Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов Pseudomonas и Rhodococcus

Петриков, Кирилл Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов Pseudomonas и Rhodococcus
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов Pseudomonas и Rhodococcus"

На правах рукописи

ПЕТРИКОВ КИРИЛЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА, ПРОДУЦИРУЕМЫЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРАМИ РОДОВ PSEUDOMONAS И RHODOCOCCUS

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 С С Iii 2011

Москва-2011

4858008

Работа выполнена на кафедре химии естественнонаучного факультета ФГБОУ ВПО «Тульский государственный университет» и в лаборатории биологии плазмид УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.

Научный руководитель:

кандидат химических наук Алферов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Каплун Александр Петрович

кандидат химических наук Руденко Наталья Васильевна

Ведущая организация: Институт биологии Коми научного центра

Уральского округа РАН

Защита диссертации состоится «'3 /»2011 г. в 'Од на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mon.gov.ru.

Автореферат разослан « » ^Мя&^ьЙ 2011 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, >

старший научный сотрудник ''

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*'

Актуальность проблемы

Решение проблемы антропогенного загрязнения окружающей среды нефтью относится к первоочередным экологическим задачам. Поскольку объёмы добычи, транспортировки и переработки этого сырья очень велики, то и связанные с этим утечки и разливы при авариях имеют глобальный масштаб. В период с 1990 по 1999 гг. приблизительный объём нефтяных загрязнений одних только морских акваторий составил более 3 ООО ООО тонн (Etkin D.S., 2001). Несмотря на то, что нефть и её компоненты подвергаются естественному разложению, процесс самовосстановления загрязненной среды является очень длительным. Без проведения широкомасштабных и эффективных мероприятий по ликвидации последствий попадания нефти и нефтепродуктов в окружающую среду, количество загрязнённых территорий будет неуклонно расти. Такие распространённые методы, как механический сбор, отжим и выжигание нефти, вывоз и захоронение загрязнённой почвы, не только являются неэффективными, но и могут нанести дополнительный вред окружающей среде. Важными задачами являются разработка и усовершенствование высокоэффективных и безопасных способов очистки загрязнённых территорий, в основе которых лежат процессы, происходящие при ауторемедиации.

Активность микроорганизмов является одним из главных факторов, способствующих естественной очистке почв и водоёмов (Van Hamme J.D. et al, 2003). Способность микроорганизмов к деградации различных загрязнителей, в том числе и углеводородов - основных компонентов нефти, известна давно и интенсивно изучается. Большое внимание уделяется процессам биологической ремедиации природных экосистем. Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную и экологически безопасную очистку, приводящую к уменьшению концентрации поллютантов. Одним из основных методов биоремедиации in situ (на месте загрязнения) является интродукция микроорганизмов в места загрязнения (Вельков В.В., 1995). Суть этого метода заключается во внесении в почву биопрепарата, включающего в себя биомассу жизнеспособных клеток одного или нескольких активных штаммов углеводородокисляющих бактерий. При этом в почве формируется конкурентоспособная ассоциация микроорганизмов-нефтедеструкторов.

Известны различные отечественные биопрепараты, используемые для биоремедиации: «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра» (ЗАО «Биоойл», г. Новосибрск); «Биоприн (Олеоворин)» (ВНИИ-Синтезбелок, предприятие «Новые технологии»), «Деворойл» (ООО «Микробные технологии» совместно с ООО «Сити Строй», г. Москва) (Кобзев E.H., 2003). Однако, несмотря на широкий спектр предлагаемых продуктов, ведётся постоянный поиск новых микроорганизмов-нефтедеструкторов и их ассоциаций и изучение их свойств с целью повышения эффективности очистки нефтезагрязнённых территорий.

Этого можно достичь, создавая новые биопрепараты, при разработке которых учитывались бы особенности деградации углеводородов нефти различными

~~^ Выполнение экспериментальной части работы в лаборатории биологии плазмид УРАН ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН осуществлялось под руководством к.б.н., с.н.с. Филонова А.Е.

микроорганизмами. Одним из важнейших механизмов утилизации компонентов нефти, которые слабо- или нерастворимы в воде, является образование микроорганизмами поверхностно-активных соединений (биоПАВ или биосурфактантов) (Desai J., Banat I., 1997). Они способствуют солюбилизации углеводородов, образованию мелкодисперсной эмульсии, в результате чего облегчается контакт микробных клеток с гидрофобным субстратом и поступление его внутрь клетки. В настоящее время биоПАВ являются объектами пристального изучения. Их преимущество перед синтетическими ПАВ состоит в том, что они высокоэффективны, биодеградабельны и обладают низкой токсичностью. Изучение свойств, строения, условий биосинтеза этих соединений позволит создать биопрепараты на основе отобранных микроорганизмов-продуцентов. Помимо этого, потенциал использования биосурфактантов не ограничивается технологиями биоремедиации. Эти вещества находят применение в таких отраслях промышленности, как нефтедобывающая, пищевая, фармацевтическая и косметическая (Banat I. et al., 2010). Таким образом, поиск новых штаммов микроорганизмов, продуцирующих биоПАВ, и изучение свойств этих соединений, является актуальной задачей.

Другим аспектом современной экологической биотехнологии является получение промышленных форм биопрепаратов, отвечающих требованиям экономичности и эффективности. Исходя из этого, для получения биомассы микроорганизмов должны быть подобраны такие условия, при которых достигался бы максимальный выход продукта с высокими численностью живых клеток и углеводородокисляющей активностью. Важен и выбор способа хранения готового биопрепарата, позволяющего сохранить максимальную численность жизнеспособных микроорганизмов, так как суспензия бактерий теряет свои качества, необходимые для использования в биопрепарате, в течение нескольких дней.

Работа выполнялась при частичной поддержке грантов федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы» госконтракты№02.740.11.0296 и№П1749.

Цель работы:

выявление особенностей образования и строения биологических поверхностно-активных веществ, продуцируемых бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus, и выбор условий культивирования и хранения этих микроорганизмов-нефтедеструкторов как компонентов биопрепарата для ремедиации нефтезагрязнённых экосистем.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить способность микроорганизмов - эффективных нефтедеструкторов к образованию поверхностно-активных веществ в зависимости от условий культивирования.

2. Провести очистку биоПАВ, образуемых выбранными эффективными микроорганизмами-продуцентами.

3. Исследовать особенности строения поверхностно-активных соединений.

4. Подобрать условия получения биомассы бактерий-нефтедеструкторов, продуцирующих биосурфактанты, при раздельном и совместном культивировании.

5. Определить условия хранения полученной биомассы, выбрав наиболее эффективные консерванты и криопротекторы.

Научная новизна

В рамках комплексного подхода к разработке биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязнённых территорий изучена способность микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus, входящих в состав биопрепаратов «МикроБак» и «ВиО», к образованию поверхностно-активных веществ. Установлено, что все изученные бактерии являются продуцентами биоПАВ. Наибольшее количество биосурфактантов экзо-типа образуется при росте псевдомонад и родококков на гексадекане.

Впервые показано, что клетки микроорганизмов рода Rhodococcus, полученные при культивировании на гидрофильных субстратах (глюкоза, бакто-триптон), способны стабилизировать эмульсию гексадекан-вода за счёт образования клеточносвязанных биоПАВ.

Исследованы особенности строения выделенных биосурфактантов, продуцируемых изучаемыми бактериями-нефтедеструкторами. Установлено, что биоПАВ экзо-типа имеют гликолипидную природу. У микроорганизмов видов Pseudomonas putida (штамм BS3701(pBS1141)(pBS1142)) и Pseudomonas fluorescens (штамм 142NF(pNF142)) впервые показана способность к биосинтезу гомологичных рамнолипидов.

Впервые продемонстрирована возможность глубинного периодического культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в смешанной культуре с высоким выходом биомассы.

Выявлено, что консервирующее действие бензоата и глутамата натрия на микроорганизмы родов Pseudomonas и Rhodococcus позволяет сохранить жизнеспособность бактериальных клеток в концентрированной суспензии при хранении.

Научно-практическая значимость

Выбранные условия культивирования бактерий-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus на полноценной среде, содержащей кислотный гидролизат казеина, дрожжевой автолизат и глюкозу, позволяют за короткое время с высокой эффективностью получить основу биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязнённых территорий: биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов. При осуществлении ферментации бактерий в смешанной культуре значительно снижаются энергетические и материальные затраты. Разработанные режимы культивирования нефтеокисляющих микроорганизмов применяются для наработки биомассы запатентованного биопрепарата «МикроБак», используемого для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Определены условия хранения получаемой биомассы микроорганизмов, обеспечивающие высокую численность и деградативную активность. Для сохранения наибольшей выживаемости бактерий в концентрированной суспензии в течение двух-четырёх недель оптимальным является использование консервирующих агентов: 0,2% раствора бензоата или глутамата натрия при поддержании низкой положительной температуры (2-4°С). Для получения товарной формы биопрепарата, пригодной для длительного хранения, транспортировки и применения, наиболее подходящим способом обработки биомассы является контактная сушка с перлитовым сорбентом и выбранной защитной средой: 10% сахарозы, 4% тиомочевины, 4% полиглюкина, 2% аскорбиновой кислоты. Этот метод позволяет повысить выживаемость микроорганизмов в 1,5-2 раза по сравнению с лиофилизированными образцами. Хранение сухого препарата при отрицательной температуре (-20°С) обеспечивает наилучшее сохранение численности и деградирующей активности микроорганизмов.

Авторские права на способ культивирования и хранения защищены патентом РФ 2378090 «Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения». Получено решение о выдаче патента РФ «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами».

Апробация работы

Материалы работы были представлены на IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес» «Нанобио- и другие перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.); VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008 г.); XII International congress of bacteriology and applied microbiology (Istanbul, 2008 г.); III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008 г.); Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010 г.); III Общероссийской студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум 2011» (диплом за лучшую работу)-, IV международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 г.); Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» (Пущино, 2011 г.).

Публикации

Опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи, 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций. Выдан патент РФ 2378090. Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке №2010121688.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 136 страницах, содержит 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы включает 256 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цели и задачи исследования.

Литературный обзор содержит анализ научно-технической литературы, посвященной видам образуемых микроорганизмами биологических поверхностно-активных веществ, особенностям их строения и закономерностям образования. Описаны методы культивирования микроорганизмов и их хранения, способы увеличения выживаемости бактерий.

Материалы и методы исследования

В качестве объектов изучения были выбраны следующие микроорганизмы: грамотрицательные Pseudomonas ßuorescens 142NF(pNF142), Pseudomonas putida BS3701(pBSl 141)(pBSl 142), содержащие плазмиды биодеградации моно- и полиароматических углеводородов; грамположительные Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5, Rhodococcus sp. S26. Данные штаммы являются высокоэффективными нефтедеструкторами и входят в запатентованные ассоциации и биопрепараты для очистки территорий от нефтезагрязнений.

Для наработки биосурфактантов микроорганизмы выращивали на жидкой среде Эванса с различными источниками углерода и энергии. Образование биоПАВ оценивали по поверхностному натяжению, индексу эмульгирования и эмульгирующей активности. Индекс эмульгирования рассчитывали как отношение объёма плотной эмульсии, образуемой при перемешивании изучаемого раствора с гексадеканом, к общему объёму раствора. Эмульгирующую активность выражали как оптическую плотность эмульсии при 540 нм. Содержание гликолипидов в культуральной среде определяли фотоколориметрически фенол-сернокислым методом.

Для выделения и очистки биоПАВ их экстрагировали из бесклеточного супернатанта смесью хлороформ:метанол (3:1 об.). Органическую фракцию собирали и упаривали. Полученный экстракт очищали колоночной хроматографией на силикагеле L 40/100. Элюирование образцов, содержащих биосурфактанты родококков, проводили вначале хлороформом, затем смесью хлороформ:метанол (10:2 об.); содержащих биосурфактанты псевдомонад - смесью хлороформ:метанол (10:1 об.), затем смесью хлороформ:метанол (10:4 об.). Наличие гликолипидных биосурфактантов обнаруживали тонкослойной хроматографией (ТСХ) с обнаружением а-нафтолом с серной кислотой при нагревании.

Масс-спектры выделенных соединений получали на масс-спектрометре с ионной ловушкой LCQ Deca ХР («ThermoFinnigan», США). Регистрацию инфракрасных спектров проводили на ИК Фурье-спектрометре ФСМ 1201 (ООО «Инфраспек», Санкт-Петербург).

Наработку биомассы для изучения динамики роста микроорганизмов и условий хранения осуществляли путём глубинного периодического культивирования в ферментёре АНКУМ-2М объёмом 10 л на средах, содержащих кислотный гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, глюкозу, набор минеральных солей, добавку салицилата натрия или дизельного топлива.

Биомассу микроорганизмов в жидкой форме хранили при 2-4°С с добавлением консервирующих растворов: 20% раствором сахарозы, 0,2% раствором бензоата натрия и 0,2% раствором глутамата. В замороженном виде биомассу хранили при -20°С с предварительным добавлением 20% раствора сахарозы в качестве криопротектора (1:1 по массе). Перед лиофилизацией и контактной сушкой биомассу смешивали с защитными средами различного состава. Контактную сушку проводили с сорбентом (перлитовый песок) при температуре 37°С. Хранили сухие образцы при комнатной температуре, при 2-4°С и при -20°С.

Деградативную активность определяли после двух недель культивирования на минимальной минеральной среде с 2% нефти. Суммарное массовое содержание остаточных нефтепродуктов определяли ИК-спектрофотометрическим методом на концентратомере АН-2 по ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000.

Основные результаты и их обсуждение

Среди методов очистки окружающей среды от загрязнений углеводородами, в том числе нефтью и продуктами её переработки, наиболее перспективным являются методы, основанные на внесения биомассы одного или нескольких активных жизнеспособных микроорганизмов-нефтедеструкторов на место загрязнения. Эффективность биоремедиации может быть повышена за счёт использования новых биопрепаратов, разработанных с учётом особенностей микробиологической деструкции компонентов нефти. Характерным свойством углеводородокисляющих микроорганизмов является образование биоПАВ, что делает актуальным изучение строения, свойств и закономерностей образования таких соединений. Исследование способов получения биопрепаратов и сохранения численности и деградирующих свойств входящих в них микроорганизмов при хранении позволит выбрать наиболее оптимальные. Это обеспечит экономическую рентабельность производства и использования биопрепаратов. В рамках такого комплексного подхода в данной работе были изучены свойства образуемых микроорганизмами-нефтедеструкторами поверхностно-активных веществ и способы культивирования и хранения этих бактерий.

Способность микроорганизмов к продуцированию биоПАВ

Способность к образованию внеклеточных биосурфактантов широко распространена среди микроорганизмов. Однако, несмотря на многочисленные сообщения о новых штаммах-продуцентах поверхностно-активных соединений, до сих пор не выработано единого методологического подхода к направленному поиску и выделения из природы таких микроорганизмов, отсутствуют общепринятые критерии оценки поверхностной активности микробных культур. Поэтому для выбора наиболее эффективных продуцентов биологических поверхностно-активных веществ необходимо проводить скрининг различных микроорганизмов, отбирая для дальнейшего изучения наиболее эффективные продуценты.

При проведении отбора микроорганизмов, способных эффективно продуцировать ПАВ, обычно оценивают поверхностное натяжение культуральной жидкости (8а1ри1е Б.К. с! а1., 2010). Кроме этого, используют простые и экспрессные методы, основанные на измерении эмульгирования гидрофобного соединения, например, гексадекана: индекс эмульгирования и эмульгирующую активность.

Определение содержания гликолипидных биоПАВ проводят фотоколориметрически по реакциям, типа реакции Молиша. Для изучения продуцентов биосурфактантов в нашей работе использовали все указанные методы.

Известно, что источник углерода может оказывать значительное влияние на образование биоПАВ (Muthusamy К. et al., 2008). Синтез биосурфактантов часто наблюдается у различных микроорганизмов при росте на гидрофобных субстратах: углеводороды, растительные жиры. С другой стороны, интенсивное образование биосурфактантов наблюдается и при росте микроорганизмов на гидрофильных источниках углерода (глюкоза, глицерин), как, например, у представителей вида Р. aeruginosa (Abdel-Mawgoud A.M. et al., 2010). При этом отмечают, что закономерности образования биоПАВ одними и теми же микроорганизмами на водорастворимых и нерастворимых субстратах могут принципиально различаться. В данной работе проводили сравнение продуцентов биоПАВ, выращивая их на двух различных субстратах: гексадекан, как гидрофобный субстрат, и глюкоза, как гидрофильный.

Из полученных данных видно (табл. 1), что гексадекан стимулирует интенсивное образование биоПАВ. Содержание биосурфактантов в культуральной среде для всех микроорганизмов, достигнутое при использовании этого субстрата достаточно высоко, до 740 мг/л для штамма Rhodococcus sp. S26. Наблюдалось и значительное снижение поверхностного натяжения: до 34-31 мН/м (в контроле 77 мН/м). При культивировании на гексадекане также отмечены наибольшие значения эмульгирующей активности (у штамма Rhodococcus sp. S26) и индексов эмульгирования (у штаммов Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. Х5). Анализ этих характеристик свидетельствуют о том, что родококки более эффективные продуценты биосурфактантов при росте на гидрофобном источнике углерода и энергии, чем псевдомонады. Исходя из совпадения индексов эмульгирования культуральной жидкости и бесклеточного супернатанта, а также высоких значений эмульгирующей активности, можно заключить, что биоПАВ, образуемые микроорганизмами на гексадекане относятся к экзо-типу, то есть выделяются в среду культивирования. Это позволяет проводить экстракцию биосурфактантов из бесклеточного супернатанта, что упрощает процедуру очистки.

При использовании глюкозы в качестве источника углерода и энергии содержание гликолипидов не превышает 50 мг/л, а значения поверхностного натяжения значительно выше, чем при росте на гексадекане. Это свидетельствует о том, что рост изучаемых микроорганизмов на гидрофильных субстратах не сопровождается интенсивным образованием экзо-биоПАВ. Таким образом, для получения биосурфактантов с высоким выходом при культивировании продуцентов оптимально использование водонерастворимых субстратов.

Сравнение значений эмульгирующей активности и индекса эмульгирования при росте псевдомонад на глюкозе позволило сделать вывод об образовании экзо-биоПАВ (табл. 2). В то же время, в бесклеточном супернатанте родококков наблюдалась близкая оптическая плотность и отсутствие плотного эмульсионного слоя, а в культуральной жидкости значения индексов эмульгирования высоки, что могло свидетельствовать об образовании родококками биоПАВ, ассоциированных с клеточной стенкой (эндо-тип), при росте на глюкозе. Для проверки этого

предположения были определены индексы эмульгирования суспензий целых клеток микроорганизмов, выращенных на гидрофильных субстратах. Клеточные суспензии родококков (Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S26) способны эффективно стабилизировать эмульсии гексадекана с водой (табл. 3), а для целых клеток псевдомонад (Р. fluorescens 142NF, Р. pulida BS3701) эмульгирования не наблюдалось. Анализируя полученные данные, можно заключить, что при росте на глюкозе родококки способны синтезировать биосурфактанты, относящиеся к эндо-типу.

Таблица 1 - Поверхностно-активные свойства микроорганизмов при росте на гексадекане.

Штамм Содержание гликолипидов, мг/л Поверхностное натяжение, мН/м Индекс эмульгирования, % Эмульгирующая активность (X.=540 нм), ед. опт. плотн.

КЖ° БС2'

Р. fluorescens 142NF 190±10 34±1 50±5 50±4 0,9±0,2

Р. putida BS3701 250±20 34±1 53±5 53±6 0,6±0,1

Rhodococcus sp. S67 310±20 33±1 78±6 78±9 0,7±0,1

Rhodococcus sp. X5 400±30 31±1 75±7 75±6 1,0±0,2

Rhodococcus sp. S26 740±50 32±1 47±3 47±3 1,5±0,2

индекс эмульгирования измерен для культуральной жидкости 2) - индекс эмульгирования измерен для бесклеточного супернатанта Таблица 2 - Поверхностно-активные свойства микроорганизмов при росте на

глюкозе.

Штамм Содержание гликолипидов, мг/л Поверхностное натяжение, мН/м Индекс эмульгирования, % Эмульгирующая активность (X=5AQ нм), ед. опт. плотн.

кж|} бс2)

Р. fluorescens 142NF 10±2 54±1 33±4 33±4 1,1 ±0,2

Р. putida BS3701 19±2 61±1 33±3 33±3 0,5±0,1

Rhodococcus sp. S67 49±9 53±1 7±2 0 0,2±0,1

Rhodococcus sp. X5 42±8 56±1 29±4 0 0,2±0,1

Rhodococcus sp. S26 19±5 49±1 29±3 0 0,2±0,1

-индекс эмульгирования измерен для культуральной жидкости 2) - индекс эмульгирования измерен для бесклеточного супернатанта

Таким образом, все микроорганизмы-нефтедеструкторы, входящие в состав биопрепаратов для биоремедиации, способны синтезировать биоПАВ. Наиболее эффективными продуцентами биосурфактантов экзо-типа являются родококки при росте на гексадекане, а при росте на глюкозе они образуют клеточносвязанные биоПАВ (эндо-тип). Псевдомонады продуцируют только внеклеточные биосурфактанты.

Таблица 3 - Эмульгирующие свойства суспензий клеток, выращенных на агаризоваииых средах.___

Штамм Питательная среда Е24. %

P. fluorescens 142NF среда Е+глюкоза 0

среда ЛБ 0

P. putida BS3701 среда Е+глюкоза 0

среда ЛБ 0

Rhodococcus sp. S67 среда Е+глюкоза 35±4

среда ЛБ 40±5

Rhodococcus sp. X5 среда Е+глюкоза 38±4

среда ЛБ 46±5

Rhodococcus sp. S26 среда Е+глюкоза 46±6

среда ЛБ 48±6

Определение особенностей строения биосурфактантов

Очистку биоПАВ проводили колоночной хроматографией после их экстракции из бесклеточного супернатанта. Обнаружение гликолипидных компонентов осуществляли методом ТСХ. Основными биосурфактантами, продуцируемыми бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus, являются, соответственно, рамнолипиды и трегалолипиды (Desai J., Banat I., 1997). Наличие в молекулах этих соединений углеводной части позволяет использовать специфические реагенты для обнаружения Сахаров при проявлении пластин. После сравнения нескольких систем для элюирования гликолипидов были выбраны обладающие наилучшей разделяющей способностью: система хлороформ:метанол:вода (65:25:4 об.) для рамнолипидов псевдомонад и хлороформ:метанол:вода (65:15:2 об.) для трегалолипидов родококков.

По результатам ТСХ можно предположить, что псевдомонады продуцируют одинаковые рамнолипиды. В образцах биоПАВ, образуемых псевдомонадами, присутствует единственное пятно с Rf 0,32. Известно, что при проведении ТСХ в описанных условиях, гликолипиды псевдомонад разделяются в зависимости от количества содержащихся в молекуле остатков рамнозы. Монорамнолипиды обладают большей подвижностью, известные значения удерживания для них составляют 0,7 (Zhang Y., Miller R.M., 1994; Robert M. et al., 1989), а для дирамнолипидов - 0,32 (Matsufuji М. et al., 1997), 0,45 (Zhang Y., Miller R.M., 1994). Сравнивая эти данные с полученными в нашей работе результатами, можно предположить, что микроорганизмы штаммов P. fluorescens 142NF и Р. pulida BS370 продуцируют дирамнолипиды. Поскольку известно, что другим распространённым типом биоПАВ, продуцируемым микроорганизмами рода Pseudomonas, являются липопептиды (Desai J., Banat I., 1997), то для проверки наличия этих соединений в экстрактах проявление хроматограмм осуществляли также нингидрином. Отсутствие характерной фиолетово-розовой окраски свидетельствует об отсутствии липопептидных биосурфактантов.

ТСХ трегалолипидов показала наличие четырёх (штамм Rhodococcus sp. S67) или пяти (штаммы Rhodococcus sp. Х5 и S26) компонентов со значениями Rf: 0,32; 0,46; 0,51 (отсутствует у штамма S67); 0,57; 0,63. Идентификация трегалолипидов,

продуцируемых представителями рода Rhodococcus, по величине удерживания затруднена, поскольку объём опубликованных данных недостаточен для полноценного сравнения. При проведении ТСХ сукциноилтрегалолипидов, продуцируемых бактериями штамма Rhodococcus sp. MS11, было получено единственное пятно с Rf 0,41 (Rapp Р., Gabriel-Jürgens L.H.E., 2003). Точно такого значения удерживания у выделенных в нашей работе соединений нет, наиболее близки к нему пятна с Rf 0,32 и 0,46. Результаты других работ о величине удерживания трегалолипидов в выбранной нами системе хлороформ:метанол:вода (65:15:2) отсутствуют. Следует отметить, что разделение биоПАВ родококков на четыре-пять компонентов при проведении ТСХ ранее не было описано. На основании этого можно предположить наличие в полученных образцах соединений, отличных от ранее изученных трегалолипидов.

Полученные образцы биоПАВ исследовали с помощью масс-спектрометрии электронного распыления в режиме положительной ионизации. Для гликолипидов микроорганизмов P.fluorescens 142NF,Р. putida BS3701 ряд сигналов наблюдается в диапазоне 700-900 Да (рис. 1). Одним из наиболее интенсивных является пик, который соответствует псевдомолекулярному иону [М+Н+] массой 803 Да. Известно, что массой 802 Да обладает рамнолипид В, похожий по строению на распространенный дирамнозил-Р-гидроксидеканоил-Р-гидроксидеканоат, но содержащий ещё один остаток жирной кислоты - деценовой, соединенный с углеводом сложноэфирной связью (рис. За) (Abdel-Mawgoud А.М. et al., 2010). Разница в массах для каждой пары соседних пиков составляет 14 Да, что соответствует массе фрагмента (-СН2-). Для псевдомонад характерно образование рамнолипидов, содержащих гомологичные жирные кислоты. Анализируя полученные данные, можно предположить, что микроорганизмы штаммов P.fluorescens 142NF и Р. putida BS370 образуют смесь рамнолипидов, гомологичных рамнолипиду типа В.

В масс-спектре биоПАВ, продуцируемых Rhodococcus sp. Х5 и Rhodococcus sp. S26, присутствуют одинаковые пики: 866,4; 871,5; 877,2; 894,4; 899,9 (рис. 2). В ряде исследований при изучении биоПАВ родококков основные сигналы в масс-спектрах электронного спрея были представлены псевдомолекулярными ионами [M+Na+] массами 871,5 и 899,6 (Rapp Р., GabrielJürgens L.H.E., 2003; Tuleva В. et al., 2008). Было установлено, что им соответствуют гомологичные сукциноилтрегалолипиды: диоктаноил-деканоил (848 Да) и октаноил-дидеканоил (876 Да), различающиеся на 28 Да, то есть на удвоенный метиленовый фрагмент (-СНг-Ь (рис. 36). Сравнение этих результатов с полученными в нашей работе, позволяет заключить, что изучаемые бактерии Rhodococcus sp. Х5 и Rhodococcus sp. S26 продуцируют трегалолипиды аналогичного строения. Остальные три сигнала не удалось сопоставить с определёнными структурами. Можно отметить, что разница между двумя пиками 866,4 и 894,4 также равна 24 Да, что может свидетельствовать о наличии гомологичных соединений.

803,4

700 720

Рисунок 1 - Масс-спектр гликолипидных биоПАВ, продуцируемых штаммом

Р. Аиогеясепь \42~NF.

871,5

886,4

(3? *5а »5 905 а!С 5Н

Рисунок 2 - Масс-спектр гликолипидных биоПАВ, продуцируемых штаммом

Шюйососсиь яр. Х5.

о о-сн-сн2-с^ с

I \ '/

С7Н15 0-СН-СН2-С

н V Ун ОН О.

C-CH=zCH-C7H15

С7Н

7П15

он

СН3-(СН2)п1-С H

СН3-(СН2)п2 с

б)

Рисунок 3 - Предполагаемая структура гликолипидных биоПАВ. а) Рамнолипид В (Abdel-Mawgoud A.M. et al., 2010); б) Сукциноил-диоктаноил-деканоил трегалоза: и/=«2=6,' сукциноил-октаноил-дидеканоил трегалоза: ni, «2 = б, 8 (RappP., Gabriel-Jurgens L.H.E., 2003; TulevaB. etal., 2008).

В биоПАВ, выделенных из псевдомонад и из родококков, методом ИК-спектроскопии показано наличие функциональных групп, характерных для предполагаемых структур гликолипидов. На полученных спектрах можно выделить широкую полосу поглощения гидроксильной группы при 3450 см'1. Полосы валентных колебаний карбонильных групп сложных эфиров и карбоновых кислот наблюдаются в областях 1745 см"1 и 1630 см'1, соответственно. Пик 1047 см"1 относится к ассиметричным валентным колебаниям связей С-О-С. В спектре наблюдаются пики валентных колебаний алифатических С-Н связей в области 2924

и 2852 см'1, поглощение деформационных колебаний указанных связей присутствует при 1380 см"'.

Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов

Культивирование микроорганизма P. fluorescens 142NF проводили с добавлением салицилата натрия, поскольку известно, что салицилат является индуктором ферментов деградации полиароматических углеводородов, входящих в состав тяжёлых фракций нефти (Van Hamme J.D. et a!., 2003). Следовательно, выращенные в таких условиях микроорганизмы будут обладать способностью к наиболее полной деградации компонентов нефти. В другом случае использовали добавку дизельного топлива (ДТ), как одного из наиболее распространённых нефтепродуктов. Микроорганизмы, выращенные в присутствии ДТ, предположительно, должны быть адаптированы к росту в условиях нефтезагрязнения.

Динамика роста псевдомонад в первые 10 часов практически одинакова для первого и второго культивирования (рис. 4). Однако после добавления в культуральную среду салицилата (на 10 часу) скорость роста возросла, что сопровождалось быстрым увеличением численности микроорганизмов. После же добавления ДТ в другом процессе, скорость роста снизилась, а к 16 часу наблюдалось снижение численности бактерий, так что рост пришлось поддерживать путём дополнительного внесения легко окисляемого субстрата - глюкозы. Такое воздействие ДТ объясняется наличием в нём примесей, оказывающих токсическое воздействие на микроорганизмы.

Таким образом, наилучшие результаты были получены при выращивании псевдомонад с салицилатом. За счёт индукции ферментных систем удельная скорость роста после внесения добавки возросла более чем в два раза, в результате чего культивирование продолжалось всего ¡4 ч.

Выращивание родококка Rhodococcus sp. S67 проводили в условиях, сходных с условиями культивирования псевдомонад. Лаг-фаза составила 8 ч. (рис. 5), что в 2 раза больше, чем для псевдомонад. Общее время процесса составило 24 ч.

ферментации в монокультуре с различными добавками.

Сравнение динамики роста двух данных микроорганизмов в одинаковых условиях позволило оценить возможность осуществления их совместного культивирования. Было показано, что микроорганизмы P. fluorescens 142NF и Rhodococcus sp. S67 способны к эффективному росту монокультур, следовательно, эти же условия можно использовать для выращивания смешанной культуры. Кроме этого, по данным различных исследований известно, что микроорганизмы родов Pseudomonas и Rhodococcus не только не ингибируют рост друг друга, но даже способны повышать эффективность окисления нефти при совместном росте (Van Hamme J.D. et al., 2001).

Рисунок 5 —Динамика численности микроорганизмов Rhodococcus sp. 567 при ферментации в монокультуре.

Время культивирования, часы [-—а—КЬо<1ососс118 ер. 867 - - Р. Пцогеэсеш 142№|_

Рисунок б - Динамика численности микроорганизмов Rhodococcus 567 и Р. Диоге5Сет 142МР при их совместной ферментации. Поскольку скорость роста псевдомонад выше, чем родококков, посевной материал быстрорастущей культуры Р. Диогезсет 142ОТ вносили с задержкой, составившей 12 часов. До инокуляции культуры псевдомонад динамика роста родококков аналогична их росту в монокультуре (рис. 6). После внесения культуры псевдомопад сразу произошло значительное снижение скорости роста родококков. Скорость роста псевдомонад при росте в смешанной культуре так же ниже, чем в монокультуре, но при этом отсутствует лаг-фаза. Достижение стационарной фазы

роста произошло одновременно для обоих микроорганизмов при близкой численности, что оптимально для использования в биопрепарате.

Совместное культивирование микроорганизмов используют для снижения себестоимости готового продукта. В ряде работ было показано успешное применение смешанных культур для приготовления бактериальных препаратов, что позволяло решить проблему адаптации культур в микробной ассоциации, а также реализовать экономические преимущества этого метода (Куюкина М.С. и др., патент 2180276 РФ; Мурыгина В.П. и др., патент 2174496 РФ).

По основным показателям (табл. 4) совместная ферментация почти не уступает раздельным, а её преимущества очевидны: число большинства необходимых технологических операций сокращается почти в два раза. Таким образом, для получения биопрепаратов на основе исследуемых штаммов-нефтедеструкторов целесообразно применять совместное культивирование.

Таблица 4 - Сравнение основных характеристик микроорганизмов Р./1иоге$сет 142ЫР и Ююйососсш яр. 567 при ферментации в монокультуре и в смешанной культуре._

Ферментация Общее время процесса, ч Удельная скорость роста ц,'' ч"1 Выход биомассы, г Численность микроорганизмов, КОЕ/мл

P.fluorescens 142NF (с салицилатом) 14 1,2(6-12) 160 (4,2±0,6)х10ю

P.fluorescens 142NF (сДТ) 23 0,5 (6-20) 136 (1,1±0,1)*10и

Rhodococcus sp. S67 24 0,5 (12-22) 200 (1,3±0,3)х1012

В смешанной культуре 26 Р.2) - 0,5 (12-22) 208 Р. - (3,4±0,4)хЮ10

R.3) - 0,3 (6-22) R. - (3,8±0,4)х1010

'' - в скобках указаны часы - границы временного интервала, для которого рассчитана скорость 2) - Р. Аиогейсею 142ЫР - /?йос/ососси.$ ер. 867

Хранение микроорганизмов

Хранение биомассы микроорганизмов в жидкой форме осуществляли при температуре 2-4°С с различными консервантами и без внесения добавок для контроля. В результате изучения динамики численности бактерий было показано, что 0,2% раствор бензоата натрия обладает наилучшим консервирующим эффектом (рис. 7, 8), проявляющемся в сохранении жизнеспособных организмов. Через два месяца хранения в варианте с использованием бензоата была показана максимальная выживаемость среди всех исследованных вариантов как для псевдомонад, так и для родококков: 0,17% и 3,0%, соответственно. Известно, что механизм действия бензоата как консерванта основан на ингибировании фосфофруктокиназы при проникновении внутрь микробной клетки (Krebs H.A. et al., 1983). Очевидно, что такое замедление жизнедеятельности клетки способствует её наилучшему сохранению. Такие же значения выживаемости были показаны в варианте с глутаматом: 0,15% и 2,8%.

Рисунок 7 - Сравнение выживаемости микроорганизмов штамма P. fluorescens 142NF при хранении в жидкой форме: 1 — контроль (нативная биомасса); 2-е 0,2% ( бензоатом натрия; 3-е 0,2% глутаматом натрия; 4-е 20% сахарозой.

Рисунок 8 - Сравнение выживаемости микроорганизмов штамма Rhodococcus sp. S67 при хранении: 1 — контроль (нативная биомасса); 2-е 0,2% бензоатом натрия; 3-е 0,2% глутаматом натрия; 4-е 20% сахарозой. Добавление сахарозы вызвало значительное снижение численности микроорганизмов обоих изученных штаммов микроорганизмов по сравнению с контролем. Консервирующее действие сахара основано на обезвоживании клеток за счёт повышения осмотического давления среды. Скорость процессов метаболизма в микроорганизмах при этом снижается. Но, как видно из полученных данных, такой способ консервирования приводит не просто к остановке жизнедеятельности, но и к гибели клеток, поэтому его использование нерационально.

В настоящей работе установлено, что микроорганизмы рода Rhodococcus хранятся лучше Pseudomonas. Через два месяца хранения выживаемость родококков в контроле в 10 раз превышала выживаемость псевдомонад. Это соответствует литературным данным, так как известно, что грамположительные бактерии, к ( которым относятся родококки, лучше переносят воздействие различных

повреждающих факторов, чем грамотрицательные (Miyamoto-Shinohara Y. et al., 2001).

Таким образом, показано, что в жидкой форме хранение биомассы рационально осуществлять не более двух недель для псевдомонад и одного месяца для родококков. При этом штаммы микроорганизмов-нефтедеструкторов Р. Аиогеясет 142ЫР и КЬойососсиБ & р. 867 лучше хранить с добавлением 0,2% раствора бензоата или глутамата натрия.

К способам подготовки микроорганизмов для длительного хранения относятся: заморозка, лиофилизация, высушивание на носителе (контактная сушка). Концентрированную суспензию микроорганизмов подвергали заморозке при -20° с, предварительным добавлением криопротектора - 20% раствор сахарозы. Через 2 месяца хранения выживаемость бактерий Р. Аиогевсет 142№ составила 3%, а родококков - 39%, что значительно превышает результаты, полученные при хранении жидкой биомассы. Однако замораживание не всегда может удобно, а именно при наработке больших объёмов биопрепарата.

Лиофилизацию микроорганизмов проводили с использованием различных , вариантов защитных сред: 20% сахароза; 10% сахароза и 6% тиомочевина; 8% сахароза, 4% тиомочевина и 4% полиглюкин. Эффективность защитных растворов оценивали по проценту жизнеспособных клеток в сухом материале сразу после высушивания. Максимальная выживаемость после лиофилизации биомассы микроорганизмов штамма Р. Аиогезсет 142ОТ, достигнута при использовании раствора сахарозы (рис. 9). Для бактерй штамма Л/?ой?ососсмх ер. Б67 наиболее сильное защитное воздействие отмечено в варианте «сахароза + тиомочевина + полиглюкин». Полученные образцы хранили при комнатной температуре. Численность жизнеспособных микроорганизмов в сухом материале проверяли через ( 1, 2 и 6 месяцев хранения. За шесть месяцев хранения количество микроорганизмов в лучших вариантах снизилось примерно на три порядка как для псевдомонад, так и для родококков, составив 1,2x107 и 1,7х!О9 КОЕ/мг, соответственно.

Рисунок 9 - Сравнение выживаемости микроорганизмов после лиофилизации и после контактной сушки: 1 - лиофилизация с сахарозой; 2 - лиофилизация с сахарозой и мочевиной; 3 - лиофилизация с сахарозой, мочевиной и полиглюкином;

4 - контактная сушка.

В качестве другого способа длительного хранения микроорганизмов 1 применяли контактную сушку на носителе (перлитовый песок). Для этого биомассу, смешанную с защитной средой (10% сахарозы, 4% тиомочевины, 4% полиглюкина, 2% аскорбиновой кислоты), а затем с перлитовым песком, сушили до постоянной массы при 37°С. Полученные результаты (рис. 9) говорят о том, что такой способ подготовки биомассы к хранению более выгоден, чем сублимационное , высушивание, так как выживаемость микроорганизмов при контактной сушке выше, > чем при лиофильной: в 2 раза для псевдомонад и в 1,5 раза для родококков. 1

При хранении образцов при различных температурах, показано, что максимальная численность жизнеспособных микроорганизмов наблюдалась в , образцах, содержащихся при -20°С (рис. 10-11). Несмотря на резкое падение > выживаемости в первый месяц, далее она стабилизировалась, и к концу шестого месяца составляла 24% для псевдомонад и 20% для родококков.

Время хранения, месяцы - комнатная «~»~»2-4С —*— -20С__________

Рисунок 10 - Динамика ooliJiCUoClt^JVlUC mu микроорганизмов Р. flúorescens 142NF при хранении после контактной сушки при разных температурах.

100 1

£ 80 "

W о % ai « а 5 !« 60 40 20 \ 22 22 20

-03 „

0 . „ . . * ♦ - •

0 1 2 3 4 5 6

Время хранения, месяцы - ♦ - комнатная ■ ' 2-41' —*— -20С_

Рисунок 11 - Динамика выживаемости микроорганизмов Ююс1ососси$ ¡р. 867 при хранении после контактной сушки при разных температурах.

Для количественной оценки эффективности действия препаратов после хранения проводили лабораторный модельный эксперимент по определению деградирующей способности микроорганизмов. Как видно полученных данных (рис. 12), для Р. Аиогеясет 142ЫР наблюдается снижение степени деструкции нефти при использовании сухого биопрепарата. Однако общий уровень убыли нефти,

составивший 14%, говорит о сохранении достаточно высокой нефтеокислительной активности. Степени деградации нефти для сухого биопрепарата и свежей культуры штамма Н1юс1ососст ер. Б67 практически совпадают, что свидетельствует о высокой [ эффективности выбранного способа хранения в отношении данного ' микроорганизма.

Рисунок 12 -Деградация нефти исследуемыми бактериями при внесении в нашивной биомассы и после двух недель хранения в виде сухого препарата.

Для хранения микроорганизмов-нефтедетрукторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в течение шести месяцев предпочтительней использовать контактную сушку. Наибольшая выживаемость клеток достигается при хранении сухих препаратов в условиях низких температур (-20°С). При этом микроорганизмы сохраняют свою деградативную активность в отношении углеводородов нефти.

Выводы:

1. Микроорганизмы-нефтедеструкторы родов Pseudomonas и Rhodococcus, входящие в состав биопрепаратов для биоремедиации «МикроБак» и «ВиО», являются эффективными продуцентами поверхностно-активных веществ при росте как на гидрофильных (глюкоза), так и на гидрофобных (гексадекан) субстратах. Впервые показано, что при росте на глюкозе родококки образуют эндо-биоПАВ, связанные с клеточной стенкой бактерий.

2. Подобраны условия для продуцирования, выделения и очистки биоПАВ, синтезируемых изучаемыми микроорганизмами-нефтедеструкторами, что позволяет получать природные биосурфактанты для дальнейшего практического использования.

3. Выявлены особенности строения выделенных биосурфактантов, 1 продуцируемых изучаемыми бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus.

Показано образование гомологичных дирамнолипидов микроорганизмами вида Р. putida (штамм BS3701) и вида Р. fluorescens (штамм 142NF). Исследованные штаммы родококков: Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S26, образуют соединения гликолипидной природы, два из которых отнесены к 1 сукциноилтрегалолипидам.

Р. fluorescens 142NF

Rhodococcus sp. S67

1Нативная биомасса 0 Сухой препарат

4. Впервые показана возможность глубинного периодического культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в смешанной культуре с высоким выходом биомассы. Индукция метаболизма псевдомонад салицилатом способствует увеличению урожая микроорганизмов. Выбранные условия культивирования были использованы при получении запатентованного биопрепарата «МикроБак» для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

5. Определён наилучший способ подготовки биомассы штаммов-нефтедеструкторов к длительному хранению: контактная сушка с защитной средой, содержащей сахарозу, тиомочевину, полиглюкин и аскорбиновую кислоту, и с сорбентом перлитовым песком. Разработанный способ сушки может быть использован для получения сухой формы биопрепарата с высокой выживаемостью и деградативной активностью входящих в его состав микроорганизмов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Петриков К.В., Власова Е.П., Понаморёва О.Н., Алфёров В.А., Якшина Т.В., Нечаева И.А., Ахметов Л.И., Пунтус И.Ф., Самойленко В.А., Филонов А.Е. Сохранение жизнеспособности и деградативной активности микроорганизмов-нефтедеструкторов при различных способах хранения биомассы // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2008. - Вып. 2. - С. 226-237.

2. Филонов А.Е., Петриков К.В., Якшина Т.В., Пунтус И.Ф., Власова Е.П., Нечаева И.А., Самойленко В.А. Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus // Биотехнология. - 2008. -№6. - С. 80-85.

3. Власова Е.П., Петриков К.В., Пунтус И.Ф., Понаморёва О.Н., Алферов В.А. Среды и условия культивирования Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) для получения биомассы с максимальной активностью фермента салицилатгидроксилазы // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2008. - Вып. 1. - С. 197-203.

4. Петриков К.В., Власова Е.П, Ветрова A.A., Овчинникова A.A., Понаморёва О.Н., Алфёров В.А., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Получение сухой формы биопрепарата для очистки от нефтяных загрязнений и изучение его свойств при долговременном хранении // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2010. - Вып. 1. - С. 186-195.

5. Петриков К.В., Власова Е.П., Нечаева И.А., Понаморёва О.Н., Филонов А.Е., Алферов В.А., Воронин A.M. Получение биомассы и сохранение активности микроорганизмов-нефтедеструкторов при раздельном и совместном периодическом культивировании // Нанобио и другие перспективные биотехнологии: Материалы IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес». Пущино, 15-18 октября 2007. С. 126-129.

6. Петриков К.В., Якшина Т.В., Власова Е.П., Пунтус И.Ф., Нечаева И.А., Самойленко В.А., Филонов А.Е. Изучение выживаемости микроорганизмов

деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus при различных способах хранения // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Материалы VI Междунар. науч. конф. В 2 т. Т.2. Минск, 2-6 июня / Под ред. Э.И. Коломиец. 2008. Минск: Изд. И.П. Логвинов. С. 223-225.

7. I. Puntus, A. Filonov, L. Akhmetov, Е. Vlasova, К. Petrikov, I. Nechaeva, M. Vainstein, A. Boronin. Cultivation and storage conditions of oil-degrading strains of généra Pseudomonas and Rhodococcus // XII International congress of bacteriology and applied microbiology / Istanbul, 5-9 august 2008. P. 359-360.

8. Филонов A.E., Нечаева И.А, Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Власова Е.П, Петриков К.В., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Ахметов Л.И. // Биоремедиация нефтеразливов в условиях холодного климата: разработка биопрепаратов и их применение. Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал: Материалы III Междунар. конф. Пермь -Н. Новгород - Пермь, 28 сентября-5 октября 2008 / Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. 2008. С. 105-106.

9. Петриков К.В., Филонов А.Е., Сурин А.К., Понаморёва О.Н. Гликолипидные биосурфактанты микрооорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus // Экотоксикология-2010: Тезисы докладов всероссийской конференции. Тула, 18-19 октября 2010 / Тула: Изд-во ТулГУ. С. 27.

10. Делеган Я.А., Петриков К.В., Кучумов П.В., Ростовцев Г.Р., Барабанов АЛО. Оценка способности микроорганизмов-нефтедеструкторов продуцировать биосурфактанты в зависимости от условий культивирования методами хроматографии и фотоколориметрии // Экотоксикология-2010: Тезисы докладов всероссийской конференции, Тула, 18-19 октября 2010 / Тула: Изд-во ТулГУ. С. 35.

П.Петриков К.В. Образование гликолипидных биосурфактантов микроорганизмами-нефтедеструкторами // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы IV международного конгресса. Москва, 21-25 марта 2011. С. 53.

12. Филонов А.Е., Овчинникова А.А., Ветрова А.А., Нечаева И.А., Петриков К.В., Власова Е.П., Росс Д.В., Ахметов Л.И., Пунтус И.Ф., Забелин В.А., Воронин А.М. Микроорганизмы и биопрепараты для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений // Окружающая среда и человек: друзья или враги? Материалы международной конференции, сборник статей. Пущино, 22-24 июня 2011. С. 189-192.

Патенты

13. Патент 2378060 РФ. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения / Филонов А.Е., Кошелева И.А., Самойленко В.А., Шкидченко А.Н., Нечаева И.А., Пунтус И.Ф., Гафаров

A.Б., Якшина Т.В., Воронин А.М., Петриков К.В. Опубл. 10.01.2009. Бюл. №1.

14. Заявка № 2010121688 на патент РФ Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами / Петриков К.В., Овчинникова А. А., Ветрова А. А., Понаморёва О.Н., Самойленко

B.А, Якшина Т.В., Воронин А.М. Заялв. 27.05.2010. Получено положительное решение о выдаче патента.

Подписано в печать 28.09.2011 г. Печать лазерная цифровая Тираж 150 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38, 8 (926) 850-53-16 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Петриков, Кирилл Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Виды, особенности синтеза и способы получения биологических поверхностно-активных веществ.

1.1.1 Классификация микробных биологических поверхностно-активных веществ.

1.1.2 Особенности строения и синтеза рамнолипидов и трегалолипидов.

1.1.2.1 Рамнолипиды микроорганизмов рода Pseudomonas.

1.1.2.2 Трегалолипиды микроорганизмов рода Rhodococcus.

1.1.3 Влияние условий культивирования микроорганизмов на продукцию биологических поверхностно-активных веществ.

1.1.3.1 Влияние источника углерода.

1.1.3.2 Влияние источника азота.

1.1.3.3 Влияние прочих условий культивирования.

1.1.3.4 Использование экономически выгодных субстратов.

1.1.4 Способы очистки биологических поверхностно-активных веществ.

1 2 Методы культивирования и хранения микроорганизмов.

1.2.1 Культивирование микроорганизмов.

1.2.1.1 Виды культивирования.

1.2.1.2 Стадии культивирования.

1.2.1.3 Питательные среды для культивирования.

1.2.2 Хранение микроорганизмов.

1.2.2.1 Повышение выживаемости микроорганизмов при длительном хранении с помощью защитных сред.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Штаммы микроорганизмов-продуцентов биологических поверхностно-активных веществ.

2.2 Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов.

2.4 Измерение индекса эмульгирования.

2.5 Измерение эмульгирующей активности.

2.6 Измерение поверхностного натяжения.

2.7 Измерение содержания гликолипидных биоПАВ.

2.8 Экстракция биоПАВ.^^

2.9 Тонкослойная хроматография гликолипидов.

2.10 Очистка биоПАВ методом колоночной хроматографии.

2.12 Анализ биоПАВ методом масс-спектрометрии.

2.13 Анализ биоПАВ методом ИК-спектроскогош.

2.14 Условия проведения периодического культивирования в ферментёре.

2.16 Определение численности жизнеспособных клеток микроорганизмов.

2.15 Расчёт удельной скорости роста микроорганизмов.

2.16 Хранение микроорганизмов.

2.16.1 Лиофилизация.^

2.16.2 Контактная сушка.^

2.17 Определение сохранения деградативной способности микроорганизмов и фенотипической стабильности плазмид.

2.17 Количественная оценка деградативной способности микроорганизмов.

2.18 Статистическая обработка результатов.5 ^

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Характеристика способности микроорганизмов-нефтедеструкторов к продуцированию биоПАВ.

3.2 Выделение биоПАВ, продуцируемых микроорганизмами-нефтедеструкторами.

3.3 Особенности структуры биоПАВ.^

3.4 Культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов.

3.4.1 Раздельное культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов.7?

3.4.2 Совместное культивирование микроорганизмов

Р.Аиогеясет 142№ и Ккодососсиз эр. Б67.

3.5 Хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов.

3.5.1 Кратковременное хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов в жидкой форме.

3.5.2 Длительное хранение микрорганизмов-нефтедеструкторов.

3.5.3 Новый способ получения сухой формы биопрепарата методом контактной сушки.^ I

4 ОБСУЖДЕНИЕ.Я

4.1 Способность микроорганизмов-нефтедеструкторов к продуцированию биоПАВ при различных условиях роста.

4.2 Выделение биоПАВ, продуцируемых микроорганизмами-нефтедеструкторами.

4.3 Определение особенностей структуры биоПАВ.

4.4 Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов.

4.5 Хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов Pseudomonas и Rhodococcus"

Решение проблемы антропогенного загрязнения окружающей среды- нефтью относится к первоочередным экологическим- задачам. Поскольку объёмы добычи, транспортировки и переработки этого сырья очень велики, то и связанные с этим-утечки« разливы при авариях имеют глобальный; масштаб; В период с; 1990: по 1999тг. приблизительный объём нефтяных загрязнёний;одних:толБКо;морских акваторий'составил более 3 000 000 тонн [1]. Несмотря на то, что нефть и её компоненты подвергаются естественному разложению,; процесс самовосстановления, загрязненной? среды; является^ очень длительным. Без проведения широкомасштабных и эффективных мероприятий; по ликвидации1 последствий попадания нефти и нефтепродуктов ; в' окружающую среду, количество загрязнённых территорий будет неуклонно расти. Такие распространённые методы, как: механический сбор, отжим и выжигание нефти,, вывоз и захоронение загрязнённой почвы, не только являются неэффективными; но и могут нанести дополнительный; вред окружающей; среде: Важными задачами являются разработка и усовершенствование высокоэффективных и: безопасных способов очистки загрязнённых: территорищ в основе которых лежат процессы^ происходящие при ауторемедиации.

Активность микроорганизмов является одним из главных' факторов, способствующих , естественной очистке почв и водоёмов [2]. Способность микроорганизмов, к деградации различных загрязнителей, в том числе и углеводородов -основных*компонентов нефти, известна давно и интенсивно: изучается. Большое внимание •уделяется процессам; биологической' ремедиации природных экосистем. Биоремедиация* обеспечивает экономически- выгодную, высокоспецифичную; и экологически безопасную очистку, приводящую к уменьшению .концентрации» полтотантов. Одним; из: основных методов биоремедиации in situ (на' месте загрязнения) является: интродукция: микроорганизмов в места загрязнения [3]. Суть этого метода заключается'во внесении в почву биопрепарата, включающего в себя биомассу жизнеспособных клеток одного или нескольких активных штаммов углеводородокисляющих бактерий. При этом в почве формируется конкурентоспособная ассоциация микроорганизмов-нефтедеструкторов.

Известны, различные отечественные биопрепараты, используемые для Выполнение экспериментальной части работы в лаборатории биологии плазмид УРАН ИБФМ им-; Г.К. Скрябина РАН осуществлялось под руководством к.б.н., с.н.с. Филонова А.Е. биоремедиации: «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра» (ЗАО «Биоойл», г. Новосибрск); «Биоприн (Олеоворин)» (ВНИИ-Синтезбелок, предприятие «Новые технологии»), «Деворойл» (ООО «Микробные технологии» совместно с ООО «Сити Строй», г. Москва) [4]. Однако, несмотря на широкий спектр предлагаемых продуктов, ведется постоянный поиск новых микроорганизмов-нефтедеструкторов и их ассоциаций и изучение их свойств с целью повышения эффективности очистки нефтезагрязнённых территорий.

Этого можно достичь, создавая новые биопрепараты, при разработке которых учитывались бы особенности деградации углеводородов нефти различными микроорганизмами. Одним из важнейших механизмов утилизации компонентов нефти, которые слабо- или нерастворимы в воде, является образование микроорганизмами поверхностно-активных соединений (биоПАВ или биосурфактантов) [5]. Они способствуют солюбилизации углеводородов, образованию мелкодисперсной эмульсии, в результате чего облегчается контакт микробных клеток с гидрофобным субстратом и поступление его внутрь клетки. В настоящее время биоПАВ являются объектами пристального изучения. Их преимущество перед синтетическими ПАВ состоит в том, что они высокоэффективны, биодеградабельны и обладают низкой токсичностью. Изучение свойств, строения, условий биосинтеза этих соединений позволит создать биопрепараты на основе отобранных микроорганизмов-продуцентов [6]. Помимо этого, потенциал использования биосурфактантов не ограничивается технологиями биоремедиации. Эти вещества находят применение в таких отраслях промышленности, как нефтедобывающая, пищевая, фармацевтическая и косметическая [7]. Таким образом, поиск новых штаммов микроорганизмов, продуцирующих биоПАВ, и изучение свойств этих соединений, является актуальной задачей.

Целью данной работы являлось выявление особенностей образования и строения биологических поверхностно-активных веществ, продуцируемых бактериями родов

Pseudomonas и Rhodococcus, и выбор условий культивирования и хранения этих микроорганизмов-нефтедеструкторов как компонентов биопрепарата для ремедиации нефтезагрязнённых экосистем:

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить способность микроорганизмов — эффективных нефтедеструкторов к образованию поверхностно-активных веществ в зависимости от условий культивирования.

2. Провести^ очистку биоПАВ, образуемых выбранными эффективными микроорганизмами-продуцентами.

3. Исследовать особенности строения поверхностно-активных соединений.

Научная новизна

Установлено, что все изученные бактерии являются продуцентами биоПАВ. Наибольшее количество биосурфактантов экзо-типа образуется при росте псевдомонад и родококков на гексадекане. Впервые показано, что клетки микроорганизмов рода

Rhodococcus, полученные при культивировании на гидрофильных субстратах (глюкоза, бакто-триптон), способны стабилизировать эмульсию гексадекан-вода за счёт образования клеточносвязанных биоПАВ.

Исследованы особенности строения выделенных биосурфактантов, продуцируемых изучаемыми бактериями-нефтедеструкторами. Установлено, что биоПАВ экзо-типа имеют гликолипидную природу. У микроорганизмов видов Pseudomonas putida (штамм BS3701(pBSl 141)(pBSl 142)) и Pseudomonas fluorescens (штамм 142NF(pNF142)) впервые показана способность к биосинтезу гомологичных рамнолипидов.

Научно-практическая значимость

Определены условия хранения получаемой биомассы микроорганизмов, обеспечивающие высокую численность и деградативную активность. Для сохранения наибольшей выживаемости бактерий в концентрированной суспензии в течение двух-четырёх недель оптимальным является использование консервирующих агентов: 0,2% раствора бензоата или глутамата натрия при поддержании низкой положительной температуры (2-4°С). Для получения товарной формы биопрепарата, пригодной для длительного храпения, транспортировки и применения, наиболее подходящим способом обработки биомассы является контактная сушка с перлитовым сорбентом и выбранной защитной средой: 10% сахарозы, 4% тиомочевины, 4% полиглюкина, 2% аскорбиновой кислоты. Этот метод позволяет повысить выживаемость микроорганизмов в 1,5-2 раза по сравнению с лиофилизированными образцами. Хранение сухого препарата при отрицательной температуре (-20°С) обеспечивает наилучшее сохранение численности и деградирующей активности микроорганизмов.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес» «Нанобио- и другие перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.); VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008 г.); XII International congress of bacteriology and applied microbiology (Istanbul, 2008 г.); Ill Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008 г.); Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010 г.); III Общероссийской студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум 2011»; IV международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 г.); Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» (Пущино, 2011 г.).

Публикации

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 136 страницах, содержит 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы включает 256 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Петриков, Кирилл Владимирович

ВЫВОДЫ

3. Выявлены особенности строения выделенных биосурфактантов, продуцируемых изучаемыми бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus. Показано образование гомологичных дирамнолипидов микроорганизмами вида Р. putida (штамм BS3701) и вида Р. fluorescens (штамм 142NF). Исследованные штаммы родококков: Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S26, образуют соединения гликолипидной природы, два из которых отнесены к сукциноилтрегалолипидам.

гидроксидекановой кислоты с образованием двух гликозидных связей: сначала между димером ЖК и углеводом, а затем между получившимся монорамнолипидом и второй молекулой ТДФ-рамнозы [80]. При этом продукт первой реакции — монорамнолипид - не обязательно участвует во второй. Реакции катализируются специфическими рамнозилтрансферазами: RhlB (мембраносвязаной) и RhlC, соответственно. Активность ферментов была обнаружена как в мембранной фракции, так и в цитозоле. В дальнейших исследованиях эти выводы были подтверждены для другого штамма, P. aeruginosa PG201, а ферменты частично охарактеризованы [82]. На основании результатов секвенирования гена rhIB и анализа полученной таким образом аминокислотной последовательности белка RhlB, предположили, что этот фермент имеет два области связывания с внутренней мембраной. Фермент был выделен из мембранной фракции, его масса составила около 47 кДа. Так же был секвенирован и ген г/г/А. Однако, в своей работе Окснер и др. [82] сделали заключение, что белок RhlA, массой 35,5 кДа, локализован в периплазме и либо является прекурсором для другой рамнозилтрансферазы, либо необходим для стабилизации или закрепления в цитоплазматической мембране фермента RhlB. Дальнейшие исследования показали неточность этих выводов: было установлено, что RlilA отвечает за образование димера гидроксикислот [77]. Ген rhlC, кодирующий фермент RhlC, который отвечает за реакцию присоединения второго углевода к монорамнолипиду, был изучен в работе Рахима и др. [83]. Поскольку белок содержал трансмембранный гидрофобный участок, он, предположительно, также является мембраносвязанным. Таким образом, за присоединение рамнозы к жирнокислотному димеру отвечает фермент RhlB, а за добавление второй молекулы углевода к монорамнолипиду - RhlC. Обе этих реакции происходят в цитоплазме на внутренней мембране и лишь затем биосурфактанты транспортируются во внешнюю среду [79].

Остаётся открытым ряд вопросов, в частности о происхождении рамнолипидов типа 3 и 4 с одним остатком гидроксикислоты вместо димера. Они могут быть как продуктами прямого синтеза из углевода и одной жирной кислоты, так и результатом отщепления соответствующего участка от рамнолипидов типа 1 и 2 [79].

Цикл биосинтеза жирных кислот

- Р-гидроксидеканоат - АПБ

АПБ

RhtA.

О о И II

О—р — о-р—о

Тимидин о о n II

НО—СН -СН--С — О— СН —сн—с—он I 2 i г iCH2)a tf»2h

СН. сн„

НО НО о- О-Тим иди н-ди фосфорами оза р-гадроксидеканоил-р-гадроксидеканоат

Тим идин-дифо сфат

Рамнозилтрансфераза 1 RhlB о о

II л

О-СН -СН "С-О-СН —СН.,—С—он

СН2)6 СН t а сн2)6

СН,

Ра м нол и пи д 1 ко но

Тим иди н-ди фосфат

3 -"3

Тим иди н-ди фосфорами оза

Рамнозилтрансфераза 2 RhlC

О О

II II о -сн -СН.-С - О -СН -СН,- с-он О | [ Z f л

СНг)3

СН2)б

Рам нол и пи д 2 сн.

СН, но но

Рисунок 3 - Биосинтез рамнолипидов у P. aeruginosa [60, 79].

Что касается генетической регуляции синтеза рамнолипидов, то известно, что она тесно взаимосвязана с механизмами «quorum sensing» [84]. Основная часть ответственных за этот процесс часть генов организована в оперон г/г/ABRI (рис. 4). Последовательно расположенные участки г hi А и гЫВ кодируют, соответственно фермент RhlA, отвечающий за образование димера ЖК, и рамнозилтрансферазу 1 (RhlB) [85]. Далее в составе оперона расположен ген, который кодирует регуляторный белок RhlR. Он имеет массу 28 кДа и является позитивным регулятором, относящимся к группе активаторов транскрипции типа LuxR [86]. Последний участок оперона кодирует фермент Rhll, который синтезирует автоиндуктор N-бутаноилгомосеринлактон, участвующий в сигнальной системе «quorum sensing» [84]. rhll-дефектный мутант был не способен к синтезу рамнолипида, но при добавлении в среду синтетического индуктора начиналось образование биосурфактанта [60].

N-ОД-ГСЛ

N-Б-ГСЛ

Рисунок 4 - Модель генетической регуляции синтеза рамнолипидов у Р. aeruginosa в опероне rhlABRI [60, 79]. N-Б-ГСЛ - N-бутаноил-гомосеринлактон; N-ОД-ГСЛ - N-3-оксо-додеканоилгомосеринлактон.

Перед генами rhlA и rhä расположены участки связывания, к которым присоединяется комплекс регуляторного белка RhlR с автоиндуктором, запуская транскрипцию. Интересно, что данный белок, предположительно, может выступать как репрессор, в том случае, если он не связан с автоиндуктором [87]. Ген rhlC, кодирующий рамнозилтрансферазу 2 RhlC, не входит в описанный оперон, однако, находится под контролем той же сигнальной системы [83].

Кроме этого, синтез рамнолипидов регулируется двумя другими системами «quorum sensing». Первая представляет собой механизм позитивной регуляции ещё одним белком группы LuxR: LasR, специфическим лигандом для которого является N-3оксододеканоил-гомосеринлактон. Участки связывания для данного регулятора расположены перед генами rhlR. и rhll [84]. Другой механизм включает в себя сложную систему регуляции с участием гидроксиацилхинолинов [77, 88]. t

1.1.2.2 Трегалолипиды микроорганизмов рода Rliodococcus

Для представителей рода Rhodococcus характерно образование поверхностноактивных веществ в ответ на присутствие в среде культивирования» алканов. Эти ПАВ представляют собой гликолипиды, содержащие невосстанавливающий дисахарид трегалозу С12Н22О11 (a-D-глюкопиранозил-1,1 -a-D-глюкопираноза), с которым сложноэфирными связями соединены жирные кислоты [27]. Наиболее распространены а-разветвлённые ß-гидроксилированные (миколовые) кислоты с суммарной длинной углеродной цепи от 20 до 90 атомов [89]. Трегалолипиды встречаются* среди представителей родов Corynebacterium, Mycobacterium и Nocardia [90]. Клеточносвязанные (эндо-тип) трегало-6,6'-димиколаты, известные как «корд-фактор», являются фактором патогенности туберкулёзных бактерий Mycobacterium tuberculosis [91].

Биосурфактанты эндо-типа были - обнаружены при изучении штамма R. erythropolis DSM43215 [92] (рис. 5). Липидные фрагменты были представлены миколовыми (З-гидрокси-2-алкилированными) кислотами с общей формулой от С32Н64О3 до СзаН760з, где С34Н68О3 и С35Н70О3 оказались доминирующими [93]. Флокулирующими свойствами обладали клеточносвязанные гликолипиды штамма R. erythropolis S-1 [94]. После щелочного гидролиза этих соединений были обнаружены глюкоза и трегалоза, а также миколовые кислоты с длиной цепи от С32 до С40 с преобладающими компонентами С34, СЗб и С38. При росте штамма Rhodococcus sp. Н13-А на гексадекане образовывались биосурфактанты экзо- и эндо-типов, представлявшие неионогенные липиды трегалозы с одним основным и десятью минорными компонентами [95]. Углевод был связан с линейными насыщенными и ненасыщенными кислотами С10-С22, миколовыми кислотами С35-С40, гексан- и додекандикарбоновыми кислотами, 10-метилированными гексановой и октадекановой кислотами. Основной компонент был идентифицирован как 2,3,4,6,2',3|,4',6,-октаалканоилтрегалоза, а минорные - как ди-, тетра- и октаацилированные производные углевода.

Образование родококками гликолипидов экзо-типа, то есть не связанных с клеточной стенкой, а выделяемых в культуральную среду, было впервые показано в 1983 в работе Ристау и Вагнера [96]. Их структура была подтверждена методами инфракрасной спектроскопии, ядерно-магнитного резонанса 'Н и 13С, масс-спектрометрии и элементного анализа. В отличие от ранее изученных миколатов трегалозы, эти биоПАВ содержали остаток янтарной кислоты, так что одна карбоксильная группа не участвовала в образовании сложноэфирных связей, то есть, фактически, данные соединения относились к анионогенным ПАВ. Кроме этого, в гликолипиды входили остатки линейных ЖК, длина которых была значительно меньше миколовых и варьировалась от С8 до С14. Анионнные трегалолипидные ПАВ, также содержащие остаток янтарной кислоты, ранее были обнаружены у микроорганизма Mycobacterium paraffinium, образующего 2-О-октаноил-3,2'-ди-0-деканоил-6-0-сукциноил трегалозу. С учётом этих структурных особенностей подобные соединения в научной литературе принято называть анионные сукциноилтрегалолипиды [27, 89, 96]. Сукциноилпроизводные, обычно, выделяются в отдельную группу биосурфактантов, с целью отделить их от более изученных трегаломиколатов. Предполагается, что для образования таких нестандартных (по сравнению миколатами) соединений, микроорганизмы должны находиться в условиях лимитированного роста, например, при дефиците азота [96].

Образование двух 2,3,4,2-тетраэфиров трегалозы, содержащих один остаток янтарной и еще три остатка декановой и октановой кислот, отмечено при культивировании микроорганизмов штамма Rhodococcus sp. MS11 с гексадеканом [97]. Методом масс-спектрометрии электронного спрея было установлено, что молекулярной массе 848 Да соответствует диоктаноил-деканоил, а массе 876 Да — октаноил-дидеканоил производные, хотя точное распределение ацильных радикалов не было установлено. Аналогичный состав биоПАВ обнаружили Тулева с соавт. [98] у R. wratislaviensis BN38, также при использовании гексадекана в качестве источника углерода и энергии.

Эспуни с соавт обнаружили сукциноилпроизводные трегалозы иного состава. Бактерии штамма Rhodococcus sp. 51Т7 при росте на отходах смазочного масла выделяли 2,3,4,2'-тетраэфиры трегалозы, в составе которых присутствовал сукциноил, а длина цепей остальных кислот варьировалась от 7 до 11 [99]. Позднее этой же группой учёных было отмечено, что состав жирнокислотных остатков зависит от источника углерода. При использовании н-декана биоПАВ представлял собой тетрадеканоилтрегалозу, а рост на н-тридекане давал в результате сукциноил-октаноил-нонаноил-деканоил производное [100]. t.I у™*

Фп

Димиколат : R-| =R2 = v JL

Y j*^ CHa

H*C ° OH Ч'Л

Моном и кол ат: R-j = - 1. £Л Ш

О ОН н

14 m-f/1 = 27-31)

Рисунок 5 - Структура трегаломиколатов эндо-типа, образуемых R. erythropolis DCM43215 [93].

Два анионных трегалолипида, содержащих два жирнокислотных остатка (С\2, С или Cie) и два (STL-1), либо один (STL-2) остаток янтарной кислоты, образуют микроорганизма штамма Rhodococcus sp. SD-74 при росте на гексадекане [101] или глицерине [102] (рис. 6). Сочетанием различных методов спектроскопии ЯМР (COSY, HMQS, НМВС), было установлено, что биосурфактант STL-1 представляет собой 3,4-0-диалканоил-2,2'-0-дисукциноил трегалозу, где длина углеродных цепей ацильных остатков составляет 12, 14 или 16 атомов [102]. Соединение STL-2 отличается отсутствием заместителя в положении С-2' и, соответственно, представляет собой триэфир.

ОН

Рисунок б - Структура анионного трегалолипида экзо-типа ЯТЬ-], образуемого

КЪойососст 8П-74 [102].

Известны некоторые закономерности и особенности путей биосинтеза соединений подобного типа, в которых углевод связан с кислотой сложноэфирной связью. Учитывая зависимость этих процессов от ростового источника углерода, особенный интерес представляют следующие аспекты.

1. Образование миколовых кислот рассматривают как реакцию по типу конденсации Кляйзена:

Е^-СО-Х + Яз-СНг-СО-У ^-СО-СНг^-СО-У К1-СН(ОН)-СН2(К2)-СООН ; где X и У - активизирующие группы возможно, -ЭН [74]. Для образования различных миколатов жирная кислота, составляющая главную цепь молекулы, синтезируется перед конденсацией со второй кислотой.

2. Синтез конечного углеводного остатка, трегалозо-6-фосфата, катализируется трегалозо-6-фосфатсинтетазой, которая соединяет два а-Б-глюкопиранозильных фрагмента 1-Г-связью. Вероятно, глюкозо-б-фосфат и глюкозо-уридин-5'-дифосфат (глюкозо-УДФ) являются непосредственными реагентами в данной реакции [93]: глюкозо-УДФ + глюкозо-б-фосфат = трегалозо-6-фосфат +УДФ

Рисунок 7 - Путь биосинтеза моно- и дикориномиколатов трегалозы у

R. erythropolis DSM43215 [93]. 3. Дальнейшее направление синтеза трегаломиколатов из трегалозо-6-фосфата было основано на изучении его индукции н-алканами у R. erythropolis. Кретчмер и Вагнер предложили путь биосинтеза моно- и дикориномиколатов при росте на тетрадекане [93] (рис. 7). Они наблюдали присутствие свободных интермедиатов синтеза кориномиколовой кислоты. Следовательно, кислота образуется независимо от этерифицируемого углевода. Трегалозо-б-фосфат, накапливающийся в клетках, конденсируется с кислотой в соответствующий кориномиколат трегалозы.

4. Механизмы синтеза сукциноилпроизводных остаются невыясненными. Исследования, направленные на выделение соответствующих ферментов, оказались неудачными [27].

Закономерности генетических механизмов синтеза гликолипидных биосурфактантов у родококков практически не изучены. Отмечено, что присутствие в клетке больших плазмид связывают со способносгью к образованию стабильных эмульсий [27].

1.1.3 Влияние условий культивирования микроорганизмов на продукцию биологических поверхностно-активных веществ

Способность микроорганизмов синтезировать биосурфактанты в зависимости от условий их культивирования интенсивно изучается. Основными направлениями является изучение влияния таких факторов, как источник углерода и азотное лимитирование культуры. С другой стороны, много исследований посвящено получению биосурфактантов при росте на дешёвых возобновляемых субстратах типа маслосодержащих отходов пищевой промышленности.

1.1.3.1 Влияние источника углерода

В ряде работ растворимые в воде источники углерода, такие как глицерин, глюкоза, маннит, и этанол использовались для синтеза рамнолипидов микроорганизмами Pseudomonas spp., однако, количество образующегося биосурфактанта был ниже, чем при культивировании с водонерастворимыми субстратами (н-алкаиы и оливковое масло) [44, 62]. Было показано [24], что хотя различные источники углерода в среде культивирования влияли на состав биосурфактанта, продуцируемого микроорганизмами рода Pseudomonas, наличие субстратов с различной длиной углеродной цепи не проявило влияния на длину цепочки фрагментов ЖК в гликолипидах. С другой стороны, для микроорганизмов штаммов Acinetobacter sp. Н13 и H01-N были отмечены качественные изменения в образовании биосурфактанта, отражающие число атомов углерода в алканах [103, 104].

При росте Arthrobacterparaffineus АТСС 19558 на глюкозе, добавление гексадекана в среду в ходе стационарной фазы роста привело к значительному увеличению выхода биосурфактанта [105]. В работе Дувняка и Козарика [105] показано образование Corynebacterium lepus большого количества биосурфактанта, связанного с клеточной стенкой, при выращивании этого микроорганизма на глюкозе, а добавление гексадекана способствовало освобождению ПАВ из клеток. Была также отмечена продукция незначительного количества биосурфактанта при росте клеток на легкодоступных источниках углерода; только тогда, когда все растворимые субстраты были исчерпаны-и при наличии водонерастворимых углеводородных субстратов запускался синтез биосурфактанта [107]. Производство гликолипида дрожжами при росте на среде, содержащей 10% глюкозы, стимулируется добавлением растительных масел, давая выход из 80 г/л [108]. Был продемонстрирован-[109] высокий выход софорозолипидов'путем преодоления ингибирования продуктов культивирования дрожжей Candida bombicola CBS 6009 после добавления этилового эфира жирной, кислоты рапсового' масла в среду с глюкозой. При культивировании» дрожжей Torulopsis apícola IMET 43747 на среде, содержащей глюкозу и подсолнечное масло, был получен выход гликолипида порядка 90 г/л [110]. В работе МакЭлви с соавт. [111] сообщается, что в периодической культуре Torulopsis bombicola, 37% усваиваемого углерода было использовано/, для получения» софорозолипида с выходом 80 г на литр. Однако в периодической культуре с подпиткой около'60% углерода было включено в биосурфактант с повышением выхода до 120 г/л.

Все эти» данные свидетельствуют, что источник углерода, имеет большое влияние на тип и количество производимого биосурфактанта. 3

1.1.3.2 Влияние источника азота

Помимо источника углерода на образование биосурфактантов влияют и другие компоненты питательной среды. Особенно важен выбор источника азота. Среди исследованных азотсодержащих соединений' соли аммония, и. мочевина были лучшими источниками азота для Arthrobacter paraffineus [112]. Количество биоПАВ, синтезируемого микроорганизмами Arthrobacter paraffineus, увеличивалось при добавлении в среду L-аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин и< глицин [112]. В тоже время, для Р. aeruginosa [111, 113, 44] и Rhodococcus spp. [114] максимальное образование биосурфактанта происходит при наличии нитратов. Структура сурфактина зависит от концентраций аминокислот в среде: может образовываться либо 7-валин, либо 7-лейцин сурфактин [115]. Аналогичным образом, синтез лихенизина-А (lichenysin-A) микроорганизмами Bacillus licheniformis BAS50 может возрастать в два или четыре раза при добавлении в среду L-глутаминовой кислоты и L-аспарагина, соответственно [116].

Известно, что рост микроорганизмов в условиях азотного* лимитирования сопровождается значительным увеличением количества синтезируемого биосурфактанта. В ряде исследований различных псевдомонад показано наличие эффекта сверхпродуцирования биоПАВ после перехода культуры в стационарную фазу роста в связи с исчерпанием источника азота в среде культивирования [117118-119]. Кроме этого азотное лимитирование вызывало увеличение количества образуемого эмульгатора у Candida tropicalis IIP-4 [120], гликолипида у Nocardia sp.SFC-D [121] и водоростворимого биосурфактант у Torulopsis apicola\ [122]. Азотное лимитирование может вызывать не только сверхпродукцию биосурфактантов, но и изменения в их составе [5]. Было показано [113]; что максимальное: количество«; рамнолипида. образовывалось; при соотношении; углерод:азот. (C:N) от 16:1 до 18: Г, а; при<; соотношении/, ниже Г1-:1,, когда азотного лимитирования культуры- не было, синтез биосурфактанта не наблюдался. В соответствии с данными работы [122];. для оптимального выхода?; биомассы важно абсолютное количество азота, а не его относительная концентрация, в то время; как концентрация . гидрофобного источник углерода является определяющей, для трансформации;доступного : углеродав биосурфактант. . :

1.1.3.3 Влияние прочих условий культивирования

Условия роста такие, как pH, температура, перемешивание и аэрация также влияют ' * . . . .' " ■ на образование;, биосурфактантов посредством воздействия накроет клеток-: или их активность. Так; pH среды играет важную роль в синтезе софорозолипида дрожжами Torulopsis bombicola [30]. Образование рамнолипида у Р. aeruginosa достигало своего максимума в диапазоне pH; от 6 до 6,5 и резко сокращалось выше рН.7 [113]. В отличие от псевдомонад, .у Nocardia corynbacteroides синтез; пента- и дисахаридных лииидов в не; изменяется Bi диапазоне pH от 6,5 до 8 [123]. Кроме.того, известно,, что поверхностное натяжение у некоторых биосурфактантов^ остается, стабильным в широком; диапазоне: значений pH, в то время; как . эмульгирующая? активность, проявляется^ в» более узком-диапазон pH [124].

Для микроорганизмов Arthrobactcr par'affiheus [125]; w Pseudomonas sp; DSM 2874 [24] изменение температуры вызывает изменения в составе биосурфактантов. Термофильные бактериш Bacillus sp. росли и синтезировали; биосурфактант при температуре выше 40°G [126]. Термическая обработка некоторых биосурфактантов не вызывала, заметных изменений в свойствах, таких, как снижение поверхностного и межфазного натяжения и эффективности эмульгирования. Все они оставались стабильными после автоклавирования при 120°G в.течение 15 мин. [5].

При изучении механизма образования биосурфактанта микроорганизмами Arthrobacter calcoaceticus RAG-1 было показано [127], что соотношение (клеточносвязанный полимер)-(сухая масса клеток) уменьшалось вследствие увеличения негативного воздействия, вызванного перемешиванием среды. В тоже время, по результатам исследования [128] авторами был сделан вывод, что транспорт кислорода является одним из ключевых параметров для оптимизации процесса и масштабов производства сурфактина микроорганизмами Bacillus subtilis.

Концентрация! соли также оказывает влияние на синтез- биосурфактантов микроорганизмами," воздействуя активность клеток. Однако образование некоторых биоПАВ не изменялось при концентрации соли до 10%, хотя наблюдалось снижение критической концентрации мицеллообразования [124].

Кроме этого, перспективным, может быть получение биосурфактантов, образуемых покоящимися или иммобилизованными1 клетками. В таких условиях микроорганизмы не размножаются, однако способны к синтезу различных соединений, в том числе и биоПАВ. Данному вопросу посвящено несколько работ, касающихся образования рамнолипидов Pi aeruginosa [129, 24], софоролипидов Torulopsis bombicola [130] и Candida apicola [131], целлобиолипидов Ustilago maydis [132], тетраэфиров трегалозы R erythropolis [93, 133], маннозилэритролипидов Candida antarctica [134, 135]. Использование таких способов поможет снизить стоимость получения продукта, поскольку фаза, в которой содержится продукт, и фаза, в которой находятся клетки микроорганизмов, изначально разделены.

Внесение в среду культивирования прекурсоров биосурфактантов может вызвать как количественные, так и качественные изменения в составе продукта. Добавление определённых липофильных соединений в ростовую среду Torulopsis magnoliae [0136], Torulopsis bombicola [137, 138] и Torulopsis apicola IMET43747 [110] вызывало увеличение производства сурфактанта примерно до 120-150 г/л. Был также отмечен рост количества синтезируемых моно-, ди- и трисахаридов при культивировании Arthrobacter paraffineus DSM2567 [0139], Corynebacterium spp. [140], Nocardia spp. [141] и Brevibacterium spp. [142] после внесения в среду культивирования' соответствующего углевода.

1.1.3.4 Использование экономически выгодных субстратов

В настоящее время, биосурфактанты не могут конкурировать с синтетическими

ПАВ, по причине высокой стоимости их производства. Часто компоненты ростовой среды вносят значительный вклад в расходы на культивирование микроорганизмов, а значит и на стоимость получаемого биосурфактанта [143]. Стоимость субстратов'составляет от 10 до 30% стоимости всего биотехнологического процесса [144]. Таким образом, для повышения экономической эффективности производства биосурфактантов желательно снижать затраты на расходные материалы. Одним из интенсивно исследуемых путей для достижения этой цели является использование дешёвых и легкодоступных материалов в качестве основных субстратов для культивирования. Такими субстратами могут быть растительные масла и отходы пищевой промышленности (табл. 2).

Исследования по культивированию микроорганизмов' с использованием растительных масел показывают, что эти субстраты могут быть достаточно эффективными и, в тоже время, дешёвыми для производства биосурфактантов. Рапсовое [145], кукурузное [146], оливковое [13], пальмовое [147, 148] и соевое масла [149] использовались для получения рамнолипидов при культивировании псевдомонад. Помимо этого, высоких выходов биоПАВ удавалось достигнуть для получения софоролипидов Candida bombicola [150, 151], маннозилэритролипидов Candida sp. SY16 [152], липопептидов Serratia marcescens [149]. Была показана возможность использования и животных жиров как субстратов для роста Candida bombicola, при этом выход софоролипида составил 12 г/л [153].

Перспективными субстратами для получения биосурфактантов являются отходы, образующиеся при получении и очистке масел [11]. Более того, отходы пищевой промышленности, которые принято относить к загрязнителям окружающей среды, оказались пригодны для получения биосурфактантов. При этом достигается не только снижение стоимости продукта, но и происходит утилизация отходов. Например, в пищевой промышленности производство оливкового масла сопровождается образованием значительного количества отходов, что негативно воздействует на окружающую среду. В работе [154] показано, что псевдомонады образуют биосурфактанты при культивировании на среде, содержащей такие отходы, при этом, выход рамнолипида составил 14 г на 1 кг отходов. Использование очистков г апельсинов как субстрата для выращивания Р. aeruginosa МТСС 2297 в оптимизированных условиях позволило добиться выхода биосурфактанта 9,2 г/л [155]. После дополнительного подбора условий культивирования микроорганизмов штамма Р. aeruginosa 47Т2 NCIB 40044 на отработанном масле (после его использования для жарки) выход рамнолипида составил 2,7 г/л [156]. При твердофазном культивировании Р. aeruginosa UFPEDA 614 на тростниковом жмыхе, пропитанном глицерином, удалось достигнуть образования 40 г продукта на 1 кг субстрата [157]. Смесь отходов переработки маниоки с отходами пищевого масла также была использована для получения рамнолипидов [158]. Показана возможность выращивания псевдомонад на отходах соевого масла для продукции биосурфактантов [159,160].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Петриков, Кирилл Владимирович, Москва

1. Etkin D.S. Analysis of oil spill trends in the United States and worldwide // 2001 International Oil Spill Conference, American Petroleum Institute, Washington D.C. 2001. P. 1291-1300.

2. Van Hamme J.D., Singh A., Ward O.P. Recent advances in petroleum microbiology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003 - V. 67. - No 4. - P. 503-549.

3. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. — 1995 -№ 3-С. 20-27.

4. Кобзев Е.Н. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов микробными ассоциациями в модельных системах. Дис. . канд. биол. наук. 2003. Оболенск. 179 с.

5. Desai J., Banat I. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol, and Molecular Biology Reviews 1997 - V. 61. - No 1. - P. 47-64.

6. Pacwa-Plociniczak M. Environmental Applications of Biosurfactants: Recent Advances // Int. J. Mol. Sci. 2011 - V. 12 - P. 633-654.

7. Banat I., Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Martinotti M., Fracchia L., Smyth T., Marchant R. Microbial biosurfactants production, applications and future potential // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2010 - V. 87. - P. 427-444.

8. Ланге K.P. Поверхностно-активные вещества: синтез, свойства, анализ, применение. Пер. с англ. / Под науч. ред. Л.П. Зайченко. СПб: Профессия, 2004. 240 с.

9. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества. Свойства и применение. Л.: «Химия», 1975. 248 с.

10. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогеных элементов: учеб. для вузов / Ю.А. Ершов, В.А. Попков, А.С. Берлянд и др. Под ред. Ю.А. Ершова. М. Высш. шк., 2000. 560с.

11. Muthusamy К., Gopalakrishnan S., Thiengungal K.R., Sivachidambaram P. Biosurfactants: Properties, commercial production and application 11 Current Science -2008 V. 94. - No 6. - P. 736-747.

12. Lima T.M., Procopio L.C., Brandao F.D., Carvalho A.M., Totola M.R., Borges А.С. Biodegradability of bacterial surfactants // Biodégradation 2011 -V. 22. -No 3. - P. 585-592.

13. Abouseoud M., Yataghene A., Amrane A., Maachi R. Biosurfactant production by free and alginate entrapped cells of Pseudomonas fluorescens // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008 - V. 35 -No 11. - P. 1303-1308.

14. Gautam K.K., Tyagi V.K. Microbial Surfactants: A Review // J. Oleo. Sci. 2006 - V. 55.17.

Информация о работе

Петриков, Кирилл Владимирович
кандидата химических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов Pseudomonas и Rhodococcus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы