, непосредственно используя клинически доступные биоматериалы от больных.

Основной стратегией борьбы с инфекционными осложнениями МКБ является антибиотикотерапия, которая в ряде случаев оказывается безуспешной. Особый интерес вызывает проблема неэффективного превентивного (предоперационного) назначения антибиотиков при удалении камней из почечной лоханки, так как в 87,5% случаев развивается пиелонефрит при отрицательных данных бактериологического анализа мочи.

Очевидно, что в этих случаях результаты бактериологического анализа мочи могут не отражать истинного профиля и состояния микрофлоры мочевых путей. Поэтому актуальной задачей остается проблема поиска альтернативной или дополнительной терапии инфекционных осложнений МКБ с помощью других антибактериальных препаратов, в механизме действия которых заключается разрушение биопленок. Вышеизложенное, указывает на необходимость дальнейшего изучения патогенеза инфекционно-воспалительных осложнений при МКБ и поиска новых способов их лечения и профилактики.

Цель работы

Оценить роль бактериальных биопленок в хронизации инфекционного процесса при мочекаменной болезни и в развитии постоперационных инфекционных осложнений после удаления почечных камней.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

• Исследование нативных мочевых камней различными методами: электронно-микроскопическими, микробиологическими и молекулярно-генетическими.

• Сравнение микрофлоры нативных мочевых камней, удаленных оперативным путем, с микрофлорой мочи больных МКБ, взятой до проведения операции.

• Характеристика выделенной микрофлоры по следующим признакам: способности к продукции уреазы, наличию генов, кодирующих факторы патогенности, способности образовывать биопленки на поверхности полимеров медицинского назначения

• Изучение процесса образования биопленок на поверхности мочевых камней в эксперименте in vitro

• Изучение в эксперименте воздействия антибактериальных препаратов на биопленки, сформированные клиническими изолятами.

Научная новизна

• Впервые обнаружены бактериальные пленки на поверхности нативных мочевых камней с помощью электронно-микроскопических методов исследований.

• Впервые выявлено, что интенсивность формирования биопленок

уропатогенами на поверхности нативных мочевых камней зависит от рельефа и химического состава камня.

• Частота выделения микроорганизмов у пациентов с МКБ непосредственно из камня значительно выше, чем из мочи: 57% против 29%, соответственно.

• Отрицательные бактериологические данные мочи у больных с МКБ не являются доказательством стерильности мочевых камней.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инфекционно-воспалительные осложнения и хронизация инфекционного процесса при мочекаменной болезни обусловлены существованием уропатогенных бактерий в составе биопленок на поверхности мочевых камней.

2. Интенсивность и скорость формирования биопленок на мочевых камнях зависят от рельефа и химического состава камней.

3. Субингибирующие концентрации антибактериальных препаратов стимулируют образование биопленок. Резистентные штаммы в присутствие антибактериальных препаратов также интенсивнее формируют биопленку.

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы доложены на: Российских научно-практических конференциях с международным участием «Рациональная фармакотерапия в урологии», Москва, Дом ученых, февраль 2011, 2012 и 2013гг; конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Гурзуф, Украина. 2011, 2012 гг; Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 26.04.2012 г; московской междисциплинарной научно-практической конференции «Современные подходы к лечению мочекаменной болезни в амбулаторной практике» (диагностика, метафилактика и реабилитация МКБ) в Научно-исследовательском центре, ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова МЗ РФ, ноябрь 2012 г; научно-практической конференции «Мочекаменная болезнь: профилактика и метафилактика» в ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России 23.11.12 г; научно-координационном совете ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России 12.02.13 г; XIII Конгрессе Российского общества урологов. 07.11.13 г; 10th Multinational Congress on Microscopy. Urbino. Italy. 2011; 6th ASM Conference on Biofilms. Miami. USA. 2012.

Публикации

По результатам исследований опубликовано 7 научных статей в рецензируемых изданиях, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 9 тезисов.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Мочекаменная болезнь (Уролитиаз, МКБ) является одним из распространенных урологических заболеваний (Arias Eunez F. et al. 2000; Голованова O.A., Борбат В.Ф. 2005; Khashayar Sakhaee et al. 2012). Самый древний камень найден археологом Смитом в 1901 году в мумии, которая была захоронена 7000 лет назад. По последним данным это заболевание встречается не менее чем у 3% населения всего мира (Лопаткин H.A., Яненко Э.К. 2000; Tiselius H.G. 2001; Яненко Э.К. и соавт. 2003; Дзеранов Н.К., Лопаткин H.A. 2007; Poulsen P.B. et al. 2001). Заболеваемость варьирует в различных странах, составляя в среднем: 1-5% в Азии, 5-9% в Европе, 13% в Северной Америке и до 20% в Саудовской Аравии. В Российской Федерации уролитиаз диагностируется среди 34,4% пациентов с урологическими заболеваниями. Дальний Восток (40%), Центрально-Черноземный (35,1%), Восточно-Сибирский (32,8%), Уральский (30,3%) и районы Крайнего Севера остаются зонами распространения МКБ в России (Тиктинский О.Л., Александров В.П. 2000). Существует эпидемичность регионов не только по частоте встречаемости, но и по виду образующихся мочевых камней. В южных регионах доминируют камни, состоящие из соединений мочевой кислоты, а в Московском регионе - в основном оксалаты. Чаше МКБ выявляется у пациентов трудоспособного возраста, от 25 до 50 лет (Боровский A.A. и др. 2008; Аполохин О.И. и соавт. 2011). Наиболее подвержены этому заболеванию мужчины (Gault М.Н. 2000; Strohmaier W.E. 2008). Одним из вероятных защитных механизмов у женщин считается действие эстрогенов, которые увеличивают почечную реабсорбцию кальция с одновременной защитой костной ткани от резорбции (Heller et al., 2002). Однако распространенность мочекаменной болезни среди женщин в последнее время увеличивается (Scales et al, 2005).

1.1. Классификация мочевых камней.

Известно несколько классификаций мочевых камней. Самая распространенная классификация основана на химическом составе конкрементов (Фрейтаг Д., Хруска К. 1987). Около 60-80% всех мочевых камней являются неорганическими соединениями кальция (Kuo R.L. et al. 2003): кальций-оксалатные (ведделит, вевеллит) и кальций-фосфатные (витлокит, брушит, апатит, гидроксиапатит и т.д.) (Worcester Е.М., Сое F.L. 2010). Камни, состоящие из мочевой кислоты (гидрат мочевой кислоты) и солей мочевой кислоты (урат натрия и урат аммония), встречаются в 7-15% случаев. Магнийсодержащие камни (ньюберит, струвит) составляют 7-10% от всех мочевых камней и часто сочетаются с инфекцией. Наиболее редкими являются белковые камни - цистиновые (выявляются в 3-10% случаев). В большинстве случаев камни имеют смешанный состав, что связанно с нарушениями сразу в нескольких метаболических звеньях и с присоединением инфекции (Люлько А.В. и соавт. 1991). Очень важным фактором при классификации мочевых камней является рН мочи больного МКБ. Было установлено, что оптимальные значения рН для кристаллизации солей мочевой кислоты - до 5.5, щавелевой до 6-6.8, фосфорной - выше 7.0 (Люлько А.В. и соавт. 1991; Дзеранов Н.К. 2004).

Для определения состава и установления структуры мочевых камней, отошедших самостоятельно или удаленных во время операции, используют химические (качественное обнаружение ионов или ионных группировок) и физические (растровая электронная микроскопия, рентгеноструктурный, петрографический, кристаллооптический, спектральный) методы исследования.

1.2. Эпидемиологические и этиологические

факторы мочекаменной болезни.

Этиология уролитиаза включает в себя экзогенные и эндогенные причины возникновения заболевания (Букин В.И. и соавт. 2000; Дасаева Л.А. и соавт. 2004; Борисов В.В., Дзеранов Н.К. 2006; Дзеранов Н.К., Лопаткин Н.А. 2007; Пигарова Е.А. и соавт. 2011; ЯашеПо А. е1 а1. 2000). Экзогенные причины заложены в окружающей среде человека: климат, биогеохимические особенности почв, воды, экологическая среда, особенности питания, социальные и другие факторы (Переверзев А.С., Россихин В.В. и соавт. 2004; Колпаков И.С. 2006). В понятие климат входят такие показатели, как температурный режим воздуха, влажность, осадки, инсоляция и др. Среди выше указанных климатических факторов на первом месте стоит механизм интенсивного испарения через кожу большого количества жидкости, при сухом жарком климате. В этих климатических условиях у людей значительно уменьшается диурез, иногда он составляет 500 мл в сутки. В результате этого резко повышается вязкость мочи за счет увеличения концентрации в ней коллоидных, кристалловидных компонентов и камнеобразующих веществ. Одновременно увеличивается кислотность мочи. Ее рН может достигать 5,5 и ниже.

Среди многих социальных факторов провоцирующих МКБ, гиподинамия стоит на первом месте. При гиподинамии снижаются метаболические процессы, что сопровождается избыточным накоплением камнеобразующих веществ в сыворотке крови. Повышение в сыворотке крови таких веществ, как кальций, фосфаты и мочевая кислота приводит к усилению их выделения почками (основным органом, участвующим в поддержании гомеостаза) и к перенасыщению мочи. В перенасыщенной моче происходит выпадение солей в виде кристаллов, что может в дальнейшем служить фактором образования сначала микролитов, а затем мочевых камней за счет оседания

новых кристаллов (Букин В.И., Кучьмиева Г.М. и соавт. 2000; Голованова О.А., Борбат В.Ф. 2005; Fasano and Khan, 2001; Evan A. et al., 2005; Evan A. et al. 2006).

Последние годы в нашем обществе наблюдается чрезмерная пропаганда лекарственных форм витаминов. Значение витаминов в процессе жизнедеятельности человека сомнению не подвергается, но бесконтрольный прием и легкий доступ к этим препаратам, приводит зачастую к серьезным нарушениям здоровья. Доказано, что передозировка аскорбиновой кислоты более 1-3 грамма в сутки приводит к оксалатурии за счет эндогенного биосинтеза - перехода аскорбиновой кислоты в щавелевую. Витамин D и особенно его метаболиты - Т)2 (эргокальциферол) и D3 (холекальцийферол) являются важными регуляторами обмена кальция и фосфатов в организме человека. При длительном гипервитаминозе витамина D (в возрасте от 6 месяцев до 2 лет) наблюдаются необратимые изменения в почках. У некоторых больных имеет место кальциноз почечных сосочков, образуются чашечные камни с образованием фосфато-кальциевых камней (фосфатов) (Колпаков И.С. 2006; Калинченко С.Ю. и др. 2012). В то же время недостаточность в пище витамина А может косвенно способствовать развитию фосфатурии (нарушение фосфорно-кальциевого обмена) и фосфатного камнеобразования. При лечении эндогенной гипроксалемии пиридоксином (витамин Вб) уровень щавелевой кислоты в крови и в моче снижается.

Проблема питания, как фактора риска развития МКБ сложна и многогранна. Пища с высоким содержанием животного белка, приводит к увеличению выделения кальция, оксалатов, уратов и уменьшению количества цитратов в моче. Побочный эффект высокого потребления NaCl и, как результат, повышение экскреции кальция, достаточно изучен многими исследователями. Употребление грейпфрутового сока повышает риск образования камней, за счет экскреции цитрата. Апельсиновый и лимонный соки не стимулируют образование камней, хотя также имеют высокое

содержание цитрата. По мнению некоторых исследователей, употребление чая, кофе, белого вина снижает риск камнеобразования, что связанно со способностью кофеина и алкоголя ингибировать антидиуретический гормон.

Этиологическими факторами уролитиаза также могут служить некоторые химические вещества и медикаменты, например сульфаметоксазол, тетрациклин, нитрофураны, триамтерен, сульфонамиды. Длительный прием цитратных препаратов, содержащих лимонную кислоту и ее соли, может осложниться нежелательной побочной реакцией - оксалатурией (Переверзев А.С., Россихин В.В. и соавт. 2004).

Эндогенные факторы, провоцирующие МКБ, заложены в организме человека. Они могут быть генетическими, врожденными и приобретенными в процессе жизни. К ним следует отнести изменения тканей почки, патологические изменения почек (Kim S.C. et al. 2005), мочевыводящих путей (Wawro A., Zwolinska D. et al. 2000), нарушение микроциркуляции в почках и наличие в них инфекции (Вощула В.И., Лыш Е.Я., Станкевич С.И. 2007., Сулейманов С.И. и соавт. 2010), изменения соста