Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА РОСТ SPIRVLINA PLATENSIS И ОПТИМИЗАЦИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭТИХ ЭЛЕМЕНТОВ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА РОСТ SPIRVLINA PLATENSIS И ОПТИМИЗАЦИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭТИХ ЭЛЕМЕНТОВ"



На правах рукописи

ПОПОВА Виктория Викторовна

ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА РОСТ ЬГМииХЛ РЬАТЕ№18 И ОПТИМИЗАЦИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭТИХ ЭЛЕМЕНТОВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. КЛ. Тимирязева РАН в Отделе молекулярных основ внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов, г. Москва

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Пронина Наталия Александровна

Градова Нина Борисовна Иванов Виктор Борисович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московский Государственный Университет им, М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра «Физиология микроорганизмов»

/ ^

Защита состоится «Л/»г. в А?

«ета'ДШ 12.204Л 3 ]

часов на заседании диссертационного совета'ДМ212.204ЛЗ в РХТУ нм. Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д. 9) в .

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «3 2004 г.

УчеяыЙ секретарь диссертационного совета, У/

ДМ212.204ЛЗ Шакир И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Исследования последних лет показывают, что обеспеченность жителей многих регионов России микроэлементами значительно снижается (Скальный, 1999; Тутельян и др, 2002). Это обусловлено истощенностью почв, вызванной неправильным ведением сельскохозяйственных работ, глобальным изменением окружающей среды, а также ухудшением качества продуктов питания. В то же время повысившийся уровень стресса в результате загрязнения окружающей среды и особенностей стиля жизни современного человека увеличивает его потребности в некоторых питательных компонентах. Другими словами, для сохранения питательной ценности продуктов человечество встало перед необходимостью их балансировки, в том числе с помощью биологически активных добавок, полученных из натуральных растительных источников.

В последнее время в качестве таких источников используются фотосинтезирующие одноклеточные организмы (Richmond, 1986; Borowitzka and Borowitzka, 1988; Цоглин и Габель, 2000), среди которых наиболее перспективной, следует считать цианобактерию Spirulina platens is. Во-первых, сравнительный анализ биохимического состава микроводорослей показал преимущество S, platensis перед многими фотосингезирующими организмами (Трубачёв и др., 1976; Richmond, 1986). Во-вторых, пластичность метаболизма микроводорослей позволяет управлять качеством биомассы путем направленного изменения условий культивирования и использовать их для транспорта в организм физиологически важных элементов в биологически активной форме (Клячко-Гурвич, 1966; Семененко, 1985). И, в-третьих, S. platensis является чрезвычайно устойчивой к воздействию стрессовых факторов и способна накапливать микроэлементы в количествах, являющихся летальными дяя других микроорганизмов (Упитие, 1983).

В настоящее время несомненный интерес представляют эссенциальные микроэлементы селен и цинк, которые требуются для осуществления важнейших физиологических процессов в организме человека. При дефиците этих микроэлементов в организме возникают хронические заболевания желудочно-кишечного тракта, дерматиты, анемия, карликовость, половое недоразвитие, онкологические заболевания, катаракта и другие заболевания.

Цель и задачи исследования. В данной работе для нас представляло интерес исследовать внутриклеточное накопление селена и цинка в клетках Spirulina platensis с целью изучения устойчивости цианобактерии к этим элементам и поиска путей оптимизации их накопления в органических соединениях для получения биомассы, обогащенной данными микроэлементами.

1 11 I I к ,—,

1ШГ, I

Л сотиетсшии с целмо рабе™ были поставлены следующие задачи: 1. Изучение влияния различных концентраций селена и шика па рост рЫетк\ 1. Исследование биохимического состава р1аСет1$ при роете на ■ модифицированных средах, обогащенных селеном и цинком;

3. Исследование способности клеток 5, р!шепт накапливать селен и цинк;

4. Исследование »ключшия селена и цинка в состав органических соединений клетки;

' 5. Оптимизация услоиий культивирования, позволяющих получить биомассу с высоким содержанием микроэлементов. Научна» потопа. Определены оптимальные и предельно допустимые концентрации йе^У) при культивировании 5. рЫгепвгз 1РРА5 В-256. Впервые исследовано влияние 8е(1У) ш биохимический состав 5. р1а1ет1$. Впервые детально щучена зависимость между внутриклеточным содержанием $е(1У) и его содержанием в среде и показано, что клетки 5. р1аШ\$'ш не способны лимитировать накопление селена вплоть до гибели культуры. Впервые показано, что высокие концентрации 8с(Г/) вшивают значтедыюс снижение адтогошматического рН. Новыми являются данные о зависимости накопления цинка от стадии культивирования, на которой вносился элемент. Ппсрвие показано, что цинк может включаться в состав линофильных соединений «иапобактерии. Впервые показано различие в накоплении цинка на свету и в темноте.

На учно-н рактнчсскос значение. Полученные результаты мо1ут быть применены в биотехнологии при производстве биологически активных добавок к пище человека и животных, в парфюмерной промышленности для получения различных косм(ли<!сских средств но уходу за кожей, в нищевой промышленности для обогащения продуктов микроэлементами. Также получепиые результаты могут быть использованы для дальнейших исследований защщных механизмов цианобактериальной клетки на вшдейетоие повышенных концентраций тяжелых. металлов и токсических элементов.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были кредегаилены: на конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущиио, 2000; 1-ом Международном симпозиуме "Биотехнология - народному хозяйству", Москва, 2000; конференции «Лвточрофпые микроорганизмы», Москва, 2000; 1-ой и 2-ой Международных конференциях Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов», Москва, 2001, 2003; Международной конференции «Достижения биотехнологии на блаи> будущею ча<онечссш1», Самарканд, Узбекистан, 2001; Международном симпозиуме «Гастспия иод влиянием спресса окружающей среды», Москва, 2001; Международном симпозиуме «Молекулярная мистика и биотехнология», Москва, 2001;

5-ой Европейской конференции «Биотсхполотя микроводороспсй», Ногсдам, Германия, 2003; 5-ом Съезде Всероссийского Общества Физиологов Растений, I lema, 2003,

Публикации. По материалам диссертационной работы онубникошк» 12 работ, включая патент РФ, в которых осажены основные положения диссертации.

Структура диссертации. Диссертация соспжг из раздело»: Введение, Обзор литературы, Объект и методы исследований, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Работа изложена на 91 странице машинописного тсксга, вшочаст 14 рисунков и 4 таблицы, список литературы содержа 201 наименование.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В качестве объекта исследовании иснолккмшгась одноклеточная термофильная нитчатая циапобактерия Spirulina platmsis (Noitîst.) Gcitl. IPPAS B-256 из коллекции культур микроводорослсй Института физиологаи растений им, К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS).

Культи в и pona » не цц ад оба ктерн и осуществляли па среде Заррука в стерильных условиях нри круглосуточном освещении (30 Вт/м2), непрерывном барбсоировании гаэо-воедушной смесыо, содержащей 1,7-2% СОт, при 33-35°С (Семененко, 1991). До внесения инокулята в среду добавляли селенит т<рии к количестве 10 - 170 мг/л* Для изучения влияния серы на накопление ceneîta культуру выращивали на модифицированной среде Заррука, содержащей 10% K^SO* or стапдарпюй среды. Сульфат, нитрат и хлорид цинка вводили в питательные среды либо до внесения носсвпот инокулята, либо лрн выходе культуры на линейную фазу в концентрациях 10 -40 мг/л.

Биохимические анализы проводили па линейной стадии роета в клеточной массе, предварительно отмытой откультуралыюй среды. Образцы ранили нри~20°С. Содержание белка определяли но методу Lowry (Lowry et al, 1951), Содержание хлорофилла измеряли спсктрофотомстричсеки в метанолы imx экстрактах (Сергеенко и др., 2000).

Содержание линофильнмх соединений оценивали весовым методом в пробах, экстрагированных метанолом при 60°С (Клячко-1 урпич, 1966),

Содержание углеподоп определяли йзснаи-ссрпым методом (Кличко-1 'урвич, 1964). Аиалт аминокислотного состава белка проводили после гидролиза биомассы в б N IIC1 на автоматическом анализаторе аминокислот АЛА 339М («Microtcchna», Чехия) (Копарев, 1973),

Состав фосфорсодержащих соединений клетки и ц итои лашатич сскн ii nll определяли с помощью спектроскопии 3|Р-ядерного магнитного резонанса ("Р-ЯМР) на MSL-200 («Broker», Германия) кап описано (Панина и др., 2002). Снекфы снимали при частоте электромашин юп> излучения 81 МГц с числом сканирований 3-5 тыс. Цитошшматический рН отделяли, используя зависимость химической) сдвш-а пика

неорганических фосфатов цитоплазмы от рН. Дня построения стандартной кривой использовали клеточный экстракт в б M HCIO4 согласно (Kichitsu et aL, 1989). Идентификация пиков резонансных сигналов проведена согласно (Roberts, 1984).

Разрушение клеток проводили в гомогенизаторе Retsch-MM2 (Германия) в течение 10 мин при 90000 уд/мин с использованием стеклянных бус при соотношении бусы/суспензия 1:1.

Фракционирование бесклеточро|~о гомогената на фракции растворимых белков и нерастворимых клеточных компонентов осуществляли центрифугированием при 14000 об/мин, 30 мин при 4°С.

Л ипоф ильные, g pgji инея и il экстрагировали метанолом при 60°.

Хроматографический анализ белков проводили с использованием колоночной хроматографии высоко давления на колонке 1,6x50 см. В качестве матрицы использовали Syperosa-12 («Pharmacia», Швеция). Белок элю провали с колонки фосфатным буфером, содержащим Ov05М KHjPO«, 0,15М NaCl (рН 6,8), со скоростью 2 мл/мин.

^лектрофоретическое разделение бел ко а проводили в 15% полиакриламндномгеле(Остерман, 1981).

Содержание селена определяли в биомассе или выделенных из нее клеточных фракциях с помощью индуктивно связанной плазмы масс-спектрометр ни (ИСП-МС) по изотопу !2Se на автоматическом анализаторе HP 4500 Series ICP-MS («Hewlett Packard», США) (Javis et. al., 1992), a также с помощью флуориметрического метода определения комплексов селена с 2,3-диаминонзфталином (Голубкина, 1995).

(^держание цинка в культуральной среде, а также в биомассе S. platensis или выделенных из нее фракциях, озоленных путем мокрого сжигания в смеси азотной и хлорной кислот, определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре («Hitachi 270», Япония).

Статистическая обработка результатов. Для получения достоверных результатов эксперименты проводили в 2-3-х биологических и не менее, чем в 3-х аналитических повторностях. В результатах работы представлены средние данные и относительные стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование роста S. platensis на средат. содержащих селенит-ионы. Исследование роста цианобакгерии показало, что в присутствии 10-20 мг/л Na2SeOj ростовые кривые почти полностью повторяли графическую характеристику коктропя (рис, 1 А). Внесение в среду культивирования 30 и 50 мг/л селенита натрия вызывало падение скорости роста на линейной фазе и значительное снижение максимальной плотности cycnesomi при выходе кривой накопления биомассы на плато.

При повышении концентрации N^SeOj до 100 мг/л (рис. 1 Б) наблюдали те же закономерности роста на линейной фазе, более быстрый выход на стационарную фазу при низком значении максимальной плотности суспензии. Концентрации селенита натрия 150 и 170 мг/л особенно сильно подавляли скорость роста культуры на линейной стадии. При этом максимальная плотность суспензии клеток на стационарной фазе не достигала 1/4 от этого значении в контроле. В присутствия 100 mi/ii селенита натрия на 11-ый день культивирования начинался лизис клеток, а при 150 и 170 мг/л на 6-ой день.

Время, дни Время, дни

Рис. 1. Вдшшне селенита натрия на рост Зр^гиНпа рШе!и«.

Кокиапрацни №25Ю1 в среде (мг/л):

(А) - 0 (1 -ко нтроль), 10 (2), 20 (3), 30 (4), 50 (5).

(Б)-0(1-контролъ), 100(2), 150(3), 170(4),

Следует отметить, что в присутствии 100-170 мг/л Ма25еО} уже в начале линейной фазы культивирования в среде появлялся красный осадок, а сине-зеленые клетки цианобактерии приобретали красноватый оттенок, что связано С появлением элементарного селена Эс(0) в среде и на поверхности клеток в результате восстановления селенита натрия.

Таким образом, £ рШеп$\$ обладает чрезвычайно высокой устойчивостью к селену, в отличие от большинства фотосинтезирующих микроорганизмов (ЯюктопЗ, 1986).

Изменение биохимического состава биомассы $. р/а/епхк. выращенной в присутствии 8е(1У1. При анализе состава биомассы р/а!ею1'х, полученной при культивировании цианобактерии в присутствии 10 и 20 мг/л селенита натрия в среде не отмечено достоверных изменений в содержании основных групп веществ в расчете иа единицу сухого веса (табл. 1), Эти данные говорят о том, что селен в этих

концентрациях не оказывал существенного влияния на сдвиг белкового, липидного и углеводного обмена и, вероятно, легко метаболизировался. Последнее подтверждается также тем, что селенит в этих концентрациях не оказывал ингибирующего эффекта на рост (рис. 1 А). В то же время из табл. 1 видна сильная обратная зависимость между концентрацией селенита натрия в среде и содержанием клеточного белка и ее прямая связь с содержанием углеводов и липкдов в биомассе, что наблюдается у цианобактерий и микроводорослей и при других стрессовых условиях (Клячко-Гурвич, 196б;Семененко, 1985).

Таблица 1. Влияние селенита натрия на биохимический состав S.platensis

Концентрация NajSeOj, мг/л % от сухой массы

Белок Хлорофилл Углеводы Липиды

0 б5±7 1,04±0,1 17±3 8±1

10 б4±б 0,77±0,05 19±2 9±1

20 б2±7 0,70±0,05 16±3 10±1

50 54±3 1,1040,08 22±2 14±1

100 46+3 0,90±0,08 24±3 16±1

Относительно метаболизма селена у микроводорослей известно немного. Показано, что он включается, главным образом, в свободные аминокислоты и белки. Являясь химическим аналогом серы, селен замещает ее в цистеине и метионине с образованием Se-аминокислот, которые принимают участие в синтезе белка наряду с S-аминокислотами (Bottino et al, 1984; Vandermeuten and Foda, 1988), Исследование аминокислотного состава белка в биомассе, полученной при выращивании культуры в присутствии 20 мг/л Na^eQj, показало, что селенит не оказывает существенного влияния на изменение содержания серусодержащих кислот - цистеина и метионина, в которые селен может включаться с образованием селеноаминокислог.

Влияние селенита натрия на фосфорный обмен S. plaiensis и внутриклеточный рН. Для более детального изучения процесса адаптации клеток к различному составу культуральной среды был проведен сравнительный анализ 31Р-ЯМР спектров клеток S. plaiensis, выращенных в присутствии Se{IV) и без него. Как видно из представленных спектров (рис. 2) наблюдался значительный химический сдвиг неорганического ортофосфата (Ps) от 2,28 рш в контроле (спектр А) до 1,55 ррш в опыте в присутствии 100 мг/л NajSeOj (спектр В). Этот сдвиг соответствует сильному подкислению цитоплазмы на I ед, рН (art 7,1? до 6,18), что, безусловно, связано с подавлением роста культуры (см. рис. 1 Б). Снижение ростовых параметров в присутствии 100 мг/л Na3Se03 коррелирует также с падением сигналов фосфорных зфиров Сахаров (пики 3-5 рргп), что указывает на ингибирование фотосинтеза. При

+ [0 0 -10 -20 Химический сдвиг, ррт

культивировании 5. рШепзк в присутствии 20 мг/л, когда не отмечалось заметных изменении в росте (рис. 1А, кривая 3) и биохимическом составе биомассы (табл. 1), ЯМР. , спектры совпадали с таковыми в контроле (рис, 2, спектры А и Б).

-30

Рис. 2. ''Р-ЯМР спектры (ш vivo) S. platensis, выращенной без (А), в присутствии 20 (Б) и 100 (В) мг/л NajScCb. Число сканирований 4500 (А) и 3000 (Б, В),

Исследование динамики накоплении селена в клетках & Ыа1еп$к, Анализ внутриклеточного накопления селена при культивировании 5, рШепзЬ на средах с различным содержанием Ка^еОз (рис. 3) позволил установить заметное повышение внутриклеточной концентрации Эе уже при минимальной из исследованных концентраций селенита натрия в среде. Содержание внутриклеточного селена находилось в прямой зависимости от концентрации селенита в среде, что, в свою очередь, говорит о неспособности клеток лимитировать его накопление вплоть до легальных величин.

При снижении в среде культивирования

в 1С раз конце; прации серы (с 1,0 до 0,1 г/л

К2304) накопление селена у 5 рШепзЫ Рис. 3. Зависимость количества связанного

5, р1а1епзи атомарного селена от значительно возрастало (таол. 2) в расчете как количества селена, введенного в среду

на сухую массу (вдвое), так и на белок (втрое), культивирования.

па 10 за 40

Содержание Se в среде, мг/л

При этом основная доля селена включалась в белковую фракцию, поскольку его содержание в белке и в суммарной биомассе в расчете на единицу сухой массы практически совпадало.

Таблица 2. Влияние количества серы в среде на накопление селена клетками Л р1а!ею1$ в присутствии 20 мг/л селенита натрия

Концентрация S, мг/л Содержание белка, мг/г Содержание Se

В биомассе Во фракции белков

мг/г сухой массы мг/г сухой массы мг/г белка

300 0,60±0,05 0,155±0,008 0,147±0,01 0,280±0,02

30 0,28±0,03 0,306+0,02 0,25б±0,03 0,914±0,07

В то же время из табл. 2 видно, что при дефиците серы содержание суммарного белка в биомассе уменьшается в 2 раза, что, безусловно, снижает суммарное обогащение биомассы селеном и указывает на изменение ее качественного состава. Таким образом, увеличение отношения Se/S, вероятно, глубоко угнетает синтез белка, хотя при этом и усиливает включение селена в серусодержащие аминокислоты, позволяя в 3.3 раза обогатить селеном белок и только в 1.S раза биомассу.

Влияние цинка на pacj $. platensis..

Внесение в среду культивирования одновременно с инокулягом 2,2 мг/л цинка в составе ZnfNOj)! не изменяло ход графической кривой роста S. platensis (рис. 4 А, кривая 2). Снижение продуктивности культуры наблюдалось до мерс увеличения содержания цинка от 4,4 да 8,8 мг/л. В концентрациях, выровненных по содержанию цинка, ZnSOj оказывал сходный эффект на рост культуры (рис, 4 Б). Однако рост S. platensis ингибировался уже в присутствии 4,8 мтУл цинка в составе ZnClj и не наблюдался при его концентрации в среде 9,6 мг/л (рис. 4 В).

Внесение до 4,4 мг/л цинка в составе Zn(NOj)2 в начале линейной стадии вызывало некоторое стимулирование роста (рис. 5, кривые 2,3). Однако в присутствии 8,8 мг/л цинка, внесенного в начале линейной фазы, культура погибала (рис. 5), чего не наблюдалось при внесении такого же количества этой соли в период лаг-фазы (рис. 4 А). Сравнение ростовых кривьк рис. 4 А и 5 показывает, что при внесении цинка на линейной стадии порог чувствительности S.plaiensis к этому металлу снижается.

Врш, сутки

Рис, 4. Влияние цинка на рост S. р1д1етий.

Количество внесенного цинка составляло (мг/л): (А) в составе Zn(NOj): - 0 (1, контроль), 2,2 (2), 4,4 (3), б,б (4), 8,8 (5); (Б) в составе ZnSO« - 0 (1, контроль), 2,3 (2), 4,6 (3), 6,8 (4), 9,1 (5); (В) в составе ZnClj -0(1, контроль), 4,8 (2), 9,6 (3). Соли вносили вместе с инокулятом.

Рис, 5. Влияние цнкка на рост S. platensis при внесении ZnCNOî)î на линейной стадии роста. Количество внесенного цнкка составляло (мг/л): 0(1, контроль), 2,2 (2). 4,4 (3), 6,6 (4), 8,8 (5).

5 7 9 Время, сутки

11

Изучение биохимическое состава S. platensis, выращенной в присутствии ионов цинка. Исследование биохимического состава S. platensis показало, что содержание тотального белка в клетках уменьшалось по сравнению с контролем при введении в среду культивирования нитрата цинка (табл. 3).

При увеличении концентрации цинка до 8,8 мг/д содержание общего белка в клетках сокращалось втрое по сравнению с контролем. Такое подавление биосинтеза

11

белка, вероятно, связано со стрессовым воздействием тяжелого металла на клетку. Анализируя кривые роста (рис. 4 А) мы видим также, что эта концентрация цинка вызывает сильное ингибирование роста культуры.

Количественное определение хлорофилла показало, что его содержание в клетках рЫепзя практически не изменялось при концентрации цинка в среде от 2,2 до 6,6 мг/л (табл. 4). В присутствии 8,8 мг/л цинка в среде содержание хлорофилла а клетках заметно возрастало.

Табл. 3. Содержание белка и хлорофилла в клетках $. ркиензк яри культивировании на средах, обогащенных цинком

Содержание, % от сух, массы Содержание цинка в среде, мг/л

0 (контроль) 2,2 4,4 6.6 а.в

Белок 61,4±5,2 51,5±4,3 45.8±3,8 47,7±3,2 17,8±1,2

Хлорофилл 3,73±0.20 3,45±0,15 3.65£0,22 3,94±0,25 4,96±0,31

Динамика накопления цинка клетками 51 рШеп$'и. Динамика накопления цинка зависела от стадии развития культуры, на которой микроэлемент вносился в питательную среду. При внесении цинка в среду вместе с инокулятом в концентрациях 2,2 - 4,4 мг/л внутриклеточное накопление цинка в расчете на единицу сухой массы происходило постепенно и достигало максимума на 4-6 день культивирования {рис. 6 А), что соответствовало приблизительно середине линейной стадии роста (рис. 4 А). После чего происходил достаточно быстрый вынос металла из клетки и к 8 суткам (начало стационарной стадии роста) концентрация цинка в клетке была практически равна его внутриклеточной концентрации в начале эксперимента. При внесении цинка на линейной стадии роста наблюдалась быстрая аккумуляция (в течение I ч) тяжелого металла с последующим быстрым выносом металла обратно в среду культивирования (рис. 6 Е). Возможно, эта разница в скорости аккумуляции металла клетками связана с различным составом клеточной оболочки на разных стадиях роста. Также, вероятно, что при длительной адаптации цианобактерии к избытку цинка (рис, 6 А) этот тяжелый металл каким-то образом ком партментал из ируетс я во внутриклеточных структурах, не оказывая влияния на ростовые процессы, а затем постепенно выводиться из клетки на поздних этапах культивирования. При внесении цинка во время активного роста (рис. б Б) клетка создает барьеры для транспорта элемента внутрь клетки, сорбирует металл клеточными оболочками и далее выносит металл в среду культивирования.

О 2 4 6 8 10 о 20 40 60

Время, сутки Время, час

Рис, б. Динамика накопления цинка клетками 3,рШепзй.

Культуру выращивали в присутствии 2п(ЫО})1, Соль вносили вместе с инокулятом (А) на линейной стадии роста (Б) в концентрациях (мг7л): 2,2 (1), 4,4 (2).

Рис. 7, Изменение содержания цинка в клетках 8.рШеп$м (2) и в среде культивирования (1).

Культуру ¿ыр&иговдли в присутствии 21п(ЫОз)г (2»2 мг/л цинка). Соль вносили одновременно с инокулятом (А) к на линейной стадии роста (Б). Пунктиром отмечена (3) расчетная кривая^ вычисленная по формуле; С ^ С внесенного цинка (С « клетке С р среде)-

При расчете содержания внутриклеточного цинка на мл суспензии (рис. 7) видна такая же динамика его изменения, как и при расчете на единицу сухой массы (рис. 6). Остается неясным, почему суммарное содержание цинка в среде и клетке ниже концентрации внесенного цинка (рис. 7 А). Эти потери, представленные расчетной кривой 3, можно объяснить тем, что цинк хелатируется какими-то прижнзнеными выделениями цианобактерии, которые теряются при отмывке клеток после их отделения от среды.

Изменение содержания цинка в среде культивирования является зеркальным отражением его накопления в клетках, если цинк введен на линейной стадии роста (рис, 7 Б). При этом увеличение содержания внутриклеточного цинка полностью коррелирует со снижением содержания металла в среде, что свидетельствует о прочной связи цинка в клетках цианобактерии.

Влияние света на вн утр и^лето ^ное накопление цинка S. platens is. Как видно из рис. 8, клетки S. pratensis способны накапливать цинк как на свету, так и в темноте. Но если на свету клетки накапливали цинк только в течение первого часа экспозиции и далее постепенно выводили его в среду культивирования, то в темноте наблюдалось практически постоянное накопление цинка в течение 48 ч.

Вероятно, иа свету в активно фотос интезиру ю щих клетках S. plaiensis индуцируются металлорегуляторные системы (Patzer and Hantke, 2000; Outten and O'Halloran, 2001), ограничивающие аккумуляцию цинка и активирующие вынос тяжелого металла в среду культивирования.

Рис. 8, Влияние света на накопление цинка клетками 3. р1агепзп.

Культуру выращивали в присутствии 2,2 мг/л 2пОТО))2. Соли вносили на линейкой стадии роста. После внесения цинка в питательные среды клетки 60 экспонировали на свету (1) и в темноте (2).

2 4

20 40 Время, час

Адсорбция цинка сухой фкомассой £ plQ(en$is. В мертвых клетках максимальное количество цинка накапливалось уже в первые минуты после внесения металла в среду, как результат формирования связей металла с клеточными оболочками. Биосорбция тяжелых металлов «неживыми» клетками установлена также другими авторами (Kuyucak and Volesky, 1990; Sag and Kutsal, 1996),

Металле вяз ывающие соединения S. olatensis. При разделении биомассы S.ptoensiSt обогащенной цинком, на фракции было показано, что около 70% иннка содержится в составе суммарного клеточного белка, и около 30% цинка обнаруживалось в составе липофильных соединений. При этом две трети от тотального белка клетки включалось во фракцию растворимых белков. В 80-е годы из растительных организмов были выделены специфические металл связывающие белки металлотионеины и фитохелатины, которые активно синтезируются в организме под влиянием высоких концентраций тяжелых металлов (Алексеева-Попова, 1991). Наиболее хорошо изученными на сегодняшний день являются металл связывающие белки, выделенные из ряда цианобактериальных штаммов с молекулярной массой в пределах 3-15 кДа (Turner and Robinson, 1995; Biindaueret al, 2002).

При хроматографическом разделении фракции растворимых белков было показано, что практически весь цинк включается в белки с молекулярными массами от 3 до 15 кДа (рис. 9).

«с и

2. X о 00 г«

I

5

S

2*103 14,0 1,8 0,2

Молекулярная масса, кДа

1М01 15,0 3,0 0,8 Молекулярная масса, кДа

Ряс. 9. Хромато Графическое разделение белков р!а(е>ц£г,

Цианобактерию выращивали на стандартной среде Заррука (А) и на той же среде при добавлении 4,4 мг/л цинка (Б), Пунктирная линия показывает относительное содержание цинка в расчете на единицу белка.

Па элсюрофорсграмме видно несколько полос, соответствующих белкам с молекулярными массами ниже М кДа (рис, 10). Можмо ](рсдположить, что 5'. рШепая также обладает способностью синтезировать белки, связываю* ¡тис тяжелые металлы, что попытает устойчивость циакобакгериальной клетки к стрессовому воздействию тяжелых металлов.

М

кДа

25 -

14 -

Рис, 10. Электрофорстнческое разделение цннксодержащих белков $.рШепж М - маркеры молекулярной массы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, Зр>ги1та ркиети:, в отличие от большинства фотосиитерирующих микрооршшмо», проявляет высокую толерантность к селену и цинку.

Механизмы детоксикации токсического действия селенит-ионои связаны со способностью клеток восстанавливать 8е(1У) до элементарного селена, что ограничивает его поступление в клетку. По-видимому, это один из основных механизмов устойчивости к селену, поскольку его накопление пропорционально содержанию этого элемента л среде. При значительном внутриклеточном накоплении селена обнаруживаются изменения и биохимическом составе клеток, нарушение клеточного гомсостаза, связанного с подкислсшкм рН цитоплазмы, что приводит к гибели клеток. Снижение концентрации серы в среде увеличивает включение селена в ссрусодсржащие аминокислоты, однако, ипгмирует синтез белка.

Механизмы устойчивости циапобакгерии к цинку, вероятно, связаны с сорбцией металла юкгточной стенкой, индукцией металлсвизываютцих белков и экспортом пинка из клетки в культуральпую среду. При этом динамика накопления цинка зависит от стадии роста 5. рШетЫ, на которой металл вводился в среду.

Проведенные комплексные исследования позволяют определить оптимальные концентрации селена и цинка для внесения в среду культивирования, которые не вызывают йпгибиропапия роста культуры и изменений биохимического состава биомассы дня оптимизации внутриклеточного накопления этих элементов и получения биомассы, обогащенной селеном и цинком.

вьтоды

1. Показано, что S. platensis чрезвычайно устойчива к действию высоких концентраций селена и цинка. Культура сохраняет способность к росту, хотя и сильно подавленную, при концентрациях селенита натрия в среде 170 мг/л, нитрата и сульфата цинка 40 мг/л.

2. Показано, что содержание внутриклеточного селена находится в прямой зависимости от концентрации селенита в среде, что, очевидно, говорит о' неспособности клеток S. platensis лимитировать накопление Se вплоть до летальных величин,

3. Содержание селена в белке и биомассе может быть увеличено црн увеличении соотношении Se/S в культуральной среде.

4. Динамика накопления пинка зависит от стадии роста культуры, на которой элемент вносился в питательную среду и продолжительности культивирования. Максимальное накопление цинка наблюдается через несколько сугох при внесении его вместе с шкжулятом и через несколько часов при внесении на линейной стадии роста.

5. Показано, что практически весь селен включаете* в белковую фракцию. Около 70% цинка обнаруживается в составе суммарного клеточного белка S. platensis. При этом две трети цинка включается в растворимые белки с молекулярной массой 3-15 кДа. 30% цинка обнаруживается в составе лшюфилышх соединений.

6. Сухая биомасса S. platensis способна сорбировать цинк.

7. В темноте клетки накапливают больше цинка, чем на свету.

8. Определение пределов концентраций Se и Zn не вызываю» них изменений биохимического состава и мотивирования роста, а также исследования динамики накопления Zn от стадии развития культуры могут служить основой для разработки технологического процесса получения биомассы S. platensis, обогащенной селеном и цшком.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ковшова ЮЛ., Милехин НА., Лапин A.B., Попова В.В., Мишина И.М„ Пронина tLA. Аккумуляция микроэлементов клетками Spiruiina platensis Н Горизонты физико-химической биологии: Тез. докл. - Пущнно, 2000. - С. 319-320.

2. Попова В.В., Ковшова Ю.И., Цоглин Л.Н., Пронина H.A. Культивирование Spiruiina platensis на средах, обогащенных микроэлементами // Биотехнология — народному хозяйству: Тез. докл. 1-го Межд.симп.-Москва, 2000,

3. Пронина H.A., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Цоглин Л.Н., Габель Б,В. Способ получения обогащенной селеном биомассы спнрултш {Spiruiina platensis). Патент РФ № 2399582 от 24 октября 2000г.

4. Попова В.В., Ковшова Ю.И., Пронина H.A. Накопление селена в клетках Spiruiina platensis при культивировании на селенит содержащих средах // Автотрофные микроорганизмы: Тез. докл. - Москва, 2000. - С. 150-151.

5. Пронина НА., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Цоглин Л.Н, Получение биомассы Spiruiina platensis, обогащенной микроэлементами It Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами я создания функциональных продуктов: Тез. докл. 1-ой Межд. конф, - Москва, 200!. • С. 236-238,

6. Попова В.В., Тучная O.A., Пронина H.A. Обогащение клеток Spiruiina platensis цинком // Достижения биотехнологии на благо будущего человечества: Тез, докл. Межд. конф. • Самарканд, Узбекистан, 2001. - С.34.

7. Popova V.V., Kovshova U.L, Mazo V.K., Pronina N.A. Accumulation of trace elements by Spiruiina platensis (1 Plant under environmental stress: Abstr, Intern. Symp. - Moscow, 2001, - C,

8. Nalimova A.A., Popova V.V., Pronina N.A. Enrichment of Spiruiina platensis cells with Cu and Zn //Molecular genetics and biotechnology: Abstr. Intern. Symp. - Moscow, 2001,

9. Пронина H.A., Ковшова Ю.И., Попова B.B., Лапин А.Б., Алексеева С.Г., Баум Р.Ф., Мишина И.М., Цоглин Л.Н. Влияние селенит ионов на рост и накопление селена у Spiruiina platensis U Физиология растений. - 2002. - Т.49, № 2. - С, 264-271,

10. Попова В.В., Пронина Н.А. Влияние различных солей цинка на рост и биохимический состав Spiruiina platensis // Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами н создания функциональных продуктов: Тез. докл. 2-ой Межд. конф. - Москва, 2003.

11. Popova V.V„ Pronina N.A. The influence of anions and light on the growth of Spiruiina platensis and intracellular zinc accumulation // Biotechnology of microalgae: Abstr, 5th workshop -Potsdam, Germany, 2003.

12. Попова B.B., Налимова А.А., Пронина НА. Накопление эссенциальных микроэлементов клетками Spiruiina platensis 1! Тез. докл. 5-го съезда ВОФР - Пета, 2003. -С. 321.

227-228.

Издательство ЦП И при механн ко- математическом факультете МГУ им. MB. Ломоносова,

Подписано в печать ¿OOS Формат 60x90 1/16. Уся. печ. л. ¿О Тираж экз. //О • Заказ S^f

Лицензия на издательскую деятельность ИД В 04059, от 20.02.2001г.

Отпечатано с орнгннал-махета на типографском оборудовании механико-математического факультета н Франко-русского центра им. A.M. Ляпунова.

».1573