Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение

Куюкина, Мария Станиславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение"

На правах рукописи

КУЮКИНА Мария Станиславовна

БИОСУРФАКТАНТЫ АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА ННОООСОССиЕ: ИНДУЦИРОВАННЫЙ БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пермь - 2006

Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный консультант:

член-корреспондент РАН Ившина Ирина Борисовна Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН Калакуцкий Лев Владимирович

доктор биологических наук, профессор Саралов Александр Иванович

доктор медицинских наук Несчислиев Валерий Александрович

Ведущая организация: Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

Защита состоится « Л» 006 г. ьЗ_ _^часов на заседании диссертационного

совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс (342)244-67-11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан « /У» яЛу£Г£?2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

член-корреспондент РАН / _ / ^—Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время заметно устойчивое повышение интереса к поверхностно-активным веществам биогенного происхождения (биоПАВ, биосурфактантам) как экологически безопасным и экономически эффективным поверхностно-активным агентам многоцелевого назначения с эмульгирующей, солюбилизирующей, антиадгезивной, детергентной активностью. Это обусловлено требованиями экологической безопасности, которые предусматривают постепенное выведение из промышленных производств высокотоксичных химических препаратов (Экологическая доктрина РФ, 2002; Design for the Environment, 1998), в частности, сурфактантов - как правило, продуктов нефтеоргеинтеза. Большое внимание уделяется изучению возможности получения новых соединений на основе биологического синтеза. При этом обеспечение биобезопасности в сфере биотехнологии требует всестороннего изучения как биологических агентов, так и продуктов биосинтеза (Шевелуха, 2002; Walsh et al., 2001; Renault, 2002; Parales et al., 2006).

Биосурфактанты имеют существенные преимущества перед синтетическими сурфактантами, как то: низкая токсичность, высокая биодеградабелыюсть, устойчивая активность в экстремальных условиях среды, улучшенные функциональные характеристики, возможность получения на возобновляемых источниках сырья (Desai, Banat, 1997; Makkar, Cameotra, 2002). Следует отметить, что среди биосурфактантов продукты микробного синтеза наиболее перспективны в плане биотехнологического применения, поскольку для культивирования продуцентов используются относительно простые по составу минеральные среды и доступные источники углерода. При этом возможность управления ферментационным процессом биосинтеза позволяет увеличивать выход продукта без значительных материальных и энергетических затрат (Елисеев, Кучер, 1991; Kosaric, 1992). Возможность in situ продуцирования биосурфактантов микроорганизмами важна для биотехнологии защиты окружающей среды, например, в процессах ремедиации почв и вод, загрязненных органическими поллютантами и тяжелыми металлами (Christofi, Ivshina, 2002). В последние годы наряду с традиционным использованием биосурфактантов в качестве эмульгаторов и солюбилизаторов гидрофобных веществ данные соединения привлекают все большее внимание как возможные агенты биомедицины, обладающие выраженной физиологической активностью (Kitamoto et al., 2002; Cameotra, Makkar, 2004: Ryll et al., 2006).

регуляторного) и фенотипического (по молекулярному строению) родства биосурфактантов указывает на независимое эволюционное развитие данного признака (Bodour et al., 2003). Биосурфактанты, синтезируемые бактериями разных видов в пределах одного рода, часто несхожи в структурном и функциональном отношении (Maier et al, 2000; Nielsen et al., 2002; Kuiper et al., 2004). Все это значительно затрудняет направленный поиск новых продуцентов по их таксономической принадлежности или на основании использования молекулярно-генетических методов. Несмотря на то, что сегодня расшифрованы генетические детерминанты синтеза отдельных биосурфактантов (Sullivan, 1998), пока не созданы молекулярные маркеры для их in situ детекции. В связи с этим в настоящее время безальтернативным остается функциональный подход к поиску продуцентов биосурфактантов, который предусматривает скрининг поверхностной активности выделенных чистых культур. Сегодня появляются все новые данные о микроорганизмах, обладающих сурфактантной способностью (Турковская и др., 2001; Denger et al., 1995; Deziel et al., 1996; Haußler et al, 1998; Kim et al, 2002; Benincasa et al., 2004; Gunther et al., 2005). Однако до сих пор не разработан методологический подход к осуществлению направленного поиска продуцентов биосурфактантов; не определены четкие критерии оценки их функциональной активности, физико-химических и биологических свойств; не решены проблемы моделирования ферментационного процесса получения биосурфактантов с заданными свойствами; недостаточно изучены особенности физиологии продуцентов и механизмы синтеза поверхностно-активных метаболитов.

патогенов группы М. avium - М. intracellularé), нокардий {Nocardia asteroides) и коринебактерий (Corynebacterium diphtheriae, С. matruchotii, С. xerosis) (Margaritis et al, 1979; Cooper, Zajic, 1980; Retzinger et al., 1981; Shimakata, Minatogawa, 2000; Puech et al., 2001; Fujita et al., 2005). Выявленная сурфакгантная активность данных гликолипидов свидетельствует об их практической значимости, однако явная или потенциальная патогенность штаммов-продуцентов и высокая токсичность синтезируемых гликолипидов (Watanabe et al, 1992; Sakaguchi et al, 2000) ограничивают их применение. В этой связи актуален поиск продуцентов гликолипидных сурфактантов среди представителей непатогенных актинобакгерий.

Перспективным объектом при скрининге новых продуцентов биосурфактантов являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие уникальными биологическими свойствами и широкими катаболическими способностями (Ившина и др., 1987; Ившина, 1997; Van der Geize et al, 2004). Известно (Коронелли и др., 1993; Пирог и др., 2004; Goclik et al, 1990; Lang, Philp, 1998; Rapp, Gabriel-Jurgens, 2003), что отдельные представители родококков при росте на жидких углеводородах продуцируют сурфакташы гликолипидной природы. Однако подавляющее большинство работ в этом направлении посвящено изучению представителей одного вида родококков - R. erythropolis. С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер в WFCC 768, www.iegm.ru/iegmcol), включающего наиболее полное собрание актинобакгерий известных видов Rhodococcus, выделенных из разнообразных природных субстратов контрастных эколого-географических зон (Каталог штаммов, 1994; Ivshina, 2001), представлялось возможным провести сравнительное исследование проявления сурфактантной активности в пределах данного рода, изучить зависимость выраженности данного признака от местообитания родококков, отобрать активные штаммы-продуценты биосурфактантов.

Цель настоящей работы - изучение особенностей процесса биосинтеза сурфактантов актинобактериями рода Rhodococcus, поиск новых продуцентов биосурфактантов с широким спектром функциональной активности.

Основные задачи исследования

1. Исследовать поверхностно-активные и эмульгирующие свойства представителей разных видов родококков. Отобрать штаммы-активные продуценты биосурфактантов.

2. Разработать оптимальные условия биосинтеза и эффективные способы выделения и очистки биосурфактантов.

3. Изучить структурные и функциональные особенности Rhodococcus-биосурфактантов.

4. Исследовать токсичность и биологическую активность полученных биосурфактантов.

5, Оценить возможность использования ЛЛоЛ>сосси5-биосурфактантов для биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов.

Научная новизна. Проведены комплексные исследования процесса биосинтеза сурфактантов актинобактериями рода Rhodococcus. Установлено, что синтез биосурфактантов клетками родококков индуцируется в присутствии углеводородного субстрата. Выявлена прямая зависимость сурфактантной активности родококков от длины углеродной цепи и степени гидрофобности углеводородов в ряду Ci0-*Ci6. Разработан научно-методологический подход к оптимизации процесса биосинтеза сурфактантов, основанный на использовании избыточной по фосфору и лимитированной по азоту минеральной среды с н-гексадеканом либо и-додеканом в качестве источника углерода и пониженной (24°С) температуры культивирования продуцентов. Обоснована возможность интенсификации процесса биосинтеза сурфактантов с использованием клеток родококков, иммобилизованных на природных и синтетических носителях. Предложен оригинальный метод выделения биосурфактантов, предусматривающий использование метил-отрет-бутилового эфира и ультразвуковой обработки (23 кГц, 10 мин) экстрагируемого материала.

Впервые показано, что представители R. ruber синтезируют биосурфактанты гликолипидной природы, в составе которых наряду с трегалозодимиколатом (С40), обнаруживаются диацилтрегалоза (Си-п) и моноацилтрегалоза (Ci2-i6)-Доминирующим компонентом гликолипидного комплекса является моноацилтрегалоза, содержащая смесь насыщенных и моноеновых ацильных остатков и характеризующаяся более выраженной полярностью по сравнению с таковой трегалозомономиколатов, выделенных ранее из коринебакгерий, микобактерий и представителей R. erythropolis. В результате детального изучения термодинамических параметров гликолипидных комплексов из клеток R. ruber получены новые данные о выраженной гидрофобной природе ЛАсх/ососсм^-биосурфактантов, их высокой адсорбционной и эмульгирующей активности, компактности пространственной структуры сурфактантных молекул в сорбционном слое и монодисперсности образуемых ими мицелл. Данные характеристики сопоставимы с таковыми известных синтетических сурфактантов гликолипидной природы. При изучении биологически активных свойств Я/го^ососси5-биосурфактантов выявлено их лио-, термо- и ксеропрогекторное действие в отношении бактериальных клеток. Установлено, что ЛАос?ососси5-биосурфакганты обладают выраженной иммуномодулирующей и противовоспалительной активностью.

родококков с высокой сурфакгантной активностью к нефтезагрязненным местообитаниям, обоснована целесообразность проведения направленного поиска продуцентов биосурфактантов в местах углеводородных скоплений. Отобраны штаммы родококков - активные продуценты, оптимизированы условия их культивирования, обеспечивающие высокий выход биосурфактантов. Обоснована целесообразность использования .Кйск/ососсия-биосурфактанта в качестве лиопротекгора при долговременном хранении культур актинобактерий. По данным исследования влияния Rhodococcus-биосурфактатов на процессы десорбции и мобилизации нефтепродуктов в модельной почве разработана математическая модель фильтрации гидрофобных веществ в пористой среде под воздействием сурфактантов. На основе /?Аог/ососс1«-биосурфакта1ггов разработан, апробирован и запатентован (Патент РФ № 2180276) эффективный биопрепарат нового состава и новой (олеофильпой) формы, пригодный для очистки нефтезагрязненных грунтов в регионах с холодными климатическими условиями, а также способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (Патент РФ № 2193464), прошедший апробацию на территории Пермского края и Удмуртской Республики. Разработан Регламент применения технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов с использованием олеофильного биопрепарата, согласованный с ФГУ «Центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Пермской области» и главным управлением природных ресурсов и охраны окружающей среды МПР России по Пермскому краю. Результаты диссертационной работы используются в лекционных и практических курсах для магистрантов Пермского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Актинобактерии рода Rhodococcus синтезируют биосурфакганты гликолипидной природы при росте на жидких углеводородах. Биосурфакганты, продуцируемые представителями R. ruber, содержат трегалозодимиколат, диацилтрегалозу и моноацилтрегалозу - доминирующий компонент, характеризующийся более выраженной полярностью по сравнению с таковой трегалозомономиколатов, выделенных из коринебактерий, микобактерий и представителей R. erythropolis.

2. Биосурфакганты, синтезируемые клетками R. ruber, обладают выраженными поверхностными и межфазными свойствами, эмульгирующей и нефтеотмывающей способностью, низкой токсичностью и высокой биологической активностью.

3. Применение Лйо^ососсил-биосурфактантов способствует повышению биодоступности нефтяных углеводородов для почвенных микроорганизмов вследствие их десорбции и мобилизации в почвенной среде и обеспечивает эффективное восстановление нефтезагрязненных почв и грунтов.

Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 1993-2006 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации

темы НИР 01980 004406), а также в рамках ГНТП РФ «Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии»; ГНТП РФ «Биотехнология защиты окружающей среды»; Региональной комплексной научно-технической программы «УРАЛ»; инициативных совместных научных проектов с Напиер университетом (Эдинбург, Великобритания) при поддержке Королевского научного общества Великобритании (The Royal Society, UK) и Международной программы НАТО (NATO Science Programme and Coopération Partners); Государственного контракта на выполнение НИР по заказу Минпромнауки РФ в рамках приоритетного направления научно-технического прогресса «Новые направления биотехнологии и обеспечение биобезопасности»; совместного проекта с Исследовательским цешром оценки и ремедиации загрязненных земель (Contaminated Land Assessment and Remediation Research Centre - CLARRC), Эдинбургский университет, Великобритания, поддерживаемого Научной программой компании "Ford Motors" в области защиты окружающей среды (Conservation and Environmental Grants); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»; Целевой программы Президиума УрО РАН поддержки междисциплинарных проектов, выполняемых в содружестве с учеными СО РАН; международного научного проекта, поддерживаемого грантом ИНТАС 012151 ; проекта РФФИ № 04-04-97518-р_офи.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на II-IV Международных конференциях «Проблемы загрязнения окружающей среды», Москва-Пермь, 1993; Санкт-Петербург, 1995; Москва, 1998; Волгоград-Пермь, 2001; Пермь-Казань, 2005; II и IV Международных симпозиумах по микробиологии подземных экосистем, Бат, 1993; Ваил, 1999; Международной конференции памяти акад. А.А. Баева, Москва, 1996; Международной конференции «Экологически чистые технологические процессы в решении проблем охраны окружающей среды», Иркутск, 1996; I и II Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы», Пермь, 1996; Пермь-Казань, 2005; Международной конференции «Загрязненные земли и грунтовые воды — новые направления», Портсмут, 1996; Международном конгрессе по нефтяному загрязнению почвы, Лондон, 2001; Международной конференции ISC-UNIDO «Новые технологии для очистки нефтезагрязпенных вод, почв, переработки и утилизации нефтешламов», Москва, 2001; Международной конференции «Микробиология и биотехнология XXI столетия», Минск, 2002; XII Международном симпозиуме по биоповреждениям и биодеградации, Прага, 2002; Межрегиональном совещании «Проблемы биоремедиации в XXI веке», Красноярск, 2002; Конгрессах Европейских микробиологов FEMS, Любляна, 2003; Мадрид, 2006; II Европейской конференции по биоремедиации, Ханья, 2003; Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2004; Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов», Москва, 2004;

X Международном симпозиуме по микробной экологии, Канкун, 2004; III Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; VIII Всероссийской конференции по биомеханике, Н. Новгород, 2006.

Публикации. Материалы диссертационной работы обобщены в 48 печатных работах, в том числе 22 экспериментальных статьях, 2 обзорах, 21 материале конференций и 3 патентах на изобретение РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 295 страницах, содержит 37 таблиц, 42 рисунка и состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 483 наименований, в том числе 69 на русском и 414 на английском языках.

Место проведения работы. Работа является частью исследований, выполняемых в лаборатории алканотрофпых микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (зав. лабораторией - чл.-корр. РАН, д.б.н., профессор И.Б. Ившина) по изучению, сохранению и использованию биоразнообразия углеводородокисляющих актинобактерий природных биоценозов. Фрагменты работы, связанные с практическим использованием полученных биосурфактаитов в коллекционном деле и биотехнологии защиты окружающей среды, выполнены при участии сотрудников лаборатории, к.б.н., с.н.с. Т.Н. Каменских, к.х.н., с.н.с. В.В. Гришко, вед. технолога М.И. Рычковой и магистрантов кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета Л.В. Костиной, A.B. Криворучко, А.Ю. Гаврина. Изучение процесса биосинтеза сурфактантов в условиях хемостата, а также токсикологические исследования проведены соискателем на базе Напиер университета (Эдинбург, Великобритания) при участии профессора N. Christofi, д-ра J.C. Philp и S.A. Dunbar. Исследования по биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов выполнены в сотрудничестве с лабораторией охраны окружающей среды ООО «ПермНИПИнефть» (зав. лабораторией - к.г.-м.н. С.М. Костарев), Удмуртским государственным научно-исследовательским институтом сельского хозяйства (зам. директора по научной работе - к.с.-х.н. A.B. Леднев) и Исследовательским центром оценки и ремедиации загрязненных земель (CLARRC) при Эдинбургском университете, Великобритания (директор - д-р C.J. Cunningham). Определение молекулярной структуры гликолипидного компонента биосурфактанта с помощью ЯМР-спекгроскопии и ионной масс-спектрометрии высокого разрешения проведено на базе Германского биотехнологического центра (Брауншвейг) под руководством профессора S. Lang и д-ра V. Wray. Изучение экотоксичности биосурфактаитов выполнено совместно с сотрудниками лаборатории водной токсикологии НИИ биологии Иркутского государственного университета (зав. лабораторией - д.б.н., профессор Д.И. Стом). Проверка биологической и иммуномодулирующей активности биосурфактантных препаратов проведена на кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии и иммунологии Пермской государственной

фармацевтической академии (зав. кафедрой, д.м.н., профессор В.В. Юшков). При разработке модели фильтрации пефти в почве под действием биосурфактантов использовано программное обеспечение, предоставленное кафедрой теоретической механики Пермского государственного технического университета (зав. кафедрой — д.т.п., профессор Ю.И. Няшин). Хромато-масс-спектрометрическое определение структуры нефтяного загрязнения в процессе биоремедиации почвы выполнено на базе аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН (зав. лабораторией - к.г.-м.н. М.А. Шишкин). Эксперименты по использованию биосурфактантов в качестве гидрофобизаторов при разработке носителей для иммобилизации клеток углеводородокисляющих бактерий проведены совместно с сотрудниками лаборатории криохимии (био)полимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва (зав. лабораторией - д.х.н., профессор В.И. Лозинский).

Автор выражает искреннюю благодарность веем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях. Глубокую благодарность и признательность автор выражает своему Учителю - члену-корреспонденту РАН, профессору Ирине Борисовне Ившиной, инициатору исследований биологии алканотрофных родококков, частью которых является настоящая работа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использовали культуры актинобактерий, принадлежащих к шести видам Rhodococcus (R. erythropolis - 26, R. fascians - 5, "R. ¡ongus" — 8, R. opacus-7, R. rhodochrous - 6, R. ruber— 33 штамма) и двум видам Gordonia (С. rubropertincta — 18, G. terrae - 8 штаммов) и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер в WFCC 768, www.iegm.ru/iegmcoI). Кроме того, из образцов нефтезагрязненной почвы, воды, нефтешлама, отобранных в районах нефтепромыслов Пермского края, Удмуртской Республики и Венгрии, а также пены аэротенка очистных сооружений фармацевтического завода на территории Великобритании, были выделены 39 штаммов актинобактерий. Чистые культуры актинобактерий получали с использованием разработанных нами [3, 25] селективных питательных сред. Идентификацию бактериальных изолятов осуществляли методами полифазной таксономии (Ившина, 1997) [6, 18]. Для подтверждения видовой принадлежности выделенных родококков использовали видоспецифическую 16S рДНК-амплификацию с применением праймеров, разработанных нами [6] для известных видов Rhodococcus. Консервацию и хранение исследуемых культур, периодическое и непрерывное культивирование их в углеводородсодержащих средах, иммобилизацию бактериальных клеток на природные и синтетические носители проводили в соответствии с традиционными, а также оригинальными [1,12, 20,21] методиками.

Поверхностное и межфазное натяжение биосурфакгантов измеряли с помощью автоматизированного тенсиометра (DB2kS; White Electrical Instrument Co. Ltd., Англия) непосредственно после ультразвуковой обработки (23 кГц, 1 мин) исследуемых растворов при температуре 20°С. По изотермам поверхностной и межфазной активности определяли критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) и критический фактор разбавления (Critical Micelle Dilution - CMD). Термодинамические параметры биосурфактантов: поверхностную и межфазную адсорбцию (Г„), минимальную площадь (Smin) молекулы, свободную энергию мицеллообразования (AG„IC), гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) определяли с помощью методов, описанных Heerklotz, Seelig, 2001; Kim et al., 2002; Yan et ai, 2003.

Выделение биосурфакгантов проводили с использованием разработанного нами [5, 10] экстракционного метода. Фракционирование и структурный анализ биосурфактантов осуществляли с помощью колоночной, тонкослойной и газовой хроматографии [10, 12]. Определение молекулярной структуры гликолипидного компонента проводили с использованием 'Н, "С и COSY ЯМР-спектроскопии (AVANCE DMX 600, ARX 400 и DPX 300, Broker BioSpin GmbH, Германия), а также ESI-MS высокого разрешения (TSQ 700, Thermo Finnigan MAT GmbH, Германия). Токсичность биосурфактантов определяли с помощью анализатора токсичности (Microtox М500; Microbics Corporation, США). Результаты выражали в виде эффективной концентрации (ЕС5о) препарата, вызывающей 50%-ное снижение свечения морских биолюминесцентных бактерий Vibrio flscheri. Биотестирование проводили с использованием в качестве индикаторных организмов пресноводных ракообразных - дафний (Daphnia magna Straus) и наземных аннелид - красного калифорнийского гибрида дождевого червя Eisenia foetida.

Проверку иммунотропной активности биосурфактантных препаратов проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета МЗ РФ, 1999. Влияние исследуемых биосурфактантов на гуморальное звено иммунной системы оценивали по числу антителообразующих клеток и титру гемагглютининов на фоне развития первичного иммунного ответа. Влияние биопрепаратов на процесс фагоцитоза оценивали по числу фагоцитирующих нейтрофилов, фагоцитарному индексу и фагоцитарному числу. Анализ противовоспалительного действия биосурфакгантов осуществляли с использованием каррагениновой модели воспаления (Шварц, Сюбаев, 2000). Изучение аллергенное™ проводили в тесте дегрануляции тучных клеток in vitro (Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств, 1988).

Нефтеотмывающую активность (био)сурфакгантов изучали с использованием модельной почвенной колонки [19]. Фракционный анализ десорбированной из загрязненной почвы нефти проводили методом TLC-FID (Iatroscan МК-5, Iatron Laboratories Inc., Япония) (Cavanagh et al., 1995). Разработку математической модели процесса десорбции/мобилизации нефти в почве под действием сурфактантов

осуществляли с использованием теории Дарси фильтрации жидкости через пористую среду [22]. Изучение влияния биосурфактантных препаратов на процесс биоремедиации нефтезагрязненной почвы проводили в лабораторных и полевых условиях с использованием твердо-жидкофазного биореактора и аэрируемых почвенных площадок [4, 11, 13, 14, 16]. В течение 1995-2005 г.г. проводили апробацию разработанной биотехнологии в полевых условиях на территории деятельности нефтяных компаний ООО «ЛУКОЙЛ-Пермь» и ОАО «Удмуртнефть». Полевые исследования по биоремедиации сельскохозяйственной почвы, загрязненной в результате аварийного разлива нефти и пластовых вод, осуществляли на участке НГДУ «Полазнанефть» Межевского нефтяного месторождения Пермского края (1995-1996 г.г.); по биологической очистке нсфтсзагрязненного грунта (нефтешлама)

- на территории комплекса по переработке отходов НГДУ «Кунгурнефть» Кокуйского нефтяного месторождения Пермского края (1999 г.) и подфакельной площадки на территории СНУ «Юрчук» Соликамского района Пермского края (20042005 г.г.); по биоремедиации пахотной почвы, загрязненной нефтесолевой эмульсией,

- на территории Ижевского НГДУ Гремихинского нефтяного месторождения Удмуртской Республики (2000-2003 г.г.).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ описательной статистики (Statistica 3.4 для Windows) с вычислением среднего квадратического отклонения, стандартной ошибки, доверительного интервала. При оценке степени достоверности различий средних данных использовали /-критерий Стьюдента. Отдельные задачи решали с помощью регрессионного, кластерного и дискриминантного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Распространенность признака сурфактантной активности среди актинобактерий рода ЯйоА>сосси5. Характеристика поверхностно-активных свойств родококков. Анализ опубликованных сведений о потенциальной опасности актинобактерий группы «миколат», содержащих в составе клеточных липидов высокомолекулярные а-разветвленные (5-гидроксилированные жирные (миколовые) кислоты, свидетельствует о том (табл. 1), что среди родов, входящих в семейства СогупеЬасгепасеае, £>геГг;асеае, Соп1отасеае, МусоЬас1епасеае, ИосагсИасеае и ТзикатигеИасеае, объединенные в подпорядок СогупеЬасгегтеае ^аскеЬгалск е1 а1., 1997), лишь два рода - Юю11ососсиз и Согс1ота характеризуются минимальным числом патогенных и условно патогенных видов и, следовательно, представляют интерес в качестве промышленных продуцентов биосурфакгантов.

Таблица 1. Результаты оценки потенциальной опасности представителей родов актинобактерий, объединенных в группу «миколат»

Род (число валидных видов) Количество видов (% от общего числа видов)

Непатогенные (группа риска 1)* Условно-патогенные (группа риска 2)* Патогенные (группа риска 3)* Нет данных о патогенности

Corynebacterium (66) 13 (20) 43 (65) 1(2) 9(14)

Dietzia (4) 2(50) 1(25) 0 1 (25)

Gordonia (19) 10(53) 3(16) 0 6(32)

Mycobacterium (110) 43 (39) 54 (49) 7(6) 6(6)

Nocardia (61) 12 (20) 33 (54) 2(3) 14(23)

Rhodococcus (24) 15(63) 1(4) 0 8(33)

Tsukamurella (7) 1(14) 3(43) 1(14) 2(29)

Примечание. * Группы риска указаны в соответствии с Risk group classification (prokaryotes): European Community classification. Использованы данные List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature [www.bacterio.net]; Bacterial Nomenclature Up-to-Date [www.dsmz.de/microorganisms].

При этом подавляющее большинство проводимых исследований сурфактантной активности непатогенных актинобактерий выполнено на штаммах, первоначально описанных как Arthrobacter paraffineus (Suzuki et al., 1969; Duvnjak et al., 1983), Coryrtebacterium lepus (Cooper et al., 1979; Duvnjac, Kosaric, 1985), Mycobacterium paraffinicum (Батраков и др., 1978, 1979), Nocardia erythropolis (Macdonald et al., 1981) и позднее реклассифицированных в вид R. erythropolis. Таким образом, спектр «миколат» с изученной сурфактантной активностью ограничивается представителями рода Rhodococcus, в частности одного вида — R. erythropolis, либо

такие исследования выполнены с использованием штаммов родококков неопределенного видового положения (Коронелли, Юферова, 1990; Назина и др., 2003; Пирог и др., 2004; Lang, Philp, 1998; Rapp, Gabriel-Jurgens, 2003).

При осуществлении направленного поиска продуцентов биосурфактантов мы использовали простой в исполнении и экспрессный метод определения эмульгирующей способности, основанный на измерении величины образующейся эмульсии при добавлении бактериальной культуры к двухфазной системе н-гексадекан-вода (Gerson, Zajic, 1978). Следует отметить, что измерение индекса эмульгирования широко используется в скрининговых работах для детекции поверхностной активности и отбора штаммов микроорганизов - активных продуцентов биосурфактантов (Коронелли, Юферова, 1990; Кислухина и др., 1993; Denger, Schink, 1995; Bredholt et al., 1998; Bodour et al., 2004). По нашему мнению, применение данного метода целесообразно при тестировании микроорганизмов, синтезирующих клеточно-связанные сурфактанты, в отличие от таких экспресс-методов, как разрушение углеводородной капли «drop-collapse», растекание масла «oil-spreading», лизис эритроцитов кровяного агара (Bodour et al., 2003; Youssef et al., 2004), пригодных для анализа экстрацеллюлярных биосурфактантов. В нашей модификации метода стандартизация физических параметров эмульсионного теста достигалась тем, что водно-углеводородную систему после добавления бактериальной культуры подвергали ультразвуковой обработке определенной интенсивности и продолжительности озвучивания (23 кГц; 3 мин). Подобранный режим акустического воздействия позволяет получать однородные, высокодисперсные и стабильные эмульсии при тестировании бактериальных культур с различными морфолого-культуральными и физиологическими характеристиками, а также обеспечивает высокую воспроизводимость экспериментальных результатов.

Как видно из табл. 2, способность к синтезу биосурфактантов широко распространена среди актинобактерий, принадлежащих к родам Rhodococcus и Gordonia. При этом биосурфактанты, продуцируемые представителями R. opacus и R. erythropolis, наиболее активно снижают поверхностное натяжение воды - от 72 до 26,5 и 27,1 мН/м, соответственно. Биосурфактанты, синтезируемые штаммами R. ruber, "R. longus" и G. rubropertincta, эффективно снижают межфазное натяжение водно-углеводородной системы - от 32 до 1,8-2,8 мН/м. По нашим данным, представители "R. longus", R. opacus и R. ruber синтезируют наиболее активные сурфактанты, о чем свидетельствуют высокие (85-95) значения показателя CMD. Эмульгирующая активность изученных штаммов родококков варьирует в пределах колебания средневидовых значений индекса эмульгирования от 41 до 53%. Наименее выражена способность к образованию эмульсий из углеводорода и воды у представителей гордоний, в частности G. terrae, индекс эмульгирования которых составляет в среднем 26% {см. табл. 2).

Таблица 2. Поверхностно-активные и эмульгирующие свойства актинобактерий Юю(1ососси$ ярр. и СогЛопш $рр.

Вид (число штаммов) Поверхностное натяжение, мН/м Межфазное натяжение, мН/м Показатель СМБ* Индекс эмульгирования, Е24, %

G. rubropertincta (18) 27,4 ± 1,4 2,8 ± 1,3 80 40,9 ± 4,8

G. terrae (8) 27,9 ± 2,5 3,9 ± 0,7 64 25,7 ±5,8

R. erythropolis (26) 27,1 ± 1,6 6,3 ± 2,6 60 46,0 ± 4,7

"R. longus" (8,1 27,6 ± 2,7 1,8 ±0,3 90 49,0 ± 2,5

R. opacus (7) 26,5 ± 1,8 3,2 ± 1,4 95 51,3 ±3,9

R. rkodochrous (6) 27,4 ± 0,7 4,7 ± 0,2 64 41,2 ±3,6

R. ruber (33) 27,3 ± 2,5 2,3 ± 1,0 85 52,6 ±3,4

Примечание. *СМО - значение максимального разбавления культуральной среды дистиллированной водой до сохранения свойства мицеллообразования.

Для детальной оценки проявления признака сурфактантной активности у исследуемых актинобактерий нами реализован алгоритм кластерного анализа данных определения поверхностной активности и эмульгирующей способности бактериальных культур. Применение кластерного анализа не выявило четкой видовой специфичности исследуемого признака среди представителей родококков и гордон. На рис. 1 в качестве примера приведена дендрограмма распределения 74 штаммов Кко(1ососсга Брр. и СоЫота врр. в зависимости от величины индекса эмульгирования. Как видно из построенной дендрограммы, большинство тестируемых штаммов объединяются в четыре группы (ЫУ), имеющие внутригрупповой показатель сходства, не превышающий 5 усл. ел,, а также весьма обособленную от других группу V, характеризующуюся высокой степенью гетерогенности по исследуемому признаку (показатель внутригруппового сходства достигает 14 усл. ед.).

При анализе физиологических особенностей 92 штаммов родококков, выделенных из разнообразных природных и техногенных источников (поверхностных и грунтовых вод, донных отложений, почв разных типов, грунтов из нефтешламоотстойников, керна геохимических скважин, снежного покрова, пены аэротенков очистных сооружений) контрастных климатических зон (Каталог штаммов..., 1994), нами выявлена четкая зависимость между сурфактантной активностью исследуемых культур и экологическими условиями обитания и субстратом их выделения. Как видно из рис. 2, родококки, выделенные из нефтезагрязненных местообитаний, характеризуются достоверно более выраженной поверхностной и эмульгирующей активностью по сравнению с таковой бактериальных культур, изолированных из незагрязненных природных субстратов.

с R. erythropolis ИЭГМ 20 Я ruber ИЭГМ 225 A ruber ИЭГМ 73 A ruber ИЭГМ 236 A ruber ИЭГМ 326 A ruber ИЭГМ 328 A ruber ИЭГМ 241 A opacus ИЭГМ 57 A opacus ИЭГМ 246 A opacus ИЭГМ 61 "A longus " ИЭГМ 68 A opacus ИЭГМ 60 R. ruber ИЭГМ 235 A ruber ИЭГМ 325 A ruber ИЭГМ 342 "A longus" ИЭГМ 27 A гкАст ИЭГМ 172 A fascians ИЭГМ 39 A erythropolis ИЭГМ 212 A erythropolis ИЭГМ 270 A fascians ИЭГМ 38 А ороси ИЭГМ 716 A erythropolis ИЭГМ 269 "A Wus" ИЭГМ 32 "A longus" ИЭГМ 29 A ruber ИЭГМ 224 A erythropolis ИЭГМ 188 G. terrae ИЭГМ 144 A ruber ИЭГМ 77 G. terrae ИЭГМ 147 G.rubropertincta ИЭГМ 106 "к. longus " ИЭГМ 69 А erythropolis ИЭГМ 192 G. rubropertincta ИЭГМ 96 G.rubropertincta ИЭГМ 128 A ruber ИЭГМ 327 "А longus" ИЭГМ 28 "А longus " ИЭГМ 31 А erythropolis ИЭГМ 708 А erythropolis ИЭГМ 267 A fascians ИЭГМ 34 "А longusИЭГМ 33 А opacus ИЭГМ 717 A rhodochrous ИЭГМ 646 А rhodochrous ИЭГМ 647 А erythropolis ИЭГМ 186 A ruber ИЭГМ 437 A ruber ИЭГМ 323 А opacus ИЭГМ 56 A erythropolis ИЭГМ 185 A ruber ИЭГМ 93 А габег ИЭГМ 438 A ruber ИЭГМ 334 A ruber ИЭГМ 238 V A ruber ИЭГМ 231

А Ы«гИЭГМ219 Г А erythropolis ИЭГМ 487 А rhodochrous ИЭГМ 339 A ruber ИЭГМ 84 О. rubropertincta ИЭГМ 95 А rhodochrous ИЭГМ 65 А erythropolis ИЭГМ 266 А erythropolis ИЭГМ 265 A ruber ИЭГМ 223 G.rubropertincta ИЭГМ105 R. erythropolis ИЭГМ 268 k. fascians ИЭГМ 170 A ruber ИЭГМ 226 С. fern» ИЭГМ 146 С. гот-ае ИЭГМ 151 А rhodochrous ИЭГМ 62 Л fascians ИЭГМ 278 О. terrae ИЭГМ 143 С. terrae ИЭГМ ] 51

'S, усл. ед."

Рис. I. Дендрограмма распределения штаммов Rhodococcus spp. и Gordonia spp по кластерам в зависимости от их эмульгирующей активности.

29,5 -

Ч) 29 -

i> 23,5 ■

В 28 ■

ES О й 27,5 •

о Ж й

8 г 27 1

к X 26,5 -|

о.

о сэ 26 1

с 25,5 -1

25 J

Рис. 2. Поверхностная (А) и эмульгирующая (Б) активность родококков, выделенных из нефтезагрязненных (■) и незагрязненных (□) природных субстратов.

1 - Все исследуемые субстраты; 2 - почва; 3 - вода. Приведенные показатели различаются статистически достоверно при уровне значимости * р< 0,05; * * р< 0,1.

При этом наиболее заметная разница показателей поверхностной активности отмечается для почвенных родококков, обитающих в загрязненных и «чистых» биотопах (рис. 2А).

По нашим данным, эмульгирующая способность родококков, выделенных из нефтезагрязненных субстратов, также достоверно превышает таковую организмов, обитающих в незагрязненных экосистемах (рис. 2Б). В частности, 22%-ое увеличение эмульгирующей активности наблюдается у обитателей водных систем, загрязненных нефтепродуктами, по сравнению с культурами, изолированными из «чистых» водоемов. Следует отметить, что способность к биосинтезу сурфактантов родококками, обитающими в почвенных и водных биотопах, имеет важное экологическое значение в процессах самоочищения нефтезагрязненных экосистем вследствие повышения биодоступности углеводородных поллютантов, обусловливающей высокую скорость их биодеструкции.

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей (Коронелли и др., 1997; Назина и др., 2003; Sorkhoh et al., 1995; Lang, Philp, 1998; Bouchez-Naitali et al., 1999), свидетельствующими о способности родококков, в частности представителей R. erythropolis, продуцировать биосурфактанты, что позволяет расширить спектр микроорганизмов - потенциальных биосинтетиков сурфактантов и дает основание считать актинобактерии рода Rhodococcus перспективными объектами для селекции промышленных продуцентов биосурфактантов.

Оптимизация процессов биосинтеза и выделения сурфактантов алканотрофных родококков. Сравнительные исследования накопления биосурфактантов клетками R. ruber при использовании различных углеродных субстратов свидетельствуют о том, что водорастворимые источники углерода (углеводы, спирты), а также газообразные н-алканы (пропан, н-бутан) обеспечивают бактериальный рост, но не поддерживают процесс биосинтеза сурфактантов (табл. 3). При росте родококков на жидких углеводородах количество образуемых сурфактантов зависит от длины углеродной цепи используемых соединений. Так, короткоцепочечные (Сб-С9) н-алканы практически не усваиваются или очень слабо ассимилируются клетками R. ruber, что, по-видимому, обусловлено токсическим действием данных углеводородов, растворяющих фосфолипидные компоненты клеточных мембран (Sikkema et al, 1995). При росте на н-декане (С10), н-ундекане (С,,), а также пристане (Ci9), отличающемся высокой степенью ветвления углеродной цепочки, количество накапливаемых биосурфактантов не превышает 0,18-1,59 г/л; на

Таблица 3. Биосинтез сурфактантов клетками R. ruber ИЭГМ 231 в зависимости от используемого углеродного субстрата

Ростовой субстрат Клеточная биомасса, г АСВ/л Поверхностное натяжение, мН/м Концентрация биосурфактанта,

Глюкоза 2,53 ±0,17 71,0 ±0,2 0

Пропанол 2,30 ± 0,22 60,5 ± 0,3 0

Бутанол 2,76 ± 0,20 56,9 ± 0,4 0

Пропанол-1 1,90 ±0,18 55,1 ±0,1 0

Глицерин 2,90 ± 0,30 71,8 ±0,2 0

Пропан 2,34 ±0,14 68,8 ±0,1 0

н-Бутан 2,67 ±0,19 68,3 ± 0,3 0

н-Гексан 0,14 ±0,07 63,1 ± 0,3 0

Циклогексан 0 65,9 ±0,1 0

н-Гептан 0,68 ± 0,08 67,9 ± 0,1 0

н-Октан 0 56,2 ± 0,2 0

и-Нонан. 0,34 ± 0,04 56,7 ±0,2 0

н-Декан 1,24 ±0,10 39,5 ±0,1 0,18

Децен-1 1,00 ±0,16 39,9 ± 0,2 0,53

н-Ундекан 2,15 ±0,17 26,9 ± 0,3 1,59

н-Додекан 4,53 ± 0,20 29,7 ±0,1 3,79

н-Тридекан 4,93 ± 0,28 32,1 ±0,2 3,23

н-Тетрадекан 5,67 ± 0,27 31,8 ±0,2 3,80

н-Пентадекан 4,53 ± 0,37 31,2 ±0,2 4,01

н-Гексадекан 4,80 ± 0,22 29,6 ±0,1 10,1

Пристан 1,35 ± 0,11 31,4 ±0,3 1,17

прямоцепочечных углеводородах от С12 до Сн данная величина составляет 3,2-3,8 г/л; на н-пентадекане (С|5) и н-гексадекане (С16) - 4,0-10,1 г/л. Повышение сурфактантной активности родококков в зависимости от увеличения длины углеродной цепочки в ряду н-алканов Сю—»С^, по-видимому, обусловлено возрастанием степени гидрофобное™ потребляемого углеводородного субстрата (Khadikar et а!., 2003).

Результаты изучения динамики клеточного роста и накопления биосурфактантов клетками R. ruber ИЭГМ 231 в условиях периодического культивирования родококков в минеральной среде с н-гексадеканом представлены на рис. 3. Характерной особенностью родококков при росте их в присутствии углеводородов является наличие довольно продолжительной (8 ч) лаг-фазы роста, в течение которой наблюдается резкое снижение поверхностного и межфазного натяжения культуральной среды, свидетельствующее об интенсивном синтезе биосурфактантов уже в первые часы культивирования. Экспоненциальный рост начинается после 10 ч, при этом максимальная скорость роста (цгаа,=0,24 ч"1) регистрируется после 24 ч культивирования. К этому сроку (22-24 ч) поверхностное и межфазное натяжение среды достигают минимальных (27,0 и 1,8 мН/м) значений при уровне показателя CMD, равном 32. В дальнейшем происходит постепенное накопление клетками биосурфактантов, ведущее к увеличению показателя CMD до 74 (32 ч), 94 (48 ч) и 100 (52 ч культивирования).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Время, ч

Рис. 3. Динамика роста и процесса синтеза биосурфактантов клетками R. ruber ИЭГМ 231 при культивировании в присутствии н-гексадекана.

• - CMD; Д - поверхностное натяжение; X - межфазное натяжение; 0 - клеточная биомасса.

С целью повышения выхода биосурфактантной продукции мы проводили оптимизацию состава питательной среды в условиях непрерывного роста родококков. Подобранный режим хемостатного культивирования (концентрация фосфатов в поступающей питательной среде - 4,0 г/л; н-гексадекана — 18,7 г/л; скорость разбавления субстрата - 0,072 ч"') способствует интенсивному (СМБ=30) образованию биосурфактантов при сохранении постоянного (4-6 х 107 КОЕ/мл) уровня численности клеточной популяции в реакторе. В ходе культивирования наблюдается постепенное снижение концентрации н-гексадекана в среде от 12 до 9 г/л, указывающее на преобладание процесса трансформации углеводородного субстрата в сурфактантые продукты над процессом клеточного роста.

В эксперименте по непрерывному культивированию родококков в условиях азотного лимитирования (рис. 4) обнаружено 5-кратное увеличение выхода биосурфактантов при снижении концентрации нитрата в среде от 1,0 до 0,01 г/л. При этом максимальный (СМЛ=50) уровень сурфактантной продукции регистрируется только после того, как в среде практически не остается источника азотного питания. В то же время не происходит угнетения роста родококков даже в отсутствие азотного субстрата, о чем свидетельствует стабильно высокая (108-109 КОЕ/мл) плотность бактериальной популяции в хемостате на протяжении всего эксперимента.

Рис. 4. Динамика роста и процесса синтеза биосурфактантов клетками Я. ruber ИЭГМ 231 в условиях азотного лимитирования.

• - CMD; Д - поверхностное натяжение; ♦ - концентрация н-гексадекана; х - концентрация NaN03; 0 - бактериальный рост. Скорость разбавления субстрата -0,06 ч"' (начало разбавления - после 64 ч); 0,05 ч"1 (после 96 ч).

o-ly-r-y-rf !■■■•!■■■ ><■ ■ ■ >f .)<

0 50 100 150 200

100 Время, ч

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей (Kim et al., 1990; Arino et al., 1996, 1998; Haba et al., 2000), отмечающих повышение сурфакгантной продукции у бактерий в ответ на снижение концентрации или даже полное исчезновение неорганического азота из среды культивирования. В настоящее время пока не найдено однозначного объяснения данного факта, выявленного у представителей таких филогенетически далеких бактериальных родов, как Pseudomonas, Cellulomonas и Rhodococcus. По-видимому, у разных бактерий, наряду со специфическими, включаются универсальные для биологических систем регуляторные механизмы в ответ на стресс азотного голодания. Так, известно, что в условиях недостатка азотного и избытка углеродного субстрата в бактериальных клетках инициируется процесс запасания энергетических ресурсов, например, олиго-и полисахаридов, полифосфатов, нейтральных липидов (Russell, 1998; Desvaux, Petitdemange, 2001; Alvarez et al., 2002). У родококков, культивируемых на углеводородной среде в условиях дефицита азота, очевидно, включается механизм накопления энергетических резервов в виде продуктов окислительной трансформации углеводородов, в частности гликолипидов и ацилглицеридов. Выявленное нами повышение интенсивности процесса биосинтеза сурфактантов в условиях азотного лимитирования, вероятно, обусловливает преимущественное выживание родококков в бедных органическими питательными элементами экосистемах, подвергнутых углеводородному загрязнению, например, кернах и грунтовых водах районов нефтепромысла (Ившина и др., 1981; 1995) нефтезагрязненных пустынных и арктических почвах (Sorkhoh et al, 1995; Juck et al., 2000).

При определении оптимального температурного режима культивирования нами обнаружено 20%-ное повышение продукции биосурфактантов при снижении температуры от 30°С на каждые 2°С, достигающее максимального значения (CMD=120) при 24°С. Полученные результаты свидетельствуют о возможности снижения энергетических затрат при производстве Лйо£?осос««-биосурфакгантов за счет использования пониженной температуры культивирования продуцентов.

С целью интенсификации процесса биосинтеза сурфактантов мы использовали клетки родококков, иммобилизованные на природных и синтетических носителях. Как видно из рис. 5, наиболее оптимальными адсорбентами родококков являются древесные опилки, обработанные небольшим количеством олифы (1:0,2). Данный носитель характеризуется высокой адсорбционной емкостью, развитой поверхностью и межфазной локализацией в водно-углеводородной системе, что способствует высокой каталитической активности иммобилизованных родококков. Кроме того, в качестве нового носителя для иммобилизации клеток родококков нами испытан полимерный криогель на основе поливинилового спирта. Выбор данного носителя обусловливается его существенным преимуществом по сравнению с другими синтетическими (полиакриламидным, полиуретановым или полимочевинным) гидрогелями, заключающемся в возможности проведения иммобилизации

микроорганизмов в «мягких» условиях, то есть при физиологических значениях рН, температуры и без применения токсичных химических веществ (Лозинский и др., 1990; Lozinsky, 2002; Chen et ah, 2003). Подобранные условия проведения иммобилизации родококков в криогель поливинилового спирта способствуют сохранению высокой жизнеспособности и функциональной активности (ем. рис. 5) закрепленных бактериальных клеток.

Рис. 5. Биотрансформация н-гексадскана иммобилизованными клетками R. ruber ИЭГМ 231 (а) и сорбция углеводорода материалом носителей (б). 1 - Свободные клетки; 2 - клетки, иммобилизованные на кукурузных отходах; 3-7 -на древесных опилках, гидрофобизованных н-гексадеканом (3), олифой в соотношении 1:0,1 (4); 1:0,2 (5); 1:1,5 (б); 1:2 (7); клетки, закрепленные в криогеле поливинилового спирта (8).

Для полного выделения синтезируемых биосурфактантов нами использован метод экстрагирования сурфактантного материала метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ) в подобранном режиме ультразвуковой обработки (23 кГц, 10 мин). Используемый в качестве экстрагента МТБЭ менее токсичен и более биодеградабелен, реже образует пероксиды и менее взрывоопасен по сравнению с другими органическими растворителями (Rosenkranz, Klopman, 1991; Gupta, Lin, 1995; Steffan et ai., 1997). Кроме того, МТБЭ характеризуется сбалансированной полярностью, превышающей таковую углеводородов, но более низкой по сравнению с другими эфирами, спиртами, кетонами и хлорсодержащими растворителями (Reichardt, 1988). Результаты сравнительного определения функциональных характеристик биосурфактантов, выделенных с использованием различных экстракционных систем (табл. 4), свидетельствуют о способности МТБЭ эффективно извлекать поверхностно-активные соединения, сопоставимой с таковой смесей хлороформа-метанола. Проведение процесса экстрагирования в условиях соникации

уменьшает критическую мицеллярную концентрацию (ККМ) выделенных биосурфактантов в 1,3-2,0 раза, по-видимому, в результате дополнительного высвобождения клеточно-связанных гликолипидов из разрушенных клеток. Необходимо отметить, что проведение экстракции с использованием дихлорметана или хлороформа-метанола в технологическом отношении осложняется необходимостью центрифугирования экстрагируемой смеси для отделения биосурфакганта от культуральной жидкости, тогда как при использовании МТБЭ экстрагируемый биосурфактант легко отделяется после 10-минутного отстаивания.

Таблица 4. Характеристика биосурфактантов из R. ruber ИЭГМ 231, выделенных с использованием различных систем растворителей

Система растворителей Выход сурфактанта, г/л Поверхностное натяжение, мН/м Межфазное натяжение, мН/м ККМ, мг/л

МТБЭ 10,1 ±0,6 29,2 ± 0,3 0,9 ± 0,2 173

МТБЭ* 8,6 ± 0,4 30,1 ± 0,4 1,5 ±0,1 135

СН2С12 9,4 ± 0,5 35,0 ± 0,3 0,5 ± 0,3 180

СН2С12* 8,1 ± 0,6 29,9 ± 0,6 1,4 ±0,3 86

СНС13:СН3ОН(1:2) 9,8 ± 0,4 28,9 ±0,3 1,0 ±0,2 171

СНС13:СН3ОН (1:2)* 9,6 ± 0,6 30,0 ± 0,4 1,6 ±0,3 90

СНС13:СН3ОН (2:1) 10,7 ±0,7 28,5 ±0,3 0,3 ±0,1 97

МТБЭ:СНС13 (1:1) 10,1 ±0,4 29,2 ± 0,4 1,2 ±0,1 140

Примечание. *3десь и в табл. 5, экстрагирование проводили в сочетании с ультразвуковой обработкой (23 кГц, 10 мин).

Физико-химическая характеристика ЛАоАгсоссги-биосурфактантон. Как

видно из табл. 5, неочищенные экстракты биосурфактантов содержат 36-63% липидов, 0,5-4,3% белка, 0,01-0,35% свободных гексоз и 36-60% остаточного н-гексадекана. Липидная фракция состоит из полярных (8,2-15,4%) и неполярных (2650%) компонентов. При этом экстракты, полученные с помощью ультразвуковой обработки, характеризуются повышенным содержанием полярных липидов. Неполярные липиды представлены ацилглицеридами и свободными жирными кислотами. ТСХ-анализ полярной липидной фракции МТБЭ-экстрактов выявил присутствие трех гликолипидов. Незначительное количество фосфолипида (кардиолипина) в экстрагированных биосурфактантах свидетельствует, что их поверхностная активность определяется присутствием гликолипидных компонентов.

Молекулярная структура (рис. 6) гликолипидных компонентов GL1, GL2 и GL3, входящих в состав биосурфактантного комплекса R. ruber ИЭГМ 231 и очищенных с помощью колоночной хроматографии, установлена на основании данных одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии на ядрах 'Н и 13С и ионной масс-спектрометрии.

Таблица 5. Химический состав (%) биосурфактантов из R. ruber ИЭГМ 231,

выделенных с использованием различных систем растворителей

Система Полярные Неполярные Белок Свободные Остаточный

растворителей липиды липиды гексозы и-гексадекан

МТБЭ 8,5 48,0 1,8 0,01 41,5

МТБЭ* 9,8 44,3 4,3 0,03 41,6

СН2С12 8,2 48,8 2,0 0,05 39,2

СН2С12* 10,0 44,0 3,5 0,10 42,3

СНС13:СН3ОН(1:2) 8,9 49,8 2,7 0,09 38,2

СНС13:СН3ОН(1:2)* 9,5 50,3 2,4 0,35 36,7

СНС13:СН3ОН (2:1) 15,4 47,7 0,5 0,12 36,0

СНС13:СН3ОН (2:1)* 10,4 47,4 Н.о. Н.о. 40,2

МТБЭ:СНС13 (1:1) 8,3 32,3 2,5 0,01 55,2

МТБЭ:СНС13 (1:1)* 9,7 25,9 Н.о. Н.о. 59,3

Примечание. Н.о. - не определено.

CH,OR1 ОН

СЫ О он

ш + п = 29-41 II I

(центрировано при 35) _ с _ «н __ сн_ (СН2) т _ СНз

I Р

(СН2)п — сн3 О

т = 13 - 15 ||

(возможно 14 + 12 и 14 + 16 у _с_( )т_

с основным компонентом 14 + 14) л

СЬЗ II

ш = 10 — 14 = —С— (СН2)т—СН3

(основной компонент 12) и2 ~ Н

Рис, 6. Структура гликолипидного комплекса из R. ruber ИЭГМ 231.

Вверху - общая схема строения. GL1, GL2 и GL3 - составные компоненты.

Структурный анализ выявил присутствие трегалозы в качестве гидрофильной части молекулы во всех трех гликолипидах. Компонент GL1, составляющий 24,2% от массы гликолипида, представлен типичным трегалозодимиколатом, отличающимся от такового из R. erythropolis DSM 43215 (Rapp et al., 1979) содержанием более высокомолекулярных (до Сю) миколовых кислот. Данный трегалозодимиколат, очевидно, обусловливает повышенную гидрофобность клеточной поверхности родококков, тем самым, обеспечивая их экологическое преимущество в условиях потребления углеводородного субстрата. В составе компонента GL2 (25,3 %) обнаружено два ацильных остатка (Ci5-C17), ковалентно связанных с молекулой трегалозы. Доминирующий (50,5 %) трегалозолипид GL3 содержит один ацильный остаток (С|2-1б) с насыщенными и ненасыщенными связями и характеризуется более выраженной полярностью по сравнению с известными трегалозомономиколатами из микобактерий, коринебактерий и представителей R. erythropolis (Rapp et al., 1979; Dhariwal et al., 1987; Datta, Takayama, 1993).

По нашим данным, термодинамические параметры (табл. 6) очищенного гликолипидного комплекса из R. ruber сопоставимы с таковыми известных синтетических сурфактантов гликолипидной природы (Rauter et al., 2005) и свидетельствуют о высокой адсорбционной активности, компактности пространственной организации биосурфактантных молекул и способности к формированию в растворе монодисперсных мицеллярных агрегатов. Выявленные термодинамические свойства определяют функциональные характеристики биосурфактанта и, следовательно, возможные области его применения. Так, при сравнении функциональных особенностей наиболее известных биогенных и синтетических сурфактантов (табл. 7) было показало, что активность гликолипидного биосурфактанта из R. ruber сопоставима с таковой коммерческого сурфактина, получаемого из В. subtilis, и значительно превышает активность большинства химических сурфактантов. Следует отметить, что способность синтезируемых родококками биосурфактантов эффективно снижать межфазное натяжение имеет важное практическое значение, в частности, в процессах эмульгирования, десорбции и солюбилизации гидрофобных соединений в водонасыщенных пористых средах (Ivshina et al., 1998; Mulligan et al., 2001). Так, биосурфактант из R. ruber, снижающий поверхностное и межфазное натяжение до значений 27 и 0,9 мН/м, может применяться в двухфазных (вода-органическая фаза) и трехфазных (вода-органическая фаза-твердое вещество) системах, например, в процессах биологического восстановления почв и донных отложений, загрязненных гидрофобными поллютангами (Volkering et al, 1995).

Таблица 6. Термодинамические параметры биосурфактанта из R. ruber ИЭГМ 235

ккм, ГЛБ ■р ПОЯ ж » Р м/ф * т * о пов ^min , с . ^Ф A Gmic,

мкМ моль/м моль/м2 нм2 нм2 кДж/моль

63,2 7,96 4,6 х 1 О*6 4,1 х 10~6 0,36 0,41 -33,3

Таблица 7. Сравнительная характеристика функциональной активности биосурфактантов и синтетических сурфактантов

Сурфактант Поверхностное Межфазное ККМ,

натяжение, мН/м натяжение, мН/м мг/л

Гликолипидный комплекс 26,8 0,9 54

из R. ruber ИЭГМ 235

Димиколаты трегалозы 36,0 17,0 4

из R. erythropolis1

Мономиколаты трегалозы из R. erythropolis 32,0 14,0 4

Рамнолипиды из P. aeruginosa1 25-40 0,2-3,5 10-400

Софоролипиды из С. bombicola3 33,0 1,8 38-77

Сурфактин из В. subtilisi 27-32 1,0 23-16

Додецилсульфат натрия4 35,0 0,02 2120

Цетилтриметиламмониум бромид4 30,0 5,0 1300

Твин 204 30,0 4,8 600

Тритон Х-1004 31,0 - 300

Линейный алкилбензолсульфонат4 47,0 < 1,0 590

Примечание. Цит. по 'Kim et al., 1990; 2Lang, Wullbrandt, 1999; 3Georgiou et al., 1992; "Finnerty, 1994.

По нашим данным, ЛЛос/ососсгм-биосурфактанты при добавлении к водно-углеводородной смеси формируют устойчивые, не расслаивающиеся даже после 10-мин центрифугирования (рис. 7), плотные высокодисперсные эмульсии типа "масло/вода", имеющие высокий (Е24 = 40-65%) индекс эмульгирования. 2.5 2.4

С О

60 5 10

Время воздействия, мин

Рис. 7. Гидродинамическая устойчивость водно-углеводородной эмульсии, стабилизированной биосурфактантом из R. ruber ИЭГМ 235.

Приведены средние показатели оптической плотности (ОП540) эмульсии после отстаивания и центрифугирования.

Анализ влияния повышенной температуры на функциональную активность ЮюАососсш-биосурфактантов (табл. 8) свидетельствует об их высокой термической стабильности. Так, инкубирование биосурфактантов при 70-90°С в течение 30 мин не приводит к потере сурфактантной активности. Более того, кипячение в течение ]5 мин не оказывает влияния на поверхностные и эмульгирующие свойства биосурфактантов. При этом эмульгирующая активность синтетических сурфактантов (Твин 60, Тритон Х-100) в данных условиях (90-100°С) снижается на 10-25 %.

Таблица 8. Влияние повышенных температур на поверхностную н эмульгирующую активность биосурфактантов

Биосурфактант Т°С Время воздействия, мин Поверхностное натяжение, мН/м Индекс эмульгирования, Е24, %

Неочищенный 20 27,3 ± 0,2 40,8 ±3,1

биосурфактант из 70 30 27,3 ± 0,1 43,8 ± 1,4

R. ruber ИЭГМ231 90 30 27,4 ± 0,2 41,2 ±2,7

100 15 27,1 ± 0,2 42,2 ±2,1

Неочищенный 20 27,0 ±0,1 46,3 ± 1,8

биосурфактант из 70 30 27,2 ± 0,2 47,5 ±2,7

R. ruber ИЭГМ 23 5 90 30 27,3 ± 0,2 44,6 ± 2,9

100 15 27,0 ± 0,2 47,0 ± 2,6

Гликолипидный 20 26,8 ± 0,2 63,4 ±2,5

комплекс из 70 30 26,8 ±0,1 63,9 ± 2,0

R. ruber ИЭГМ 235 90 30 26,9 ± 0,2 61,4± 1,8

100 15 27,2 ± 0,2 64,4 ± 2,7

По нашим данным, ДйоЛ>сс>сси5-биосурфакганты устойчивы к замораживанию. В частности, полученные нами препараты биосурфактантов полностью сохраняют сурфактантную активность после длительного (в течение 3 лет) хранения при температуре -20°С. Кроме того, возможно хранение лиофилизированных биосурфактантных препаратов без потери функциональных (поверхностно-активных и эмульгирующих) свойств в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.

Как видно из рис. 8, устойчивая активность биосурфакганта сохраняется при значениях показателя кислотности внешней среды в диапазоне от 3 до 9. Снижение рН среды до значения 2,0 приводит к уменьшению индексов эмульгирования Е| и Е24 на 9 и 27 %, соответственно. Закисление среды до рН 1,0 вызывает 56-63%-ную потерю эмульгирующей активности препарата. В сильнощелочных (рН 11,0) условиях эффективность биосурфакганта снижается на 14-25 %.

s К

90 80 -70 60 -50 -40 -30 -20 -10 0

rfl

:Ы1

□ El ■ E24

HEi

lllli

2 3 5 7 9

Значения pH

Рис. 8. Зависимость эмульгирующей активности биосурфактанта из Я. ruber ИЭГМ 231 от показателя кислотности среды.

Приведены индексы эмульгирования (Е] и Е24)» измеренные после 1 и 24 ч.

Полученные данные термической и рН стабильности Rhodococcus-биосурфакгантов согласуются с таковыми наиболее эффективного гликолипидного биосурфактанта MEL-SY16, продуцируемого дрожжами Candida antarctica (Kim el al., 2002). Характерно, что при повышенных температурах (90-100 °С), а также в кислых (рН 2-4) и щелочных (рН 9-11) растворах эмульгирующая способность микробных биосурфактантов превышает таковую синтетических аналогов (наши данные и Kim et al., 2002), свидетельствуя об их высокой структурной и функциональной стабильности в экстремальных условиях окружающей среды.

Нами впервые был использован А/ки/ососа«-биосурфактант для гидрофобизации криогеля на основе поливинилового спирта. Как видно из табл. 9, внесение биосурфактанта оказывает существенное влияние на реологические и термальные свойства криогеля, в частности повышает его механическую прочность и эластичность. Так, в зависимости от концентрации добавленного биосурфактанта значение условно-мгновенного (G0) модуля упругости криогеля увеличивается в 1,51,8, а величина динамического (С?30) модуля упругости - в 1,5-1,9 раз по сравнению с контрольными показателями. При этом максимальное (15%, v/v) внесение биосурфактанта не приводит к уменьшению температуры плавления (Гг) криогеля. Необходимо отметить, что добавление синтетических сурфактантов (додецил-сульфата натрия, цетилтриметиламмониум бромида) вызывает снижение механической прочности криогелей. Выявленный гидрофобизующий и упрочняющий эффект ДЛси/ососсиз-биосурфакганта на криогель поливинилового спирта может быть использован в биотехнологических процессах трансформации органических соединений, в частности, природных изопреноидов [8, 9] и биодеградации гидрофобных ксенобиотиков с применением иммобилизованных бактериальных клеток.

Таблица 9. Влияние ЯЛ<?</0с<?сси$-биосурфактанта на реологические и термальные свойства криогеля поливинилового спирта

Образец криогеля ту,°с Go, кПа G30, кПа

Контроль (без добавок) 69,5 ± 0,3 4,65 ± 0,28 3,21 ±0,31

Криогель + 5 % (v/v) воды 68,6 ± 0,2 3,93 ± 0,72 3,19 ±0,50

Криогель + 5 % (v/v) биосурфактанта 69,5 ±0,1 6,04 ± 0,70 4,65 ± 0,27

Криогель + 10 % (v/v) воды 68,3 ± 0,2 3,72 ± 0,28 2,69 ±0,10

Криогель + 10 % (v/v) биосурфактанта 69,6 + 0,1 5,63 ± 0,60 4,14 ±0,30

Криогель + 15 % (v/v) воды 67,0 ±0,1 3,07 ±0,21 2,30 ±0,21

Криогель + 15 % (v/v) биосурфактанта 69,7 ±0,1 5,63 ± 0,69 4,39 ± 0,33

Биологически активные свойства гликолипидных Rhodococcus-биосурфактантов. Известно, что микробные метаболиты, представленные гликолипидами, как правило, обладают высокой биологической активностью (HauBler et al., 1998; Kitamoto et al., 2002). Однако вопросам изучения биологических свойств гликолипидов, синтезируемых непатогенными нокардиоформными актинобактериями, до сих пор посвящены лишь единичные публикации в зарубежной печати (Natsuhara et al., 1990; Sakaguchi et al., 2000; Cameotra, Makkar, 2004).

Поскольку биологическая активность биосурфакгантов часто проявляется в цитотоксическом действии (Hauffler et al., 1998), это ограничивает их применение в качестве лечебных препаратов. Такое применение возможно только в случае, если терапевтическая активность биосурфактантного препарата значительно превышает его токсичность. Сравнительные данные токсичности (табл. 10) гликолипидного биосурфактанта из R. ruber и других биогенных и синтетических сурфактантов свидетельствуют о том, что полученный препарат в 10-1000 раз менее токсичен, чем синтетические сурфактанты (финазол, корексит, инипол) и в 2-10 раз, чем гликолипиды из R. erythropolis и P. aeruginosa. Полученные данные согласуются с результатами (Sakaguchi et al., 2000) определения in vitro токсичности трегалозолипидов, синтезируемых представителями Rhodococcus sp. и М. tuberculosis, свидетельствующими о том, что трегалозодимиколаты родококков в 40 раз менее токсичны по сравнению с таковыми, синтезируемыми клетками микобактерий. По нашим данным и сведениям, приведенным в обзоре D. Kitamoto с соавт. (2002), гликолипидные биосурфактанты, синтезируемые родококками, не проявляют ингибиторного эффекта на рост бактерий и грибов.

Нами выявлено лиопротекторное действие Дйог/ососсия-биосурфактанта на клетки пропан- и бутанокисляющих родококков в процессе их лиофилизации и последующего хранения. Так, результаты определения жизнеспособности лиофилизированных культур в зависимости от температуры и продолжительности хранения (рис. 81) свидетельствуют о 1,3-8,1-кратном возрастании устойчивости к

действию повышенных температур клеток родококков, высушенных с добавлением комплекса биосурфакганта и желатинового агара, по сравнению с таковой при использовании традиционного лиопротектора - сахарозо-желатинового агара (СЖА). Произведенные расчеты показывают, что рациональная длительность хранения родококков при условии предварительного выращивания их на пропане и использования традиционного лиопротектора - СЖА, составляет около пяти лет, тогда как применение желатинового агара с добавлением биосурфактанта способствует увеличению прогнозируемого срока хранения до 18 лет.

Таблица 10. Сравнительная токсичность (био)сурфактантов

Сурфактант ECjo Vibrio flscheri, мг/л

Гликолипидный комплекс из R. ruber ИЭГМ 235 650

Димиколат трегалозы из R. erythropolis' 49

Тетраэфир трегалозы из R. erythropolis' 286

Рамнолипиды из P. aeruginosa 50

Нонилфенол-(этиленоксид)9-ацетат EQ 91 78

Стеарат сахарозы DK 501 67

Финазол OSR-51 7

Корексит 95971 5

Спиртовый (первичный) этоксилат РАЕ (12-8)2 3

Спиртовый (вторичный) этоксилат SAE2 22

Инипол ЕАР 22 0,4

Примечание. Цит. по Poremba et al., 1991; Sherrard et al., 1996.

4,5

2 4

Длительность хранения, сут

2 4

Длительность хранения, сут

Рис. 8. Жизнеспособность клеток пропан- и бутаиокисляющих R. ruber ИЭГМ 333 в лнофнлизнрованных препаратах.

Среда предварительного культивирования — минеральная среда с н-пропаном. Лиопротекторы: А - СЖА; Б - ЖА+биосурфактант. Температура хранения: 1 - 37; 2-45 °С.

По нашим данным, клетки родококков, растущие в углеводородсодержащей среде и активно синтезирующие биосурфактанты, более устойчивы к высушиванию и действию повышенных температур по сравнению с клетками, культивируемыми в углеводной среде и не продуцирующими сурфактанты. Как видно из табл. 11, показатель жизнеспособности как высушенных, так и прогретых при 50°С клеток R. ruber ИЭГМ 235, проявляющих высокую сурфактантную активность, значительно (в 580 и 25 раз, соответственно) превосходит таковой родококков с индуцированным углеводным обменом.

Таблица 11. Жизнеспособность (кл/мл) клеток R. ruber ИЭГМ 235 при нагревании и высушивании в зависимости от среды предварительного культивирования

Среда культивирования Исходная бактериальная суспензия После прогревания в течение 5 ч при температуре После высушивания при комнатной температуре в

50°С 80°С течение 4 мес

Мясопептонный агар Минеральный агар с м-гексаде-каном (5,3±0,7) х 108 (3,5±0,4) х 10s (3,0±0,4) х 106 (7,4±0,3) х 107 (1,б±0,3) х 104 (9,3±1,3) х 106

Примечание. "После 5-часового прогревания бактериальной суспензии при 80°С наблюдался рост единичных колоний родококков при высеве на мясопептонный агар.

Выявленная повышенная устойчивость алканотрофных родококков к исследуемым неблагоприятным факторам среды, на наш взгляд, обусловлена термо- и ксеропротекторным действием синтезируемых гликолипидных биосурфактантов. Так, известно, что гликолипидные компоненты (в частности, трегалозолипиды) клеточной оболочки термо- и ксеротолерантных бактерий и грибов играют важную роль в молекулярных механизмах адаптации данных микроорганизмов к экстремальным условиям существования (Коронелли, 1984; Волков, 1994; Beney, Gervais, 2001).

Проверка иммуномодулирующей активности полученных нами гликолипидных биосурфактантов, проведенная на кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии и иммунологии Пермской государственной фармацевтической академии, выявила их стимулирующее воздействие на гуморальный иммунный ответ (табл. 12). Так, пероральное введение биосурфактантных препаратов мышам в дозе 0,1 мг/кг вызывает 60-70%-ное увеличение числа антителообразующих клеток (ЛОК) и 20-30%-ное повышение титра гемагглютинирующих антител по сравнению с таковыми у контрольных животных, не получающих биопрепаратов. Следует отметить, что иммуностимулирующая активность исследуемых биосурфактантов сопоставима с таковой бронхомунала, лекарственного препарата на основе

бактериальных лизатов. Кроме того, обнаружено, что пероральное введение биосурфактантов мышам в дозе 0,1 мг/кг увеличивает процент фагоцитоза в 1,8-2,3; фагоцитарный индекс - в 2,3-2,5; фагоцитарное число - в 1,3-2,2 раза по сравнению с контрольными показателями.

Таблица 12. Влияние биосурфактантных препаратов на гуморальный иммунный ответ

Вариант опыта Доза введения, мг/кг Число АОК на 106 ядросодержащих клеток в селезенке Титр антител, log2

Контроль 91,2 ± 1,4 6,7 ± 0,2

Биосурфактант 1 0,1 143,5 ± 2,4*"'2) 8,0 ± 0,2*"'2>

Биосурфактант 2 0,1 153,3 ± 1,2*"'2) 8,5 ± 0,2*"'2)

Бронхомунал 0,1 136,2 ± 1,1*П) 6,7 ± 0,3

Примечание. Биосурфактантные препараты получены из R. ruber ИЭГМ 231, культивируемого в присутствии н-гексадекана (биосурфактант 1) или н-додекана (биосурфактант 2). ^Экспериментальные показатели статистически достоверно отличаются от "'контрольной группы и (2)группы, получающей бронхомунал, при уровне значимости р < 0,01.

Как видно из рис. 9, пероральное введение крысам Л/юЛ>с0ссм$-биосурфакганта вызывает достоверное торможение развития модельного каррагенинового отека по сравнению с таковым у контрольных животных. Данный факт свидетельствует о возможном противовоспалительном действии биосурфактанта. Изучение аллергенных свойств ЯЛоЛ?сосси.5-биосурфакгантов in vitro выявило отсутствие у них выраженной аллергенности (степень дегрануляции тучных клеток крыс составляет 4,2-6,8% при использовании биосурфактантов в концентрации 1,0-100,0 мг/мл).

Таким образом, препараты гликолипидных , „, , , биосурфактанта на развитие

Ляодососси^-биосурфактантов характеризуются

- каррагенинового воспаления,

широким спектром проявления биологической

активности, в том числе иммуномодулирующим и 1 ~~ Контроль, 2 - биосурфактант. противовоспалительным действием при отсутствии выраженного аллергического и токсического эффекта.

160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 -0 --

Рис. 9. Влияние Rhodococcus-

ORhodococcus-

биосурфактант Л Контроль (вода)

Оценка возможности использования ЛА<к/»с«сси5-биосурфакгантов для биоремедиации нефтезагрязнеииых почв и грунтов. Результаты изучения нефтеотмывающей активности биосурфактанта из R. ruber ИЭГМ 231 представлены на рис. 10. Степень удаления тяжелых (удельная плотность 0,93-0,97 г/см3) нсфтей из

загрязненного песка составляет 60-80%, что превышает контрольные показатели в 15-30 раз. При этом обнаружена обратная корреляция между степенью извлечения нефти и содержанием в ней асфальтенов (R2=-0,96; Р=0,03б) и смол (RJ=-0,84; Р=0,057).

В экспериментах с использованием модельной почвенной колонки установлено (рис. 11), что способность Rhodococcus-биосурфактантов удалять нефть из загрязненной почвы в стационарных условиях в 1,4-2,3 раза превышает таковую синтетического сурфактанта - Твина 60. При этом нефте-отмывающая активность биосурфактанта, полученного при росте родококков на н-до декане, составляет 43% при 15°С, что в 1,5 раза превышает таковую Твина 60. Данный биосурфактант целесообразно использовать в процессах нефтеотмывания почвы при низких температурах. С возрастанием температуры увеличивается способность биосурфактантов извлекать нефть из загрязненной почвы. При 28°С /г/юс7ососс1«-биосурфактанты демонстрируют наиболее высокую (59-82%) нефтеотмывающую активность, тогда как контрольный показатель десорбции нефти при данной температуре не превышает 35%.

о 1

Рис. 10. Нефтеотмывающая активность биосурфактанта.

Образцы нефти различной удельной плотности: 1 - 0,87; 2 - 0,88; 3 - 0,93; 4 - 0,97 г/см3.

22 28 Температура, °С

Рис. 11. Зависимость нефтеотмывающей активности (био)сурфактантов от температуры.

1 - Контроль (вода); 2 - Твин 60; 3-4 - биосурфактанты, полученные при культивировании R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии к-гексадекана (3) или н-додекана (4).

На основании экспериментальных данных, представленных на рис. 12,

построена математическая модель проникновения гидрофильных и гидрофобных

веществ в пористой среде под действием сурфактантов, основанная на теории

фильтрации несмешивающихся жидкостей. Процесс фильтрации (био)сурфактантов в

нефтезагрязненной почве описывается следующей (неявной) теоретической

зависимостью глубины проникновения (/) от времени (<): / - — 1п(1 + Ы)= а , где

параметры а, Ь, с определены экспериментально (рис. 13) и составляют для биосурфактанта: а =0,95; Ь-2,7 м"1; с=1,5-10"5 м/сек; Твина-60: а=0,86; 6=2,2 м'1; с=1,М0"5 м/сек. Следовательно, скорость нефтеотмывания почвы ЮюАососсиз-биосурфактантом выше по сравнению с таковой при использовании синтетического сурфактанта. Построенная теоретическая модель демонстрирует качественное и количественное совпадение {см. рис. 13) с полученными данными.

100 й? 90 а* 80

5 60 S 50

S 30

I 20

U 10 о

Аппроксимация

4,3 5 5,5 6

0 0.5 1 14 2 2.5 3 3,5 4 Время, ч

Рис. 12. Динамика процесса фильтрации воды (1-3) и нефти (4-6) в почвенной колонке при температуре 28 (1, 4), 22 (2, 5) и 15 "С (3, 6).

Рис. 13. Экспериментальная зависимость глубины проникновения (био)сурфактантов в нефтезагрязненную почву от времени (точки) и ее теоретическая аппроксимация (линии). 1 - Лйо^ососсия-биосурфактант; 2 -Твин-60.

Разработанный метод математического моделирования был использован нами при создании прогнозной модели стационарного процесса нефтеотмывания загрязненного почвогрунта под действием Rhodococcus-Сжосурфактата, адаптированной к полупромышленному процессу отмывания почвы с применением внешнего отрицательного давления [22]. Полученная с помощью разработанной модели теоретическая оценка основных рабочих параметров и эффективности (продолжительности) процесса нефтеотмывания согласуется с известными (Kosaric, 2001; Mulligan et al., 2001) экспериментальными оценками.

Сравнительное биотестирование ЛЛо^ососси5-биосурфактантов и синтетического сурфактанта - Твина 60 (табл. 13), проведенное с использованием дафний (Daphnia magna Straus) и красного калифорнийского гибрида дождевого

червя Eisenia foetida в качестве индикаторных организмов, свидетельствует о низкой экотоксичности исследуемых биосурфактантов по сравнению с синтетическим аналогом. Так, токсичность ДйоЛ>соссг«-сурфактантов в отношении водных организмов в 4-20 раз, а наземных животных - почти в 100 раз ниже, чем Твина 60. Полученные результаты подтверждают литературные данные (Mulligan et ah, 2001; Doong, Lei, 2003) о высокой токсичности и потенциальной опасности применения синтетических сурфактантов, широко используемых сегодня для борьбы с нефтяными загрязнениями, и указывают на необходимость и целесообразность их замены экологически безопасными ЛАоА?«>сси.г-биосурфактантами.

Таблица 13. Сравнительные результаты биотестирования (био)сурфактантов

Концентрация препарата (г/л) Выживаемость D. magna, % Выживаемость Е. foetida, %

24 ч 48 ч 96 ч 6ч 12ч 24 ч

Биосурфактант 1

100,0 60 20 20 100 100 100

50,0 80 60 50 100 100 100

25,0 100 80 60 100 100 100

10,0 100 90 70 100 100 100

5,0 100 100 100 100 100 100

2,5 100 100 100 100 100 100

Биосурфактант 2

100,0 0 0 0 100 100 100

50,0 30 10 0 100 100 100

25,0 40 10 0 100 100 100

10,0 70 50 50 100 100 100

5,0 100 100 100 100 100 100

2,5 100 100 100 100 100 100

Твин 60

100,0 0 0 0 50 50 0

50,0 0 0 0 50 50 0

25,0 0 0 0 50 50 10

10,0 30 0 0 50 50 25

2,5 80 70 60 100 50 50

1,25 100 100 100 100 100 100

Примечание. Неочищенные биосурфактантные препараты получены при культивировании R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии к-гексадекана (биосурфактант 1) или н-додекана (биосурфактант 2).

На основании проведенных исследований можно заключить, что неочищенные ЛйоЛэсосои-биосурфактанты могут использоваться в качестве нефтеэмульгирующих и нефтеотмывающих агентов в процессах биоремедиации водных и наземных экосистем, загрязненных нефтью, не оказывающих отрицательного экологического воздействия на развитие природных биоценозов.

Полученные результаты исследования позволили предложить новый подход в разработке технологии биоремедиации нефтезагрязненной почвы, основанный на применении биогенных сурфактантов бактериального происхождения. Используя этот подход, на основе полученных биосурфактантов нами разработан (Патент РФ № 2180276) биопрепарат, представляющий собой органо-минеральный биокомплекс, содержащий ЛЙ£и/осоеси.5-биосурфактант, экспериментально подобранную ассоциацию бактериальных культур-нефтеразрушителей и все необходимые для биологического восстановления поврежденных почв компоненты (соли NPK, витамины, аминокислоты, микроэлементы). Бактериальные компоненты биопрепарата представлены штаммами R. ruber ИЭГМ 327 и R. erythropolis ИЭГМ 708, выделенными из дерново-подзолистой почвы и содержимого шламотстойника на территории нефтяного месторождения Пермского края, устойчивыми к высоким (МИК=1,2-5,0 мМ) концентрациям солей тяжелых металлов (Cd, Zn, Ni, Си, Mo, Pb, Cr, V) и активными в условиях повышенной кислотности (рН 5,0-6,0) и засоленности (5-7% NaCl) почвы. Предложена новая форма биопрепарата в виде олеофильной концентрированной эмульсии. Включение Яйос/ососсия-биосурфактанта в состав биопрепарата определяет его основные эксплуатационные характеристики: высокую степень солюбилизации с нефтяными углеводородами; повышение биодоступности нефти в результате десорбции с почвенных частиц под действием биосурфакганта; заключенный в олеофильном матриксе комплекс питательных соединений и отсутствие токсического воздействия на почвенные микроорганизмы. Созданный биопрепарат удобен в хранении и транспортировке и, в отличие от лиофильно-высушенных препаратов, не требует предварительной активации при использовании.

Разработанный биопрепарат использовался при создании экологически безопасной технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов (Патент РФ № 2193464). В лабораторных условиях нами разработаны и апробированы специальные приемы биоремедиации сильнозагрязненного (30 вес.%) нефтью почвогрунта, предусматривающие применение твердо-жидкофазного биореактора и аэрируемых почвенных площадок. Как видно из табл. 14, внесение биопрепарата стимулирует развитие гетеротрофов (их число возрастает в 100 раз по сравнению с первоначальной численностью) и, в большей степени, углеводородокисляющих бактерий, численность которых в биореакторе увеличивается в 500 раз и составляет 107 кл/мл.

Анализ динамики процесса биодеградации нефтяных углеводородов (рис. 14) в твердо-жидкофазном биореакторе свидетельствует об интенсивном окислении алифатических и ароматических компонентов, доля последних в остаточном загрязнении уменьшается в два раза. Значительно медленнее происходит микробиологическая деструкция асфальтенов и смол, относительное содержание которых к концу эксперимента возрастает до 14%.

Таблица 14. Влияние биопрепарата на основе .КЛо^ососсиз-биосурфактанта на численность микроорганизмов в твердо-жидкофазном биореакторе

Вариант опыта

Численность бактерий, кл/мл

гетеротрофных углеводородокисляющих

Контроль (без препарата) (3,4±0,8) х 105 (9,2±1,7) х 104

Внесение биопрепарата* (4,5±1,7) х 107 (4,5±1,9)х ю7

Через 1 неделю опыта (1,2±0,2) х 107 (9,8±3,3) х 106

Внесение биопрепарата* (1,2±0,3) х 108 (9,2±3,8) х ю7

Через 2 недели опыта (4,2±1,3) х 10® (8,3±3,2) х ю7

Через 3 недели опыта (1,3±0,6) х 108 (4,2±1,3) х ю7

Через 4 недели опыта (1,0±0,2) х 108 (3,2±1,2)х ю7

Внесение биопрепарата* (3,3±0,3) х 10' (3,7±0,2) х ю8

Через 5 недель опыта (1,9±0,б) х 10® (1,3±0,4) х 10s

Через 6 недель опыта (8,8±2,6) х 10s (4,1±1,7) х ю7

Примечание. 'Внесение биопрепарата проводили непосредственно после отбора образцов.

Смолы и асфальтены ES3S Гетероциклические углеводороды

I_I Ароматические

углеводороды

ES3) Алифатические углеводороды

Остаточная нефть

Время, недели

Рис. 14. Влияние биопрепарата на основе /Мо^/ососсдо-биосурфактанта на интенсивность процесса деградации нефтяных углеводородов в твердо-жидкофазном биореакторе.

На основании результатов лабораторных и полевых исследований нами разработана последовательная схема (рис. 15) процесса биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов, предполагающая: (1) первоначальную обработку сильнозагрязненного (10-30 вес. %) почвогрунта в твердо-жидкофазном биореакторе; (2) внесение органического разрыхлителя (древесной щепы или опила) в соотношении разрыхлитель : почвогрунт - 1 : 6-8; (3) внесение биопрепарата по схеме: 10 л на 0,5-1,0 м3 почвогрунта 1 раз в неделю в течение первого месяца и, в дальнейшем, - по меньшей мере, 1 раз в месяц до окончания срока биоремедиации; (4) периодическое рыхление и полив для поддержания уровня относительной влажности почвы 20%; (5) применение фиторемедиации (засева многолетними травами) для ликвидации остаточного нефтезагрязнения и восстановления почвенного плодородия.

Результаты проведенных испытаний разработанного биопрепарата свидетельствуют о том, что эффективность микробиологической деградации нефти в почве при его использовании составляет 85-90% по истечении 7-12 недель. При этом содержание остаточных нефтепродуктов в очищенной почве не превышает 1,0 вес.%, что делает ее пригодной к хозяйственному использованию.

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что характерной особенностью актинобактерий рода Ыюйососсив, растущих в присутствии жидких углеводородов, является сурфактантная активность, то есть способность снижать поверхностное натяжение среды культивирования до значений 2 30 мН/м. Данная активность родококков обусловлена синтезом биосурфактантов гликолипидной природы, содержащих трегалозу в качестве гидрофильной части молекулы и варьирующих по структуре видоспецифических жирноацильных компонентов. Исследование поверхностно-активных свойств большого массива представителей известных видов Ююйососсих, выделенных из разнообразных природных и техногенных источников и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ, выявило отсутствие у родококков видовой и наличие экологически обусловленной специфичности в проявлении сурфактантной активности. Показано, что районы природных и антропогенных углеводородных скоплений могут служить источником новых штаммов актинобактерий - активных продуцентов биосурфактантов.

биосурфактантов обеспечило использование метил-от/?е/я-бутилового эфира в качестве экстрагента и ультразвуковой обработки экстрагируемого материала. В процессе детального изучения выделенных /?Ае>г/ососсг«-биосурфактантов получены новые данные о термодинамических свойствах, определяющих их функциональные характеристики (поверхностную, межфазную, эмульгирующую, десорбционную, гидрофобизующую активность) и возможные области применения.

Полученные нами и другими исследователями сведения о многообразии физиологических функций биосурфактантов - от участия в процессе потребления жидких углеводородов до формирования устойчивости бактериальных клеток к неблагоприятным воздействиям окружающей среды - свидетельствуют об их существенной роли в жизнедеятельности микроорганизмов-продуцентов. Следует отметить, что выявленные биологически активные свойства ЛЛси/ососа«-биосурфактантов, в частности лио-, термо- и ксеропротекториое действие, требуют дальнейшего углубленного исследования. Необходимы новые подходы для расшифровки механизмов физиологической активности биосурфактантов, базирующиеся на молекулярно-генетических технологиях. Эти фундаментальные исследования станут возможными только после создания генетически маркированных мутантных штаммов родококков, не способных к синтезу биосурфактантов, сравнение которых с родительским фенотипом поможет пролить свет на участие поверхностно-активных метаболитов в физиологических процессах и экологическом поведении бактерий-продуцентов. В дальнейшей разработке нуждается выявленный факт об иммуномодулирующей и противовоспалительной активности ЮюЛососсия-биосурфактантов.

Основными итогами проведенных исследований являются доказательство многообразия проявления сурфактантной активности у акгинобакгерий рода ЛАо<&>сосси$ и создание практически-ориентированного подхода к получению на основе непатогенных штаммов бактерий эффективных биосурфактантов с широким спектром функциональных возможностей. Обозначены перспективные области возможного применения ДАо<з?ососси^-биосурфактантов в качестве биопротекторов и биостимуляторов, эмульгирующих и гидрофобизующих агентов при создании перспективных биотехнологий, а также нефтеотмывающих препаратов, пригодных для биоремедиации окружающей среды [17,20,23, 27, 37].

НефтезагрязненныЙ почвогрунг

<5% весовых

Анализ содержания нефтепродуктов

5-30% весовых

Твердо-жидкофазный

биореактор

<5 % Анализ содержания >5%

весовых нефтепродуктов весовых

Аэрируемые почвенные площадки

Последовательность операций Периодичность операций за 1 цикл биоремедиации Контроль параметров

1. Внесение органического разрыхлителя Разовая Гранулометрический и агрохимический анализ; определение /°С, рН, влажности, влагоемкости; содержания нефтепродуктов; микробиологический анализ; фитотоксичность

2. Внесение биопрепарата Еженедельная Определение /°С, влажности; содержания нефтепродуктов; микробиологический анализ; фитотоксичность

3. Рыхление и увлажнение Еженедельная Тоже

4. Фиторемедиация Разовая Тоже

Очищенный почвогрунг;

Использование очищенного грунта на основании результата приемки

Сельскохозяйственное

Лесохозяйственное

Техническое

Рис. 15. Схема обработки нефтезагрязненного почвогрунта с использованием биопрепарата на основе ЯЛоЛ>с0сс/«-биосурфактанта.

ВЫВОДЫ

1. Изучены поверхностно-активные и эмульгирующие свойства актинобактерий рода Rhodococcus. Установлена экологическая приуроченность родококков с высокой сурфактантной активностью к нефтезагрязненным местообитаниям, обоснована целесообразность проведения направленного поиска активных продуцентов биосурфактантов в местах углеводородных скоплений. Выделены и охарактеризованы штаммы родококков - активные продуценты биосурфактантов.

2. Подобраны оптимальные условия синтеза биосурфактантов, предусматривающие использование избыточной по фосфору и лимитированной по азоту минеральной среды с н-гексадеканом либо н-додеканом, пониженной (24°С) температуры культивирования, а также иммобилизацию клеток родококков на природных (гидрофобизованный древесный опил) и синтетических (криогель поливинилового спирта) носителях. Разработан эффективный способ выделения Лйо£/ососсы5'-биосурфакта1ггов, предусматривающий использование метил-трет-бутилового эфира в качестве экстрагента и ультразвуковую обработку экстрагируемого материала.

3. Выявлено, что представители R. ruber синтезируют гликолипидный комплекс, содержащий трегалозодимиколат (С40), диацилтрегалозу (Спи) и моноацилтрегалозу (Сщ-м) - доминирующий компонент, характеризующийся более выраженной полярностью по сравнению с таковой трегалозомономиколатов, выделенных из коринсбактсрий, микобактерий и представителей R. erythropolis.

4. Показано, что биосурфактанты, синтезируемые представителями R. ruber, характеризуются низкой токсичностью, выраженными поверхностными и межфазными свойствами, эмульгирующей и нефтеотмывающей способностью, а также высокой биологической (ксеро-, термопротекторной, иммуномодулирующей, противовоспалительной) активностью.

5. На основе полученных ДАсх/ососси^-биосурфактантов разработана экологически безопасная технология биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов, пригодная для использования в условиях умеренного и холодного климата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Шадрин О.Л., Рыбалка Л.В., Зверева JI.B., Чумаков О.Б. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков //Микробиология. — 1994. — Т. 63. Вып. 1. — С. 118-128,

2. Тульбович Б.И., Казакова Л.В., Радушев А.В., Лесков А.Е., Дроздецкий А.Г., Ившина И.Б., Куюкина М.С. Многофункциональный реагент для интенсификации добычи нефти//Нефтяное хозяйство. — 1995. — № 11. — С. 44-46.

3. Ившина ИХ Куюкина ' М.С. Селективное выделение пропанокисляющих родококков с использованием антибиотических веществ//Микробиология. - 1997. -Т. 66. № 4. - С. 494-500. *--

4. Christofi N.. Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Philp J.C. Biological treatment of crude oil contaminated soil in Russia///«: Contaminated Land and Groundwater: Future Directions. Ed. D.N. Lerner and N.R.G. London, Geological Society Engineering Geology Publications, 1998.-V. 14.-P. 45-51.

5. Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Plilp J.C., Christofi N. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species/ZWorld J. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - V. 14. - P. 711-717.

6. Bell K.S., Kuyukina M.S., Heidbrink S., Philp J.C., Aw D.W.J., Ivshina I.B., Christofi N. Identification and environmental detection of Rhodococcus species by 16S rDNA-targeted PCR//J. Appl. Microbiol. - 1999. - V. 87. - P. 472-480.

7. Куюкина M.C., Ившина И.Б., Рычкова М.И., Чумаков О.Б. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков//Микробиология. - 2000. - Т. 69. № 1. - С. 62-69.

8. Гришко В .В., Воробьев А.В., Ившина И.Б., Шмидт Э.Н., Покровский Л.М., Куюкина М.С., Толстиков Г.А. Микробиологическая трансформация природных изопреноидов. Биотрансформация изопимаровой и дегидроабиетиновой кислот с использованием бактерий рода Rhodococcus!/Химия в интересах устойчивого развития. - 2000. - № 8. - С. 693-698.

9. Vorob'ev A.V., Grishko V.V., Ivshina I.B., Shmidt E.N., Pokrovskii L.M., Kuyukina M.S., Tolstikov G.A. Microbial transformation of diterpene acids//Mendeleev Communications. - 2001. - N. 11. - C. 72-73.

10. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Philp J.C., Christofi N.. Dunbar S.A., Ritchkova M.I. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl-tertiary butyl ether extraction//J. Microbiol. Methods. - 2001. - V. 46. - P. 149-156.

11. Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Ritchkova M.I., Philp J.C., Cunningham C.J., Christofi N. Oleophilic biofertilizer based on a Rhodococcus surfactant complex for the bioremediation of crude oil-contaminated soil//Contaminated Soil Sediment Water. - 2001. -N. 4.-P. 20-24.

12. Philp J.C., Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Dunbar S., Christofi N.. Lang S., Wray V. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer//Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - V. 59. - P. 318-324.

13. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Ritchkova M.I., Philp J.C., Cunningham J.C., Christofi N. Bioremediation of crude oil-contaminated soil using slurry-phase biological treatment and land farming techniques//Soil Sediment Contamination. - 2003. - V. 12. - P. 85-99.

14. Ившина И.Б., Куюкина M.C., Костарев C.M. Применение экологически безопасной экспресс-технологии очистки нефтезагрязненных почв и грунтов (на примере районов нефтедобычи Пермской области)//Нефтяное хозяйство. - 2003. -

№9.-С. 116-118.

15. Bell J.M.L., Philp J.C., Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Dunbar S.A., Cunningham C.J., Anderson P. Methods evaluating vanadium tolerance in bacteria isolated from crude oil contaminated land//J. Microbiol. Methods. - 2004. - V. 58. - P. 87-100.

16. Cunningham C.J., Ivshina I.B., Lozinsky V.I., Kuyukina M.S., Philp J.C. Bioremediation of diesel contaminated soil by microorganisms immobilised in a polyvinyl alcohol cryogel//Int. Biodeterioration Biodégradation. - 2004. - V. 54. - P. 167-174.

17. Каменских Т.Н., Куюкина M.C., Ившина И.Б. Особенности консервации актинобактерий рода Rhodococcusll Вестник Пермского государственного университета. Серия Биология. - 2004. — ВыпГзГ^'бт 110-113.--"

18. Осипенко М.А., Куюкина М.С., Ившина И.Б., Потеряева Е.В., Рогожникова Е.Н. Вероятностная модель антибиотикотипирования непатогенных актинобактерий// Российский журнал биомеханики. - 2004. - Т. 8. № 2. - С. 71-77.

ТТЛГиуиклпа MIS-, IVtihUîâ~I.B., Makarov S.O., Litvinenko L.V., Cunningham C.J., Philp J.C. Effect of biosurfactants on crude oil desorption and mobilization in a soil system//Environment International. -2005. — V. 31.-P. 155-161.

20. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Gavrin A.Yu., Podorozhko E.A., Lozinsky V.I., Jeffree C.E., Philp J.C. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogcls hydrophobized using a biosurfactant//J. Microbiol. Methods. - 2006. - V. 65. - P. 596-603.

21. Коваленко Г.А., Перминова JI.B., Чуенко T.B., Ившина И.Б., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Филп Дж.К. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. 5. Иммобилизация нерасхуших клеток дрожжей и растущих клеток алканотрофных родококков//Биотехнология. - 2006. - № 1. - С. 76-83.

22. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Коростина О.А. Модель нефтеотмывания загрязненного почвогрунта под действием Rhodococcus-биосурфактанта//Российский журнал биомеханики. - 2006. - Т. 10. № 1. - С. 59-67.

Обзоры

23. Philp J.C., Cunningham C.J., Kuyukina M.S., Ivshina I.B. In-situ bioremediation of contaminated groundwater. In: Water Encyclopedia: Ground Water. Ed. J.H, Lehr, J. Kecley, J. Lehr, T.B. Kingcry III. Pub. John Wiley and Sons Inc., New Jersey, 2005. P. 38-42.

24. Stainsby F.M., Philp J.C., Dunbar S.A, Ivshina I.B., Kuyukina M.S. Microbial foaming and bulking in activated sludge plants. In: Water Encyclopedia: Domestic, Municipal, and Industrial Water Supply and Waste Disposal. Ed. J.H. Lehr, J. Keeley, J. Lehr, T.B. Kingery III. Pub. John Wiley and Sons Inc., New Jersey, 2005. P. 844-848.

Патенты

25. Ившина И.Б., Куюкина M.C. Способ изоляции пропанокисляющих родококков. Патент на изобретение РФ № 2106407. Приоритет изобретения 30.12.1996. Зарегистр. в Госреестре изобретений 10.03.1998.

26. Куюкина М.С., Ившина И.Б. Олеофильный биопрепарат, используемый для очистки нефтезагрязненной почвы. Патент на изобретение РФ № 2180276. Приоритет изобретения 19.02.2001. Зарегистр. в Госреестре изобретений 10.03.2002.

27. Ившина И.Б., Косгарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Патент на изобретение РФ № 2193464. Приоритет изобретения 14.11.2001. Зарегистр. в Госреестре изобретений 27.11.2002.

Труды конференций

28. Kuyukina M.S. Selective isolation of subsurface alkanotrophic Rhodococcus bacteria using antibiotics//Proc. Int. Symp. on Subsurface Microbiology. Bath. UK, 1993. P.36.

29. Ившина И.Б., Куюкина M.C., Рычкова М.И. Экологические аспекты использования алканотрофных родококков - новых продуцентов биосурфактантов/ЛЗ кн.: Экологическая безопасность зон градопромышленных агломераций Западного Урала. Пермь, 1993. - С. 29-30.

30. Куюкина М.С. Своеобразие физиологических свойств родококков, ассимилирующих газообразные и жидкие н-алканы//Труды Региональной конференции молодых ученых "Проблемы экологии и охраны окружающей среды". Екатеринбург, 1994. С. 86-87.

31. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Philp J.C., Christofi N. Production of ecologically harmless biosurfactant complexes synthesised by Rhodococcus ruberllProc. Int. Conf. on Environmental Pollution. St.-Peterburgh, Russia, 1995. P. 32.

32. Куюкина M.C., Ившина И.Б., Филп Д., Кристофи Н. Способ получения экологически чистых сурфактантов из Rhodococcus/fMinep. Междунар. конф. "Экологически чистые технологические процессы в решении проблем охраны окружающей среды". Иркутск, 1996. Т. 1. С. 51-54.

33. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Филп Д.К., Кристофи Н. Нефтеэмульгирующий экологически чистый биоэмульгатор из алканотрофных родококков//Матер. Междунар. конф. "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы". Пермь, 1996. С. 57-58.

34. Kuyukina M.S., Bell K.S., Ivshina I.B., Philp J.C., Christofi N. Use of species-specific DNA amplification for identification of Rhodococcus species and their detection in environmental samples//Abstr. Inter. Symp. on Subsurface Microbiol. Vail, Colorado, USA. 1999. http://www.asmusa.org/mtgsrc/issm'99.htm.

35. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Ritchkova M.I., Kostarev S.M., Philp J.C., Cunningham C.J., Christofi N. Bioremediation of crude oil contaminated soil using slurry-phase biological treatment and landfarming techniques//Abstr. First Int. Congress on Petroleum Contaminated Soils, Sediments and Water. London, 2001. P. 46.

36. Куюкина M.C., Ившина И.Б. Биотехнология очистки нефтезагрязненных грунтов из шламохранилищ в холодных климатических условиях//В кн.: Новые технологии для очистки нефтезагрязненных вод, почв, переработки и утилизации нефтешламов. Тез. докл. Междунар. конф. ISC-UNIDO. М.: Ноосфера, 2001. С. 154156.

37. Куюкина М.С., Юшкова Т.А., Ившина И.Б., Юшков В.В. Выделение и оценка биологической активности Дйо^ососом-биосурфакгантных комплексов//Матер. Междунар. конф. "Микробиология и биотехнология XXI столетия". Минск, 2002. С. 47-48.

38. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Cunningham C.J., Philp, J.C. Crude oil removal from contaminated soil using a novel bioemulsifier produced by Rhodococcus n/6er//Abstr,12th Int. Biodeterioration and Biodégradation Symp. Prague, 2002. P. 81.

39. Куюкина M.C., Ившина И.Б., Филп Д.К., Кашшнгхэм К.Д. Комплексная биотехнология очистки нефтезагрязненной почвы с использованием олеофилыюго биопрепарата на основе ЛАос?ососси5-сурфакганта//Матер. Межрегион, совещания "Проблемы биоремедиации в XXI веке". Красноярск, 2002. С. 27-28.

40. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Litvinenko L.V., Cunningham C.J., Philp J.C. Biosurfactant enhanced crude oil mobilization in a soil system: laboratory simulation and mathematical modelling//Proc. II European Biorcmediation Conf. Chania, Greece, 2003. P. 83-86.

41. Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Cunningham C.J., Philp J.C. In situ identification of oil-degrading rhodococci using immunofluorescent technique//Abstr. First FEMS Congress of European Microbiologists. Ljubljana, Slovenia, 2003. P. 183.

42. Куюкина M.C., Ившина И.Б., Рычкова М.И., Коваленко Г.Л., Филп Дж. К. Эффективные биокатализаторы на основе родококков, иммобилизованные на новых углеродных материалах//Матер. Междунар. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск, 2004. С. 304-306.

43. Ившина И.Б., Куюкина М.С., Костина J1.B. Изучение эмульгирующей активности коллекционных штаммов актинобактсрий//Научные труды Междунар. биотехнологического Центра МГУ. -Москва, 2004. - С. 171.

44. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Лозинский В.И., Филп Дж.К. Биоремедиация нефтезагрязненных почвогруптов с использованием иммобилизованных клеток родококков//Тез. Всеросс. симп. "Биотехнология микробов". Москва: МГУ, 2004. С. 52.

45. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Lozinsky, V.I., Philp, J.C. Laboratory-scale bioremediation of crude oil contaminated soil using immobilized Rhodococcus cells//Abstr. 10th International Symp. Microbial Ecology. Cancun, Mexico, 2004. P. 241.

46. Куюкина M.C., Ившина И.Б., Рычкова М.И., Филп Дж.К. Биосурфактанты алканотрофных родококков: ферментативное получение и коммерческий потенциал//Матер. III Междунар. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2005. Ч. 1. С. 338.

47. Куюкина М.С., Рычкова М.И., Ившина И.Б. Физико-химические и биологически-активные свойства ЛАо^ососси5-биосурфакгантов//Матер. II Междунар. конф. «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». Пермь-Казань-Пермь, 2005. С. 54-55.

48. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Коростина О.А. Прогнозная модель нефтеотмывания почвы под действием биосурфактанта//Матер. VIII Всероссийской конф. по биомеханике. - Н. Новгород, 2006. - С. 54-56.

КУЮКИНА Мария Станиславовна

БИОСУРФАКТАНТЫ АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS: ИНДУЦИРОВАННЫЙ БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ

Автореферат

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99

Подписано в печать - 26.05.2006. Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1,0 Формат 60x84/16. Набор компьютерный. Заказ № 81к/200б.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113, т. (342) 219-80-33

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Куюкина, Мария Станиславовна

Введение Обзор литературы

Глава 1. Характеристика биосурфактантов, продуцируемых 17 микроорганизмами

1.1. Физико-химические свойства и классификация микробных 17 сурфактантов. Эволюционная конвергентность признака сурфактантной активности.

1.2. Биологические свойства алканотрофных актинобактерий и 37 способность к синтезу поверхностно-активных веществ

1.2.1. Поглощение и транспорт гидрофобных соединений в клетки 38 родококков. Участие биосурфактантов.

1.2.2. Окислительная трансформация углеводородов

1.3. Метаболические пути и механизмы регуляции биосинтеза 46 сурфактантов

1.4. Методы выделения и очистки биосурфактантов

Глава 2. Промышленный потенциал микробных сурфактантов. 65 Использование биосурфактантов в технологиях биоремедиации загрязненных экосистем

Глава 3. Возможные физиологические роли и биологическая активность микробных сурфактантов

1.1. Физиологические функции биосурфактантов

1.2. Антибиотическая активность

1.3. Некоторые аспекты воздействия биосурфактантов на высшие 91 организмы

Экспериментальная часть

Глава 4. Объекты и методы исследования

4.1. Микроорганизмы, условия их выделения и культивирования

4.2. Генетический анализ с использованием полимеразной цепной реакции

4.3. Иммобилизация клеток родококков на органические и минеральные носители

4.4. Выделение поверхностно-активных веществ (биосурфактантов)

4.5. Определение поверхностной, межфазной и эмульгирующей активности

4.6. Структурный анализ биосурфактантов

4.7. Выделение и структурная идентификация гликолипидного 113 комплекса

4.8. Изучение токсичности и биодеградабельности

4.9. Определение биологической активности

4.10. Определение нефтеотмывающей активности

4.11. Фракционный анализ нефтепродуктов

4.12. Математическое моделирование процесса нефтеотмывания

4.13. Опыты по биоремедиации нефтезагрязненной почвы

4.14. Статистическая обработка результатов исследования 124 Результаты и обсуждение

Глава 5. Распространенность признака сурфактантной 125 активности среди актинобактерий рода Rhodococcus. Характеристика поверхностно-активных свойств алканотрофных родококков

5.1. Скрининг потенциальных продуцентов биосурфактантов среди 125 природных изолятов актинобактерий

5.2. Сравнительная характеристика поверхностно-активных и 129 эмульгирующих свойств представителей разных видов родококков

Глава 6. Оптимизация процессов биосинтеза и выделения 138 сурфактантов алканотрофных родококков

6.1. Изучение динамики биосинтеза сурфактантов родококками в 138 условиях роста на углеводородсодержащих средах. Поиск эффективных индукторов процесса биосинтеза

6.2. Моделирование ферментационного процесса получения 144 биосурфактантов

6.3. Иммобилизация родококков - продуцентов бисурфактантов на 150 природные и синтетические носители

6.4. Оригинальный метод выделения Rhodococcus-сурфактантов

Глава 7. Физико-химическая характеристика Rhodococcus- 162 биосурфактантов

7.1. Поверхностная и межфазная активность очищенных

ЛЛог/ососсш'-биосурфактантов

7.2. Эмульгирующая активность /гЛо^ососсш'-биосурфактантов

7.3. Гидрофильно-липофильный баланс

7.4. Качественный состав биосурфактантных комплексов

7.5. Молекулярная структура гликолипидов GL1-GL

7.6. Устойчивость ЛАо^ососсия-биосурфактантов к физико- 189 химическим воздействиям

7.7. Оценка возможности использования Rhodococcus- 192 биосурфактантов в качестве гидрофобизаторов природных и синтетических носителей

Глава 8. Биологические свойства гликолипидных Rhodococcus- 195 биосурфактантов

8.1. Токсикологическая характеристика Rhodococcus- 196 биосурфактантов

8.2. Активность Rhodococcus-^ иосурфактантов в отношении 198 микроорганизмов

8.3. Воздействие Rhodococcus-биосур^актаятов на высшие организмы

8.3.1. Иммуномодулирующая активность

8.3.2. Противовоспалительная активность

8.3.3. Аллергенность

8.3.4. Влияние на центральную нервную систему

Глава 9. Оценка возможности использования Rhodococcus- 208 биосурфактантов для биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов.

9.1. Изучение эффективности и экологической безопасности 208 применения биосурфактантов для интенсификации процессов восстановления нефтезагрязненных почв

9.2. Создание олеофильного биопрепарата на основе Rhodococcus- 223 сурфактантов

9.3. Разработка биотехнологии восстановления нефтезагрязненных 228 почв и грунтов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение"

Актуальность проблемы. В настоящее время заметно устойчивое повышение интереса к поверхностно-активным веществам биогенного происхождения (биоПАВ, биосурфактантам) как экологически безопасным и экономически эффективным поверхностно-активным агентам многоцелевого назначения с эмульгирующей, солюбилизирующей, антиадгезивной, детергентной активностью. Это обусловлено требованиями экологической безопасности, которые предусматривают постепенное выведение из промышленных производств высокотоксичных химических препаратов (Экологическая доктрина РФ, 2002; Design for the Environment, 1998), в частности, сурфактантов - как правило, продуктов нефтеоргсинтеза. Большое внимание уделяется изучению возможности получения новых соединений на основе биологического синтеза. При этом обеспечение биобезопасности в сфере биотехнологии требует всестороннего изучения как биологических агентов, так и продуктов биосинтеза (Шевелуха, 2002; Walsh et al., 2001; Renault, 2002; Parales et al., 2006).

Биосурфактанты имеют существенные преимущества перед синтетическими сурфактантами, как то: низкая токсичность, высокая биоде-градабельность, устойчивая активность в экстремальных условиях среды, улучшенные функциональные характеристики, возможность получения на возобновляемых источниках сырья (Desai, Banat, 1997; Makkar, Cameotra, 2002). Следует отметить, что среди биосурфактантов продукты микробного синтеза наиболее перспективны в плане биотехнологического применения, поскольку для культивирования продуцентов используются относительно простые по составу минеральные среды и доступные источники углерода. При этом возможность управления ферментационным процессом биосинтеза позволяет увеличивать выход продукта без значительных материальных и энергетических затрат (Елисеев, Кучер, 1991; Kosaric, 1992). Возможность in situ продуцирования биосурфактантов микроорганизмами важна для биотехнологии защиты окружающей среды, например, в процессах ремедиации почв и вод, загрязненных органическими поллютантами и тяжелыми металлами (Christofi, Ivshina, 2002). В последние годы наряду с традиционным использованием биосурфактантов в качестве эмульгаторов и солюбилизаторов гидрофобных веществ данные соединения привлекают все большее внимание как возможные агенты биомедицины, обладающие выраженной физиологической активностью (Kitamoto et al., 2002; Cameotra, Makkar, 2004: Ryll et al., 2006).

Продуценты биосурфактантов обнаруживаются среди представителей трех доменов Bacteria, Archaea, Eucarya и выделяются из различных природных источников (почв, кернов, морской и пресной воды, донных отложений). По данным R.M. Maier (2003), биосурфактанты филогенетически отдаленных микроорганизмов функционально конвергентны, что свидетельствует об их существенной роли в жизнедеятельности продуцентов. Отсутствие генетического (структурно-регуляторного) и фенотипического (по молекулярному строению) родства биосурфактантов указывает на независимое эволюционное развитие данного признака (Bodour et al., 2003). Биосурфактанты, синтезируемые бактериями разных видов в пределах одного рода, часто несхожи в структурном и функциональном отношении (Maier et al., 2000; Nielsen et al., 2002; Kuiper et al., 2004). Все это значительно затрудняет направленный поиск новых продуцентов по их таксономической принадлежности или на основании использования молекулярно-генетических методов. Несмотря на то, что сегодня расшифрованы генетические детерминанты синтеза отдельных биосурфактантов (Sullivan, 1998), пока не созданы молекулярные маркеры для их in situ детекции. В связи с этим в настоящее время безальтернативным остается функциональный подход к поиску продуцентов биосурфактантов, который предусматривает скрининг поверхностной активности выделенных чистых культур. Сегодня появляются все новые данные о микроорганизмах, обладающих сурфактантной способностью (Турковская и др., 2001; Denger et al., 1995; Deziel et al., 1996; HauBler et al., 1998; Kim et al., 2002a; Benincasa et al., 2004; Gunther et al.,

2005). Однако до сих пор не разработан методологический подход к осуществлению направленного поиска продуцентов биосурфактантов; не определены четкие критерии оценки их функциональной активности, физико-химических и биологических свойств; не решены проблемы моделирования ферментационного процесса получения биосурфактантов с заданными свойствами; недостаточно изучены особенности физиологии продуцентов и механизмы синтеза поверхностно-активных метаболитов.

Биосурфактанты характеризуются высоким структурным разнообразием - от низкомолекулярных глико- и фосфолипидов до сложных высокомолекулярных биополимеров полисахаридной, липидной и белковой природы, что обусловливает широкий спектр их функциональных особенностей (Rosenberg, Ron, 1999). В плане практического применения интенсивно изучаются (Lang, Wullbrandt, 1999; Otto et al., 1999; Spoechner et al., 1999; Maier, Soberon-Chavez, 2000; Nunez et al., 2004) гликолипидные биосурфактанты, представляющие собой комплексы на основе моно- и дисахаров, соединенных посредством сложноэфирной связи с жирными кислотами (рамнолипиды псевдомонад, маннозилэритритол- и софоролипиды дрожжей). Известно (Draper, 1998), что клетки коринеформных и нокардиоформных актинобактерий характеризуются повышенным (30-60%) содержанием липидов, преимущественно высокомолекулярных а-разветвленных Р-гидроксилированных жирных (миколовых) кислот, которые присутствуют в свободном состоянии и входят в состав гликолипидов клеточной оболочки. Детально изучены поверхностные трегалозокориномиколаты, известные как «корд-фактор» и «лизо-корд-фактор», в 1930-х г.г. в клетках Mycobacterium tuberculosis (Noll et al., 1956). Ди- и монокориномиколаты трегалозы позднее обнаружены у других патогенных микобактерий (включая так называемых «мягких» оппортунистических патогенов группы М. avium - М. intracellular), нокардий (Nocardia asteroides) и коринебактерий (Corynebacterium diphtheriae, С. matruchotii, С. xerosis) (Margaritis et al., 1979; Cooper, Zajic, 1980; Retzinger et al., 1981; Shimakata, Minatogawa, 2000; Puech et al., 2001; Fujita et al., 2005). Выявленная сурфактантная активность данных гликолипидов свидетельствует об их практической значимости, однако явная или потенциальная патогенность штаммов-продуцентов и высокая токсичность синтезируемых гликолипидов (Watanabe et al., 1992; Sakaguchi et al., 2000) ограничивают их применение. В этой связи актуален поиск продуцентов гликолипидных сурфактантов среди представителей непатогенных актинобактерий.

Перспективным объектом при скрининге новых продуцентов биосурфактантов являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие уникальными биологическими свойствами и широкими катаболическими способностями (Ившина и др., 1987; Ившина, 1997; Van der Geize et al., 2004). Известно (Коронелли и др., 1993; Пирог и др., 2004; Goclik et al., 1990; Lang, Philp, 1998; Rapp, Gabriel-Jurgens, 2003), что отдельные представители родококков при росте на жидких углеводородах продуцируют сурфактанты гликолипидной природы. Однако подавляющее большинство работ в этом направлении посвящено изучению представителей одного вида родококков - R. erythropolis. С использованием генофонда Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ; www.iegm.ru/iegmcol), включающего наиболее полное собрание актинобактерий известных видов Rhodococcus, выделенных из разнообразных природных субстратов контрастных эколого-географических зон (Каталог штаммов, 1994; Ivshina, 2001), представлялось возможным провести сравнительное исследование проявления сурфактантной активности в пределах данного рода, изучить зависимость выраженности данного признака от местообитания родококков, отобрать активные штаммы-продуценты биосурфактантов.

Цель настоящей работы - изучение особенностей процесса синтеза биосурфактантов актинобактериями рода Rhodococcus, поиск новых продуцентов биосурфактантов с широким спектром функциональной активности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

2. Разработать оптимальные условия биосинтеза и эффективные способы выделения и очистки биосурфактантов.

3. Изучить структурные и функциональные особенности Rhodococcus-биосурфактантов.

4. Исследовать токсичность и биологическую активность полученных биосурфактантов.

5. Оценить возможность использования Rhodococcus-биосурфактантов для биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов.

Научная новизна работы. Проведены комплексные исследования процесса биосинтеза сурфактантов актинобактериями рода Rhodococcus. Установлено, что синтез биосурфактантов клетками родококков индуцируется в присутствии углеводородного субстрата. Выявлена прямая зависимость сурфактантной активности родококков от длины углеродной цепи и степени гидрофобности углеводородов в ряду Сю—*►С]б- Разработан научно-методологический подход к оптимизации процесса биосинтеза сурфактантов, основанный на использовании избыточной по фосфору и лимитированной по азоту минеральной среды с w-гексадеканом либо н-додеканом в качестве источника углерода и пониженной (24°С) температуры культивирования продуцентов. Обоснована возможность интенсификации процесса биосинтеза сурфактантов с использованием клеток родококков, иммобилизованных на природных и синтетических носителях. Предложен оригинальный метод выделения биосурфактантов, предусматривающий использование метил-трет-бутилового эфира и ультразвуковой обработки (23 кГц, 10 мин) экстрагируемого материала.

Впервые показано, что представители R. ruber синтезируют биосурфактанты гликолипидной природы, в составе которых наряду с трегалозодимиколатом (С40), обнаруживаются диацилтрегалоза (С 15.17) и моноацилтрегалоза (С]2-1б)- Доминирующим компонентом гликолипидного комплекса является моноацилтрегалоза, содержащая смесь насыщенных и моноеновых ацильных остатков и характеризующаяся более выраженной полярностью по сравнению с таковой трегалозомономиколатов, выделенных ранее из коринебактерий, микобактерий и представителей R. erythropolis. В результате детального изучения термодинамических параметров гликолипидных комплексов из клеток R. ruber получены новые данные о выраженной гидрофобной природе /?/го</ососсмя-биосурфактантов, их высокой адсорбционной и эмульгирующей активности, компактности пространственной структуры сурфактантных молекул в сорбционном слое и монодисперсности образуемых ими мицелл. Данные характеристики сопоставимы с таковыми известных синтетических сурфактантов гликолипидной природы. При изучении биологически активных свойств Rhodococcus-биосурфактантов выявлено их лио-, термо- и ксеропротекторное действие в отношении бактериальных клеток. Установлено, что Rhodococcus-биосурфактанты обладают выраженной иммуномодулирующей и противовоспалительной активностью.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о физиологической роли биосурфактантов и механизмах процесса их биосинтеза актинобактериями рода Rhodococcus. Разработан научно-методологический подход к осуществлению направленного поиска продуцентов биосурфактантов и получения поверхностно-активных соединений с широким спектром функциональной активности. Установлена экологическая приуроченность родококков с высокой сурфактантной активностью к нефтезагрязненным местообитаниям, обоснована целесообразность проведения направленного поиска продуцентов биосурфактантов в местах углеводородных скоплений.

Отобраны штаммы родококков - активные продуценты, оптимизированы условия их культивирования, обеспечивающие высокий выход биосурфактантов. Обоснована целесообразность использования Rhodococcus-биосурфактанта в качестве лиопротектора при долговременном хранении культур актинобактерий. По данным исследования влияния Rhodococcus-биосурфактантов на процессы десорбции и мобилизации нефтепродуктов в модельной почве разработана математическая модель фильтрации гидрофобных веществ в пористой среде под воздействием сурфактантов. На основе Rhodococcus-б иосурфактантов разработан, апробирован и запатентован (Патент РФ № 2180276) эффективный биопрепарат нового состава и новой (олеофильной) формы, пригодный для очистки нефтезагрязненных грунтов в регионах с холодными климатическими условиями, а также способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (Патент РФ № 2193464), прошедший апробацию на территории Пермского края и Удмуртской Республики. Разработан Регламент применения технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов с использованием олеофильного биопрепарата, согласованный с ФГУ «Центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Пермской области» и главным управлением природных ресурсов и охраны окружающей среды МПР России по Пермскому краю. Результаты диссертационной работы используются в лекционных и практических курсах для магистрантов Пермского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Актинобактерии рода Rhodococcus синтезируют биосурфактанты гликолипидной природы при росте на жидких углеводородах. Биосурфактанты, продуцируемые представителями R. ruber, содержат трегалозодимиколат, диацилтрегалозу и моноацилтрегалозу доминирующий компонент, характеризующийся более выраженной полярностью по сравнению с таковой трегалозомономиколатов, выделенных из коринебактерий, микобактерий и представителей R. erythropolis.

2. Биосурфактанты, синтезируемые клетками R. ruber, обладают выраженными поверхностными и межфазными свойствами, эмульгирующей и нефтеотмывающей способностью, низкой токсичностью и высокой биологической активностью.

3. Применение Rhodococcus-биосурфжтатов способствует повышению биодоступности нефтяных углеводородов для почвенных микроорганизмов вследствие их десорбции и мобилизации в почвенной среде и обеспечивает эффективное восстановление нефтезагрязненных почв и грунтов.

Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 1993-2006 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01980 004406), а также в рамках ГНТП РФ «Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии»; ГНТП РФ «Биотехнология защиты окружающей среды»; Региональной комплексной научно-технической программы «УРАЛ»; инициативных совместных научных проектов с Напиер университетом (Эдинбург, Великобритания) при поддержке Королевского научного общества Великобритании (The Royal Society, UK) и Международной программы НАТО (NATO Science Programme and Cooperation Partners); Государственного контракта на выполнение НИР по заказу Минпромнауки РФ в рамках приоритетного направления научно-технического прогресса «Новые направления биотехнологии и обеспечение биобезопасности»; совместного проекта с Исследовательским центром оценки и ремедиации загрязненных земель (Contaminated Land Assessment and Remediation Research Centre - CLARRC), Эдинбургский университет, Великобритания, поддерживаемого Научной программой компании "Ford Motors" в области защиты окружающей среды (Conservation and Environmental Grants); Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»; Целевой программы Президиума УрО РАН поддержки междисциплинарных проектов, выполняемых в содружестве с учеными СО

РАН; международного научного проекта, поддерживаемого грантом ИНТАС 01-2151; проекта РФФИ № 04-04-97518-рофи.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на II-IV Международных конференциях «Проблемы загрязнения окружающей среды», Москва-Пермь, 1993; Санкт-Петербург, 1995; Москва, 1998; Волгоград-Пермь, 2001; Пермь-Казань, 2005; II и IV Международных симпозиумах по микробиологии подземных экосистем, Бат, 1993; Ваил, 1999; Международной конференции памяти акад. А.А. Баева, Москва, 1996; Международной конференции «Экологически чистые технологические процессы в решении проблем охраны окружающей среды», Иркутск, 1996; I и II Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы», Пермь, 1996; Пермь-Казань, 2005; Международной конференции «Загрязненные земли и грунтовые воды - новые направления», Портсмут, 1996; Международном конгрессе по нефтяному загрязнению почвы, Лондон, 2001; Международной конференции ISC-UNIDO «Новые технологии для очистки нефтезагрязненных вод, почв, переработки и утилизации нефтешламов», Москва, 2001; Международной конференции «Микробиология и биотехнология XXI столетия», Минск, 2002; XII Международном симпозиуме по биоповреждениям и биодеградации, Прага, 2002; Межрегиональном совещании «Проблемы биоремедиации в XXI веке», Красноярск, 2002; Конгрессе Европейских микробиологов FEMS, Любляна, 2003; Мадрид, 2006; II Европейской конференции по биоремедиации, Ханья, 2003; Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2004; Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов», Москва, 2004; X Международном симпозиуме по микробной экологии, Канкун, 2004; III Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; VIII Всероссийской конференции по биомеханике, Н. Новгород, 2006.

Объем и структура работы. Работа изложена на 295 страницах, содержит 37 таблиц, 42 рисунка и состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 478 наименований, в том числе 64 на русском и 414 на английском языках.

Место проведения работы. Работа является частью исследований, выполняемых в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (зав. лабораторией - чл.-корр. РАН, д.б.н., профессор И.Б. Ившина) по изучению, сохранению и использованию биоразнообразия углеводород-окисляющих актинобактерий природных биоценозов. Фрагменты работы, связанные с практическим использованием полученных биосурфактантов в коллекционном деле и биотехнологии защиты окружающей среды, выполнены при участии сотрудников лаборатории, к.б.н., с.н.с. Т.Н. Каменских, к.х.н., с.н.с. В.В. Гришко, вед. технолога М.И. Рычковой и магистрантов кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета JI.B. Костиной, А.В. Криворучко, А.Ю. Гаврина. Изучение процесса биосинтеза сурфактантов в условиях хемостата, а также токсикологические исследования проведены соискателем на базе Напиер университета (Эдинбург, Великобритания) при участии профессора N. Christofi, д-ра J.C. Philp и S.A. Dunbar. Исследования по биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов выполнены в сотрудничестве с лабораторией охраны окружающей среды ООО «ПермНИПИнефть» (зав. лабораторией - к.г.-м.н. С.М. Костарев), Удмуртским государственным научно-исследовательским институтом сельского хозяйства (зам. директора по научной работе - к.с.-х.н. А.В. Леднев) и Исследовательским центром оценки и ремедиации загрязненных земель (CLARRC) при Эдинбургском университете, Великобритания директор - д-р C.J. Cunningham). Определение молекулярной структуры гликолипидного компонента биосурфактанта с помощью ЯМР-спектро-скопии и ионной масс-спектрометрии высокого разрешения проведено на базе Германского исследовательского центра биотехнологии (Брауншвейг) под руководством профессора S. Lang и д-ра V. Wray. Изучение экотоксично-сти биосурфактантов выполнено совместно с сотрудниками лаборатории водной токсикологии НИИ биологии Иркутского государственного университета (зав. лабораторией - д.б.н., профессор Д.И. Стом). Проверка биологической и иммуномодулирующей активности биосурфактантных препаратов проведена на кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии и иммунологии Пермской государственной фармацевтической академии (зав. кафедрой, д.м.н., профессор В.В. Юшков). При разработке модели фильтрации нефти в почве под действием биосурфактантов использовано программное обеспечение, предоставленное кафедрой теоретической механики Пермского государственного технического университета (зав. кафедрой - д.т.н., профессор Ю.И. Няшин). Хромато-масс-спектро-метрическое определение структуры нефтяного загрязнения в процессе биоремедиации почвы выполнено на базе аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН (зав. лабораторией - к.г.-м.н. М.А. Шишкин). Эксперименты по использованию биосурфактантов в качестве гидрофобизаторов при разработке носителей для иммобилизации клеток углеводородокисляющих бактерий проведены совместно с сотрудниками лаборатории криохимии (биополимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва (зав. лабораторией - д.х.н., профессор В.И. Лозинский).

Автор выражает искреннюю благодарность всем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях. Глубокую благодарность и признательность автор выражает своему Учителю чл.-корр. РАН, профессору Ирине Борисовне Ившиной, инициатору исследований биологии алканотрофных родококков, частью которых является настоящая работа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Куюкина, Мария Станиславовна

242 ВЫВОДЫ

2. Подобраны оптимальные условия синтеза биосурфактантов, предусматривающие использование избыточной по фосфору и лимитированной по азоту минеральной среды с я-гексадеканом либо н-додеканом, пониженной (24°С) температуры культивирования, а также иммобилизацию клеток родококков на природных (гидрофобизованный древесный опил) и синтетических (криогель поливинилового спирта) носителях. Разработан эффективный способ выделения Rhodococcus-биосурфактантов, предусматривающий использование метип-трет-бутилового эфира в качестве экстрагента и ультразвуковую обработку экстрагируемого материала.

3. Выявлено, что представители R. ruber синтезируют гликолипидный комплекс, содержащий трегалозодимиколат (С40), диацилтрегалозу (С13.15) и моноацилтрегалозу (Сю-м) - доминирующий компонент, характеризующийся более выраженной полярностью по сравнению с таковой трегалозомономиколатов, выделенных из коринебактерий, микобактерий и представителей R. erythropolis.

4. Показано, что биосурфактанты, синтезируемые представителями R. ruber, характеризуются низкой токсичностью, выраженными поверхностными и межфазными свойствами, эмульгирующей и нефтеотмывающей способностью, а также высокой биологической (ксеро-, термопротекторной, иммуномодулнрующей, противовоспалительной) активностью.

5. На основе полученных Л/гог/ососсмя-биосурфактантов разработана экологически безопасная технология биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов, пригодная для использования в условиях умеренного и холодного климата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что характерной особенностью актинобактерий рода Rhodococcus, растущих в присутствии жидких углеводородов, является сурфактантная активность, то есть способность снижать поверхностное натяжение среды культивирования до значений < 30 мН/м. Данная активность родококков обусловлена синтезом биосурфактантов гликолипидной природы, содержащих трегалозу в качестве гидрофильной части молекулы и варьирующих по структуре видоспеци-фических жирноацильных компонентов. Исследование поверхностно-активных свойств большого массива представителей известных видов Rhodococcus, выделенных из разнообразных природных и техногенных источников и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ, выявило отсутствие у родококков видовой и наличие экологически обусловленной специфичности в проявлении сурфактантной активности. Показано, что районы природных и антропогенных углеводородных скоплений могут служить источником новых штаммов актинобактерий - активных продуцентов биосурфактантов.

Установление рост-зависимой динамики синтеза биосурфактантов клетками родококков, а также стимулирующего влияния на данный процесс избыточного содержания фосфатов в среде, азотного лимитирования, снижения температуры культивирования и иммобилизации клеток на органические носители позволило оптимизировать условия культивирования штаммов-продуцентов с целью повышения выхода биосурфактантов. Эффективное выделение клеточно-связанных биосурфактантов обеспечило использование метил-трет-бутилового эфира в качестве экстрагента и ультразвуковой обработки экстрагируемого материала. В процессе детального изучения выделенных Д/шг/ососсия-биосурфактантов получены новые данные о термодинамических свойствах, определяющих их функциональные характеристики (поверхностную, межфазную, эмульгирующую, гидрофобизующую активность) и возможные области применения.

Полученные нами и другими исследователями сведения о многообразии физиологических функций биосурфактантов - от участия в процессе потребления жидких углеводородов до формирования устойчивости бактериальных клеток к неблагоприятным воздействиям окружающей среды - свидетельствуют об их существенной роли в жизнедеятельности микроорганизмов-продуцентов. Следует отметить, что выявленные биологически активные свойства /г/го^/ососсия-биосурфактантов, в частности термо- и ксеропротекторное действие, требуют дальнейшего углубленного исследования. Необходимы новые подходы для расшифровки механизмов физиологической активности биосурфактантов, базирующиеся на молекулярно-генетических технологиях. Эти фундаментальные исследования станут возможными только после создания генетически маркированных мутантных штаммов родококков, не способных к синтезу биосурфактантов, сравнение которых с родительским фенотипом поможет пролить свет на участие поверхностно-активных метаболитов в физиологических процессах и экологическом поведении бактерий-продуцентов. В дальнейшей разработке нуждается выявленный факт, что /?/гой?ососс«5-биосурфактанты обладают иммуномодулирующей и противовоспалительной активностью.

Основными итогами проведенных исследований являются доказательство многообразия проявления сурфактантной активности у актинобактерий рода Rhodococcus и создание практически-ориентированного подхода к получению на основе непатогенных штаммов бактерий эффективных биосурфактантов с широким спектром функциональных возможностей. Обозначены перспективные области возможного применения Rhodococcus-биосур^жтттов в качестве биопротекторов и биостимуляторов, эмульгирующих и гидрофобизующих агентов при создании перспективных биотехнологий, а также нефтеотмывающих препаратов, пригодных для биоремедиации окружающей среды [17, 20, 23, 27,37].

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Куюкина, Мария Станиславовна, Пермь

1. Абрамзон А. А. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение / А. А. Абрамзон, Л. П. Зайченко, С. И. Файнгольд. Л.: Химия, 1988. - 200 с.

2. Аристархова В. И. Нокардиоподобные микроорганизмы / В. И. Аристархова. М.: Наука, 1989. - 248 с.

3. Балаян А. Э. Способ биотестирования нефтепродуктов / А. Э Балаян, Д И. Стом, М. Н. Саксонов // Патент на изобретение РФ № 2152612. Зарегистр. в Госреестре изобретений 10.07.2000.

4. Батраков С. Г. Липиды микобактерий. III. Мономиколат трегалозы из Mycobacterium paraffinicum / С. Г. Батраков, О.А. Мухитдинова, Т. В. Коронелли, Л. Д. Бергельсон // Биоорган, химия. 1979. - Т. 5. № 1.-С. 83-91.

5. Боголюбов А. Н. Задачи по математической физике / А. Н. Боголюбов, В. В. Кравцов . М.: Изд-во МГУ, 1998.

6. Веслополова Е. М. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов / Е. М. Веслополова //Микробиология. 1995. Т. 64. № 2. - С. 279-284.

7. Ю.Волков В. Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию и высушиванию / В. Я. Волков // Микробиология. 1994. - Т. 63. № 1.-С. 5-16.

8. И.Голубев В. И. Pseudozyma fusiformata ВКМ Y-2821 продуцент антифунгального гликолипида / В. И. Голубев, Т. В. Кулаковская, Е. В. Голубева // Микробиология. - 2001. - Т. 70. № 5. С. 642646.

9. Гринберг Т. А. Биополимеры, используемые для увеличения нефтеотдачи пластов / Т. А. Гринберг, Т. П. Пирог, А. М. Полищук, Н. В. Краснопевцева // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52. №2.-С. 100-112.

10. Дымшиц В. А. Двухфазное культивирование Streptomyces levoris. Выбор органической фазы и ее влияние на жизнедеятельность культуры / В. А. Дымшиц, В. Г. Гильманова, В. JI. Древецкая, И. М. Печерский //Биотехнология. 1994. - № 5. - С. 20-22.

11. Егоров Н. С. Биосинтез биологически активных веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов / Н. С. Егоров, Н. С. Ландау, Е. А. Борман, И. Б. Котова //Прикл. биохим. микробиол. 1984. - Т. 20. Вып. 5. - С. 579-592.

12. Елисеев С. А. Нефтеотмывающий биоэмульгатор, образуемый Bacillus species! С. А. Елисеев, Р. И. Вильданова-Марцишин, А. Н. Шульга, 3. В. Шабо, А. А. Туровский // Микробиол. журн. 1991. -Т. 53, № 6. - С.61-66.

13. Елисеев С. А. Поверхностно-активные вещества и биотехнология / С. А. Елисеев, Р. В. Кучер. Киев: Наук, думка, 1991. - 116 с.

14. Ившина И. Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие)/Дис. .докт. биол. наук. / И. Б. Ившина. Пермь, 1997. - 197 с.

15. Ившина И. Б. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И. Б. Ившина, М. В. Бердичевская, Л. В. Зверева, J1. В. Рыбалка, Е. А. Еловикова //Микробиология. 1995. - Т. 64. № 4. - С. 507-513.

16. Ившина И. Б. Селективное выделение пропанокисляющих родококков с использованием антибиотических веществ / И. Б. Ившина, М. С. Куюкина //Микробиология. 1997. - Т. 66. № 4. -С. 494-500.

17. Ившина И. Б. Бактерии рода Rhodococcus грунтовых вод района нефтяных месторождений Пермского Предуралья / И. Б. Ившина, А. А. Оборин, О. А. Нестеренко, С. А. Касумова //Микробиология.- 1981.-Т. 50. Вып. 4.-С. 709-717.

18. Ившина И. Б. Пропанокисляющие родококки / И. Б. Ившина, Р. А. Пшеничнов, А. А. Оборин Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987.- 125 с.

19. Каплин В. Н. Нетрадиционная иммунология инфекций / В. Н. Каплин Пермь: Изд-во Пермской гос. мед. академии, 1996. - 163 с.

20. Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994.- 163 с.

21. Квасников Е. И. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах / Е. И. Квасников, Т. М. Клюшникова - Киев: Наук, думка, 1981.-131 с.

22. Кислухина О. В. Определение способности микроорганизмов диспергировать нефтепродукты / О. В. Кислухина, О. Ж. Хамроев, Г. Н. Морщакова, М. Б. Биттеева // Экология. 1993. - № 3. -С. 81-84.

23. Козляк Е. И. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции (обзор) / Е. И. Козляк, М. М. Якимов, И. Б. Уткин, И. С. Рогожин, 3. Г. Соломон, А. М. Безбородое //Прикл. биохим. микробиол. 1991. - Т. 27. Вып. 6. - С. 788-803.

24. Коллинз Р. Течения жидкостей через пористые материалы / Р. Коллинз. М.: Мир, 1964.

25. Кондрашенко В. М. Препарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / В. М. Кондратенко, В. П. Холоденко, И. А. Дунайцев, 3. М. Ермоленко, В. А. Чугунов, И. И. Мартовецкая, Р. И. Миронова, Н. А. Жиркова // Патент РФ № 2191753 от 27.10.2002.

26. Коронелли Т. В. Проникновение углеводородов в клетки микроорганизмов / Т. В. Коронелли // Успехи микробиол. 1980.- № 15.-С. 99-111.

27. Коронелли Т. В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов / Т. В. Коронелли. М.: МГУ, 1984. - 158 с.

28. Коронелли Т. В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде / Т. В. Коронелли // Прикл. биохим. микробиол. 1996. - Т. 32. № 6. -С. 579-585.

29. Коронелли Т. В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон / Т. В. Коронелли, С. Г. Дермичева, В. В. Ильинский, Т. И. Комарова, О. В. Поршнева // Микробиология. 1994. - Т. 63, вып. 5. - С. 917922.

30. Коронели Т. В. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью / Т. В. Коронели, Т. И. Комарова, В. В. Ильинский, Ю. И. Кузьмин, Н. Б. Кирсанов, А. С. Яненко // Прикл. биохим. микробиол. 1997. - Т. 33, № 2. - С. 198201.

31. Коронелли Т. В. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий / Т. В. Коронелли, Т. И. Комарова, С. Г. Юферова, В. В. Ильинский, О. Б. Чивкунова, Б. В. Розынов // Микробиология. -1993. Т. 62, Вып. 2. - С. 231-236.

32. Коронелли Т. В. Поверхностно-активные свойства некоторых штаммов углеводородокисляющих бактерий / Т. В. Коронелли, С. Г. Юферова // Вестн. Моск. ун-та. Серия 16. Биология. 1990. № 1.- С.14-18.

33. Кошелев А. В. Ускоренный тест прогнозирования выживаемости лиофилизированных культур метанотрофных бактерий / А. В. Кошелев, А. И. Нестеров // Микробиология. 1987. - Т. 56. Вып. З.-С. 492-496.

34. Куюкина М. С. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков/ М. С. Куюкина, И. Б. Ившина, М. И. Рычкова, О. Б. Чумаков / Микробиология. 2000. - Т. 69. № 1. - С. 62-69.

35. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. М.: Высш. шк., 1990. - 352с.

36. Ланге К. Поверхностно-активные вещества: синтез, свойства, анализ, применение / К. Ланге. М.: Высш. школа, 2004. - 240 с.

37. Ландау Л. Д. Гидродинамика / Л. Д. Ландау, Е. М. Лифшиц. М.: Наука, 1988.

38. Лесин В. В. Основы методов оптимизации / В. В. Лесин, Ю. П. Лисовец. М.: Изд-во МАИ, 1995.-341 с.

39. Линник Ю. В. Метод наименьших квадратов и основы математико-статистической теории обработки наблюдений / Ю. В. Линник. М.: Физматгиз, 1962.

40. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. М.: МЗ СССР, Фарм. комитет, 1988. -37 с.

41. Методические рекомендации по оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств. М.: МЗ СССР, Фарм. комитет, 1999. 39 с.

42. Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118-0290. М., 1991.-48 с.

43. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983. - Т.1, 2.

44. Назина Т. Н. Образование нефтевытесняющих соединений микроорганизмами из нефтяного месторождения Дацин (КНР) / Т. Н. Назина, Д. Ш. Соколова, А. А. Григорьян, Я.-Ф. Сюэ, С. С. Беляев, М. В. Иванов // Микробиология. 2003. - Т. 72. № 2. - С. 206-211.

45. Нестеренко О. А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О. А. Нестеренко, Е. И. Квасников, Т. М. Ногина. Киев: Наук, думка, 1985. - 336 с.

46. Нестеренко О. А. Ассимиляция углеводородов микроорганизмами рода Nocardia и группы «rhodochrous» / О. А.Нестеренко, С. А. Касумова, Е. И. Квасников // Микробиол. журн. 1979. - Т. 41. № 2.-С. 110-114.

47. Позмогова И. Н. Возможные пути окисления жидких н-алканов микроорганизмами / И. Н. Позмогова //Успехи микробиол. 1968. -Вып. 5. - С. 62-89.

48. Полубаринова-Кочина Т. П. Теория движения грунтовых вод / Т.П. Полубаринова-Кочина. М.: Высшая шк. - 1977.

49. Синицын А. П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А. П. Синицын, Е. И. Райнина, В. И. Лозинский, С. Д. Спасов. М.: Изд-во МГУ, 1994. 288 с.

50. Скрябин Г. К. Использование микроорганизмов в органическом синтезе / Г. К. Скрябин, Л. А. Головлева. М.: Наука, 1976. - 336 с.

51. Стабникова Е. В. Применение биопрепарата "Лестан" для очистки почвы от углеводородов нефти / Е. В. Стабникова, М. В. Селезнева, А. Н. Дульгеров, В. Н. Иванов // Прикл. биохим. микробиол. 1996. - Т. 32. № 2. - С. 219-223.

52. Старостина Н. Г. О прогнозировании устойчивости микроорганизмов к процессу иммобилизации в полиакриламидном геле / Н. Г. Старостина, К. А. Луста, Б. А. Фихте // Прикл. биохим. микробиол. 1983. - Т. 19. № 3. - С. 369-371.

53. Тихонов А. Н. Уравнения математической физики / А. Н. Тихонов, А. А. Самарский. М.: Изд-во МГУ, 1999

54. Томашевський В. Ф. Изучение гидрофильно-липофильного баланса ряда поверхностно-активных веществ / В. Ф. Томашевський, М. X. Глузман, С. С. Ляшенко, Р. Г. Заславська // Фармацевтичний журнал. -1971. Т. 26. № 6. - С. 33-37.

55. Турковская О. В. Штамм Pseudomonas aeruginosa продуцент биоПАВ / О. В. Турковская, Т. В. Дмитриева, А. Ю. Муратова // Прикл. биохим. микробиол. -2001. - Т. 37. № 1. - С. 80-85.

56. Шевелуха В. С. Биотехнология и биобезопасность/ В. С. Шевелуха // Сельскохозяйственная биология. 2002. - № 3. - С. 3-15.

57. Экологическая доктрина Российской федерации. 2002.

58. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов. (Методические рекомендации одобрены ФГК МЗ России в 1998 г.) // Ведомости фармакологического комитета. 1999. - № 1. - С. 31-36.

59. Abbanat D.R. Sulphonolipids are molecular determinants of gliding motility / D. R. Abbanat, E. R. Leadbetter, W. Godchaux III, A. Escher // Nature. 1986. - V. 24. - P. 367-369.

60. Adamczak M. Influence of medium composition and aeration on the synthesis of biosurfactants produced by Candida antarctica / M. Adamczak, W. Bednarski // Biotechnol. Lett. 2000. - V. 22. - P. 313316.

61. Adeyeye С. M. Effect of non-ionic surfactant concentration and type on the formation and stability of W/O/W multiple emulsions: Microscopic and conductometric evaluations/ С. M. Adeyeye, J. C. Price // Drug Dev. Ind. Pharm. 1991. - V. 17. - P. 725-736.

62. Aislabie J.M. Hydrocarbon spills on Antarctic soils: effects and management / J. M. Aislabie, M. R. Balks, J. M. Foght, E. J. Waterhouse // Env. Sci. Technol. 2004. - V. 38. - P. 1265-1274.

63. Alon R. N. Esterase from the oil-degrading Acinetobacter Iwoffii RAG-1: sequence analysis and over-expression in Escherichia coli / R. N. Alon, D. L. Gutnick // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 112. - P. 275-280.

64. Alvarez H. M. Identification of phenyldecanoic acid as a constituent of triacylglycerols and wax ester produced by Rhodococcus opacus PD630

65. Н. М. Alvarez, Н. Luftmann, R. A. Silva, А. С. Cesari, A. Viale, М. Waltermann, A. Steinbuchel // Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 1407-1412.

66. Arino S. Production of new extracellular glycolipids by a strain of Cellulomonas cellulans (Oerskovia xanthineolytica) and their structural characterization / S. Arino, R. Marchal, J.-P. Vandecasteele // Can. J. Microbiol. 1998. - V. 44. - P. 238-243.

67. Arino S. Identification and production of a rhamnolipid biosurfactant by a Pseudomonas species / S. Arino, R. Marchal, J.-P. Vandecasteele // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 45. - P. 162-168.

68. Askolin S. Overproduction, purification, and characterization of the Trichoderma reesei hydrophobin HFBI / S. Askolin, T. Nakari-Setala, M. Tenkanen // Appl. Microbiol.Biotechnol. 2001. - V. 57. - P. 124130.

69. Atlas R. M. Response of microbial populations to environmental disturbance / R. M. Atlas, H. A. Horowitz, M. Krichevsky, A. K. Bej // Microb. Ecol. -1991. V. 22. - P. 249-256.

70. Auger R. L. Effect of nonionic surfactant on bacterial metabolism of naphthalene: assessment of toxicity and overflow metabolism potential / R. L. Auger, A. M. Jacobson, M. M. Domach // J. Hazard. Mater. -1995.-V. 43.-P. 263-272.

71. Azad A. K. Gene knockout reveals a novel gene cluster for the synthesis of a class of cell wall lipids unique to pathogenic mycobacteria / A. K. Azad, T. D. Sirakova, N. D. Fernandes, P. E. Kolattukudy// J. Biol. Chem. 1997.-V. 272.-P. 16741-16745.

72. Azuma I. Development of immunoadjuvants or immunotherapy of cancer /1. Azuma, T. Seya // Int. Immunopharmacol. 2001. - V. 1. -P. 1249-1259.

73. Bacterial Nomenclature Up-to-Date http://www.dsmz.de/-microorganisms.

74. Bai G. Influence of rhamnolipid biosurfactant on the transport of bacteria through a sandy soil / G. Bai, M. L. Brusseau, R. M. Miller // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 1866-1873.

75. Balks M. R. Effects of hydrocarbon spills on the temperature and moisture regimes of cryosols on the Ross Sea region / M. R. Balks, R. F. Paetzold, J. M. Kimble, J. Aislabie, I. В Campbell. // Antarctic Sci. -2002.-V. 14.-P. 319-326.

76. Banat I. M. Biosurfactant production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review /1. M. Banat // Bores. Technol. 1995. - V. 51. - P. 1 -12.

77. Banat I. M. Potential commercial application of microbial surfactants / I. M. Banat, R. S. Makkar, S. S. Cameotra // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 53. - P. 495-508.

78. Banat I. M. Biosurfactant production and use in oil tank clean-up /1. M. Banat, N. Samarah, M. Murad, R. Home, S Benerjee // World J. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V. 7. - P. 80-84.

79. Barkay T. Enhanced solubilization and biodegradation of polyaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier alasan / T. Barkay, S. Navon-Venezia, E. Ron, E. Rosenberg // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -V. 65.-P. 2697-2702.

80. Bartha R. Biotechnology of petroleum pollutant biodegradation / R. Bartha // Microb. Ecol. 1986. - V. 12. - P. 155-172.

81. Beal R. Role of rhamnolipid biosurfactants in the uptake and mineralization of hexadecane in Pseudomonas aeruginosa / R .Beal, W. B. Betts //J. Appl. Microbiol. 2000. - V. 89. - P. 158-168.

82. Beebe J. L. Extracellular lipid of Thiobacillus thiooxidans / J. L. Beebe, W. W. Umbreit. //J. Bacterid. 1971. - V. 108. - P. 612-614.

83. Bekierkunst A. Supression of urethan-induced lung adenomas in mice treated with trehalose-6,6-dimycolate (cord factor) and living bacillus

84. Calmette Guerin / A. Bekierkunst, I. S. Levij, E Yarkoni // Science. -1971.-V. 174.-P. 1240-1242.

85. Beney L. Influence of the fluidity of the membrane on the response of microorganisms to environmental stresses / L Beney., P Gervais. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 57. - P. 34-42.

86. Bernhard W., Haslam P. L., Floros J. From birds to humans. New concepts on airways relative to alveolar surfactant // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2004. - V. 30. - P. 6-11.

87. Beven L. Effect of natural amphipathic peptides on viability, membrane potential, cell shape and motility of mollicutes / L. Beven., H. Wroblewski//Res. Microbiol. 1997.- V. 148.-P. 163-175.

88. Beveridge T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles / T. J. Beveridge // J. Bacteriol. 1999. - V. 181.-P. 4725-4733.

89. Billingsley K. A. Remediation of PCBs in soil by surfactant washing and biodegradation in the wash by Pseudomonas sp. LB400 / K. A. Billingsley, S. M. Backus, S. Wilson, A. Singh, O. P. Ward // Biotechnol. Lett. 2002. - V. 24. - P. 1827-1832.

90. Bisht K. J. Enzyme-mediated regioselective acylations of sophorolipids / K. J. Bisht, R. Gross, D. Kaplan // Org. Chem. 1999. -V. 64.-P. 780-789.

91. Bisht K. S. Glycolipids from Candida bombicola: polymerization of 6-o-acryl sophorolipid deriva tive / K. S. Bisht, W. Gao, R. A. Gross // Macromolecules. 2000. - V. 33. - P. 6208-6210.

92. Bodour A. A. Distribution of biosurfactant-producing bacteria in undisturbed and contaminated arid southwestern soils / A. A. Bodour K. P. Drees, R. M. Maier // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. -P. 3280-3287.

93. Bouchez-Naitali M. Diversity of bacterial strains degrading hexadecane in relation to the mode of substrate uptake / M. Bouchez-Naitali, H. Rakatozafy, R. Marchal, J. Y. Leveau, J. P.Vandecasteele // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 86. - P. 421-428.

94. H.Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248254.

95. Bredholt H. Emulsification of crude oil by an alkane-oxidizing Rhodococcus species isolated from seawate / H. Bredholt, K. Josefsen,

96. A. Vataland, P. Bruheim, К. R. Eimhjellen // Can. J. Microbiol. 1998. - V. 44. - P. 330-340.

97. Bruheim P. Effects of surfactant mixtures, including Corexit 9527, on bacterial oxidation of acetate and alkanes in crude oil / P. Bruheim, H. Bredholt, K. Eimhjellen // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. -P. 1658-1661.

98. Bryant R. D. The role of Thiobacillus albertis glycocalyx in the adhesion of cells to elemental sulfur / R. D. Bryant, J. W. Costerton, E. J. Laishley // Can. J. Microbiol. -1984. V. 30. - P. 81-90.

99. Bury S. J. Effect of micellar solubilization on biodegradation rate of hydrocarbons/ S. J. Bury, C. A. Miller// Environ. Sci. Technol. 1993. -V. 27.-P. 104-110.

100. Caiazza N. C. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa / N. C. Caiazza, R. M. Q. Shanks, G. A. O'Toole // J. Bacterid. 2005. - V. 187. - P. 7351 -7361.

101. Cameotra S. S. Recent applications of biosurfactants as biological and immunological molecules / S. S. Cameotra, R. S. Makkar // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - V. 7. - P. 262-266.

102. Carrillo C. Molecular mechanism of membrane permeabilization by the peptide antibiotic surfactin / C. Carrillo, J. A. Teruel, F. J. Aranda, A. Ortiz // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - V. 1611. - P. 91-97.

103. Catalogue of Strains of the Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms. 2006. www.iegm.ru/iegmcol.

104. Cavanagh J. E. Analysis of microbial hydrocarbon degradation using TLC-FID / J. E. Cavanagh, A. L. Juhasz., P. D. Nichols, P.D. Franzmann, T. A. McMeekin. // J. Microbiol. Methods. 1995. - V. 22. -P. 119-130.

105. Chayabutra C. Polyhydroxyalkanoic acids and rhamnolipids are synthesized sequentially in hexadecane fermentation by Pseudomonas aeruginosa ATCC 1014 / C. Chayabutra, L. K. Ju // Biotechnol. Prog. -2001.-V. 17.-P. 419-423.

106. Chayabutra C. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa unger denitrification: effects of limiting nutrients and carbon substrates / C. Chayabutra, J. Wu, L. K. Ju // Biotechnol. Bioeng. 2001. - V. 72. -P. 25-33.

107. Chen J.-H. Trace metal mobilization in soil by bacterial polymers / J.-H Chen., D. R. Czajka, L. W. Lion, M. L. Shuler, W. С Ghiorse // Environ. Health Perspect. 1995. - V. 103. Suppl. 1. - P. 53-58.

108. Chen К. C. Decolorization of azo dye using PVA-immobilized microorganisms / К. C. Chen, J. Y. Wu, С. - C. Huang, Y. - M. Liang, S. - C. J. Hwang // J. Biotechnol. - 2003. - V. 101. - P. 241-252.

109. Chevalier Y. New surfactants: new chemical functions and molecular architectures / Y. Chevalier // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2002. -V. 7.-P. 3-11.

110. Christofi N. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation / N. Christofi, I. B. Ivshina // J. Appl. Microbiol. 2002. -V. 93.-P. 915-929.

111. Chiou С. T. Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil and organic matter and water / С. T. Chiou, P. E. Porter,

112. D. W. Schmeddling // Environ. Sci. Technol. 1983. - V. 17. - P. 227231.

113. Chun J. Phylogeny of mycolic acid-containing actinomycetes / J. Chun, S. 0. Kang, Y. C. Hah, M. Goodfellow // J. Ind. Microbiol. -1996.- V. 17.-P. 205-213.

114. Churchill P. Surfactant-enhanced bioremediation / P. Churchill, R. Dudley, S. A. Churchill // Waste Manag. 1995. - V. 15. - P. 371-377.

115. Cirigliano M. C. Purification and characterization of liposan, a bioemulsifier from Candida lipolytica / M. C. Cirigliano, G. M. Carman // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 50. - P. 846-850.

116. Cooper D. G. Enhanced production of surfactin from Bacillus subtilis by continuous product removal and metal cation additions / D. G. Cooper, C. R. MacDonald, S. F. B. Duff, N. Kosaric // Appl. Environ. Microbiol. 1981. - V. 42. - P. 408-412.

117. Cooper D. G. Surface-active compounds from microorganisms / D. G. Cooper, J. E. Zajic // Appl. Microbiol. 1980. - V. 26. - P. 229-252.

118. Cooper D. G. Production of surface-active lipids by Corynebacterium lepus / D. G. Cooper, J. E. Zajic, D. F Gerson // Appl. Environ. Microbiol. 1979. - V. 37. - P. 4-10.

119. Cooper D. G. Isolation and identification of biosurfactants produced during anaerobic growth of Clostridium pasteuranum / D. G. J. Cooper, J. E. Zajic, D. F. Gerson, К. I. Manninen // Ferment Technol. 1980. -V.58.-P. 83-86.

120. Dahrazma B. Extraction of copper from a low-grade ore by rhamnolipids / B. Dahrazma, C. N. Mulligan // Pract. Periodical Haz. Toxic Radioactive Waste Mgmt. 2004. - V. 8. - P. 166-172.

121. Damjanovic V. Predicting the stability of freeze-dried Lacto-bacillus bifidus by the accelerated storage test / V. Damjanovic, D. Radulovic // Cryobiology. 1968. - V. 5. - P. 101-104.

122. Reuss, С. Syldatk // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 51. - P. 40-45.

123. Datta A. K. Isolation and purification of trehalose 6-mono- and 6,6-di-corynomycolates from Corynebacterium matruchotii. Structural characterization by 1H NMR / A. K. Datta, K. Takayama // Carbohydrate Res. 1993. - V. 245. - P. 151-158.

124. Davey M. E. Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAOl / M. E. Davey, N. C. Caiazza, G. A. O'Toole // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 10271036.

125. Deleu M. Interfacial and emulsifying properties of lipopeptides from Bacillus subtilis / M. Deleu, H. Razafindralambo, Y. Popineau, P. Jacques, P. Thonart, M. Paquot // Colloids Surfaces A: Physicochem. Engineer. Aspects. 1999. - V. 152. - P. 3-10.

126. Denger K. New halo- and thermotolerant fermenting bacteria producing surface-active compounds / K. Denger, B. Schink // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V. 44. - P. 161-166.

127. De Philippis R. Exocellular polysaccharides from cyanobacteria and their possible applications / R. De Philippis, M. Vincenzini // FEMS Microbiol. Rev. 1998. - V. 22. - P. 151-175.

128. Desai J. D. Microbial production of surfactants and their commercial potential / J. D. Desai, I. M. Banat // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. -V.61.-P. 47-64.

129. Deshpande M. Evaluation of sophorolipid biosurfactant production by Candida bombicola using animal fat / M. Deshpande, L. Daniels // Biores. Technol. 1995. - V. 54. - P. 143-150.

130. Deshpande S. Surfactant selection for enhancing ex situ soil washing / S. Deshpande, B. J. Shiau, D. Wade, D. A. Sabatini, J. H. Harwell // Wat. Res. 1999. - V. 33, - P. 351-360.

131. Deziel E. Biosurfactant production by a soil Pseudomonas strain growing on polysyclic aromatic hydrocarbons / E. Deziel, G. Paquette, R. Villemur, F. Lepine, J. Bisaillon // Appl. Environ. Microbiol. 1996. -V. 62.-P. 1908-1912.

132. Design for the Environment Program. Cleaner Technologies Substitutes Assessment: Professional Fabricare Processes. U. S. Environmental Protection Agency. EPA 744-B-98-001, 1998.

133. Dhariwal K. R. Detection of trehalose monomycolate in Mycobacterium leprae grown in armadillo tissues / K. R. Dhariwal, Y. M. Yang, H. M. Fales, M. B. Goren // J. Gen. Microbiol. 1987. - V. 133.-P. 201-209.

134. Doong R. A. Solubilization and mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas putida in the presence of surfactant R. - A. Doong, W. - G. Lei // J. Hazard. Mater. - 2003. - V. B96.-P. 15-27.

135. Drews G. Mikrobiologisches Praktikum, 2nd edition / G. Drews. -Springer-Verlag, Berlin, 1974.

136. Dubois M. Colorimetric method for the determination of sugars and related substances / M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, R. A. Rebers, F. Smith // Anal. Chem. 1956. - V. 28. - P. 350.

137. Duvnjak Z. Production and release of surfactant by Corynebacterium lepus in hydrocarbon and glucose media / Z. Duvnjak, N. Kosaric // Biotechnol. Lett. 1985. - V. 7. - P. 793-796.

138. EPA National Contingemcy Plan. Product Schedule. U.S. Environment Protection Agency, Washington, 2005.

139. Erler S. T. Oil/water and pre-emulsified oil/water (PIT) dispersions in a stirred vessel: Implications for fermentations / S. T. Erler, A. W. Nienow, A. W. Pacek // Biotechnol. Bioeng. 2003. - V. 82. - P. 543551.

140. Espuny M. J. Nutritional requirements of a biosurfactant producing strain Rhodococcus sp. 51T7 / M. J. Espuny, S. Egido, I. Rodon, M. E. Mercade, A. Manresa // Biotechnol. Lett. 1996. - V. 18. - P. 521-526.

141. Fernandes P. J. Construction of Rhodococcus random mutagenesis libraries using Tn5 transposition complexes / P. J. Fernandes, J. A. C. Powell, J. A. C. Archer // Microbiology. 2001. - V. 147. - P. 25292536.

142. Fiechter A. Biosurfactants: moving towards industrial application / A. Fiechter // Trends Biotechnol. 1992a. - V. 10. - P. 208-217.

143. Fiechter A. Integrated systems for biosurfactant synthesis / A. Fiechter // Pure Appl. Chem. 19926. - V. 64. - P. 1739-1743.

144. Finnerty W. The biology and genetics of the genus Rhodococcus! W. Finnerty // Ann. Rev. Microbiol. 1992. - V. 46. - P. 193-218.

145. Finnerty W. Biosurfactants in environmental biotechnology / W. Finnerty // Curr. Opin. Biotechnol. 1994. - V. 5. - P. 291-295.

146. Fletcher P. D. I. Surfactant Science / P. D. I. Fletcher, R. Strey // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2002. - V. 7. - P. 1-2.

147. Fluharty A. L. A mannose- and erythritol-containing glycolipid from Ustilago maydis / A. L. Fluharty, J. S. O'Brien // Biochemistry. 1969. -V. 8.-P. 2627-2632.

148. Fought J. Effect of emulsan on biodegradation of crude oil in pure and mixed cultures / J. Fought, D. Gutnick, W. Westlake // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V. 55. - P. 36-42.

149. Fujita Y. Direct molecular mass determination of trehalose monomycolate from 11 species of mycobacteria by MALDI-TOF mass spectrometry / Y. Fujita, T. Naka, T. Doi, I. Yano // Microbiology. -2005.-V. 151.-P. 1443-1452.

150. Fujita Y. Intact molecular characterization of cord factor (trehalose 6,6'-dimycolate) from nine species of mycobacteria by MALDI-TOF mass spectrometry / Y. Fujita, T. Naka, M. McNeil, I. Yano // Microbiology. 2005. - V. 151. - P. 3403-3416.

151. Garon D. Influence of surfactants on solubilization and fungal degradation of fluorine / D. Garon, S. Krivobok, D. Wouessidjewe, F. Seigle-Murandi //. Chemosphere. 2002. - V. 47. - P. 303-309.

152. Georgiou G. Surface-active compounds from microorganisms / G. Georgiou, S. C. Lin., M. M. Sharma // Biotechnology. - 1992. - V. 10. -P. 60-65.

153. Gerard J. Massetolides A-H antimycobacterial cyclic depsipeptides produced by two pseudomonads isolated from marine habitats / J. Gerard, R. Lloyd, T. Barsby, P. Haden, M. T. Kelly., R. J Andersen. // J. Nat. Prod. 1997. - V. 60. - P. 223-229.

154. Gerson D. F. Surfactant production from hydrocarbons by Corynebacterium lepus sp. nov. / D. F. Gerson, J. E. Zajic // Devel. Ind. Microbiol. 1978. - V. 19. - P. 577-599.

155. Godchaux W. Defects in gliding motility in mutants of Cytophaga johnsonae lacking a high-molecular-weight cell surface polysaccharide / W. Godchaux, III, M. A. Lynes, E. R. Leadbetter // J. Bacteriol. -1991.-V. 173.-P. 7607-7614.

156. Goel S. K. Selecting the optimal linear alcohol ethoxylate for enhancing oily soil removal / S. K. Goel // J. Surfactants Detergents. -1998.-V. 1.N. 2.-P. 213-219.

157. Goldman S. Emulsan in Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 / S. Goldman, Y. Shabtai, C. Rubinovitz, E. Rosenberg, D. L. Gutnick // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - V. 44. - P. 165-170.

158. Goodfellow M. The actinomycete-genus Rhodococcus: a home for the "rhodochrous" complex / M. Goodfellow, G. Alderson // J. Gen. Microbiol. -1977. V. 100. - P. 99-122.

159. Goodfellow M. The genera Nocardia and Rhodococcus / M. Goodfellow, D. E Minnikin. // The Prokaryotes. Eds: M. P. Starr, H. Stolp, H. G. Truper, A. Balows, H. G. Schlegel. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1981. V. 2. - P. 2016-2026.

160. Grangemard I. Lichenysin: A more efficient cation chelator than surfactin / I. Grangemard, J. Wallach, R. Maget-Dana, F. Peypoux // Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. - V. 90. - P. 199-210.

161. Grimberg S. Quantifying the biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas stutzeri P16 in the presence of a nonionic surfactant / S. Grimberg, W. Stringfellow, M. Aitken // Appl. Environ. Microbiol. -1996.-V. 62.-P. 2387-2392.

162. Guerra-Santos L. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source / L. Guerra-Santos, O. Kappeli, A. Fiechter // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48. -P. 301-305.

163. Guerra-Santos L. Dependence of Pseudomonas aeruginosa continuous culture biosurfactant production on nutritional and environmental factors / L. Guerra-Santos, O. Kappeli, A. Fiechter // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986. - V. 24. - P. 443-448.

164. Guha S. Biodegradation kinetics of phenanthrene partitioned into the micellar phase of non-ionic surfactants / S. Guha, P. Jaffe // Environ. Sci. Technol. 1996. - V. 30. - P. 605-611.

165. Gunther N. W. Production of rhamnolipids by Pseudomonas chlororaphis, a nonpathogenic bacterium / N. W. Gunther, A. Nunez, W. Fett, D. K. Y. Solaiman // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71.-P. 2288-2293.

166. Gupta G. Toxicity of methyl tertiary butyl ether to Daphnia magna and Photobacterium phosphoreum / G. Gupta, J. Y. Lin // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1995. - V. 55. - P. 618-620.

167. Haba E. Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils / E. Haba, M. J. Espuny, M. Busquets, A. Manresa // J. Appl. Microbiol. 2000. - V. 88.-P. 379-387.

168. Haferburg D. Antiviral activity of rhamnolipids from Pseudomonas aeruginosa / D. Haferburg, R. Hommel, H. P. Kleber, S. Klug, G. Schuster, H. J. Zchienger // Acta Biotechnol. 1987. - V. 7. - P. 353356.

169. Harvey S. Enhanced removal of Exxon Valdez spilled oil from Alaskan gravel by a microbial surfactant / S. Harvey, I. Elashi, J. J.

170. Valdes, D. Kamely, A. M. Chakrabarty // Biotechnology. 1990. - V. 8.-P. 228-230.

171. Haskins R. H. Biochemistry of the Ustilaginales. I. Preliminary cultural studies of Ustilago zeae / R. H. Haskins // Can. J. Res. 1950. -V. 28.-P. 213-223.

172. Haskins R. H. Biochemistry of the Ustilaginales. XI. Metabolic products of Ustilago zeae in submerged culture / R. H. Haskins, J. A. Thorn, B. Boothroyd // Can. J. Microbiol. 1955. - V. 1. - P. 749-756.

173. HauJ31er S. Purification and characterization of a cytotoxic exolipid of Burkholderia pseudomallei / S. HauBler, M. Nimtz, T. Domke, V. Wray, I. Steinmetz // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 1588-1593.

174. Hayes M. E. Microbial surfactants / M. E. Hayes, E. Nestaas, K. R. Hrebenar // Chemtech. 1986. - V. 4. - P. 239-243.

175. Heerklotz H. Detergent-like action of the antibiotic peptide surfactin on lipid membranes / H. Heerklotz, J. Seelig // Biophys. J. 2001. - V. 81.-V. 1547-1554.

176. Herman D. C. Rhamnolipid (biosurfactant) effects on cell aggregation and biodegradation of residual hexadecane under saturated flow conditions / D. C. Herman, Y. Zhang, R. M. Miller // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 3622-3627.

177. Hermann T. Industrial production of amino acids by coryneform bacteria / T. Hermann //J. Biotechnol. 2003. - V. 104. - P. 155-172.

178. Hewald S. Genetic analysis of biosurfactant production in Ustilago maydis / S. Hewald, K. Josephs, M. Bolker // Appl. Environ. Microbiol. -2005.-V. 71.-P. 3033-3040.

179. Hildebrand P. D. Role of the biosurfactant viscosin in broccoli head rot caused by a pectolytic strain of Pseudomonas Jluorescens / P. D. Hildebrand, P. G. Braun, К. B. McRae, X. Lu // Can. J. Plant Pathol. -1998.-V. 20.-P. 296-303.

180. Hodgson J. Tween 80 enhanced TNT mineralization by Phanerochaete chrysosporum / J. Hodgson, D. Rho, S. R. Guiot, G. Ampleman, S. Thiboutot, J. Hawaii // Can. J. Microbiol. 2000. -V. 46.-P. 110-118.

181. Hommel R. K. Production of sophorose lipid by Candida (Torulopisis) apicola grown on glucose / R. K. Hommel, L. Weber, A. Weiss, U. Himmelreich, 0. Rilke, H. P. Kleber // J. Biotechnol. -1994.-V. 33.-P. 147-155.

182. Hong K. J. Removal of cadmium and lead from soil using asecin as a biosurfactant / K. J. Hong, Y. K. Choi, S. Tokunaga, Y. Ishigami, T. Kajiuchi // J. Surfactant Deterg. 1998. - V. 2. - P. 247-250.

183. Hong K. J. Evaluation of remediation process with plant-derived biosurfactant for recovery of heavy metals from contaminated soils / K. J. Hong, S. Tokunaga, T. Kajiuchi // Chemosphere. 2002. - V. 49. -P. 379-387.

184. Horowitz S. Isolation and characterization of a surfactant produced by Bacillus licheniformis 86 / S. Horowitz, J. N. Gilbert, W. M. Griffin // J. Ind. Microbiol. 1990. - V. 6. - P. 243-248.

185. Hua Z. Influence of biosurfactants produced by Candida antarctica on surface properties of microorganism and biodegradation of zi-alkanes / Z. Hua, J. Chen, S. Lun, X. Wang // Water Res. 2003. - V. 37. - P. 4143-4150.

186. Hug H. The functional role of lipids in hydrocarbon assimilation / H. Hug, H. W. Blanch, A. Fiechter // Biotechnol. Bioengineer. 1974. -V. 16.-P. 965-985.

187. Inoh Y. MEL-A dramatically increases gene transfection via membrane fusion / Y. Inoh, D. Kitamoto, N. Hirashima, M. Nakanishi // J. Control. Release. 2004.' - V. 94. - P. 423^31.

188. Isoda H. Differentiation of human promyelocyte leukemia cell line HL60 by microbial extracellular glycolipids / H. Isoda, H. Shinmoto, D. Kitamoto, M. Matsumura, T. Nakahara // Lipids. 19976. - V. 32. - P. 263-271.

189. Isoda H. The neurite-initiating effect of microbial extracellular glycolipids in PC 12 cells / H. Isoda, H. Shiumoto, M. Matsumura, T. Nakahara // Cytotechnology. 1999. - V. 31. - P. 163-170.

190. Jahan K. Selection of non-ionic surfactants in enhancing biodegradation of phenanthrene in soil / K. Jahan, T. Ahmed, W. J. Maier // Water Environ. Res. 1997. - V. 69. - P. 317-325.

191. Jain D. K. Effect of addition of Pseudomonas aeruginosa UG2 inocula or biosurfactant on biodegradation of selected hydrocarbons in soil / D. K. Jain, H. Lee, J. T. Trevors // J. Ind. Microbiol. 1992. - V. 10.-P. 87-93.

192. Javaheri M. Anaerobic production of a biosurfactant by Bacillus licheniformis JF-2 / M. Javaheri, G. E. Jenneman, M. J. Mclnerney, R. M. Knapp // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 50. - P. 698-700.

193. Johri A. K. Bioengineered emulsans from Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 transposon mutants / A. K. Johri, W. Blank, D. L. Kaplan // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 59. - P. 217-223.

194. Jones G. E. Surface-active substances produced by Thiobacillus thiooxidans / G. E. Jones, R. L. Starkey // J. Bacteriol. 1961. - V. 82. -P. 788-789.

195. Juck D. Polyphasic microbial community analysis of petroleum hydrocarbon-contaminated soils from two northern Canadian communities / D. Juck, T. Charles, L. G. Whyte, C. W. Greer // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - V. 33. - P. 241-249.

196. Kalyanpur M. Downstream processing in the biotechnology industry / M. Kalyanpur // Mol. Biotechnol. 2002. - V. 22. - P. 87-97.

197. Kaplan N. Acinetobacter calcoaceticus BD4 emulsan: reconstitution of emulsifying activity with pure polysaccharide and protein / N. Kaplan, Z. Zosim, E. Rosenberg // Appl. Environ. Microbiol. 1987. -V. 53.-P. 440-446.

198. Kappeli 0. Partition of alkane by an extracellular vesicle derived from hexadecane-grown Acinetobacter / 0. Kappeli, W. R. Finnerty // J. Bacteriol. 1979. - V. 140. - P. 707-712.

199. Kates M. Techniques of Lipidology. 2nd ed. / M. Kates. Elsevier, New York, 1988.

200. Kato M. Antibody formation to trehalose-6,6'-dimycolate (cord factor) of Mycobacterium tuberculosis / M. Kato // Infect. Immun. -1972.-V. 5.-P. 203-212.

201. Khadikar P. V. QSAR study on solubility of alkanes in water and their partition coefficients in different solvent systems using PI index / P. V. Khadikar, D. Mandloi, A. V. Bajaj, S. Joshi // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. - V. 13. - P. 419-422.

202. Kierszenbaum F. Macrophage activation by cord factor (trehalose 6,6'-dimycoIate) enhanced association with and intracellular killing of Trypanozoma cruzi / F. Kierszenbaum, A. Zenian, J. J. Wirth // Infect. Immunol. 1984. - V. 43. - P. 531-535.

203. Kikuchi T. Enhancement of plasminogen activation by surfactin C: augmentation of fibrinolysis in vitro and in vivo / T. Kikuchi, K. Hasumi // Biochim. Biophys. Acta. 2002. - V. 1596. - P. 234-245.

204. Kim H. S. Production and properties of lipopeptide biosurfactant from Bacillus subtilis C9 / H. S. Kim, B. D. Yoon, С. H. Lee, H. M. Oh, T. Katsuragi, Y. Tani //J. Ferment. Bioeng. 1997. - V. 84. - P. 41-46.

205. Kim J. S. Microbial glycolipid production under nitrogen limitation and resting cell conditions / J. - S. Kim, M. Powalla, S. Lang, F. Wagner, H. Lunsdorf, V. Wray // J. Biotechnol. - 1990. - V. 13. - P. 257-266.

206. Kitamoto D. Extracellular accumulation of mannosylerythritol lipids by a strain of Candida Antarctica / D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki, T. Tabuchi // Agric. Biol. Chem. 1990. - V. 54. - P. 31 -36.

207. Kitamoto D. Production of mannosylerythritol lipids as biosurfactants by resting cells of Candida antartica / D. Kitamoto, T. Fuzishiro, H. Yanagishita, T. Nakane, T. Nakahara // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14.-P. 305-310.

208. Kitamoto D. Formation of giant vesicles from diacylmannosylerythritols and their binding to concanavalin A / D. Kitamoto, S. Ghosh, O. G. Y. Nakatani // Chem. Comm. 2000. -V. 10.-P. 861-862.

209. Kitamoto D. Functions and potential applications of glycolipid biosurfactants from energy-saving materials to gene delivery carriers / D. Kitamoto, H. Isoda, T. Nakahara // J. Biosc. Bioengin. - 2002. -V. 94.-P. 187-201.

210. Kosaric N. Biosurfactants in industry / N. Kosaric // Pure Appl. Chem. 1992. - V. 64. - P. 1731-1737.

211. Kosaric N. Biosurfactants and their application for soil bioremediation / N. Kosaric // Food Technol. Biotechnol. 2001. - V. 39. - P. 295304.

212. Kosaric N. The role of nitrogen in multiorganism strategies for biosurfactant production / N. Kosaric, W. L. Cairns, N. С. C. Gray, D. Stechey, J. Wood // JAOCS. 1984. - V. 61. - P. 1735-1743.

213. Kracht M. Antiviral and hemolytic activities of surfactin isoforms and their methyl ester derivatives / M. Kracht, H. Rokos, M. Ozel, M. Kowall, G. Pauli, J. Vater // J. Antibiot. (Tokyo). 1999. - V. 52. - P. 613-619.

214. Kretschmer A. Chemical and physical characterization of interfacial-active lipids from Rhodococcus erythropolis grown on «-alkanes / A. Kretschmer, H. Bock, F. Wagner // Biochim. Biophys. Acta. 1983. -V. 753.-P. 306-313.

215. Kretschmer A. Characterization of biosynthetic intermediates of trehalose dicorynomycolates from Rhodococcus erythropolis grown on л-alkanes / A. Kretschmer, F. Wagner // Appl. Environ. Microbiol. -1982.-V.44.-P. 864-870.

216. Kulakovskaya Т. V. ATP leakage from yeast cells treated by extracellular glycolipids of Pseudozyma fusiformata / Т. V. Kulakovskaya, E. V. Kulakovskaya, W. I. Golubev // FEMS Yeast Research. 2003. - V. 3. - P. 401-404.

217. Kwok S. Avoiding false positives with PCR / S. Kwok, R. Higuchi // Nature. 1989. - V. 389 - P. 237-238.

218. Lafrance P. Mobilisation and co-transport of pyrene in the presence of Pseudomonas aeruginosa UG2 biosurfactants in sandy soil columns / P. Lafrance, M. Lapointe // Ground Water. Monitor. Remed. 1998. -V. 18.-P. 139-147.

219. Laha S. Inhibition of phenanthrene mineralization by nonionic surfactants in soil water system / S. Laha, R. Luthy // Environ. Sci. Technol. 1991. - V. 25. - P. 1920-1930.

220. Laha S. Effect of nonionic surfactants on the solubilisation and mineralisation of phenanthrene in soil-water system / S. Laha, R. G. Luthy // Biotechnol. Bioeng. 1992. - V. 40. - P. 1367-1380.

221. Lang S. Biological amphiphiles (microbial biosurfactants) / S. Lang // Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2002. - V. 7. - P. 12-20.

222. Lang S. Production of native and modified sophorose lipids / S. Lang, A. Brakemeier, R. Heckmann, S. Spockner, U. Rau // Chimica Oggi (Chem. Today). 2000. - V. 18. N. 10. - P. 76-79.

223. Lang S. Surface-active lipids in rhodococci / S. Lang, J. C. Philp // Antonie van Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 1998. - V. 74. -P. 59-70.

224. Lang S., Wagner F. Biological activities of biosurfactants / S. Lang, F. Wagner // Biosurfactants Production, Properties and Application. Ed. N. Kosaric. Surfactant Science Series. Marcel Dekker Inc., New York, 1993. - V. 48.

225. Lang S. Rhamnose lipids biosynthesis, microbial production and application potential / S. Lang, D. Wullbrandt // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - V. 51. - P. 22-32.

226. Lechevalier M. P. Biology of actinomycetes not belonging to genus Streptomyces / M. P. Lechevalier, H. Lechevalier // Biology of Industrial Microorganisms / Eds: A.L. Demain, N.A. Solomon, Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1985. P. 315-358.

227. Lee В. H. Natural ferric ionophores total synthesis of schizokinen, schizokinen-a, and arthrobactin / В. H. Lee, M. J. Miller // J. Org. Chem.- 1983.-V. 48.-P. 24-31.

228. Le Floch S. A field experimentation on bioremediation: BIOREN / S. Le Floch, F. X. Merlin, M. Guillerme, C. Dalmazzone, P. Le Corre // Environ. Technol. 1999. - V. 20. - P. 897-907.

229. Lemieux R. U. Biochemistry of the ustilaginales. II. Isolation and partial characterization of ustilagic acid / R. U. Lemieux, J. A. Thorn, C. Brice, R. H. Haskins // Can. J. Chem. 1951. - V. 29. - P. 409-414.

230. List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature http://www.bacterio.net.

231. Liu W. H. Bioconversion of cholesterol to cholest-4-en-3-one in aqueous / organic solvent two-phase reactors / W. - H. Liu, W. - C. Horng, M. - S. Tsai // Enzyme Microb. Technol. - 1996. - V. 18. - P. 184-189.

232. Liu Z. Biodegradation of naphthalene in aqueous nonionic surfactant system / Z. Liu, A. M. Jacobson, R. G. Luthy // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 145-161.

233. Lozinsky V. I. Cryogels on the basis of natural and synthetic polymers: preparation, properties and applications / V. I. Lozinsky // Russ. Chem. Rev. 2002. - № 6. - P. 489-511.

234. Macdonald C. R. Surface-active lipids from Nocardia erythropolis grown on hydrocarbons / C. R. Macdonald, D. G. Cooper, J. E. Zajic // Appl. Environ. Microbiol. 1981.-V. 41.-P. 117-123.

235. Macnaughton S. J. Micribial population changes during bioremediation of an experimental oil spill / S. J. Macnaughton, J. R. Stephen, A. D. Venosa, G. A. Davis, Y. J. Chang, D. C. White // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. - P. 3566-3574.

236. Maier R. M. Biosurfactants: evolution and diversity in bacteria / R. M Maier// Adv. Appl. Microbiol. 2003. - V. 52. - P. 101-121.

237. Maier R. M. Remediation of metal-contaminated soil and sludge using biosurfactant technology / R. M. Maier, J. W. Neilson, J. F. Artiola, F. L. Jordan, E. P. Glenn, S. M. Descher // Int. J. Occup. Med. Environ. Health.-2001.-V. 14.-P. 241-248.

238. Maier R. M. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications / R. M. Maier, G. Soberon-Chavez // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 54. - P. 625-633.

239. Makkar R. Biosurfactant production by a thermophilic Bacillus subtilis strain / R. Makkar, S. Cameotra // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1997.-V. 18.-P. 37-42.

240. Makkar R. S. Production of biosurfactant at mesophilic and thermophilic conditions by a strain of Bacillus subtili/ R. S. Makkar, S. S. Cameotra // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 20. - P. 4852.

241. Makkar R. S. An update on the use of unconventional substrates for biosurfactant production and their new applications / R. S. Makkar, S. S. Cameotra // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 428434.

242. Makkar R. S. Comparison of synthetic surfactants and biosurfactants in enhancing biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons / R. S. Makkar, K. J. Rockne // Environ. Toxicol. Chem. 2003. - V. 22. -P. 2280-2292.

243. Makula R. A. Isolation and characterization of an ornithine-containing lipid from Desulfovibrio gigas / R. A. Makula, W. R. Finnerty // J. Bacteriol. 1975. - V. 123. - P. 523-529.

244. Maneerat S. Production of biosurfactants using substrates from renewable-resources / S. Maneerat // Songklanakarin J. Sci. Technol. -2005.-V. 27.-P. 675-683.

245. Margaritis A. Production and surface-active properties of microbial surfactants / A. Margaritis, J. E. Zajic, D. F. Gerson // Biotech. Bioeng. 1979.-V.21.-P. 1151-1162.

246. Mata-Sandoval J. C. Effect of nutritional and environmental conditions on the production and composition of rhamnolipids by P. aeruginosa UG2 / J. C. Mata-Sandoval, J. Karns, A. Torrents // Microbiol. Res. 2001. - V. 155. - P. 249-256.

247. МсСгау J. Biosurfactant-enhanced solubilization of NAPL mixtures / J. McCray, G. Bai, R. Miller, M. Brusseau // J. Contam. Hydrol. -2001.-V. 48.-P. 45-68.

248. McInerney M. Properties of the biosurfactant produced by Bacillus licheniformis strain JF-2 / M. Mclnerney, M. Javaheri, D. P. Nagle // J. Ind. Microbiol. 1990. - V. 5. - P. 95-102.

249. Meylheuc T. Adsorption of biosurfactant on solid surfaces and consequences regarding the bioadhesion of Listeria monocytogenes L028 / T. Meylheuc, C. J. van Oss, M. N. Bellon-Fontaine // J. Appl. Microbiol. - 2001. - V. 91. - P. 822-832.

250. Miller. R. M. Biosurfactant-facilitated remediation of metal-contaminated soils / R. M. Miller. // Environ. Health Perspect. 1995. -V. 103. Suppl. l.-P. 59-62.

251. Mireles J. R. Salmonella enterica Serovar Typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: Surfactin inhibits biofilm formation/ J. R. Mireles, II, A. Toguchi, R. M. Harshey / J. Bacterid. -2001.-V. 183. P. 5848-5854.

252. Mishina M. Fatty acid composition of triglyceride and phospholipid from Candida tropicalis grown on «-alkanes / M. Mishina, M. Isurugi, A. Tanaka, S. Fukui // Agric. Biol. Chem. 1977. - V. 41. - P. 635640.

253. Moffitt M. C. The expansion of mechanistic and organismic diversity associated with non-ribosomal peptides / M. C. Moffitt, B. A. Neilan // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 191. - P. 159-167.

254. Moran A. C. Enhancement of hydrocarbon waste biodegradation by addition of a biosurfactant from Bacillus subtilis 09 / A. C. Moran, N. Olivera, M. Commendatore, J. L. Esteves, F. Sineriz // Biodegradation. -2000. -V. 11.-P. 65-71.

255. Mulligan C. N. Correlation of nitrogen metabolism with biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa / C. N. Mulligan, B. F. Gibbs // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V. 55. - P. 3016-3019.

256. Mulligan С. N. Remediation technologies for metal-contaminated soils and groundwater: an evaluation / C. N. Mulligan, R. N. Yong, B. F. Gibbs // Engineering Geology. 2001a. - V. 60. - P. 193-207.

257. Mulligan C. N. Surfactant-enhanced remediation of contaminated soil: a review / C. N. Mulligan, R. N.Yong, B. F. Gibbs // Engineering Geology. 20016. - V. 60. - P. 371-380.

258. Mulligan C. Metal removal from contaminated soil and sediments by the biosurfactant surfactin / C. Mulligan, R. Yong, B. Gibbs, S. James, H. P. J. Bennett // Environ. Sci. Technol. 1999. - V. 33. - P. 38123820.

259. Murygina V. Bioremediation of oil polluted aquatic systems and soils with novel preparation "Rhoder" / V. Murygina, M. Arinbasarov, S. Kalyuzhnyi // Biodegradation. 2000. - V. 11. - P. 385-389.

260. Nakata K. Two glycolipids increase in the bioremediation of halogenated aromatic compounds / K. Nakata // J. Biosc. Bioeng. -2000.-V. 89.-P. 577-581.

261. Navon-Venezia S. Alasan, a new bioemulsifier from Acinetobacter radioresistens / S. Navon-Venezia, Z. Zosim, A. Gottlieb, R. Legmann, S. Carmeli, E. Z. Ron, E. Rosenberg // Appl. Environ. Microbiol.1995.-V. 61.-P. 3240-3244.

262. Neu T. R. Significance of bacterial surface-active compounds in interaction of bacteria with interfaces / T. R. Neu // Microbiol. Rev.1996.- V. 60.-P. 151-166.

263. Nicolas J. P. Molecular dynamics simulation of surfactin molecules at the water-hexane interface / J. P. Nicolas // Biophys. J. 2003. - V. 85. -P. 1377-1391.

264. Nielsen Т. H. Viscosinamide, a new cyclic depsipeptide with surfactant and antifungal properties produced by Pseudomonas fluorescens DR54 / Т. H. Nielsen, C. Christophersen, U. Anthoni, J. Serensen // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 86. - P. 80-90.

265. Neilson J. W. Characterization of lead removal from contaminated soils by nontoxic soil-washing agents / J. W. Neilson, J. F. Artiola, R. M. Maier//J. Environ. Qual. 2003. - V. 32. - P. 899-908.

266. Noffz G. Neutrophils but not eosinophils are involved in growth supression of IL-4-secreting tumors / G. Noffz, Z. Qin, M. Kopf, T. Blankenstein // J. Immunol. 1998. - V. 160. - P. 345-350.

267. Noll H. The chemical structure of the cord factor of Mycobacterium tuberculosis / H. Noll, H. Bloch, J. Asselineau, E. Lederer // Biochim. Biophys. Acta. 1956. - V. 20. - P. 299-309.

268. Noordman W. H. Effects of rhamnolipid biosurfactants on removal of phenanthrene from soil / W. H. Noordman, W. Ji, M. L. Brusseau, D. B. Janssen // Environ. Sci. Technol. 1998. - V. 32. - P. 1806-1812.

269. Nunez A. LC/MS analysis and lipase modification of the sophorolipids produced by Rhodotorula bogoriensis / A. Nunez, R. Ashby, T. A. Fogilia, D. K. Solaiman // Biotechnol. Lett. 2004. -V. 26.-P. 1087-1093.

270. Page C. A. Biosurfactant solubilization of PAHs / C. A. Page, J. S. Bonner, S. A. Kanga, M. A. Mills, R. L. Autenrieth // Environ. Eng. Sci. 1999.-V. 16.-P. 465-474.

271. Parales R. E. Biodegradation, biotransformation, and biocatalysis (B3) / R. E. Parales, N. C. Bruce, A. Schmid, L. P. Wackett // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - P. 4699-4709.

272. Park A. J. Enhancing solubilization of sparingly soluble organic compounds by biosurfactants produced by Nocardia erythropolis / A. J. Park, D. K. Cha, M. Holsen // Water Environ. Research. 1998. - V. 70.-P. 351-355.

273. Patel G. B. Archaeobacterial ether lipid liposomes (archaeosomes) as novel vaccine and drug delivery systems / G. B. Patel, G. D. Sprott // Crit. Rev. Biotechnol. 1999. - V. 19. - P. 317-357.

274. Pearson J. P. Roles of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems in control of elastase and rhamnolipid biosynthesis genes / J. P. Pearson, E. C. Pesci, В. H. Iglewski // J. Bacteriol. 1997. - V. 179.-P. 5756-5767.

275. Persson A. Biosurfactant yield and nutrient consumption of Pseudomonas fluorescens 378 studied in a microcomputer controlled multifermentation system / A. Persson, G. Molin, N. Andersson, J. Sjoholm // Biotechnol. Bioeng. 1990. - V. 36. - P. 252-255.

276. Pesci E. C. Regulation of las and rhl quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / E. C. Pesci, J. P. Pearson, P. C. Seed, В. H. Iglewski // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 3127-3132.

277. Peypoux F. Recent trends in the biochemistry of surfactin / F. Peypoux, J. M. Bonmatin, J. Wallach // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1999.-V. 51.-P. 553-563.

278. Poremba K. Marine biosurfactants, III. Toxicity testing with marine microorganisms and comparison with synthetic surfactants / K. Poremba, W. Gunkel, S. Lang, F. Wagner // Z. Naturforsch. Sect. C. -1991.-V. 46.-P. 210-216.

279. Rapp P. Use of trehalose lipids in enhanced oil recovery / P. Rapp, H. Bock, E. Urban, F. Wagner, W. Gebetsberger, W. Schulz // DESCHEMAMonogr. Biotechnol.- 1977.-V. 81.-P. 177-185.

280. Rapp P. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from Rhodococcus erythropolis grown on и-alkanes / P.

281. Rapp, H. Воск, V. Wray, F. Wagner // J. Gen. Microbiol. 1979. - V. 115.-P. 491-503.

282. Rau U. Downstream processing of mannosylerythritol lipids produced by Pseudozyma aphidis /U. Rau, L. A. Nguyen, H. Roeper, H. Koch, S. Lang // Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2005. - V. 107. - P. 373-380.

283. Reichardt C. Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry, 2nd ed. Verlag Chemie, Weinheim, 1988. Ch. 7.

284. Renault P. Genetically modified lactic acid bacteria: applications to food or health and risk assessment / P. Renault // Biochimie. 2002. -V. 84.-P. 1073-1087.

285. Retzinger G. S. The role of surface in the biological activities of trehalose 6,6'-dimicolate / G. S. Retzinger, S. C. Meredith, K. Takayama, R. L. Hunter, F. J. Kezdy // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. -P. 8208-8216.

286. Richter M. Streptofactin, a novel biosurfactant with aeral mycelium inducing activity from Streptomyces tendae Tu 901/8c / M. Richter, J. M. Willey, R. Submuth, G. Jung, H. P. Fiedler // FEMS Microbiol. Lett.- 1998.-V. 163.-P. 165-171.

287. Rinker K. D. Continuous culture as a tool for investigating the growth physiology of heterothrophic hyperthermophiles and extreme thermoacidophiles / K. D. Rinker, C. J. Han, R. M. Kelly // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 85. - P. 118S-127S.

288. Ristau E. Formation of novel anionic trehalose tetraesters from Rhodococcus erythropolis under growth-limiting conditions / E. Ristau, F. Wagner//Biotechnol. Lett. 1983. - V. 5. - P. 95-100.

289. Robbers J. E. Technique for the rapid determination of HLB and required-HLB values / J. E. Robbers, V. N. Bhatia // J. Pharm. Sciences. 1961. - V. 50. - P. 708-709.

290. Robinson K. G. Mineralisation enhancement of non-aqueous phase and soil-bond PCB using biosurfactant / K. G. Robinson, M. M. Ghosh, Z. Shi // Water Sci. Technol. 1996. - V. 34. - P. 303-309.

291. Roch F. Biodegradation of hydrophobic compounds in the presence of surfactants / F. Roch, M. Alexander // Environ. Toxicol. Chem. 1995. -V. 14.-P. 1151-1158.

292. Rodrigues L. Biosurfactants: potential applications in medicine / L. Rodrigues, I. M. Banat, J. Teixeira, R. Oliveira // J. Antimicrob. Chemother. 2006. Doi: 10.1093/jac/dkl024.

293. Ron E. Z. Natural roles of biosurfactants / E. Z. Ron, E. Rosenberg // Environ. Microbiol. 2001. - V. 3. - P. 229-236.

294. Rosenberg E. Exploiting microbial growth on hydrocarbon: new markets / E. Rosenberg I I Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 419424.

295. Rosenberg E. Surface active polymers from the genus Acinetobacter / E. Rosenberg, E. Z. Ron // Biopolymers from renewable resources. Ed.

296. D.L. Kaplan, Springer, Berlin, Heidelberg, New York. 1998. -P. 281-291.

297. Rosenberg E. High- and low-molecular-mass microbial surfactants /

298. E. Rosenberg, E. Z. Ron // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 52.-P. 154-162.

299. Rosenberg E. G. A. Inhibition of bacterial adherence to hydrocarbons and epithelial cells by emulsan / E. G. A. Rosenberg, M. Rosenberg // Infect. Immun. 1983. - V. 24. - P. 1024-1028.

300. Rosenkranz H. S. Predictions of the lack of genotoxicity and carcinogenicity in rodents of two gasoline additives: methyl- and ethyi-/-butyl ethers / H. S. Rosenkranz, G. Klopman // In Vitro Toxicol. -1991.-V.4.-P. 49-54.

301. Russell J. B. Strategies that ruminal bacteria use to handle excess carbohydrate / J. B. Russell // J. Animal Sci. 1998. - V. 76. - P. 19551963.

302. Ryll R. Immunological properties of trehalose dimycolate (cord factor) and other mycolic acid-containing glycolipids a review / R. Ryll, Y. Kumazawa, I. Yano // Microbiol. Immunol. - 2001. - V. 45. -P. 801-811.

303. Sandberg K. L. Surfactant replacement therapy improves ventilation inhomogeneity in infants with respiratory distress syndrome / K. L.

304. Sandberg, D. P. Lindstrom, B. A. Sjoqvist, R. A. Parker, R. B.Cotton // Pediatr Pulmonol. 1997. - V. 24. - P. 337-343.

305. Schaffer C. The structure of secondary cell wall polymers: how Gram-positive bacteria stick their cell walls together / C. Schaffer, P. Messner // Microbiology. 2005. - V. 151. - P. 643-651.

306. Schmid A. Developments toward large-scale bacterial bioprocesses in the presence of bulk amounts of organic solvents / A. Schmid, A. Kollmer, R. G. Mathys, B. Witholt // Extremophiles. 1998a. - N. 2. -P. 249-256.

307. Schmid A. Effect of biosurfactant on two-liquid phase Pseudomonas oleovorans cultures and cell-free emulsions containing w-decane / A. Schmid, A. Kollmer, B. Witholt // Enzime Microbial Technol. 19986. -V. 22.-P.487-493.

308. Singer M. E. V. Physiology of biosurfactant synthesis by Rhodococcus species H13-A / M. E. V. Singer, W. R. Finnerty // Can. J. Microbiol. 1990. - V. 36. - P. 741-745.

309. Singh A. Biodegradation and Bioremediation / A. Singh, O. P. Ward. Springer, 2003. 309 pp.

310. Solaiman D. K. Production of sophorolipids by Candida bombicola grown on soy molasses as substrate / D. K. Solaiman, R. D. Ashby, A.

311. Nunez, Т. A. Fogilia // Biotechnol. Lett. 2004. - V. 26. - P. 12411245.

312. Sorkhoh N. A. Establishment of oil-degrading bacteria associated with cyanobacteria in oil-polluted soil / N. A. Sorkhoh, R. H. Al-Hasan, M. Khanafer, S. S. Radwan // J. Appl. Bacteriol. 1995. - V. 78. - P. 194199.

313. Spoeckner S. Glycolipids of the smut fungus Ustilago maydis from cultivation on renewable resources / S. Spoeckner, V.Wray, M. Nimtz, S. Lang // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 51. - P. 33-39.

314. Spragg R. G. The future of surfactant therapy for patients with acute lung injury new requirements and new surfactants / R. G. Spragg // Biol. Neonate. - 2002. - V. 81. - P. 20-24.

315. Stackebrandt E. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov / E. Stackebrandt, F. A. Rainey, N. L. Ward-Rainey // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 479-491.

316. Stackebrandt E. Evidence of phylogenetic heterogeneity within the genus Rhodococcus: revival of the genus Gordona (Tsukamura) / E. Stackebrandt, J. Smida, M. D. Collins // J. Gen. Appl. Microbiol. -1988.-V. 34.-P. 341-348.

317. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions / T. Stein // Mol. Microbiol. 2005. - V. 56. - P. 845-852.

318. Stelmak P. L. Bacterial adhesion to soil contaminants in the presence of surfactants / P. L. Stelmak, M. R. Gray, M. A. Pickard // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 163-168.

319. Sullivan E. R. Molecular genetics of biosurfactant production / E. R. Sullivan // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. - V. 9. - P. 263-269.

320. Suzuki T. Trehalose lipid and branched-b-hydroxy fatty acids formed by bacteria grown on w-alkanes / T. Suzuki, K. Tanaka, J. Matsubara, S. Kimoshita//Agric. Biol. Chem. 1969. -V. 33. - P. 1619-1625.

321. Syldatk C. Production of biosurfactants / C. Syldatk, F. Wagner // Biosurfactants and Biotechnology. Eds. N. Kosaric, W. L. Cairns, N. C. C. Gray. Marcel Dekker Inc., New York. 1987. - P. 89-120.

322. Taylor W. H. Pathways for biosynthesis of a bacterial capsular polysaccharide. I. Characterization of the organism and polysaccharide / W. H. Taylor, E. Juni //J. Bacterid. 1961. - V. 81. - P. 688-693.

323. Tiehm A. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presence of synthetic surfactants / A. Tiehm // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 258-263.

324. Tiehm A. Surfactant-enhanced mobilization and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in manufactured gas plant soil / A. Tiehm, M. Stieber, P. Werner, F. Frimmel // Environ. Sci. Technol. -1997.-V. 31.-P. 2570-2576.

325. Toguchi A. Genetics of swarming motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium: critical role for lipopolysaccharide / A. Toguchi, M. Siano, M. Burkart, R. M. Harshey // J. Bacterid. 2000. - V. 182. -P. 6308-6321.

326. Toren A. The active component of the bioemulsifier alasan from Acinetobacter radioresistens KA53 is an OmpA-like protein / A. Toren, E. Orr, Y. Paitan, E. Z. Ron, E. Rosenberg // J. Bacteriol. 2002. -V. 184.-P. 165-170.

327. Tsuge K. Horizontal transfer of iturin A operon, itu, to Bacillus subtilis 168 and conversion into an iturin A producer / K. Tsuge, S. Inoue, Т. Ano, M. Itaya, M. Shoda // Antimicrob. Agents Chemother. -2005.-V. 49.-P. 4641-4648.

328. Tuleva В. K. Biosurfactant production by a new Pseudomonas putida strain / В. K. Tuleva, G. R. Ivanov, N. E.Christova // Z. Naturforsch. -2002.-V. 57.-P. 356-360.

329. Tuleva В. K. A model for diffusion controlled bioavailability of crude oil components / В. K. Tuleva, G. R. Ivanov, N. E. Christova // Biodegradation. 1998. - V. 8. - P. 287-296.

330. Urum К. Evaluation of biosurfactants for crude oil contaminated soil washing / K. Urum, T. Pekdemir // Chemosphere. 2004. - V. 57. -P. 1139-1150.

331. Van der Geize R. Harnessing the catabolic diversity of rhodococci for environmental and biotechnological applications / R. Van der Geize, L. Dijkhuizen // Cur. Opin. Microbiol. 2004. - V. 7. - P. 255-261.

332. Van Dyke M. I. Evaluation of microbial surfactants for recovery of hydrophobic pollutants from soil / M. I. Van Dyke, S. L.Gulley, H. Lee., J.T.Trevors//!Ind.Microbiol- 1993.-V. ll.-P. 163-170.

333. Van Hamme J. D. Recent advances in petroleum microbiology / J. D. Van Hamme, A. Singh, O. P. Ward // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2003.-V. 67.-P. 503-549.

334. Vollbrecht E. Microbial conversion of vegetable oils into surface-active di-, tri-, and tetrasaccharide lipids (biosurfactants) by the bacterial strain Tsukamurella spec. / E. Vollbrecht, U. Rau, S. Lang // Lipid. 1999. -V. 101.-P. 389-394.

335. Volkering F. Influence of nonionic surfactants on bioavailability and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons / F. Volkering, A. M. Breure, J. G. van Andel, W. H. Rulkens // Appl. Environ. Microbiol. 1995.-V. 61.-P. 1699-1705.

336. Vollenbroich D. Mechanism of inactivation of enveloped viruses by the biosurfactant surfactin from Bacillus subtilis / D. Vollenbroich, M. Ozel, J. Vater, M. Kamp, G. Pauli // Biologicals. 1997a. - V. 25. -P. 289-297.

337. Vollenbroich D. Antimycoplasma properties and application in cell culture of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis / D. Vollenbroich, G. Pauli, M. Ozel, J. Vater // Appl. Environ. Microbiol. -19976.-V. 63.-P. 44-49.

338. Walsh U. F. Pseudomonas for biocontrol of phytopathogens: from functional genomics to commercial exploitation / U. F. Walsh, J. P.

339. Morrissey, F. O'Gara // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. - V. 12. -P. 289-295.

340. Ward 0. Accelerated biodegradation of petroleum hydrocarbon waste / 0. Ward, A. Singh, J. Van Hamme // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. -2003.-V. 30.-P. 260-270.

341. Warhurst A. W. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus / A. W. Warhurst, C. A. Fewson // Crit. Rev. Biochem. -1994.-V. 14.-P. 29-73.

342. Watanabe M. A new glycolipid from Mycobacterium avium -Mycobacterium intracellular complex / M. Watanabe, S. Kudoh, Y. Yamada, K. Iguchi, D. E. Minnikin I I Biochim. Biophys. Acta. 1992. -V. 1165.-P. 53-60.

343. Wei Y. H. Optimizing iron supplement strategies for enhanced surfactin production with Bacillus subtilis / Y. -H. Wei, L. F. Wang, J.-S. Chang // Biotechnol. Prog. - 20046. - V. 20. - P. 979-983.

344. Wick L. Y. Responses of Mycobacterium sp. LB501T to the low bioavailability of solid anthracene / L. Y. Wick, A. R de Munain., D. Springael, H. Harms // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 58. -P. 378-385.

345. Wicke C. Production and structure elucidation of glycoglycerolipids from a marine sponge-associated Microbacterium species / L. Y. Wick, A. R. de Munain, D. Springael, H. Harms // J. Nat. Prod. 2000. - V. 63.-P. 621-626.

346. Wild. M. Selection and partial characterization of a Pseudomonas aeruginosa mono-rhamnolipid deficient mutant / M. Wild., A. D. Caro,

347. A. L. Hernaendez, R. M. Miller, G. Soberoen-Chaevez // FEMS Microbiol. Lett. 1997. - V. 153. - P. 279-285.

348. Wilson R. Overview of the preparation, use and biological studies on polyglycerol polyricinoleate (PGPR) / R. Wilson, B. J. Van Schie, D. Howes // Food Chem. Toxicol. 1998. V. 36. - P. 711-718.

349. Woese C. R. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya / C. R. Woese, O. Kandler, M. L. Wheelis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 45764579.

350. Woods N. R. The methabolism of propane in Rhodococcus rhodochrous PNKbl / N. R. Woods, J. C. Murrell // J. Gen. Microbiol. 1989.-V. 135.-P. 117-123.

351. World Directory of Collections of Cultures of Microorganisms. 5th ed./Eds. H. Sugawara, S. Miyazaki. WFCC-MIRCEN. World Data Centre for Microorganisms, 1999. 140 pp.

352. Wosten H. A. B. Surface-active proteins enable microbial aerial hyphae to grow into the air / H. A. B. Wosten, J. M. Willey // Microbiology. 2000. - V. 146. - P. 767-773.

353. Yakimov M. M. The potential of Bacillus licheniformis strains for in situ enhanced oil recovery / M. M. Yakimov, M. M. Amro, M. Bock, K. Boseker, H. L. Fredrickson, D. G. Kessel, K. N. Timmis // J. Petroleum Sci. Engin.- 1997.-V. 18.-P. 147-160.

354. Yarkoni E. Histopathology of tumor regression by cord factor, turpentine or endotoxin, dissociation of therapy and granuloma formation / E. Yarkoni, L. P. Ruco, H. J. Rapp, M. S. Meltzer// Eur. J. Cancer.- 1979.-V. 15.-P. 1401-1407.

355. Yasuda K. Complement activation by mycoloyl glycolipids from Mycobacterium tuberculosis and Rhodococcus ruber/ K. Yasuda // Osaka City Med. J. 1999. - V. 45. - P. 159-174.

356. Yeom I. Micellar solubilization of polynuclear aromatic hydrocarbons in coal tar contaminated soil /1. Yeom, M. Ghosh, С. Cox, K. Robinson // Environ. Sci. Technol. 1995. - V. 29. - P. 3015-3021.

357. Youssef N. H. Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms / N. H. Youssef, К. E. Duncan, D. P. Nagle, K. N. Savage, R. M. Knappb, M. J. Mclnerney // J. Microbiol. Methods. 2004. - V. 56. - P. 339-347.

358. Yuan S. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a mixed culture / S. Yuan, S. Wei, B. Chang // Chemosphere. 2000. -V. 41. - P. 1463-1468.

359. Zhang Y. Effect of rhamnolipids on the dissolution, bioavailability, and biodegradation of phenanthrene / Y. Zhang, W. Maier R., Miller // Environ. Sci. Technol. 1997. - V. 31. - P. 2211 -2217.

360. Zhang Y. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant) / Y. Zhang, R. M. Miller // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 3276-3282.

361. Zhang C. Y. A pilot test of EOR by in situ microorganism fermentation in the Daqing oil field / C. Y. Zhang, J. C. Zhang // Dev. Petr. Sci. 1993. - V. 39. - P. 231-244.

362. Zhu X. Literature review on the use of commercial bioremediation agents for cleanup of oil-contaminated estuarine environments / X. Zhu, A. D. Venosa, M. T. Suidan // EPA/600/R-04/075. U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, 2004. 56 pp.

363. Zhu X. The use of biosurfactants in flotation: application for the removal of metal ions / X. Zhu, A. D. Venosa, M. T. Suidan // Minerals Engineering.-2003.-V. 16.-P. 1231-1236.

Информация о работе

Куюкина, Мария Станиславовна
доктора биологических наук
Пермь, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы