Влияние серотонина на свойства возбудителя чумы, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток

Клюева, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние серотонина на свойства возбудителя чумы, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние серотонина на свойства возбудителя чумы, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток"

На правах рукописи

КЛЮЕВА Светлана Николаевна

ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА НА СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ АПОПТОЗ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

03.00.07 - микробиология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук I ,у ¿^л)

Саратов - 2008

003465593

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Щуковская Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация: ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

, ¿'С

Защита состоится »Л^уЩсЛ2009 г. в /3 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.078.01 при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Автореферат разослан « ъи&Ы^гыс^2009 г.

Ученый секретарь диссертационног доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Существование на территории России и многих стран мира природных очагов чумы, а также угроза применения возбудителя чумы в качестве агента биотерроризма диктуют необходимость углубленных исследований иммунопатогенеза чумной инфекции с целью создания современных, надежных средств и методов её диагностики, лечения и профилактики [Онищенко Г.Г. и др., 2004, 2006; Clarke R.A., 1999, Richard J.L., Grimes D.E., 2008].

В последние годы интенсифицировались исследования по изучению триггерных молекулярных механизмов взаимодействия патогена с организмом хозяина, в том числе возможности использования микроорганизмами эндогенных биологически активных веществ макроорганизма для ускорения собственного развития на начальных этапах инфекционного процесса. Формируется новое междисциплинарное направление - микробная эндокринология, изучающее фундаментальные и прикладные аспекты нейроэндокринной регуляции взаимодействия про- и эукариот [Олескин A.B. и др., 2000; Стадников A.A. и др., 2002; Lyte M., 2004; Voigt W. et al., 2006].

Получены свидетельства наличия на клеточной поверхности прокариот рецепторных структур, связывающих биогенные амины - нейрогормоны [Freestone P.P. et al., 2007]. Выявлен стимулирующий эффект стрессорных гормонов на рост патогенных штаммов Escherichia coli и синтез адгезина К99, шига-подобных токсинов I и II, показана зависимость транскрипции генов, кодирующих секрецию III типа и синтез флагелл у энтерогеморрагических и энтеротоксигенных Е. coli от адреналина и норадреналина [Lyte M. et al.,1997; O'Donnell P.M. et al., 2006]. Катехоламины, в частности норадреналин, способны влиять на процесс захвата Е. coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis ионов железа из трансферрина и лактоферрина [Freestone P.P.et al., 2002, 2003; Anderson M.T., Armstrong S.A., 2006; O'Donnell P.M. et al., 2006], на интенсивность процесса образования биопленок бактериями [Lyte M. et al., 2003]. Обнаружено существование перекрестной связи между luxS/Al-2 бактериальной QS (кворум сенсинг) и адренергической (адреналин/норадреналин) системой организма хозяина [Sperandio V. et al., 2003; Clarke M.B et al., 2006].

В этой связи, большой интерес представляет серотонин (5-окситриптамин), который принадлежит к группе биогенных аминов: азотистых оснований, возникающих в организме при декарбоксилировании аминокислот и обладающих чрезвычайно сильной активностью, благодаря высокой способности их к конформационным изменениям, к соединению с макромолекулами, к переносу электронов и протонов [Белжеларская С.Н., Саттон Ф., 2003].

Биогенный амин серотонин является нейромедиатором, медиатором воспаления и аллергических реакций, обладает выраженным

иммуномодулирующим действием, является одним из компонентов сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, способен комплексировать с Д1Ж про- и эукариот, с нуклеозидами и нуклеотидами, ингибировать процессы перекисного окисления липидов в клеточных мембранах, непосредственно взаимодействуя с перекисными радикалами [Ноздрачев А.Д., Пушкарев Ю.П., 1980; Бурлакова Е.Б. и др., 1992; Щуковская Т.Н. и др., 1999,2008; Helene С. et al., 1971].

Известно, что серотонин ускоряет рост культур Е. coli, Rhodospiriilum rubrum, Streptococcus faecalis, Candida guilliermondii, вызывая сокращение лаг-фазы, стимулирует формирование биопленки у Е. coli и плодовых тел у миксобактерий [Страховская М.Г., Иванова Э.В., Фрайкин ГЛ., 1993; Олескин A.B. и др., 1998].

На данный момент отсутствуют сведения о потенциальном влиянии серотонина, высвобождаемого тромбоцитами и клетками нейроэндокринного микроокружения в месте проникновения чумного микроба в организм хозяина, на размножение клеток У. pestis, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), культурально-морфологические характеристики чумного микроба, профиль синтезируемых им белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена). Отсутствует также какая-либо информация о возможности применения серотонина в схеме лабораторной диагностики чумы для повышения эффективности выделения возбудителя чумы из исследуемого материала, как контаминированного, так и не контаминированного сопутствующей микрофлорой.

Цель исследования - изучить влияние серотонина на рост, электрофоретический профиль белков, экспрессию поверхностных антигенов чумного микроба, а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток.

Основные задачи исследования

1. Изучить влияние серотонина на скорость роста, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), морфометрические характеристики Y. pestis EV НИИЭГ (pFra+, pCad+, pPst+) и его изогенных штаммов Y. pestis КМ218 (pFra", pCad", pPst"), Y. pestis KM216 (pFra", pCad", pPst+) в условиях культивирования на плотных и жидких питательных средах.

2. Оценить возможность применения серотонина для повышения эффективности выделения возбудителя чумы бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой.

3. Изучить влияние серотонина на экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена) и электрофоретический профиль белков Y. pestis с различным плазмидным составом в условиях культивирования на питательных средах.

4. Провести сравнительный анализ влияния серотонина на развитие индуцированного Y. pestis и другими представителями рода Yersinia (У.pseudotuberculosis, Y. enterocoliticá) апоптоза лейкоцитов крови человека в модельной системе in vitro.

5. С применением проточной цитофлуориметрии изучить in vivo влияние серотонина на процессы апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов биомодели (мыши BALB/c, нелинейные белые мыши) в условиях иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, а также различными препаратами капсульного антигена чумного микроба Ф1.

Научная новизна

Впервые установлено, что серотонин стимулирует накопление биомассы Y. pestis EV НИИЭГ и бесплазмидного штамма Y. pestis КМ218 на ранних стадиях развития культур, индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК-флуоресценцией для Y. pestis EV НИИЭГ в 2 раза, для Г. pestis КМ218 - в 1,8 раза.

Получены новые сведения о влиянии серотонина на выделение чумного микроба из исследуемого материала, контаминированного посторонней микрофлорой. Показана эффективность применения серотонина на начальном этапе бактериологического исследования на чуму. С применением серотонина разработан способ выделения Y. pestis бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, позволяющий сократить до 24 ч сроки биологического накопления возбудителя чумы и увеличить число колониеобразующих единиц (КОЕ) чумного микроба. Новизна исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (варианты)» (положительное решение о выдаче патента от 16.10.2008 г. по заявке №2007142840/13(046910), приоритет от 19.11.2007 г.).

Показано влияние серотонина на экспрессию видоспецифических антигенов чумного микроба (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), детектируемых с помощью коммерческих препаратов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных. Обнаружено увеличение процентного содержания клеток с повышенной интенсивностью свечения.

Впервые выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез чумным микробом полипептида с молекулярной массой 22 кДа, участвующего в формировании поверхностного заряда клеток и проявлении адгезивных свойств, в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 °С в течение 24 ч.

Впервые in vitro и in vivo с применением проточно-цитофлуориметрического метода цитологического анализа установлено непосредственное участие серотонина в механизмах модуляции индуцированного Y. pestis и капсульным антигеном чумного микроба (Ф1) апоптоза, изменений состояния ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов биомодели. Серотонин в концентрации 10 "5 моль (М) в первые 6 ч замедляет in vitro развитие индуцированного Y. pestis апоптоза лейкоцитов крови интактных биомоделей, что создает благоприятные условия для роста и размножения чумного микроба в организме хозяина и связано с влиянием антигенов, синтезируемых при 37 °С, в первую очередь капсульного антигена (Ф1). В иммунном организме модулирующее действие серотонина проявляется лишь через 24 ч и имеет противоположную направленность.

Впервые получены новые данные о влиянии биогенного амина серотонина на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Серотонин оказывает модулирующее действие на распределение лейкоцитов по клеточному циклу, изменяя соотношение в крови клеток, находящихся на стадиях апоптоза и пролиферации. Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.

Практическая значимость

Результаты исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Организация работы и обеззараживание материала, содержащего возбудитель чумы при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии», которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 6 от 12.12.2008 г.) и утверждены директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Разработанный нами «Способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (варианты)» (положительное решение на выдачу патента от 16 октября 2008 г. по заявке № 2007142840/13(046910), приоритет от 19.11.2007 г.) внедрен в работу специализированной лаборатории препаратов против чумы и др. ООИ ГИСК им. Л.А. Тарасевича (акт внедрения патента в НД утвержден директором ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича академиком Н.В. Медуницыным от 26.11.2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биогенный амин серотонин в концентрации Ю-5 М оказывает стимулирующее влияние на рост чумного микроба на стандартно используемых для его культивирования жидких и плотных питательных средах [бульон и агар Хотгингера рН 7,2; агар Хоттингера рН 7,2, содержащий лизированную кровь (1%) и генцианвиолет (1:100000-1:200000)], индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК-флуоресценцией.

2. С применением серотонина разработан способ выделения Y. pestis бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, который позволяет увеличить число КОЕ чумного микроба в 1,5-5,5 раза и значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы из нативного материала.

3. Выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа клетками вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, бесплазмидного штамма Y. pestis КМ218, моноплазмидного штамма Y. pestis КМ216 в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 °С в течение 24 ч.

4. В модельной системе in vitro серотонин в концентрации 10~5 М оказывает модулирующее действие на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.

5. Установлено, что примирование серотонином биомоделей (мыши BALB/c, беспородные белые мыши) до иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, различными препаратами капсульного антигена чумного микроба (Ф1) влияет на характер развития процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина, лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов, интенсивность и направленность которых зависят от вида иммунизирующего препарата.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на: Международных конференциях «Saratov Fall Meeting: Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine IY» (Саратов, 2002-2003); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI век» (Саратов, 2004); на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов' (Москва, 2007); на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории

государств-участников Содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2003-2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 работ, их них статей в рекомендованных ВАК изданиях - 4, в зарубежной печати - 2.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 147 отечественных и 150 зарубежных источников. Объем диссертации составляет 159 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы

В работе использовали: 1) штамм Y. pestis EV НИИЭГ (pFra+, pCad\ pPst+), его изогенные производные - штаммы Y. pestis КМ216 (pFra*, pCad", pPst+), Y. pestis KM218 (pFra", pCad", pPst'); 2) вирулентный штамм Y. pestis 231 (Pgnf, pFra+, pCad+, pPst+); 3) другие виды иерсиний: штаммы Y.pseudotuberculosis I серовар, Y. pseudotuberculosis IV серовар, Y. enterocolitica 383 (pCad") 09 серовар, Y. enterocolitica KM-33 (201) (pCad+) 09 серовар, Y.enterocolitica 134 03 серовар 4) S. aureus 209-П, E. coli 25922 ATCC; 5) углеводсодержащий препарат капсульного антигена чумного микроба (Ф1) и чистый белок Ф1. Все указанные штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Препараты капсульного антигена любезно предоставлены доктором биологических наук Тараненко Т.М. (лаборатория биохимии РосНИПЧИ «Микроб»).

Серотонин-креатинин сульфат («Merck», Germany) применяли в виде свежеприготовленного водного раствора, стерилизованного фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Конечное разведение серотонин-креатинин сульфат соответствовало 3,5* 10"4 М или 1x10"5 М в пересчете на серотонин основание.

В экспериментах использованы 180 клинически здоровых нелинейных белых мышей, мышей инбредной линии BALB/c массой (18±2) г, полученные из «Сектора по разведению экспериментальных животных» лаборатории биомоделей РосНИПЧИ «Микроб».

Микробиологические методы

Штамм Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенные производные выращивали на агаре и бульоне Хоттингера рН 7,2 при температуре 28 °С и 37 "С, штаммы Y. pseudotuberculosis - при 28 °С и 37 °С, Y. enterocolitica - при 37 °С в течение 48 ч, E.coli - на агаре Хоттингера рН 7,2 при 37 °С в течение 24 ч, S. aureus - на агаре Хоттингера рН 7,4 при 37 °С в течение 24 ч. Из полученных культур готовили соответствующие взвеси в стерильном 0,9 % растворе натрия хлорида рН 7,2 по

стандартному образцу мутности ОСО-42-28-85П 10 единиц, эквивалентному 1*109 м.к./мл. Методом серийных разведений доводили концентрацию клеток до 103 м.к./мл. Для получения смешанной взвеси клеток Y. pestis EV, S.aureus, Е. coli по 500 мкл взвеси каждого штамма вносили в одну пробирку. Навески природной почвы массой 1 г инфицировали 105 и 104 м.к Y. pestis EV, затем суспензировали в 10 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. Серотонином обрабатывали как непосредственно исследуемый материал перед посевом, так и готовые агаровые пластины.

Морфометрический анализ колоний и клеток чумного микроба проводили с применением аппаратно-программного комплекса «Мекос-Ц» (Мекос-ДММ, версия 2.1.0.0.) и биологического микроскопа Olimpus СХ 31 с видеокамерой JVC.

Электрофоретическое разделение белков цельно-клеточных лизатов исследуемых культур проводили в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) по методу U. К. Laemmli (1970).

Для регистрации относительного содержания ДНК в микробных клетках и анализа распределений бактерий по клеточному циклу (ДНК-гистограмм) применяли цитохимический метод, основанный на специфической окраске ДНК смесью митрамицина и этидиум бромида [Steen Н.В., Boye Е., 1981] предварительно обеззараженных и фиксированных (70±1)° этанолом бактериальных клеток. Измерения флуоресценции проводили на цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия), оснащенном 2048-канальным амплитудным анализатором импульсов Orto Instruments 2102 (Westwood, Mass USA) для автоматической сортировки клеток и построения гистограмм.

Для проточно-цитофлуориметрического анализа экспрессии поверхностных антигенов Y. pestis использовали коммерческий препарат иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных производства РосНИПЧИ «Микроб», прошедший контроль на активность и специфичность в ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Измерения проводили на цитофлуориметре ICP-22 PHYWE. Экспрессию специфических поверхностных антигенов чумного микроба оценивали количественно путем измерения в потоке интенсивности иммунофлуоресценции большой статистической выборки отдельных клеток и автоматической сортировки их по данному показателю.

Иммуносерологические методы

Антитела к капсульному антигену Ф1 чумного микроба в сыворотке крови определяли микрометодом в системе реакций РНГА и РТНГА с применением диагностикума чумного эритроцитарного антигенного производства НИИМ МО РФ (г. Киров). ТИФА применяли для выявления капсульного антигена Ф1 чумного микроба с использованием тест-системы иммуноферментной моноклональной.

Иммуноблоттинг после электрофоретического разделения белков цельно-клеточных лизатов исследуемых культур в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) проводили согласно Н. Towbin с соавторами (1979).

Иммунологические методы

Иммунизацию биомодельных животных осуществляли подкожно двухсуточной агаровой культурой вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ в дозе 105 м.к. или капсульным антигеном чумного микроба Ф1 в дозе 100 мкг в объеме 0,2 мл. Серотонин (10'5 М) вводили за 30 мин до иммунизации однократно, подкожно в область спины в объеме 0,5 мл.

Определение апоптотических и пролиферирующих эукариотических клеток проводили с применением проточной цитофлуориметрии. Окраску ДНК митрамицином (Serva, Германия), бромидом этидия (Serva, Германия) проводили по методу В. Barlogie et al. (1976). Морфологическое подтверждение апоптоза лейкоцитов проводили в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе, с применением аппаратно-программного комплекса «Мекос-Ц» (Мекос-ДММ, версия 2.1.0.0.).

Проточно-цитофлуориметрический мониторинг состояния ядерного хроматина и лизосомального аппарата клеток иммунной системы проводили с использованием цитохимического метода, основанного на применении красителя акридинового оранжевого (АО) [Melamed M.R., 1972]. По интенсивности зеленой флуоресценции ядерного хроматина и красной флуоресценции лизосомальных гранул на гистограммах идентифицировали активированные клетки, которые подсчитывали в процентах по отношению к общему числу исследованных клеток.

LD5o заражающего штамма Y. pestis 231 определяли по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина, A.A. Воробьева (1962).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel», гистограмм и фотографий - «Corel PHOTO PAINT 11», «Adobe Photoshop». Фотографии получали при помощи цифровой фотокамеры Canon Power Shot А 70, Canon Power Shot A 410 я программно-аппаратного комплекса Мекос-Ц (программа Мекос-ДММ, версия 2.1.0.0.).

Результаты исследований и их обсуждение

Нами проведено исследование влияния серотонина на динамику роста, морфометрические показатели Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом на плотных и жидких питательных средах в условиях культивирования при 28 °С и 37 °С.

Добавление серотонина в различных концентрациях в жидкую среду культивирования (бульон Хоттингера pH 7,2) оказывало непосредственное влияние на количественные показатели интенсивности роста чумного микроба. Выявлена зависимость роста Y. pestis EV при 28 °С от концентрации добавленного в среду культивирования серотонина. Наличие экзогенного серотонина в жидкой среде культивирования в концентрации 10"5 М, 10""M, 10"1 M более чем в 2 раза увеличивало количество микробных клеток на начальном этапе выращивания. Низкие концентрации серотонина (10"8 М, 10"7М, 10'° М) в

аналогичных условиях не обладали стимулирующим действием и оказывали противоположный эффект на рост чумного микроба (рисунок 1).

ОДб

ё 0,14

о в 0,12

о 0,1

5 0,08

к о о 0,06

З4 0,04

| 0,02

>>---

Т5^- -о- -С • ' —о——

-о -_ / * 1

—у 1

10"® ю-7 10 е ю-5 ю-4 ю*3

Концентрация серотонина (моль) ■■ Ш бч ЕУ —«- 6чЕУ+С —о—9чЕУ —о- 9чЕУ+С

ЕУ - штамм У. резНз ЕУ;

ЕУ +С - штамм У. резйв ЕУ в среде с добавлением серотонина.

Рисунок 1. Влияние различных концентраций серотонина на рост У. рея№ ЕУ НИИЭГ в бульоне Хотгингера рН 7,2 при 28 °С.

Для дальнейших исследований была выбрана концентрация серотонина 10"5 М, обладающая стимулирующим действием на рост чумного микроба и соответствующая физиологическим концентрациям серотонина, освобождающимся при разрушении и агрегации тромбоцитов в очаге воспаления, что соответствует обычно 10'6 - 10"5 М [Тагшг Н. е! а!., 1983; СегеЬоп М.О., Тапнг Н., 1984].

Нами установлено, что выращивание У. рыНз ЕУ в бульоне Хоттингера рН 7,2 в присутствии Ю-5 М серотонина как при 28 °С, так и при 37 °С обеспечивало более интенсивное, по сравнению с контролем, накопление клеточной биомассы У. реэйэ ЕУ в течение 23-24 ч. В более поздние сроки наблюдения (28 ч, 47 ч, 51 ч) ростостимулирующий эффект серотонина проявлялся только в условиях инкубирования посевов при 37 °С.

При культивировании штамма У. резИз ЕУ с полным набором плазмид и изогенного бесплазмидного штамма У, реяНз КМ218 в бульоне Хоттингера при температуре 28 °С наличие экзогенного серотонина в концентрации 10"" М приводило к увеличению количества микробных клеток на начальном этапе выращивания для обоих штаммов, что свидетельствовало о независимости

стимулирующего действия серотонина от плазмидного состава клеток чумного микроба.

В ходе проведенных нами исследований показано, что биогенный амин серотонин в концентрации 10"5 М оказывает стимулирующие действие на рост чумного микроба в условиях культивирования на плотных питательных средах, применяемых при стандартном бактериологическом методе исследования на чуму (агар Хотгингера pH 7,2, агар Хоттингера pH 7,2 с лизированной кровью и генцианвиолетом).

Обработка серотонином как непосредственно самого исследуемого материала перед посевом (бактериальной взвеси), так и готовых агаровых пластин приводила к достоверному увеличению числа колониеобразующих единиц (КОЕ), не оказывая при этом значимого влияния на тинкториальные, культурально-морфологические свойства и морфометрические показатели чумного микроба. При добавлении серотонина во взвесь клеток У. pestis EV или на поверхность агара число КОЕ через 24-48 ч возрастало в 2 раза (р<0,05) по сравнению с контрольными посевами (таблица 1).

Аналогичные результаты получены нами при изучении влияния серотонина на рост чумного микроба в смешанной культуре. Ростостимулирующий эффект серотонина проявлялся одинаково как при нанесении раствора серотонина на поверхность агара, так и при внесении его в смешанную взвесь клеток У. pestis EV, S. aureus, E. coli за 30 мин до посева на плотную питательную среду. Серотонин в концентрации 10"5М оказывал также стимулирующее действие и на рост Е. coli, что согласуется с данными A.B. Олескина с соавторами (1998), однако сам эффект выражен намного слабее по сравнению с его действием на чумной микроб (уровень стимуляции роста по сравнению с контролем - 25 % у Е. coli, против - 120 % у Y. pestis-, число КОЕ в контроле принято за 100 %).

При исследовании контаминированного сопутствующей микрофлорой материала, в первую очередь объектов внешней среды и, особенно, при малом содержании в нем чумного микроба, наблюдается, как правило, поздняя визуализация колоний Y. pestis (через 48-96 ч). На примере искусственно инфицированной У. pestis природной почвы, нами установлено, что обработка серотонином перед посевом либо исследуемого материала, либо агаровых пластин позволяет значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы и увеличить в 3-5 раз число колониеобразующих единиц чумного микроба.

С применением серотонина нами разработан способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (положительное решение о выдаче патента на изобретение от 16 декабря 2008 г. по заявке № 2007142840, приоритет от 19.11.2007 г.), который не требует больших материальных затрат и дорогостоящего оборудования, легко воспроизводим и может быть реализован как в стационарных, так и полевых условиях.

Таблица 1 - Влияние серотонина на количество КОЕ У. реяпя, выращенных на агаре Хоттингера рН 7,2 с лизированной кровью (1 %) и генцианвиолетом (1:100000) при 28 °С _________'

Исследуемый материал Способ обработки серотонином Вид микроорганизмов КОЕ

n через 24 ч M±m через 48 ч М±ш

Монокультура Внесение во взвесь У. pestis EV НИИЭГ 10 44 ± 1,8* 85 ± 1,8*

Контроль (без серотонина) Y. pestis EV НИИЭГ 10 20 ± 1,2 38 ± 1,0

Монокультура Внесение во взвесь Е. coli 25922 АТСС 10 62 ± 2,5* 88 ±4,9

Контроль (без серотонина) Е. coli 25922 АТСС 10 50 ± 2,0 83 ± 4,3

Монокультура Внесение во взвесь St. aureus 209-П 10 нет роста нет роста

Контроль (без серотонина) St. aureus 209-П 10 нет роста нет роста

Смешанная культура Внесение во взвесь У. pestis EV НИИЭГ 10 12 ±2,4* 32 ±3,6*

St. aureus 209-П 10 нет роста нет роста

E. coli 25922 АТСС 10 16 ± 2,7 29 ±3,1

Смешанная культура Контроль (без серотонина) У. pestis EV НИИЭГ 10 6 ±1,5 15 ±1,9

St. aureus 209-П 10 нет роста нет роста

E. coli 25922 АТСС 10 13 ±2,3 22 ± 2,8

Почва (105м.к. У. резИз на 1 г почвы) Внесение в почвенную суспензию y.pejfeEVrairor 5 6 ± 0,5* 55 ±6,1*

Нанесение на поверхность агаровых пластин У. pestis EV НИИЭГ 5 7 ± 0,8* 37 ± 2,1*

Контроль (без серотонина) Y. pestis EV НИИЭГ 5 нет роста 10 ± 1,2

Почва (104м.к. У. р^Ш на 1 г почвы) Внесение в почвенную суспензию У. pestis EV НИИЭГ 5 2 ± 0,8* 20 ± 1,5*

Нанесение на поверхность агаровых пластин У. pestis EV НИИЭГ 5 3 ± 0,6* 18 ±2,3*

Контроль (без серотонина) У. pestis EV НИИЭГ 5 нет роста 6 ±0,8

Примечание - * достоверность различий опытных проб с серотонином от проб без серотонина (р<0,05).

Нами обнаружено, что обработка взвеси клеток Y. pestis EV серотонином в конечной концентрации 10'5 М в течение 30 мин при комнатной температуре приводит к достоверному двукратному увеличению доли клеток с повышенным содержанием ДНК, регистрируемой методом проточной цитометрии (рисунок 2). Ранее A.B. Олескиным с соавторами (1998) было отмечено, что ростостимулирующий эффект серотонина на Е. coli, Rsp. rubrum не зависел от того, добавляли ли серотонин однократно в момент посева культуры или вносили многократно. По-видимому, биогенный амин серотонин действует на определенный «пусковой механизм», инициируемый на ранней стадии развития культуры.

«U

о о н о и F

1000

5® „.

I» $11 TI

liKf

i«a

1-1-1-г

100 200 300 400

1000

300

CK «Mint

•j!*T »ИТ

4Ю

313 109 200 300

Содержание ДНК на клетку в условных единицах (каналах)

312

А - распределение клеток К. р&Ш ЕУ без обработки бактериальной взвеси серотонином; Б - распределение клеток У. рейИв ЕУ с обработкой бактериальной взвеси серотонином.

Рисунок 2. Влияние серотонина в концентрации 10" М на характер распределения Y. pestis ЕУ НИИЭГ по клеточному циклу.

Проведенный нами впервые проточно-цитофлуориметрический мониторинг относительного содержания ДНК в клетках У. рез№ ЕУ НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом в условиях культивирования при 37 °С на питательных средах в присутствии серотонина также показал наличие активирующего воздействия серотонина на генетический аппарат клеток чумного микроба.

С применением проточно-цитофлуориметрического анализа нами в условиях культивирования при 37 "С установлена возможность влияния серотонина на экспрессию видоспецифических антигенов (капсулыюго антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена) клетками штамма Крет/и ЕУ НИИЭГ и У. реяИя КМ216 (рРв1:+), детектируемых с помощью

коммерческого препарата иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных, в сторону ее усиления. Обнаружено увеличение процентного содержания клеток с повышенной интенсивностью свечения.

При сравнительном изучении влияния серотонина в 508-РАСЕ на электрофоретический профиль белков цельно-клеточных лизатов штаммов чумного микроба с различным плазмидным составом было обнаружено, что все культуры, независимо от того, содержат ли они одну (У. ре$Ш КМ216), три {У.реэНз ЕУ), или ни одной (У. рел'?;,? КМ218) плазмиды, синтезируют полипептид молекулярной массы 22 кДа, что согласуется с литературными данными [Заднова С.П., 1998].

Обнаружено, что культивирование У. рена агаре Хоттингера рН 7,2, обработанном 10~5 М серотонина, приводило почти к исчезновению на тестируемых протеинограммах мажорного белка с молекулярной массой 22 кДа, выявляемого в лизатах культур У. резИя ЕУ, У. резИя КМ218 и У. резИя КМ216, выращенных на этой же среде, но без серотонина (рисунок 3).

М 12 3 4

М - маркеры (белки с известной молекулярной массой); 1 - бактерии выращены на агаре Хоттингера; 2 - бактерии выращены на агаре Хоттингера с серотонином; 3 - бактерии выращены на агаре Хоттингера с лизированной кровью; 4 - бактерии выращены на агаре Хоттингера с лизированной кровью и серотонином.

Рисунок 3. Элекгрофореграмма цельно-клеточных лизатов клеток У. реяйБ ЕУ НИИЭГ, выращенных при 28 °С в течение 24 ч.

Выявленный нами ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа имеет, по-видимому,

немаловажное значение для адаптации и реализации патогенного потенциала чумного микроба на начальных этапах инфекционного процесса.

Не исключено также, что данный эффект может быть реализован в условиях биопленки У. pestis в блохах, так как клетки чумного микроба, выделенные из биопленки, обладают повышенной резистентностью к фагоцитозу полиморфноядерными лейкоцитами крови человека именно на стадии захвата, а внеклеточный матрикс, образующий оболочку биопленки Y.pestis, включает форменные элементы поглощенной блохой крови, в состав которых входят тромбоциты, депонирующие серотонин. Вследствие разрушения и агрегации тромбоцитов происходит высвобождение серотонина, способного к реализации своего модулирующего действия. В пользу высказанного предположения свидетельствует также факт отсутствия продукции чумным микробом при нахождении в блохе таких антифагоцитарных факторов, как капсульный антиген Ф1 и секретируемые белки Yop [Jarret С.О. et al., 2004].

Нами впервые с применением проточной цитофлуориметрии в модельной системе in vitro получены новые данные о влиянии биогенного амина серотонина на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (У. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.enterocolitica).

Установлено, что серотонин замедляет in vitro развитие раннего (через 6 ч) и стимулирует проявление позднего (через 24 ч) апоптоза лейкоцитов крови человека в ответ на клетки вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенные при 28 °С. Серотонин в 2 раза снижал интенсивность раннего апоптоза лейкоцитов крови человека в ответ на клетки У. pseudotuberculosis I серовара, независимо от температуры их выращивания, и не оказывал достоверного воздействия на развитие раннего и позднего апоптоза, индуцированного У. pseudotuberculosis IV серовара. Под влиянием серотонина зарегистрировано более чем двукратное увеличение интенсивности развития позднего апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного клетками штамма У. enterocolitica 383 09 серовара, лишенного плазмиды кальцийзависимости (рисунок 4).

В нашей работе, как и в исследованиях других авторов [Шмелькова Т.П. и др., 2007], наблюдалось развитие позднего апоптоза лейкоцитов крови человека под действием У. pestis и У. pseudotuberculosis I серовара, относящихся к одной эволюционной линии и вызывающих заболевания, часто сопровождающиеся острым течением инфекции [Гаева А.В., 2002]. Физиологические концентрации серотонина, освобождающиеся при разрушении и агрегации тромбоцитов в очаге воспаления могут быть достаточны для оказания модулирующего действия на развитие апоптоза эукариотических клеток, запускаемого патогенными иерсиниями.

Как показали результаты нашего исследования, серотонин в концентрации 10"5 М оказывает в условиях in vitro различной степени влияние на апоптоз лейкоцитов, индуцируемый в крови человека представителями рода

Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica). Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.

СИ 505;CTS ОсЮТ 30081

{{ Контроль

fj\

СН 406:CTS ЗЯТГ 31)579

У. enterocolitica 383

СН S02:CTS 1:BNT 30387

Y.enterocolitica 383 + С

ilA

Ось абсцисс - относительное содержание ДНК на клетку в условных единицах интенсивности флуоресценции; ось ординат - количество лейкоцитов. 1- гиподиплоидные клетки (менее 2С ДНК); 2 - диплоидные клетки (2С ДНК); 3- пролиферирующие клетки (более 2С ДНК). Срок инкубации 24 ч при 37 °С.

Рисунок 4. Влияние серотонина на индуцируемый Y. enterocolitica 383 апоптоз лейкоцитов крови человека

Механизм модулирующего действия биогенного амина серотонина на развитие апоптоза под влиянием патогенных иерсиний может быть связан с одной стороны, с изменением экспрессии поверхностных антигенов под влиянием серотонина, что было показано нами на примере чумного микроба, а с другой - с интенсивностью выработки цитокинов лейкоцитами, изменением экспрессии молекул, участвующих в связывании лигандов TLR (таких как CD 14) и опосредующих эффекторные функции клеток (молекул адгезии, рецепторов хемокинов, костимуляторных молекул) [Хорева М.В., 2006]. Полученные новые сведения, несомненно, имеют важное значение для понимания патогенеза вызываемых Yersinia spp. инфекций и могут быть использованы при разработке новых подходов в их комплексной терапии.

Нами также, впервые in vitro и in vivo с применением проточно-цитофлуориметрического метода цитологического анализа установлено непосредственное участие серотонина в механизмах модуляции апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, изменений состояния ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных клеток в динамике формирования иммунного ответа биомодельных животных в условиях иммунизации вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ и капсульным антигеном чумного микроба (Ф1), а также индуцированного in vitro Y. pestis апоптоза лейкоцитов крови.

Показано, что серотонин в концентрации 10"5 М в первые 6 ч замедляет in vitro развитие индуцированного Y. pestis апоптоза лейкоцитов крови интактных биомоделей, что создает благоприятные условия для роста и

размножения чумного микроба в организме хозяина и связано с влиянием антигенов, синтезируемых при 37 °С, в первую очередь капсульного антигена (Ф1). В иммунном организме модулирующее действие серотонина проявлялось лишь через 24 ч и имело противоположную направленность.

Иммунизация мышей ВАЬВ/с вакцинным штаммом У. рехШ ЕУ НИИЭГ индуцировала в течение первой недели активацию ядерного хроматина лейкоцитов крови. Доля клеток с активированным ядерным хроматином достоверно повышалась в крови на 1-е и 7-е сутки иммуногенеза. Одновременно регистрировалось увеличение относительного содержания клеток с активированным лизосомальным аппаратом с 19 % до 72 % на 1-е сутки и до 77,4 % - на 7-е сутки (р<0,05). К 21-м суткам данные показатели были несколько меньше исходных значений.

Примирование серотонином приводило к увеличению в крови более чем в 2 раза доли клеток с активированным ядерным хроматином на 1-е сутки и заметному снижению ее на 7-е и 21-е сутки с момента вакцинации. Напротив, среди перитонеальных клеток, полученных путем промывания средой 199 брюшной полости мышей ВАЬВ/с на 21-е сутки с момента вакцинации У. ре$Ив ЕУ НИИЭГ на фоне примирования серотонином, в 1,85 раза увеличивалась доля клеток с активированным хроматином (р<0,05).

Введение серотонина перед иммунизацией вакцинным штаммом чумного микроба К. резШ ЕУ НИИЭГ приводило к снижению степени реактивности лизосомального аппарата клеток иммунофагоцитарной системы, что проявлялось значительным уменьшением в крови и перитонеальной полости доли клеток с интенсивной красной флуоресценцией лизосомальных гранул в течение всего периода наблюдения.

Примирование серотонином биомодельных животных за 30 минут до их иммунизации У. реяНБ ЕУ сопровождалось достоверным повышением пролиферативной активности лейкоцитов крови и спленоцитов на ранней стадии вакцинального процесса (1-е сутки). Следует отметить, что в центральном органе иммунной системы тимусе доля пролиферирующих тимоцитов под воздействием серотонина снижалась на 7-е сутки иммуногенеза на фоне повышенного количества гиподиплоидных клеток (< 2С ДНК). По-видимому, под влиянием серотонина происходит повышение интенсивности отрицательной клональной селекции Т-клеток в ответ на иммунизацию У. реэНэ ЕУ, что согласуется с данными Л.С. Елисеевой (1984) о выраженном модулирующем действии серотонина на Т-клеточное звено иммунитета и изменение соотношения Т- и В-лимфоцитов в сторону" увеличения последних. Как показали результаты наших исследований, иммунизация на фоне примирования серотонином приводила к четырехкратному увеличению титров сывороточных антител к капсульному антигену чумного микроба Ф1, выявляемых в системе реакций РНГА - РТНГА.

На фоне примирования серотонином, иммунизация углеводсодержащим препаратом капсульного антигена Ф1 нелинейных белых мышей сопровождалась достоверным повышением в крови доли клеток с активированным хроматином при одновременном уменьшении ее в

перитонеалыюй полости. Напротив, при иммунизации примированных серотонином в концентрации 10~5 М белых мышей белковым препаратом Ф1 наблюдалась тенденция к уменьшению доли лейкоцитов крови с активированным хроматином без достоверных изменений состояния перитонеальных клеток по исследуемому показателю.

Независимо от препарата капсульного антигена чумного микроба подкожное введение 10~5 М серотонина за 30 мин до иммунизации индуцировало снижение относительного содержания лейкоцитов крови с активированным лизосомальным аппаратом.

Следует отметить, что в условиях повышенной реактивности клеток иммунной системы на углеводсодержащий препарат капсульного антигена чумного микроба, интенсивно воздействующий на метаболизм макрофагов и более протективный для мышей [Ермакова Г.В., 1990], обладающий достоверно более высоким эффектом стимуляции колониеобразующей функции стволовых клеток [Щуковская Т.Н. и др., 1999], модулирующее действие серотонина было наиболее выраженным.

Таким образом, полученные в результате проведенных исследований новые сведения о влиянии серотонина на рост У. реБИз, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), электрофоретический профиль белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток организма хозяина, свидетельствуют о реальной возможности использования возбудителем чумы биогенного амина серотонина, являющегося компонентом микроокружения в месте входных ворот чумной инфекции, для создания условий, направленных на ускорение адаптации его к внутренней среде организма хозяина и способности противостоять системе антиинфекционной защиты макроорганизма.

ВЫВОДЫ

1. Биогенный амин серотонин в концентрации 10"5 М оказывает стимулирующее влияние на рост чумного микроба на стандартно используемых для его культивирования жидких и плотных питательных средах (бульон и агар Хоттингера рН 7,2; агар Хоттингера рН 7,2 с лизированной кровью и генцианвиолетом), не оказывая при этом значимого влияния на тинкториальные, . культурально-морфологические свойства и морфометрические показатели чумного микроба.

2. С применением серотонина разработан способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, который позволяет увеличить число колониеобразующих единиц (КОЕ) чумного микроба в 1,5-5,5 раза и значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы из нативного материала.

3. Биогенный амин серотонин в концентрации 10"5 М индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК-флуоресценцией, оказывает влияние на экспрессию видоспецифических антигенов чумного микроба (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), детектируемых с помощью коммерческих препаратов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных, в сторону ее усиления.

4. Выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа клетками Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных Y. pestis КМ218, Y. pestis КМ216 в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 °С в течение 24 ч.

5. Серотонин в концентрации 10"5 М оказывает различной степени влияние на индуцируемый Yersinia spp. апоптоз лейкоцитов крови in vitro. Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара. Серотонин ингибирует развитие раннего (через 6 ч) апоптоза лейкоцитов крови человека под действием близкородственных бактерий У. pestis и Y.pseudotuberculosis I серовара.

6. Установлено, что примирование серотонином биомоделей (мыши BALB/c, нелинейные белые мыши) до иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, различными препаратами капсульного антигена чумного микроба (Ф1) влияет на характер развития процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина, лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов, интенсивность и направленность которых зависят от вида иммунизирующего препарата.

7. Полученные новые сведения о влиянии серотонина на рост Y. pestis, перераспределение по клеточному циклу, электрофоретический профиль белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток организма хозяина, свидетельствуют о реальной возможности использования возбудителем чумы биогенного амина серотонина, являющегося компонентом микроокружения в месте входных ворот чумной инфекции, для создания условий, направленных на ускорение адаптации его к внутренней среде организма хозяина и способности противостоять системе антиинфекционной защиты макроорганизма.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Корсуков В.Н., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Клюева С.Н., Попов Ю.А. Действие серотонина на размножение и содержание ДНК бактерий Yersinia pestis // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - 2002.-Вып. 5.- С. 58 - 60.

2. Korsukov V.N., Schukovskaya T.N., Klueva S.N., Kravtsov A.L., Polunina T.A., Popov Yu.A. The application of the flow cytometry for determination of the

action of serotonin on the antigenic composition and amount of DNA of plague microbe, cultured at 37 ° С // Proc. SPIE. - 2002. - V. 5068 - P. 61 - 67.

3. Клюева C.H., Корсуков B.H., Щуковская Т.Н., Кравцов A.JL, Попов Ю.А. Модуляция серотонином свойств клеточной поверхности и содержания ДНК в клетках Yersinia pestis с различным плазмидным составом // Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ Микробиологии МОРФ. - Киров, 2003. - С.83.

4. Klueva S.N., Korsukov V.N., Schukovskaya T.N., Kravtsov A.L. Effect of serotonin on the expression of antigens and DNA levels in Yersinia pestis cells with different plasmid content // Proc. SPIE. - 2003. - V. 5474. - P. 361 - 368.

5. Кравцов A.JI., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Кутырев В.В. Проточная цитометрия как новая технология современной клинической микробиологии // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всерос. науч.- практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 125 - 126.

6. Киреев М.Н., Тараненко Т.М., Храмченкова Т.А., Кравцов A.JL, Гусева Н.П.. Полунина Т.А.. Подборонова H.A., Клюева С.Н.. Шмелькова Т.П. Структурно-функциональные свойства препаратов капсульного антигена Ф1 в процессе хранения // Биотехнология. - 2005. - № 5. - С. 41 - 43.

7. Киреев М.Н., Кравцов А.Л., Тараненко Т.М., Храмченкова Т.А., Клюева С.Н., Гусева Н.П., Шмелькова Т.П. Сравнительная оценка методом проточной цитофлуориметрии степени активации клеток иммунофагоцитарной системы у мышей, иммунизированных различными препаратами капсульного антигена чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып. 2 (94).-С. 61 -64.

8. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Задумина С.Ю., Бугоркова С.А., Клюева С.Н., Щуковская Т. Н. Азурофильная дегрануляция нейтрофилов крови in vitro у лиц, привитых живой чумной вакциной // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации: Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 71 - 72.

9. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Лоцманова Е.Ю., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Феномен внеклеточной бактерицидности нейтрофилов и механизмы защиты бактерий от действия лейкоцитарной эластазы // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - № 1. - С. 49 - 52.

10. Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н. Экспериментальная система для изучения антифагоцитарных свойств возбудителей особо опасных инфекций // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 232 - 234.

11. Щуковская Т.Н., Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Козлова Е.А. Влияние биогенного амина серотонина на индуцированный иерсиниями in vitro апоптоз лейкоцитов крови человека // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в

государствах-участниках СНГ: Матер, VIII Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 322 - 324.

12. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Лоцманова Е.Ю., Кутырев В.В. Роль апоптоза в иммунопатогенезе особо опасных инфекций // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации: Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -Москва, 2007. - Т. 1. - С. 118 -119.

13. Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Тараненко Т.М., Щуковская Т.Н. Влияние серотонина на функциональную активность иммунокомпетентных клеток биомоделей, иммунизированных Yersinia pestis EV НИИЭГ или капсульным антигеном чумного микроба // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества независимых государств: Матер. IX Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 93 - 95.

14. Щуковская Т.Н., Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Волох О.А., Алешина Ю.А., Кутырев В.В. «Влияние биогенного амина серотонина на рост и профиль белков чумного микроба в условиях культивирования на плотных питательных средах» // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - Вып.2 (96). - С. 35 - 39.

15. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н. Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации - Саратов, 2008. - С. 43.

Подписано в печать 25.12.2008. Формат 60х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Объем Усл.печ.л. 1.0 Тираж 100 экз. Заказ 236

Типография АВП «Саратовский источник» г. Саратов, ул. Университетская, 42 к. 106 т. 520593

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клюева, Светлана Николаевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОГЕННЫЕ АМИНЫ (НЕЙРОГОРМОНЫ) И ИХ РОЛЬ В 17 МЕХАНИЗМЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРО- И ЭУКАРИОТ

1.1. Роль биогенных аминов в регуляции жизнедеятельности 17 прокариот

1.2. Биогенные амины в иммунопатогенезе инфекционных 29 болезней

1.3. Модулирующее действие биогенного амина серотонина на 35 процессы формирования адаптивного иммунитета

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы исследования 44 2.2.1. Микробиологические методы исследования

2.2.1.1. Культивирование микроорганизмов в присутствии 44 серотонина

2.2.1.2. Приготовление бактериальных взвесей и смешанных 45 культур

2.2.1.3. Морфометрия бактериальных клеток, колоний чумного 46 микроба

2.2.1.4. Электрофоретическое разделение цельно-клеточных лизатов 47 исследуемых культур в полиакриламидном геле (SDS - PAGE)

2.2.1.5. Определение содержания ДНК в микробных клетках методом проточной цитометрии

2.2.1.6. Проточно-цитофлуориметрический мониторинг экспрессии 49 антигенов У. ревйв, детектируемых коммерческим препаратом иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных

2.2.2. Иммуносерологические методы исследования (РНГА, 50 РТНГА, ТИФА, иммуноблоттинг)

2.2.3. Иммунологические методы

2.2.3.1. Выделение иммунокомпетентных клеток из крови и органов 51 биомоделей

2.2.3.2. Выделение суммарной фракции лейкоцитов из крови 52 человека и биомодельных животных

2.2.3.3. Определение апоптотических и пролиферирующих 52 эукариотических клеток

2.2.3.4. Цитофлуориметрический мониторинг состояния хроматина 54 и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, клеток перитонеального экссудата

2.2.3.5. Определение напряженности иммунитета

2.2.4. Статистические методы

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СЕРОТОНИНА НА СКОРОСТЬ РОСТА,

ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО КЛЕТОЧНОМУ ЦИКЛУ (СОДЕРЖАНИЕ ДНК), МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЧУМНОГО МИКРОБА В УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПЛОТНЫХ И ЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

3.1. Влияние серотонина на динамику роста, морфометрические 57 показатели У. реяИз ЕУ НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом на плотных и жидких питательных средах в условиях культивирования при 28 °С и 37 °С

3.2. Проточно-цитофлуориметрический мониторинг относительного 67 содержания ДНК в клетках У. резШ ЕУ НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом в условиях культивирования при 37 °С на питательных средах в присутствии серотонина

3.3. Изучение возможности применения серотонина для выделения 73 чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного посторонней микрофлорой

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА НА ЭКСПРЕССИЮ

ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ БЕЛКОВ Y. PESTIS С РАЗЛИЧНЫМ ПЛАЗМИДНЫМ СОСТАВОМ

4.1. Изучение влияния серотонина на экспрессию поверхностных 79 антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена) клетками Y. pestis EV НИИЭГ и его изогенного производного Y. pestis КМ216 (pPst+) в процессе культивирования в жидкой питательной среде

4.2. Изучение влияния культивирования на питательных средах с 84 серотонином на электрофоретический профиль белков Y. pestis

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА НА РАЗВИТИЕ

ИНДУЦИРОВАННОГО ИЕРСИНИЯМИ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК IN VITRO

5.1. Изучение in vitro модулирующего действия серотонина на 91 развитие индуцированного Y. pestis апоптоза и пролиферацию лейкоцитов крови биомодели (мыши BALB/c)

5.2. Изучение в модельной системе in vitro влияния серотонина на 93 развитие индуцированного Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.enterocolitica апоптоза и пролиферацию лейкоцитов крови человека

ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ IN VIVO ВЛИЯНИЯ СЕРОТОНИНА НА

ПРОЦЕССЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА, РЕАКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ИММУ НО ФАГОЦИТАРНОЙ СИСТЕМЫ БИОМОДЕЛЕЙ В УСЛОВИЯХ ВАКЦИНАЦИИ Y. PESTIS EV НИИЭГ, КАПСУЛЬНЫМ АНТИГЕНОМ ЧУМНОГО МИКРОБА

6.1. Изучение in vivo влияния серотонина на процессы 104 пролиферации и апоптоза эукариотических клеток в условиях вакцинации Y. pestis EV НИИЭГ

6.2. Влияние серотонина на состояние ядерного хроматина и 108 лизосомального аппарата иммунокомпетентных клеток биомоделей в условиях иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ

6.3. Изучение влияния серотонина на состояние ядерного 112 хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, клеток перитонеального экссудата экспериментальных животных в условиях иммунизации капсульным антигеном чумного микроба

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние серотонина на свойства возбудителя чумы, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Существование на территории России и многих стран мира природных очагов чумы, а также угроза применения возбудителя чумы в качестве агента биотерроризма диктуют необходимость углубленных исследований иммунопатогенеза чумной инфекции с целью создания современных, надежных средств и методов её диагностики, лечения и профилактики [Онищенко Г.Г. и др., 2004, 2006; Clarke R.A., 1999, Richard J.L., Grimes D.E., 2008].

Инфекция является одной из форм взаимодействия микро- и макроорганизма с нарушением биологического баланса в сторону усиления влияния микроорганизмов, начальные этапы механизма развития которой состоят из внедрения возбудителя, его размножения и распространения за пределы первичного очага, инициации и реализации защитных реакций организма хозяина, таких как фагоцитоз, воспаление, апоптоз, формирование адаптивного иммунитета [Зигангирова H.A., Гинцбург A.JL, 2004; Медуницын Н.В., 2004; Симбирцев A.C., 2005].

До настоящего времени исследование фундаментальных и прикладных аспектов нейроэндокринной регуляции различных функций животных и человека в процессе адаптации к меняющимся условиям жизнедеятельности макроорганизма, в том числе в условиях инфекционного и вакцинального процесса, было направлено на изучение их роли и значимости в обеспечении функционирования жизненно важных систем многоклеточного организма, включая систему защиты от патогенов (естественный и адаптивный иммунитет). Вопрос о том, что патогенные микроорганизмы могут непосредственно реагировать на нейроэндокринное окружение организма хозяина и использовать для ускорения своего развития продуцируемые макроорганизмом в ходе защитной реакции биологически активные вещества (биогенные амины - нейромедиаторы, нейрогормоны) ранее практически не рассматривался.

Установлено, что бактерии имеют фрагменты молекул, аналогичные связывающим сайтам некоторых естественных физиологически активных веществ организма хозяина, таких как инсулин, гонадотропин, кальмодулин. Белки Escherichia coli и Yersinia enterocolitica перекрестно реагируют с тиреотропином. Выявлен стимулирующий эффект стрессорных гормонов на рост патогенных штаммов Е. coli и синтез адгезина К99, шига-подобных токсинов I и II, показана зависимость транскрипции генов, кодирующих секрецию III типа и синтез флагелл у энтерогеморрагичсских и энтеротоксигенных Е. coli от эпинефрина (адреналина) й норэпинефрина (норадреналина), синтезируемых в клетках хозяина [Пинчук Л.М.,1992; Lyte М. et al., 1997; Burton C.L. et al., 2002; Visidou I. et al., 2004; O'Donnell P.M. et al., 2006].

Серотонин является нейромедиатором, медиатором воспаления и аллергических реакций, обладает выраженным иммуномодулирующим действием, является одним из компонентов сосудисто-тромбоцитарного гемостаза [СидоркинаА.Н. и др., 2005; Щуковская Т.Н., 2008]. В организме серотонин присутствует во всех иммунокомпетентных тканях, ЦНС, селезенке, печени, почках. В тромбоцитах серотонин накапливается при их прохождении по сосудам желудочно-кишечного тракта, в энтерохромафинных . клетках которого синтезируется [Стручко Г.Ю., 1997; Симоненков А.П., Федоров В.Д., 2002; Hellstrand К., Hermodsson S„ 1987; Sternberg Е.М. et al., 1987; Kvetnoy I.M., 2002].

В отечественной и зарубежной литературе имеются сведения о взаимодействии серотонина с аппаратом клеточного деления, способности серотонина комплексировать с ДНК про- и эукариот, с нуклеозидами и нуклеотидами, ингибировать процессы перекисного окисления липидов в клеточных мембранах, непосредственно взаимодействуя с перекисными радикалами [Бурлакова Е.Б. и др., 1992; Helene С. et al., 1971].

Установлено, что серотонин ускоряет рост культур Е. coli, Rhodospirillum rubrum, Candida guilliermondii, Streptococcus faecalis, вызывая сокращение лаг-фазы, стимулирует формирование биопленки у Е. coli и плодовых тел у миксобактерий [Страховская М.Г. и др., 1991, 1993; Олескин A.B. и др., 1998(6)]. Комбинация антибиотиков с психотропными препаратами - селективными ингибиторами транспорта серотонина через ионный канал, приводит к появлению чувствительности у полиантибиотикорезистентных штаммов [Munoz-Bellido J.L. et al., 2000].

Как известно, особенностью течения инфекционного процесса при чуме является расстройство гемостаза, проявляющееся в виде диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдрома), важное значение в развитии которого имеет агрегация тромбоцитов, активным инициатором которой является серотонин, а также продуцируемый чумным микробом активатор плазминогена (Pia protease), синтез которого детерминируется плазмидой пестициногенности. Активатор плазминогена является видоспецифическим антигеном, имеющим диагностическую значимость, а также специфическим поверхностным рецептором клеток чумного микроба к фибриногену [Дятлов И.А., Филиппов А.Ф., 1990; Понукалина Е.В., 1990; Захаров A.B., 1991; Кутырев В.В., 1992; Perry R.D., Fetherston J.D., 1997].

Zychlinsky A., 1999; DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005; Marketon M.M. et al., 2005; Parrino S. et al., 2007]. Механизмы индукции апоптоза представителями рода Yersinia находятся на стадии исследования [Fields К., Straley S.,1999; Weinrauch Y. et al., 2002; Zhang Y., Bliska J.D., 2003]. Не изучено in vitro и in vivo влияние биогенных аминов, в том числе серотонина, на развитие индуцированного Y. pestis и другими представителями рода Yersinia (Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis) апоптоза эукариотических клеток.

Также отсутствуют сведения о возможном влиянии серотонина, присутствующего в месте проникновения чумного микроба в организм хозяина, на размножение клеток Y. pestis, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), профиль синтезируемых им белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), патогенные и иммуногенные свойства чумного микроба, способствующих поддержанию оптимальных условий развития инфекции.

На данный момент также отсутствуют какие-либо сведения о возможности применения серотонина в схеме лабораторной диагностики чумы для повышения эффективности выделения возбудителя чумы из исследуемого материала как контаминированном, так и не контаминированном сопутствующей микрофлорой.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучить влияние серотонина на рост, электрофоретический профиль белков, экспрессию поверхностных антигенов чумного микроба, а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. Изучить влияние ееротонина на экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена) и электрофоретический профиль белков 7. pestis с различным плазмидным составом в условиях культивирования на питательных средах.

4. Провести сравнительный анализ влияния ееротонина на развитие индуцированного Y. pestis и другими представителями рода Yersinia {Y.pseudotuberculosis, Y. enterocolitica,) апоптоза лейкоцитов крови человека в модельной системе in vitro.

5. С применением проточной цитофлуориметрии изучить in vivo влияние ееротонина на процессы апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов биомодели (мыши BALB/c, нелинейные белые мыши) в условиях иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, а таюке различными препаратами капсульного антигена чумного микроба Ф1.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлено, что серотонин стимулирует накопление биомассы Y pestis EV НИИЭГ и бесплазмидного штамма Y pestis КМ218 на ранних стадиях развития культур, индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК-флуоресценцией для 7. pestis EV НИИЭГ в 2 раза, для Y. pestis КМ218 -в 1,8 раза.

Получены новые сведения о влиянии ееротонина на выделение чумного микроба из исследуемого материала, контаминированного посторонней микрофлорой. Показана эффективность применения ееротонина на начальном этапе бактериологического исследования на чуму. С применением ееротонина разработан способ выделения 7. pestis бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, позволяющий сократить до 24 ч сроки биологического накопления возбудителя чумы и увеличить число колониеобразующих единиц чумного микроба. Новизна исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (варианты)» положительное решение на выдачу патента от 16 октября 2008 г. по заявке №2007142840/13(046910), приоритет от 19.11.2007).

Показано влияние ееротонина на экспрессию видоспецифических антигенов чумного микроба (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), детектируемых с помощью коммерческих препаратов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных. Обнаружено увеличение процентного содержания клеток с повышенной интенсивностью свечения.

Впервые выявлен ингибирующий эффект ееротонина на синтез чумным микробом полипептида с молекулярной массой 22 кДа, участвующего в формировании поверхностного заряда клетокипроявлении адгезивных свойств, в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 °С в течение 24 ч.

Впервые in vitro и in vivo с применением проточно-цитофлуориметрического метода цитологического анализа установлено непосредственное участие ееротонина в механизмах модуляции индуцированного Y. pestis и капсульным антигеном чумного микроба (Ф1) апоптоза, изменений состояния ядерного хроматина и лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальпых макрофагов биомодели. Серотонин в концентрации 10 -5 М в первые 6 ч замедляет in vitro развитие индуцированного Y pestis апоптоза лейкоцитов крови интактных биомоделей, что создает благоприятные условия для роста и размножения чумного микроба в организме хозяина и связано с влиянием антигенов, синтезируемых при 37 °С, в первую очередь капсульного антигена (Ф1). В иммунном организме модулирующее действие ееротонина проявляется лишь через 24 ч и имеет противоположную направленность.

Впервые получены новые данные о влиянии биогенного амина ееротонина на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocoliticd). Серотонин оказывает модулирующее действие на распределение лейкоцитов по клеточному циклу, изменяя соотношение в крови клеток, находящихся на стадиях апоптоза и пролиферации. Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Организация работы и обеззараживание материала, содержащего возбудитель чумы при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии», которые одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 6 от 12.12.2008 г) и утверждены директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Разработанный нами «Способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (варианты)» (положительное решение на выдачу патента от 16 октября 2008 г. по заявке № 2007142840/13(046910), приоритет от 19.11.2007 г.) внедрен в работу специализированной лаборатории препаратов против чумы и др. ООИ ГИСК им. JI.A. Тарасевича (акт внедрения патента в НД утвержден директором ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича академиком Н.В. Медуницыным от 26.11.2008).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Биогенный амин серотонин в концентрации 10"5 М оказывает стимулирующее влияние на рост чумного микроба на стандартно используемых для его культивирования жидких и плотных питательных средах [бульон и агар Хоттингера рН 7,2; агар Хоттингера рН 7,2, содержащий лизированную кровь (1%) и генцианвиолет (1:100000-1:200000)], индуцирует, по данным проточной цитофлуориметрии, увеличение числа клеток с интенсивной ДНК-флуоресценцией.

2. С применением серотонина разработан способ выделения Г. pest is бактериологическим методом из исследуемого материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включая объекты внешней среды, который позволяет увеличить число КОЕ чумного микроба в 1,5-5,5 раза и значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы из нативного материала.

3. Выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа клетками Y. pestis ЕV НИИЭГ, Y. pestis КМ218 и Y.pestis КМ216 в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2 при 28 °С в течение 24 ч.

4. В модельной системе in vitro серотонин в концентрации 10"5 М оказывает модулирующее действие на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y. pestis, Y.pseudotuberculosis, Y enterocolitica). Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.

5. Установлено, что примирование серотонином биомоделей (мыши BALB/c, нелинейные белые мыши) до иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ, различными препаратами капсульного антигена чумного микроба (Ф1) влияет на характер развития процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина, лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов, интенсивность и направленность которых зависят от вида иммунизирующего препарата.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Исследования проведены в рамках плановых НИР: 006-3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных методов оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» (№ госрегистрации 01.200.11150); 019-3-03 «Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro» (№ госрегистрации 01.2.00306526); НИР «Изучение роли биомолекул возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» (2004 г.), являвшейся составной частью научно-исследовательской работы «Изучение роли биомолекул возбудителей опасных инфекционных заболеваний в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» (ОФИ-6), выполнявшейся в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, Блок I «Ориентированные фундаментальные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защита от патогенов» (Договор № 105-3/04 от 05.11.04 г. к госконтракту № 01.035.11.1535 от 05.11.04г.).

Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на: Международных конференциях «Saratov Fall Meeting: Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine IY» (Саратов, 2002-2003); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI век» (28-30 сентября 2004 г., Саратов); на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (26-27 апреля 2007 г., Москва); на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (25-26 сентября 2007 г., Саратов); IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества независимых Государств» (30 сентября-2 октября 2008 г, Волгоград); научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2003-2008).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 15 работ, их них статей в рекомендованных ВАК изданиях - 4.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 147 отечественных и 150 зарубежных источников. Объем диссертации составляет 159 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 11 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Клюева, Светлана Николаевна

выводы

1. Биогенный амин серотонин в концентрации 10"5 М оказывает стимулирующее влияние на рост чумного микроба на стандартно используемых для его культивирования жидких и плотных питательных средах (бульон и агар Хотгингера рН 7,2; агар Хоттингера рН 7,2 с лизированной кровью и генцианвиолетом), не оказывая при этом значимого влияния на тинкториальные, культурально-морфологические свойства и морфометрические показатели чумного микроба.

3. Биогенный амин серотонин в концентрации индуцирует по данным проточной цитофлуориметрии увеличение числа клеток с интенсивной ДНК-флуоресценцией, оказывает влияние на экспрессию видоспецифических антигенов чумного микроба (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), детектируемых с помощью коммерческих препаратов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных адсорбированных, в сторону ее усиления.

4. Выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида с молекулярной массой 22 кДа клетками Y. pestis EV НИИЭГ (pFra+, pCad+, pPst+) и его изогенных производных Y. pestis КМ218 (pFra", pCad", pPst"), Y. pestis KM216 (pFra", pCad", pPst+) в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7.2 при 28 °С в течение 24 ч.

5. Серотонин в концентрации 10"5 М оказывает различной степени влияние на индуцируемый Yersinia spp. апоптоз лейкоцитов крови in vitro. Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара. Серотонин ингибирует развитие раннего (через 6 ч) апоптоза лейкоцитов крови человека под действием близкородственных бактерий Y. pestis и Y. pseudotuberculosis I серовара,

6. Установлено, что примирование серотоннном биомоделей (мыши ВАЬВ/с, нелинейные белые мыши) до иммунизации У резйз ЕУ НИИЭГ, различными препаратами капсульного антигена чумного микроба (Ф1) влияет на характер развития процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток, состояние ядерного хроматина, лизосомального аппарата лейкоцитов крови, перитонеальных макрофагов, интенсивность и направленность которых зависят от вида иммунизирующего препарата.

7. Полученные новые сведения о влиянии серотонина на рост У резИя, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), электрофоретический профиль белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток организма хозяина свидетельствуют о реальной возможности использования возбудителем чумы биогенного амина серотонина, являющегося компонентом микроокружения в месте входных ворот чумной инфекции, для создания условий, направленных на ускорение адаптации его к внутренней среде организма хозяина и способности противостоять системе антиинфекционной защиты макроорганизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема взаимодействия возбудителей особо опасных инфекций с организмом хозяина, связанная с адаптацией, способностью бактериального агента противостоять защитным системам макроорганизма, реализацией патогенных свойств далека от своего окончательного решения и остается актуальной на настоящий момент.

В последние годы интенсифицировались исследования по изучению триггерных молекулярных механизмов взаимодействия патогена с организмом хозяина, в том числе возможности использования микроорганизмами эндогенных биологически активных веществ макроорганизма для ускорения собственного развития. Формируется новое междисциплинарное направление - микробная эндокринология, изучающее фундаментальные и прикладные аспекты нейроэндокринной регуляции взаимодействия про- и эукариот [Олескин A.B. и др., 2000; Стадников A.A. и др., 2002; Lyte М., 2004; Voigt W. et al., 2006]

Установлено, что бактерии имеют фрагменты молекул, аналогичные связывающим сайтам некоторых естественных физиологически активных веществ хозяина. У E.coli, N. gonorrhoeae, Y. enterocolitica, Shigella, S. aureus обнаружены белки, имитирующие инсулин, гонадотропин, кальмодулин. Белки Е. coli и Y. enterocolitica перекрестно реагируют с тиреотропином [Пинчук Л.М.,1992]. Получены свидетельства наличия на клеточной поверхности прокариот рецепторных структур, связывающих биогенные амины - нейрогормоны [Freestone P.P.et al., 2007].

Исследованиями последних лет выявлен стимулирующий эффект норадреналина на рост патогенных штаммов E.coli и синтез адгезина К99, шига-подобных токсинов I и II, показана зависимость транскрипции генов, кодирующих секрецию III типа и синтез флагелл у энтерогеморрагических и энтеротоксигенных Е. coli от адреналина и норадреналина, синтезируемых в клетках хозяина [Burton C.L. et al., 2002; Visidou I. et al., 2004; O'Donnell P.M. et al., 2006]. Показано избирательное повышение адгезии патогенных Е. coli 0157:Н7 под действием норадреналина [Green В.Т. et al., 2004] и уровня экспрессии фактора вирулентности Р. aeruginosa РА-1 [Alverdy J. et al., 2000]. Катехоламины, в частности норадреналин, способны влиять на процесс захвата Е. coli, К. pneumonia, Р. aeruginosa, E. cloacae,. S. sonnei, S. aureus, B.bronchiseptica, B. pertussis ионов железа из трансферрина и лактоферрина [Freestone P.P.et al., 2002, 2003; Anderson M.T., Armstrong SA., 2006; O'Donnell P.M. et al., 2006], на интенсивность процесса, образования биопленок бактериями [Lyte М. et al., 2003]: Обнаружено существование перекрестной связи между luxS/А1-2 бактериальной> QS (кворум сенсинг) и адренергической (адреналин/норадреналин) системой организма хозяина [Sperandio V et al-, 2003; Clarke M.B et al., 2006].

Проведенный анализ/отечественной и зарубежной литературы показал, что исследования, связанные с изучением роли биогенных аминов организма хозяина в регуляции жизнедеятельности прокариот, ориентированы преимущественно на стрессорные гормоны, такие как. норадреналин; адреналин, дофамин; что обусловлено первоочередностью применения в качестве объекта исследования энтеропатогенных бактерий и особенностью иннервации желудочно-кишечного тракта, являющегося входными воротами для кишечных инфекций.

В; настоящее время; имеются лишь единичные сообщения о возможности использования микроорганизмами в своей жизнедеятельности и для обеспечения ускоренного развития других, не менее важных биологически активных веществ, продуцируемых организмом- хозяина, таких как биогенный амин-нейромедиатор серотонин, выполняющий у живых организмов многообразные функции и являющийся эволюционно консервативным агентом;

Серотонин (5-окситриптамин) принадлежит к группе биогенных аминов: азотистых оснований; возникающих в организме при декарбоксилировании аминокислот и обладающих чрезвычайно сильной активностью, благодаря высокой способности их к конформационным изменениям^ к соединению с макромолекулами, к переносу электронов и протонов [Белжеларская С.Н., Саттон Ф., 2003].

Биогенный; амин серотонин является нейромедиатором, медиатором воспаления и аллергических реакций, обладает выраженным иммуномодулирующим действием, является одним из компонентов сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, способен комплексировать с ДНК про- и эукариот, с нуклеозидами и нуклеотидами, ингибировать процессы перекисного окисления липидов в клеточных мембранах, непосредственно взаимодействуя с перекисными радикалами [Ноздрачев А.Д., Пушкарев Ю.П., 1980; Бурлакова Е.Б. и др., 1992; Щуковская Т.Н. и др., 1999; 2008; Helene С. et al., 1971].

Известно, что серотонин ускоряет рост культур Е. coli, Rsp. rubrum, С. guilliermondii, S. faecalis, вызывая сокращение лаг-фазы, стимулирует формирование биопленки у Е. coli и плодовых тел у миксобактерий [Страховская М.Г., Иванова Э.В., Фрайкин Г.Я., 1993; Олескин A.B. и др., 1998].

На данный момент отсутствуют сведения о потенциальном влиянии серотонина, высвобождаемого тромбоцитами и клетками нейроэндокринного микроокружения в месте проникновения чумного микроба в организм хозяина, на размножение клеток Y. pestis, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), культурально-морфологические характеристики чумного микроба, профиль синтезируемых им белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена). Отсутствует какая-либо информация о возможности применения серотонина в схеме лабораторной диагностики чумы для повышения эффективности выделения возбудителя чумы из исследуемого материала, как контаминированного, так и не контаминированного сопутствующей микрофлорой.

Интегральным показателем, характеризующим изменения эукариотических клеток под воздействием инфекционного агента является соотношение количества клеток на разных стадиях клеточного цикла, включая стадию их запрограммированной гибели (апоптоз). Активация процессов апоптоза происходит под действием факторов вирулентности патогенных микроорганизмов и приводит к элиминации ключевых, обладающих защитными функциями, клеток организма хозяина, таких как лимфоциты, моноциты, нейтрофилы [Weinrauch I., Zychlinsky А., 1999; DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005; Marketon M.M. et al., 2005; Parrino S. et al., 2007]. Механизмы индукции апоптоза представителями рода Yersinia находятся на стадии исследования [Fields К., Straley S.,1999; Weinrauch Y. et al., 2002; Zhang Y., Bliska J.D., 2003]. Не изучен механизм модулирующего действия биогенных аминов, в том числе серотонина, на развитие апоптоза под влиянием патогенных иерсиний, а также пролиферацию иммунокомпетентных клеток в условиях иммунобиологической перестройки, вакцинированного против чумы макроорганизма.

В этой связи целью настоящего исследования явилось изучение влияния серотонина на рост, электрофоретический профиль белков, экспрессию поверхностных антигенов чумного микроба, а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток.

Нами проведено исследование влияния серотонина на динамику роста, морфометрические показатели У. реяШ ЕУ НИИЭГ и его изогенных производных с различным плазмидным составом на плотных и жидких питательных средах в условиях культивирования при 28 °С и 37 °С.

Добавление серотонина в различных концентрациях в жидкую среду культивирования (бульон Хотгингера рН 7,2) оказывало непосредственное влияние на количественные показатели интенсивности роста чумного микроба. Выявлена зависимость роста У. рея Их ЕУ (рРга+, рСасГ, рРэГ) при 28 °С от концентрации добавленного в среду культивирования серотонина. Наличие экзогенного с I л серотонина в жидкой среде культивирования в концентрации 10" М, 10" М, 10" М более чем в 2 раза увеличивало количество микробных клеток на начальном этапе о 7 А выращивания. Низкие концентрации серотонина (10" М, 10" М, 10" М) в аналогичных условиях не обладали стимулирующим действием и оказывали противоположный эффект на рост чумного микроба.

Для дальнейших исследований была выбрана концентрация серотонина 10"5 М, обладающая стимулирующим действием на рост чумного микроба и соответствующая физиологическим концентрациям серотонина, освобождающимся при разрушении и агрегации тромбоцитов в очаге воспаления, что соответствует обычно 10"6 - 10"5 М [Тагшг Н. ^ а1.,1983; ОегеЬоп МХ>., Тагшг Н., 1984].

Нами было установлено, что выращивание У реяНх ЕУ в бульоне Хоттингера рН 7,2 в присутствии 10"5 М серотонина как при 28 °С, так и при 37 °С обеспечивало более интенсивное по сравнению с контролем накопление клеточной биомассы У реяШ ЕУ в течение 23-24 ч. В более поздние сроки наблюдения (28 ч, 47 ч, 51 ч) ростостимулирующий эффект серотонина проявлялся только в условиях инкубирования посевов при 37 °С.

При культивировании штамма У реяНя ЕУ (рРга+, рСас1+, рРэ^) с полным набором плазмид и изогенного бесплазмидного штамма У. ре$И$ КМ218 (рРга", рСасГ, рРэГ) в бульоне Хоттингера рН 7,2 при температуре 28 °С наличие экзогенного ееротонина в концентрации 10"5 М приводило к увеличению количества микробных клеток на начальном этапе выращивания для обоих штаммов, что свидетельствовало о независимости стимулирующего действия ееротонина от плазмидного состава клеток чумного микроба.

В ходе проведенных нами исследований установлено, что биогенный амин серотонин в концентрации 10'5 М оказывает стимулирующее действие на рост чумного микроба в условиях культивирования на плотных питательных средах, применяемых при стандартном бактериологическом методе исследования на чуму (агар Хоттингера pH 7,2, агар Хоттингера pH 7,2 с лизированной кровью и генцианвиолетом).

Аналогичные результаты получены нами при изучении влияния ееротонина на рост чумного микроба в смешанной культуре. Ростостимулирующий эффект ееротонина проявлялся одинаково как при нанесении раствора ееротонина на поверхность агара, так и при внесении его в смешанную взвесь клеток Y. pestis EV, S. aureus, Е. coli за 30 мин до посева на плотную питательную среду. Серотонин (10"5 М) оказывал также стимулирующее действие и на рост Е. coli, что согласуется с данными A.B. Олескина с соавторами (1998), однако сам эффект выражен намного слабее по сравнению с его действием на чумной микроб (уровень стимуляции роста по сравнению с контролем - 25 % у Е. coli, против - 120 % у Y.pestis; число КОЕ в контроле принято за 100 %).

На примере искусственно инфицированной Y. pestis природной почвы, нами установлено, что обработка серотонином перед посевом либо исследуемого материала, либо агаровых пластин позволяет значительно сократить (до 24 ч) сроки биологического накопления возбудителя чумы и увеличить в 3-5 раз число колониеобразующих единиц чумного микроба. С применением серотонина нами разработан способ выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала (положительное решение о выдаче патента на изобретение от 16 декабря 2008 г. по заявке №2007142840, приоритет от 19.11.2007), который не требует больших материальных затрат и дорогостоящего оборудования, легко воспроизводим и может быть реализован как в стационарных, так и полевых условиях.

По данным Н.В. Бреневой с соавторами (2007) адаптация Y. pestis к длительному персистированию в окружающей среде выражается в образовании некультивируемых форм (НФ). В эксперименте для реверсии НФ чумного микроба в вегетативную форму ими был использован метод, основанный на добавлении в бульон Хоттингера и казеиново-дрожжевой агар 10 % фетальной сыворотки, которая также является обязательным стимулирующим пролиферацию компонентом среды для культивирования эукариотических клеток. Зарубежными исследователями установлено, что 10 % фетальная сыворотка, добавляемая в среду для культивирования клеток, содержит 2,4><10"6 М серотонина, способного к проявлению своих модулирующих свойств, а его селективное удаление приводит к их ингибированию [Sternberg Е.М. et al., 1986]. В этой связи разработанный нами способ имеет перспективу применения для выделения некультивируемых форм Y. pestis.

В настоящее время установлено, что серотонин способен образовывать комплексы с ДНК бактериальных клеток за счет связывания индольного кольца с основаниями ДНК [Helene С. et al., 1971], что, по-видимому, может также оказывать влияние и на процессы, связанные с изменением относительного содержания ДНК.

Нами обнаружено, что обработка взвеси клеток Y. pestis EV серотонином в конечной концентрации 10"5 М в течение 30 мин при комнатной температуре приводит к достоверному двукратному увеличению доли клеток с повышенным содержанием ДНК, регистрируемой методом проточной цитометрии. Ранее А.В. Олескиным с соавторами (1998) было отмечено, что ростостимулирующий эффект серотонина на Е. coli, Rsp. rubrum не зависел от того, добавляли ли серотонин однократно в момент посева культуры или вносили многократно. По-видимому, биогенный амин серотонин действует на определенный «пусковой механизм», инициируемый на ранней стадии развития культуры.

Проведенный нами впервые проточно-цитофлуориметрический мониторинг относительного содержания ДНК в клетках У реъИз ЕУ НИИЭГ и его изогенных производных с различным, плазмидным составом в условиях культивирования при 37 °С на питательных средах в присутствии серотонина также показал наличие активационного воздействия серотонина на генетический аппарат клеток чумного микроба.

С применением проточно-цитофлуориметрического анализа нами установлена возможность влияния серотонина на экспрессию видоспецифических антигенов чумного микроба (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), детектируемых с помощью коммерческих препаратов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумиых адсорбированных, в сторону ее усиления. Обнаружено увеличение процентного содержания клеток с повышенной интенсивностью свечения. , I

Нами впервые выявлен ингибирующий эффект серотонина на синтез чумным микробом, независимо от плазмидного состава, полипептида с молекулярной массой 22 кДа в условиях культивирования на агаре Хоттингера рН 7,2, агаре Хоттингера рН 7,2 с лизированной кровью при 28 °С в течение 24 ч.

Согласно исследованиям С.П. Задновой (1998), выделенный из клеток , штамма У реяШ ЕУ белок с молекулярной массой 22 кДа принимает участие в формировании поверхностного заряда клеток, проявлении адгезивных свойств и рассматривается как дополнительный фактор, обеспечивающий контакт патогена с клетками макроорганизма. Утрата полипептида 22 кДа клетками У реяШ ЕУ ведет к снижению захвата и поглощения их макрофагами, обусловливает картину незавершенного фагоцитоза. Выявленный нами ингибирующий эффект серотонина на синтез полипептида" с молекулярной массой 22 кДа имеет, по-видимому, немаловажное значение для адаптации и реализации патогенного потенциала чумного микроба на начальных этапах инфекционного процесса.

Не исключено также, что данный эффект может быть реализован в условиях биопленки У. реБйз в блохах, так как клетки чумного микроба, выделенные из биопленки, обладают повышенной резистентностью к фагоцитозу полиморфноядерными лейкоцитами крови человека именно на стадии захвата, а внеклеточный матрикс, образующий оболочку биопленки Y pestis, включает форменные элементы поглощенной блохой крови, в состав которых входят тромбоциты, депонирующие серотонин. Вследствие разрушения и агрегации тромбоцитов происходит высвобождение серотонина, способного к реализации своего модулирующего действия. В пользу высказанного предположения свидетельствует также факт отсутствия продукции чумным микробом при нахождении в блохе таких антифагоцитарных факторов, как капсульный антиген Ф1 и секретируемые белки Yop [Jarret С.О. et al., 2004].

Серотонин в концентрации 10"5 M в первые 6 ч замедляет in vitro развитие индуцированного Y. pestis апоптоза лейкоцитов крови интактных биомоделей, что создает благоприятные условия для роста и размножения чумного микроба в организме хозяина и связано с влиянием антигенов, синтезируемых при 37 °С, в первую очередь капсульного антигена (Ф1). В иммунном организме модулирующее действие серотонина проявляется лишь через 24 ч и имеет противоположную направленность.

Примирование серотонином биомодельных животных за 30 мин до их иммунизации Y pestis EV вызывает достоверное повышение пролиферативной активности лейкоцитов крови и спленоцитов на ранней стадии вакцинального процесса (1-е сутки). Следует отметить, что в центральном органе иммунной системы тимусе, доля пролиферирующих тимоцитов под воздействием серотонина снижалась на 7-е сутки иммуногенеза на фоне повышенного количества гиподиплоидных клеток (< 2С ДНК). По-видимому, под влиянием серотонина происходит повышение интенсивности отрицательной клональной селекции Т-клеток в ответ на иммунизацию Y pestis ЕV, что согласуется с данными Л.С. Елисеевой (1984) о выраженном модулирующем действии серотонина на Т-клеточное звено иммунитета и изменение соотношения Т- и В^лимфоцитов в сторону увеличения последних.

Нами впервые с применением проточной цитофлуориметрии в модельной системе in vitro получены новые данные о влиянии биогенного амина серотонина на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного различными представителями рода Yersinia (Y.pestis, Y. pseudotuberculosis, Y.enterocolitica).

Установлено, что серотонин замедляет in vitro развитие раннего (через 6 ч) и стимулирует проявление позднего (через 24 ч) апоптоза лейкоцитов крови человека в ответ на клетки вакцинного штамма Y. pestis ЕV НИИЭГ, выращенные при 28 °С. Серотонин в 2 раза снижал интенсивность раннего апоптоза лейкоцитов крови человека в ответ на клетки Y. pseudotuberculosis I серовара независимо от температуры их выращивания, и не оказывал достоверного воздействия на развитие раннего и позднего апоптоза, индуцированного Y. pseudotuberculosis IV серовара. Зарегистрировано более чем в 2 раза увеличение под влиянием серотонина интенсивности развития позднего апоптоза лейкоцитов крови человека, индуцированного клетками штамма Y. enterocolitica 383 09 серовара, лишенного плазмиды кальцийзависимости.

Экспрессируемые иерсиниями белки Yop, синтез которых детерминируется плазмидой кальцийзависимости (YopP у Y. enterocolitica и его анаолог YopJ у Y.pestis и Y. pseudotuberculosis), участвуют в управлении процессами апоптоза эукариотической клетки. Эти белки транспортируются в цитоплазму клетки хозяина при участии системы секреции III типа, где связывают и ингибируют 1КК/?-каталитическую субъединицу 1КК/?-киназного комплекса, блокируя тем самым сигнальный путь, ответственный за координацию активации ядерного фактора транскрипции NF-кВ и играющий центральную роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как воспаление, иммунный ответ, дифференциация, пролиферация и апоптоз [Zhang Y., 2003]. Индукция апоптоза моноцитов, макрофагов консервативными компонентами иерсиний (ЛПС, липопротеины) осуществляется через То11-подобные рецепторы (TLR), соответственно через TLR-4 и TLR-2 [Ruckdeschel К., 2004]. У людей при моделировании эндотоксинового шока (внутривенное введение референс препарата эндотоксина добровольцам) выявлено в цельной крови шестикратное усиление экспрессии TLR-4 на моноцитах через 6 ч после стимуляции ЛПС на фоне моноцитопении, в то время как значительное увеличение экспрессии TLR-4 на гранулоцитах регистрировалось только через 24 ч [Wittbole X., 2005]. Продуцируемые моноцитами цитокины (ИЛ-1, ГМ-КСФ), а также ИЛ-8, образуемый гранулоцитами в первые часы после стимуляции ЛПС, запуск синтеза которых осуществляется через TLR-4, обладают антиапоптозным действием и обеспечивают тем самым сохранение жизнеспособности гранулярных лейкоцитов на раннем этапе (4-6 ч) после контакта их с бактериальными патогенами [Sabroe I., 2002]. По-видимому, этим объясняется наблюдаемое как в нашей работе, так и в исследованиях других авторов [Шмелькова Т.П., 2007] развитие позднего апоптоза лейкоцитов крови человека под действием У. pestis и Y. pseudotuberculosis I серовара, относящихся к одной эволюционной линии и вызывающих заболевания, часто сопровождающиеся острым течением инфекции [Гаева А.В., 2002]. Физиологические концентрации серотонина, освобождающиеся при разрушении и агрегации тромбоцитов в очаге воспаления, обычно это 10~8-10"5 М [Gershon M.D., 1984], могут быть достаточны для оказания модулирующего действия на развитие апоптоза эукариотических клеток, запускаемого патогенными иерсиниями. Как показали результаты нашего исследования, серотонин в концентрации 10"5 М оказывает в условиях in vitro различной степени влияние на апоптоз лейкоцитов, индуцируемый в крови человека представителями рода Yersinia spp. (7. pestis, Y.pseudotubercidosis, Y. enterocoliticd). Характер выявленных изменений зависит от вида иерсиний и их серовара.

Механизм модулирующего действия биогенного амина серотонина на развитие апоптоза под влиянием патогенных иерсиний может быть связан, с одной стороны, с изменением экспрессии поверхностных антигенов под влиянием серотонина, что было показано нами ранее на примере чумного микроба, а с другой - с интенсивностью выработки цитокинов лейкоцитами, изменением экспрессии молекул, участвующих в связывании лигандов TLR (таких как CD 14) и опосредующих эффекторные функции клеток (молекул адгезии, рецепторов хемокинов, костимуляторных молекул) [Хорева М.В., 2006]. Полученные новые сведения имеют важное значение для понимания патогенеза вызываемых Yersinia spp. инфекций и могут быть использованы при разработке новых подходов в их комплексной терапии.

Таким образом, полученные в результате проведенных исследований новые сведения о влиянии серотонина на рост Y. pestis, перераспределение по клеточному циклу (относительное содержание ДНК), электрофоретический профиль белков, экспрессию диагностически значимых поверхностных антигенов (капсульного антигена чумного микроба Ф1, активатора плазминогена), а также индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток организма хозяина, свидетельствуют о реальной возможности использования возбудителем чумы биогенного амина серотонина, являющего компонентом микроокружения в месте входных ворот чумной инфекции, для создания условий, направленных на ускорение адаптации его к внутренней среде организма хозяина и способности противостоять системе антиинфекционной защиты макроорганизма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клюева, Светлана Николаевна, Саратов

1. Абрамов В.В. Взаимозависимость функционирования иммунной и нервной систем // Успехи соврем, биологии. 1991. - Т. 111. - № 6. - С. 840 - 844.

2. Авакян О.М. Фармакологическая регуляция функции адренорецепторов / М.: Медицина, 1988. 256 с.

3. Адамов O.A. Показатели обмена медиаторов в процессе развития противочумного иммунитета / Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1982. - 19 с.

4. Адо А.Д. О нервной регуляции функций иммунокомпетентной системы // Взаимодействие нервной и иммунной систем: Тез. докл. V Всесоюзного симпозиума. Оренбург - Ленинград - Ростов-на-Дону. - 1990 г. - С. 59.

5. Атауллаханов Р.И., Кочина И.С. Наличие ß-адренорецепторов, функционально ассоциированных с аденилатциклазой, в мембране предшественников антителообразующих клеток // Иммунология. 1985. - № 3. -С. 13-16.

6. Афонина С.Н., Шалаева Г.В., Вовбас Е.И. Влияние эмоционально-болевого стресса на содержание биогенных аминов в лимфоцитах тимуса, селезенки и лимфоузлов // Стресс и иммунитет: Тез. докл. Всес. конф. «Стресс и иммунитет». Ростов-на-Дону, 1989.-С. 105.

7. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях / Л.: Медгиз, 1962. 180 с.

8. Бахтеева И.В., Кравченко Т.Б., Титарева Г.М., Иванов С.А. Взаимодействие pH 6 антигена Yersinia pestis с различными типами эукариотических клеток // Пробл. особо опасных инфекций. 2007. - Вып.2 (94). - С. 40 - 42.

9. Беклемишев Н.Д. Иммунопатология и иммунорегуляция (при инфекциях, инвазиях и аллергиях) / М.: Медицина, 1986. 256 с.

10. Белоконева О.С., Зайцев C.B. Роль мембранных липидов в регуляции функционирования рецепторов нейромедиаторов // Биохимия. 1993. - Т. 58. -№ 11.-С. 1685-1708.

11. Белжеларская С.Н., Сатгон Ф. Роль серотониновой системы в реакции различных клеток на стрессорные сигналы // Молекулярная биология. 2003. -Т. 37. -№3.~ С. 452 -457.

12. Бобылева Е.В. Клинико-лабораторный мониторинг за развитием повреждающего воздействия Staphylococcus aureus на лизосомальный и генетический аппараты лейкоцитов крови человека / Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2004. - 23 с.

13. Бренева Н.В., Марамович А.С., Климов В.Т. Клональная структура популяций Yersinia pestis в экспериментальных почвенных экосистемах // Журн. микробиол. 2007. - № 1.- С.12-16.

14. Бреслер С.Е., Васильева Н.Н., Казбеков Э.Н. и др. Комплексы с переносом заряда между рибофлавином и производными триптофана // Молекулярная биология. 1979. - Т. 4. - С.571 - 579.

15. Бугоркова С.А., Исупов И.В. Апуд-система кишечника животных при холерной инфекции, интоксикации и вакцинальном процессе / Ин-т «Микроб». -Саратов, 2000. 68 с. - Деп. в ВИНИТИ 09.11.2000. № 2825.

16. Бузников Г.А. Низкомолекулярные регуляторы зародышевого развития Текст. / М.: Наука, 1987. 230 с.

17. Бурлакова Е.Б. Влияние липидов мембран на ферментативную активность // Липиды. Структура, биосинтез, превращения и функции. М.: Наука. - 1977. -С. 16-27.

18. Бурлакова Е.Б., Губарева А.Е., Архипова Г.В., Рогинский В.А. Модуляция перекисного окисления липидов биогенными аминами в модельных системах // Вопр. мед. химии. 1992. - № 2. - С. 17 - 20.

19. Быкова А.А., Сединина Н.С. Состояние нейромедиаторной системы у участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. - № 3. - С. 17-18.

20. Бычковский В.Н. Об участии биологически активных веществ в патогенезе дизентерии // Сов. медицина. 1972. - Т. 35. - № 5. - С. 30 - 35.

21. Васильева Г.И. Роль взаимодействия Yersinia pestis с клетками системы мононуклеарных фагоцитов в реализации вакцинного и инфекционного процессов / Автореф. дис. . док. мед. наук. Саратов, 1990. - 40 с.

22. Васильева Г.И. Роль макрофагов в иммуногенезе чумы // Журн. микробиол. -1990. -№ 12.-С. 98- 104.

23. Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н. Гистамин в биохимии и физиологии / М.: Наука, 1981.-278 с.

24. Ветошкин А.В., Фоменко A.M., Зозуля А.А. Серотониновые рецепторы лимфоцитов: радиорецепторное исследование // Бюл. экспер. биол. и мед. 1982. -№ 7. - С. 52-53.

25. Видяева Н.А. Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis / Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1992. - 21 с.

26. Воробьева Л.И. Изучение роли биогенных аминов при вакцинации животных различными вариантами вакцины АКДС // Материалы Всесоюзн. конф., посвящ. 125-летию со дня рожд. И.И. Мечникова. М., 1972. - С. 29 - 30.

27. Гаева А.В., Видяева Н.А., Проценко О.А., Кутырев В.В. Особенности штаммов Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в различных природных очагах // Пробл. особо опасных инфекций. 2002. - Вып.1 (83). - С. 5 - 14.

28. Гончаренко Е.Н., Горская Т.Г., Капля С.А. и др. Роль эндогенных веществ в создании повышенной радиорезистенции // Радиобиология. 1980. - Т. 20, № 2. -С. 266-268.

29. Гончаренко Е.Н., Граевская Е.Э., Кудряшов Ю.Б. Мастоциты и радиорезистентность // Успехи современной биологии. 1994. - Т. 114. - С. 475 -481.

30. Гордон Д.С., Сергеева В.Е., Зеленова И.Г. Нейромедиаторы лимфоидных органов (Функциональная морфология) / Л.: Наука, 1982. 129 с.

31. Григорович Н.А., Алекса Т.Ф. Использование цитофлуоресцентных методов для идентификации лимфоцитов и макрофагов, оценки их функционального состояния // Иммунология. 1984. -№ 1. - С.10 - 15.

32. Гюлазян Н.М., Давтян Т.К., Пак С.Г. Индуцированный липополисахаридами апоптоз гранулоцитов периферической крови больных, перенесших сальмонеллезную инфекцию // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. - № 8. - С. 25 - 28.

33. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов / М.: Медицина, 1985. -224 с.

34. Девойно J1.B., Ильюченок Р.Ю. Моноаминергические системы в регуляции иммунных реакций (серотонин, дофамин) / Новосибирск: Наука, 1983. — 234 с.

35. Девойно Л.В., Морозова Н.Б. Участие клеток-супрессоров в угнетающем действии серотонина на иммуногенез // Журн. микробиол. 1979. - № 5. - С. 60 -63.

36. Деева Э.Г., Павловская Я.В., Киселев О.И. и др. Структурно-функциональный анализ биологической активности производных акридина // Вестник Российской АМН. 2004. - № 12. - С. 29 - 33.

37. Демьяненко C.B., Мишанькин М.Б., Мишанькин Б.Н. и др. Пирацетам в профилактике интоксикации, вызванной чумным микробом // Пробл. особо опасных инфекций. 2004. - Вып. 1 (87). - С.55 - 58.

38. Демьяненко C.B., Мишанькин М.Б., Мишанькин Б.Н., Водопьянов A.C. Изучение проницаемости гематоэнцефалического барьера при чумной инфекции методом полимеразной цепной реакции // Пробл. особо опасных инфекций. -2006. Вып. 1(91). - С. 62 - 64.

39. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз / Екатеринбург, 2001. -284 с.

40. Домарадский И.В. Чума / М.: Медицина, 1998. 176 с.

41. Дыгай A.M., Захарова О.Ю., Фомина Т.И., Гольдберг Е.Д. Адренергические механизмы в формировании адаптационного ответа различных тканей // Бюл. экспер. биол. и мед. 1992. - № 3. - С. 278 - 280.

42. Дятлов И.А., Филиппов А.Ф. Взаимодействие чумного микроба с фибриногеном // Микробиология, биохимия и специфическая профилактика карантинных инфекций. 1990. - С. 9 -16.

43. Елисеева JI.C. Участие серотонинергической системы и надпочечников в регуляции динамики и соотношения Т- и В-розеткообразующих клеток в иммуногенезе // Иммунология. 1984. - № 4. - С.43 - 46.

44. Елисеева JI.C. Биологический эффект связывания серотонина с иммуноцитами // Иммунология. 1988. - № 5. - С. 42 - 46.

45. Ермакова Г.В., Тараненко Т.М., Наумов A.B. и др. Изучение протективной активности различных по химическому составу препаратов капсульного антигена чумного микроба // Микробиол., биохим. и специф. профил. карантин, инф.- 1990.-С. 84-89.

46. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. Quorum sensing, или как бактерии разговаривают друг с другом // Молекулярная биология. 2001. - Т. 35. - С. 268 -277.

47. Заднова С.П. Влияние полипептида с молекулярной массой 22 kD на свойства клеточной поверхности штаммов возбудителей чумы / Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1998. - 20 с.

48. Заднова С.П., Лозовский Ю.В. Механизмы секреции грамотрицательных бактерий // Пробл. особо опасных инфекций. 2005. - Вып. 2 (90). - С. 11-16.

49. Захаров A.B. Влияние живой чумной вакцины и некоторых ее антигенов на систему гемостаза в эксперименте / Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1991.-20 с.

50. Зигангирова H.A., Гинцбург А.Л. Роль апоптоза в регуляции инфекционного процесса // Журн. микробиол. 2004. - № 6. - С. 106 - 113.

51. Зудина И.В., Булгакова Е.Г., Видяева H.A., Кутырев В.В. Изучение роста Psn" и Hms" -мутантов чумного микроба на средах с различными хелаторами ионов железа // Пробл. особо опасных инфекций. 1999. - Вып. 79. - С. 162 - 168.

52. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Системы коммуникации у бактерий и их роль в патогенности // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2006. - № 3. - С. 22 - 29.

53. Кац П.Д. Динамика гистамина и серотонина крови при экспериментальной дизентерийной интоксикации у кроликов // Азерб. мед. журнал. 1965. - № 9. -С. 27-31.

54. Класон А.Г., Райцис А.Б. Флюориметрический метод определения активности гистаминазы в сыворотке крови // Лаб. дело. 1973. - № 4. - С. 231 -233.

55. Князькин И.В., Цыган В.Н. Апоптоз в онкоурологии / Санкт-Петербург: «Наука». 2007. - 239 с.

56. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др. Клетки крови, современные технологии их анализа / М.: «Триада-фарм», 2002. 535 с.

57. Козлов В.А., Матросова В.Ю., Орловская И.А., Акименко З.А. Роль гистаминовых рецепторов в реализации эффекта ß-цепи гемоглобина, ингибирующей пролиферацию ранних гемопоэтических предшественников // Иммунология. 1998. - № 2. - С. 34 - 36.

58. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза (МУ 3.3.2.2124-06) / М.: Минздрав России, 2006. 25с.

59. Корнева Е.А. Нарушения нейрогуморальной регуляции функций иммунной системы // Вестник АМН СССР. 1990. - № 11. - С. 36 - 42.

60. Корнева Е.А. Механизмы резистентности организма при различных видах стресса // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы. -М., 1996.-С. 212-213.

61. Корнева Е.А., Бычков Е.Р. Моноамины в структурах гипоталамуса в первые часы после иммунизации // Вестник РАМН. 1992. - № 7. - С. 25 - 28.

62. Корнева Е.А., Казакова Т.Б., Носов М.А. Экспрессия c-fos мРНК и c-Fos-подобных белков в клетках гипоталамических структур при введении антигена // Аллергология и иммунология. 2000. - Т. 1. - № 1. - С. 37 - 44.

63. Коткина Т.А., Дальвадянц С.М., Метлин В.Н. Изменение баланса гистамина в органах белых крыс в динамике при интоксикации, вызванной экзо- иэндотоксинами возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 1972. -№ 2. -С. 115-117.

64. Кравцов A. JI. Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогенных популяций Y pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных / Автореф. дис. . док. биол. наук. Саратов, 1997.-57 с.

65. Кравцов A.JL, Костылева Н.И. Результаты цитометрии ДНК бактерий Yersinia pestis в процессе роста на среде, не содержащей и содержащей стрептомицин // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 1994. - Вып. 5(75). -С. 97- 106.

66. Кулинский В.И., Черкасова Т.П. Серотонин кроветворной и иммунокомпетентной тканей различных видов млекопитающих // Бюл. экспер. биол. и мед. 1974. - Т.78. - № 8. - С. 71 - 76.

67. Курский М.Д., Бакшеев Н.С. Биохимические основы механизма действия серотонина / Киев: «Наукова думка», 1974. 296 с.

68. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителячумы / Дис. . док. мед. наук. Саратов, 1992. - 332 с.

69. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета / М.: Медицина, 1985. 256 с.

70. Лившиц Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М.: Медицина, 1978. - С. 24 - 36.

71. Лимфоциты. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. М.: Мир, 1990. -395 с.

72. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. А.И. Карпищева СПб.: Интермедика, 2002. - Т. 1. - 408 с.

73. Медуницин Н.В. Вакцинология / Москва, 2004. 446 с.

74. Монцевичюте Эрингене Е.В. Упрощенные математико-статистические методы в медицинской исследовательской работе // Патол. физиол. и эксперимен. терапия. - 1964. - № 4. - С. 71-78.

75. Морозова Н.Б. Влияние серотонина на антигенеспецифические судрессоры тимуса // Бюл. эспер. биол. и мед. 1990. - № 7. - С.68 - 70.

76. Мынкина Г.И., Короленко Т.А. Рецепторный и жидкофазный эндоцитоз // Успехи современной биологии. 1992. - Т. 112. - № 2. - С. 252 - 264.

77. Назаров Ш.Н. Характерисика иммунокомпетентных клеток крови и тканей при различных формах дизентерии // Иммунология. 1982. - № 3. - С. 51 - 55.

78. Назарова JI.C. Иммуноморфологический анализ вакцинальных и инфекционных процессов при холере и чуме в эксперименте / Автореф. дис. . док. мед. наук. Саратов, 1995. - 37 с.

79. Наумов A.B., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы / Саратов, 1992. -172 с.

80. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Варфоломеева М.И. и др. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию // Иммунология. № 2. - 1999. - С. 20 - 23.

81. Новиков Д.К., Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики / Минск: «Беларусь», 1979. 222 с.

82. Ноздрачев А.Д., Пушкарев Ю.П. Характеристика медиаторных превращений / Л.: «Наука», 1980. 230 с.

83. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Кировская Т.А Микробная эндокринология и биополитика // Вестник Моск. ун-та. Сер. Биология. 1998(а). - № 4. - С. 3 - 10.

84. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. -Т.69. -№ 3. — С. 309-327.

85. Олескин A.B., Кировская Т.А., Ботвинко И.В., Лысак Л.В. Действие серотонина (5-окситриптамина) на рост и дифференциацию микроорганизмов // Микробиология. 1998(6). - Т.67. - № 3. - С. 305 - 312.

86. Онищенко Г.Г. Об эпидемиологической обстановке по особо опасным, природно-очаговым и другим инфекциям на территории Южного федерального округа // Журн. микробиол. 2004. - № 3. - С. 23-30.

87. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д. и др. Стратегия борьбы с инфекционными болезнями и санитарная охрана территорий в современных условиях // Пробл. особо опасных инфекций. 2006. - Вып. 2(92). - С.5 - 9.

88. Организация и проведение эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации (МУ 3.5.5.1034-01) / М., 2002.- 103 с.

89. Перелыгина Г.М., Поляк А.И. Субпопуляционный анализ влияния альфа-адреноблокаторов на первичный иммунный ответ // Взаимодействие нервной и иммунной систем: Тез. докл. V Всесоюзного симпозиума. Оренбург -Ленинград - Ростов-на-Дону. - 1990 г. - С. 76.

90. Пинчук Л.М. Молекулярная мимикрия как фактор патогенности микроорганизмов // Успехи современной биологии. 1992. — Т.112, № 2. — С. 225 -237.

91. Понукалина Е.В. Механизмы нарушений коагуляционного гемостаза при чумной интоксикации / Автореф. дис. . канд. мед. наук Саратов, 1990. - 21 с.

92. Попененкова З.А., Завенягина Т.Н. Влияние серотонина (5-окситриптамина) и 5-окситриптофана на летальность животных при экспериментальной пневмококковой инфекции и брюшнотифозной интоксикации // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1962. - № 6. - С. 27 - 32.

93. Попененкова З.А., Романовская М.Г. Изменение содержания гистамина в крови и органах крыс при экспериментальной пневмококковой инфекции // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1968. - Т. 65. - № 4. - С. 43 - 45.

94. Попов Н.В., Слудский A.A., Удовиков А.И. и др. Роль биопленок Yersinia pestis в механизме энзоотии чумы // Журн. микробиол. 2008. - № 4. - С. 118 — 120.

95. Попова Н.К., Кудрявцева H.H., Лубсанова С.Д. Генетический контроль тканевого содержания серотонина у мышей // Генетика. 1978. - Т. 14. - № 10. — С.1804 -1808.

96. Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. РД 42-28-10-90. М., 1989. - 49 с.

97. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами // Иммунология. 2002. - № 4. - С. 237 - 243.

98. Правила проведения работ и использования экспериментальных жиротных / «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы сиспользованием экспериментальных животных»: Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77.

99. Прозоров A.A. Строение генома бактерий: единство или многообразие? // Генетика. 1995.-Т. 31.-№6.-С. 741 -742.

100. Райхлин И.Т., Кветной И.М., Осадчук М.А. АПУД-система (общепатологические и онкологические аспекты) / Обнинск, 1993. С. 30 - 35.

101. Ребенок Ж. А., Вершеня М.И. Гистамин крови при пищевых токсикоинфекциях и инфекционном гепатите // Сов. Медицина. 1970. - № 6. -С. 130- 133.

102. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология / М.: Мир, 2000. 592 с.

103. Руководство по профилактике чумы / Под ред. A.B. Наумова, J1.B. Самойловой. Саратов, 1992. - 278 с.

104. Саяпина JI.B. Пролиферация и популяционный состав иммунокомпетентных клеток в динамике вакцинального и инфекционного процессов при чуме / Автореф. дис. . канд. мед. наук Саратов, 1990. - 20 с.

105. Саяпина JI.B., Медуницын Н.В., Анисимова Т.И., Кутырев В.В. Производство и внедрение новых препаратов для диагностики и профилактики особо опасных заболеваний // Пробл. особо опасных инфекций. 2002. - Вып. 84.-С. 133- 144.

106. Самыгин В.М., Пивень H.H., Гришкина Т.А. Условия культивирования как лимитирующие факторы в развитии патогенных бактерий // Пробл. особо опасных инфекций. 2005. - Вып. 86. - С. 68 - 79.

107. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03 // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2003. - Вып.З (13). - № 9. - С. 62-144.

108. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами» СП 1.2.731-99. Изд. официальное. - М.: Минздрав России, 1999. - 107 с.

109. Сердобинцев JI.H., Тараненко Т.М., Веренков М.С., Наумов A.B. Получение капсульного антигена методом одноэтапной гелевой фильтрации // Вопр. профилакт. природно-очаговых инф. Саратов, 1983. - С. 37 - 41.

110. Сидоркина А.Н., Сидоркин В.Г., Преснякова М.В. Биохимические основы системы гемостаза и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови / Н.Новгород: ННИИТО, 2005. 112 с.

111. Симбирцев A.C. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология. 2005. - № 6. - С. 368 - 376.

112. Симоненков А.П., Федоров В.Д. Серотонин и его рецепторы в генезе стресса и адаптации // Вестник Российской АМН 2002. - № 8. - С. 9 - 13.

113. Смирнов Г.Б. 8-й Международный симпозиум по иерсиниям (4-8 сентября 2002 г., Турку, Финляндия) // Пробл. особо опасных инфекций. 2002. - Вып. 84.-С. 203-208.

114. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко. М.:ЗАО «МП Гигиена», 2006. - 288 с.

115. Стадников A.A., Ковбык Л.В., Карташова О.Л. Фундаментальные и прикладные аспекты нейроэндокринной регуляции взаимодействий про- и эукариот // Вестник Российской АМН. 2002. - № 3. - С. 48-51.

116. Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Фрайкин Г.Я. Активация роста дрожжей под действием ультрафиолетового света области 280 380 нм // Микробиология. - 1991. - Т.60. - № 2. - С. 292 - 297.

117. Страховская М.Г., Иванова Э.В., Фрайкин Г.Я. Стимулирующее влияние серотонина на рост дрожжей Candida guilliermondii и бактерий Streptococcus faecalis II Микробиология. 1993. - Т.62. - № 1. - С. 46 - 49.

118. Стручко Г.Ю. Участие тучных клеток в ранней фазе иммунного ответа тимуса на введение растворимого антигена // Иммунология. 1997. - № 6. - С. 55-56.

119. Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., Сергеева В.Е., Стоменская И.С. Реакция биоаминсодержащих структур тимуса крыс на экспериментальное удаление селезенки // Иммунология. 2000. - № 2. - С. 13 - 17.

120. Судаков К.В. Иммунные механизмы системной деятельности организма: факты и гипотезы // Иммунология. 2003. - Т. 24. - № 6. - С.372 - 381.

121. Теренина Н.Б., Густафссон М.К.С. Нейротрансмиттеры у гельминтов (биогенные амины, оксид азота) / М: Наука, 2003. 179 с.

122. Титенко М.М., Проценко O.A., Фурсов В.В. и др. Информативность люминесцентно-серологического метода диагностики возбудителя чумы // Генетика и микробиология природно-очаговых инфекций. Саратов, 1984. - С. 27-32.

123. Томилец В.А., ' Донцов В.И. Действие серотонина на пролиферацию субпопуляций лимфоцитов селезенки мышей в ходе иммунного ответа // Иммунология. 1984. - № 5. - С. 43 - 45.

124. Третьяк Т.М., Архипова Л.В. Внутриклеточная активность нейромедиаторов // Успехи современной биологии. 1992. - Т. 112. - № 2. - С.265 - 272.

125. Федорова В.А. Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител / Автореф. дис. . док. мед. наук Саратов, 2004.-41 с.

126. Фрайкин Г.Я., Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Рубин А.Б. Способ выращивания дрожжей. A.c. 1544796 СССР // Бюл. изобретений. 1990. - № 7. -С. 154.

127. Фримель X. Иммунологические методы / М.: Медицина, 1987. 472 с.

128. Фролов Е.П. Нейрогуморальные механизмы регуляции иммунологических процессов / М.: Медицина, 1974. 264 с.

129. Хорева М.В., I-Совальчук JI.B., Варивода A.C. и др. Опосредованные через То11-подобные рецепторы выработка цитокинов и экспрессия поверхностных маркеров лейкоцитами крови человека // Аллергология и иммунология. 2006. -№2(7).-С. 199-206.

130. Цавкелова Е.А., Ботвинко И.В., Кудрин B.C., Олескин A.B. Детекция нейромедиаторных аминов у микроорганизмов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Докл. Росс. Акад. Наук. 2000. - Т. 372. - № 6. -С.840 - 842.

131. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А., Нетрусов А.И. Гормоны и гормоноподобные соединения микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42. - № 3. - С. 261 - 268.

132. Черкасова Т.Д. Роль токсинов в патогенезе чумы / Автореф. дис. . док. мед. наук. Москва, 1994. - 48 с.

133. Чуйков Л.И. Гистамин в патогенезе пищевых токсикоинфекций // Врачебное дело. 1974. -№ 9. - С. 147 - 150.

134. Шенкман Б.З. Изменение обмена медиаторов в тканях желудочно-кишечного тракта и некоторые пути их фармакологической коррекции при экспериментальной дизентерийной интоксикации / Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1977. - 22 с.

135. Шмелькова Т.П., Кравцов А. Л., Щуковская Т.Н. и др. Влияние биологических свойств чумного микроба на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека в системе in vitro II Пробл. особо опасных инфекций. 2007. - Вып. 1(93).-С. 85-89.

136. Щуковская Т.Н. Показатели медиаторного обмена в процессе формирования иммунитета к холере / Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1978. - 19 с.

137. Щуковская Т.Н. Регуляция нейромедиаторами формирования специфической резистентности к особо опасным инфекциям // Аллергология и иммунология. -2000.-Т. 1.-№2.-С. 110-111.

138. Щуковская Т.Н. Регуляция нейромедиаторами формирования специфической резистентности к холере // Материалы совещания специалистов

139. Роспотребнадзора и проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2008. - № 21. - С. 108 - 110.

140. Щуковская Т.Н., Горькова А.В. Роль биогенных аминов в противохолерном вакцинальном процессе // Рос. Н.И. противочумн. ин-т «Микроб». Саратов, 1992. - 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 03.08.92.- № 2534-В.92.

141. Щуковская Т.Н., Санин А.В., Назарова JI.C. и др. Механизмы нейроиммуномодуляции формирования специфической резистентности к чуме и холере // Иммунология и специфическая профилактика ООИ: Материалы Российской научной конф. Саратов, 1993. - С. 84 - 85.

142. Abrams W.R., Diamond L.W., Kane А.В. A flow cytometric assay of neutrophil degranulation // J. Histochemistry and Cytochemistry. 1983. - V. 31, N 6. - P. 737 -744.

143. Allman R., Manchee R., Lloyd D. Flow cytometric analysis of heterogenous bacterial populations // In Flow Cytometry in Microbiology D. Lloyd (ed.), SpringerVerlag, London. 1993. - P. 27 - 47.

144. Alverdy J., Holbrook C., Rocha F. et al. Gut-derived sepsis occurs when the right pathogen with the right host: evidence for in vivo virulence expression in Pseudomonas aeruginosa // Ann Surg. 2000. - V. 232. - P. 480 - 489.

145. Anderson M.T., Armstrong S.K. The Bordetella Bfe system: growth and transcriptional response to siderophores, catechols, and neuroendocrine catecholamines // J. Bacteriol. 2006. - V. 188. - P. 5731 - 5740.

146. Baker E.E., Sommer H.L., Foster L.B. et al. Studies on immunization against plague. I. The isolation and characterization of the soluble antigen of the Pasteurella pestislll. Immunol. 1952.-V. 47.-P. 131 - 145.

147. Barlogie B., Spidzer G., Hart G.S. et al. DNA histogram analysis of human hemopoetic cells II Blood. 1976. - V.48, N2. - P. 245 - 257.

148. Bashaw J., Norris S., Weeks S. et al. Development of in vitro correlate assay of immunity to infection with Yersinia pestis // Clinical and vaccine immunology. -2007. V. 14, N 5. - P. 605 - 616.

149. Begier E.M., Asiki G., Anywaine Z. et al. Pneumonic plague cluster, Uganda, 2004 // Emerging Infectious Diseases. 2006. - V. 12, N3. - P. 460 - 467.

150. Belay T., Sonnenfeld G. Differential effects of catecholamines on in vitro growth of pathogenic bacteria // Life Sei. 2002. - V. 71. - P. 447 - 456.

151. Benedict C.R., Mathew B., Rex K.A. et al. Correlation of plasma serotonin changes with platelet aggregation in an in vivo dog model of spontaneous occlusive coronary thrombus formation I I Circ. Res. 1986. - V. 58. - P. 58 - 67.

152. Betten A., Dahlgren C., Hermodsson S., Hellstrand K. Serotonin protects NK cells against oxidatively induced functional ingibition and apoptosis // J. Leukocyte Biology. 2001. - V. 70. - P.65 - 72.

153. Betten A., Dahlgren C., Mellqvist U.-H. et al. Oxygen radical-induced natural killer cell dysfunction: role of myeloperoxidase and regulation by serotonin // J. Leukocyte Biology. 2004. - V. 75. - P. 1111 - 1115.

154. Beye E., Steen H.B. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology II J. Gen. Microbiol. 1983. - V.129, N 4. - P. 971 - 978.

155. Bliznakov E.G. Serotonin and its precursors as modulators of the immunological responsiveness in mice // J. Med. 1980. - V. 11(2-3). - P. 81 - 105.

156. Borovikova L.V. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin // Nature. 2000. - V. 405. - P. 458 - 462.

157. Bride M.D., Aroskar V.A., Datta N.K. Release of activite substances by cholera toxin // Indian J. Med. Res. 1970. - V. 58. - P. 548 - 550.

158. Burton C.L., Chhabra S.R., Swift S. et al. The growth response of Escherichia coli to neurotransmitters and releted catecholamine drugs requires a functional enterobactin biosynthesis and uptake system // Infect. Immun. 2002. - V. 70. -P.5913 - 5923.

159. Butts C.L., Sternberg E.M. Neuroendocrine factors alter host defense by modulating immune function // Cell Immunol. 2008. - V. 252(1 - 2). - P. 7 - 15.

160. Chen C., Brown D.R., Xie Y. et al. Catecholamines modulate Escherichia coli 0157.-H7 adherence to murine cecal mucosa // Chock. 2003. - V.20, N 2. - P. 183 -188.

161. Chromy B.A., Choi M.W., Murphy G.A. et al. Proteomic characterization of Yersiniapestis virulence // J. Bacteriol. 2005. - V. 187, N 23. - P. 8172 - 8180.

162. Clarke M.B., Hughes D.T., Zhu C. et al. The QseC sensor kinase: a bacterial adrenergic receptor // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006. - V. 103. - P. 10420 -10425.

163. Clarke R.A. Finding the right balance against bioterrorism // Emerging Infectious Diseases. 1999. - V.5, N 4. - P.497.

164. Cohen J. M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem J. 1997. - V. 326.-P. 1 - 16.

165. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V.62. - P. 1315 - 1352.

166. DeLeo F.R., Hinnebusch B.J. A plague upon the phagocytes // Nature Medicine. -2005. V.l 1, N 9. - P. 927-928.

167. Ehlers S., Bulfone-Paus S. Shaping adaptive immunity against pathogens: the contribution of innate immune responses // Noved Vaccination Strategies. Ed. By Stefan H.E. Kaufmann. - WILEY - VCH Verlag GmbH& Co. KgaA, Weinheim. -2004.-P. 19 —50.

168. Emau P., Giri S.N., Bruss M.L. Comparative effects of smooth and rough Pasteurella hemolytica lipopolysaccharides on arachidonic acid, eicosanoids, serotonin, and histamine in calves // Circ Scock. 1986. - V.20, N 3. - P. 239 - 253.

169. Fallah H.A., Maillard J.L., Voisin G.A. Regulatory mast cells. I.Suppressive action of their products on an in vitro primary immune reaction // Ann. Immunol. 1975. -V. 126.-P. 669-673.

170. Feng B. S., He S. H., Zheng P. Y. et al. Mast cells play a crucial role in Staphylococcus aureus peptidoglycan-induced diarrhea // Am J. Pathol. 2007. - V. 171 (2).-P. 537-547.

171. Fields K., Straley S. LcrV of Yersinia pestis enters infected eukariotic cells by a virulence plasmid-independed mechanism // Infect. Immun. 1999. - V. 67, N 9. - P. 4801 -4813.

172. Forslund O., Wong L.M.S., Lee P.F.P. et al. The response of murine macrophages to infection with Yersinia pestis as revealed by DNA microarray analysis // 8 th Intern. Symposium on Yersinia, September 4-8, 2002, Turku, Finland, 2002. P. 97 - 98.

173. Freestone P.P., Haigh R.D., Lyte M. Specificity of catecholamine induced growth in Escherichia coli 0157:HL, Salmonella enterica and Yersinia enterocolitica II FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - V. 222, N 1. - P. 39 - 43.

174. Freestone P.P., Haigh R.D., Williams P.H., Lyte M. Involment of enterobactin in norepinephrine-mediated iron supply from transferring to enterohaemorragic Escherichia coli IIFEMS Microbiol. Lett. 2007(b). - V. 262, N 2. - P. 221 - 228.

175. Freestone P.P., Lyte M., Neal C.P. et al. The mammalian neuroendocrine hormone norepinephrine supplies iron for bacterial growth in the presence of transferring or lactoferrin // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 6091 - 6098.

176. Freestone PP, Sandrini SM, Haigh RD, Lyte M. Microbial endocrinology: how stress influences susceptibility to infection // Trends Microbiol. 2008. - V. 16(2). -P. 55-64.

177. Freestone P.P., Williams P.H., Maggs A.F. et al. Growt stimulation of intenstinal commensal Escherichia coli by catecholamines: a possible contributory factor in trauma-induced sepsis 11 Shock. 2002. - V. 18. - P. 465 - 470.

178. Genaro A.M., Borda E. Alloimmunisation-induced changes in p-adrenoreceptor expression and cAMP on B lymphocytes // Immunopharmacology. 1990. - V. 18, N l.-P. 63-70.

179. Gershon M.D., Tamir H. Serotonectin and family of proteins that bind serotonin // Biochem. Pharmacol. 1984.-V. 33.-P. 3115-3119.

180. Green B.T., Lyte M., Chen C. et al. Adrenergic modulation of Escherichia coli 0157:H7 to the porcine colonic mucosa // J. Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 2004. - V. 287. - P. 1238 - 1246.

181. Greenberg E.P., Winans S., Fugua C. Quorum sensing by bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1996. - V. 50. P. 727 - 751.

182. Halper J.P., Mann J.J., Weksler M.E. et al. Beta adrenergic recepters and cyclic AMP levels in intact human lymphocytes: effects of age and gender // Life Sci. -1984. -V. 35, N 8. P. 855 - 863.

183. Helene C., Dimicoli J.L., Brun F. Binding of tryptamine and 5-hydroxytryptamine (serotonin) to nucleic acids. Fluorescence and proton magnetic resonance studies // Biochemistry. 1971. - V. 10, N 20. - P. 3802 - 3809.

184. Hellstrand K., Czerkinsky C., Ricksten A. et al. Role of serotonin in the regulation of interferon-gamma production by human natural killer cells // J. Interferon Res. -1992.-V. 13.-P. 33-38.

185. Hellstrand K., Hermodsson S. Role of serotonin in the regulation of human natural killer cell cytotoxicity // J. Immunol. 1987. - V.139, N 3. - P. 869 - 875.

186. Hellstrand K., Hermodsson S. Enhancement of human natural killer cell cytotoxicity by serotonin: role of non-T/CD16+ NK cells, accessory monocytes, and 5-HT1A receptors // Cell. Immunol. 1990. - V.127. - P. 199 - 214.

187. Hellstrand K., Kylefjord H., Asea A., Hermodsson S. Regulation of the natural killer cell response to interferon-a by biogenic amines // J. Interferon Res. 1992. -V.12.-P. 199-206.

188. Heron D.S., Shinitzky M., Hershkowitz M. et al. Lipid fluidity markedly modulates the binding of serotonin to mouse brain membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77. - P. 7463 - 7467.

189. Hills T., Brockie P.J., Maticq A.V. Dopamine and glutamate control area-restricted search behavior in Caenorhabditis elegans II J. Neuroscience. 2004. - V. 24, N5-P. 1217-1225.

190. Hirafuji M., Minami M., Endo T. et al. Intracellular regulatory mechanisms of 5-HT release from enterochromaffin cells in intestinal mucosa // Biogenic amines. -2000.-V. 16, N l.-P. 29-52.

191. Hoffman R.A., Hansen W.P. Immunofluorescent analysis of blood cells by flow cytometry // Int. J. Immunopharmac. 1981. - V. 3, N 3. - P. 249- 254.

192. Horwitz H.R., Chalfie M., Trent C. et al. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans II Science. 1982. - V. 216. - P. 1012-1014.

193. Hori Y., Nichei Y., Kurokawa Y. et al. Accelerated clearance of Escherichia coli in experimental peritonitis of histamine-dellcient mice // J. Immunol. 2002. - V. 169(4).-P. 1978-1983.

194. Hsu S.C., Johansson K.R., Donahne M.J. The bacterial flora of the intestine of Ascaris suum and 5-hydroxytryptamine production 11 J. Parasitol. 1986. - V.72. -P.545 - 549.

195. Iken K., Cheng S., Fargin A. et al. Serotonin upregulates mitogen-stimulated B lymphocyte proliferation through 5-HTIA receptors // Cell. Immunol. 1995. - V. 163.-P. 1-9.

196. Jarrett C.O., Deak E., Isherwood K.E. et al. Transmission of Yersinia pestis from an infectious biofilm in the flea vector // J. Infect. Dis. 2004. - V. 190, N 4. - P.783 -792.

197. Jeffrey J.J., Ehlich L.S., Roswit W.T. Serotonin: an inducer of collagenase in myometrial smooth muscle cells // J. Cell Physiol. 1991. - V.146, N 3. - P.399 -406.

198. Khan M.M., Keaney K.M., Melmon K.L. Histamineregulates the generation of human cytolytic T lymphocytes // Cell. Immunol. 1989. - V. 121, N 1. - P. 60 - 73.

199. Kell D.B., Ryder H.M., Kaprelyants A.S., Westerhoff H.V. Quentifying heterogeneity: flow cytometry of bacterial cultures // Antonie van Leeuwenhoek. -1991.-V. 60.-P.145- 158.

200. Kinney K.S., Austin C.E., Morton D.S., Sonnenfeld G. Catecholamine enhancement of Aeromonas hydrophila growth // Microbial Pathogenesis. 1999. - V. 25.-P. 85-91.

201. Kinney K.S., Austin C.E., Morton D.S., Sonnenfeld G. Norepinephrine as a growth stimulating factor in bacteria mechanistic studies // Life Sei. - 2000. - V. 67. -P. 3075-3085.

202. Kravtsov A.L., Grebenyukova T.P., Bobyleva E.V. et al. Flow cytofluorometric assay of human whole blood leukocyte degradation in response to Yersinia pestis and Staphylococcus aureus II Proc. SPIE. 2001. - V.4241. - P.260 - 267.

203. Kukkonen M., Korhonen T.K. The omptin family of enterobacterial surface proteases/adhesions: from housekeeping in Escherichia coli to systemic spread of Yersinia pestis II Int. J. Med. Microbiol. 2004. - V. 294, N 1. - P. 7-14.

204. Kvetnoy I.M. Neuroimmunoendocrinology: Where Is the Field for Study? // NEL. 2002. - V.23, N.2. - P. 119 - 120.

205. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227, N 15. - P. 680 - 685.

206. Lang K., Drell T.L., Niggemann B. et al. Neurotransmitters regulate the migration and cytotoxicity in natural killer cells // Immunol. Lett. 2003. - V. 90. - P. 165 — 172.

207. Lebaron P., Joux F. Flow cytometric analysis of the cellular DNA content of Salmonella typhimurium and Alteromonas haloplanktis during starvation and recovery in seawater // Appl. Environ. Microbiology. 1994. - V. 60, N 12. - P. 4345 - 4350.

208. Lett-Brown M.A., Kaiman V., Klimpel G.R. Histamine production by alloantigen-activated mouse bone marrow cells // Cell. Immunology. 1984. - V. 87, N 1. - P. 53 -64.

209. Leurs R., Beusenberg F.D., Bast A. et al. Identification of ß2-adrenoreceptors on guinea pig alveolar macrophages using (-)-3- I. iodocyanopindol // Inflammation. -1990.-V. 14, N4.-P. 421 -426.

210. Liepins A., LeFever A., Truitt R.L. Serotonin modulated Ca4^ dependent K+ channels in alloimmune effector cell lytic function // Immunopharmacol. and lmmunotoxicol. 1989.- V.11,N 2-3.- P.165- 178.

211. Lyte M. The role of microbial endocrinology in infectious disease // J. Endocrinol. 1993.-V.137.-P.343-345.

212. Lyte M. Microbial endocrinology and infectious disease in the 21 st century // Trends Microbiol. 2004. - V. 12(1). - P. 14-20.

213. Lyte M., Auralanandam B., Frank C.D. Production of Shiga-liketoxins by Escherichia coli 0157:H7 can be influenced by the neuroendocrine hormone norepinephrine // J. Lab. Clin. Med. 1996(a). - V. 128. - P. 392 - 398.

214. Lyte M., Erickson A. K., Arulanandam B. et al. Norepinephrine-induced expression of the K99 pilus adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V. 232. - P. 682 - 686.

215. Lyte M., Frank C.D., Green B.T. Production of an autoinducer of growth by norepinephrine cyltured Escherichia coli 0157:H7 // FEMS Microbiol. Lett. -1996(c).-V. 139.-P. 155- 159.

216. Lyte M., Freestone PP., Neal CP. et al. Stimulation of Staphylococcus epidermidis growth and biofilm formation by catecholamine inotropes // Lancet. 2003. - V. 361. -P. 130- 135.

217. Magerl M., Lammel V., Siebenhaar F. et al. Non-pathogenic commensal Escherichia coli bacteria can inhibit degranulation of mast cells Text. // Exp. Dermatol. 2008. - V. 17(5). - P. 427 - 435.

218. Mandell A.J., Knapp S. Regulation of serotonin biosynthesis in brain: role of the high affinity uptake of tryptophan into serotonergic neurons // Fed. Proc. 1977. -V.36, N 8. - P.2142 - 2148.

219. Marketon M.M., DePaolo R.W., DeBord K.L., Schneewid O. Plague bacteria tavget immune cells dutiry infection // Science. 2005. - V.309. - P. 1739 - 1741.

220. McCutcheon M.J., Miller R.G. Fluorescence intensity resolution in flow systems Text. // J. Histochemistry and Cytochemistry. 1979. - V.27, N1. - P.246 - 249.

221. Mekoi Y.A., Bender E.M., Zapata-Sirrent R. et al. The effect of histamine receptor antagonists on specific suppression of experimental contact sensitivity // J. Allerg. And Clin. Immunol. 1985. - V. 76, N 1. - P. 90 - 96.

222. Melamed M.R., Adams L.R., Traganos F. et al. Acridine orange metachromasia for characterization of leukocytes in leukemia, limphoma, and other neoplasms // Cancer. 1972.-V. 29.-P. 1361- 1368.

223. Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2001. -V. 55.-P. 165- 199.

224. Minkowski M., Lebel B., Arnold A., Dy M. Interleukine 3 induces histamine synthesis in the human hemopoietic system // Exp. Hemathol. 1990. - V. 18, N 11. -P. 1158- 1163.

225. Morale M.C., Earinella Z., Marhetti R. Central nervous system (CNS) modulation of immune system development: role of the thymic beta2-adrenergic receptor // Pharmacol. Res. 1990. - V. 27, N 1. - P. 47 - 48.

226. Morken J.J., Warren K.U., Rodriguez J.L., Lyte M. Epinephrine as a mediator of pulmonary neutrophil sequestration // Shock. 2002. - V.18, N 1. - P. 46 - 50.

227. Motomura Y., Ghia J.E., Wang H. et al. Enterochromaffin cell and 5-hydroxytryptamine responses to the same infectious agent differ in Thl and Th2 dominant environments //Gut. -2008. V. 57(4). -P. 475 -81.

228. Munoz J.J., Arai H., Cole R.L. Mouse-protecting and histamine-sensitizing activities of pertussigen and fimbrial hemagglutinin from Bordetella pertussis II Infect. Immun. 1981. - V. 32, N 1. - P. 243 - 250.

229. Munoz-Bellido J.L., Munoz-Griado S., Garcia-Rodriguez J.A. Antimicrobial activity of psychotropic drugs: selective serotonin reuptake inhibitors // Int. J. Antimicrob. Agents. 2000. - V. 14, N 3. - P. 177 - 180.

230. Nicholson A.C., Unger E.R., Mangalathu R. et al. Exploration of neuroendocrine and immune gene expression in peripheral blood mononuclear cells // Brain Res. -2004. V. 129 (1 - 2). - P. 193 - 197.

231. Oberbeck R. Adrenergic modulation of syrvival and cellular immune functions during polimicrobial sepsis // J. Neuroimmunomodulation. 2004. - V. 11. - P. 214 -223.

232. Oh C., Okamoto H., Nakano K. Regulation of lymphocyte blastogenesis by histamine produced in system per se // Agr. And Biol. Chem. 1989. - V. 53, N 2. -P. 377-382.

233. Okamoto H., Nakano K. Regulation of interleukin-1 syntesis by histamine produced by mouse peritoneal macrophages per se // J. Immunology. 1990. - V. 69, N l.-P. 162- 165.

234. Olsson M., Rundguist I., Brunk U. Flow cytofluorometry of lysosomal acridine orange uptake by living cultured cells // Acta pathol., microbial., immunol. Scand. -1987.-V. 95, N4.-P. 159- 165.

235. Paegelow J., Lange P. Pharmacological studies on lymphocytes. 2. Effects of indole derivates and their antagonists on the lymphocyte migration // Agents Actions.- 1984. V. 15. -P. 361 -365.

236. Panse M.V., Dutta N.K. Release of histamine by cholera toxin // Arch. Inter. Pharmacodyn. 1963. - V. 145. - P. 479 - 488.

237. Parrino S., Hotchkiss R.S., Bray M. Preventation of immune cell apoptosis as potential thevapentic strategy for sovere infections // Emerging Infections Diseases. -2007. V. 13, N 2. -P.191 - 198.

238. Permin H., Skov P. S., Norn S. et al. Text. // Platelet 3H-serotonin releasing immune complexes induced by Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis // Allergy.- 1982. V. 37(2). - P. 93 - 100.

239. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis — Ethiologic agent of plague // Clinical Microbiology Reviews. -1997. V. 10 (1). - P. 35-66.

240. Phillips A.P., Martin K.L. Direct and indirect immunofluorescence analysis of bacterial populations by flow cytometry // J. Immunol. Meth. 1987. - V. 101, N 2. -P. 219-228.

241. Pujol J., Buguet A., Froment J et al. The central metabolism of serotonin in the cat during insomnia: a neurophysiological and biochemical study after administration of the raphe system // Brain Res. 1971. - V. 29. - P.195 - 212.

242. Reichenbach H. Myxobacteria: A most peculiar group of social prokaryotes Text. // Myxobacteria: development and cell interaction / Ed. Rosenberg E., Berlin, N.Y., Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag. 1984. -P.l-51.

243. Richard J.L., Grimes D.E. Bioterrorism: class A agents and their potential presentations in immunocompromised patients // Clin. J. Oncol. Nurs. 2008. - V. 12(2).-P. 295-302.

244. Rocklin R.E., Greineder D., Littman B.H., Melmon K.L. Modulation of cellular immune function in vitro by histamine receptor-bearning lymphocytes: Mechanism of action // Cell. Immunology. 1978. - V. 37, N 1. - P. 162 - 173.

245. Rocklin R.E., Beard J., Gupta S. et al. Characterization of the human blood lymphocytes that produce a histamine induced suppression factor // Cell. Immunology. 1980.-V. 51.-P. 226-230.

246. Sabroe I., Jones E.C., Usher L.R. et al. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses // J. Immunol. 2002. - V. 168. - P. 4701 - 4710.

247. Sanyal S., Wintle R.F., Kindt K.S. et al. Dopamine modulates the plasticity of mechanosensory responses in Caenorhabditis elegans //Embo J. 2004. - V. 23. - P. 473-482.

248. Savageau M.A. Regulation of differentiated cell specific functions // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. - 1982. - V. 80, N 5 - P.1411 - 1415.

249. Sebbane F., Jarrett C.O., Gardner D. et al. Role of the Yersinia pestis plasminogen activator in the incidence of distinct septicemic and bubonic forms of flea-borne plague // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006. - V. 103, N 14. - P. 5526 - 5530.

250. Sidibe S., Saal F., Rhodes-Feuillette A. et al. Effects of serotonin and melanin on in vitro HIV-1 infection // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 1996. - V.10 (1). - P.19 -24.

251. Skarstad K., Bernander R., Wold S. et al. Cell cycle analysis of microorganisms // Flow cytometry applications in cell culture / Eds M. Al-Rubeai and A.N. Emery. -Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996. P. 241 - 255.

252. Slauson D.O., Walker C., Kristensen F., deWeck A.L. Mechanisms of serotonin-induced lymphocyte proliferation ingibition // Cell. Immunology. 1984. - V. 84. - P. 240-252.

253. Smart L.M., Kay A.B. Histamine receptors on human peripheral blood leucocytes // Clin. exp. Immunol. 1981. - V. 44. - P. 581 - 586.

254. Soliven B., Nelson D J. Beta-adrenergic modulation of K+ current in human T lymphocytes // J. Membrane Biol. 1990. - V. 117, N 3. - P. 261 - 274.

255. Sperandio V., Torres A.G., Jarvis B. et al. Bacteria-host communication: the language of hormones // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. - V.100. - P.8951 -8956.

256. Steen H.B., Boye E. Escherichia coli growth studied by dual-parameter flow cytophotometry // J. Bacteriol. 1981. - V. 145. - P. 1091-1094.

257. Steen H.B., Boye E., Starsted K. et al. Applications of flow cytometry on bacteria: cell cycle kinetics, drug effects and antibody binding // Cytometry. 1982. - V. 2, N 4.-P. 249-256.

258. Sternberg E.M., Trial J., Parker C.W. Effect of serotonin on murine macrophages: upression of la expression by serotonin and its reversal by 5-HT2 serotonergic receptor antagonists // J. Immunol. 1986. - V. 137, N 1. - P.276 - 282.

259. Sternberg E.M., Wedner H.J., Leung M.K., Parker C.W. Effect of serotonin (5-HT) and other monoamines on murine macrophages: modulation of interferon-y induced phagocytosis // J. Immunol. 1987. - V.138, N 12. - P. 4360 - 4365.

260. Styer K.L., Hopkins G.W., Batra S.S. Yersiniapestis kills Caenorhabditis elegans by biofilm independent process that involves novel virulence factors // EMBO Report. 2005. - V. 6, N 10. - P. 992 - 997.

261. Tamir H., Kupsky W.J., Huang Y.L., Gershon M.D. Serotonin-binding glycoprotein of rat platelets // J. Cell. Sei. 1983. - V. 62. - P. 439 - 443.

262. Telford W., King L., Fraker P. Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry // J. Immunol. Meth. 1994. - V. 172.-P. 1 - 16.

263. Tits L.J.H., Michel M.C., Grosse-Wilde H. et al. Catecholamines increase lymphocyte ß2-adrenergic receptors via a ß2-adrenergic, spleen dependent process // American J. Physiol. 1990.-V. 258, N l.-P. 191-192.

264. Toninello A., Salvi M., Pietrangeli P., Mondovi B. Biogenic amines and apoptosis // Amino Acids. 2004. - V. 26, N 4. - P. 339 - 343.

265. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylemide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some application // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350 - 4354.

266. Vago T., Norbiato G., Baldi G. Respiratory-burst stimulants desensitize p2-adrenoreceptors on human polymorphonuclear leukocytes // Int. J. Tissue React. -1990.-V. 12, N 1. -P. 53-58.

267. Voigt W., Fruth A., Tschape H. et al. Enterobacterial autoinducer of growth enhances shiga toxin production by enterohemorrhagic Escherichia coli II J. Clinical Microbiology. 2006. - V.44, N 6. - P. 2247 - 2249.

268. Walters M., Sperandio V. Quorum sensing in Escherichia coli and Salmonella II J. Med. Microbiol. -2006. -V. 296. P. 125-131.

269. Webster J.I., Tonelli L., Sternberg E.M. Neuroendocrine regulation of immunity //Annu. Rev. Microbiol. 2002. - V. 20. - P. 125 - 163.

270. Weinrauch Y ., Zychlinsky A. The induction of apoptosis by bacterial pathogens //Annu. Rev. Microbiol. 1999. - V.53. - P. 155 - 187.

271. Weinrauch Y., Drujan D., Shapiro S.D. et al. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria // Nature. 2002. - V.417. - P. 91 - 94.

272. Wojtecka-Lukasic E., Maslinski S. Histamine, 5-hydroxy tryp tarn ine and compound 48/80 activate PMN-leucocyte collagenase of the rat // Agents Actions. -1984.-V. 14, N3.-P. 451 -453.

273. Zhang Y., Bliska J.B. Role of Toll- like receptor signaling in the apoptosis response of macrophages to Yersinia infection // Infect. Immun. 2003. - V. 71(3). -P. 1513-1519.

Информация о работе

Клюева, Светлана Николаевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Влияние серотонина на свойства возбудителя чумы, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы