Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние Rhodococcus-биосурфактантов на процессы десорбции и деградации нефтяных углеводородов в почве

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние Rhodococcus-биосурфактантов на процессы десорбции и деградации нефтяных углеводородов в почве"

На правах рукописи

/7

003058135

РЫЧКОВА Марина Ивановна

ВЛИЯНИЕ ДЯОООСОССЮ-БИОСУРФАКТАНТОВ НА ПРОЦЕССЫ ДЕСОРБЦИИ И ДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ В ПОЧВЕ

03 00 07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2007

003058135

Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Соловых Галина Николаевна доктор биологических наук, профессор Артамонова Валентина Сергеевна

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов

Защита состоится «//» tAl&i- 2007 г в /X часов на заседании диссертационного совета Д 004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, г Пермь, ул Голева, д 13 Факс (342)244 67 11

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http /www iegm ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь р член-корр РАН

Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Загрязнение окружающей среды сырой нефтью и нефтепродуктами является важной экологической проблемой, возникающей в процессе добычи, транспорта и переработки нефти Почва аккумулирует нефтяное загрязнение в большей степени по сравнению с атмосферой и природными водами Нефтяные углеводороды оказывают негативное влияние на агрофизические и агрохимические свойства почвы, делая ее непригодной для ведения сельского хозяйства Оптимальное сочетание агротехнических мероприятий позволяет снизить уровень почвенного загрязнения на 30-40% в основном за счет окисления легкодеградируемых компонентов нефти При этом высокомолекулярные парафины, иолиароматическис и гетероциклические соединения адсорбируются почвенными частицами и становятся недоступными для микроорганизмов, что приводит к замедлению процессов самоочищения почвы (Коронелли, 1996, Boromn, 2001) Для повышения биодоступности гидрофобных поллютантов широко используют поверхностно-активные вещества (сурфактстты), которые способствуют десорбции и солюбилизации нефтяных углеводородов, тем самым, обеспечивая их ассимиляцию микробными клетками Однако применяемые с этой целью синтетические сурфактанты представляют собой токсичные вещества с низкой степенью деградабельности (Mulligan et al, 2001, Cort et al, 2002, Noordman et al, 2002, Doong, Lei, 2003) Накопление их в почве приводит к ее вторичному загрязнению, имеются сведения (Brucheim et al, 1999, Jahan et al, 1999) о подавлении углеводородокисляющей активности почвенных бактерий при внесении синтетических сурфактантов

Наиболее перспективным представляется использование биосурфактантов микробного происхождения, ибо они характеризуются низкой токсичностью, легкой биодеградабельностью, устойчивой активностью в экстремальных условиях среды (Коронелли и др , 1993, Desai, Banal, 1997, Lang, Wagner, 1999, Chnstofi, Ivshma, 2002, Makkar, Cameotra, 2002) Известно, что активными продуцентами биосурфактантов являются актинобактерии рода Rhodococcus (Коронелли 1984, 1988, Ившина и др, 1993, 1995, Kuyukina et al, 2005) Установлено, что синтез биосурфактантов клетками родококков

индуцируется только в присутствии жидких углеводородов, Rhodococcus-биосурфактанты представляют собой гликолипидные комплексы с широким спектром функциональной активности (Куюкина, 2006, Lang, Philp, 1998, Philp et al, 2002)

Следует отметить, что, несмотря на все возрастающий интерес к бактериальным сурфактантам как агентам биоремедиации, до сих пор недостаточно изучены особенности их влияния на почвенные биоценозы, а также механизмы десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под воздействием биосурфактантов

Цель настоящей работы - изучение влияния Rhodococcus-биосурфактантов на процессы десорбции и разрушения нефтяных углеводородов в почве

Основные задачи исследования

1 Среди культур, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www tegm ni/iegmcol), отобрать штаммы родококков - активные продуценты биосурфактантов

2 Определить нефтеэмульгирующую и нефтеотмывающую активность биосурфактантов, синтезируемых родококками при росте на жидких н-алканах

3 Провести сравнительные исследования особенностей процессов десорбции и мобилизации нефтяных углеводородов в почве под действием биогенных и синтетических сурфактантов

4 Оценить возможность использования Rhodococcus-биосурфактаитов для биоремедиации нефтезагрязненной почвы в лабораторных и полевых условиях

Научная новизна. На основе изучения большого массива коллекционных штаммов Rhodococcus spp отобраны культуры родококков, синтезирующие биосурфактанты с высокой поверхностной и межфазной активностью при росте на жидких н-алканах Установлено, что Rhodococcus-биосурфактанты характеризуются выраженными эмульгирующими свойствами и способствуют формированию стабильных (Ег4=54-86%) водно-углеводородных эмульсий из сырой нефти и нефтепродуктов Определены эффективная доза (2,0 г/л) внесения биосурфактантов и оптимальные условия десорбции нефтяных

углеводородов от почвенных частиц под воздействием Я/юЛ>соссм.$-биосурфактантов Выявлено, что биосурфактанты, продуцируемые родококками при росте на и-додекане (С]2), наиболее эффективны в процессах нефтеотмывания почвы при низкой (10-15°С) температуре Экспериментально обосновано положительное влияние /?/гог/ососс(«-биосурфактантов на процессы микробиологической деструкции нефтяных углеводородов в почве

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о роли актинобактерий рода ЮюЛососсиз в процессах восстановления нефтезагрязненной почвы, раскрывают механизмы десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под действием биосурфактантов, а также подтверждают целесообразность и необходимость использования Л/юЛ?сосси5-биосурфактантов в биотехнологиях очистки нефтезагрязненных почв В результате проведенных исследований отобраны штаммы родококков, активно продуцирующих биосурфактанты с высокой нефтеэмульгирующей и нефтеотмывающей активностью Разработана математическая модель процесса фильтрации нефтяных углеводородов в почве под воздействием биосурфактантов, на основании которой осуществлен прогноз интенсивности распространения нефтяного загрязнения в почве, а также выбор адекватного способа применения биосурфактантов для восстановления нефтезагрязненной почвы Определены оптимальные условия применения Лйо^/ососсм^-биосурфактантов в сочетании с агротехническими приемами для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы

Основные положения, выносимые на защиту

1 Биосурфактанты, синтезируемые актинобактериями рода ЯЛоАзсосгмз при росте на жидких н-алканах, характеризуются высокой нефтеэмульгирующей активностью

2 Нефтеотмывающая активность /?/го£/ососси5-биосурфактантов зависит от температуры внешней среды В холодных (10-15°С) условиях процесс десорбции нефти наиболее эффективно протекает при использовании биосурфактантов, продуцируемых родококками при росте на н-додекане

3 ЯЛосйэсоссад-биосурфактанты оказывают стимулирующее воздействие на развитие бактериального и растительного ценозов нефтезагрязненной почвы

4 Внесение КЛбк/ососсих-биосурфактантов способствует ускорению процесса биодеградации нефтяных углеводородов в почве и повышению степени эффективности биоремедиации нефтезагрязненных почв

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Москва-Пермь, 1993, VI Всероссийской научной конференции «Новые направления биотехнологии», Пущино, 1994, Международном конгрессе по нефтяному загрязнению почвы, Лондон, 2001, II Международной конференции «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, 2005, III Международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 2005 По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ Связь работы с крупными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5 28, номер госрегистрации 01 9

70 005279) Исследования поддержаны грантами РФФИ № 04-04-97518р.0фи

и ИНТАС 01-2151

Объем и структура работы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 18 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 240 наименований, в том числе 67 на русском и 173 на английским языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали 60 культур родококков, принадлежащих к пяти видам Rhodococcus R erythropolis (25 штаммов), "R longus" (4 штамма), R opacus (4 штамма), R rhodochrous (6 штаммов), R ruber (21 иламм) и

поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (www iegm.ru/iegmcol/strains) Родококки выращивали в течение 3-5 сут при 28°С в минеральной среде "Rhodococcus surfactant" (Catalogue of strains, 2006) в присутствии (3,0 об %) н-додекана (С]2) или //-гексадекана (Ci6) с добавлением дрожжевого экстракта (1,0 г/л)

Для выделения ДЛос/ососси^-биосурфактантов использовали метод экстрагирования метил-тре/п-бутиловым эфиром (Kuyukina et ai, 2001) Поверхностное и межфазное натяжение биосурфактантов измеряли с помощью автоматизированного тенсиометра (DB2kS, White Electncal Instrument Co Ltd, Англия) после предварительной обработки исследуемых образцов ультразвуковым диспергатором Soniprep 150 (Япония) (23 кГц, 0,7 А) в течение 1 мин Эмульгирующую активность биосурфактантов анализировали методом пробирочной пробы (Коронелли, Юферова, 1990) и оценивали по индексу эмульгирования (Е, %), регистрируемого через 6 мин, 1 ч, 24 ч и 2 нед Определение оптической плотности (ОП54о„м) образуемых водно-углеводородных эмульсий проводили на спектрофотометре LAMBDA EZ201 Perkin Elmer (США) Размеры капель и однородность эмульсий определяли методом фазово-контрастной микроскопии с использованием микроскопа Axiostar plus (Германия)

В лабораторных опытах по изучению нефтеотмывающей активности /?АоА?сосси5-биосурфактантов использовали образцы нефти с различной удельной плотностью с Кокуйского (р = 0,8660 г/см3), Васильевского (р = 0,8747 г/см3), Шумовского (р = 0,9280 г/см3), Чашкинского (р = 0,9635 г/см3) нефтяных месторождений, а также нефтешлама с Шумовского нефтяного месторождения с различным содержанием органической фракции При этом эксперименты проводили в условиях непрерывного перемешивания (70 об/мин) с использованием орбитального шейкера Certomat IS (Германия) при 28°С Способность биосурфактантов к десорбции и мобилизации нефти определяли в стационарных условиях с использованием модельных почвенных колонок (песок - 40%, глина - 40%, чернозем - 20%) при температуре 15, 22 и 28°С В сравнительных экспериментах использовали синтетический сурфактант Твин 60 (Sigma)

Разработку математической модели процесса десорбции/мобилизации нефти в почве под действием биосурфактантов осуществляли на базе кафедры общей физики Пермского государственного университета с использованием теории фильтрации несмешивающихся жидкостей (Полубаринова-Кочина, 1977)

Оценку возможности применения Rhodococcus-биосурфактатов для биоремедиации нефтезагрязненной почвы проводили в лабораторных условиях с использованием модельной почвы, а также в полевых экспериментах на территории деятельности НГДУ «Полазнанефть» (Межевское нефтяное месторождение, Добрянский р-н Пермского края) с 1998 по 2004 гг с использованием аэрируемых почвенных площадок (2,0 х 2,0 х 1,5 м) При этом использовали пахотную дерново-подзолистую почву, в которую вносили (1 и 5 вес %) сырую нефть, водные растворы (0,2%) биосурфактантов, полученные из R ruber ИЭГМ 231, и минеральные удобрения, содержащие соли азота, фосфора и калия в соотношении 70 5 1 Почвенные образцы, предварительно обработанные ультразвуком (23 кГц, 2 мин), анализировали на присутствие гетеротрофных, аммонифицирующих, олиготрофных, нитрифицирующих, денитрифицирующих, углеводородокисляющих, сульфатредуцирующих бактерий, а также актиномицетов и мицелиальных грибов с использованием накопительных питательных сред (Atlas, 1993) методом предельных разведений и высевом на плотные питательные среды (Методы бактериологии, 1983) Идентификацию углеводородокисляющих микроорганизмов проводили с использованием Определителя Берджи (1999), а также диагностических таблиц и ключа, предложенных И Б Ившиной (1997) для видовой дифференциации бактерий рода Rhodococcus

Ферментативную окислительную активность почвенных бактериоценозов оценивали по скорости выделения СОг методом газовой хроматографии (Семенов и др , 1998) Для сравнения использовали Инипол ЕАР 22 - препарат на основе синтетического сурфактанта, широко используемого в работах по восстановлению нефтезагрязненных почв (Pnchard, 1992) Определение общего содержания нефтепродуктов, полярной и неполярной нефтяной фракции в почвенных образцах проводили весовым методом по количеству

углеводородной фракции, выделенной хлороформенной и гексановой экстракцией (ОСТ 41-93, 1993) Структурно-групповой состав нефти определяли методом ИК-спектрометрии на базе лаборатории исследования технологических процессов при отборе и подготовке нефти, газа и воды ОАО «ПермНИПИнефть»

Исследование влияния Rhodococcus-биосурфактатов на рост и развитие растений проводили методом биотеста с использованием проростков редиса красного Raphanus radícula сорта Цимлянский Для восстановления почвенного плодородия нефтезагрязненной почвы применяли смесь многолетних травяных культур клевер луговой (Trifolium pratense), костер безостый (Bromus exaristatus) и тимофеевка луговая (Phleum pratense) (Лозановская и др, 1998) Степень фитотоксичности рекультивируемой почвы определяли по общей биомассе растений Токсичными считали почвы, вызывающие угнетение роста растений на 20-30% и более (Лозановская, 1998)

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft lnc , 2003)^Statistica, версия 6,0 (StatSoft lnc, 2001), рассчитывая среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительные интервалы Для оценки степени достоверности различий средних данных использовали /-критерий Стьюдента (Лакин, 1990)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Отбор продуцентов биосурфактантов и сравнительное исследование функциональных характеристик ЯАо^ососсиж-биосурфактантов. Как видно из рис 1, строгой корреляции между видовой принадлежностью исследуемых штаммов родококков и функциональной активностью синтезируемых ими биосурфактантов не выявлено По нашим данным, разные штаммы одного и того же вида родококков синтезируют биосурфактанты с различной функциональной активностью Так, биосурфактанты из R opacus и R erythropolis эффективно снижают поверхностное натяжение воды от значения 72,0 до 26,0 и 25,6 мН/м, соответственно При этом биосурфактанты, полученные из культур R ruber и "R long us", снижают межфазное натяжение двухфазной системы «н-гексадекан/вода» от 32,0 до 1,7 мН/м Установлено, что Rhodococcus-биосурфактанты проявляют выраженную эмульгирующую активность и

формируют аодно-угпево дородные эмульсии с высокими (Е:>,!^4$-54%) значениями индекса эмульгирования. При этом 6 и осу рфа ктан ты, синтезируемые большинством исследуемых штаммов рояококков, образуют стабильные, не расслаивающиеся в течение 3-7 сут эмульсии типа «масло в воде». Отличительная особенность б и осу рфа ктан гов, синтезируемых представителями I?. орасм - формирование эмульсий типа «иода в масле», что может иметь значение при стабилизации олеоф ильных гетсрофаэных систем различного состава (ВскЬиг е! а!., 1998).

123456789 10 11 Ш таммы

■ Поверхностное натяжение Ш*Jмульгнруюта* активность □ Межфазное натвженне

Рис. 1 Функциональные характеристики Rhodococcus-

биосурфактантов. Продуценты: 1-4 - R. erylhropolis ИЭГМ 20, ИЭГМ 185, ИЭГМ 188, ИЭГМ 271; 5-6 - UR. longus " ИЭГМ 68, ИЭГМ 32; 7-8 - R. opacus ИЭГМ 56, ИЭГМ 60; 9-11 - й- ruber ИЭГМ 327. ИЭГМ 231, ЮГМ 235.

По нашим данным, Rhodococcus-6носурфактанты проявляют выраженные эмульгирующие свойства не только в отношении индивидуальных углеводородов, но также сырой нефти и нефтепродуктов (табл. 1). При этом наиболее стабильные, не расслаивающиеся в течение двух недель эмульсии образуются m сырой нефти (Е2„м=80,2%) и дизельного топлива (ЕзНЫ1=71,2%). Полученные результаты свидетельствуют о возможности промышленного и экологического применения Р/|с^ососс1«-биосурфактантов в качестве нефтеэмульгирующих агентов.

Таблица 1,

Эмульгирующая активность биосурфактантов из R. ruber ИЭГМ 231

Углеводородный субстрат Е о,[> * Е ,.о, % Е24, % Е 2 нед. t %

н-Додекан 89,2 ± 2,9 59,9 ±1,3 44,8 ± 1,1 И.О.

н-Гексадекан 86,6 ± 3,5 54,9 ± 1,7 53,9 ±1,7 н.о.

Керосин 82,6 ± 9,0 76,4 ± 6,0 76,4 ± 6,0 8,0 ±3,7

Дизельное топливо 74,4 ± 3,3 75,2 ±2,2 61,6 ±4,4 71,2 ±6,1

Минеральное масло 67,0 ± 7,7 42,0 ±4,1 22,7 ± 4,6 8,7 ± !,8

Нефть 95,0 ±9,4 80,2 ± 9,9 85,7 ±4,1 80,2 ± 7,4

Примечание. Едл, % - индекс эмульгирования через 6 мин; Е[ 0, % — через 1 ч; Е24, % - через 24 ч; Ег 1[сд, % - через 2 нед; «н о.» - не определено.

Как видно из рис. 2, эмульсионные системы, формируемые с использованием Л/шА^сосс иI - би ос урфакта Е1То в, характеризуются высокой гидродинамической стабильностью и не разрушаются после центрифугирования в течение 5-15 мин. Средние размеры капель полученных эмульсий варьируют от 2 до 3 мкм (табл. 2).

Це [(три фугирован не 3000 об/мин

60 5 10

Время, мни

15

Рис. 2. Гидродинамическая устойчивость водно-

углеводородных эмульсий.

Приведены средние показатели оптической плотности (ОП54о) эмульсий после отстаивания и центрифугирования.

IR ruber

9 R erylrhropolis □ Н ¡ongus

При этом биосурфактангы, синтезируемые клетками R. erythropolis и R. ruber, характеризуются формированием наиболее мелкодисперсных и однородных, а R. opacus - г етерогенных, эмульсий с различными размерами капель.

Таблица 2

Морфология водно-углеводородных эмульсий

Биосурфактант из

Диаметр капель эмульсий, мкм

R erythropolis ИЭГМ 185 2,08 + 0,20

ИЭГМ256 1,98 ±0,10

"R longus"

ИЭГМ 33 1,73 ±0,10

ИЭГМ 68 1,93 ±0,01

R opacus

ИЭГМ 57 3,19 + 0,30

ИЭГМ 716 2,18 ±0,20

ИЭГМ 717* 4,09 + 0,41

R ruber

ИЭГМ 73 2,46 ± 0,20

ИЭГМ 93 2,09 ±0,02

ИЭГМ 235 2,73 ±0,20

Примечание *Эмульсия типа «вода в масле»

Изучение нефтеотмывающих свойств /Нют/ососсде-биосурфактантов.

В опытах по разделению нефтезагрязненного песка и нефтешлама выявлена прямая зависимость нефтеотмывающей активности биосурфактантов от используемой концентрации (рис 3) Так, оптимальная концентрация биосурфактантов, выделенных из клеток R ruber ИЭГМ 231, составляет 2,0 г/л, что обеспечивает эффективную десорбцию нефти от почвенных частиц на уровне 62-98% Известно (Kyukina et al, 2003), что критическая мицсллярная концентрация Rhodococcus-бтсурфактатов из клеток R ruber ИЭГМ 231, составляет 0,72 г/л В связи с этим можно предположить, что процесс отделения нефти от почвенных частиц под действием Rhodococcus-биосурфактантов происходит по пути мицеллобразования Установлено, что внесение биосурфактантов способствует увеличению степени нефтеотмывания загрязненного песка в 3-30 раз (рис 4), а нефтешлама в 2-17 раз (рис 5) по сравнению с контрольными показателями

0.001 0.01 0,08 0.1 08 1 2 5

Концентрация Вмссурфяктяя. i>j.>. гУя

Рис. 3 Нсфтеотмывающая активность биосурфактан-тов из R. ruber ИЭГМ 231.

Удельная плотность нефти: 1 - 0,866; 2 - 0,928 г/см3.

№

"Hi J КшпрОЛЬ 1

Удельная плотность нефти г/см3: а - 0,866; б - 0,875; в ~ 0,928: г - 0,964.

Рис, 4 Эффективность нефтеотмыва-ния загрязненного песка с использованием биосурфактантов из родококков:

1 - R. eryihropolis ИЭГМ 271;

2 - "R. longus" ИЭГМ 68;

3 -К. opacus ИЭГМ 60, 4-Й. ruber ИЭГМ 231,

Коктроль I 2

Органическая фракция нефтешлама вес. %' а - 23,0; 6 - 27,0; е - 56,5.

Рис, 5 Эффективность разделения нефтешлама с использованием биосурфактантов из родококков:

1 - R. eryihropolis ИЭГМ 271; 2-R. ruber-ИЭГМ 231.

Следует отметить, что биосурфактанты, синтезируемые родококками разных видов, характеризуются неодинаковой нефтеотмывающей активностью в отношении нефти с различной удельной плотностью (см рис 4) В частности, максимальная (62-76%) степень извлечения тяжелой (р>0,9 г/см3) нефти из загрязненного песка обнаруживается для биосурфактантов, синтезируемых R ruber ИЭГМ 231 и R opacus ИЭГМ 60 В то же время для биосурфактантов, синтезируемых представителями R erythropolis и "R longus", характерна сравнительно невысокая (10-34%) эффективность десорбции тяжелой нефти Как видно из рис 5, наиболее интенсивно под воздействием Rhodococcus-биосурфактантов осуществляется процесс разделения нефтешлама с содержанием органической фракции, не превышающей 30 вес % При этом сепарация более нефтенасыщенного (>50 вес %) шлама оказалась неэффективной, что свидетельствует о возможном концентрационном пределе активности биосурфактантов и целесообразности использования в данном случае физико-химических методов сепарации (Fox, 1996)

Сравнительное изучение процесса десорбции и мобилизации нефти в почве под воздействием сурфактантов в стационарных условиях. При исследовании динамики процесса водо- и нефтесмачивания почвы в модельной почвенной колонке обнаружено, что скорость вертикальной фильтрации гидрофильной (воды) и гидрофобной (нефти) жидкостей в почве увеличивается в 1,5 раза при повышении температуры от 15 до 28°С (рис 6, 7) При этом проникновение нефти в модельной почве осуществлялось на 15-30% медленнее, чем воды, по-видимому, вследствие интенсивной адсорбции нефтяных углеводородов на поверхности почвенных частиц (Ivshina el al, 1998, Deshpande et al, 1999) Нами не выявлено достоверных различий в интенсивности проникновения нефти через почву при температурах 15 и 22°С (см рис 7) В то же время установлено, что при температуре 28°С скорость процесса нефтесмачивания исследуемой почвы является максимальной и достигает в среднем 10 см/ч, что согласуется с литературными данными (Wong, 2005)

2.5 3,5 4,5 Время, ч

Рис 6 Зависимость скорости процесса водосмачиваиия почвы от температуры

3,5 5,5

Время, ч

Рис 7 Зависимость скорости процесса нефтесмачивания почвы от температуры.

Приведенные в табл 3 результаты сравнительного исследования процесса нефтеотмывания загрязненной почвы в стационарных условиях свидетельствуют о том, что способность /?/го^ососс«5-биосурфактантов к десорбции и мобилизации нефти в почве в 1,5-2 раза превышает таковую синтетического сурфактанта - Твина 60 При этом нефтеотмывающая активность биосурфактантов, синтезируемых R ruber ИЭГМ 231 при росте на н-додекане, составляет 43% при 15°С, что в 1,5 раза превышает таковую Твина 60 Данные биосурфактанты целесообразно использовать в процессах нефтеотмывания почвы при низких температурах Важно отметить, что биосурфактанты, продуцируемые при росте родококков на н-гексадекане, замерзают при температуре 15°С С повышением температуры наблюдается существенное увеличение степени извлечения нефти из загрязненной почвы Так, при 22°С степень десорбции нефти составляет 53-65%, а при 28°С - 59-82%, что в 1,5-2 раза выше таковой при использовании синтетического сурфактанта При этом контрольный показатель нефтеотмывания при всех исследуемых температурах (15, 22 и 28°С) относительно невысок (5, 10 и 34%, соответственно), что свидетельствует о низкой эффективности извлечения нефти из нефтезагрязненной почвы с помощью воды

Таблица 3.

Нефтеотмывающая активность (био (сурфактантов в стационарных условиях при различных температурах

Вариант Степень нефтеотмывания почвы (%) при температуре

опыта 15°С 221 28 °С

Вода 5,0 ± 0,43 10,5 ± 1,50 34,4 ± 9,30

Твин 60 27,3 ± 4,50 28,0 ± 3,54 46,0 ± 5,30

Биосурфактант 1 43,0 ± 2.85* 53,0 ± 2.69* 59,0 ± 4,30*

Биосурфактант 2 - 65,0 + 6,06* 82,3 ± 2,60*

Примечание. Биосурфактанты получены из клеток R. ruber ИЭГМ 231, выращенных в присутствии н-додекана (Биосурфактант 1) или н-гсксадекана (Сиосурфактант 2). *Статистически достоверно (р<0,05) от контроля и Тиика 60.

Обнаружена прямая корреляция между скоростью фильтрации био сурфактантов через нсфтеза1~рязненную почву и их нефтеотмыаающей активностью при различных температурах (113=0,94, Р=0,16 при 15"С; Кг=0,99, Р=0,08 при 22°С; Р=0,11 при 28°С). По-видимому, КИоЛососсм-

биосурфактанты характеризуются более низкой величиной сорбции к почвенным частицам, чем синтетический сурфактант - Твин 60. В связи с этим их проникновение через нефтезагрязненную почву происходит быстрее и эффективнее.

На рис. 8 приведены данные структурно-группового состава нефти, извлеченной из модельной почвенной колонки с помощью сурфактантов.

Рис. 8. Структурно групповой состав нефти до (1) и после (2-4) десорбции из модельной почвы с помощью сурфактантов: 2 -контроль (вода); 3 -Твин 60; 4 - биосурфактанты из И. гиЬег ИЭГМ 231.

ЛА/Ж

■ Афшлоы D Гстцхиисы

□ Лроюгншж чтиицти

Следует отметить, что для нефти, извлеченной иод действием Rhodococcus-биосурфактантов, характерно повышение относительного содержания ароматических компонентов в 3,6 раза и пятикратное снижение концентрации асфальтеновой фракции по сравнению с исходной нефтью Такая нефть с низким содержанием асфальтенов характеризуется более высокой степенью биодоступности для микроорганизмов (Uraizee, Venosa, 1998)

На основании данных, полученных в экспериментах по изучению скорости проникновения ййог/ососаи-биосурфактантов в модельной почвенной колонке, построена математическая модель процесса нефтеотмывания загрязненной почвы в стационарных условиях под действием биосурфактантов (рис 9) Процесс фильтрации биосурфактантов в нефтезагрязненной почве описывается следующей (неявной) теоретической зависимостью глубины проникновения (Н) от времени (f) Н = t - 1 + е"'

Построенная теоретическая модель демонстрирует качественное и количественное совпадение с полученными экспериментальными данными С помощью разработанной модели проведены теоретическая оценка основных параметров процесса фильтрации биосурфактантов в нефтезагрязненной почве и расчет продолжительности процесса нефтеотмывания почвы в полевых условиях

Изучение влияния ЙЛог/ососпм-биосурфактантов на состояние почвенного биоценоза. Приведенные на рис 10 данные по изучению сравнительной динамики ферментативной активности почвенного микробиоценоза свидетельствуют о том, что внесение Ккобососсич-

Рис 9 Экспериментальная зависимость глубины проникновения ИЬ сн1ососсих-биосурфактантов в нефтезаг-рязненную почву от времени (точки) и ее теоретическая аппроксимация (линии)

Температура

1 - 28°С, 2 - 22°С, 3 - 15°С

0 0,5 1,5 Z5 3,5 4,5 5,5 Время ч

б косу р ф актантов в концентрации 5,0 мг/г в неф геза грязненную почву активизирует процесс почвенного дыхания в 3 раза по сравнению с контролем уже через 48 ч инкубирования.

400 1

I: * &

Í 7 200

toe ■ о

□ 18 ч 0 96 ч

*

1-Х-

rí-

-л ■

Рис. 10. Динамика процесса выделения С()2 в нефтезаг-рязненной почве с внесением с у рф актантов:

I - контроль (без внесения), 2 -Инипол; 3 - Rhodoeoccus-биосурфактанты из R. ruber ИЭГМ 231.

* Статистически достоверно (< 0,05) от контроля и Инипола.

При этом скорость выделения С02 составляет 35Ü мкг/г в сут, что в 2,1 раза выше таковой при внесении синтетического сурфактантного препарата — Инипола. Повышение интенсивности респирации нефтезагрязненной почвы свидетельствует о возрастании ферментативной активности углеводород-окисляющих почвенных микроорганизмов, по-видимому, вследствие увеличения б недоступности нефтяных углеводородов гтод действием биосурфактантов (Christofi, Ivshina, 2002).

При изучении влияния Rh odococcus-5 иосурфактан то в на растительный компонент почвенного биоценоза выявлено отсутствие их фитотоксического действия в отношении тест-культуры - редиса красного (табл. 4)

Таблица 4.

Результаты определения влияния R hodoco сс ы s-б и осу рфа кта нто в на прорастание семян и развитие редиса красного Raphanus radícula

Вариант опыта Концентрация, г/л Всхожесть семян, % Длина корня проростка, см Общая биомасса проростка, мг

Контроль (вода) Al ±1 1,9 ±0,1 153 ± 12

Rhodococcus-биосурфактанты 2,0 49 ±5 2,6 ± 0,3* 247 ±23*

из R. ruber ИЭГМ 231 5,0 47 ±3 2,4 ± 0,2* 212± 18*

Примечание. Приведены средние данные определения 20 проростков.

* Статистически достоверно (р< 0,05) от контроля.

Колее того, значения длины корня и общей биомассы проростков редиса в вариантах опыта с внесением биосурфактантоа превышают контрольные показатели в 1,4 и 1,6 раз, соответственно, В связи с тем, что известны данные (Карпенко и др., 2005) о положительном влиянии глнколипидов на растения, выявленный нами факт стимулирования роста растений под действием ¡(НоЛососсиз - 6 и ос у р фактантои можно, по-видимому, объяснить присутствием в их составе тре] алозолипидое (Киуикша ел а!., 2001).

Опенка влияния К ко(1осо ее «5-би ос у рфа кта нтов на процесс биоремедиацни нефтез а гр я зи с ни о й почвы. Результаты лабораторных исследований свидетельству ¡от о том, что в искусственно зафяэненной нефтью почве присутствуют углеводородокисляющие бактерии на уровне численности [О5 клеток/г (табл. 5). Внесение КкЫососсих-биосурфактантов вызывает повышение количества у гл е водород о кисля ю щи х микроорганизмов и последующую стабилизацию их численности на уровне 107-103 клеток/г. Интенсивное формирование углеводородокисляюшсго бактериоценоза в почве коррелирует с высокой скоростью биодеструкции нефти в почвенных системах как с высоким (5,0 все. %), так и с низким (1,0 вес. %) исходным содержанием нефтепродуктов (рис, 11). Так, эффективность очистки нефтезагрязненной почвы в лабораторных опытах с использованием ^(^¿ососсм-биосурфактатов достигает 45-58% в течение 4 недель. При этом степень деградации алифатических углеводородов в вариантах опыта с внесением биосурфактантов составляет 44 и 60%, соответственно, что в 1,2-1,8 раза превышает соответствующие показатели в контрольной почве (си. рис. 11).

Рис 1!. Содержание остаточных нефтяных углеводородов в лабораторных почвенных системах после 4 недель биоремедиацни.

Варианты опыта: 1,4

о

2

л

i

исходная нефтезагрязненная почва; 2, 5 - почва без внесения биосурфактантов); 3, 6 - почва + Rhodococcu j-биосурфактанты из

R ruber ИЭГМ 231. * Статистически достоверно от исходной

нефтезафязненной почвы и от контроля.

исходной

Таблица 5

Влияние Лйог/ососсн^-биосурфактантов на численность гетеротрофных и углеводородокисляющих бактерий (клеток/г почвы) в лабораторных почвенных системах

Сроки Количество Количество углево-

Характеристика образца эксперимента, недели гетеротрофных бактерий дородокисляющих бактерий

Чистая почва 0 4 (1,4 ± 0,33) х 107 (2,0 ± 0,20) х 107 (3,2 ± 0,55) х Ю5 (3,5 ±0,98) х Ю5

0 (1,1 ±0,13) х 10б (3,0 ± 0,45) х 105

Нефтезагрязненная почва (5,0 вес %) 1 2 (2,5 ± 0,30) х 106 (3,4 ± 0,57) х 10б (5,7 ± 0,24) х 105 (8,1 ±0,54) х 105

3 (6,3 ± 0,73) х 106 (1,8 + 0,57) х 106

4 (5,2 ± 0,20) х 106 (6,8 ± 0,25) х 106

Нефтезагрязненная почва (5,0 вес %) 0 1 (1,4 ± 0,60) х 106 (5,2 ± 0,47) х 106 (3,4 ± 0,38) х 105 (1,5 ± 0,60) х 106

+ ЛЛосЛэсоса«-биосурфактанты из Я гиЬегЯЭГМ 231 2 3 (6,6 ± 0,34) х 106 (6,0 ± 0,63) х 106 (1,6 ± 0,19) х 107 (6,4 ± 0,37) х 107

4 (9,1 ±0,22) х 10® (8,5 ± 0,43) х 107

Нефтезагрязненная почва (1,0 вес %) 0 1 (1,3 ± 0,27) х 107 (8,5 ± 0,80) х 10б (3,8 ± 0,33) х 105 (1,5 ± 0,50) х 106

2 (2,6 ± 0,10) х 107 (8,6 ±0,45) X 106

3 (4,4 ± 0,42) х 107 (1,6 ± 0,32) х 107

4 (6,8 ± 0,86) х 107 (8,8 ± 0,20) X 107

Нефтезагрязненная почва (1,0 вес %) 0 1 (2,0 ± 0,24) х 107 (6,2 ± 0,59) х 106 (3,1 ±0,44) х 105 (5,4 ± 0,30) х 106

+ ЯЛо^ососо«-биосурфактанты из /? гиЪег ИЭГМ231 2 3 (4,7 ± 0,41 )х 107 (6,0 ± 0,35) х 107 (1,2 ± 0,31) Х107 (9,9 ± 0,14) х 107

4 (8,0 ± 0,06) х 107 (5,5 ± 0,09) X 108

Примечание Внесение /?/ю<Аэсосс(м-биосурфактантов (2,0 г/л) проводили еженедельно после отбора почвенных образцов

В последующем микроделяночном опыте исследовали возможность применения /?/ю^ососсм^-биосурфактантов для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы в полевых условиях По литературным данным (Рыбак и др, 1984, Головченко, Полянская, 2001), почвенные микробиоценозы отвечают на умеренное (<5 вес %) нефтяное загрязнение увеличением численности бактерий и микромицетов, что согласуется с выявленным нами (табл 6) повышением общего числа микроорганизмов в почве с исходным уровнем нефтяного загрязнения 1,0 вес %

Характерно, что при загрязнении почвы нефтью в количестве 5,0 вес % отмечается дифференцированное воздействие на представителей различных групп почвенных микроорганизмов Так, в исследуемой нефтезагрязненной почве увеличивается численность аммонифицирующих (от 105до 106 клеток/г) и денитрифицирующих (от 105 до 106 клеток/г) бактерий при одновременном снижении количества нитрифицирующих бактерий (от 104 до 103 клеток/г) и актиномицетов (от 105 до 103 клеток/г) (см табл 6) Численность углеводородокисляющих микроорганизмов оставалась на прежнем уровне (105 клеток/г), тогда как количество гетеротрофных микроорганизмах, снизилось в 10 раз (от 107 до 106 клеток/г) При этом углеводородокисляющий почвенный бактериоценоз отличается значительным разнообразием по сравнению с таковым в искусственных почвенных системах, в частности более широким спектром грамположитсльных бактерий, представленных родами Arhtrobacter, Gordoma, Kocuria, Micrococcus и Rhodococcus При внесении в загрязненную почву биосурфактантов наблюдается повышение на один порядок численности как гетеротрофных, так и углеводородокисляющих бактерий После 12 недель эксперимента исследуемые микробиологические показатели нефтезагрязненной почвы (1,0 вес %), обработанной /?йо^ососс«5-биосурфактантами, в основном приближаются к соответствующим значениям для чистой сельскохозяйственной почвы (см табл 6)

Результаты изучения сравнительной динамики процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы приведены на рис 12 По нашим данным, скорость разложения нефти, обработанной биосурфактантами почве в 1,6-2,0 раза превышает таковую в контрольной необработанной почве

Таблица 6

Динамика численности микроорганизмов (клеток/г почвы) в аэрируемых почвенных площадках

Характеристика образца Общая Численность бактерий физиологических групп, участвующих в циклах С, N и S

численность микроорга низмов, х 107 гетеротрофных, х 107 олиго-трофных, х Ю5 углеводород окисляющих х 105 аммонифицирующих, х 105 нитрифицирующих, х 103 денитрифицирующих, х 105 сульфат-восстанавли вающих Актино-мицеты, х 104 Микро-мицеты, х 104

Чистая 1.5±0,1 1,3±0,3 5,8±1,1 3,8±1,0 3,8+0,3 28,3±1,1 5,5±0,8 32,4±1,1 38,0+1,8 б,2±0,5

почва 1,8±0,1 1,4±0,3 4,8+0,4 3,3 ±1,5 4,0±0,2 20,0±1,7 4,3±0,1 40,8±4,3 46,7±5,6 8,7±0,4

Нефть 0,8±0,3 0,43±0,1 0,6±0,1 6,4±1.2 18,0±0,4 1,2±0,1 10,0±5,5 22,3±0,7 0.23±0,4 80,3±3,9

(5,0 вес %) 7,8±0,3 6,9±0,35 1,7±0,4 80,0 ± 8,5 9,0±2,2 10,0±4,0 7,5±0,3 43,2±8,2 11,4±0,1 16,7±0,6

Нефть 8,0±0.2 0.41 ±0.1 0.45±0,3 15.0±0,8 15,7±0.2 2,3±0,2 11,0±3,0 14,0±0.8 0,18±0,3 76,0+6,2

(5,0 вес %) + БС 21,0±0,4 9,3±3,0 3,3±1,4 1130,0±3,3 5,0±0,4 18,0±3,0 5,0±0,7 44,0±8,0 27,3±0,8 9,7±0,4

Нефть 5,2±0.2 4,8±0.3 2,5±0,5 9,3±0,5 14,4±0,7 10,0±3,6 8,0±14,0 34,9±1,3 9,1±0,58 7,8±1,2

(1,0 вес %) 82,0±0,7 76,0±0,3 6,2±0,2 540,0±0,7 6,3±1,2 12,0±2,0 5,9±0,1 40,0±8,0 20,0±2,6 6,7±0,4

Нефть (1,0 вес %) + БС 5.2±0,6 5.5±0,2 2.3±0.1 35±0.7 12,0±4,0 13.0±3,0 7.0±1.7 24,0±4,5 9.3±0,2 8.4 ±0.2

6,8±0,2 5,4±0,5 6,2±0,2 140,0+0,7 3,0±0,4 26,2±1,3 3,7±0,3 30,0±7,6 36,3±4,0 6,0±0,1

Примечание В числителе численность микроорганизмов после 1 недели, в знаменателе после 12 недель биоремедиации БС - /Мо&>сосс1«-биосурфактанты из R ruber ИЭГМ 231

* Рис 12 Динамика процесса био-4 ремедиации нефтезагрязненной почвы. Варианты опыта 1 - неф-2* тезагрязненная почва (5,0 вес %), 3 2 - кефтезагрязненная почва

(5,0 вес %) + Rhodococcus-био-1 сурфактанты из R ruber ИЭГМ 231,3 - нефтезагрязненная почва (1,0 вес %), 4 - нефтезагрязен-ная почва (1,0 вес %) + Rhodococcus-бчосурфактакты из R ruber ИЭГМ 231 ♦Статистически достоверно

(р< 0,05) от контроля

Время, нед

Следовательно, повышение биодоступности нефтяных углеводородов, десорбированных от почвенных частиц под действием биосурфактантов, обусловливает высокую интенсивность процесса микробиологической деструкции нефти Общая эффективность биоремедиации нефтезагрязненной почвы с использованием /?/ю<&сос««-биосурфактантов составляет 78-93% после 12 недель биоремедиации

Получение оперативной информации о степени восстановления загрязненной почвы возможно при использовании в качестве тест-объектов семян и проростков травяных культур (Киреева и др , 2004, Муратова и др, 2005) По нашим данным (рис 13), в нефтезагрязненной (5,0 вес %) почве происходит значительное угнетение развития фитокультур, в особенности костра безостого и тимофеевки луговой (снижение продуктивности биомассы составляет 96 и 84%, соответственно) Развитие клевера лугового угнетается в меньшей (64%) степени, при этом подавляется рост только наземной части растений, а корневая система остается хорошо развитой В результате обработки загрязненной почвы Rhodococcus-биосурфактантами наблюдается существенное (в 2-5 раз) снижение ее фитотоксичности в отношении исследуемых культур При этом в варианте опыта с низким (1,0 вес %) уровнем нефтяного загрязнения при внесении Khocíococcus-биосурфактантов регистрируется 2-10%-ное стимулирование роста тимофеевки луговой и клевера лугового Уровень биомассы исследуемых

фитокультур практически не отличается от таковых в чистой сельскохозяйственной почве.

6

-ZO

Рис. 13. Фитотоксичность нефтезагрязненной почвы, определенная по общей биомассе растений: клевера лугового (а); костра безостого (б); тимофеевки луговой (в).

1 - нефтезагрязненная почва {5,0 вес. %); 2 - нефтезагрязпенная почва (5,0 вес. %) + Rhodococcus-Guосурфактанты из R. ruber 231; 3 - нефтезагрязненная почва (1,0 вес. %); 4 — нефтезагрязненная почва {1,0 вес. %) + Rhodococcus-биосурфактангы из R. ruber 231.

Полученные данные позволяют предположить, что применение Дйо^£)сос(Ч«-биосурфактантов оказывает стимулирующее воздействие на развитие как бактериальных, так и растительных компонентов почвенного биоценоза, что обеспечивает процесс эффективной очистки почвы и восстановления почвенного плодородия при умеренном (до 5 вес. %) уровне нефтяного загрязнения.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus продуцируют биосурфактанты с высокой нефтеэмулы'ирующей (Ei4= 54-86%) и нефтеотм ы в а ю щей (62-99%) активностью. Десорбция и мобилизация сырой нефти в почве под действием Rhodococcus-б носу рфакта н то в представляет собой сложный нелинейный процесс, описываемый с помощью построенной на основе теории фильтрации математической модели. Экспериментально подтверждено положительное влияние Rh odococcus-б иос у рфа кта нто в на процессы микробиологической деструкции нефтяных углеводородов в почве. Подобраны оптимальные условия

применения К/гойососсих-биосурфактантов в сочетании с агротехническими приемами для ускорения процесса биоремециации нефтезагрязненной почвы

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что биосурфактанты, продуцируемые родококками при росте на жидких н-алканах, проявляют высокую нефтеотмывающую (62-99%) и нефтеэмульгирующую (Е2нса =71-80%) активность в отношении нефти и нефтепродуктов

2 Выявлена прямая зависимость между эффективностью процесса десорбции нефти от почвенных частиц под воздействием ЛАо^ососсм5-биосурфактантов и температурой окружающей среды При этом биосурфактанты, продуцируемые родококками на н-додекане, наиболее эффективны для нефтеотмывания загрязненной почвы при низкой (10-15°С) температуре по сравнению с таковыми, продуцируемыми на н-гексадекане

3 Показано, что К1ю(1ососсш-биосурфактанты оказывают стимулирующее воздействие на развитие бактериального и растительного ценозов нефтезагрязненной почвы

4 Обоснована целесообразность применения ЯИо({ососси5-биосурфактантов для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы В условиях полевых экспериментов с использованием Я1юе1ососсш-биосурфактантов достигнута 93%-ная степень очистки нефтезагрязненной почвы в течение 12 недель биоремедиации

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Ившина И Б , Куюкина М С , Рычкова М И Экологические аспекты использования алканотрофных родококков - новых продуцентов биосурфактантов//В кн Экологическая безопасность зон градопромышленных агломераций Западного Урала - Пермь, 1993 - С 29-30

2 Ившина И Б , Куюкина М С , Рычкова М И , Кристофи Н, Филп Д , Рид П Алканотрофные родококки - активные продуценты биосурфактантов//Междунар конф "Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикологии и эпидемиологии" Тез докл -Москва-Пермь, 1993 -С 55-56

3 Ившина И Б, Каменских Т Н , Куюкина М С , Рычкова М И, Шадрин О А , Рыбалка Л В , Зверева Л В , Чумаков О Б Методы консервации культур

Rhodococcus spp и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков//Микробиология -1994 -Т 63, вып 1 -С 118-128

4 Ившина И Б , Куюкина М С , Рычкова М И Новые продуценты сурфактантов, перспективных для биотехнологии и защиты окружающей среды//У1 Конф Российской Федерации «Новые направления биотехнологии» Тез докл -Пущино, 1994 - С 26

5 Ivshina I В , Kuyukina М S , Ritchkova М I, Philp J С , Cunningham С J , Chnstofi N Oleophilic biofertihzer based on a Rhodococcus surfactant complex for the bioremediation of crude oil-contaminated soil//Contaminated Soil Sediment and Water -2001 -P 20-24

6 Kuyukina M S , Ivshina I В , Ritchkova M I, Kostarev S M , Philp J С , Cunningham С J , Chnstofi N Bioremediation of crude oil contaminated soil using slurry-phase biological treatment and landfarming techmques//I Int Congress on Petroleum Contaminated Soils, Sediments and Water - London, 2001 -P 46

7 Kuyukina M S , Ivshina I В , Philp J С , Chnstofi N , Dunbar S A , Ritchkova M I Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl-tertiary butyl ether extraction//J Microbiol Methods -2001 -V 46 -P 149-156

8 Kuyukina M S , Ivshina I В , Ritchkova M I, Philp J С , Cunningham J С, Chnstofi N Bioremediation of crude oil-contaminated soil using slurry-phase biological treatment and land farming techniques//Soil Sediment Contamination -2003 -V 12 -P 85-99

9 Рычкова M И , Куюкина M С , Криворучко А В , Ившина И Б Сравнительная характеристика нефтедеградирующих свойств биопрепаратов микробного происхождения//Вестник Пермского государственного университета Серия Биология -2004 - Вып 2 — С 142-147

10 Куюкина МС, Ившина ИБ, Рычкова МИ, Филп Дж К Биосурфактанты алканотрофных родококков ферментативное получение и коммерческий потенциал//Матер III Московского междунар конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» Тез докл - Москва, 2005 -Ч 1 -С 338

11 Рычкова М И, Куюкина М С, Ившина И Б Интродукция алканотрофных родококков в нефтезагрязненную почву//Матер II Междунар конф «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» Тез докл - Пермь-Казань-Пермь, 2005 С 87-88

Рычкова Марина Ивановна

ВЛИЯНИЕ ИНОЭОСОССиЪ- БИОСУРФАКТАНТОВ НА ПРОЦЕССЫ ДЕСОРБЦИИ И ДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ В ПОЧВЕ

Автореферат

Подписано в печать 10 04 2007 Тираж 120 экз Уел печ л 1,0 Формат 60x84/16 Набор компьютерный Заказ № 241 к/2007

Отпечатано в типографии ИД «Пресстайм» 614025, г Пермь, ул Г Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рычкова, Марина Ивановна

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Биосурфактанты микробного происхождения

1.1. Природа, структура, типы

1.2. Физиологическая роль биосурфактантов

1.3. Влияние физико-химических факторов на синтез биосурфактнтов

1.4. Практическое применение биосурфактантов

1.5. Характеристика Rhodococcus-биосурфактантов

Глава 2. Влияние биосурфактантов на процесс разрушения нефтяных углеводородов в почве

2.1. Характеристика нефтяного загрязнения

2.2. Пути естественной деградации нефти в почве

2.3. Способы биологической очистки нефтезагрязненных почв

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. Микроорганизмы и условия их культивирования

3.2. Определение поверхностной, межфазной и эмульгирующей 52 активности биосурфактантов

3.3. Изучение нефтеотмывающих свойств Rhodococcus- 54 биосурфактантов

3.4. Изучение процесса десорбции и мобилизации нефти в модельной 57 почве под действием (био)сурфактантов

3.5. Математическое моделирование процесса нефтеотмывания почвы

3.6. Лабораторные эксперименты по биоремедиации нефтезагрязненной 61 почвы

3.7. Полевые исследования по биоремедиации нефтезагрязненной 62 почвы

3.8. Микробиологические исследования

3.9. Аналитические методы исследования

3.10. Определение фитотоксичности

3.11. Статистическая обработка результатов

Экспериментальная часть

Глава 4. Функциональная характеристика Rhodococcus-биосурфактантов

Глава 5. Оценка нефтеотмывающих свойств Rhodococcus-биосурфактантов

Глава 6. Исследование процесса десорбции и мобилизации нефти почве под воздействием (био)сурфактантов

Глава 7. Исследование влияния Rhodococcus-биосурфякгантов на состояние почвенного ценоза

Глава 8. Оценка эффективности использования Rhodococcus-биосурфактантов для биоремедиации нефтезагрязненной почвы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние Rhodococcus-биосурфактантов на процессы десорбции и деградации нефтяных углеводородов в почве"

Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды сырой нефтью и нефтепродуктами является важной экологической проблемой, возникающей в процессе добычи, транспорта и переработки нефти. Почва аккумулирует нефтяное загрязнение в большей степени по сравнению с атмосферой и природными водами. Нефтяные углеводороды оказывают негативное влияние на агрофизические и агрохимические свойства почвы, делая ее непригодной для ведения сельского хозяйства. Оптимальное сочетание агротехнических мероприятий позволяет снизить уровень почвенного загрязнения на 30-40% в основном за счет окисления легкодеградируемых компонентов нефти. При этом высокомолекулярные парафины, полиароматические и гетероциклические соединения адсорбируются почвенными частицами и становятся недоступными для микроорганизмов, что приводит к замедлению процессов самоочищения почвы (Коронелли, 1996; Boronin, 2001). Для повышения биодоступности гидрофобных поллютантов широко используют поверхностно-активные вещества (сурфактанты), которые способствуют десорбции и солюбилизации нефтяных углеводородов, тем самым, обеспечивая их ассимиляцию микробными клетками. Однако применяемые с этой целью синтетические сурфактанты представляют собой токсичные вещества с низкой степенью деградабелыюсти (Mulligan et al., 2001; Cort et al, 2002; Noordman et al, 2002; Doong, Lei, 2003). Накопление их в почве приводит к ее вторичному загрязнению, имеются сведения (Brucheim et al., 1999; Jahan et al., 1999) о подавлении углеводородокисляющей активности почвенных бактерий при внесении синтетических сурфактантов.

Наиболее перспективным представляется использование биосурфактаптов микробного происхождения, ибо они характеризуются низкой токсичностью, легкой биодеградабельностью, устойчивой активностью в экстремальных условиях среды (Коронелли и др., 1993; Desai, Banat, 1997; Lang, Wagner, 1999; Christofi, Ivshina, 2002; Makkar, Cameotra,

2002). Известно, что активными продуцентами биосурфактантов являются актинобактерии рода Rhodococcus (Коронелли 1984, 1988; Ившина и др., 1993, 1995; Kuyukina et al., 2005). Установлено, что синтез биосурфактантов клетками родококков индуцируется только в присутствии жидких углеводородов; Rhodococciis-QuocypfyaKTambi представляют собой гликолипидные комплексы с широким спектром функциональной активности (Куюкина, 2006; Lang, Philp, 1998; Philp et al., 2002).

Следует отметить, что, несмотря на всё возрастающий интерес к бактериальным сурфактантам как агентам биоремедиации, до сих пор недостаточно изучены особенности их влияния на почвенные биоценозы, а также механизмы десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под воздействием биосурфактантов.

Цель настоящей работы - изучение влияния Rhodococcus-биосурфактантов на процессы десорбции и разрушения нефтяных углеводородов в почве.

Основные задачи исследования

1. Среди культур, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol), отобрать штаммы родококков - активные продуценты биосурфактантов.

2. Определить нефтеэмульгирующую и нефтеотмывающую активность биосурфактантов, синтезируемых родококками при росте на жидких н-алканах.

3. Провести сравнительные исследования особенностей процессов десорбции и мобилизации нефтяных углеводородов в почве под действием биогенных и синтетических сурфактантов.

4. Оценить возможность использования ^/юс/ососсг/.у-биосурфактантов для биоремедиации нефтезагрязненной почвы в лабораторных и полевых условиях.

Научная новизна. На основе изучения большого массива коллекционных штаммов Rhodococcus spp. отобраны культуры родококков, синтезирующие биосурфактанты с высокой поверхностной и межфазной активностью при росте на жидких н-алканах. Установлено, что Rhodococcus-биосурфактанты характеризуются выраженными эмульгирующими свойствами и способствуют формированию стабильных (Е24=54-86%) водно-углеводородных эмульсий из сырой нефти и нефтепродуктов. Определены эффективная доза (2,0 г/л) внесения биосурфактантов и оптимальные условия десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под воздействием /?/го^ососсм5-биосурфактантов. Выявлено, что биосурфактанты, продуцируемые родококками при росте на н-додекане (С 12), наиболее эффективны в процессах нефтеотмывания почвы при низкой (10-15°С) температуре. Экспериментально обосновано положительное влияние Я/ю^ососа^-биосурфактантов на процессы микробиологической деструкции нефтяных углеводородов в почве.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о роли актинобактерий рода Rhodococcus в процессах восстановления нефтезагрязненной почвы, раскрывают механизмы десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под действием биосурфактантов, а также подтверждают целесообразность и необходимость использования Я/ю^/ососсия-биосурфактантов в биотехнологиях очистки нефтезагрязненных почв. В результате проведенных исследований отобраны штаммы родококков, активно продуцирующих биосурфактанты с высокой нефтеэмульгирующей и нефтеотмывающей активностью. Разработана математическая модель процесса фильтрации нефтяных углеводородов в почве под воздействием биосурфактантов, на основании которой осуществлен прогноз интенсивности распространения нефтяного загрязнения в почве, а также выбор адекватного способа применения биосурфактантов для восстановления нефтезагрязненной почвы. Определены оптимальные условия применения /?/го^/ососси5-биосурфактантов в сочетании с агротехническими приемами для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биосурфактанты, синтезируемые актинобактериями рода Rhodococcus при росте на жидких //-алканах, характеризуются высокой нефтеэмульгирующей активностью.

2. Нефтеотмывающая активность Я/го^/ососсш'-биосурфактантов зависит от температуры внешней среды. В холодных (10-15°С) условиях процесс десорбции нефти наиболее эффективно протекает при использовании биосурфактантов, продуцируемых родококками при росте на н-додекане.

3. Rhodococcus-6mcyp§aKTmnbi оказывают стимулирующее воздействие на развитие бактериального и растительного ценозов нефтезагрязненной почвы.

4. Внесение Rhodococcus-биосурфактантов способствует ускорению процесса биодеградации нефтяных углеводородов в почве и повышению степени эффективности биоремедиации нефтезагрязненных почв.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Москва-Пермь, 1993; VI Всероссийской научной конференции «Новые направления биотехнологии», Пущино, 1994; Международном конгрессе по нефтяному загрязнению почвы, Лондон, 2001; II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, 2005; III Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Связь работы с крупными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5.28, номер госрегистрации 01.9. 70 005279). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 04-04-97518р.офи и ИНТАС 01-2151.

Объем и структура работы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 18 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 240 наименований, в том числе 67 на русском и 173 на английском языках.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Рычкова, Марина Ивановна

124 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что биосурфактанты, продуцируемые родококками при росте на жидких н-алканах, проявляют высокую нефтеотмывающую (6299%) и нефтеэмульгирующую (Е2нед =71-80%) активность в отношении нефти и нефтепродуктов.

2. Выявлена прямая зависимость между эффективностью процесса десорбции нефти от почвенных частиц под воздействием Rhodococcus-биосурфактантов и температурой окружающей среды. При этом, биосурфактанты, продуцируемые родококками на к-додекане, наиболее эффективны для нефтеотмывания загрязненной почвы при низкой (10-15°С) температуре по сравнению с таковыми, продуцируемыми на н-гексадекане.

3. Показано, что Rhodococeus-биосурфактанты оказывают стимулирующее воздействие на развитие бактериального и растительного компонентов биоценоза нефтезагрязненной почвы.

4. Обоснована целесообразность применения Rhodococcus-биосурфактантов для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы. В условиях полевых экспериментов с использованием Rhodococcus-биосурфактантов достигнута 93%-ная степень очистки нефтезагрязненной почвы в течение 12 недель биоремедиации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus при росте на жидких углеводородах синтезируют биосурфактанты с высокой функциональной (поверхностной, межфазной, эмульгирующей) активностью, которая сопоставима с таковой синтетических сурфактантов (Твина 20, додецилсульфата натрия), а также рамнолипидов, синтезируемых клетками Ps. aeruginosa и сурфактина из В. subtilus (Bernheimer, Avigad, 1970; Ivshina et al., 1998; Christofi, Ivshina, 2002). Показано, что исследуемые Rhodococcus-ftuocypfyamambi характеризуются выраженной нефтеэмульгирующей активностью (Ег4=54-86%) в отношении сырой нефти и нефтепродуктов. При исследовании поверхностно-активных свойств биосурфактантов, продуцируемых родококками разных видов, не выявлено строгой корреляции между таксономической принадлежностью исследуемых коллекционных штаммов и функциональными свойствами синтезируемых биосурфактантов.

Экспериментально подтверждено, что Я/го^ососсия-биосурфактанты в концентрации, превышающей в 2,8 раза значение критической мицеллярной концентрации (Kuyukina et al., 2003), обеспечивают максимальное (62-99%) извлечение нефти различной удельной плотности из нефтезагрязненного песка. В связи с этим можно предположить, что процесс десорбции нефти от почвенных частиц под воздействием Rhodococcus-6mcyp^aKTamoB осуществляется по механизму мицеллообразования, при котором нефтяные углеводороды, заключенные в мицеллы, становятся биодоступными для почвенной биоты (Deshpand et al., 1999). Следует отметить, что Rhodococcus-биосурфактанты характеризуются неодинаковой нефтеотмывающей активностью в отношении нефти различной удельной плотности и нефтешлама с различным содержанием органической фракции. По нашим данным, наиболее интенсивно под воздействием Rhodococcus-биосурфактантов осуществляется процесс извлечения из песка легкой (р<0,9 г/см3) нефти и нефтешлама с содержанием органической фракции, не превышающей 30 вес. При этом сепарация нефтенасыщенного (>50 вес. %) шлама при внесении Я/ю^ососсия-биосурфактантов оказывается неэффективной, что свидетельствует о возможном концентрационном пределе активности биосурфактантов и целесообразности использования в данном случае механических или физико-химических методов сепарации (Fox, 1996).

Нами установлена прямая зависимость процесса нефтеотмывания от температуры окружающей среды. При этом способность Rhodococcus-биосурфактантов к десорбции и мобилизации нефти в почве при исследуемых (15-28°С) температурах 1,5-2 раза превышает таковую синтетического сурфактанта (Твина 60). По-видимому, это обусловлено низкой величиной сорбции /?Ао£/ососсм5-биосурфактантов к почвенным частицам. Показано, что в холодных (15°С) условиях нефтеотмывание целесообразно проводить с использованием биосурфактантов, продуцируемых родококками при росте на н-додекане (Сп). Следует отметить, что десорбированная под воздействием биосурфактантов нефть, содержащая пониженное количество асфальтенов и смол, характеризуется сравнительно более высокой биодоступностью для микроорганизмов (Uraizee, Venosa, 1998).

Экспериментально обосновано положительное влияние Rhodococcus-биосурфактантов на развитие почвенного бактериоценоза, а также на процессы микробиологической деструкции нефтяных углеводородов в почве с разным (1,0 и 5,0 вес. %) уровнем загрязнения. Так, степень биодеградации нефти в аэрируемых почвенных площадках с внесением Rhodococcus-биосурфактантов составляет в зависимости от исходного уровня загрязнения от 78 до 93% после 12 недель биоремедиации.

Важно отметить, что нами не обнаружено ингибирующего воздействия 7?/?0£/о<%>са«-биосурфактантов на растительные компоненты почвенного биоценоза. В дальнейшем в более детальном исследовании нуждается выявленный факт стимулирования развития растений под действием биосурфактантов.

На основании разработанной математической модели процесса фильтрации нефтяных углеводородов в почве под воздействием биосурфактантов осуществлен прогноз интенсивности распространения нефтяного загрязнения в почве и подбор адекватного способа применения биосурфактантов для восстановления нефтезагрязненной почвы.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности промышленного и экологического использования Rhodococcus-биосурфактантов в качестве нефтеэмульгирующих и нефтеотмывающих агентов для биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рычкова, Марина Ивановна, Пермь

1. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества / А.А. Абрамзон, Л.П. Зайченко, С.И. Файнгольд. Л.: Химия, 1988. - 200 с.

2. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв / Е.В. Аринушкина. М.: МГУ, 1970.-488 с.

3. Батраков С.Г. Липиды микобактерий / С.Г. Батраков, В.Б. Муратов,

4. Л.Д. Бергельсон // Биоорганическая химия. 1981. - Т. 7, № 7. -С. 1075-1086.

5. Билай В.И. Микромицеты почв / В.И. Билай, И.А. Элланская, Т.С. Кириленко и др. Киев : Наук, думка, 1984. - 264 с.

6. Благодатская Е.В. Характеристика состояния микробного сообщества почв по величине метаболического коэффициента / Е.В. Благодатская, Н.Д. Ананьева, Т.Н. Мякшина // Почвоведение. 1995. - Т. 2. -С. 205-210.

7. Вадюнина А.Ф. Методы исследования физических свойств почв / А.Ф. Вадюнина, З.А. Корчагина. М.: Агропромиздат, 1986. - 244 с.

8. Восстановление нефтезагрязненных почвенных земель. М. : Наука, 1990.-254 с.

9. Головченко А.В. Влияние нефти на численность, биомассу и жизнеспособность грибов в верховьях торфяника / А.В. Головченко, Л.М. Полянская//Микробиология.-2001.-Т. 70, № 1.-С. 111-117.

10. Гринберг Т.А. Биополимеры, используемые для увеличения нефтеотдачи пластов / Т.А. Гринберг, Т.П. Пирог, A.M. Полищук, Н.В. Краснопевцева // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, № 2. - С. 100-112.

11. И. Грищенков В.Г. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях /

12. B.Г. Грищенков, P.P. Гаязов, В.Г. Токарев и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 1997. - Т. 33, № 4. - С. 423-427.

13. Гузев B.C. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязненных почв / B.C. Гузев, С.В. Левин, Г.И. Селецкий и др. // Микроорганизмы и охрана почв. М., 1989. - С. 129-150.

14. Звягинцев Д.Г. Диагностические признаки различных уровней загрязнений почвы нефтью / Д.Г. Звягинцев, B.C. Гузеев, С.В. Левин, и др. // Почвоведение. 1989. - Т. 1. - С. 72-78.

15. Елисеев С.А. Поверхностно-активные вещества и биотехнология /

16. C.А. Елисеев, Р.В. Кучер. Киев : Наук, думка, 1991. - 116 с.

17. Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus: биоразнообразие, иммунодиагностика, детекция,: дис. : д-ра биол. наук / И.Б. Ившина. -Пермь, 1997.-197 с.

18. Ившина И.Б. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, Л.В. Зверева и др. // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 4. - С. 507-513.

19. Ившина И.Б. Перспективы использования бактерий рода Rhodococcus в биотехнологии защиты окружающей среды / И.Б. Ившина, Е.А. Еловикова, Я.Э. Ляпунов // Экологическая безопасность городов Урала : матер. Регион, науч.-техн. конф. Пермь, 1994а. - С. 41-43.

20. Ившина И.Б. Селективное выделение пропанокисляющих родококков с использованием антибиотических веществ / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина // Микробиология. 1997. - № 4. - С. 494-500.

21. Ившина И.Б. Применение экологической безопасной экспресс-технологии нефтезагрязненных почв и грунтов (на примере районов нефтедобычи Пермской области) / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, С.М. Костарев // Нефтяное хозяйство. 2003. - № 9. - С. 116-118.

22. Ившина И.Б. Новые продуценты сурфактантов, перспективных для биотехнологии и защиты окружающей среды / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, М.И. Рычкова // Новые направления биотехнологии: матер. VI Конф. Российской Федерации. Пущино, 19946. - С. 26.

23. Ившина И.Б. Экологические аспекты использования родококков -новых продуцентов биосурфактантов / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, М.И. Рычкова // Экологическая безопасность зон градопромышленных агломераций Западного Урала. Пермь, 1993. - С. 29-30.

24. Ившина И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, Р.А. Пшеничнов, А.А. Оборин. Свердловск : УНЦ АН СССР, 1987. -125 с.

25. Инструктивные указания по проведению газобиохимических поисковых работ на нефть и газ / под ред. Г.А. Могилевского, Е.В. Стадника. -М.: ОНТИ ВНИИЯГГ, 1974. 116 с.

26. Кабиров P.P. Разработка и использование многокомпонентной тест-системы для очистки токсичности почвенного покрова городской территории / Р.Н. Кабиров, А.Р. Сагитова, Н.В. Суханова // Экология. -1997.-№6.-С. 408-411.

27. Казакова Е.Н. Поиски методов стимуляции биодеградации нефти в почве / Е.Н. Казакова, А.А. Оборин // Освоение Севера и проблема рекультивации : докл. 2-ой Междунар. конф. Сыктывкар, 1994.1. С. 214-217.

28. Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / под ред. И.Б. Ившиной. М. : Наука, 1994.- 163 с.

29. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах / Н.А. Киреева. Уфа : Башк. гос. ун-т, 1995. - 172 с.

30. Киреева Н.А. Комплексное биотестирование для оценки почв, загрязненных нефтью / Н.А. Киреева, М.Д. Бакаева, Е.М. Тарасенко // Экология и промышленность. 2004. - № 2. - С. 26-29.

31. Киреева Н.А. Влияние загрязнения нефтью на фитотоксичность серой лесной почвы // Н.А. Киреева, М.Д. Михтахова, Г.Г. Кухтемов // Агрохимия. 2001. - № 2. - С. 64-69.

32. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов / Т.В. Коронелли. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1984. -158 с.

33. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде / Т.В. Коронелли // Микробиология. 1996. - Т. 32, № 6. - С. 579-585.

34. Коронелли Т.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон

35. Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, В.В. Ильинский и др. // Микробиология. 1994. - Т. 63. - С. 917- 922.

36. Коронелли Т.В. Родококки как природный сорбент углеводородов / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, М.Н. Семененко // Микробиология. -1986. Т. 55, вып. 4. - С. 683-685.

37. Коронелли Т.В. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, С.Г. Юферова и др. // Микробиология. 1993. - Т. 62, вып. 2. - С. 231-236.

38. Коронелли Т.В. Поверхностно-активные свойства некоторых штаммов углеводородокисляющих бактерий / Т.В. Коронелли, С.Г. Юферова // Вестн. Моск. ун-та. Серия 16. Биология. - 1990. - № 1. - С. 14-18.

39. Кутепов П.А. Химическая технология / П.А. Кутепов. -М.: Просвещение, 1989.-253 с.

40. Куюкина М.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus индуцированный биосинтез, свойства : дис. . : д-ра биол. наук / М.С. Куюкина. Пермь, 2006. - 244 с.

41. Куюкина М.С. Способ получения экологически чистых сурфактантов из Rhodococcus / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, Д. Филп, Н. Кристофи

42. Экологически чистые технологические процессы в решении проблем охраны окружающей среды : материалы Междунар. конф. Иркутск, 1996.-Т. 1.-С. 51-54.

43. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая шк., 1990. - 352 с.

44. Лозановская И.Н. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении / И.Н. Лозановская, Д.С. Орлов, Л.К. Садовников. -М.: Высшая шк., 1998. 287 с.

45. Марфенина О.Е. Микологический мониторинг почв: возможности и перспективы / О.Е. Марфенина // Почвоведение. 1994. - № 1. -С.75-80.

46. Методы общей бактериологии : в 3-х т. М.: Мир, 1983. - Т. 1, Т. 2.

47. Милехина Е.И. Свойства углеводородокисляющей бактерии Rhodococcus erythropolis, изолированной из нефтяного месторождения / Е.И. Милехина, И.А. Борзенков, И.С. Звягинцева и др. // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 3. - С. 328-332.

48. Мицевич Е.В. Микроорганизмы как возможные индикаторы интегральной загрязненности почв диоксиносодержащимидефолиантами / Е.В. Мицевич, И.П. Мицевич, В.В. Перелыгин и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. - Т. 36, № 6. - С. 672-678.

49. Муратова А.Ю. Нефтеокисляющий потенциал ассоциативных ризобатерий рода Azospirillum / А.Ю. Муратова, О.В. Турковская, Л.П, Антонюк и др. // Микробиология. 2005. - Т. 74, №2. - С. 248-254.

50. Нестеренко О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Киев : Наук. Думка, 1985.-336 с.

51. Нефти, газы и битумоиды Пермского Прикамья и сопредельных районов. Каталог физико-химических свойств. Пермь, 1977. - 567 с.

52. Новиков В.В. Влияние минерального азота на процессы микробной трансформации метана в почвах / В.В. Новиков, А.Л. Степанов //Почвоведение.- 1999.-Т. 32,№ 10.-С. 1255-1258.

53. ОСТ 41-93. Методы лабораторного определения содержания нефтепродуктов в почвах и грунтах. М. : Миннефтепром РФ, 1993. -12 с.

54. Определитель бактерий Берджи : в 2-х т. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. М.: Мир, 1999. - Т. 1. - 432 с. - Т 2. - 368 с.

55. Полубаринова-Кочина Т.П. Теория движения грунтовых вод / Т.П. Полубаринова-Кочина. М.: Высшая шк., 1977. - 360 с.

56. Рыбак В.К. Микрофлора почвы, загрязненной нефтью / В.К. Рыбак, Е.П. Овчарова, Э.З. Коваль // Микробиол. журн. 1984. - Т. 46, № 4. -С. 29-33.

57. Семенов A.M. Лабораторные тесты для оптимизации интродукции в почву микроорганизмов-деструкторов нефти / A.M. Семенов, И.С. Куличевская, Э.М. Халимов и др. // Прикл. биохим. и микробиол. -1998.-Т. 5.-С. 576-582.

58. Сидоров Д.Г. Полевой эксперимент по очистке почвы от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокислящих микроорганизмов / Д.Г. Сидоров, И.А. Борзенков, Е.И. Милехина и др. // Прикл. биохим. и микробиол. 1997, № 5. - С. 497-502.

59. Солнцева Н.П. Проблемы загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами: геохимия, экология, рекультивация / Н.П. Солнцева, Ю.И. Пиковский, Е.И. Никифорова и др. // Докл. симпоз. VII делегатского съезда Всесоюз. об-ва почвоведов. Ташкент, 1985. -С. 246-254.

60. Стабникова У.В. Применение препарата «Лестан» для очистки почвы от углеводородов нефти / У.В. Стабникова, В.Н. Иванов, Б.Н. Милько // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - Т. 32, № 2. - С. 219-220.

61. Сулейманов P.P. Изменение свойств нефтезагрязненной серой лесной почвы в процессе биологической рекультивации / P.P. Сулейманов, И.М. Габбасова, Р.Н. Ситдиков // Изв. РАН. Серия. Биол. 2005. - № 1. - С. 109-115.

62. Суржко Л.Ф. Утилизация нефти в почве и в воде микробными клетками / Л.Ф. Суржко, З.Н. Финкильштейн, Б.П. Баскунов, и др. // Микробиология. 1995. - Т. 64, вып. 3. - С. 393-398.

63. Тарасенко Е.М. Биологическая активность и токсичность нефтезагрязненных и рекультивируемых почв : дис. . : канд. биол. наук. / Е. М. Тарасенко. Уфа, 2006. - 140 с.

64. Хазиев Ф.Х. Почвы Башкортостана : в 2-х т. / Ф.Х. Хазиев, А.Х. Мукатанов, И.К. Хабиров и др. // Воспроизводство плодородия: зонально-экологические аспекты. Уфа : Гилем, 1997. - Т. 2. -С. 288-299.

65. Шульга А.Н. Экстрацеллюлярные липиды и поверхностно-активные свойства бактерий Rhodococcus erythropolis, зависящие от источникауглерода / А.Н. Шульга, Е.В. Карпенко, С. А. Елисеев // Микробиология. 1990. - Т. 59. - С. 337-443.

66. Abalos A. Enhanced biodegradation of Casablanca crude oil by a microbial consortium in presence of a rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 / A. Abalos, M. Vinas, J. Sabate et al. II Biodegradation. -2004.-V. 15.-P. 60-249.

67. Abu-Ruwaida A. S. Isolation of biosurfatant-producing bacteria product characterization and evolution / A.S. Abu-Ruwaida, I.M. Banat, S. Haditirito et al. II Acta Biotechnol. - 1991. - V. 11. - P. 315-324.

68. Adamczak M. Influence of medium composition and aeration on the synthesis of biosurfactants produced by Candida antarctica / M. Adamczak, W. Bednarski //Biotechnol. Lett. 2000. -V. 22. - P. 313-316.

69. Akit J. Investigation of potential biosurfactant production among phytopathogenic Corynebacteria and related soil microbes / J. Akit, D.G. Cooper, К. I. Manninen, J. E. Zajic // Current Microbiol. 1981. -V.6.-P. 145-150.

70. Alvarez H.M. Identification of phenyldecanoic acid as a constituent of triacylglycerols and wax ester produced by Rhodococcus opacus PD630 / H.M. Alvarez, H. Luftmann, R.A. Silva et al. / Microbiology. 2002. -V. 148.-P. 1407-1412.

71. Arima K. Surfactin, a crystalline peptidolipid surfactant produced by Bacillus subtilis; isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation / K. Arima, A. Kakinuma // Biochem. Biophys. Res. Comm. -1968.-V. 31.-P. 488-494.

72. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective / R.M. Atlas // Microbiol. Rev. 1981. - V. 45. -P. 180-209.

73. Atlas R.M. Hand book of microbiological media / R.M. Atlas. Boca Raton : CRC Press LLC, 2004. - 1960 p.

74. Atlas R.M. Hydrocarbon biodegradation and oil spill bioremediation / R.M. Atlas, R. Bartha // Adv. Microb. Ecol. 1992. - V. 12. - P. 287-338.

75. Atlas R.M. Response of microbial populations to environmental disturbance / R.M. Atlas, A. Horowitz, M. Krichevsky, A.K. Bej // Microbial Ecology. -1991.-V. 22. P. 249-256.

76. Bai G. Biosurfactant enchanced removal of residual hydrocarbon from soil

77. G. Bai, M.L. Brusseau, R.M. Miller // J. Contaminant Hydrology. 1997. -V. 25.-P. 157-170.

78. Ban T. Aqueous microbiol biosurfactants solution exhibiting ultra-low tension at oil-water interfaces / T. Ban, T. Satio // Dev. Petr. Sci. 1993. -P. 115-125.

79. Banat I.M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation / I.M. Banat //Bioresource Technol. 1995 a. - V. 51. - P. 1-12.

80. Banat I.M. Characterization of biosurfactants and their use in pollution removal: state of the art / I.M. Banat // Acta Biotechnol. 19956. - V. 15. -P. 251-267.

81. Banat I.M. The isolation of a thermophilic biosurfactants producing Bacillus sp. / I.M. Banat // Biotech. Lett. 1993. - V. 15. - P. 591-594.

82. Banat I.M. Biosurfactant production and use in oil tank clean-up / I.M. Banat, N. Samarah, M. Murad et al. II World J. Microbiol. Biotechnol. -1991.-V. 7.-P. 80-84.

83. Barkay T. Enhancement of solubilization and biodegradation of poliaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier alasan / T. Barkay, S. Navon-Venozia, E.Z. Ron, E. Rosenberg // Appl. Environ. Microbiol. -1999.-V. 65.- P. 2697-2702.

84. Bartha R. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation / R. Bartha //Microb. Ecol.- 1986. -V. 12.-P. 155-172.

85. Beebe J.L. Extracellular lipid of Thiobacillus thiooxidans / J.L. Beebe, W.W. Umbreit I I J. Bacteriol. 1971. - V. 108.-P. 612-614.

86. Bernheimer A.W. Nature and properties of a cytological agent produced by Bacillus subtillis I A.W. Bernheimer, L.S. Avigad // J. Gen. Microbiol. -1970. V. 61. - P. 361-369.

87. Bodour A. Structure and characterization of flavolipids, a novel class of biosurfactants produced by Flavobacterium sp. strain MTN 11 / A. Bodour, C. Guerrero-Barajas, B. Jiorle et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2004. -V. 1.-P. 114-120.

88. Bodour A. Distribution of biosurfactant-producing bacteria in undisturbed and contaminated arid southwestern soils / A. Bodour, P. Kevin, D. Maier, R. Maier // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 3280-3287.

89. Boronin A. Microorganisms for bioremediation of oil-contaminated sites / A. Boronin // Platform Presentation at the First Int. Congress on Petroleum Contaminated Soils, Sediments and Water. August 14-17. Imperial College, London, UK, 2001. - P. 8.

90. Bruheim P. Effects of surfactant mixtures, including corexit 9527, on bacterial oxidation of acetate and alkanes in crude oil / P. Bruheim,

91. H. Bredholt, К. Eimhjellen // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. -P. 1658-1661.

92. Brusseau M.L. Biosurfactant and cosolvent-enhanced remediation of contaminated media / M.L. Brusseau, R.M. Miller, Y. Zang et al. II Microbial Processes for Remediation, / ed. R.E. Hinchee, F.G. Brockman,

93. C.M. Vogel Columbus. Ohio : Battle Press, 1995. - P. 82-84.

94. Caiazza N.C. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa / N.C. Caiazza, R.M.Q. Shanks, G.A. O'Toole // J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - P. 7351-7361.

95. Cameron D. The mannoprotein of Sacharomyces cerevisiae is an effective bioemulsifer / D. Cameron, D. Cooper, R. Neufeld // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. - P. 1420-1425.

96. Catalogue of strains of Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms. 2006. www.iegm.ru/iegmcol.

97. Chakrabarty A.M. Genetically-manipulated microorganisms and their products in the oil service industries / A.M. Chakrabarty // Trends Biotechnol. 1985. - V. 3. - P. 32 -38.

98. Christofi N. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation / N. Christofi, I.B. Ivshina // J. Appl. Microbiol. 2002. -V. 93.-P. 915-929.

99. Cooper D.G. Surface-active compounds from microorganisms /

100. D.G. Cooper, J.E. Zajic // J. Appl. Microbiol. 1980. - V. 26. - P. 229-252.

101. Cort T.L. Nonionic surfactant effects on pentachlorphenol degradation / T.L. Cort, M.S. Song, A.R. Belefeldt // Water Research. 2002. - V. 36. -P. 253-1261.

102. Davey M.E. Rhamnolipid surfactant production affects bifilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAOl / M.E. Davey, N.C. Caiazza, G.A. O'Toole //J.Bacterid.-2003.-V. 185.-P. 1027-1036.

103. DeI'Arco J.P. Influence of oil contamination levels on hydrocarbon biodegradation in sandy sediments / J.P. Del'Arco, E.P. de Franca // Environ. Pollut. 2001. - V. 110. - P. 515-519.

104. Desai J.D. Microbial production of surfactants and their commercial potential / J.D. Desai, I.M. Banat // Microbiol. Mol. Biol. Reviews. 1997. -V. 61.-P. 47-64.

105. Desai J.R. Advances in production of biosurfactants and their commercial applications / J.R. Desai, R.M Patel, J.D. Desai // J. Sci. Ind. Res. 1994. -V. 53.-P. 619-629.

106. Desai J.R. Emulsifier production biosurfactants by Pseudomonas fluorescens during the growth on hydrocarbons / J.R. Desai, R.M. Patel, J.D. Desai // Curr. Sci. 1988. - V. 57. - P. 500-501.

107. Deshpand S. Surfactant selection for enhancing ex situ soil washing // S. Deshpand, B.J. Shiau, D. Wade et al. II Wat. Res. 1999. - V. 33. -P. 60-351.

108. Doong R.A. Solubilization and mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas putida in the presence of surfactant / R.A. Doong, W.G. Lei // J. Hazard. Mater. 2003. - V. 96. - P. 15-27.

109. Fattom A. Production of emulcan by Phormidium J-l: its activity and function / A. Fattom, M. Shilo // FEMS Microbiol. Ecol. 1985. - V. 31. -P. 3-9.

110. Fautz В. Formation of cellobiose lipids by growing and resting cells of Ustilago maydis / B. Fautz, S. Lang, F. Wagner // Biotechnol. Lett. 1986. - V. 8.-P. 757-762.

111. Fiechter A. Biosurfactants moving towards industrial application / A. Fiechter// Trends Biotechnol. 1992. - V. 10. - P. 208-217.

112. Finnerty W. Biosurfactants in environmental biotechnology / W. Finnerty // Curr. Opin. Biotechnol. 1994. - V. 5. - P. 291-295.

113. Fogliano V. Immunological detection of syringeopeptins produced by Pseudomonas syringa pv. Lachrymans / V. Fogliano, M. Gallo, F. Vnale et al II Physiol. Mol. Plant Pathol. 1999. - V. 55. - P. 255-261.

114. Fox R.D. Physical/chemical treatment of organically contaminated soils and sediments / R.D. Fox // J. Air and Waste Management Association. 1996. -V. 46.-P. 391-413.

115. Fujiwara T. Chemical, immunobiological and antigenic characterization of lipopolisacharides from Bacteroides gingivalis strains / T. Fujiwara, T. Ogawa, S. Sobue, S. Hamada // J. Gen. Microbiol. 1990 - V. 136. -P. 319-326.

116. Georgiou G. Surface-active compounds from microorganisms / G. Georgiou, S.C. Lin, M.M. Sharma // Biotechnology. 1992. - V. 10. -P. 60-65.

117. Ghosh M.M. Surface-enhanced bioremediation of PAH- and PCB-contaminated soil / M.M. Ghosh, I.T. Yeom, Z. Shi // Microbial Processes for Remediation / ed. R.E. Hinchey, F.G. Brockman, C.M. Vogel. -Columbus, Ohio : Battle Press, 1995. P. 15-23.

118. Guerra-Santos L.H. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source / L.H. Guerra-Santos, O. Kappeli, A. Fiechter // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48. -P. 301-305.

119. Haferburg D. Antiviral activity of rhamnolipid from Pseudomonas aeruginosa / D. Haferburg, R. Hommel, H.P. Kleber // Acta Biotechnol. -1987.-V. 7.-P. 353-356.

120. Harvey S. Enhanced removal of Exxon Valdes spilled oil from Alaskan gravel by a microbial surfactant / S. Harvey, I. Elashi, J.J. Valdes et al II Biotechnology. 1990. - V. 8. - P. 228-230.

121. Herman D.C. Rhamnolipid (Biosurfactant) effects on cell aggregation and biodegradation of residual hexadecane under saturated flow conditions / D.C. Herman, Y. Zhang, R.M. Miller // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63-P. 3622-3627.

122. Horowitz S. Novel dispersants of silicon carbid and aluminium nitride / S. Horowitz, J.K. Currie // J. Dispersion Sci. Technol. 1990. - V. 11. -P. 637- 659.

123. Hustasuka K. Protein-like activator for л-alkane oxidation by Pseudomonas aeruginosa S7B1 / K. Hustasuka, T. Nakahara, N. Sano, K. Yamada // Agric. Biol. Chem. 1972. - V. 36. - P. 1361-1369.

124. Hustavova H. Selection of microorganisms for biodegradation of crude oil carbohydrates / H. Hustavova, D. Havranecova // Ecology. 1994. - V. 13. -P. 123-130.

125. Inoue S. German Patent 2905252 / S. Inou, Y. Kimwa, M. Kinta. to Kao Soap Co., Japan.-1979.

126. Inoue S. Sophorolipids from Torulopsis bombicola as microbial surfactants in alken fermentation / S. Inoue, S. Itoh // Biotech. Lett. 1982. - V. 4. -P. 3-8.

127. Jahan K. Modeling the influence of nonionic surfactants on biodegradation of phenanthrene / K. Jahan, T. Ahmed, W. J. Maier // Water Research.1999.-V. 33.-P. 2181-2193.

128. Jain D. K. Effect of addition of Pseudomonas aeruginosa UG2 inocula or biosurfactants on biodegradation of selected hydrocarbons in soil / D.K. Jain, H. Lee, J.T. Trevors // J. Ind. Microbiol. 1992. - V. 10. - P. 87-93.

129. Janneman G.E. A halotolerant biosurfactant producing Bacillus species potentially useful for enhanced oil recovery / G.E. Janneman, M.J. Mclnerney, R.M. Knapp et al. II Dev. Ind. Microbiol. 1983. - V. 24. -P. 484-492.

130. Jordan R. N. Role of (bio)surfactant sorption in promoting the bioavailability of nutrients localisized at the solid-water interface / R.N. Jordan, E.P. Nichols, A.B. Cunningham // Water Science and Technology. -1999.-V. 39.-P. 91-98.

131. Kaplan N. Structural studies on the capsular polysaccharide of Acinetobacter calcoaceticus BD 4 / N. Kaplan, B. Jann, K. Jann // Eur. J. Biochem. 1985. - P. 453-458.

132. Kaplan N. Acinetobacter calcoaceticus BD 4 emulsan: reconstitution of emylsifying activiti with pure polysaccharide and protein / N. Kaplan, Z. Zosim, E. Rosenberg // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - V. 53. -P. 440-446.

133. Kappeli О. The mode of interaction between the substrate and cell surface of the hydrocarbon-utilizing yeast, Candida tropicalis / 0. Kappeli, A. Fiechter //Biotech. Bioeng. 1976. - V. 18. - P. 967-974.

134. Kappeli O. Structure of cell surface of the yeast, Candida tropicalis and its relation to hydrocarbon transport / O. Kappeli, P. Walther, M. Mueller, A. Fiechter// Arh. Microbiol. 1984. - V. 138. - P. 279-282.

135. Khan A. Biosurfactant production by Rhodococcus rubra / A. Khan, C. Foster //Environ. Technol. Lett. 1988. -V. 9. - P. 1349-1360.

136. Kim S. Purification and characterization of biosurfactants from Nocardia sp. L-417 / S. Kim, E. Lim, S. Lee et al. II Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. -V.31.-P. 249-253.

137. Kim J. Microbial glycolipid production under nitrogen limitation and resting cell conditions / J. Kim, M. Powalla, S. Lang et al. // J. of Biotechnology. 1990. - V. 13. - P. 257-266.

138. Kitamoto D. Production of mannosylerythrol lipids as biosurfactants by resting cells of Candida antarctica / D. Kitamoto, T. Fuzishiro, H.Yangishita // Biotehnol. Lett. 1992. - V. 14. - P. 305-310.

139. Kitamoto D. Surface-active properties and antimicrobial activities of mannosylerythritol lipids as biosurfactants produced by Candida antarctica / D. Kitamoto, H. Yanagishita, T. Shinbo et al. II J. Biotechnol. 1993. -V. 29.-P. 91-96.

140. Klekner V. Biosurfactants for cosmetics / V. Klekner, // Biosurfactant -production, properties, applications / ed. N. Kosaric. Surfactant Science Series, Marcel Dekker Inc, New York, 1993. - V. 48. - P. 329-372.

141. Klute A. Methods of Soil Analyseis: Part 1. // Physical and Mineralogical Methods / ed. A. Klute. Agronomy, Madison WI : American Society of Agronomy, Soil Science Society of America, 1986. - № 9, Part 1. - P. 396399.

142. Kretschemer A. Chemical and physical characterization of interfacial-active lipids from Rhodococcus erythropolis grown on w-alkanes / A. Kretschemer,

143. H. Bock, F. Wagner // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V. 44. -P. 864-870.

144. Kuyukina M.S. Biosurfactant enhanced crude oil mobilization in soil system: laboratory simulation and mathematical modeling / M.S. Kuyukina,

145. B. Ivshina, L.B. Litvinenko et al. II Proc. II European Bioremediation Conf. Chania, Greece, 2003. P. 83-86.

146. Kuyukina M.S. Effect of biosurfactants on crude desorption and mobilization in soil system / / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, S.O. Makarov et al. /EvironmentInternational.-2005.-V. 31.-P. 155-161.

147. Kuyukina M.S. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl-tertiary butyl ether extraction / M.S. Kuyukina, I.B Ivshina, J.C. Philp et al. II J. Microbiol. Methods. 2001. - V. 46. - P. 149-156.

148. Lafrance P. Mobilization and co-transport of pyrene in the presence of Pseudomonas aeruginosa UG2 biosurfactants in sandy soil columns / P. Lafrance, M. Lapointe // Ground Water Monitor. Remed. 1998. -V. 178.-P. 139-147.

149. Lang S. Antimicrobial effects of biosurfactants / S. Lang, E. Katsiwela, F. Wagner // Fat Sci. Technol. 1989. - V. 91. - P. 363-366.

150. Lang S. Surface-active lipids in rhodococci / S. Lang, J.C. Philp // Antonie van Leeuwenhoek. Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 1998. - V. 74. - P. 59-70.

151. Lang S. Biological activities of biosurfactants / S. Lang, F. Wagner // Biosurfactants production, properties and applications / ed. N. Kosaric.

152. Surfactant Science Series, Marcel Dekker Inc, New York, 1993. V. 48. -P. 21-34.

153. Lee E. Bioremediation of petroleum contaminated soils using vegetation a microbial study // E. Lee, M.K. Banks // J. Environ. Sei and Heaf A. 1993. -V. 28.-P. 2187-2198.

154. Lee D.H. Effect of soil texture on surfactant based remediation of hydrophobic organic-contaminated soil / D.H. Lee, R.D. Cody, D.J. Kim, S. Choi // Environ. Int. 2002. - V. 27. - P. 8-681.

155. Le Floch S. A field experimentation on bioremediation: BIOREN / S. Le Floch, F.X. Merlin, M. Guillerme et al. II Environ. Technol. 1999. - V. 20. -P. 897-907.

156. Lesik O.Y. The surface-active and emulsifying properties of Candida lipolytica Y-917 grown on w-hexadecane / O.Y. Lesik, E.V. Karpenko, S.A. Elyseev, A.A. Turovsky // J. Mirobiol. 1989. - V. 51. - P. 9-56.

157. Liu Z. Biodegradation of naphthalene in aqueous nonionic surfactant systems / Z. Liu, A.M. Jacobson, R.G. Luthy // Appl. Environ. Microbiol. -1995.- V. 61.-P. 145-151.

158. MacdonaId C.R. Surface-active lipids from Nocardia erythropolis grown on hydrocarbons / C.R. Macdonald, D.G Cooper, J.E. Zajic // Appl. Environ. Microbiol. 1981. - V. 41. - P. 117-123.

159. Makkar R.S. An update on the use of unconventional substrates for biosurfactant prodaction and their new application / R.S. Makkar, S.S. Cameotra // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 428-434.

160. MeInerney M.J. Properties of the biosurfactant produced Bacillus licheniformus JF-2 / M.J. Mclnerney, M. Javaheri, D.P. Nagle // J. Ind. Microbiol. 1990. - V. 5. - P. 95-102.

161. Meers E. Field trial experiment: Phitoremediation with Salix sp. on a dredged sediment disposal site in Flanders, Belgium / E. Meers,

162. P. Vervaeke, F.M.G. Tack et al. II Remediation Journal. 2003. - V. 13. -P. 87-97.

163. Miller R.M. Biosurfactant-facilitated remediation of metal-contaminated soils / R.M. Miller // Environ. Health. Perspect. 1995. - V. 103. - P. 59-62.

164. Miller R.M. Measurement of biosurfactant-enhanced solubilization and biodegradation of hydrocarbons / R.M. Miller, Y. Zhang // Methods Biotechnol. 1997. - V. 2. - P. 59-66.

165. Moran A.C. Enhancement of hydrocarbon wast biodegradation by addition of a biosurfactant from Bacillus subtilis 09 / A.C. Moran, N. Olivera, M. Commendatore // Biodegradation. 2000. - V. 11. - P. 65-71.

166. Morikawa M. Isolation of a new surfactin producer Bacillus pumilis A-l and cloning and nucleotide sequence of the regulator gene, psf-1 / M. Morikawa, M. Ito, T. Imanaka // J. Ferment. Bioenging. 1992. -P. 255-261.

167. Moseley W.A. Capillary pressure-saturation relations in porous media including the effect of wettability / W.A. Moseley, V.K. Dhir // J. Hydrology. 1996. - V. 78. - P. 33-53.

168. Mulligan C.N. Remediation technologies for metal-contaminated soils and groundwater: an evaluation / C.N. Mulligan, R.N. Yong, B.F. Gibbs // Engineering Geology. 2001 a. - V. 60. - P. 193-207.

169. Mulligan C.N. Surfactant-enhanced remediation of contaminated soil / C.N. Mulligan, R.N. Yong, B.F. Gibbs // Engineering Geology. 2001 б. - V. 60. -P. 371-380.

170. Navon-Venozia S. The bioemulsifier alasan: role of protein in maintaining structure and activity / S. Navon-Venozia, E. Banin, E. Z. Ron, E. Rosenberg // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 49. - P. 382-384.

171. Navon-Venozia S. Alasan a new bioemulsifer from Acinetobacter radioresistens / S. Navon-Venozia, Z. Zosim, A. Gottlieb et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 3240-3244.

172. Neu T.R. Surface-active properties of viscosin a peptidolipid antibiotic / T.R. Neu, T. Hartner, K. Poralla // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1990. -V. 32.-P. 518-520.

173. Nokano M.M. Identification of a genetic locus required for biosynthesis of lipopeptid antibiotic surfactin in Bacillus subtilis / M.M. Nokano, M.F. Marahiel, P. Zuber // J. Bacteriology. 1988. - V. 70. - P. 5662-5668.

174. Noordman W.E. The enhancement by surfactants of hexadecane degradation by Pseudomonas aeruginosa varies substrate availability / W.E. Noordman, H. Johann, G. de Boer et al. II J. Biotechnol. 2002. -V. 94.-P. 195-212.

175. Oberbremer A. Effect of the addition of microbial surfactants on hydrocarbon degradation in a soil population in a stirred reactor / A. Oberbremer, R. Muller-Hurtig, F. Wagner // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990.-V. 32.-P. 485-489.

176. Osterreicher-Ravid D. Horizontal transfer of an exopolymer complex from one bacterial species to another / D. Osterreicher-Ravid, E.Z. Ron, E. Rosenberg // Environ. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 366-372.

177. Page C.A. Biosurfactant solubilisation of PAHs / C.A. Page, J.S. Bonner, S.A. Kanga et al И Environ. Eng. Sci. 1999. - P. 465-474.

178. Park A.J. Enhancing solubilization of sparingly soluble organic compounds by biosurfactant produced by Nocardia erythropolis / A J. Park, D.K. Cha, M. Holsen // Water Environment Research. 1998. - V. 70. - P. 351-355.

179. Passeri A. Marine biosurfactants. II. Production and characterization of an anionic trehalose tetraester from the marine bacterium Arthrobacter sp. EK1 / A. Passeri, S. Lang, F. Wagner // Z. Natufosh. 1991. - P. 210-216.

180. Pellerin N.B. Alginate as ceramic processing aid / N.B. Pellerin, G.L. Graff, D.R. Treadwell et al II Biometrics. 1992. - V. 1. - P. 119-130.

181. Pines O. Localization of emulsan-like polymers associated with the cell surface of Acinetobacter calcoaceticus RAY-1 / O. Pines // J. Bacteriol. -1983.-V. l.-P. 893-905.

182. Philp J.C. Alcanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer / J.C. Philp, M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina et al // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 902-909.

183. Pritchard P.H. Use of inoculation in bioremediation / P.H. Pritchard // Curr. Opin. Biotech. 1992. - V. 3. - P. 232-243.

184. Pucci O.H. Influence of crude oil contamination on the bacterial community of semi-arid soils of Patagonia (Argentina) / O.H. Pucci, M.A. Bak, S.R. Peressutti et al I I Acta Biotechnologica. 2000. - V. 10. - P. 129-146.

185. Radwan S.S. Enhanced remediation of hydrocarbon contaminated desert soil fertilized with organic carbons / S.S. Radwan, D. Al-Mailem, I. El-Nemr, S. Salamah // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2000. - V. 46. - P. 129132.

186. Rajput V.S. Cleaning of excavated soil contaminated with hazardous organic compound by washing / V.S. Rajput, A. J. Higegens, M.E. Singley / Water Environ. Res. 1994. - V. 66. - P. 27-819.

187. Ramsay B. Biosurfactant production and diauxic growth of Rhodococcus aurantiacus, when using и-alkanes as the carbon source / B. Ramsay, J. McCarthy, L. Guerra-Santos et al. II Can. J. Microbiol. 1988. - V. 34. -P. 1209-1212.

188. Rapp P. Use of trehalose lipids in enhanced oil recovery / P. Rapp, H. Bock,

189. E. Urban et al // DESCHEMA Monogr. Biotechnol. 1977. - V. 81. -P. 177-185.

190. Rapp P. Formation of trehalose lipid by Nocardia rhodochrous sp. grown on w-alkane / P. Rapp, F. Wagner // V. International Fermentation Symposium. 1976.-P. 133.

191. Rapp P. Formation, isolation and characterization of trehalose dimicolates from Rhodococcus erythropolis grown on w-alkanes / P. Rapp, Y. Bock, V. Wray, F. Wagner // J. Gen. Microbiol. 1979. - V. 115. - P. 491-503.

192. Rashid M.H. Polyphospate kinase is essential for biofilm development quorum sensing and virulence / M.H. Rashid, K. Rumbough, I. Passador et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 9636-9641.

193. Richer M. Streptofactin, a novel biosurfactant with aerial mycelium inducing activity from Stretomyces tendae Tue 901 / M. Richer, M. Willey, R. Suessmuth et al // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 163. -P. 165-171.

194. Ristau E. Formation of novel anionic trehalose tetraesters from Rhodococcus erythropolis under growth-limiting conditions / E. Ristau,

195. F. Wagner // Biotechnol. Lett. 1983. - V. 5. - P. 95-100.

196. Robert M. Effect of the carbon source on biosurfactants production by Pseudomonas aeruginosa 44 T1 / M. Robert, M.E. Mercade, M.P. Bosch et al // World J. Microbiol. Biotech. 1989. - V. 8. - P. 4-851.

197. Robinson K.G. Mineralisation enchancement of non-aqueous phase and soil-bound PCB using biosurfactants / K.G. Robinson, M.M. Ghosh, Z. Shi // Water Sci. Technol. 1996. - V. 34. - P. 303-309.

198. Ron E.Z. Biosurfactants and oil bioremediation / E.Z. Ron, E. Rosenberg // Current Opin. in Biotech. 2002. - V. 13. - P. 249-252.

199. Ron E.Z. Natural roles of biosurfactants / E.Z. Ron, E. Rosenberg // Environ. Microbiol. 2001. - V. 3. - P. 229-236.

200. Rosenberg E. Inhibition of bacterial adherence to hydrocarbons and epithelial by emulsan / E. Rosenberg, M. Rosenberg // Infect. Immun. -1983.-V. 39.-P. 1024-1028.

201. Rosenberg E. Surface active polymers from the genus Acinetobacter / E. Rosenberg, E.Z. Ron // Biopolymers from renewable resources / ed.

202. D.L. Kaplan. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1998. -P. 281-291.

203. Rosenberg E. Purification and chemical properties of Acinetobacter calcoaceticus A2 biodispersan / E. Rosenberg, C. Rubinnovits, R. Legmann,

204. E.Z. Ron // Appl. Environ. Microbiol. 1988. -V. 54. - P. 323-326.

205. Row D. Application of surfactant solution and colloid gas aragon suspensions in flushing naphthalene from a contaminated soil matrix / D. Row, S. Kongara, K.T. Valsaraj // J. Hazard Mater. 1995. - V. 42. -P. 63-247.

206. Sanders P. F. Effects of discarded drill on microbial populations / P.F. Sanders, P.J.C. Tibbetts // Phil. Trans. R. Soc. Land. 1987. - V. 316.- P. 567-585.

207. Sar N. Emulsifier production by Acinetobacter calcoaceticus strains / N. Sar, E. Rosenberg // Curr. Microbiol. 1983. - V. 9. - P. 688-693.

208. Sarkar A.K. Acritical evolution of MEOR process / A.K. Sarkar, G.C. Goursand, M.M. Sharma, G. Georgiou // In Situ. 1989. - V. 13. -P. 207-238.

209. Schmid A. Effects of biosurfactant and emulsification on two-liquid phase Pseudomonas oleovorans cultures and cell-free emulsions containing и-decan / A. Schmid, A. Kollmer, B. Witholt // Enzyme Microbial. Technol.- 1998.- V. 22.-P. 487-493.

210. Shennan G.L. In situ microbial enhanced oil recovery / G.L. Shennan, J.D. Levi // Biosurfactants and biotechnology / ed N. Kosaric, W.L. Cairns, N.C. Gray. Marcel Dekker, Inc., New York, 1987. - P. 163-187.

211. Shephord R. Novel bioemulsifier from microorganisms for use in foods / R. Shephord, J. Rockey, I.W. Shutherland, S. Roller//J. Biotechnol. 1995. -V. 40.-P. 207-217.

212. Shuls D. Marine Biosurfactants. I. Screening for Biosurfactants among crude oil degrading marine microorganisms from the North sea / D. Shuls, A. Passed, M. Schmidt et al IIZ Naturforsch 1991. - V. 46. - P. 197-203.

213. Siegmund I. New method for detecting ramnolipids excreted by Pseudomonas species grown on mineral agar / I. Siegmund, F. Wagner // Biotechnol. Techniques. 1991. - V. 5. - P. 263-268.

214. Singer M.E.V. Physiology of biosurfactant synthesis by Rhodococcus species H13-A / M.E.V. Singer, W.R. Finnerty // Can. J. Microbiol. 1990. -V.36.-P. 741-745.

215. Sorkhoh N.A. Establishment of oil-degrading bacteria associated with cyanobacteria in oil-polluted soil / N.A. Sorkhoh, R.H. Al-Hasan, M. Khanafer, S.S. Radwan // J. Appl. Bacteriol. 1995. - V. 78. - P. 194199.

216. Suldatk C. Production of biosurfactants / C. Suldatk, F. Wagner // Biosurfactants and Biotechnology / ed. N. Kosaric, W.L. Cairns, N.L.L. Grey. Marcel Dekker, New York, 1987. - P. 89-120.

217. Stackebrandt E. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov / E. Stackebrandt, F.A. Rainey, N. Ward-Rainey // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 479-491.

218. Suzuki T. Trehalose lipid and branched-P-hydroxy fatty acids formed by bacteria grown on alkenes / T. Suzuki, H. Tanaka, J. Matsubara, S. Kimoshita //Agric. Biol. Hem. 1969. - V. 33.-P. 1619-1625.

219. Taylor W.H. Pathways for biosynthesis of bacterial capsular polysaccharide. I. Characterization of the organism and polysaccharide / W.H. Taylor, E. Juni //J. Bacteriol. 1961. - V. 81. - P. 688-693.

220. Tiehm A. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presence of synthetic surfactants / A. Tiehm // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -V. 60.-P. 258-263.

221. Tokeda M. A protein bioflocculant produced by Rhodococcus erythropolis / M. Tokeda, R. Kurane, J. Koizumi, I. Nakamura // Agric. Biol. Chem. -1991.-V. 55.-P. 2663-2664.

222. Truu J. Phitoremediation of solid oil shale waste from the chemical industry // J. Truu, L. K'arme, E. Talpseps et al. II Acta Biotechnologica. 2003. -V. 23.-P. 301-307.

223. Uchida Y. Factors affecting the production of succinoltregalose lipids by Rhodococcus erythropolis SD-74 grown on и-alkanes / Y. Uchida, S. Misava, T. Nakahara, T. Tabuchi // Agric. Biol. Chem. 1989 a. - V. 53. -P. 765-769.

224. Uchida Y. Extracellular accumulation of mono- and disuccinyl trehalose lipids by a strain of Rhodococcus erythropolis grown on я-alkanes / Y. Uchida, R. Tsuchiya, M. Chino et al. И Agric. Biol. Chem. 19896. -V. 53.-P. 757-763.

225. Uraizee F.A. A model for diffusion controlled bioavailability of crude oil components / F.A. Uraizee, A.D. Venosa, M.T. Suidan // Biodegradation. -1998.-V. 8.-P. 287-296.

226. Vardar-Sucar F. Biosurfactants / F. Vardar-Sucar, N. Kosaric // Encyclopedia of microbiology 2 nd edn. Lederberg J., San.Diego, С : Academic Press, 2000. - V. 1. - P. 618 - 63 5.

227. Vasuderan N. Bioremediation of oil sludge-contaminated soil / N. Vasuderan, P. Rajaram // Environ. Int. 2001. - V. 26. - P. 409-411.

228. Velikonja J. Biosurfactant in food applications / J. Velikonja, N. Kosaric // Biosurfactants, production, properties and applications / ed. N. Kosaric. -Surfactant Science Series, Marcel Dekker Inc, New York, 1993. V. 48. -P. 419-446.

229. Warhurst A.M. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus / A.M. Warhurst, C.A. Fewson // Crit. Rev. Biochem. 1994. - V. 14. -P. 29-73.

230. Wasko M.P. Properties of biosurfactants produced by the fuel contaminant Ochrobactrum anthropii / M.P. Wasko, R.P. Bratt // Inter. Biodeter. 1990. -V. 27.-P. 265-273.

231. Watanabe M. A new glycolypid from Mycobacterium avium -Mycobacterium intracellular complex / M. Watanabe, S. Kudoh, Y. Yamada et al II Biochemica et Biophisica Acta. 1992. - V. 1165. - P. 53-60.

232. Wong R.C.K. Effects of clay content and temperature on crude oil (nonvolatile components) transport in unsaturated soils: centrifuge study / R.C.K. Wong //J. Environ. Engrg.-2005.-V. 131.-P. 1473-1478.

233. Yakimov M.M. The potential of Bacillus licheniformis strains for in situ enhanced oil recovery / M.M. Yakimov, M.M. Amro, M. Bock et al /J.Petroleum Sci. Engin. 1997. - V. 18.-P. 147-160.

234. Yamane T. Enzyme technology for the lipid industry: an engineering overview / T. Yamane // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1987. - V. 64. -P. 741-742.

235. Zajic J.E. Bio-emulsifiers / J.E. Zajic, C.J. Panchal // Critical Revies in Microbiology. 1976. - V. 1. - P. 39-66.

236. Zhang Y. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a

237. Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant) / Y. Zhang, R.M. Miller // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 3276-3282.