Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте

Шитов, Леонид Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте"

0У41

На правах рукописи

ШИТОВ Леонид Николаевич

ВЛИЯНИЕ ЦИТОСТАТИКОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Москва - 2010

004609072

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Романов Виталий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Митрохин Сергей Дмитриевич Царёв Виктор Николаевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится » 2010 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д.Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан «_»_2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Препараты, обладающие цитостатическим действием, являются эффективными противоопухолевыми средствами; кроме того, обладая иммуносупрес-сивным эффектом, цитостагики находят широкое применение в терапии аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии.

К наиболее опасным и часто встречающимся осложнениям, развивающимся на фоне иммуносупрессии, возникающей при цитостатической терапии, относятся инфекции (Балабанова P.M., 2006; Белов Б.С. и соавт., 2006; Jallouli М., 2008), возбудителями которых являются, главным образом, условно-патогенные представители микрофлоры организма (Соколов А.А., 2009; Garbino J. et al., 2005; Lee P.P.W., 2007). При этом в ряде исследований было показано, что при заболеваниях, требующих назначения цитостатиков, имеют место изменения в микробиоценозах пациентов, выражающиеся, главным образом, в избыточном росте условно-патогенных микроорганизмов (Привалова Т.Ю., 2006; Гульнева М.Ю. и соавт., 2007, Stringer A.M. et al., 2009).

Одним из наименее изученных вопросов является прямое воздействие цитостатиков на биологические свойства микроорганизмов и состояние микрофлоры макроорганизма. Вместе с тем, препараты с цитостатическим механизмом действия являются ДНК-тропиыми агентами, проявляют выраженные мутагенные свойства и, следовательно, потенциально способны вызвать изменения свойств микроорганизмов. Отмечено, что биологические характеристики бактерий, выделенных на фоне введения рассматриваемых лекарственных средств, отличаются от аналогичных свойств бактерий, встречающихся у людей или лабораторных животных, не подвергавшихся воздействию препаратов с цитотоксическими свойствами (Бельский В.В. и соавт., 2008; Гульнева М.Ю. и соавт., 2007). Публикации о прямом влиянии цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий единичны (Шаповал О.Г., 2008).

В соответствии с рассмотренными выше обстоятельствами, актуальным является исследование, позволяющее установить характер эффектов цитостатиков в отношении условно-патогенных бактерий микрофлоры организма в контексте возникновения инфекционных осложнений и микроэкологических нарушений при применении данных препаратов.

В реальной практике данные о состоянии и свойствах микрофлоры до назначения цитостатической терапии, как правило, отсутствуют, а учесть все факторы, влияющие на микрофлору организма больного, крайне затруднительно, поэтому получение объективных данных в рамках клинического исследования представляется весьма сложным. Можно предположить, что в условиях живого организма воздействие цитостатиков на микрофлору может реализовываться не напрямую, а за счёт влияния на различные системы макроорганизма, прежде всего, на иммунную систему. В соответствии с изложенным, обоснованным подходом к достижению поставленной цели является исследование воздействия

широко применяемых в медицине цитостатиков - метотрексата и циклофосфамида - на условно-патогенные микроорганизмы в опытах как in vitro, так и in vivo, в сравнении с эффектами преднизолона - иммуносупрессивного препарата с нецитостатическим механизмом действия.

Цель исследования - оценка влияния цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в экспериментах in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1. Оценить уровни колонизации толстой кишки стафилококками, энтерококками и знтеробактериями при курсовом введении белым мышам цитостатиков - метотрексата и циклофосфамида в сравнении с преднизолоном — иммуно-депрессангом с нецитостатическим механизмом действия.

2. Изучить биологические свойства штаммов, выделенных у животных, получавших метотрексат, циклофосфамид и преднизолон.

3. Исследовать влияние различных концентраций метотрексата на развитие популяции музейных штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemo-lyticus, Enterococcus faecaüs, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa в опытах in vitro.

4. Изучить биологические свойства условно-патогенных бактерий, подвергшихся воздействию различных концентраций метотрексата в опытах in vitro.

Научная новизна

В экспериментальном исследовании, исключающем влияние комплекса дополнительных факторов, действующих на микрофлору пациента в клинических условиях, получены новые данные о самостоятельной роли цитостатиков в изменении показателей кишечного микробиоценоза и свойств его представителей.

Новые данные о влиянии курсового введения цитостатиков разных групп (метотрексата и циклофосфамида) и иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом действия (преднизолона) на уровни колонизации толстой кишки белых мышей стафилококками, энтерококками и знтеробактериями показывают, что все препараты повышают общее количество условно-патогенных микроорганизмов, однако имеются некоторые различия в характере воздействия препаратов на популяционные уровни отдельных бактерий.

Впервые установлено, что цитостатики вызывают разнонаправленные изменения антибиотикорезистснтности условно-патогенных бактерий, а также их адгезивпости; при этом выявлена прямая корреляция между показателями адгезии и популяциоными уровнями знтеробактерий в содержимом толстой кишки экспериментальных животных; под влиянием метотрексата in vitro происходит замедление развития популяции условно-патогенных бактерий и изменение культуральных свойств золотистого стафилококка.

Практическая значимость работы

Данные о способности цитостатиков вызывать микроэкономические нарушения и влиять на антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий в эксперименте являются основой рекомендаций для совместной работы с клиницистами при проведении цитостатической терапии, в частности, при лечении инфекционных осложнений, развившихся на её фоне.

Результаты выполненной работы необходимы для дальнейшего развития исследований, направленных на формирование концепции самостоятельной роли цитостатической терапии в изменении показателей микрофлоры и биологических свойств её отдельных представителей.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы внедрены в работу межкафедралыюй научно-исследовательской лаборатории на базе кафедры микробиологии ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава, полученные данные используются при проведении занятий и чтении лекций для интернов, ординаторов, слушателей факультета последипломного образования и студентов всех факультетов ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение цитостатиков является самостоятельной причиной микроэкологических нарушений и изменения биологических свойств условио-патогенных бактерий in vivo; сходные эффекты реализуются также при введении ггреднизолона - иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом действия.

2. Введение циклофосфамида и метотрексата экспериментальным животным влияет на антибиотикорезистентность и адгезивные свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника.

3. Прямое воздействие метотрексата в опытах in vitro характеризуется изменениями антибиотикорезистентности, показателей адгезии, культуральных свойств и динамики развития популяции условно-патогенных бактерий.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась на межкафедральной научной конференции кафедр микробиологии с вирусологией и иммунологией, фармакологии и патологической анатомии с курсом судебной медицины Ярославской государственной медицинской академии, протокол № 1 от 5 мая 2010 года.

Основные положения работы были представлены на 57-60-й научных студенческих конференциях ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава (г. Ярославль, 20032006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007), научно-практической конференции «Современные возможности клинической лабораторной диагностики в клинико-диагностическом процессе» (г. Ярославль, 2008), V съезде Общества биотехпологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2008), V съезде ревматологов России (г. Москва, 2009), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (г. Казань, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 3 - в других периодических изданиях, 6 - в материалах конференций, 6 - в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на русском языке на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы методы исследования», четырёх глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Указатель литературы включает 211 источников: 103 отечественных и 108 иностранных. Диссертация иллюстрирована 46 таблицами, 20 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Препараты. В работе использованы коммерческие препараты «Веро-метотрексат», 1%-ный раствор натриевой соли метотрексата для ииъекций (ЗАО «Верофарм», Москва); «Циклофосфан», порошок для приготовления инъекционных растворов (ОАО «Биохимик», Саранск); «Преднизолон Никомед», раствор для внутривенного и внутримышечного введения («Nycomed», Австрия).

Штаммы микроорганизмов. Эксперименты in vitro выполнены на музейных штаммах S. aureus АТСС25923, Е. coliАТСС25922, Е. faecalis АТСС29212, Р. aeruginosa АТСС 27853, S. haemolyticus 107, К. pneumoniae 119 (два последних - из музея кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава).

Лабораторные животные. Исследование микрофлоры толстой кишки выполнено на 60 беспородных белых мышах обоих полов массой 30 ± 3 г. Контрольные и опытные группы состояли из 15 животных. Все животные находились в стандартных условиях содержания и кормления.

Исследование микрофлоры толстой кишки экспериментальных животных. Препараты вводили внутрижелудочно с помощью атравматического зонда. Схемы введения выбирали исходя из режимов дозирования, применяемых у человека, пересчёт доз осуществляли в соответствии с действующими рекомендациями («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», М.; 2000). Циклофосфамид (ЦФ) вводили в дозе 35,4 мг/кг ежедневно; метотрексат (МТ) - 2,5 мг/кг в неделю за 2 приёма с интервалом 24 часа; преднизолон (ПЗ) - 2,5 мг/кг ежедневно. Продолжительность введения всех препаратов составляла 6 недель. Животным контрольной группы вводили стерильную дистиллированную воду.

Исследование содержания микроорганизмов с аэробным и факультативно-анаэробным типом дыхания в фекалиях мышей выполняли через 2, 4 и 6 недель после начала введения препаратов. Выделение, идентификацию и количественную оценку содержания микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами на основе изучения морфологических, тинкториальных, культураль-ных и биохимических свойств. Культуры, выделенные на 6-й неделе исследо-

вания, использовали для определения биологических свойств и антибиотикоре-зистентности. Исследовано 120 культур стафилококков, 130 культур энтерококков, 360 культур энтеробактерий.

Исследование влияния метотрексата на развитие популяции и биологические свойства условно-патогенных бактерий. Для оценки влияния МТ на развитие популяции условно-патогенных бактерий стерильный раствор натриевой соли МТ добавляли в МПБ в концентрациях 0,1; 1,0; 10; 100 и 1000 мг/л; число параллельных образцов каждой из концентраций равнялось 7. Суспензию тест-культуры вносили в пробирки до концентрации 5-105 КОЕ/мл. Культивирование осуществляли при 37°С в течение 18 часов; концентрацию бактериальных клеток в суспензии оценивали фотометрическим методом на планшетном фотометре ЭФОС 9305 (светофильтр 450 нм). Интенсивность роста выражали в процентах от контроля, не содержащего препарат (100%). Для микроорганизмов, интенсивность роста которых значимо менялась под воздействием препарата, построены кинетические кривые роста.

Влияние МТ на рост условно-патогенных бактерий оценивали также с помощью диско-диффузионного метода и метода серийных разведений в агаре. В диско-диффузионпом методе использовали агар Мюллера-Хинтон и стандартизированные бумажные диски, содержащие 50, 250, 750 и 1000 мкг натриевой соли МТ. Тестирование осуществляли согласно методическим указаниям «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК 4.2. 1890-04). Для исследований методом серийных разведений на агаре готовили агар Мюллера-Хинтон и МПА с концентрациями натриевой соли МТ 100, 500 и 1000 мг/л. На поверхность агара наносили 0,1 мл бактериальной суспензии, содержащей 500-2000 клеток в 1 мл (одинаковое число клеток наносили на чашки с разными концентрациями метотрексата). Осуществляли инкубацию при 37°С в течение 48-72 часов. Отмечали наличие роста, сравнивали число колоний, выросших на образцах агара, содержащих различные концентрации МТ и не содержащих препарата (контроль); изучали культураль-ные и морфологические свойства.

С целью оценки влияния МТ на биологические свойства и антибиотико-резистентность условно-патогенных бактерий осуществляли посев инокулюма, приготовленного аналогично вышеописанной методике, в пробирки с 5 мл МПБ, содержащего натриевую соль МТ в концентрациях 1, 10, 100 и 500 мг/л, а также с МПБ, не содержащим препарата (контроль). Культивирование осуществляли в течение 5 суток при 37°С с периодическим встряхиванием. По окончании периода культивирования у бактерий определяли адгезивные свойства, чувствительность к антибактериальным препаратам (АБП), некоторые факторы патогенности.

Адгезивные свойства микроорганизмов оценивали по методике, предложенной Брилис В.И. с соавт. (1986) с определением среднего показателя адгезии (СПА — среднее число микробных клеток, прилипших к поверхности одного эритроцита), коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процессе (К, % - процент эритроцитов, участвующих в адгезивном процессе), индекса адге-зивности микроорганизма (НАМ, вычисляемый по формуле

ИАМ=(СПА100)/К). Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой - при СПА от 1,01 до 2,0; средней - от 2,01 до 4,0; высокой - свыше 4,0.

Чувствительность условно-патогенных бактерий к АБП оценивали с помощью диско-диффузионного метода и метода серийных разведений в бульоне. У культур, выделенных от мышей контрольной и опытных групп, определяли чувствительность к основным клинически значимым АБП. Музейные штаммы, подвергшиеся воздействию различных концентраций метотрексата, тестировали на чувствительность к расширенному спектру АБП.

Активность плазмокоагулазы определяли по методике Трояшкина A.A. и Ивановой С.П. (1968), гемолитической и лсцитиназной активности использовали методики Чистовича Г.Н. (1961), а также упрощённую методику, описанную Ходаковой Н.Г. (2008).

Программное обеспечение. Хранение и обработку полученных данных осуществляли на IBM PC совместимом компьютере с помощью программ Microsoft® Office Excel 2003, STATISTICA® (StatSoft, Inc.) релиз 7.0, Primer of Bio-statistics (Stanton A. Glantz, McGraw Hill) версия 4.03 в среде WINDOWS™. Для графического оформления работы использованы программы Microsoft® Office Excel 2003 и Adobe® Photoshop CS2.

Статистическая обработка данных. Нормальность распределения данных оценивали по W-тесту Шапиро-Уилка; при нормальном распределении выполняли дисперсионный анализ и множественные сравнения по критерию Стьюдеита с поправкой Бонферрони; в случае распределения, отличного от нормального, осуществляли непараметрический дисперсионный анализ по критерию Крускалла-Уоллиса и множественные сравнения по критерию Данна. При анализе качественных признаков применяли критерий у\ Для оценки тесноты взаимосвязи между анализируемыми показателями вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (при нормальном распределении) или коэффициент ранговой корреляции Спирмена (при распределении, отличном от нормального). При анализе повторных измерений применяли критерий Фридмана (распределение, отличное от нормального) и множественные сравнения по критерию Ныомена-Кейлса (Гланц С., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Популяционные уровни некоторых условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей, получавших цито-статикк и предкизолок

У всех животных, получавших исследуемые препараты, отмечались статистически достоверные изменения показателей микрофлоры, выраженность которых, как правило, возрастала по мере увеличения продолжительности введения препаратов (таблица 1).

Введение циклофосфамида вызывало статистически достоверное повышение высеваемости стафилококков на 2-й и 4-й неделях (р<0,05), а также лак-тозонегативных энтеробактерий (ЛНЭБ) в течение всего срока наблюдения и кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью (КГ1СФА) на

Таблица 1. Содержание некоторых микроорганизмов в фекалиях экспериментальных животных

Группа Общее число АФАМ Стафилококки Энтерококки КП типичные КПСФА ЛНЭБ Содержание ГМ

млн КОЕ/г % от общего числа АФАМ

Показатели через 2 недели (медиана; [25-й процентиль; 75-й процентилъ])

К' 43,92 [18,65; 59,541 1,23 [1,09; 1,41] 2,66 [2,34; 6,03] 5,20 [2,14; 21,761 2,27 [1,08; 5,27] 0,86 [0,69; 1,46] 7,10 [6,05; 8,10]

ЦФ 193,24 [123,54; 249,54]* 39,00 [30,31; 58,041* 7,82 [4,38; 11,93] 9,20 [2,45; 16,491 8,93 [4,48; 10,45] 55,16 [17,04; 732,76]* 4,07 [3,33; 6,00]

мт 227,68 [201,71; 296,54]* 105,51 [63,21:156,471* 17,75 [6,62; 40,13)* 0,42 [0,22; 0,61]* 9,90 [0,32; 15,18] 11,41 [5,26; 13,86] 5,73 [2,62; 6,90]

го 127,66 [110,31; 135,54]* 60,21 [50,24; 76,601* 9,22 [6,41; 30,15] 1,57 [0,83; 2,62] 0,56 [0,11; 10,28] 1,16 [0,18; 5,78] 6,90 [5,11; 8,10]

Показатели через 4 недели

К 44,76 [22,32; 51,20] 1,14 [0,56; 2,01] 3,65 [3,13; 4,20] 6,60 [2,01; 18,281 2,39 [1,02; 7,00] 1,20 [0,76; 1,75] 5,56 [3,70; 6,42]

ЦФ 295,75 [178,30; 340,78]* 7,71 [5,90; 15,06]* 6,48 [4,49; 8,82] 31,47 [16,93; 54,73] 167,26 [72,80; 339,19]* 10,78 [6,30; 905,32]* 7,10 [4,18; 8,17]

МТ 53,71 [31,71; 67,331 7,93 [5,34; 10,34]* 6,18 [5,62; 8,25] 0,61 [0,17; 1,071* 6,39 [2,41; 8,871 1,06 [0,62; 2,12] 3,70 [2,86; 5,87]

пз 151,48 [119,23; 171,771* 57,10 [7,21; 89,28]* 18,73 [9,95; 20,721* 3,65 [1,86; 7,28] 6,67 [2,26; 9,91] 5,22 [2,41; 8,20] 5,90 [3,87; 7,45]

Показатели через 6 недель

К 42,76 [18,31; 50,14] 1,48 [0,79; 2,00] 1,34 [0,30; 5,92] 5,99 [2,05; 31,12] 2,65 [1,67; 5,87] 1,37 [0,78; 1,61] 6,79 [3,33; 7,58]

ЦФ 1570,47 [1273,14; 1831,76]* 0,67 [0,58; 0,71] 1,12 [1,02; 1,21] 68,37 [38,02; 146,58] 822,27 [571,30; 2156,31]* 574,67 [79,68; 4952,42]* 6,21 [5,71; 6,90]

МТ 61,24 [49,11; 71,35] 22,11 [9,56; 77,47]* 3,24 [0,20; 12,50] 1,25 [0,98; 2,02]* 0,18 [0,12; 0,25] 0,13 [0,12; 0,17] 5,71 [3,33; 6,90]

пз 306,08 [276,31; 382,831* 190,88 [55,93; 220,15]* 1,69 [0,74; 3,75] 3,66 [3,33; 7,46] 3,95 [2,54; 16,01] 25,31 [2,74; 56,50] 6,00 [4,07; 7,40]

* - статистически достоверные различия с контрольной группой, р<0,05 ' - средний исходный уровень показателей для всех групп

4-й и 6-й неделях эксперимента (р<0,05). В группе животных, получавших ПЗ, отмечено наиболее выраженное по сравнению с другими группами повышение высеваемости стафилококков на протяжении всего периода введения препарата (р<0,05) и энтерококков на 4-й неделе. Введение МТ вызывало статистически достоверное снижение высеваемости типичных кишечных палочек (КП) на протяжении всего периода введения препарата (р<0,05). На протяжении всего периода введения МТ отмечено достоверное повышение высеваемости стафилококков, па 4-й неделе - энтерококков (р<0,05).

Таким образом, введение экспериментальным животным МТ, ЦФ и ПЗ приводит к увеличению содержания условно-патогенных бактерий в фекалиях. В ходе введения ЦФ и ПЗ наблюдается увеличение выраженности происходящих изменений. Повышение общего числа условно-патогенных микроорганизмов при использовании ЦФ происходит, преимущественно, за счёт энтеробак-терий, а при введении ПЗ, главным образом, за счёт стафилококков. МТ вызывает повышение общего числа условно-патогенных микроорганизмов с последующим снижением их уровня при выраженном дисбалансе соотношения анализируемых показателей по сравнению с контрольной группой: повышение численности стафилококков и снижение - энтеробактерий.

2. Биологические свойства условно-патогенных бактерий, выделенных из фекалий экспериментальных животных

Плазмокоагулаза и лецитиназа не были выявлены ни у одной из исследованных культур.

Частоты встречаемости гемолитических условно-патогенных бактерий (УПБ) у опытных групп мышей преимущественно не претерпевали статистически значимых изменений по сравнению с аналогичными показателями животных контрольной группы. Достоверные изменения отмечены только на фоне введения ПЗ: снижение частоты высеваемости р-гемолитических стафилококков и повышение - а-гемолитических ЛНЭБ.

Исследование адгезивных свойств микроорганизмов показало (таблица 2), что типичные КП, КПСФА и ЛНЭБ, выделенные у животных, получавших МТ, отличались более низкими показателями адгезии по сравнению со штаммами, изолированными у мышей контрольной группы (ИАМ у типичных КП; СПА, К и ИАМ у КПСФА; СПА у ЛНЭБ; р<0,05).

Штаммы ЛНЭБ, полученные от мышей, которым вводили ПЗ, характеризовались более высокими показателями адгезии (СПА, К; р<0,05). Установлена статистически значимая взаимосвязь между адгезивными свойствами исследованных представителей семейства ЕШегоЬа^епасеае и их количественным содержанием в фекалиях (СПА и ^КОЕ/г на б-й неделе исследования; коэффициент ранговой корреляции Спирмена г = 0,73, р<0,01).

Стафилококки, выделенные у животных, получавших ЦФ, отличались сниженными по сравнению с контрольной группой показателями адгезии (СПА и ИАМ, р<0,05); при исследовании адгезивных свойств стафилококков, полученных от мышей, которым вводили ПЗ, было отмечено уменьшение значения коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процессе.

При оценке показателей адгезии энтерококков, выделенных у мышей, которым вводили ЦФ, установлено более высокое, по сравнению с контрольной группой, значение К (р<0,05).

Таблица 2

Адгезивные свойства микроорганизмов, выделенных у мышей контрольной и

Микроорганизмы Группа животных СПА К НАМ

Стафилококки Контроль 2,36*0,73 72,51*9,63 3,22*0,77

ЦФ 1,83*0,61* 69,70*10,63 2,61*0,73*

МТ 2,66*1,02 73,06± 14,78 3,59*0,94

ПЗ 1.99±0.82 62,44*13,56* 3,14*0,92

Энтерококки Контроль 2,44*0,69 61,69±9,31 4,02*1,10

ЦФ 2,63±0,69 68,41*9,92* 3,89*1,05

МТ 2,43±0,49 65,49±6,68 3,74*0,77

ПЗ 2,38*0,50 63,86*9,26 3,73*0,67

КП типичные Контроль 2,06*0,63 63,54±12,74 3,21*0,71

ЦФ 2,21*0,59 69,01±12,04 3,18*0,62

МТ 1,74*0,59 66,92*11,07 2,55*0,63*

ПЗ 2,13*0,88 66,31*14,50 3,10*0,74

КПСФА Контроль 2,01±1,01 56,00*18,43 3,41*1,04

ЦФ 2,44*0,99 67,48*14,07* 3,63*1,19

МТ 1,18±0,36* 42,29±12,77* 2,81*0.53*

ПЗ 1,93±0,81 63,73*13,83 2,95*0,79

ЛНЭБ Контроль 2,05*0,88 64,31*14,07 3,20*0,92

ЦФ 1,95±0,89 69,05*9,45 2,84*1,16

1,47±0,56* 53,22*17,53* 2,72*0,60

ПЗ 2,65*0,81* 75,89*14,82* 3,47*0,64

* - статистически достоверные различия с контрольной группой, р<0,05

Для всех групп животных, получавших препараты, выявлены отличия в антибиотикорезистентности выделенных от них условно-патогенных бактерий по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы. В наибольшей степени это касалось групп мышей, подвергавшихся воздействию ЦФ и ПЗ. Достоверно изменённые уровни чувствительности обнаружены в первую очередь у кишечных палочек. Для типичных КП показано повышение чувствительности к АБП; в отношении КПСФА и ЛНЭБ отмечено как повышение, так и снижение чувствительности к АБП. В ряде случаев, несмотря на достоверно сниженные значения минимальных подавляющих концентраций (МПК50) антибиотиков у штаммов, изолированных от мышей, получавших МТ, ЦФ и ПЗ, среди этих культур бактерий обнаруживались резистентные штаммы, не выявленные у животных контрольной группы. Различия в антибиотикорезистентности стафилококков и энтерококков, выделенных от животных контрольной и опытных групп на фоне введения препаратов, носили менее выраженный характер, чем у представителей семейства ЕШегоЬа^епасеае.

3. Влияние мстотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий in vitro

В диапазоне концентраций МТ 0,1 - 1,0 мг/л не наблюдалось статистически достоверного влияния на рост взятых для исследования штаммов УПБ; при концентрациях 10 - 1000 мг/л метотрексат вызывал частичное угнетение роста всех взятых для исследования микроорганизмов, за исключением P. aeruginosa ATCC 27853. Достоверные различия с показателями роста контрольных образцов приходились главным образом на концентрации препарата 1000 и 100 мг/л. Аналогичные результаты были получены при исследовании штаммов, выделенных у мышей (таблица 3).

Таблица 3

Интенсивность роста УПБ в жидкой питательной среде в присутствии различных концентраций метотрексата (в % от контроля, не содержащего препарат)

Микроорганизмы Концентрации метотрексата, мг/л

1000 10 0 10 1 0,1

Музейные штаммы

S. aureus ATCC25923 51,33*3,08* 66,81*4,08* 87,53*5,43* 99,76*6,21 99,88*4,99

S. haemolyticus 107 78,66*4,72* 98,73*5,34 99,25*4,88 99,62*6,18 99,77*6,49

E. faecalis ATCC 29212 46,25*2,82* 80,03*4,80* 89,55*5,55* 94,15*5,65 99,47*5,57

E. coli ATCC 25922 57,14*3,49* 88,07*5,42* 99,14*4,62 99,82*6,14 99,85*6,09

K. pneumoniae 119 63,76*3,91* 78,95±3,45* 96,73*5,94 99,14*7.51 99,71*9,85

P. aeruginosa ATCC 27853 99,81±6,17 99,75*5,48 99,85*4,95 99,90*4,53 99,95*6,10

Штаммы, выделенные у мышей

S. haemolvlicus M0210 81,02*3,98* 91,31*3,94* ' 99,12*5,01 99,31*7,11 99.62*7,12

S. haemolyticus M0233 70,! 4*4,19* 87,52*4,78* 98,85*3,55 99,43*5,98 99,81*4,56

E. coli M0251 71,22*3,77* 89,91*2,98* 99,20*3,69 99,75*5,21 99,90*4,17

E. coli M0263 62,23*4,43* 84,27*4,12* 98,87*3,91 99,76*4,87 99,89*7,01

E. coli M0301 59,67*4,67* 89,12*6,76* 98,57*3,98 99,57*5,23 99,87*7,12

E. faecalis M1019 56,34*3,36* 89,72±3,57* 94,35*3,87 98,65*7,45 99,87*2,97

E. faecalis Ml 187 77,12*6,34* 9l,45±3,34 98,67*7,01 99,15*4.92 99,81*8,13

E. faecium Ml201 60,34*5,34* 83,67*3,98* 96,98*4,76 98,81*3,48 99,52*4,87

* - достоверные различия с контрольным образцом, р<0,05

Наиболее выраженное ингибирующее действие МТ оказывал в отношении роста Е. faecalis А ТСС 29212 и aureus А ТСС 25923. При исследовании динамики развития популяции бактерий было отмечено, что ингибирующее действие имело место на всех фазах развития бактериальной популяции. Наиболее ощутимые различия между контрольными и опытными образцами проявлялись в поздние сроки; на ранних фазах различия были выражены в меньшей степени (рисунки 1-4).

время, ч

Рисунок 1. Динамика развития популяции S. aureus АТСС25923 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (D - оптическая плотпость бактериальной суспензии, МТ - метотрексат)

время, ч

Рисунок 2. Динамика развития популяции Е. coli А ТСС 25922 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (D - оптическая плотность бактериальной суспензии, МТ - метотрексат)

время, ч

Рисунок 3. Динамика развития популяции Е. /аесаШ А ТСС 29212 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (Б - оптическая плотность бактериальной суспензии, МТ - метотрексат)

время, ч

Рисунок 4. Динамика развития популяции К. pneumoniae 119 в жидкой питательной среде в присутствии метотрексата (D - оптическая плотность бактериальной суспензии, МТ - метотрексат)

При оценке чувствительности к метотрексату взятых для исследования штаммов УПБ диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон зона задержки роста была выявлена только у S. aureus АТСС 25923 и S. haemolyticus 107. Диско-диффузионный метод продемонстрировал лишь частичное угнетение роста 5. aureus АТСС 25923. При последующей оценке чувствительности к метотрексату стафилококков, выросших в зоне частичного угнетения роста, установлено, что их уровень чувствительности не отличался от исходного, т.е. неполный характер угнетения роста бактерий в рассматриваемой зоне не был связан с селекцией мутантов, резистентных к МТ.

Также было осуществлено сравнение чувствительности к МТ штаммов стафилококков, выделенных у мышей контрольной группы и группы, получавшей МТ; при этом достоверных различий не было выявлено. При содержании МТ в диске 250 мкг диаметр зоны частичной задержки роста (мм, M±SD) для стафилококков, выделенных у контрольной группы составил 19,93±5,85 мм, у стафилококков, изолированных от мышей, получавших МТ, - 21,36±6,64 мм (р>0,05). Показано, что чувствительность разных штаммов к метотрексату варьирует в достаточно широких пределах: диаметры зон задержки роста 56 штаммов стафилококков находились в пределах от 12 до 36 мм. Распределение значений данного показателя соответствует нормальному (р=0,0013 при использовании W-теста Шапиро-Уилка).

Метод серийных разведений в агаре показал, что на среде, содержащей МТ в концентрациях 100 - 1000 мг/л, рост колоний S. aureus АТСС 25923 в значительной степени замедлялся; колонии имели меньшие размеры и неправильную форму (рисунок 5). При последующем пересеве колоний неправильной формы на агар Мюллера-Хинтон, не содержащий МТ, культуральные свойства выросших колоний полностью соответствовали исходным характеристикам музейного штамма.

А Б

Рисунок 5. Колонии S. aureus АТСС 25923 на агаре Мюллера-Хинтон с содержанием метотрексата 500 мг/л (Б) и без добавления препарата (А)

4. Влияние метотрексата на биологические свойства условно-патогенных бактерий in vitro

У штаммов S. aureus АТСС 25923 и Е. coli АТСС 25922 достоверных изменений показателей адгезии под влиянием МТ не было выявлено (таблица 4).

При исследовании адгезии Е. faecalis АТСС 29212, культивированных в присутствии 100 и 500 мг/л МТ, было установлено статистически достоверное (р<0,05) повышение коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процессе. При этом достоверных различий величин СПА и ИАМ между контролем и энтерококками, выращенными в присутствии МТ, не обнаружено.

У штамма Р. aeruginosa АТСС 27853, выращенных на МПБ с концентрацией МТ 100 и 500 мг/л наблюдалось статистически достоверное (р<0,05) повышение СПА и К, при концентрации 500 мг/л - достоверное повышение ИАМ. Значения СПА и К, выявленные у Р. aeruginosa АТСС 27853, подвергшихся действию 100 и 500 мг/л МТ достоверно (р<0,05) отличались от аналогичных показателей, полученных при исследовании адгезии Р. aeruginosa АТСС 27853, выращенных при 1 и 10 мг/л МТ. Значение ИАМ Р. aeruginosa АТСС 27853, полученное при культивировании в присутствии 100 мг/л, достоверно выше значений, наблюдаемых у бактерий, подвергшихся действию 1 и 10 мг/л МТ.

По результатам оценки адгезивных свойств К. pneumoniae 119 констатировано статистически достоверное (р<0,05) снижение СПА и К при воздействии 100 и 500 мг/л МТ.

Таким образом, имели место как повышение, так и снижение показателей адгезии взятых для исследования штаммов УПБ. При этом все выявленные изменения показателей адгезии приходятся на наиболее высокие концентрации МТ - 100 и 500 мг/л.

При концентрациях МТ 100 и 500 мг/л наблюдалось статистически значимое снижение титра плазмокоагулазы по сравнению с контролем; по-видимому, указанные изменения активности плазмокоагулазы в культуральной жидкости связаны со снижением интенсивности роста бактерий в среде культивирования, содержащей МТ (коэффициент линейной корреляции между анализируемыми показателями г = 0,95; р=0,014).

У S. aureus АТСС 25923 наблюдалось статистически достоверное снижение титра гемолизинов в культуральной жидкости, которое, как и в случае с плазмокоагулазой, коррелировало со снижением интенсивности роста (коэффициент линейной корреляции г = 0,94, р=0,018). Для Р. aeruginosa АТСС 27853 достоверных изменений гемолитической активности не выявлено.

У всех взятых для исследования штаммов УПБ имели место изменения чувствительности к АБП при культивировании на МПБ, содержащем МТ (таблицы 5-10). В целом, преобладали факты снижения чувствительности по сравнению с исходным уровнем. Изменения антибиотикорезистентности происходили преимущественно при концентрациях МТ в среде культивирования 10 и 100 мг/л в меньшей степени - при 1 и 500 мг/л. Среди взятых для исследования штаммов наибольшее число изменений в чувствительности к АБП выявлено у S. aureus А ТСС 25923 и Е. faecalis А ТСС 29212.

Таблица 4

Показатели адгезии условно-патогенных бактерий при воздействии

Концентрация МТ, мг/л СПА К НАМ

5. аигеиз АТСС 25923

0 (контроль) 2,23±0,20 67,51±6,54 3,33±0,46

1 2,35±0,49 61,04±7,17 3,88±0,81

10 2,36±0,26 64,29±8,57 3,73±0,69

100 2,37±0,78 66,00±12,12 3,69±1,38

500 2,29±0,25 64,27±8,80 3,62±0,60

Е. (аесаШ А ТСС 29212

0 2,31±0,22 69,33±5.57 3,32±0,07

1 2,31±0,33 71,93±7,79 3,23±0,43

10 2,39±0,35 77,22±2,44 3,10±0,40

100 2,75±0,35 79,20±5,57* 3,48±0,47

500 2,59±0,62 78,90±5,18* 3,29±0,75

Е. соН АТСС25922

0 2,58±0,23 61,75±5,68 4,21±0,54

1 2,50±0,21 59,88±6,79 4,23±0,61

10 2,41±0,23 59,50±5,10 4,08±0,57

100 2,70±0,16 60,50±6,70 4,51±0,54

500 2,57±0,19 62,00±4,96 4,17±0,46

К. рпеитотае 119

0 1,61±0,20 79,26±4,94 2,05±0,37

1 1,57±0,23 78,42±4,69 1,98±0,32

10 1,70±0,11 75,89±2,07 2,24±0,21

100 1,26±0,14* 63,99±9,95* 2,03±0,53

500 1,32±0,05* 62,45±7,44* 2,15±0,28

Р. аегигтоха АТСС 27853

0 1,30±0,11 66,91±2,38 1,94±0,18

1 1,32±0,16 71,65±7,76 1,86±0,30

10 1,22±0,10 67,57±3,37 1,81±0,21

100 1,82±0,26* 80,45±5,69* 2,26±0,28

500 2,07±0,29* 79,30±2,48* 2,61±0,33*

* - статистически достоверные различия с контролем, р<0,05

В ряде случаев изменения чувствительности имели однонаправленный характер на всём диапазоне концентраций МТ, при этом для некоторых штаммов величина сдвигов показателей антибиотикорезистентности возрастала по мере увеличения концентрации МТ; следует отметить, что кривая «концентрация МТ - диаметр зоны задержки роста» для всех подобных ситуаций имеет сходную форму и соответствует повышению чувствительности по сравнению с исходным уровнем.

Таблица 5

Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам 5. aureus АТСС 25923, подвергшегося воздействию метотрексата2

Смт, мг/л Бензил-пенициллин Оксациллин Меропенем' Гентамицин' Линезолид1 | Ципрофлокса-цин Эритромицин 5 я я о g- я о о о. Лиикомицин а £ я 3 о я РЗ оа Фузидин Рифампицин

1 - - - t ■f * т т t - -

10 т* - т t* t 4* t - 4* - Т*

100 f * - t т* t* 1* t i - 4* - t

500 t - т ?* t* 4* t 4 - - f t

Примечания к таблицам 5-9: Сит - концентрация метотрексата в питательной среде;

1 - случаи повышения выраженности изменений чувствительности УПБ к АБП при возрастании концентраций МТ в среде культивирования;

2 - таблицы составлены по объединённым данным диско-диффузионяого метода и метода серийных разведений;

Т - повышение чувствительности, -I - снижение чувствительности; * - статистически достоверные различия с контролем, р<0,05

Таблица 6

Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам

я S я я

S i и я <L> с 4 5 п Я V ia Ампициллин j Гентамицин я s S о н я 4J с. и и ^ Линезолид d О * | о а. с !§ Ванкомицин Рифампицин Доксициклин Фурадонин ¡Эритромицин

1 4* - - 4 4* 4 4* 4* 4 4* -

10 + т т t t t t* 4 t t t

100 4 - 4* 4 - 4 4* 4 - - t

500 4 t 4 4 t t t* Т 4 Г t*

Таблица 7

Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам Е. coli АТСС 25922, подвергшейся воздействию метотрексата2

- X ä X

.g ЕЗ ч О Я et 2 V я я bs О я о и к я я S 5 Я

Е я fr S3 aj Я О 3 i-i Я я S S о EJ я О Я

н S £ ■с V -a- и ь- я § я я о я я к £

О < я а S и < s с ч н о

1 - t* - 4 4 - - - 4 - -

10 - t - 4* 4* - 4* - - -

100 - * т 4 -

500 4* "f4* - 4 - - - - 4 4 -

Таблица!

Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам К. pneumoniae 119, подвергшейся воздействию метотрексата2

с S н 2 и Ампициллин Меропенем Цефтриаксон Цефтазидим ü 1 £ и 1 < Ципрофлоксацин Полимиксин Тетрациклин | Фурадонин Линкомицин

1 - - т 1 4 4* т 4 4 t t

10 - - т 4 - 4* t - - - -

100 - - т 1» - 4* т 4 4* - -

500 - t - 4 - 4* ? т* 4* -г 4

Таблица 9

Изменения чувствительности к антибактериальным препаратам Р. аеги^тоха ЛТСС 27853, подвергшейся воздействию метотрексата2

2 3 я s

Смт, мг/л Цефтазидим Цефепим Аэтреонам Меропенем а й X Ш (- Амикацин й § •е- о а с s X äj VC a. а X о у к d С Тетрацикли)

1 т - t т - - t t - t*

10 т - - 4* - - 4 t - 4*

100 4 4* 4 4* - т 4 t - t*

500 Т - t 4 - - t* t - t

Таблица 10

Анализ результатов оценки влияния метотрексата на чувствительность условно-патогенных бактерий к антибактериальным препаратам_

Штаммы условно-патогенных бактерий Общее число препаратов, чувствительность к которым достоверно изменялась3 Снижение3 S 5 а з са о С Разнонаправленные эффекты при действии разных концентраций 3 Число препаратов, измене-j пил чувствительности к которым являются наследуемыми 3 Число препаратов, изменения чувствительности к которым являются однонаправленными на всём диапазоне концентраций метотрексата (включая тенденции)

S. aureus А ТСС 25923 7 3 4 - 3 7

E. coli ЛТСС 25922 5 4 1 - 3 1

E. faecalis ЛТСС 29212 7 5 1 1 1 2

P. aeruginosa А ТСС 27853 4 2 1 1 1 1

К. pneumoniae 119 4 3 1 - 2 3

- учтены только статистически достоверные изменения чувствительности

На основании полученных нами результатов и данных литературы можно констатировать, что наблюдаемое повышение уровня УПБ в составе микрофлоры толстой кишки не является результатом прямого действия препаратов-цитостатиков на их клетки. Наблюдаемый избыточный рост факультативной микрофлоры, по-видимому, не связан с цитостатическими эффектами препаратов в отношении облигатных представителей микрофлоры, поскольку аналогичные изменения в кишечном микробиоценозе имеют место при введении преднизолона - препарата с нецитостатическим механизмом действия. Можно предположить, что микроэкологические взаимоотношения нарушаются не на уровне влияния препаратов на рост и развитие микроорганизмов, а в результате влияния на ряд их свойств: в случае облигатных представителей микрофлоры -на способность секретировать субстанции, обуславливающие антагонистические эффекты в отношении УПБ, в случае оппортунистических микроорганизмов - на чувствительность к указанным субстанциям.

Изменения адгезивных свойств трактуются как одна из причин изменения численности УПБ в составе микрофлоры толстой кишки, однако данный механизм не является универсальным. Повышение показателей адгезии ЛНЭБ на фоне введения ПЗ рассматривается в контексте тенденции к повышению их содержания в составе микробиоценоза кишечника: допускается, что повышение численности происходит за счёт клеток с повышенной адгезивностью. В то же время, при введении ЦФ происходит гораздо более выраженное повышение уровня ЛНЭБ, не сопровождающееся повышением показателей их адгезии. В связи с этим можно предположить, что ПЗ специфическим образом усиливает экспрессию адгезинов у энтеробактерий в условиях in vivo. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Alverdy J. & Aoys Е. (1991), продемонстрировавшими повышенный уровень адгезии энтеробактерий к слизистой оболочке кишечника при введении крысам дексамстазона.

Снижение иммунитета, развивающееся на фоне введения цитостатиков, рассматривается в качестве одного из ведущих механизмов, обуславливающих наблюдаемое нами повышение численности УПБ в составе полостной микрофлоры кишечника экспериментальных животных. Ещё одна из возможных причин - нарушение целостности и функций слизистой ободочки кишечника.

При воздействии метотрексата на условно-патогенные бактерии in vitro не отмечено значимого влияния препарата на адгезивные свойства S. aureus, Е. faecalis и Е. coli. В отношении Е. coli констатировано, что пониженные показатели адгезии бактерий этого вида, выделенных у мышей на фоне введения метотрексата, и отсутствие прямого влияния препарата на показатели адгезии Е. coli АТСС 25922 in vitro свидетельствует об отсутствии универсального механизма изменения численности эшерихиозной микрофлоры в результате прямого влияния препарата на адгезивные свойства. При этом нельзя исключить избирательного влияния МТ на адгезивные свойства отдельных штаммов.

Характер воздействия МТ на лекарственную устойчивость АБП был различным в условиях воздействия in vivo и in vitro.

Наиболее выраженные отличия лекарственной устойчивости от аналогичных показателей контрольной группы выявлены у штаммов, выделенных у

мышей на фоне введения ЦФ и ПЗ; достоверно изменённые уровни чувствительности имели место в первую очередь у кишечных палочек: для типичных КП было выявлено повышение чувствительности к АБП; в отношении КПСФА и ЛНЭБ отмечено как повышение, так и снижение чувствительности к АБП.

Причины выявленных изменений лекарственной устойчивости могут быть связаны с мутагенными эффектами, способными привести к появлению устойчивых мутантов, либо, наоборот, к повышению чувствительности в результате утраты или нарушения структуры и функционирования генов, обуславливающих резистентность; возможна элиминация плазмид лекарственной устойчивости. Предположение о наличии различных причин изменения анти-биотикорезистентности условно-патогенных бактерий основывается на выявленном нами разнонаправленном характере изменений рассматриваемых показателей под влиянием исследуемых препаратов: имело место как повышение, так и снижение чувствительности.

Антибиотикорезистентность УПБ менялась на фоне изменения их попу-ляционный уровней, а при изменении численности популяций бактерий может иметь место изменение соотношения чувствительных и устойчивых клеток. Другим механизмом, объясняющим полученные результаты, может быть прямое или косвенное влияние взятых для исследования препаратов на процессы обмена генетическим материалом между бактериями, включая факторы лекарственной устойчивости. Это может происходить как на генетическом уровне в результате влияния препаратов-цитостатиков на репликацию ДНК, так и на уровне микроэкологических взаимоотношений, поскольку при наблюдаемых выраженных сдвигах численности УПБ может существенно изменяться интенсивность процессов внутри- и межпопуляционного генетического обмена.

In vitro, в условиях прямого воздействия МТ, отмечено как снижение, так и повышение чувствительности к АБП, а также разноЕШправленные эффекты при воздействии разными концентрациями МТ; преимущественно наблюдалось снижение чувствительности: выявлено 17 эпизодов снижения чувствительности, 8 - повышения и 2 - разнонаправленного воздействия (под «эпизодом» здесь понимается выявление статистически достоверного изменения чувствительности одного штамма УПБ к одному АБП). Отмечены как наследуемые (10 эпизодов, 37% от общего числа выявленных случаев изменения антибиотикоре-зистентности, из них 6 - снижение чувствительности, 4 - повышение), так и не-наследуемые (17 эпизодов, или 63%, из них 11 - снижение чувствительности, 4 - повышение, 2 - разнонаправленное действие). Среди изменений антибиоти-корезистеитности преобладают ненаследуемые. Как в случае наследуемых, так и ненаследуемых изменений преобладает снижение чувствительности.

Вероятно, воздействие МТ является специфическим, что выражается в избирательности эффектов в отношении разных АБП. Особенно наглядно это проявляется при сравнении чувствительности к препаратам из одной группы: например, при воздействии МТ на К. pneumoniae 119 наблюдается статистически достоверное снижение чувствительности данного штамма к амикацину на всём диапазоне концентраций МТ, тогда как в отношении гентамицина в диапазоне концентраций МТ от 10 до 500 мг/л отсутствует даже тенденция к измене-

ниго чувствительности К. pneumoniae 119 к данному препарату; при воздействии МТ на Е. coli АТСС 25922 на всём диапазоне концентраций препарата имеет место повышение чувствительности данного штамма к цефтриаксону (при воздействии 1, 100 и 500 мг/л МТ изменения статистически достоверные, при 10 мг/л - тенденция), тогда как в отношении цефтазидима не выявлена даже тенденция к изменению чувствительности Е. coli АТСС 25922 к данному препарату.

Наследуемое повышение чувствительности УПБ к некоторым АБП может быть связано с элиминацией факторов резистентности, например, плазмид, в результате воздействия МТ. Наследуемое снижение чувствительности можно объяснить направленным действием МТ на гены, ответственные за синтез молекул-мишеней, подвергающихся действию АБП. Ненаследуемые изменения чувствительности говорят о том, что эффекты МТ способны быть обратимыми, и при формировании новых генераций бактерий исходные свойства восстанавливаются.

Результаты выполненных исследований показывают, что цитостатики являются самостоятельными факторами, способными вызывать нарушения состояния микрофлоры организма, а также изменения свойств её отдельных представителей. Характер воздействия рассматриваемых препаратов, по-видимому, является комплексным и может реализовываться как путем прямого воздействия на клетки микроорганизмов, так и опосредованно через макроорганизм и микроэкологические взаимоотношения. Прогнозирование эффектов цитостати-ков в отношении микроорганизмов в клинических ситуациях может быть затруднено множественностью факторов, воздействующих на организм пациента, различиями направленности влияния одних и тех же препаратов на микроорганизмы в зависимости от конкретных условий. Это указывает на необходимость максимально широкого использования мер микробиологического мониторинга у пациентов, получающих рассматриваемые препараты, с целью выявления и коррекции микроэкологических нарушений, а также выбора рациональной антибактериальной терапии в случае развития инфекционных осложнений на фоне иммуносупрессии, вызываемой цитостатиками.

ВЫВОДЫ

1. Введение метотрексата, циклофосфамида и преднизолона белым мышам вызывает динамические изменения в составе полостной микрофлоры толстой кишки. Микроэкологические нарушения, развивающиеся под влиянием циклофосфамида и преднизолона, зависят от продолжительности применения препаратов, усиливаясь в более поздние сроки их введения.

2. Действие препаратов избирательно в отношении уровней колонизации кишечника отдельными представителями микрофлоры: циклофосфамид вызывает избыточный рост энтеробактерий, преднизолон - стафилококков; применение метотрексата - повышение численности стафилококков и снижение - энтеробактерий.

3. Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий in vivo выражается в снижении показателей адгезии: при действии циклофосфамида - стафилококков, метотрексата - энтеробактерий. Введение преднизолона вызывает повышение показателей адгезии лакто-зонегативных энтеробактерий. Показатели адгезии энтеробактерий коррелируют с их популяционными уровнями в кишечном микробиоценозе.

4. На фоне воздействия метотрексата, циклофосфамида и преднизолона in vivo меняется антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий. Эффекты препаратов являются разнонаправленными: у типичных кишечных палочек констатировано повышение чувствительности, у кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью, лактозонегативных энтеробактерий и стафилококков - как повышение, так и снижение чувствительности, что указывает на наличие различных механизмов воздействия исследуемых препаратов на антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий.

5. Воздействие метотрексата in vitro проявляется в зависящем от концентрации препарата замедлении развития популяций всех условно-патогенных бактерий, за исключением P. aeruginosa АТСС 27853, изменении культуральных свойств S. aureus АТСС 25923, показателей адгезии К. pneumoniae 119 и P. aeruginosa АТСС 27853, антибиотикорезистентно-сти всех исследованных штаммов. Повышения устойчивости к метотрек-сату на фоне его воздействия не отмечено ни in vivo, ни in vitro.

6. Метотрексат оказывает прямое влияние на антибиотикорезистентность условпо-патогенных бактерий, приводя, преимущественно, к повышению резистентности; выявленные изменения, выраженность которых зависит от концентрации препарата, являются в большей мере ненаслсдуемыми; однако 37% полученных изменений - наследуемые, что в последующих генерациях может существенно изменять структуру популяции бактерий по рассматриваемому признаку.

Практические рекомендации

При ведении больных, получающих цитосгатики, необходимо учитывать способность данных препаратов вызывать микроэкологические нарушения; для данной категории пациентов целесообразен контроль со-

стояния кишечного микробиоценоза, проведение профилактики и коррекции дисбактериоза кишечника.

Возможность изменения антибиотикорезистентности условно-патогенных бактерий при применении цитостатиков следует учитывать при выборе рациональной терапии инфекционных осложнений, развившихся у пациентов, получающих данные препараты. Эффективность лечения инфекционных осложнений возможно повысить за счёт мер микробиологического мониторинга лекарственной устойчивости возбудителей.

Список научных работ, опубликованных но теме диссертации

1. Шитов, Л.Н. Изучение влияния циклофосфана на антибиотикорезистент-ность синегнойной палочки / Л.Н. Шитов // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА, Ярославль 2004. - С. 28-29.

2. Шитов, J1.II. Влияние метотрексата па рост и резистентность кишечной палочки к некоторым антибактериальным препаратам / Л.Н. Шитов, Н.С. Борисова / Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА, Ярославль 2005. - С. 27-28.

3. Романов, В.А. Влияние метотрексата на резистентность кишечной палочки к некоторым антибактериальным препаратам / В.А. Романов, Л.Н. Шитов, Н.С. Борисова // Научно-практическая ревматология. - №3. — 2005. - С.106.

4. Шитов, Л.Н. Влияние циклофосфамида на некоторые показатели микробиоценоза кишечника мышей / Л.Н. Шитов // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА, Ярославль 2007. - С. 31-32.

5. Шитов, Л.Н. Влияние циклофосфамида на рост возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний / Л.Н. Шитов, В.А. Романов, A.A. Макарушин // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: В 3-х т. - Москва, 2007. - Т. 2. - С. 285-286.

6. Шитов, Л.Н. Влияние иммуиодепрессантов на численность стафилококков в составе микрофлоры толстой кишки / Л.Н. Шитов // Фундаментальные исследования. - 2008. - №1. - С. 151-152.

7. Шитов, Л.Н. Влияние иммуиодепрессантов на численность и видовой состав энтерококков в составе микрофлоры толстой кишки / Л.Н. Шитов // Фундаментальные исследования. - 2008. - №1. - С.152-154.

8. Шитов, Л.Н. Показатели микрофлоры толстой кишки у белых мышей, получавших метотрексат: дозозависимость эффекта и влияние пугей введения / Л.Н. Шитов // Современные наукоёмкие технологии. - 2008. - №5. - С. 83-85.

9. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодспрессантов на численность и антибиотико-резистентность стафилококков в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей / Л.Н. Шитов // Современные возможности клинической лабораторной диагностики в клинико-диагностическом процессе: Сб. науч.-практ. конф. -Ярославль: ООО «Изд. дом «Верхняя Волга», 2008. - С.103-106.

10. Шитов, Л.Н. Влияние метотрексата на некоторые показатели микробиоценоза толстой кишки / Л.Н. Шитов // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА, Ярославль 2008. - С. 78-79.

11. Шитов, Л.Н. Влияние иммуиодепрессантов на численность энтеробактерий в составе микрофлоры толстой кишки / Л.Н. Шитов // Материалы Пятого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва, 2-4 декабря 2008. Под ред. Р.Г. Василова. - М.: ИАЦ, 2008. - С. 255-257.

12. Шитов, Л.Н. Влияние иммуиодепрессантов па некоторые характеристики микрофлоры толстой кишки белых мышей / Л.Н. Шитов // Сборник материалов V съезда ревматологов России: Москва, 23-27 марта 2009. - С. 131.

13. Шитов, Л.Н. Сравнительная оценка влияния иммуиодепрессантов различных групп на некоторые показатели микробиоценоза толстой кишки белых

мышей / Л.Н. Шитов // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ студентов и молодых учёных Всероссийской конференции с международным участием, 22 апреля 2009, Ярославль: ООО "ЯрМедиаГруп", 2009. - С.79-80.

14. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на антибиотикорезистентность стафилококков и кишечных палочек / Л.Н. Шитов // Сборник материалов X международного конгресса: «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии»: Казань, 20-23 мая 2009. - С. 266.

15. Шигов, Л.Н. Влияние метотрсксата на рост и развитие популяции условно-патогенных микроорганизмов. / Л.Н. Шитов // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ сотрудников Ярославской государственной медицинской академии, посвящённый 65-летию ЯГМА. - Ярославль: ООО «ЯрМедиаГруп», 2009. - С. 157-160.

16. Шитов, Л.Н. Влияние иммунодепрессантов на популяциогшый уровень и адгезивные свойства условно-патогенных бактерий толстой кишки белых мышей / Л.Н. Шитов, В.А. Романов // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. -№6.- С. 12-16.

17. Шитов, Л.Н. Влияние метотрексата на антибиотикорезистентность стафилококков и кишечных палочек / Л.Н. Шитов, В.А. Романов // Фундаментальные исследования. - 2010. - №4, - С. 86-91.

Список сокращений

АБП - антибактериальные препараты

АФАМ - аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы ГМ - гемолитические микроорганизмы НАМ - индекс адгезивности микроорганизма КП - кишечные палочки

КПСФА - кишечные палочки со сниженной ферментативной активностью

ЛНЭБ - лактозонегативные энтеробактерии

МПК - минимальная подавляющая концентрация

МТ - метотрексат

ПЗ - преднизолон

СПА - средний показатель адгезии

УПБ - условно-патогенпые бактерии

ЦС - цитостагики

ЦФ - циклофосфамид

АТСС - American type culture collection

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шитов, Леонид Николаевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Применение цитостатиков в клинической практике.

1.2. Инфекционные осложнения, возникающие при заболеваниях, требующих цитостатической терапии.

1.2.1. Инфекционные осложнения при ревматических заболеваниях.

1.2.2. Инфекционные осложнения в онкологии.

1.2.3. Инфекционные осложнения в трансплантологии.

1.3. Изменения в микробиоценозах организма при аутоиммунных и онкологических заболеваниях.

1.3.1. Микрофлора при ревматических заболеваниях.

1.3.2. Микрофлора и онкологические заболевания.

1.4. Изменения в микробиоценозах организма на фоне применения цитостатиков и иммунодепрессантов.

1.5. Прямое влияние препаратов с цитостатическим механизмом действия на рост, развитие и свойства микроорганизмов.

Собственные исследования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.

2.1.1. Препараты, использованные в работе.

2.1.2. Штаммы микроорганизмов и питательные среды, использованные в работе.

2.1.3. Лабораторные животные.

2.2. Методы.

2.2.1. Исследование микрофлоры толстой кишки экспериментальных животных.

2.2.2. Схема эксперимента по исследованию влияния метотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий.

2.2.3. Схема эксперимента по исследованию влияния мето-тотрексата на биологические свойства и антибиотикорезис-тентность условно-патогенных бактерий in vitro.

2.2.4. Оценка адгезивных свойств условно-патогенных бактерий.

2.2.5. Оценка чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам.

2.2.6. Оценка влияния метотрексата на продукцию факторов патогенности.

2.2.6.1. Оценка активности плазмокоагулазы S. aureus.

2.2.6.2. Оценка лецитиназной активности S. aureus и гемолитической активности S. aureus и P. aeruginosa.

2.2.7. Программное обеспечение.

2.2.8. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Популяционные уровни некоторых условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей, получавших метотрексат, циклофосфамид и преднизолон.

Глава 4. Биологические свойства условно-патогенных бактерий, выделенных из фекалий экспериментальных животных.

4.1. Факторы патогенности.

4.2. Адгезивные свойства.

4.3. Чувствительность к антибактериальным препаратам.

Глава 5. Влияние метотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий in vitro.

Глава 6. Влияние метотрексата на адгезивные свойства, факторы патогенности и лекарственную устойчивость условно-патогенных бактерий in vitro.

6.1. Адгезивные свойства.

6.2. Факторы патогенности.

6.3. Чувствительность к антибактериальным препаратам.

Глава 7. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте"

Актуальность проблемы

Препараты, обладающие цитостатическим действием, являются эффективными противоопухолевыми средствами; кроме того, обладая иммуносупрес-сивным эффектом, цитостатики находят широкое применение в терапии аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии.

К наиболее опасным и часто встречающимся осложнениям, развивающимся на фоне иммуносупрессии, возникающей при цитостатической терапии, относятся инфекции [5, 6, 7, 63, 158], возбудителями которых являются главным образом условно-патогенные представители микрофлоры организма [6, 7, 19, 81, 160]. При этом в ряде исследований было показано, что при заболеваниях, требующих назначения цитостатиков, имеют место изменения в микробиоценозах пациентов, выражающиеся, главным образом, в избыточном росте условно-патогенных микроорганизмов [20, 63, 193, 194].

Одним из наименее изученных вопросов является прямое воздействие цитостатиков на биологические свойства микроорганизмов и состояние микрофлоры макроорганизма. Вместе с тем, препараты с цитостатическим механизмом действия являются ДНК-тропными агентами, проявляют выраженные мутагенные свойства, и, следовательно, потенциально способны вызвать изменения биологических свойств микроорганизмов. Отмечено, что биологические свойства бактерий, выделенных на фоне введения рассматриваемых лекарственных средств, отличаются от аналогичных характеристик бактерий, встречающихся у людей или лабораторных животных, не подвергавшихся воздействию препаратов с цитотоксическими свойствами [9, 17, 20]. Публикации о прямом влиянии цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий единичны [97].

В соответствии с рассмотренными выше обстоятельствами, актуальным является исследование,, позволяющее установить характер эффектов цитостатиков в отношении.условно-патогенных бактерий микрофлоры организма в контексте инфекционных осложнений и микроэкологических нарушений при применении данных препаратов.

В число широко применяемых цитостатиков входят циклофосфамид и метотрексат [130, 170, 200]. Данные препараты также часто используются в качестве иммуносупрессивных средств [54, 147, 152,173], коммерчески доступны и удобны для исследований in vitro, так как хорошо растворимы в воде.

Поскольку в реальной практике данные о состоянии и свойствах микрофлоры до назначения цитостатической терапии, как правило, отсутствуют, а учесть все факторы, влияющие на микрофлору в организме больного, крайне затруднительно, получение объективных данных в рамках клинического исследования представляется весьма сложным. В соответствии с изложенным выше, эксперименты на лабораторных животных и in vitro являются обоснованным подходом к достижению поставленной цели.

Можно предположить, что в условиях живого организма эффекты цитостатиков в отношении микрофлоры могут реализовываться не напрямую, а за счёт влияния на макроорганизм, в частности, посредством подавления иммунной системы. В соответствии с изложенными обстоятельствами, при проведении эксперимента in vivo представлялось целесообразным сравнить эффекты цитостатиков с действием преднизолона, обладающего иммуносупрессивными свойствами, но не являющегося цитостатиком.

Задачи исследования:

1. Оценить уровень колонизации толстой кишки стафилококками, энтерококками и энтеробактериями при курсовом введении белым мышам цитостатиков - метотрексата и циклофосфамида в сравнении с преднизолоном - иммуно-депрессантом с нецитостатическим механизмом действия.

3. Исследовать влияние различных концентраций метотрексата на развитие популяции музейных штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemo-lyticus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Pseudomo-nas aeruginosa в опытах in vitro.

Научная новизна

Новые данные о влиянии курсового введения цитостатиков разных групп (метотрексата и циклофосфамида) и иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом действия (преднизолона) на уровни колонизации толстой кишки белых мышей стафилококками, энтерококками и энтеробактериями показывают, что все препараты повышают общее количество условно-патогенных микроорганизмов, однако имеются некоторые различия в характере воздействия препаратов на популяционные уровни отдельных бактерий.

Впервые установлено, что цитостатики вызывают разнонаправленные изменения антибиотикорезистентности условно-патогенных бактерий, а также их адгезивности; при этом выявлена прямая корреляция между показателями адгезии и популяциоными уровнями энтеробактерий в содержимом толстой кишки экспериментальных животных; под влиянием метотрексата in vitro происходит замедление развития популяции условно-патогенных бактерий и изменение культуральных свойств золотистого стафилококка.

Практическая значимость работы

Данные о способности цитостатиков вызывать микроэкологические нарушения и влиять на антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий в эксперименте являются основой рекомендаций для совместной работы с клиницистами при проведении цитостатической терапии, в частности, при лечении инфекционных осложнений, развившихся на её фоне.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы внедрены в работу межкафедральной научно-исследовательской лаборатории на базе кафедры микробиологии ЯГМА, полученные данные используются при проведении занятий и чтении лекций для интернов, ординаторов, слушателей факультета последипломного образования и студентов всех факультетов ЯГМА.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение цитостатиков является самостоятельной причиной микроэкологических нарушений и изменения биологических свойств условно-патогенных бактерий in vivo; сходные эффекты реализуются также при введении преднизолона — иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом действия.

2. Введение циклофосфамида и метотрексата экспериментальным животным влияет на антибиотикорезистентность и адгезивность условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника.

3. Прямые эффекты метотрексата в опытах in vitro характеризуются изменениями антибиотикорезистентности, адгезивности, культуральных свойств и динамики развития популяции условно-патогенных бактерий.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на межкафедральной научной конференции кафедр микробиологии с вирусологией и иммунологией, фармакологии и патологической анатомии с курсом судебной медицины Ярославской государственной медицинской академии, протокол № 1 от 5-мая.2010 года.

Основные положения работы были представлены на 57-60-й научных студенческих конференциях ЯГМА (г. Ярославль, 2003-2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007), научно-практической конференции «Современные возможности клинической лабораторной диагностики в клинико-диагностическом процессе» (г. Ярославль, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2008), V съезде ревматологов России (г. Москва, 2009), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (г. Казань, 2009).

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Росздрава» (ректор - почётный работник высшего профессионального образования РФ, заслуженный работник высшей школы РФ, член-корреспондент Российской академии естественных наук, доктор медицинских наук, профессор А.В. Павлов) на кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией (заведующий кафедрой - почётный работник высшего профессионального образования РФ, академик Российской академии естествознания, доктор медицинских наук, профессор В.А. Романов).

Публикации

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы методы исследования», 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Указатель литературы включает 211 источников: 103 отечественных и 108 иностранных. Диссертация иллюстрирована 46 таблицами, 20 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шитов, Леонид Николаевич

143 Выводы

2. Эффекты препаратов избирательны в отношении уровней колонизации кишечника отдельными представителями микрофлоры: циклофосфамид вызывает избыточный рост энтеробактерий, преднизолон - стафилококков; применение метотрексат - повышение численности стафилококков и снижению - энтеробактерий.

3. Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий in vivo выражается в снижении адгезивности: при действии циклофосфамида. — стафилококков, метотрексата — энтеробактерий. Введение преднизолона вызывает повышение адгезивности лактозонегатив-ных энтеробактерий. Показатели адгезии энтеробактерий коррелируют с их популяционными уровнями в кишечном микробиоценозе.

4. На фоне воздействия метотрексата, циклофосфамида и преднизолона in vivo меняется антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий, в особой степени - кишечных палочек. Эффекты препаратов являются разнонаправленными: у типичных кишечных палочек констатировано повышение чувствительности, у кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью, лактозонегативных энтеробактерий и стафилококков - как повышение, так и снижение чувствительности, что указывает на наличие различных механизмов воздействия исследуемых препаратов на антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий.

К. pneumoniae 119 и P. aeruginosa АТСС 27853, антибиотикорезистентно-сти всех исследованных штаммов. Повышения устойчивости к метотрек-сату на фоне его воздействия не отмечено ни in vivo, ни in vitro.

6. Метотрексат оказывает прямое влияние на антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий, приводя, преимущественно, к повышению резистентности; выявленные изменения, выраженность которых зависит от концентрации препарата, являются в большей мере ненаследуемыми; однако 37% полученных изменений - наследуемые, что в последующих генерациях может существенно изменять структуру популяции бактерий по рассматриваемому признаку.

Практические рекомендации

При ведении больных, получающих цитостатики, необходимо учитывать способность данных препаратов вызывать микроэкологические нарушения; для данной категории пациентов целесообразен контроль состояния кишечного микробиоценоза, проведение профилактики и коррекции дисбактериоза кишечника.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шитов, Леонид Николаевич, Москва

1. Алимова Н.З. Микробиоциноз кишечника и подходы к антибактериальной терапии при реактивных артритах // Научно-практ. ревматол. 2003. - № 2. - С. 6.

2. Аманов Н., Гариб Ф.Ю., Умаров Я.А. Микробная экология кишечника и её изменение под влиянием иммунодепрессантов // Антибиотики и химиотерапия. 1989. -№ 6. -С. 453-457.

3. Аманов Н., Холодова Е.Г. Микробиоценоз кишечника у больных, получающих иммунодепрессанты // Клин, медицина. 1989. - Т. 67. - № 4. - С. 68-70.

4. Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Воробьев А.А. и др. Влияние препаратов цитокинов на устойчивость бактерий к антибиотикам in vitro // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. - № 3. - С. 95-97.

5. Балабанова P.M., Белов Б.С. XXI век: инфекция и ревматические заболевания // Научно-практ. ревматол. 2006. - № 3. - С. 4-6.

6. Белов Б.С., Балабанова P.M., Манукян С.Г. и др. Коморбидные инфекции при ревматических заболеваниях // Тез. Докладов междунар. конф. ревматологов. Чимкент, 2006. - С. 17.

7. Белов Б.С., Балабанова P.M., Манукян С.Г. и др. Коморбидные инфекции при ревматических заболеваниях: современное состояние проблемы // Научно-практ. ревматол. 2006. - № 3. - С. 62-66.

8. Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия: Руководство для врачей М.: Универсум паблишинг, 2000. -540 стр.

9. Бельский В.В., Калуцкий П.В., Киселёва В.В. и др. Гетерогенность микробных популяций. М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2008. -160 с.

10. Билалов Ф.С., Габидуллин З.Г., Туйгунов М.М. и др. Сравнительная характеристика гемолитической активности бактерий Esherichia coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных // Сопр. терапия в онкологии. -2006.-№ 1. С. 43-45.

11. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 304 с.

12. Воробьева Л.И., Абилев С.К. Антимутагенные свойства бактерий // Прикл. биохим. микробиол. 2002. - Т.38. - № 2. - С. 115-127.

13. Воропаева С.Д. Особенности внутрибольничных штаммов стафилококков // Акушерство и гинекология. 1974. - № 8. - С. 60-62.

14. Гладько И.А., Пинегин Б.В., Коршунов В.М. и др. Влияние активной иммунизации на микрофлору кишечника при дисбактериозе // Иммунология. -1983. №2. - С.56-59.

15. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. - 459 с.

16. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т. 48. - № 10. - С. 32-39.

17. Гульнева М.Ю., Романов В.А., Шилкина Н.П. Микробная экология кишечника при некоторых системных заболеваниях соединительной ткани // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. - № 4. - С. 38-41.

18. Гульнева М.Ю., Шилкина Н.П. Микробный биоценоз кишечника у больных системной красной волчанкой на фоне применения преднизолона // Клин, медицина. 2009. - Т. 87. - № 6. - С. 42-45.

19. Гульнева М.Ю., Шилкина Н.П. Микрофлора открытых биотопов у больных системной красной волчанкой // Терапевт, арх. 2008. - Т. 80. - № 11. - С. 68-72.

20. Гульнева М.Ю., Шилкина Н.П., Малафеева Э.В. Микробиоценоз кишечника при системных заболеваниях соединительной ткани // Клин, медицина. 2007. -Т. 85. - № 8. - С. 50-54.

21. Давыдов М.И., Дмитриева Н.В. Нозокомиальные инфекции у онкологических больных // Сопроводительная терапия в онкологии. 2006. - № 1. - С.2-8.

22. Дворниченко В.В., Шевчук А.В., Шелехов А.В. и др. Предоперационная химиотерапия в комплексном лечении рака прямой кишки // Сибирский онкологический журнал. 2009. - Т. 32. - №2. - С. 64-66.

23. Демина А.Б., Раденска-Лоповок С.Г., Фоломеева О.М. и др. Причины смерти пациентов с ревматоидным артритом в ГУ институте ревматологии РАМН // Научно-практ. ревматол. 2005. - № 3. - С. 36.

24. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - 240 с.

25. Дмитриева Н.В., Смолянская А.З., Петухова И.Н. и др. Таксономическая структура возбудителей инфекции в онкологической клинике // Современная онкология. 2001. - Т. 3. - № 3. - С. 93-96.

26. Дурнев А.Д. Мутагены и антимутагены в продуктах питания // Генетика. -1997. Т.ЗЗ. - № 2. - С. 65-176.

27. Егорова О.Н., Балабанова P.M. Клинико-иммунологические особенности ревматоидного артрита и системной красной волчанки, осложненных хронической вирусной инфекцией семейства Herpesviridae (HV) // Научно-практ. ревматол. 2005.-№3. С. 39.

28. Жарова Н.И., Гольдат С.Ю. Изучение мутагенного действия циклофосфана на изменчивость Act. antibioticus продуцента олеандромицина // Антибиотики. - 1973. - Т. 18. - №5. - С. 391-394.

29. Иванов Д.В., Шилкина Н.П., Романов В.А. Аутомикрофлора поверхностных биотопов при некоторых ревматических заболеваниях // Научно-практ. ревматол. 2001. -№ 3. - С. 10.

30. Иванов Ю.Б., Черкасов С.В., Кузьмин М.Д. и др. Влияние препаратов стероидных гормонов на персистентные и ростовые характеристики стафилококков // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - N4. -С.92-95.

31. Иванова М.М., Соловьев С.К. Достижения и новые подходы к лечению системной красной волчанки // Научно-практическая ревматология. 2009. - № 2. -Приложение. - С. 19-22.

32. Иммуносупрессивная химиотерапия: Пер. с нем. / Под ред. Д. Нелиуса. М.: Медицина, 1984. - 288 с.

33. Калуцкий П.В. Динамика изменений структуры популяций Staphylococcus aureus и Salmonella typhimurium в организме мышей с различным уровнем иммунной защиты: дис.канд. мед. наук / Калуцкий Павел Вячеславович. Ростов-на-Дону, 1988. - 128 с.

34. Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Постникова Е.А. и др. Особенности становления микрофлоры у детей раннего возраста // Детские инфекции. 2006. - № 6. -С. 6-11.

35. Кузьмина Е.Г., Неприна Г.С., Ватин О.Е. и др. Коррекция вторичных им-мунодефицитных состояний, индуцированных химиолучевой терапией у онкологических больных // Российский онкологический журнал. 2003. - № 2. - С. 32-36.

36. Левашов А.В. Факторы индивидуализации лечения послеоперационных раневых осложнений у больных раком желудка // Вопросы онкологии. 2001. - Т. 47. - № 4. - С. 475-477.

37. Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. Антиэндотоксиновый иммунитет в регуляции численности эшерихиозной микрофлоры кишечника М.: Медицина, 2007. -216 с.

38. Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю. и др. Состояние антиэндотоксинового иммунитета при эксперимнтальном кишечном дисбактериозе у мышей / // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1998. - № 4. - С. 14-16.

39. Личиницер М.Р., Степанова Е.В. Новые противоопухолевые препараты на основе моноклональных антител // Русский медицинский журнал. 2002. - Т. 10. -№ 14. - С. 609-616.

40. Лысенко Г.И., Теслюк Л.В., Никольская О.И. Состояние микробиоценоза кишечника и его коррекция у больных с артритом // Украинский ревматологический журнал. 2005. - № 3. - С. 14.

41. Максимов И.К., Калинин А.В., Рукавицын О.А. и др. Состояние микрофлоры кишечника у больных опухолевыми заболеваниями системы крови при полихимиотерапии / // Клин, медицина. 2005. - № 2. - С. 48-53.

42. Машковский М.Д. Лекарственные средства, 15-е изд. М.: Новая волна. -2007. - 1206 с.

43. Моисеев С.И., Нуйя M.JL, Чеботкевич В.Н. и др. Цитомегаловирусная инфекция в практике трансплантации костного мозга / // Терапевт, арх. 2002. -Т. 74. - № 7. - С. 44-48.

44. Насонов E.JI. Применение ритуксимаба при ревматоидном артрите // Научно-практическая ревматология. 2009. - № 1. - Приложение. - С. 3-22.

45. Невожай Д.В., Будзыньская Р., Каньская У. и др. Современные представления о механизме противоопухолевого действия метотрексата и устойчивости к нему // Тихоокеанский медицинский журнал. 2006. - №4. - С.12-16.

46. Нещадим Г.Н. Изучение путей ограничения антибиотикорезистентности у энтеробактерий в эксперименте: автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1972. -24 с.

47. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М. Иммуномодулирующая и антиканцерогенная активность нормальной микрофлоры кишечника // Экспер. клин, гастроэнтерол. 2004. - № 4. - С. 54-59.

48. Никонова Н.А., Руденко А.В. Изменение биологических свойств Mycoplasma hominis под влиянием преднизолона и циклофосфана // Микро-биол. журнал. 1989. - Т. 51. - № 1. - С. 36-40.

49. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. МУК 4.2.1890-04.- 91 с.

50. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хо-улта, Н. Крига, П Снита и др.. М.: Мир, 1997. - 432 с.

51. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хо-улта, Н. Крига, П Снита и др.. М.: Мир, 1997. - 36.8 с.

52. Орлова О.Г. Взаимодействие микроорганизмов с продуктами гидролиза иприта: автореф. дис.канд. биол. наук. С-Пб., 2007. - 24 с.

53. Осминина М.К., Геппе Н.А., Рабиева Г.М. Базисная терапия ювенильной склеродермии // Вопросы практической педиатрии. 2007. - Т. 2. - № 4. - С. 6570.

54. Отраслевой стандарт "Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника" (ОСТ 91500.11.0004-2003, Приказ Министерства здравоохранения РФ №231 от 09.06.2003).

55. Пахомова Е.Н. Воздействие иммунодепрессантов in vitro на морфобиологи-ческие свойства грибов Candida albicans II Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1994. - № 2. - С. 24-27.

56. Переводчикова Н.И. Изменение арсенала противоопухолевых препаратов за последние 15 лет и современные возможности химиотерапии опухолевых заболеваний // Материалы IX Российского онкологический конгресса. Москва, 2224 ноября 2005 года. С. 47-52.

57. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. -М.: Медицина, 1984. 135 с.

58. Подборнов В.М. Предупреждение развития лекарственноустойчивых форм Е. coli В антибиотиками в сочетании с ДНК-тропными веществами // Антибиотики. 1972. - Т. 17. - № 6. - С. 539-546.

59. Пономарева Т.Р., Смолянская А.З. Влияние антибиотиков антрациклиновой группы, митомицина и брунеомицина на трансдукцию лекарственной устойчивости у стафилококков // Антибиотики. 1978. - Т.23. - № 10. - С. 896-901.

60. Попкова С.М., Шмелёва Е.А., Лещук С.И. Дисбактериоз как следствие нарушения иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. 2007. - Т. 55. - № 3. - Приложение. - С. 57-62.

61. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. / Под ред. Л. С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова. НИИАХ СГМА. - 2002. -350 с.

62. Привалова Т.Ю. Микроэкологические аспекты хирургического лечения ко-лоректального рака у больных пожилого и старческого возраста: автореф. дис.канд. мед. наук. М., 2006. - 26 с.

63. Прокопенко Е.И., Щербакова Е.О., Ватазин А.В. и др. Инфекционные осложнения при использовании мофетила микофенолата у больных с почечным аллотрансплантатом // Тер. архив. 2005. - № 1. - С. 67-72.

64. Рациональная фармакотерапия ревматических заболеваний / Под ред. В.А. Насоновой, E.JI. Насонова. М.: Литтерра, 2003. - 507 с.

65. Рехтина И.Г., Бирюкова Л.С. Фатальные осложнения иммуносупрессивной терапии у рецепиента почечного трансплантата // Тер. архив. 2008. - № 7. - С. 62-64.

66. Романов В.А., Шилкина Н.П., Гульнева М.Ю. Микрофлора организма больных при системных заболеваниях соединительной ткани // Вестник Российской Академии медицинских наук. 2008. - № 4 . - С. 10-14.

67. Рябухина Ю.Е. Инфекционные осложнения у больных лимфомой Ходжкина в различных прогностических группах: автореф. канд. мед. наук. М., 2009. - 25 с.

68. Савицкая И.С., Бондаренко В.М. Подавление мутагенной активности метаболитов кишечника при нормобиоценозе // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008. - № 3. - С. 53-58.

69. Савченко В.Г., Троицкая В.В., Мисюрин А.В и др. Цитомегаловирусная инфекция у больных гемобластозами // Терапевт, арх. 2003. - Т. 75. - № 7. -С. 52-58.

70. Святославов Д.С. Антибактериальная профилактика и лечение раневых инфекций у больных опухолями головы и шеи: дисс. канд. мед. наук. Москва, 2007. - 136 с.

71. Севостьянова Н.В., Исаева Т.М., Уразова JI.H. Особенности иммунологических показателей у онкобольных // Вопросы онкологии. 2001. - Т. 47. -№ 4. -С. 446-448.

72. Семенкова Е. Этиология системных васкулитов и перспективы лечения // Врач. 2000. № 5. С. 4-5.

73. Сеньчукова М.А., Стадников А.А. О роли бактерий в этиологии и патогенезе злокачественных новообразований // Сибирский онкологический журнал. -2009. Т. 32. - № 2. - С. 79-85.

74. Сивашинский М.С. Некоторые пути повышения эффективности химиотерапии больных с диссеминированными солидными опухолями // Вопросы онкологии. 2004. - Т. 50. - № 2. - С. 237- 242.

75. Сидоренко С.В. Инфекционный процесс как "диалог" между хозяином и паразитом // Клин, микробиология и антимикроб, терапия. 2001. - Т. 3. - № 4. - С. 301-315.

76. Сингин А.С., Бондарева И.Б. Популяционное моделирование фармакокине-тики высоких доз метотрексата у пациентов с остеосаркомой // Клиническая фармакокинетика. 2005. - № 1. С. 18-23.

77. Смолянская А.З. Действие 5-фторурацила на передачу фактора множественной лекарственной устойчивости у бактерий // Антибиотики. 1970. - Т. 15. -№1.с. 38-46.

78. Смолянская А.З. Индукция синтеза колицина 5-фторурацилом // Микробиология. 1968. - Т. 37. - Вып. 4. - С. 707-710.

79. Соколов А.А. Микробиологический мониторинг в системе профилактики и лечения внутрибольничных инфекций в онкологическом стационаре: автореферат докт. мед. наук. М., 2009. - 43 с.

80. Соколов А.А., Митрохин С.Д., Минаев В.И. и др. Нозокомиальные инфекции в онкологической клинике: современное состояние проблемы // Российский онкологический журнал. 2007. - № 1. - С. 29-37.

81. Сперанский А.И., Иванова С.М., Мелкумова K.JI. и др. Постинфекционные ревматоидные артриты, связанные с бэта-гемолитическим стрептококком группы А и Chlamidia trachomatis // Научно-практ. ревматол. 2002. - № 4. - С. 126.

82. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. - 464 с.

83. Толкачева Т.В. Профилактика эндогенного инфицирования больных острыми лейкозами, путём коррекции дисбактериоза кишечника: автореферат канд. биол. наук. Москва, 1981. - 24 с.

84. Трояшкин А.А., Иванова С.П. Коагулазная и лецитовителлазная активность стафилококков различного происхождения // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1968. - №3. - С. 106-108.

85. Туманова И.Г., Сигидин Я.А. Новые базисные препараты пролонгированного действия в лечении ревматоидного артрита // Терапевт, арх. 1987. - № 4. -С. 80-83.

86. Фризен Б.Н. Ревматоидный артрит и микробиоценоз кишечника // Терапевт, арх. 1994. - Т. 66. - № 5. - С. 17-21.

87. Фризен, Б.Н. Концепция прямого участия кишечника в патогенезе ревматоидного артрита // Терапевт, арх. 1998. - № 5. - С. 24-28.

88. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет // Русский медицинский журнал. 2003. - Т.П. - № 3. - С. 122-126.

89. Харченко Н. В., Старинский В.В., Петрова Г.В. и др. Смертность населения России от злокачественных новообразований в 2000 г. // Российский онкологический журнал. 2002. - № 4. - С. 37-40.

90. Ходакова Н.Г. Биологические характеристики метициллинорезистентных стафилококков, циркулирующих в Саратовском регионе: автореферат канд. мед. наук. Саратов, 2008. - 19 с.i |

91. Чеботкевич В.Н., Румель Н.Б., Абдулкадыров К.М. Респираторные вирусные инфекции у онкогематологических больных (обзор) // Терапевт, арх. -2001.- Т. 73. № 11.- С. 11-15.

92. Чиссов В.И. Современное состояние онкологии и перспективы её развития // Российский онкологический журнал. 1999. - № 4. - С. 50-54.

93. Шаповал О.Г. Влияние доксорубицина на развитие устойчивости стафилококков к цефтриаксону // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. - №5. - С.82-84.

94. Шаповал О.Г. Сочетанное действие противоопухолевых препаратов и антибиотиков на микроорганизмы: автореф. дис.канд. мед. наук. Саратов, 2008. -23 с.

95. Шендеров Б.А. Микроэкологические аспекты канцерогенеза // Антибиот. химиотерап. 1990. - Т. 35. - № 3. - С. 165-170.

96. Шендеров Б.А. Трансмиссивная лекарственная устойчивость бактерий (микробиологические и эпидемиологические аспекты): дис.докт. мед. наук. -Саратов, 1975.-374 с.

97. Шендеров Б.А., Глухова Е.В., Вядро М.М. Микробная экология лабораторных животных как модель при оценке иммуномодулирующих и антимикробных агентов //Антибиотики и химиотерапия. 1992. - № 8. - С. 39-43.

98. Шильникова И.И. Анаэробные возбудители инфекций человека // Сопроводительная терапия в онкологии. 2005. - № 2. - С. 9-17.

99. Юлдашева Н.Э., Карачунский М.А., Пивник А.В. Клиническая картина и течение туберкулеза при сочетании с гемобластозами // Терапевт, арх. 2004. -Т. 76.-№3.- С. 49-51.

100. ЮЗ. Яфаев Р.Х., Зуева Л.П. Эпидемиология внутрибольничных инфекций. Л.: Медицина, 1989: - 166 с.

101. Alverdy J., Aoys E. The effect of glucocorticoid administration on bacterial translocation. Evidence for an acquired mucosal immunodeficient state // Ann. Surg. 1991. - V. 214. - № 6. - P. 719-723.

102. Araujo R., Carneiro A., Costa-Oliveira S. et al. Fungal infections after haema-tology unit renovation: evidence of clinical, environmental and economical impact // European journal of haematolology. 2008. - V. 80. - № 5. - P. 436-443.

103. Asano-Mori Y., Kanda Y., Oshima K. et al. Clinical features of late cytomegalovirus infection after hematopoietic stem cell transplantation // International journal of hematology. 2008.- V. 87. - №3.- P. 310-318.

104. Benedict W.F., Baker M.S., Haroun L. et al. Mutagenicity of cancer chemo-therapeutic agents in the Salmonella/microsome test // Cancer Res. 1977. - V. 37. -№7.-P. 2209-2213.

105. Berg R.D., Wommack E., Deitch E.A. Immunosuppression and intestinal bacterial overgrowth synergistically promote bacterial translocation // Arch. surg. 1988. -№ 11.-P. 1359-1364.

106. Bindl L., Nicolai T. Management of septic shock and acquired respiratory distress syndrome in pediatric cancer patients // Klin. Padiatr. 2005. - V. 217. - Suppl. l.-P. 130-142.

107. Blum R., Seymour J.F., Toner G. Significant impairment of high-dose methotrexate clearance following vancomycin administration in the absence of overt renal impairment // Annals of Oncology. 2002. - V. 13. - P. 327-330.

108. Bodet, C.A. 3rd., Jorgensen J.H., Drutz DJ. Antibacterial activities of antineoplastic agents // Antimicrob. Agents Chemother. 1985. - V. 28. - № 3. - P. 437-439.

109. Boirivant M., Amendola A., Butera A. Intestinal microflora and immunoregula-tion // Mucosal Immunol. 2008. - V. 1. - Suppl. 1. - P. 47-49.

110. Bosch X., Guilabert A., Pallar-s L. et al. Infections in systemic lupus erythematosus: a prospective and controlled study of 110 patients // Lupus. 2006. - V. 15. - № 9. - P. 584-589.

111. Bow E.J. Considerations in the approach to invasive fungal infection in patients with haematological malignancies // British journal of haematology. 2008. - V. 140.-№2.- P. 133-152.

112. Brandtzaeg P.E. Current understanding of gastrointestinal immunoregulation and its relation to food allergy // Ann. NY Acad. Sci. 2002. V. 964. - P. 13-45.

113. Burns A.J., Rowland I.R. Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics // Curr. Issues Intest. Microbiol. 2000. - V. 1. - № 1. - P. 13-24.

114. Caggiano G., Iatta R., Laneve A. et al. Observational study on candidaemia ata university hospital in southern Italy from 1998 to 2004 // Mycoses. 2008. - V. 51.-№2. - P. 123-128.

115. Cervera R., Asherson R.A., Acevedo M.L. et al. Antiphospholipid syndrome associated with infections: clinical and microbiological characteristics of 100 patients //Ann. Rheum. Dis. 2004. - V. 63.-№ 10.-P. 1312-1317.

116. Chen H.S., Tsai W.P., Leu H.S. et al. Invasive fungal infection in systemic lupus erythematosus: an analysis of 15 cases and a literature review // Rheumatology. -2007. V. 46. - P. 539-544.

117. Chinen J., Buckley R.H. Transplantation immunology: solid organ and bone marrow // J. Allergy Clin. Immunol. 2010. - V. 125. - Suppl. 2. - P. 324-335.

118. Chong A.L., Clinton F., Breatnach F. et al. Cytomegalovirus infection in pae-diatric haemopoietic stem cell transplantation // Irish medical journal. 2008. - V.101. № 1. - P. 17-21.ik

Информация о работе

Шитов, Леонид Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы