Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние состава растворителя и замораживания-отогрева на структурно-функциональные характеристики встроенной в искусственные мембраны цитохромоксидазы

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние состава растворителя и замораживания-отогрева на структурно-функциональные характеристики встроенной в искусственные мембраны цитохромоксидазы"

Еац±ойальна акадегйя паук ГкраЗЕнгс

lEc^-iryr проблей кр±сб±ологй ¿ roict'ossns:ï '

'П fm '

0 0.1 ' ,

Í -, I

ca û.pcScx рухатюу

Наунэнко £ег2Н±я Jíccicrfcssa

ЕШЗЗ СКЛАДУ rCSqiSSEÚl I EL1"0FG3JEiISH-3lAirrïB3 ВБУДСВДНО! 3 Ш7Ч32 Ш?ЗРАШГ' ЦШОлРС^ОШИДЮИ

03.CO.22 - ;~xc-jic-":crí.i

АВТОРЕФЕРАТ дг-:с2ргсцх£ на здсбутгя гиглсзсго сгугзпя кандидата б±ологхчнлг-наук

XspsíB - 1ST3

Диоэртац1ез е рукопас.

Роботу ваконгно в 1нстигут1 проблем кр!об1ологН I крю- .

~'-|£ЭД5ЩИНИ НАН УгГра»НЕ '

е С' '

Науковий квр1вннк: 'доктор б1одоз?1чних наук, црофвсор

В1ктср 0лекс1йозич Ц0ИС65В

' : ' -л V '

0ф!ц{Ен1 спонзнти: . -вдктор 61олог1чних наук, ирофзсор ^ .. ГенадШ Федорович- Еэгупов

... кандадат 61олог1чних наук, доцент

■ ■ . Александр Яеон1дович Наркозсышй V

Пров1дза орган!зац1я: ФIзнко-техн 1 чглй 1нстптут низыдос ... тешаратур Ы..Б.1 .Бзрк1на 11АН

.;■■'■' У1шз11ш ^

' Захкст в1дбудеться п к . 1&35 р. на зас1-

данн! СП2Ц1ал1зовгно1 вчено! ради'' .Д 50.21^01 йрн I астату тГ"-. проблем кр!об1ологН I ьр1омедкцшш НАН Укра1ни,.310015, Хар- " к!в, вуя. Парэяславська, 23.

3 дасертац1еэ »¿окна ознайомитись у б10л1отец1 1нститу?у проблем 1ф1об1охогИ I кр!омэдациш НАН Укра1аа

Автореферат роа!слано " " 1996 р.

Вчёний секретар: Сгац1ая1зовано1 вчено! рада, доктор медачнихнаук, професор

А.Ы.ГОЛБЦЕВ

зхгшт xipaiorkiskka fosgei

¿:?хупльплс?ь .rs cggräc». яссл*х?Апо<гз1 токгпгкп лнссртптгИ. Актуальной гшосз.10?.:са крЮсЯолог!î с з'ясузалня г.:олеху-лярыж î.'.oxciiiEMlD 1ф1опопь:ода:е!21я та^ Kptopo3i:c?eniHGCTt. псаук оггогсалъкн укоз кр!оза>:псту 61 слог lisa об'ск?1з.

Анад1з KexastsMta кр1оупкод:-зння на bísííhhhx р!Еняг^б!о-

j-0ri4E0l оргаг-пзацп нлязнз. що д!я нпзы-п-г-: те?.~эратур чисть

*

значкнЗ вплнз на стоук'гурно-фуЕщ1он2льниП: стан б5олог1чних мембран (Белоус A.M. IS32;' ГулевскаЗ' А.К., ISS3). Еа piss! кл1-тиншк та вкутр!пньокл!тЕннпх кембпан -ссеоееоэ причиною удцпф!-кацх I ix фуннцiокунания ннаслЁдо:-: ssrwpasysssss-вiдi.rplay з'яз-ляетъся isn»iiloB2He зн;п-:ег;:.::л талтзратури та супутн{мл факторам порусэння л!шд-л11пднпх та л!п{д-61лкоепх ЕзасгодШ (araki т., IS77; cro-jä J.K., IS-S3). 1%:асл!док цъого зрсстае пронпклнз1сть

' V

."-зу.брЕН в областях б1лок-л1я1дах контакт1з. п1дзнзуеться дотор-

:-:sHiCTB мембранное 6{лкёз роз—гот: (fin!: a.l. . is8i).

i

Отржган! на TenepíEHiñ час дан! са!дчгть про те. цо з бэзпеч&нн» cnein:Si4HocTi б!лок-л{я!дн11Д взае:.:Сд1й нгзлпзу роль зШгразть 0ic:íko-7.ímí4hí зластззсет t лtn!д1в.сссблгзостi структурно! орган 120ц!! а тане;: загальна тополог i я ÖIjskobkx i лш1дн!Г£ ыолзкул. Структура л1шд1з, i б!лк!з наст i лыс: близьхо Езаемснов'язана з л1нС'Проте1нсЕс:.-у кааггекс! .£0 зм!на вяастзвос-теЗ одного з кс:л:онгнт1з црдгЕ-эдэ до emíhh властяЕОСтей ík-Юго.

Сказана у ecehIS mí?: з!деос*ться tskcz: до досл1дхвкня - зплнву крiспротэкторiз на ôfo.œrl'ïHi ;::-::бран:!. Ichtss! на тепе-pínnií- -tac з Л1тератур1 дан! св!д^ать, цо кр1епротекторк на яв-ляэться îHHHïspeHTHi^ai у з!днсл-экн! 6!олог1чнз2: гзмбрга (Аксе-

нов С Л!., 1935).-. :,:од!гф1куя ¿пшд-лш^дн! та лш1д-б1лко21 ззас-шдН. Дани отрешай! на розчнныих б'лкал сз!дчать. цо ц! речо- • еикн здатш взаемод1яти з б!лкамц та сорбуваткся на !х по2вр;сш (Моисеев В.А., 1935). часткозо за^Ьчаач:: г!дратну воду. Вкра'1 кало в Л1тератур1 роб!?, прнснячзнкх дослгдхеггЕ- внлкву кр!одрб-?зктор!в на лш1дн1 бшзрл. »-эдоХЛкозан! бЬ-сап!.'

Кэобх1дн:!м етапом . з'ясуваЁця голокулярнэ: г.:ехан1г:г1в 1ф!ошз2кодаоння кэмбран -е досл!дгэвш1 шхшу кпзыаа тзшератур та поз'язаних з •!>; шлнво.м £г_;тор1в на сНлок-лш1д;п комплекса. Доц1льы1сть таких досллдгэзь шдтвбрдг.:уетъся дакии про з;,'Лнен-ня активное?I ряду ыецбранозз^яза-ЕХ . шсля заморокут

вання 10111121 та кл1к-:зн2£ орга-юл. Одвки з ва£яив1шх фэрмэнт1в . внутр 1 шньоI квкбранк ЫтозсщрШ* в .штохргаоксидаза (ЦХО) -?ерм1нальна д1лянх;а дкхадького ланцету. поз'язаного з лаэдюгсм оккслшального фосфзрнлгсаазня. Досл1даення стану цього ферменту в тканинах п!олл за^орозування сз1дча?ь про -знлзэния його активность У роботах, вглонк^: на 1зодьозано.чу л ¡шпроте ¡косому еомшюкс! есте202лэк0. ЦЗ 3&\£>р02;увгнШ1 до - 20 °С !,50118 -сщкгсшштп 2м1ыеш1л структур:* фэр^енту (Розанова 5.Д., 1584), внасл1дсн еплизу кокцеятрованнх розчшпв солей при вжорогуаанк! води. Складн1сть структурно! орган1зацII тк.родннх :бран. та Бнасл1док цього. неодзозначн1с?ь Штерпрзтащ1 отр^аких результатов. дозволяе лзшзэ поб!чно оц!н::т:г роль 1нтагргльнкх б;лк!з з рэакцП б1ог.;&ыбргн на дш за\:оро:<у2аш1л-21д1гр1ву I кр1опроте:с-тор:в, дкктуе необх1дн1стъ проведения досл1дкзеь на >;одэльних системах. У.абуть, досшджзкня, якг зд1йсь":взться на такта системах. будуть спрзятп з'ксуааннв особливостей .Ч'Эхагпз.\'Лв вплнву охолоджэння на 1нтогралып быки у склад! г,'.амбра:: та в ¡зольо-

ваному станiч

Як кодэльн! система начат були ЕЕбран! протеол1поссягн. ко утворювалпсь фосфол1п!да\ш та , штеграл ьннм 61лкон ГКО (ЕС 1.9.3 Л.). ' • .

l'.a-ra та ззвдакня дсслЬсекня. {¿этой ais! рсботп з1 явилася дослЕдгзння вплизу затарал:/зання-в!д!гр1ву. коЕцентровангх рсз-•■íhhíb солей та шзьксмолакулярхгх кр1спротектор1в на структурно-фуккц1окалъниЗ стен LEO, яку було вбудована у jisuetíeobí л!пссо-!"í. а такок ка стан стучнкх ссссёол1п1днэс мембран, со г.'Лстять ПХО.

Були остановлен: наступи! завдання досл^ення: Í. Вазчктк вплиз за,арокуггння-31Д|гр1ву з сврвдозззах з р1зк:и солевим складом на струк7урноч5уккц1ональнпЗ: стан ISOr цо вбудована у л1посс?«ь

2. аЬсл!дк?л ссобливсстi структурно-функц1аналъного стану ЦКО, вбудозано! в л1пссо.-.<л пр- еплнв! р{зштх кокцептраШй сслэё i кр!сЕротектор1з. • ,

2. Естгнозтти v.cc^eiсть кр!олротекц1I вбудованне! в л!по-согл! ПХО за доло:догоо глшерлну i 1.2-пропанд1оду (1,2-ПД).

4. Б'>:вчктп вплив за\'орозуЕакня-в1д1г?1ву, солей t :срÍсироте ктор i б на стан пратесип пасом.

Тесгеттгенз t гтсг:-гг:гч:-:э nfesícTb ' дсслхдггкня та Пего нзтг.сза новизна.

Вперла встановлено, цо nosiльне заморо::уваЕня протеол!носом. як! к i стать ШСО, спрл*-дд-:яе частнсву 1нактивац1в (40 х) " ферменту, до сущюводауеться saieco'ксЕ&зрлгЩ! б!лка в облает! rerííc с i з„. як{ вхедять до складу активного центру ЩО.

Выявлено. со е:;сстс; концантрацП rtaci t kci гшпце 1,2 Ut

5

сщжчинявть ам1ку конфэрм2цН!Ш:о. вбудовано! у л1посолш, що су-проводзуеться 1нактивадиев фзрланту. Вплыв концвнтрованих розчи-шв солей ЕэоднаковнЗ при 8 1 'при 24 °С, що пэвно обуыозлено 1с-нуванняы конформаЩйного температурного переходу при 22 °С.

Досд1дганнп, здШсншанэ з визначенням в^дносннх змш пара-., мэтр!в хЛпосом, встановпло взаемозв'язок м1г кокформащею б1лка 1 станом л1шсоы та П1дтвврдаи10. прзшущзкыя про мо2ШШ1сть шак-тнвувчого вшиву розчш1в солей на ЦХО. %

Вивчення вшпшу за.моро2ування-в1д1гр1ву на ЦХО. яка вбудо-. вана у лэцит1нов! .л1посомп. в розчингх. що ыIстять 1,2-ПД 1 гл1-■ церян показало, що фзрлзнтативна актившсть збер1гае?ься при заморолуванн! е 30 х-них розчкыах крiопрэтектор1в.

0гр:шаЕ1 експершлзнтальш дан 1 змогу/ть знайтк застосуваыня при подальиому фундаментальному досл1даэнн1 мехашзглв крЮза-хисту б1олог1ЧК31х об'ект1в, у розробц! ефэктйвша' метод ¡в крю-протекцН б1олог1чнп£ мэмбран.

. Апробап1я та пубд!кац1я рззультагхв досд1пгбнь. Осноен! шлоЕэння дасертащйно! роботх докладалися. I обговорювалися на: - У1 Загалькосоюзшй конференцП по спектроскоп! X бюжшмэ- '• р1в (Хар-ив. 1933); уц ЗагапькосоазнШ конфэренцП по спектроскоп! I б10П0л1ыер!в (Харк1в. 19Э1): и ЬПгаарэднШ конференцП -Усп1хи сучасно! кр1об1ологп- (Харк!в. УкраШа. 1992): I зЧз-д! б!оф!зичного товариства сКх'Лз. 1ЭЭ4). По те:.п дксертацП опубл!ковано 8 наукових роб!т.

Структура 1 обсяг робота. Дксертац!я викладэна на 134 сто-р!шсах машинописного тексту, скдэдаеться з вступу. 3 глав обзору л!тератури. 3 глав результата власких досл!д>::ень та п. ойгово-. равання. закШчзння, вцсновк^в та списку л1тератури.

6

Робота _м1 стать 3S малияк1з i II таблиць. Список лiтературп нал!ковуе 262 дозрела.

Oco6itcTiGl вкесок jsiceртсггта з е:п:опз;ел ссбота •га сснсзп* поло~ення, по гтгкссяться па заулс?. ОссбистиЗ внесак дпсертанта у розроСку науковах результат!а полягае з поен!стэ са.\:ост1£Еому втсонанн! всього обсягу експерпментальЕо! робота. статт'.стнчнГД обробш отр'лмакнх данях та сцищь На шдстаз! анял!зу результат ¡з експерикенту та cniвставления !х з ' дансл1 л!т8ратурп дисертгнтом сфориульовгнt так! полопення. цо паносяться на за-

хист:

1. Поз iльне замзро:-узання суспензП протеолшоссм спричпняе часткозу !нактквацш Ебудовано! ШО. ¡50 супрозодкуеться е:.нес-з конфорглацп б1лка з облает! гэШв а 1 а,- При вассках пвадкостпг охсложения таш прсцеса спостер1гакться т!лька пра пр::сутност! в po34:::-ii хлорад!Е i к.

2. Розчана хлорал ¡в i к сз концентрация:: е::цэ 1.2 Г.!) отзичкняять нэоборотш кенфэрггшл £н t ^зрэходц Ебудовгно! у лэна-T!H03i лптосс:^: ПХО. я::; суарогодзуються iE2Hurnsauisa й-эр:,;знту. З-УЛНИ ПрОТбОЛШОССМ, 250 СПр!£ЧИН5Я t КОНЦеНТрОЗаНаГ.1 СОЛЬОВ!П.Я1

розчангш: при 3 °С, аналогfrei 'cnocrepiraercr.: при зг-'-гороауванш

протеолшосом.

3. Глшеркн i 1.2-ШЕ запсб!гагггъ коЕфэргац!£нам. autE&'j ШО, спричаненкм закорэгуванням. Bi ло:-:-л!п! да1 взаег,:од!1 стсб!л!зу-аться т!лькн 30 х-кам резчаком 1.2-ПД.

?'отояолсг£я, дослйггe?as nr-gr^5T7 ± cO'sxry. ГГ'О з

- серця взлако! рогато! худоба валучала за г.тетодсм ¡ein; а деякар/л Kauf яма (Jons p.c. . 1972). Для Еазначення частота препарату ьикористозувала загалънопртйнягу характэрастаку спектр(в .

7

гюглшання щп 2S0 егл I 418 ем. В отриглашп: препаратах E280sE_118 було и ьзезх 2.5 - 2.6. цо св1дчнть про достатка ступ1нь очистки б1лка. - ;

Blnapnl пр0ге0л1п0сс;с1.: ях:1 Еы1цувть ЦХО i фосфолШд от>

ргмувалп за мэтодом д!ел1зу в;присутност1 холату натрия (коиа-to s.. 1231). Вагозэ сп1вз1дноаення 61лок/л1п1д складало Ы. Контроль за вбудозгнил в л t по сом:» формантом .здШснюзали sa методов впзЕачопЕЯ шстпвкоот! ЩО.. яка повинна перевэрйувати актив, Е1сть фэргленту в роз'-ЛЕ! в 4 рази.

\ ©ункц1ю ЦХО характэрдзувалк за допомогою елэктронпвредаю-цо1 зд16еостК ¿ктпвя1сть виШрааалася спектрофотсметрично за-лэ-iho в1д oi.iiini поглинавня -в^даовлэного цитохрому С при 550 нм за ыэтодшсою (Yonetani т.. IS55). Концентрацию б!лк1в визначали" ва допо^огоа .спектрсфоашэтр!!: Ц20 при 418 км (е мы = 79), ;ци-. тозфозлу С - щзп 550 ел (е fJJ;» 27,7). -

Для хорактерлстскЕ структур:: ЦлО використовували метода ДЕфоронцi алыю I та тешзратурно! пертурбац1йно! диференшаль-ео! (ТЦДС) спэктрс$ога\:этрН (Дзмченко А.П., IS3I). Уряд! екс-пэрглош:1в п1сля зг&орогувгнкя-в 1дt грIву i п!сля впливу охолод-'. еэеня зестосовувалн чиселькэ даЗерэщ{'юзашм спактр!в поглиыан-ня Щ0 та гор1вшзалп форду Ix парацх пох1дгсгх.. Параметром, що характеризував конформац1в б!лка. буди спектра поглинання в области смугн Сора. При nofiCH6HHt вшшзу складу розчишв на ЦХО ввакалп, цо поруцешя л1н1йност! } структура croiapiB св1дчать про зм1ну конформацП б1лка.

Для внявлення теглшратурних конформац!Йних переходив вивча-лн тошературзу залакн1сть 1нкрем8нту екстинцИ, котрий е в!дно-сенням приросту екстинцИ при зм!н1 температуря на I °С до зна-

8

чення екстиккци в максимум! поглинаняя (Демченко А.П.. 1931). Область кон£юру.ащйного переходу визначалась за змшою формн ТПДС.

'и'орфолог!чн!' дослгдЕення протеолШосом проводили за допомо-гою елбктронно-м!кроскошчного методу заморожузання-скалування на установи, яка описана Решнкы Н.В. в 1984 р.

Власкэ змшу розм!р1в протеолшосом характернзували за до-помогою Ш1То:ло! мутност1 х « 2.303 2500н„/С11гЛ ^ та параметру Р = 4.18 - (и !е5оони /Е550нк)/С1г 500/550)). залекного в1д радиусу лшосом за методикою, яка списана в статт! (спопг с. в.. 1976). Зам.оршуванкя протеолшосом здШсшовали у шзастмасових проб1рках сб'емом 3 мл. Швидке охолодкення досяталось зануреннягл склянка з суспензги лшосом в редкий азот. Середня пвидк!сть охолодхування при цьому становнла 70 °С/хзил. Поз¡льне за\:орслу-вання зд1Йснязали в парах азоту до - 30 °С з серэдкьою шеидкгств 2 °С/хеил. В1Д1гр13 ПХО учиняли у водянШ баш при температур i 20 °С. Замст:о:::ування-31Д1гр1В ПдО проводили в севадовнщал, основою яких був ка-фосфатЕй буфер. со утрпмузав Н5одк8ков1 конце ктрадП солей 1 хрюпротектор{з.

Концентрация ферменту в цих досл!дах збер(галась сост!йнов на р!ВН1 4-6 ккМ.

Статкстичну обробку результат1з проводил;: за методом Стьп-дента-<31Еерз.

РЕЗУЛЬТАТ!! ЕЛАСШК Д0СЛ1Д2ЕНЬ ТА Г-Г СБХТЛхТТБЛНКЯ

Егь~е зг-.!орогувгннл-в^дЬгр1зу на сгруктурно-»рун1сц+снальн; паранетрн ПдО в яйюссиах

За дспомогов електронно-м1кроскои1'шогс катоду земероаунан--

9

кя-скалуваннл ми отругали результата. як! показали. цо препарата лШосом, як! вцвчались в робот!, складаються гаревазно з 1Н-дав!дугльншс сфзр'лчкаг. зразк!в з вармруеким дЬаметрсм 0.4 -0,7 кхм. Дкт:шн!сть ферменту п!сля збудування в лШ1дни& б!шар переверауо Гюго актазн1сть у рэзчшп в 4 рази, цо вштозиае Л!-. ТОратурНИМ дака! (Кача$:о Б.. 1931).

Перга парадна спектр¡з пэглннання ПХО, яка знаходиться в складI л!посо:г, ггае макетам при 403 нм, г<п н • глум при 440 и-:. I практично не В1др1зыяеться В1Д параметр I в ЦХО в розчкнь В той ке час спектр погл;£наккя вбудоваккого у лшосоми бглкэ в У£-сб-ласт! зм!яй5ться шал. п.

ДЕ/сЛ

Мал. 1. Пера! пох!днI спектр!в поглинання ЦХО. I - в розчнн!. 2 - у склад! л Iпосом.

Як св!дчать спектры поглинання, процес вбудуванкя ЦХО ь л1-посоыи з яечного лоцит!ну цризводкть до зьини конформацП бктка. яка но в1д!грав на ступен! Ього активность

ЦХО в розчнн! мае конфэрмац1йний перехлд при 20 °0. якиП зач!пае б!лкову часткыу макромолекула. Вбудована у лшосоми ЦХО мае додатковнй конформащйний перех!д в облает! 10-12 °С. Зрэб-

10

лен висновок, шо конформаШйний перех1д в облает! 10-12 °С тор-каеться не т!лыш б!лково1 частиш комплексу. але й област1 ге-шв. що св{дчить про текпэратурну лаб(л1зад1ю внутр1сн|х областей б1лка. ■ ! ■ ■

Досл1даення, виконаш на протел!посомах, як! м1стять ЦХО, показали, що внаелгдок заморояування-в!д1гр!ву (швидкого) фэр-ментативна актившеть ЦХО практично не змШюеться (табл. I). на-В1ть шеля 2-кратнкх цикл!в заморокування-в1д1гр1ву. Одаак. спектр поглинання ферменту в облает 1 смуги Сорэ поширззться.

Таблэдя I

Еплив пвидкого та гов1льного занорокування на ферментативну 2ктизн1сть ЩО та параметр:! л!посом

ЦХО Склад роз-чину АКТ1ЕВН|СТЬ. XX до контр. Р . т/с

Швилке заморояування

Контроль 0,05 Н-фосфзт 100 ; 1,9440,2 1,ЗЭ±0,1

1-разове . « Э8±2 2,05^0,1 1,13*0,1

2-разове « Э5±3 2,И±0,2 0,Э8±0,1

Пов!льне замогюкування

Контроль « 100 1,79±0,1 0,Э2±0,1

1-разове п 78±4 1.86*0,2 0,77±0,1

2-разове и 65±2 2,05±0,1 0,75±0,1

Анал1з перших гох1дних спектр!в поглинання ЦХО дозволив з'ясувзти, що шел я заморожування змша спектру вибуваеться за рахунок змщення в довгохвильовий б1к мшШуму першо! пох!дно! (мал. 2). Враховуючи те, що у спектр поглинання ЦХО дають внесок два геки: гем а з максимумом при 430 т 1 гем а3 - з максимумом при 410 нм, можна припустити, що змша конформацН ЦХО в!дбува-

II

dE/йЯ.

X, НМ

Мал. 2.

Перш пох!дн1 спектр1в поглинання ЦХО п1сля заморожування.

1 - контроль!

2 - швидке заморожу-

вання*

3 - пов!льне заморо-

жування

вться в облает! гему а. Причому. ц1 зм!ни в!дбуваються незалежно в!д того, знаходиться ЦХО в розчшп. або вбудована в лецитшов! лШосоми.

Вивчення тешературних залежностей спектр!в поглинання ЦХО в л1посомах показало, що п!сля швидкого заморожування протеол1-посом темпвратурний переход в облаетI 20-2 °С зм1вдеться в б1К високих-температур на 2-4 °С. Тегшературний переххд в облает I 10-12 °С - в1дсутнШ. 1

Пов1льна швидк!сть охолоджування протеолШосом приводить до пад1ння ферментативно! активное?I на 40 г (див. табл. I). Цвй факт посилюеться 1з зб!льшенням числа циклIв заморожувакня-в! д! -гр1ву. ■ ' ; "

Шсля повального заморожування протеолхпосом спостерхгаеть-

ся зм1нення спектру пог.

линання\

ферменту в облает i смуги Соре.

Анал1з горших пох1даих спектру 'доглинашм щ;0 показав, що. шсля заморожування в!дбуваеться змщення всього спектру у коротко-хвильовий б!к. то евгдчить про змшу кокформацп ферменту в облает! гекив а I аэ (див.-мал. 2).

Характеристика л!посом шсля бпливу заморокування зм:вдеться.. Спостерхгаеться утворення б!лыи великих неагрегоЕаних л!-

12

посом за рахунок уливання мекших за розм!рами (див. табл. I). Даш. отриманî за допомогою електронно-м1кроскоп1чного методу, свгдчать про однородность розмгр^в лiпосом п!сля заморокування.

Значку роль у пошкодженн! структури мембран I л!п!дного 6i-шару при заморожуваннi вод¡грають концвнтровая1 розчши солей. В(домо. що ЦХ0 в розчиш i«активуеться при швидкому заморожуван-Hi в присутност! хлоридiв Na i к. Для модалювання реального кл!тинного середовища mi досл!даували вплив заморокування-в1д!г-piBy на ЦХО в л!посомах при доданн! в буферне середовище солей Naci i KCl в концентрац!яг 0.1 H.

Швидке заморокування протоол¡посом в присутност! хлорид!в цих солей в середовищ! заморожування приводить до зникення фер-ментативно'! активностi на 10-20 г.. Анализ перших пох1дних спект-pis погл1шання ЦХО в'л!посомах в облаетi Соре показав, шо п1сля швидкого охолодкування протеолопосом в присутност! МаСi t KCl в концентратах 0.1 M спостер1гаеться зм!щення м1н!муму першо! по-х i дно ï в короткохвильовий б!к. БИдбуваеться зм!на конформацП ЦХО в облаетi гему а.

Пов1льне заморокування протеол!посом б присутност! хлорид!в на i к приводить до значно! ¡нактивацо: ЦХО i до короткохвильо-вого зм!щення MiHiMyMy i максимуму першоï пох!дно! спектр!в го-глин ання ЦХО у склад! л ¡посом. що св!дчить про зм1ну конформац! ï ЦХО в областях-гем!в a i а3-

Заморокування л ¡посом в присутност! Naci не чинить вшшву на bhb4aemi параметра. aie- в присутностt kci спостер!гавться зм1ни аналог1чн! тим. що в1дбуваються при заморокуванн! в фосфатному буфер!.

Таким чином, при мекших твидаостях заыорохування спостер!-

13

гаяться б1льш Еиражаш зм1ни структурно-фукнщональких параметра ЦХО t л!посом, а також ix залезайсть в!д сольового складу сервдовища. Для п!дтвердження цього припущення було проведено. б1льш докладне вивчення впливу властивостей розчишв на ЦХО...

Структурко-функц1ональн± характеристики вбудовано!

Е лЬюсоки ЦХО в розчинах хлорид!в Ка ± К

Як було показано виде, при вплив! заморокування на ЦХО в присутност! солей мае Micue змша досл!даених параметр!в ферменту та лшосом. Вгдомо. що ряд катiон¡в та aHioHis. hki в малих концентрац!ях Heo6xi,zcn для шдтримки структури i функцИ б!лка, мосуть спричиняти пошкоджуычу д!ю при високих концентратях (Моисеев Б.А., 1980; Герман М.Л., IS83). Для шдтвердаекня цього припущення було проведеке б!льш докладне досл1даення Епливу роз-чин! в солзй Naci i KCl в концентратйних мехах вгд 0 до 2 М на ЦХО в лшосомах при 8 та 24 °С.

Вивчення спектр!в поглинання ШСО в облает! Соре дозволило вотановитк, що концентратSHi залежност! останшх рIзн i при 24 та 8 °С. При 24 °С спостерггаеться зб1льшеш1я штенсивкост! спектру поглинання пропори¡онально концентрат; з розчиш 3i ЗМ1Н0Ю нахилу прямо! в облаетi 0,8 М ;'мал.3).При досягненн! uiei

концектрацп спостер!гаеться змщення спектру поглинання в ко-

\

рОТКОХВИКЬОВИЙ б!к, ЩО OCOÖJEIBO добре /¡..Xl'iHO НГ; ПорШИХ 110-

х!днгх спектрtв поглинання. Вивчення гермектатанноi активност! таког показало, що и'зшжеккя спостер;гаеться гпелн 'експояицП в роз чин i :;aci з кониентрац!ею. яка перевернув 0.8-0.9 М.

Дан! спзктрсфотометричнш: доелгджекь вклвча«/гь ^оять багату :-::льк!сть огнак. як! сз1дчать про те.цо при концентратях 0.8

'а

с. н

Мал. 3. Залегла i сть ¡нтенсивност! píshícthhx спектр i в погли-нгння Щ:0 В1Д концентрацil солей та температуря. I - кс1. 8 °С; 2 - KC1. 24 °С; 3 - Nací. 8 °С; 4 - nscl. 24 °С

-0.9 M в!дбуЕаетЬся конформац!йкий перех!д (Морозова Т.5.,1982).

Секлльки з1дсмо, цо д!я солей залеккть з!д те?шературн. нами був шшчен еплнв хлориду на 1£С0,,Е0удовану з л!пссо»к яри

Досл1д-энкя показали, що до концэнтрац! I f.'aci 0.8 М набузаз зкензення штенсквншть спектру погл1шаккя (див. мал. 3). при цьому Лого структура практично не змпнеться. При б!льа елсских концентра:; 1ях спостерггаеться зг.пщення максимуму спектру погли-наннн та ¿"стремушв першо! похгдно!. в!дм1чаеться злам на концентрат йн!Л ззлежocTi ¡ктенсивност! дЕферэкц1альних спектр!в. Наведен! д-rdi дозволянть взажата, ¡до з облаетi mix концентрации сол! з'дбукаеться конформац1£ний перех!д ЦХО. Б1лыл низьке значения кснцентрацП Mac 1 у дано.му випадку, Htrt для бииа в розта-Hi (1.4 М) сз1дчить про тэ, ео з л ¡шдному б inapt Или меяп спй-ка лс нплизу сол!. н!:к в розчкн! детергенту (Резанова E.I.,

8 °С.

Î59I).

Змша в повед1нщ лшосом при досягешп концентрацп сол! 0.8 Ы св1дчить про те. цо стан б1Лкозо! молэкули i змша бiлок-лш1дних взабмов1дношень в1дбивамться на властивостях лшосом.

Додання з розчин протеолшосом хлористого калш призводить до появи дофэрекшальЕих спектр i в в облает i Сорэ, структура яких залечить В1д концентрацп соль Вивчення cneKipis поглинання дозволило встановити. що концентрашйш залекност1 останн!х неод-наков! при 24 i при 8 °С. \

При 24 °С до концентрацп 1.2 М спостер1гаеться зб1льшення iHTeHCHBHOCTi спектру поглинання пропарцjfc;о концентрацп соль Пагш набувае pi3Koro збмьшення шгенсившсть спектру (див. мал. 3).

При досягненш концентратi KCl, 1.2 М спостер!гаетьск такох ЗМ1Щ8ННЯ спектру поглинання в короткохвилъовий 6iK (кал. 4).

äE/öX

г 1

// \

1 _ 400 1 \ 42 " 1 i I I О 440 460 \ /

—

X, нм

■■Мал. 4.

Перш noxiflHl спектргв поглинання ЦХО в при-сутност! KCl" при 24 °С.

1 - контроль,-

2 - 0,56 М; 3-1,9 М.

Анал1зуя дан! диференц1альних спектрiв моаиа црипустити, що зб1льшення !х iHTeHCHBHOCTi зумовлено змшою властивостей сере-довиша, а в облаетi концентрац!I 1.2 Ы мае wieye конформащйний перех1д. який зачшае геми а i в3-

Вивчення активност* ЩО Шсля експозицi i при 24 °С з разними концентрац!ями kci виявило пад1ння активност1 ферменту.

Що стосуеться самих д1посом. то видно вплив KCl на ix стан,

16

який приводить до arperayl!, котра прпзушнявться в облаетi кон-центрац!й 0.8 - 1.4 И (мал. 5).

Наш було аивчоно вшшв ксх на протоол!поссш1 1 пра 8 °С. Анал1зуя ц! доя! ткна припу стати. со в облает! кенцэнтра-

2

г.о сксп.м

Мал. 5. Концентрацией! зале^ност! пвраг£этр!в л!госом в пра-

сутност! kcl.

I -"8 °С; 2 - 24 °С

uil I.2 И в1дбуваеться конфармац1Янн2 шрех1д. якпй торкаеться reutB a t а3 (дав. ШЛ. 4).

Вшшв KCl прн 8 °С на ЩСО шкшодать до яад!ння активкост! •ферменту:niсля експозпцИ в розчзнах з коЕцентрац1ев. яка нере-вершуе I.4 М.

кс! вкклнкае процес злиття л!тгосон в б!льп велик!. Актпв-н1сть цього процесу значно зб!льауеться при кокцентрацН сол! ксце 1.2 М с див. мал. 5). .

. Такта чгасм. пор1внэычи наведен! результата в цьЬ-7 p.j34HH! з результатам за-юроггування протеол!шсом у р1зних сольоеях се-редовпцах. гложа зробкти впеновок. но заморозувгння в розчинах. як1 м i стять íiaci i KCl, виелгкаг tekt г: 2!.! i Ell, як1 в!дбуваються пр;: вшлзг кощентровангх розчпн1з цих солей прп 8 °С.

Вплиз irpicnporeirropíB кз ЩО 7 сплад! л±яосеи

В1домо.ео крюпротенторя чкнять вплпз на ф1зико-х1м1чн1 па-

17

рема три л1п1даого б!пару. модггф!кувть л!п!д-лйг1дз! та л!п!д-

öijatoBi взаемодИ у ыодельних та природных мембранах (Rodoiph

Alan s.. 1936). 0ск1лыш гл!цэрш та 1.2-Щ здатн! запоб1гати

змШам. сцрячиняемим заморсщуваякям-вiд!rp 1 вом б!лок-л!п!дному

комплексов! ЦХО лРозанова Е.Д*, I9S4). уявлялосл доц!льнлм вив-

чити структурно-функц!ональний стан ферменту у склад! штучних

мембран в присутност! цих кр!опротектор!в.

Додання до розчину ЦХО гл!церину приводить дол появи соль-

вентно-пертурбад!йних диференц!ал.ьних ,спектр!в (СПДС) в облает!

i смути Соре, структура яких практично не заложить в!д концентра-

ц!1 кр1опротектора в розчин! (мал. '6).

äe/e . Мал. 6.

Залежш сть Штенсишос-^Z ' Tt СЦЦС ЦХО в!д концен-■'2 трацН кр!опрот9кгорсв.

1 - ГЛ'ШерИН:

2 - 1,2-ЭД

-Г—-1-г——~|—•—

ю го зо АО

Кр1оцротектор, X Порушання л!н1Сност! коядантрзШйш! зглежност! cnocTepira-._ еться при концентрацй глШзрину 22-25 г. При цьому структура диференц!альнпх спектр!в була однакова при концентрац!ях вице та нижче критично!. Ми припускаемо.; що порушення лШйно! залеж-HocTi С1ЩС пов'язане на з! змШоа конфэрмац!! б!лка. а з! зм!ною доторканост! хромофор 1 вгл!цэринов 1 внасл!док адсорбц!! молекул кр!оцротектору на поверхн! л!посом (Моисеез В.А., 1985).

При концентрац!ях гл!дерину нижче тих, при котрих спостер!-гаеться злам на концентрац!йн1й залежност! !нтенсивност! .С1ЩС. в1дбуваеться зм!щания температурного переходу при 20 °С в 6iK

18

eiicokiix температур. При подзшцзнно концентрацП глшернну це£ кокфорг.таоййнай переход не спостер1гаеться. Проте, злам на температурив залекностi ¡нтсн-изност! ТДДС в облает! 10-12 °С зали-опався при ycix вивчаемои: концентра-,1ях' глщерину. алэ тако;х зм!-■цузазся в 6iK Шдвищаиях температур на 2-4 °0.

Цей факт когаа. певио. пояснитк там. що за кокфоркац!йшй перех!д при цях теьтазратурах водповодальш облает! б!лково1 молекул:. якл не доступно гл!церинов1. Слод вш-'Лтита, що -вплаз глщеркну поен!ста оборота lit.

Активность ЦХО а прнсутксст! глщерину змэгпоуеться. ЦеЛ ггроцес моглоа отоясошти зннг.оенням сродства ферменту' до субстрату при сорбцП молекул гд!церину на понерхн! л 1 носом. Шсля вилу-чення глщерину актива ¡сть ЦХО ггсыпста в!днозлюеться.

Вивчегшя змши poswipiB опютеолшосом показало, що при п!д-виоценш кониентрацп глицерину в суспензП спостер!габться зрос-таошя po3Mipi3 лшосом.

Концентрашйна залезь iсть iнтексивност i СТЩС для ЦХО в!д концентрацоi 1.2-ПД лошйна до 24-2S х крюпротектору <дав. кал. 6).

Активность ферменту, вбудованого у л!посоми. зкачно зна:.:у-еться вод присутност! 1.2-ПД, але цей процес. як ! у випадку з глоцераном, оборотной.

При коощентраои i 1.2-ПД 20 z ! вице, тампературний перех!д в облает! 20 °С ке зиявляеться. Але злам на температурной за-лег-зост! оHTsнеявностi ТПДС в облаетi 10-12 °С залиглався пра ycix вивчених концентрациях 1.2-ПД. Поведонка ЦХО в л!посомах з присутност! I,2-ПД в основному не в!др!зняеться в!д повед!нка ферменту у присутност! гл!церину.

19

Впвчення лIпосом методом электронно! кнкроскопи та пор!в-нлныя результат1в з даними, як! отркмаш по змш! св1тлорозс!ю-ванкя, показало, що 1.2-1Щ приводить до зб1льшення розм!р1в Л1-посом.

Таким чином, вплив кр!опротектор1В на ЩСО.вбудовану в лйго-соми, не викликае необоротшх зм!н структура ферменту. Так як структура диференщальних спектрIв не зг.инюзться, висказано при-пущення. що пад!ння актлвност1 ферменту зумовлено взаемод1ею кр!опротектор!в з л1п1дним б Шаром.

Заради з>ясуванНя могливост! кр1озахисту ЦХО у л 1 пасома?. за дономогою кр1опротектор1в Оуло вивчено вплив заморожування.-в1-Д1гр1ву в присутност 2 гл!цер;шу та 1,2-ЦЦ на структурно-функцю-нальний стан ферменту.

Суспенз1ю л 1 носом заморожузали в середовицах> як; мостили 10, 20, 20 % кр1опротектор1в.

Заморохування лШоссм з збудованою ЦХО в прксутност1 ус¡х Зосл!даенпг концентрата гл{цер;яу не празводкло до змши спектру поглинання ферменту з облаетI Соре.

Поз1льне заморозунання ггоотеолшосом в середов1щ1 з глицерином у концентрац1ях 10 та 20 - приводить до пад1ння фермента-тизно! гктпЕНост!. Шсля вшиву зачорокування в прксутност 1 30 " гл!церину актиан1сть ЦХ0 зС5ер1г'алася (табл. 2). Р]зшстний спектр практично не був присутн1м.

АктиваIсть'вбудованого в лшосоми ферменту шеля замороку-ваЕня-в1д1гр1зу в присутностI 1,2-ПД ке змлнюеться при концентрат яг кр1опротектору 20 та 30 г (див. табл. 2).

Як було зауваяено вице, поз 1 льне заморожування ЩО у л ¡посохах приводить до угарення спектру поглинання ферменту в сблас-

20

Тгблтця 2

Еплив закорозування-в1д1гр1зу на актизн1сть ЩО та параметр:! протеол1посом в прясутност! гл1цер:шу та 1,2-ПД

Екстарпмэнт Контроль КтПопеютокТот»

10 20 : .30

Г л 1 ц 8 в л п

Актива1сть 10014- . 63±5 7018 10015

Р 1,9710,I: 2,05±0,1 2,1110,2 2,2410.1

т/с 1,5910,2 1,8710.1 1,7710,1 1,7510,2

1.2 - - п Л

Актившсть ЮОгЗ 9015 10014 10013

Р 2,01±0,1 1,9710,1 . 2,1010,2 2,0510,2

Т/с 1,9510,1 1,8310,2 1,ес±о,2. 1,85Ю,1

т! Соре. Акал1зуя пера! пох!да1 спектр1в йоглжання ЦХО п!слл заморокування з присутност; .ус¡7. досл1дхенпх концентрацШ гл1цо-ршу та 1.2-ПД моана дШти висновку. цо цей вшит на приводить до зм!ни структура спектру поглинання фзркепту.

Вивчення температурннх залезностеЗ ТПДС ЦКО, Ебудовано! у лШосоми гпсля вшшву за',юро:.<увашш-в 1 дIгрIву в прнсутност! гл1-церину показало, ¡до зла:.<и в областях 10-12 та 20 °С зрупувться. в область високих температур на 2-3 °С. Пологення теглпзратурних конформашйних переходов ЦХО в прпсутност1 ус1х викорпстапнх концентрацШ 1.2-ПД не з?^нюеться. При кокцентрац!ях хр(опроток-тор1з в середовпц! заморокування суспензП л1посом 30 г. та вгсцэ. тешературнпй перех1Д'при 20 °0 не спостор!гаеться.

... Ь'огша зробити висновок.' що при за-:оро"ува'ш1 ЦХО. вбудова-но! в л1посоми, присутнЮть I,2-ЦД та гл!цорину у ко!щентрац1ях 30 х дозволяв зберегти II конформац1йн! параметра. На повод1нц1 лИтосои, га? ц1ло5 структура, присутн!сть кр!опротектор1в в серэ-

21

г.оЕШДI за'.».оро2:увгння-в1Д1гр1ву практично не позкачилася (дев. табл. 2).

Теки:.! чином, отриман! в робот! дан! св!дчать про структуры! та функц!ональн! зм!ш вбудовано! в штучн! мембран*.! ЦХО при за-юрожуванн! у середовизах, як! м!стять р!знг сполуки, та дозво-ляють знайти зв'язок них зм!н з процесами, цо в!дбуваиться при т!м кв ЕШБ1в! у лшосомах, гадиф1 кованых ИХО.

В К С н О В К и

1. ВстаноЕлано, цо зачорокуванкя-в1д1гр1в суспензП протео-лшосом приззодить до зм!ни конформацп вбудовано! а них ИХО. цо супрозоджуеться у деяких вкладках знихенням ферментатизно 1 активност!. Характер конформащйних зм!н Ензначаеться евидк1стю охолодження ! сольовов речовиноа середозица.

2." Виявлено, цо заморозузання-в!д!гр1в яротеолшоесм' нвза-лекно в!д ивидкост! охолоджання призводкть до злиття др1бних Л1-посом у б'льа велик!.

3. Встанозлено. що !нкубащя протеолшосом, як1 ,\пстя?ъ в якост! бьткового компоненту;ЦХО при температур! 8 та 24 °С б розчинах каС1 1 кс! в кскцентрашях 0.8 - 1.2 М поизводить до необзротяього кон£ормац1Енаго переходу, який супроводкуеться па-

д!княы ферггэнтатиЕНо! активност! та поиводить до злиття та агре-

\

гацП лIпасок. \

4. Присутн1сть гл!цэрину !■ 1.2-ПЦ в суспензп протеолшосом не цр;:зводцть до нзоборатшх структурЕо-функцюнгльних змш у ЩО. При цьому виявляеться п!Д2ищэння розм1р1в лшосом за раху-ЕОК 1х ЗДКТТЯ.

5. Встанозлено, цо присутн!сть 1.2-ПЦ та глщерпну в кон-

22

, центраци 30 х в серэдоппщ! заморозуваиня протеол1посо?л дозволяв ." зберегти активн!сть ЦХО. яка вбудозава у штучн! ыэмОрзди.

СПИСОК 0П5БЛШ0ВЛШН ЗА TLJ03 '£:СЕРТЛЦП РОВГГ

1. Розанова Е.Д., Науменко'Е.И. Влияние замораззшашм-отог-рева на встроенную в липосог.щ цитохромоксидазу // Сб. научн. тр. "Влияние охлаждения на биологические объекты".- Харысов, 1990.-С. 22-24.

2. Науменко Е.И., Розанова Е.Д. Влияние хлоридов калия п натрия на встроенную в лшосокы цктохрокохсидазу //Сб. научн.тр. "Физико-химические процессы в криобиологических системах".- Харьков, 1991.- С. 105-110.

3. Розанова Е.Д., Науменко Е.И. Структурно-функциональные параметры цитохромоксидаэц в растЕоре и в составе липосом: влияние глицерина // Проблемы криобиологии.- 1992,- » I-- CL 32-35..

4. Наумекко Е.И., Розанова Е.Д. Структурно-функционазшннэ характеристики цитохромоксвдазы, встроенной ¡в дшгосо.та, -в растворах хлорида натрия // Укр. биохим. нурнал.-- 1994.- T. 66, к '3. - С. 44-49.

5. Розанова Е.Д., Науменко Е.И.Изучение встроенной в лшго-сокы цитохромоксвдазы методом дифференциальной спектрофотоматрин // Тез. докл. yi Всесоззн. конф. по спектроскопии биополимеров.-Харькоз,, IS83.- С. 259. . .

S. Розанова Е.Д., Науменко Е.И. Влияние концентрированных солевых растворов на протел:шосоьи // Тез. докл. уп Есесоюзн. конфер. по спектроскопии биополимеров.- Харысов, 1991.- С- 204.

7. Розанова Е.Д.,' Наумэнко Е.И. Структурно-фужциональгще изменения цитохромоксидазы при действии низких температур// Тез.

23

докл. II Мездунар. кокф."Успехи современной криобиологии".- Харьков, 1992.- С. 154-155.

8. Розанова Е.Д., Науменко Е.П., Морозоза Т.Ф. Температура! конформацгйн! переходи в цитохромоксидазi // Тези доп. х зЧ'зду 6io$i3H4Horo товаркства.- Ни! в, 1994.- С. 199-200.

Науменко Е.И. ВЛИЯНИЕ СОСТАВА РАСТВОРИТЕЛЯ К ЗАЫОРАЕйВАШЯ-ОТОГ-РЕВА КА СТРУКТУРНО-ФУНЩЮНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВСТРОЕННОЙ В ИСКУССТВЕННЫЕ МЕМБРАНЫ ЦИТОХРСМОКСЙДАЗЫ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - криобиология. Институт, проблем криобиологии и крискеднцины КДН Украины, Харьков, I93S-

Установлено веяние замораживания,- замораживания в присутствии хлоридов калия, натрия и криопротекторов на структурно-функциональные изменения цитохромоксздазы, встроенной в искусственные мембраны. Интенсивность изменений фермента определяется скоростью замораживания, составом растворителя и его концентрацией. Установлена взаимосвязь мээду изменениями функции п структуры цитохромоксздазы с изменениями з липосомах.' ?лодкфщирозан-Ни*х"".ЭГЕИ ферментом.

Ksili.T.OnkO Е-. I. \

EFFECT OP SOLVENT CONTENT AND VREEZE-THAHING ON STRUCTURE-FUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF CYTOCHROME OXIDASE BUILT IN ARTIFICIAL KEHBRAHES

Thesis ior obtalniris .scientific degree of Candidate of Bio-IxiS'.Ical Sciences ,on the 03.00.22. speciality - Cryoblolgy. In--Eiittuie ;fcr ¡Problems of CrjynMolosy a^d Cryocedicine of the Na-

24

ticr.al Асеоэпу of Scloncea of tha Ukraino. Khàrkov. Ukralno. 1Э55.

Hiîect o: froorini. freozing in tho ргз-'sncs of 1С or.d П.1 chlorlàiïs and cryoprotectcîntc on : ^ruc'ture-functicr.al chsncea in cytochroir.e o::ldar,o built in л-tificial nonbraiios vаз undfjrstudy. Intencity of опгуяе сЬ?.я;ез detcrninod by îroo^Sns rntc,

solvcnt contcnt ita concentrai10л. Th-э rolctionship bntucon

cytochro-.э osidaca fur. et ion sr.d structure and chcn in llpocn-г..ез. nodifiod by cytochrc.-.э о;:idnc2.

Нлвчов! слова: ш'.точрог.'.окс5?цаза, етру:стурз, 'ачгагн1сть, л1-посоми, кр'юпротохтори, сол1, за:.:оро::унагп!Я-з!Д1гр1з

Е1дпоЕ1дальний за випуск -. Грященко 5.1..

Ыдпое. до друку • üopviat .60 84 1/16. I.O. уы.-друк.аря.,игрок 100; ДЬльниш (Друкаспя).У.З¿V\CT ■

Адреса ; су A. C¿-£h<SAU¡k'í ,