Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние состава питательной среды и физико-химических условий культивирования на образование покоящихся спор гриба entomophthora thaxteriana — основы биопрепарата микоафидина

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние состава питательной среды и физико-химических условий культивирования на образование покоящихся спор гриба entomophthora thaxteriana — основы биопрепарата микоафидина"

& -3 М^^^^Г

всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

На правах рукописи Для служебного поль^^^я^ ^

Экз. №-

ГИНДИНА

Галина Матвеевна

удк 632.937.14

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ОБРАЗОВАНИЕ4ПОКОЯЩИХСЯ СПОР ГРИБА ЕЫТОМОРНТНОА ТНАХТЕШАМА — ОСНОВЫ БИОПРЕПАРАТА МИКОАФИДИНА

03.00.07 — микробиология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ленинград 1984

Работа выполнена в лаборатории энтомопатогенпых микроорганизмов н антагонистов возбудителей болезней Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В, А. ЦЫГАНОВ, кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник Э. Г. ВОРОНИНА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. А. ЕВЛАХОВА, кандидат биологических наук А. В. ХОТЯНОВИЧ

Ведущее учреждение—институт микробиологии к вырусологин АН УССР им, акад. Д. К- Заболот кого.

Зашита диссертации состоится * » 1984 г,

в час. мин. на заседании специализированного совета

К 020.26,01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 138620, г. Ленинград-Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1984 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологически* наук

А. Н. ЗАРЕЦКАЯ

Актуальность проблемы. В решениях Х2У1 съезда КОХ я »тайского (1982 года) пленума ЦК КПСС предусмотрено создавав новых эффективных средств запиты растений от вредителей, болезнав я сорняков, в том чясде подученных на основа продуктов микробного синтеза, а также разработка я внецрвняе технологии их прошшленмого производства. В последнее годы в роде стран мира (СССР, Франция, США» Чехословакия) интенсивно изучается возможность получения новые биопрепаратов на основе покоящихся спор энтомофторовых грибов (кл, 2увотуе«'&м > сем. Ео'ЬошорЬ'Ыюгасем ) ,. выэьташих в природе массовые заболевания многих видов тлей. Покоящееся споры 'грибов устойчивы к неблагоприятным внеиним условиям в длительное время-сохраняется в очагах эпизоотяй. Однако проблема массового получения покоящихся спор до сих пор остается нерешенной. Это связано как с недостатком теоретических знаний об условиях, способствующих спорообразовании граба на искусственных средах, так я с отсутствием приемлемой:дли промышленности технология культивирования с использованием дешевых и доступных компонентов питания. Недостаточно изучено влияние минеральных элементов а фазлко-химяче-ехпх условий культивирования на споруляцию, а также состава питательной среды на аяоектхцядиу» активность препарата.

Цель я задачи исследований. Целью исследований являлось изучение условий, индуцирущщх ссорообразовааяе и разработка экономически выгодной лабораторной технология получения покоящихся спор гриба ■ В.ШахЪаПааа ** основы биопрепарата микоафидяна, в связи с чем решались следующие конкретные задачи:

- изучение факторов, способствуешь спорообразовании гриба на искусственных питательных средах;

- изучение возможности использования экономически целесообразных источников питания для массового получения покоящихся спор;

- изыскание новых видов сырья для создания дешевых и высокопродуктивных питательных сред; " '

- изучение влияния физико-химических условий культивирования на спорогенез гриба;

- наработха опытных образцов биопрепарата на предлагаемых питательных средах и определение ях эффективности.

Научная новизна. Впервые изучены у еловая, сдо'собствушие спорообразованию гриба Е.шажйвЕЮйл--доказано влияние отдедьных к^миояентов рос|а

шпоне нтов ^^У^н^Шоцессы рос

им«нв кх тимирй**»*

ЦНЬ имен» Н И. Железном Фонд научный литературы

I дифференциации. Разработано несколько продуктивных питательных сред для массового получения покоящихся спор а определен оптимальный рекам кулыяварованая патогена. Показана возможность использования новых видов сырья (мацелля 1ор®г£111из п1к«г * гвдродяэа-тов дрввесдны), перспективных дм замены дефи ци тных 1 сточнаков гш-таная. Впервые- показав стимулиругаий эффект фильтрата культура льнов жидкосм гряба . в.11иШег1«щ* на спорообраэ оаана е я предложен способ кудьтявлрованяя патогена с его использованием.

Практическая ^енно^тьд .реализация, а 9с д ад рва ид йа Установленные закономерности развитая граба в гау банной культуре позволяют рагу даровать процесс получения покоящихся спор. Для массового культивирования патогена предложены дешевые я доступные питательные среда я режим выращаваняя, обеспечивающий высокая татр свор в препарате. Результаты проведенных исследований лэгла в осмолу лабораторного регламента производства биопрепарата макоафадана. Регламент передан во ВНИИбакпрепарат для разработки опытно-прсмышденяой технолога!, производства препарата.

Апробация работыт Основные положения диссертационной работы была представлены на конференция .■ учвннх-баслогов, посвященной биолога ческам аспектам.рационального использования животного в растительного мира <Рига, 1981), на научное конференции ВИЗР (Леааа- ^ град. 1981), ва первой республиканской научной конференции по па-тологан членистоногих и биологическим средствам борьбы с вредными организмами (Канва, 1962), на совещании по вопросам производства и применения грибных энтомопатогеяных препаратов (Неринга, 1983).

Итблддапии. По теме диссертация опубликовано 10 работ, подучены 3 авторских свидетельства (Л* 802362, 854348, 957564).

Структура и объем диссертация. Диссертация наложена на. 112 страницах машаяопясного текста, иллюстрирована 32 рисунками н 24 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, посвященных экспериментальной работа, заключения, выводов, списка литературы. Библиография содержит 179 названий, в том числе 88 иностранных авторов.

Содержание диосертапян. Во введения показана актуальность темы > диссертация я сформулированы основные задачи исследований.

3.

Обзор даyeрастры состоят аа трех разделов, в которых рассматриваются вопроси кудьтдварованая энтоыофторовых грабов ва искусственных питательных средах а вдяяявя отдельных компонентов дятааая ва процессы роста а дифференциации мжкрооргаяяэмов. Особое внимание уделено авали эу сырья, перспективного для массового получения покоящихся спор эатомофторовых грабов.

Материалы а методы доследований. Работа проводилась с отсе-лекцаонвроваяным ос вирулентности мовосооровым изолятом граба B.thaxterlsuaa. . Культаварованае осуществлялось в колбах ва качалке при температуре 27-284;, рН 6,5-7,0 в течение 7 с J ток.

Влияние компонентов латаная на спорообра з ова ви е гриба азу-чала на среде Сабуро, азменяя соотношение азота, углерода а фосфора. £ качестве основных сырьевых источников использовали сое-ejd муку, кукурузный экстракт, ферментативный гадролазат ЕВК, ма-целий .¿sp.nig«r , гвдрол, крахмал, кукурузную мук;. Ферментативный идродиз белкового сырья осуществила протосубтаданом ГЗХ -I при дозе 10 ед./мд 10% суспензии субстрата, температуре 45-47^3 * и рН - 8,0-8,2 в течение 18-24 часов. Кислотный гидролиз кицелая Asp.niger проводили слабыми растворами (I-3S) миавральных кислот (серной я соляной) при температуре 100-132^ в течение 0,5-8,0 часов. Подученные гидролизаты фильтровали я нейтрализовали 40% ыаОН.

При аэученаи потребноста граба в дополнительном минеральном питании в соевую среду вносили К4", jja са ug в виде хлорвдов а сульфатов в количестве I, 2,г4, 8, 12 мг-аон/л, а также ?» 2+, Ре Мп 2+» Си М, 2а Со , Mo + В Виде F*SO„ • 7^0, PeClj t UnSO^ • CuSO* > ZnSO^ . CoCl^ • 6B20, (Ш1^)2ко04 в количестве 0,001, 0,01, 0,1 мг?.

Изучена а влияния фиэако-химическах условий культивирования проводила на соевой среде при температуре от 23 до 35°С, рН среды от 4,0 до 9,0. Аэрация регулировалась измаявшем соотношения объема среды к объему колбы (от 1:4 до 1:40).

При повторном использовании фильтрата культуральной жидкости его предварительно стерилизовала при 0,8 ат*20 минут. В опытах применяла фильтрат от 3-х, 5-та, 7-ча суточных культур, неразведанный ада разбавленный в 2. 4, 10 раз.

В питательных средах и культура льяой жидкости в процессе роста граба определяла:

- рН - потенциометраческа

- скорость растворекая кислорода - сульфитным методом ( Cooper et al , 1944)

- ашяный азот - методом с аяагидрином (Фаворская, Кононова, 1962),

- углеводы - методой Бертрана (Цлещтов, 1976),

- неорганический фосфор - методом Ееренблша а Чвйла (Олешков, 1976),

- общую кислотность - алкалометрически (Плещков, 1976),

- татр спор - методом прямого подсчета в камере Горяева,

- масс; сухого маце лея.

Качество образцов препарата оценивали во прорастание покоящихся спор аа X% водном агаре к но эффективности в отношена« гороховой тля Acyrthoeiphon pleue Harris при обработке 2$ суспензией в объеме 1.5-2.0 мл на 100 тлей. Тлей опрыскивала на ростках гороха высотой 3-5 си, выращенных гидропонно. Учет гябалл проводили на I л 3 сутки после обработка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I. Индуцирование спорообразования граба tha*theriane различными факторами питания

Выявление условий, способствующих переходу культура от вегетативной фазы развабяя в репродуктивную позволит цеденаправлено проводить процесс массового получения покоящихся спор.

Выращивание гриба в условиях избытка в недостатка азотных я углеродных компонентов лягавая, проведенное на наиболее известной для культивирования энтоыофторовых грибов среде с пептоном (среда Сабуро), показало, что урожай биомассы равномерно повышался при увеличении содержания аминного азота в среде. Исходная концентрация углеводов а фосфора несущественно влияли на скорость роста и накопление биомассы. Переход к сташонярнои фаза роста, сопровождающейся началом формирования спор, наступал при потреблении грибом аминного азота до уровня 20-30 мг£* Массовое образование спор отмечалось независимо от азотсодержащего источника при снижении аминного азота а среде до 10-15 мгХ. Наиболее высокий титр спор - (8,8+3,0)*105 спор/мл на среде с пептоном был достигнут на 7 сутки при начальной концентрации аминного азота 40 мг£. Использование более богатой среды затягивало развитие культуры, так как в этом случае для утилизации азотного питания и, следовательно, для создания обязательных для споруляшя условий требовалось более длительное время (рас.1).

2. + 6 Т.сум

Рис.1. Культявярованве граба Б. на средах

с пептоном (I) я дрожжевым экстрактом (0) пря раэлачяои начальном содержания амииного азота: А - 20 Б - 40 ит%, В - 60 мт%, Г - 80 кг%, Д - 100 мй6.

Условные обозначения: I - титр спор, 2-бломасса, 3 - амянный азот, 4 - углеводы.

Период, необходимый для завершения цикла развитая граба х обильной соорудяции, зависят не только от начальноа концентрация амииного азота, во в от качественных особенностей источника, определяющих скорость утилизация его культурой. На средах с лег-козсвояеыим источником азота (дрожжевой экстракт) его концентрации быстрей достигала критического уровня, оОесаечаваещего спорообразование, но колячество образующихся спор не заввсело от скорости потребления субстрата.

Таим образе«, изменяя качветввааый состав а начальное содержание азотного плтакая в среде, можно регулировать как выход сохоящахся опор, так в продолжательность процесса выращава-ная.

Изучена а развитая граба на среде Сабуро с различным начальным содержа на ем глюкозы (от 2 до 10%) показало, что наа большее количество спор формируется upa 2-6Í концентрация углеводов. 06-разовавае спор происходило как пра недостатка {2%), так в ври значительном избытке .(8-I0Í) в среде Сахаров, срачем дезавасамо от начального содержания в процессе развятая потреблялось не более 2-3¡E глюкозы. В связи с этим, несмотря на определенную зависимость татра спор от исходной концентрации гмжози, углеводное патанае не является фактором, регударувщам рост а даффе-реяцаацаю граба. Это подтвердилось в в острых опытах, когда расту щуп культуру'переносила на споруляцаоннув среду с ограниченным содержанаем азот- в углеродсодержашах источников.

Пра добавление неоргандче ск ого фосфора к среде Сабуро спо-рообразованае резко подавлялось независимо от того, в веде ка-ко! соля он ввода лея. Уввдаченае концентрации фосфора с 0,2 до I шт% приводило к сяаженяс татра покоя шахся спор в 7-10 раз, пра введении 5 mtJ£ а культуре образовывалась лишь полупустые гяфендые тела, споры на отмечалась.

Таким образом, подученные результаты показывает, что голодание культуры по азоту - кеобходамое условие, индуцирующее спорогенез. Изменение начального содержандя углеводов не влияет на скорость развитая гриба, но повышает конечный татр спор. Избыток фосфорного., патаная ингибарует спорообразование культуры.

2. Массовое спорообразование граба s.thaxteriasai на сырье, применяемом в мвкробаологической промышленности

До настоящего временя культивированае гриба E.thext-eri&na проводилось в лабораторных условиях с нспользованаем дорогих и дефицитных компонентов питания. Создание технологии массового получения покоящихся спор требует разработка новых дешевых пата тельных сред, применение которых экономически целесообразно.

Азотсодержащие источника насевая

В отечественной микробиологической промышленности в качестве источников органического азота широко используют соевую муку, кукурузный экстракт а гадролазаты НВК,

Азотистые вещества соевой мука представлены, в основном, белками. Выращивание гриба на средах с возрастающей концентрацией соевой мука Сот I до Ь%) з 4% глюкозы показало, что менее доя-центрированные среды способствовали накоплении большего количества спор. Массовое спорообразование отмечалось лиль на средах с I и 2í соевой муки, наибольшее количество спор (6,5+1,0}>105 спор/мл формировалось к 5-7 суткам при 1% концентрация соевоей муки.

Учитывая, что соевая среда содержит твердую фазу эксперименты со изучению динамики роста гриба была проведены на 1% экстракта соевой щю> с глюкозой. Установлено, что дродомагель-ность лаг-фазы составляла 6 часов, затем культура начинала активно расти с максимальной скоростью 0,5 мг/мл.час, образуя тонкий неразветвленный мидалдй с мелкозернистой дроголлазмой. Через 18 часов скорость роста снижалась и начинался интенсивный распад мицелия на более короткие гафенныв тела, а с 24 часов формировались первые предспоры. Массовое спорообразование началось с 48 часов досле замедления скорости роста.

Таким образом, соевая мука может быть использована для массового получения покоящихся спор, ее концентрация в среде не должна превышать 1%.

¿елково-витаминный концентрат (ШК) представляет собой сухую бисмассу дрожжей рода Candila. . Ори предварительном выращивании гриба ка средах с цельными дрожжами формирование покоящихся спор практически не отмечалось. Культивирование на ферментативном га яро/шаге ЯВК с глюкозой (4Í) показало, что экспоненциальная фаза роста культуры заканчивалась на средах с начальным содержанием аминного азота 20-40 Mrí на 3-4 сутки, на более концентрированных - на 5-5 сутки. Стационарная фаза роста наступала ври снижении уровня аминного азота в культуральной жидкости до 15-^0 мг£, тогда же начинался а процесс спорообразования. Максимальное количество спор - í.ó,4+2,&)-10^ спор/мл образовывалось на среде с начальным содержанием амияного азота 40 mtí, в этой концентрация ферментативный гадролязат ЬйК может использоваться для получения покоящихся спор.

КуктрузкыЙ акетоаку содержат 40-50Í азотастых веществ. Atu-яоквелоты кукурузного экстракта интеасавяо потреблялась растущей культу pol. £ 3-4 суткам роста концентра цая аманвого азота нваавасдыо от его.асхвдной величины (20-ХСЮ urí) ва превышала уровень 10-15 mtÍ. Однако, не смотри на почтж поляуо уталаэацав амяяокяслот кукуруавого экстракта нормальный шел развитая отме-. чался ллсь opa начальном содержания амниного азота - 20 mtí. На этой среда в конца экс оон а вша лько S фазы роста начаналось форма-рованае покоящахся спор, максямальвый татр - (3,9+0,8)-10^ спор/мл. отмечался ва 5-7 сути poeta. Увеляченяе концеатрацаа кукурузного экстракта opa в ода до к евдженаю татра спор до (0,1-1,3) *Ю® спор/мл, прячем, начиная с 4-5 суток роста отмечался лязяс гяфенных тэл. По-»ядя*с«у, это свезено с высокам содержа-наем фосфора в кукурузном экстракте, янгябяруадее вляявяе которого ва спорообразованяе бы» показано не сред« с пептоном. Плохой рост в яязкяй татр спор огранячввают возможность прамеяевая кукурузного экстракта для культаварованля патогена.

Углеводсодержащее ясточяякя патаяяя

По лятературяым данным С Late* * 1975) хорошее спорообразование эятсмофторовых грабов отмечается в присутствен таках углеводов, как глвкоза, мальтоза, а для некоторых вядов - крахмал ( Gustalason t 1965). Это поз вола л о вам огра начать круг поаска промышленного сырья, сосредоточив свое вяямаяде ва язучевяя глю-возо- я крахмалосодержаищх компонентов - гдшозе, гадроде, кукурузной муке, картофельном а кукурузном крахмале.

Глюкоза.

Вырапшваяае граба E.thaiteri&na не средах с соевой мукой (1$) в фермеятатяввш гадролязатом ЕВК оря возраставшей концаат-рацаа гшжозы (от 2 до 10%) показало, что ее начальное сслерха-ва* существенно влияло на колячество образующихся спор. Макса-мальвый твтр - (1,0+0,7)*Ю6 я (1,3+0,9)спор/мл достягался ва соевой среде пря'4-éí, а ва среде с фермента таввьм гадролазатом ЕВК пря 6-8Í ковиентрадин сахара - (0,7+0,1).10е я (0,9+0,1) •10® соответственно.

Динамика потребления глхжозн ва завасада как от взиевевяя его начальной концентрации, так а от ясточняка азота. Растущая культура использована ляшь часть внесенного сахара (2,5-3,0$), а значительный избыток его (I-7Í) не репрессировал сдорогеяез.

Таим образе«, для получеяяя максимального выхода покоящихся спор не соевой я дрожжевой средах необходимо наличие в вах да менее 4-6$ гдгаози. Однако, применение ее для массового нахоц-леняя спор аконошчески невыгодно, что вызывает необходимое» юпольаомкая более дешевых источников углерода*

^ндрои - отход крахмально-ваточного производства содержат около 50? глюкозы (Бринберг, Андреева, 1970), Изменение концентрации гядрола оря культивировании гриба на соевой я дрожжевое средах оказывало существенное влияние на споруляцип. Титр спор равномерно воввдался иря увеличении содержания гядрола до 6-10$ (по РВ), достигая уровня (1,3-1,4)-10 спор/мл, что указывает ва возможность замены глюкозы гндролом без снижения выхода покоящихся свор (рис.2).

/г

&

§

8

л

г ч 6

г * «

Г

2 4 6

2*6

г ча г*б

г « б

и

* 6 2*6 2 4 6 2*6

Ряс.2. Спорообразование гриба на соевой

среде с глюкозой (I) я гидролом <Ш при различной начальной концентрации углеводов; А - 2$, Б - 4?, В - Г - 65£, Д - 10$, Б - 12$.

Стоимость питательной среды сокращается при этом почти в 30 раз, оптимальное содержание гидрола в среде - 6-10$.

хо

На средах с крахмалом л кукурузной мукой спорообразование гриба было незначительным, титр спор не превышал величины (1-3)*Ю5 спор/мл, что в 5-10 раз ниже, чем при использования глюкозы.

Минеральное питание

При культивировании на сложных питательных средах значительную часть минеральных компонентов микроорганизмы получают из природных субстратов, однако в ряде случаев отдельные элементы необходимо вводить в вице солеи. Изучалась возможность повышения выхода спорового материала за счет дополнительного обогащения среды минеральными веществами. Установлено, что добавление отдельных макро- и микроэлементов, а также их смесей нэ влияло на образование спор, за исключением варианта с внесением 2 мглой/ л калия в виде сульфата, где титр спор был почти в 2 раза выше, чем в контроле. Однако, при замене в соевой среде глюкозы гндролом стимуляция спорообразования сульфатом кадия не отмечалась. Таким образом, основные элементы минерального питания, необходимые для развития гриба, содержатся в соевой среде, что исключает необходимость их дополнительного введения.

Физико-химические условия культивирования

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на спорообразование микроорганизмов, относятся температура, аэрация и кислотность среды, оптимальные значения которых меняются в зависимости, от состава питательной среды.

Установлено, что при культивировании на соевой среде температура выше 30 °С снижает титр образующихся покоящихся спор. Наиболее благоприятной является температура в пределах 23-2Н°С.

мля обильного спорообразовался необходимо интенсивное сняЗ-культуры кислородом (сульфадноа число О,¿8-0,44 .

низкой аэрации гриб не епорулйрэвал даже а условия*, азотного голодания, а к 5-7 суткам отмечался лизис гафенных тел.

с ложность среды ьуеег большое значение для нормального здкла разлития культуры. Граб кокет самостоятельно изменять кислотность среды б Злагопрянтную для poci.ii к спорообразования сторону. Независимо от начального рН к началу стаиаонзрной Таз» каслотность культурэлькой жидкости находится в пределах о,0-7,0. Однако, чем зо.чьде огллчается ксходноа от оптимального для соорудят тем медленнее р^эваеается кул^лура, так кик

больше времена требуется для ауторэгудявда кислотности среды.

Изучение влияния фнзако-хнмвческвх условий на спорообразование гриба позволяло разработать оптимальный режаы культивирования патогена, направленный на массовое получение покоящихся спор: температура выращивания 23-28°С, рй среди - 6,0-7,0, ян-тенсивность аэрации не менее 0,23 мадля-моль 02/л-мин.

Влияние состава питательной среды на

эффективность препарата

Состав питательной среды влияет не только на интенсивность спорообразования, но я на инсвктииаднув активность и прорастание покоящихся спор (Велацкая, 1968; кплоуа , 1979). Образцы препарата, полученные на соевой и дрожжевой средах, прорастали на 40-50$, что соответствовало уровне контрольных образцов, полученных на наяном су еле, я превышало степень.прораставая спор со среды с пептоном в 4-5 раз..Замена глюкозы гадролом не снижала степени прорастания (табл.1).

Табллда I,

Прорастание покоящихся спор я инсектицидная активность препарата с разных питательных сред

Состав среды Прорастание спор, Ъ Гибель тлей, %

I 2 3

Соевая мука (IX) с глюкозой (6$) 45,7+3,0 64,7+10,1

Соевая муха (Ш с гадролом (&% по РВ> 40,1+6,1 63,5+17,8

Ферментативный гидролазат БВК _ С Na*) - 40 MTÍJ с глюкозой (6$) 53,7+0,8 68,9+6,8

Пивное сусло 51,2+9,1 46,3+8,3

Пептон (1$) о глюкозой (6$) 11,2+8,7 24,9+5,8

Известно, что физиологическая зрелость покоящихся спор не всегда соответствует морфологическок. Морфологически зрелые споры образовывались в оптимальных условиях уже на 4-5 сутки, однако прорастание их было незначительным - 6,7$. Пра увеличения

временя кулыиварованая до 7-9 су гон степень ах прорастания рав-ншеряо повышалась до 30-62?, что связано, по-вадямоыу, с их физиологическим доэреваяаем.

Состав среды влиял в на лноектицидяуо активность препарата. На 1 большая га бель тлей (60-80ЭЕ) отмечалась при обработке их образцами, выращенными на соевой и дрожжевой средах с глюкозой н гидролом, наименьшая (до 25%) ив среде с пептоном (табд.Х).

Таким обраа см, споры, выращенные на соевой и дроххевой средах, предлагаемых для массового получения препарата, отличаются высоким уровне» прорастания л хорошей инсектицидной активность».

3. Использование некоторых отходов промышленности ДЛЯ культивирования Гриба E.tbaxteriana.

В микробиологической промышленности остро ощущается дефицит многих постоянных компонентов питательных сред* В связи с этим изучалась возможность получения покоящихся спор гриба на средах, содержащих иицедиальные отхода Aspergillus niger , гддролиза-та древесина н фильтрат культуральнои жидкости, оставшейся после предыдущего цикла выращивания.

МацелаЙ Asp. niger - аеиспользуемый отход производства лимонной-кислоты. Водные экстракты мицедвя (15-2055 суспенэва сухого порошка) содержала мало свободных аминокислот ( Ham. - II--12 мIii), однако на такой среде ухе яа 2-3 сутхя отмечалось массовое спорообразование, а к 5 суткам титр спор достигал величины (5,8+1,9).Ю5 спор/мл* Использование более концентрированных экстрактов (300 г/л) приводило к резкому снижение титра спор до (0,6+0,2)*105 спор/мл, а при навеске 400 г/л споры не образовывалась. Анализ водных экстрактов показал, что онд содержат большое количество лимонной кислоты (до 3-4?), а экспериментально было установлено, что при концентрации лимонной кислоты титр спор снижался в 5-6 раз. В связд с этвм при приготовлении экстрактов следует использовать 15-20? суспензии порошка мицелия Asp.niger

Для получонал сред с более высоким содержанаем аминного азота были опробованы разные способы а режимы гидролиза мапелвя. При кислотном гидролизе 1% серной кислотой в течение I часа уровень аминного азота достигал 64,5+15,4 мг£, однако, гриб рос яа таком гидролизате очень плохо, споры почти не образовывались,

несмотря на янтенеявное потребление аманвого азота я создавав условий, благоприятных для спорообразовааия. Экспериментально было показано, что высокие концентрации сульфатов я хлоридов (.1-2%), образующихся после нейтрализация гядролязатов, торговали рост я снихаля титр спор в 2-7 раз. Вследствие этого кислотный гидролиз, хот* а позволяет эффективно разрушать оболочку ¿зр.шеог . , не может быт» применен вря приготовлении питательной среды.

При ферментативном гядролязе мицелия протосубтялином (10 ед/мл дхн 20$ сусаензяя поровжа) максямальный выход аминокислот не превышал 39,0+5,5 мг$, что, учитывая сложность обработка, материальные затрат» я продолжительность процесса, делает процесс ферментоляза экономически невыгодным.

Таким обраэсм, изучение разных способов обработки порошка ¿вр.Щ£*г показало, что наиболее рационально готовять пята-тельные среды ва основе водвых экстрактов ми да лая. Образец препарата, полученный ва такой среде, обладал высокой явсектяоад-ной активностью - 75,2+6,9$ пря смертности в контроле 4,7+3,0$.

Культивирование гриба ва средах, содержа-

щих в качестве углеводного питания гидролязата древесины, показало принципиальную возможность использования ах для получения покоящихся спор. Однако наличие в них различных ингибиторов спорообразования (солей уксусной я серной кислот, ксилозы а т.д.), влияние которых било доказано при постаяовк* модельных опытов, требует разработка специальных методов очистки л нейтрализация . гядроляэатов в соответствия с фязяологяческяна особенностями эн-томофторовых грибов*

Циклическое ведение процесса культа варованвя, включающее в себя утяяазацво фильтрата жультуральдож жадкоста, позволяет значительно сократить затраты на производство препарата. Предыдущими исследованиями было показано, что оптимальная для споруля-цяя концентрация глюкозы в питательной среде - 4-6$; В то же время в процесс« роста граб потребляет не более 2-3$ углеводов я в кудьтурадьиоа жидкости остается еще много неуталиэяроваиного сахара (около 2-3$). Представляло аятерее изучить возможность повторного использования ультра та вря одновременное сокращении расхода глюкозы. Установлено, что ва среде с соевой мукой граб может растя а споруляровать, потребляя только остаточный сахар фильтрата, причем титр спор в »том случае в 1,5 раза выше, чем при использовании глюкозы в той же концеяграция.

При внесения в фильтрат (остаточный сахар - около 3£)1-3£ глюкозы титр повышается до (0,Э-1,1)*Ю® спор/мд, выращивание граба на среде без фильтрата с той же суммарной концентрацией сахара при в они до к более низкой споруляции - (0,5-0,7)-Ю^саор/мл.

Эффективность фильтрата зависела от возраста культуры; наибольшую стимуляцию спорообразования (в 1,5-2,0 раза по сравнению с контролем) оказывала 5-7-ми суточная культуральная жидкость.

Стимулирующей эффект проявлялся также и при разбавлении фильтрата в 2,Ь и £0 раз при соответствующем увеличении вносимой глюкозы до суммарной концентрации 6%. Хранение стерильного фильтрата в течение 3-х месяцев не ухудшало его качества.

Инсектицидная активность препарата, полученного на среде с фильтратом - 61,0+6контрольный образец с соевой среды показал эффективность - 60,6+6,5?. Таким образом, использование фильтрата культуральной жидкости повышает титр спор в 1,5-2,0 раза при сокращении расхода сахара в 2 раза и без снижения инсектицидной активности.

ВЫВОДЫ

1. Урожай биомассы гриба к.ш.теПала равномерно повышается при увеличении исходной концентрации аминного азота, потребление которого до остаточного уровня 20-30 мг5Е вызывает переход к стационарной фазе роста, ¿даяние концентрации углеводов на рост культуры незначительно, независимо от начального содержания (4-10£) за весь цикл развития гриб использует на более 2,5-3,056 глюкозы.

2. Установлены закономерности развития культуры в зависимости от концентрации азотсодержащих веществ, что позволяет направленно проводить процесс массового получения покоящихся спор, образующихся при снижении уровня аминного азота в среде до 10-15 мгХ для любого азотсодержащего источника.

3. Увеличение начального содержания углеводов в среде до А-о% не влияет на скорость развития культуры, но повышает конечный титр покоящихся спор, образование которых отмечается как при полной утилизации Сахаров, так и при их высокой остаточной концентрации (до 7%).

4. Разработаны питательные среды для массового культивирования патогена, содержащие дешевые и доступные источники азота и углерода - соевую муку, гидролнзаты БеК, гидрол. питательные среды, предназначенные дям получения вокоящихся спор гриба

в.*Ьах1;»г1ааа должны содержась 30-40 ыг% аминяого азота я 4-б£ углеводов.

5. Проведенные доследования показали, что при кулъгяаирова-кди граба на питательных средах, содержащих природные белковые соединения, нет необходимости вносить дополнительное минеральное питание. Не органически! фосфор в зависимости от состава среды в большей или меньшей степени ингибярует процесс спорообразования, на влияя, однако существенно на скорость потребления азотного и углеводного питания.

6. Установлен оптимальный режим.культивирования гриба: температура - 2о-28°С, кислотность среды — 6,0+7,0, аэрация не вяжа 0,28 ымоль 02/л*мин.

7. Характер изменения рЫ в процессе развития культуры зависят от начальной кислотности я состава питательной среды. Впервые установлена способность патогена к саморегуляции активной кислотности при выращивании его на соевой среде. Спорудяция отмечается после стабилизации рН в пределах 6,0-7,0.

6. Показана принципиальная возможность получения покоящихся спор на некоторых отходах промышленности, прежде всего на экстракте мицелия лар.п1свг - отхода производства лимонной ялслоты. При выращивания гриба Д.^ахЬвгАвла на экстракта из мяцедяя Asp.ni.Eex- массовое спорообразование отмечается на 2-3 сутки, прячем титр спор в культуре существенно не отличается от полученного на соевой и дрожжевой средах*

8. Выявлена возможность повторного использования фильтрата культуральной жидкости для получения .спор гриба Е,гь»«вг1ава . Кудьтурааьная жидкость обладает свойством стимулировать спорообразование, что выражается как в сокращении длительности цикла, так я в более высок см титре спор. Расход углеводов при этомм окно сократить почти в 2 раза за счет неутипизированных Сахаров предыдущего цикла выращивания.

йРАКТИЧГСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

I. На основе проведенных исследований подготовлен лабораторный регламент получения биопрепарата микоафидина для борьбы с гороховой тлей, который был одобрен комиссией по микробиологическим средствам зашиты растений от 31 карта 1983 г. и передан

во ВНМ бакпрепарат для разработки опытно-промышленной технологяи.

2* Для массового получения покоящихся спор предлагается дс-пользовать в качества азотного питания соевуо муку, ферментативный гидролиза* БЕК, гидролизаты мицелия А8р.п1бвг , а в качества углеродного питания - гидрол (авт.свяд»802362, авт.свзд. 957564, ДСП).

3. Дла снижения затрат на питательную среду и утилизацию отходов рекомендуется повторное использование аераэведенного или разведенного в 2 раза фильтрата культуральной жидкости с соответствующим снижением содержания глюкозы в 1,5-2,0 раза (подана заявка на изобретение, получено доложительное решение от 27 июля 1583 Г., ДСП).

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУНШКОВАНЫ СЛДОЩИБ РАБОТЫ

1. Гиндина Г.М. ¡фльти верование гриба Intomophtrhora tbaxtoriana на средах с различными концентрациями азотного

питания. Сборник трудов ВИЗР. Перспективы использования микроорганизмов в защите растений. Д., 1980, с.75-81.

2. Воронина Э.Г., Гиндина Г.М., Цыганов В.А. Спорообразование гриба Entodopbtïiora tbaxterianà в зависимости от источников азотного питания* Микология и фитопатология, 1981, т.15, вып.2, с.92-96.

3. Воронина Э.Г., Гиндина Г.Ы., Цыганов В.А., Наместнико-ва В.П. Использование гидролизатов мицелия продуцента лимонной КИСЛОТЫ ДЛЯ культивирования гриба JSnto^ophthora tlXiiXte^Iaua Микология и фитопатология, 1У81, т.15, вып.З, с.209-214.

4. Гиндина Г.М. Массовое спорообразование гриба ¿ntoso-phthor^ thaxteriaaa на различных питательных средах. В сборнике: биологические аспекты изучения и рационального использования животного и растительного кара. Рига, 1981, с.329-331.

5. Воронина Э.Г., Гиндина Г.М. Питательная среда для получения покоящихся спор гриба EilUoiophthor;. th^tartuna в глубинной культуре (авт.свид.Л 8023Ô2, 195I, бол.И 5).

6. Воронина Э.Г., Гиндина Г.М,, Чумакова А .Я. Влажная камера для выделения знтомофторовых грибов (авт.свяд.й 654348, 1981, бюлл.» 30).

7. Воронина Э.Г., Гиядина Г.М. Влияние углеводного питания на рост и споро образована а гриба aatwsopfctbora ъь^^еп^а. Микология и фитопатология, 1982, т.16, выц.Ь, с.403-407.

8. Воронина Э.Г., Гиндина Г.М., Чумакова А.Я. Устройство для выделения энтдаофторовых грибов (класс Zjgcmt7c«t«s , семейство Entomophthoraceae ) В ЧВСТУБ Культуру. МИКОЛОГИЯ И фИТО-датологня, 1982, т.16, вып.6, с.542-543.

9. Гиндина Г.М. Индуцирование спорообразования гриба Ento-mophthora thasteriana основными компонентами латания. Тезисы

докладов Первой республиканской научней конференция, Канев, 1982, с.47-48.

10. ¿юронина Э.Г., Гиндина Г.М. Питательная среда дла получения покоящихся спор гриба .Entomopbthora tbaxteriaaa. * Авт. свяд.» 957564,(1982, ¿СП.

Подписано к печати 1.03.84. Заказ в-Д, Тираж 100, формат бумаги 60x34 1/16, I печ.л. Бесплатно. Ротапринт тип.» 2 "Ленуприэдата". 191104, Ленинград, Литейный пр., дом № 55.