Образование поверхностно-активных веществ аэробными органотрофными бактериями нефтяных пластов

Соколова, Дияна Шамилевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Образование поверхностно-активных веществ аэробными органотрофными бактериями нефтяных пластов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование поверхностно-активных веществ аэробными органотрофными бактериями нефтяных пластов"

На правах рукописи

СОКОЛОВА Дияна Шамилевна

ОБРАЗОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ АЭРОБНЫМИ ОРГАНОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ

Специальность 03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

МОСКВА-2013

005541626

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Назина Тамара Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Горленко

главный научный сотрудник лаборатории Владимир Михайлович

экологии и геохимической

деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН

доктор биологических наук, доцент кафедры биологии почв факультета

Лысак

Людмила Вячеславовна

почвоведения Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева.

Защита диссертации состоится "23" декабря 2013 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН. Автореферат диссертации разослан ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время все большую актуальность приобретает вопрос о полноте извлечения нефти из коллекторов и разработке способов борьбы с загрязнениями окружающей среды нефтью и ее продуктами. Существует необходимость в поиске микроорганизмов - деструкторов нефти и продуцентов поверхностно активных веществ (био-ПАВ, биосурфактанты), изменяющих свойства нефтяных флюидов. С помощью микроорганизмов возможно получение ПАВ, обладающих высокой растворимостью в водах различной минерализации и с высокой поверхностной активностью. Способность к образованию биосурфактантов выявлена у широкого круга микроорганизмов. Микробное сообщество нефтяного пласта, эксплуатирующегося с применением заводнения, включает аэробные, и, в том числе, углеводородокисляющие бактерии, и анаэробные бродильные, сульфатредуцирующие и метанобразующие прокариоты. С нагнетаемой водой в пласт поступает растворенный кислород и микроорганизмы, что способствует развитию в призабойной зоне нагнетательных скважин аэробно-анаэробного микробного сообщества (Розанова, Кузнецов, 1974; Иванов и соавт., 1982; Борзенков и соавт., 1994; Назина, Беляев, 2004). Наибольший интерес представляют углеводородокисляющие бактерии, которые при росте на углеводородах нефти образуют поверхностно-активные вещества, способствующие проникновению углеводородов в клетку (Banat et al., 2008; Kuyukina et al., 2005; Филонов и соавт., 2008).

Изучению аэробных углеводородокисляющих бактерий нефтяных пластов посвящен широкий ряд работ (Розанова, Кузнецов, 1974; Иванов и соавт., 1982; Борзенков и соавт., 1996; Назина, Беляев, 2004), тогда как образование биосурфактантов пластовыми микроорганизмами мало изучено. В немногочисленных публикациях отмечалось образование биосурфактантов при нагнетании бактерий рода Bacillus и сахаросодержащих субстратов в нефтяной пласт (Youssef et al., 2007), тогда как продукция био-ПАВ из нефти в пласте не исследовалась. При использовании биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на активации аэробно-анаэробного микробного сообщества нефтяного пласта, показано образование летучих кислот, спиртов и газов в пласте (Беляев и соавт., 2004). В то же время систематические исследования образования биосурфактантов в пласте и влияния разных микробных метаболитов на вытеснение нефти не проводились.

В связи с вышесказанным, изучение распространения и разнообразия микроорганизмов, способных продуцировать ПАВ, в заводняемых нефтяных пластах, образования биосурфактантов в пласте и выделение перспективных продуцентов ПАВ представляется актуальной и важной задачей. ~

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение распространения и разнообразия микроорганизмов - продуцентов поверхностно-активных веществ в заводняемых нефтяных пластах, образования биосурфактантов и других микробных метаболитов в пласте в ходе применения биотехнологии повышения нефтеизвлечения и оценка их воздействия на вытеснение нефти.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.

1. Исследовать распространение, биоразнообразие и численность аэробных органотрофных бактерий, образующих биосурфактанты, в терригенных нефтяных пластах на примере нефтяных месторождений Дацин и Даган, различающихся температурой пластов.

2. Выделить аэробные органотрофные бактерии из нефтяных пластов и определить их таксономическое положение и физиологические характеристики, способствующие распространению в нефтяных пластах.

3. Исследовать образование поверхностно-активных веществ (ПАВ), способствующих наибольшему снижению поверхностного и межфазного натяжения, при росте микробного сообщества пластовой воды и выделенных чистых культур на w-алканах и других субстратах.

4. Исследовать образование поверхностно-активных веществ и других микробных метаболитов из нефти в пласте в ходе применения биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на введении аэрированной воды и солей азота и фосфора, и статистически оценить влияние разных метаболитов на вытеснение нефти.

Научная новизна работы. Впервые выполнены экологические исследования распространения аэробных бактерий, образующих биосурфактанты, в нефтяных пластах на примере изучения месторождений Дацин и Даган, отличающихся температурой пластов. Показано, что численность продуцентов био-ПАВ в ряде проб пластовой воды достигала численности аэробных органотрофных бактерий.

В нефтяных пластах Дацина, длительно заводняемых поверхностными водами, разнообразие аэробных мезофильных бактерий было велико; среди них выявлены бактерии родов Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas и Dietzia, образующие био-ПАВ из широкого ряда субстратов и н-алканов нефти. Выделены штаммы Rhodococcus ruber 14Н и Bacillus licheniformis 421, образующие высокоэффективные био-ПАВ гликолипидной природы, связанные с клеточной стенкой. В высокотемпературных горизонтах нефтяного месторождения Даган основными продуцентами био-ПАВ были представители рода Geobacillus, в том числе бактерии, выделенные в новый вид Geobacillus jurassicus sp. nov. Впервые проведены систематические исследования образования био-ПАВ из нефти в нефтяном пласте. Выполнен статистический анализ результатов испытаний биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на нагнетании аэрированной воды и солей азота и фосфора, на месторождении Даган, и

определено влияние различных микробных метаболитов на вытеснение нефти. Показано, что снижение поверхностного натяжения пластовой воды вследствие образования биосурфактантов, и накопление летучих кислот, образуемых аэробными бактериями при окислении нефти, оказывает основное влияние на вытеснение нефти.

Практическая значимость работы. Показано, что в пластовых водах нефтяного месторождения Дацин обитает многокомпонентное микробное сообщество, включающее мезофильные аэробные бактерии, анаэробные бродильные и метанобразующие микроорганизмы. Результаты изучения продуцентов био-ПАВ, выделенных из месторождения Дацин, позволяют рекомендовать применение биотехнологии активации пластовой микрофлоры для повышения нефтеизвлечения на исследованных нефтяных пластах. Выделенные бактерии Rhodococcus ruber 14Н, Bacillus licheniformis 421 и Bacillus subtilis 32a образуют биосурфактанты, эффективные при разведении культуральной среды в 100-1000 раз, что позволяет рекомендовать нагнетание культуральных сред этих бактерий в нефтяной пласт в качестве био-ПАВ, а культуры включать в состав биопрепаратов для очистки от нефтяных загрязнений. Метод Вилкоксона-Манна-Уитни, используемый для статистической обработки результатов испытаний биотехнологии активации пластовой микрофлоры, позволяет идентифицировать добывающие скважины, реагирующие на биотехнологическое воздействие, и может быть использован для доказательства эффективности применения микробных биотехнологий повышения нефтеизвлечения.

Место проведения работы. Работа проводилась под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной в лаборатории нефтяной микробиологии в рамках плана научно-исследовательских работ ИНМИ РАН по теме: «Биоразнообразие, метаболизм и геохимическая деятельность микроорганизмов нефтяных месторождений и других подземных экосистем и возможность совершенствования природоохранных и энергосберегающих биотехнологий» (Госрегистрация № 01200950961), а также при поддержке РФФИ (гранты № 02-04-39002, 05-04-39029 и 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании (CNPC, контракт DFT04-122-IM-18-20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, RBO-1364-MO, RBO-1364-МО-02, RUB 1 -30028-МО-12) и Миннауки РФ (Ведущая научная школа академика РАН М.В. Иванова, 2006-РИ-112.0/001/367 и НШ-1189.2012.4).

Апробация работы. Материалы диссертации были неоднократно представлены на международных симпозиумах по подземной микробиологии (Джексон-Холл, США, 2005; Шизуока, Япония, 2008; Гармиш-Партенкирхен, Германия, 2011); на Второй международной конференции по прикладной микробиологии и молекулярной биологии нефтяных систем (2nd International Conference on Applied Microbiology and Molecular Biology in Oil Systems, Орхус, Дания, 2009); на 3-м Московском Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития"

(Москва, 2005), на VI и VIII Международной молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2010, 2012).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 статей и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит их введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 134 страницах и включают 33 рисунка и 27 таблиц. Список литературы включает 39 отечественных и 182 зарубежных наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были микроорганизмы пластовых вод терригенных нефтяных месторождений Дацин и Даган (КНР), различающихся температурой пластов. Пробы пластовой воды отбирали из добывающих скважин и из нагнетательных скважин, переведенных в режим обратного излива. Посевы на питательные среды производили в день отбора проб. Пробу пластовой воды (1 л) для молекулярно-биологических исследований фиксировали этиловым спиртом (1:1, об.) у скважины в момент отбора.

Состав питательных сред; условия культивирования и учёта микроорганизмов.

Аэробные микроорганизмы. Численность аэробных микроорганизмов в пробах пластовой воды определяли путем посева воды в жидкие среды методом десятикратных разведений в двух повторностях. Результаты рассчитывали методом наиболее вероятного числа по таблице Мак-Креди (Koch, 1994). Численность аэробных бактерий определяли в среде, содержащей (г/л дистиллированной воды): глюкозу - 1.0, бакто-триптон — 5.0, дрожжевой экстракт — 2.5, NaCl - от 2 до 5 г/л, в зависимости от солености исследуемой пластовой воды, рН 7.0-7.2. Углеводородокисляющие бактерии учитывали в минеральной среде (Adkins et al., 1992), в которую вносили смесь С12-С16 н-алканов (0.5-1.0 об. %).

Спектр используемых микроорганизмами источников углерода изучали на минеральной среде (Adkins et al., 1992). Субстраты вносили в следующих концентрациях: сахара - 5.0 г/л; соли жирных кислот - 2.0 г/л; метанол и этанол — по 5.0 мл/л; н-алканы - 2.0 об. %. Микроорганизмы культивировали в стационарных условиях при температуре, соответствующей таковой среды обитания.

Чистые культуры выделяли из первичных накопительных культур путем посева на плотную питательную среду Plate Count Agar (РСА, Sigma, США), на жидкие и

плотные среды для углеводородокисляющих бактерий. Посевы инкубировали аэробно при температуре среды обитания микроорганизмов в течение 2-5 суток до образования отдельных колоний.

Физиолого-биохимические признаки бактерий исследовали традиционными методами (Герхардт, 1984).

Анаэробные микроорганизмы. Среды для анаэробных бактерий готовили, используя анаэробную технику Хангейта (Hungate, 1969). В качестве газовой фазы использовали очищенный от кислорода аргон или смесь Н2+ С02 для метаногенов.

Численность бродильных микроорганизмов оценивали микроскопированием посевов и обнаружением образования молекулярного водорода в газовой фазе в среде Постгейта с пептоном и глюкозой (Postgate, 1984). Численность сульфатвосстанавливающих бактерий определяли по образованию сероводорода в серии разведений пластовой воды в среде Видделя с лактатом натрия (Widdel et al., 1981). Метаногенов учитывали по образованию метана в конечных разведениях в средах Зейкуса (Zeikus et al., 1975) с ацетатом 3.2 (г/л) и/или Н2+С02. В среды вносили микроэлементы (Pfennig and Lippert, 1966). Посевы инкубировали в течение 15 суток при температуре исследуемого нефтяного пласта.

Аналитические методы.

Прирост биомассы в жидкой среде оценивали по величине оптической плотности при длине волны 600 или 540 нм (ОД6оо или ОД5до) на приборе Ultrospec 2100 pro (Amersham Biosciences, США). Содержание белка в микробной биомассе определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951), используя кит-набор (Protein assay kit, Sigma diagnostics, США).

Использование н-алканов нефти оценивали, анализируя изменение содержания н-алканов в деградированной нефти по сравнению с контролем (в %) (Борзенков и соавт., 2006). Культуры выращивали в минеральной среде (Adkins et al., 1992) с добавлением 0.5 г нефти и 0.05 г/л дрожжевого экстракта. Термофильные штаммы инкубировали при 60°С, мезофильные - при 37°С в течение 7-14 суток. Контролем служила стерильная среда с нефтью. Расщифровку хроматограмм производили по методу внутренней нормализации (Богомолов и соавт., 1984).

Методы обнаружения поверхностно-активных веществ в культуральной среде и в пластовой воде. Индекс эмульгирования (Ем) определяли методом Заджика (Zajic et al., 1977). Поверхностное натяжение против воздуха и межфазное натяжение на границе раздела фаз: культуральная жидкость/гексадекан (цетан) измеряли полустатическим методом отрыва кольца на полуавтоматическом тензиометре Surface Tensiomat 21 (Cole-Parmer, США) (Фролов, 1986).

Динамическую вязкость пластовой воды и среды с клетками измеряли на ротационном вискозиметре Brookfield (Германия).

Методы выделения поверхностно-активных веществ. Трегалозолипиды,

софоролипиды и липозан обнаруживали в биомассе бактерий по методу Ристау и Вагнера (Ristau and Wagner, 1983). Эмульсан в культуральной среде обнаруживали по методу Розенберга (Rosenberg et al., 1979). Сурфактин из культуральной среды выделяли по методу Арима (Arima et al., 1968). Поверхностно-активные продукты анализировали на пластинках для тонкослойной хроматографии. В качестве растворителя использовали смесь хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода (40:25:3:7). Проявителем служил 0.5 %-ный раствор a-нафтола (Кейтс, 1975).

Скорости сульфатредукции и метаногенвза в пластовых водах определяли радиоизотопными методами, используя меченые Na235S04, ЫаН|4СОз и 14CH3COONa (Иванов, 1966; Беляев, Иванов, 1975; Лауринавичус, Беляев, 1978).

Молекулярно-биологические методы.

Содержание Г+Ц в ДНК-препаратах определяли с помощью кривых плавления (Marmur and Doty, 1962). ДНК-ДНК гибридизацию проводили по методу Де Лея (De Ley et al., 1970). Тотальную ДНК выделяли из биомассы чистых культур и из фиксированной этанолом пластовой воды с использованием набора для выделения ДНК «DiatomtmDNAprep» (ИБХ РАН, Москва, РФ).

Выделенную ДНК использовали для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, универсальными для представителей доменов Bacteria (8-27f и 519г) (Weisburg et al., 1991; Brunk et al., 1996) и Archaea (A109f и A1041r) (Weisburg et al., 1991; Колганова и соавт., 2002). ПЦР проводили на амплификаторе iCycler фирмы "BioRad" (США). ПЦР-продукты фрагментов генов 16S рРНК бактерий и архей очищали и клонировали с использованием набора «ТА cloning vector kit» (Promega, США) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Клоны, содержащие вставку, секвенировали с использованием плазмидных праймеров M13D или M13R. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer с использованием набора "BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits" ("Applied Biosystems", США).

Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с помощью программы Blast в базе данных NCBI GenBank. Последовательности редактировали с помощью программы BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Последовательности выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов микроорганизмов с помощью программы CLUSTALW vi.75. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых микроорганизмов производили с помощью программы TREECONW [http://bioc-www.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html] и референтных последовательностей Ribosomal Database Project — RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Полученные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК выделенных чистых культур помещены в GenBank под номерами HQ324907.1, EF534141.1, GU323954.1, NR_042835.1, AY312405.1, HQ324908.1, HQ324912.1, HQ324911.1, HQ324910.1.

Методы статистической обработки результатов испытаний биотехнологии повышения нефтеизвлечения. Воздействие микробных метаболитов на вытеснение нефти и определение добывающих скважин, реагирующих на микробиологическое воздействие, проводили на основе статистической обработки экспериментальных данных, полученных в результате анализа 14 микробиологических, физико-химических и реологических параметров пластовой воды из 22 добывающих скважин опытного участка нефтяного месторождения Даган, используя критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (Wilcoxon, 1945; Mann, Whitney, 1947) Каждый параметр для каждой добывающей скважины анализировали не менее 5 раз.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Распространение и численность аэробных органотрофных микроорганизмов, образующих биосурфактанты, в пластовых водах нефтяных месторождений с разными физико-химическими условиями.

2.1.1. Биоразнообразие и численность микроорганизмов в пластовых водах нефтяного месторождения Дацин, характеризующихся температурой 40-46°С.

Физико-химические условия и численность микроорганизмов в пластовой воде нефтяного месторождения Дацин. Нефтяное месторождение Дацин расположено в провинции Хейлонгджан (КНР). Исследованные нефтеносные горизонты залегают на глубине 1008-1068 м ниже уровня моря, имеют температуру 42-46°С. Пластовая вода гидрокарбонатно-натриевого типа, имеет низкую минерализацию (4.28-6.89 г/л), не содержит сероводорода, pH 7.0-9.0, концентрация сульфатов - 115-566 мг/л, ацетата - 1.8-5.4 мг/л. Нефтяные пласты длительно эксплуатируются с применением заводнения.

На месторождении Дацин было проанализировано 11 проб воды (из девяти добывающих скважин и две пробы нагнетаемой воды). Численность аэробных органотрофных микроорганизмов в нагнетаемой воде варьировала от 10 до 103 кл/мл, а в воде ряда добывающих скважин достигала 104"5 кл/мл. Численность углеводородокисляющих бактерий была на порядок ниже численности аэробных органотрофов. Среди анаэробных микроорганизмов доминировали бактерии с бродильным типом метаболизма и метаногены. Метаногенез из меченого бикарбоната был выявлен лишь в двух пробах (0.51-0.74 мкг СН4 л"1 сут"1); скорость метаногенеза из ацетата варьировала от 0 до 0.27 мкг СН4 л"1 сут'1. Процесс сульфатредукции не был зарегистрирован в исследуемой воде, хотя численность сульфатредуцирующих бактерий в одной пробе достигала 103 кл/мл.

Таблица 1. Физико-химическая характеристика, численность микроорганизмов (кл/мл) и скорости анаэробных процессов в пробах пластовой воды нефтяного месторождения Дацин

Номер скважины, проба Минера лизация, мг л"1 рН Аэробные органо-трофы Углеводо-родокисля-ющие Бродильные Сульфат-редуци-руюище Метаногены Сульфат-редукция, мкг Б2" л"1 сут"1 Метаногенез, мкг СН4 л"' сут"1

Н2+СО2 Ацетат Из НСОз' Из ацетата

гнх 201* 738 6.10 <10 0 10 0 102 <10 Нд Нд Нд

В1-321-Р43* 1790 7.00 103 103 103 10 102 <10 Нд Нд Нд

В1-02-С5Р44 5000 7.00 105 10 ю7 103 104 103 0 0 0.27

В1-03-Р46 6200 9.00 103 0 ю4 10 104 ю4 0 0 0.01

В1-ЭЗ-Р47 6200 9.00 10 <10 ю5 10 103 103 0 0 0.02

В1-03-Р48 5160 8.50 ю4 ю4 10 <10 ю4 103 0 0 0.01

В1-2-Р30 4280 8.45 ю4 103 ю5 ю2 103 103 0 0.51 0.05

В1-2-Р31 5230 8.25 ю4 103 103 0 ю4 ю4 0 0 0.01

В1-2-Р130 6170 8.80 ю4 10 103 <10 103 103 0 0 0.09

0165-157 6890 8.35 >10" 0 104 0 103 103 0 0 0

0 165-563 6420 8.50 10 103 10 0 >103 10 0 0.74 0

* Нагнетаемая вода, остальные пробы из добывающих скважин; Нд - нет данных.

Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в пластовой воде нефтяного месторождения Дацин. По мнению американских исследователей (Youssef et al., 2009), использование молекулярных методов перспективно для обнаружения в нефтяных пластах известных продуцентов биосурфактантов, которые впоследствии можно быстрее выделить микробиологическими методами.

В настоящей работе был выполнен филогенетический анализ микробного сообщества пластовой воды, отобранной из добывающей скважины B1-D2-CSP44. Была выделена тотальная ДНК, амплифицированы гены 16S рРНК и созданы библиотеки клонов генов 16S рРНК представителей доменов Bacteria и Archaea, содержащие 127 и 41 клон соответственно (рис. 1).

Группа аэробных органотрофов, в состав которой могут входить возможные продуценты биосурфактантов, включала представителей родов Pseudomonas (Gammaproteohacteria) и Thermaerob acter (Clostridia) с низким уровнем сходства с типовыми видами.

Известно, что бактерии рода Pseudomonas продуцируют рамнолипиды при росте на растворимых и водонерастворимых субстратах (нефти, соевом масле, пальмовом масле) (Burger et al., 1963; Itoh and Suzuki, 1972; Maier and Soberon-Chavez, 2000). Таким образом, представлялся необходимым поиск псевдомонад - продуцентов ПАВ.

оо/ 2% 2% 2%

24%

□ Deltaproteobacteria ■ Clostridia

□ Thermotogae □ Alphaproteobacteria

■ Gammaproteobacteria □ Candidate division OP 11

□ Candidate divisionODl, OD2 □ Caldisericia

■ Chlo го flexi □ Bacteroidetes

□ Spirochaetes

Рис. 1. Филогенетическое разнообразие генов 16S рРНК представителей домена Bacteria в библиотеке клонов, созданной на основе ДНК микроорганизмов пластовой воды из добывающей скважины В1-D2-CSP44 месторождения Дацин.

2.1.2. Выделение продуцентов биосурфактантов из пластовой воды нефтяного месторождения Дацин и определение их таксономического положения и физиологи ческих характеристик.

Отсутствие общей реактивной группы или хромофора в молекулах поверхностно-активных веществ не позволяет разработать универсальный химический или спектральный метод анализа этих веществ. Для оценки поверхностно-активных свойств микроорганизмов используется показатель индекса эмульгирования. Поиск продуцентов биосурфактантов в пластовой воде месторождения Дацин вели по образованию эмульсии и снижению поверхностного и межфазного натяжения культуральных сред аэробных органотрофов и углеводородокисляющих бактерий.

На основании определения индекса эмульгирования были выбраны две из восьми первичных накопительных культур, которые использовали для поиска продуцентов био-ПАВ. В ряде случаев численность продуцентов ПАВ достигала численности аэробных органотрофных бактерий в пластовой воде, но в большинстве проб она была в 10-100 раз ниже. Продуценты ПАВ не всегда выделялись на использовавшихся средах из культур, показавших эмульгирование.

Методом последовательных пересевов было выделено 16 штаммов (табл. 2).

Таблица 2. Таксономическая принадлежность аэробных бактерий, выделенных из пластовой воды месторождения Дацин, и реологические характеристики культуральной среды с сахарозой* (индекс эмульгирования - Е24, поверхностное натяжение - ПН и межфазное натяжение - МН)

Штамм Ближайший родственный Сходство генов Е24, ПН, МН**,

микроорганизм 16S рРНК, % % мН/м мН/м

D7-h Pseudomonas putida 98.0 20 30.2 18.3

К.12 Pseudomonas putida 99.0 50 56.4 22.6

D2-0 Thauera aminoaromatica 99.0 Н.д. Н.д. Н.д.

К14 Brachymonas petroleovorans 99.0 0 67.2 28.6

К16 Pannonibacter phragmiletus 99.0 10 52.4 24.6

32d Kocuria erylhromyxa 100.0 5 37 4

263 Dietzia maris 98.3 35 38 3

421 Bacillus licheniformis 1000 50 30 22 (102)***

321 Gordona rubropertinctus 100.0 20 35 ЗО (102)***

14Н Rhodococcus rubber 100.0 100 40 37 (103)***

23 Cellulomonas cellulans 98.0 35 38 20 (102)***

62 Bacillus cereus 100.0 8 46 14

310-2-3 Clavibacter michiganensis 99.0 10 31 3

Контроль, среда с сахарозой 0 50 16

* - среда с сахарозой, инкубировали в течение 12 сут при 45°С; ** - межфазное натяжение на границе раздела фаз культурапьная среда с бактериями/гексадекан; *** - разведение культуральной среды

Выделенные аэробные бактерии на основании высокого сходства генов 16S рРНК (98-100%) были отнесены к известным видам Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Brachymonas petroleovorans, Pannonibacter phragmitetus, Rhodococcus ruber, Tepidiphilus margaritifer, Thauera aminoaromatica (табл. 1). Кроме того, в работе исследовали бактерии Rhodococcus ruber 14Н, В. licheniformis 421, Gordonia rubropertinctus 321, Cellulomonas cellulans 23 и Dietzia maris 263, выделенные ранее Т.Н. Назиной и Сюэ Янфен из месторождения Дацин.

Наряду с мезофильными бактериями были выделены термофильные (Geobacillus stearothermophilus) и термотолерантные (В. licheniformis и Tepidiphilus margaritifer) бактерии, способные расти при температуре пласта 40-46°С. Бактерии использовали растворимые органические субстраты - сахара (глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу), низшие спирты и летучие кислоты (ацетат и бутират), глицерин и др. Большинство штаммов росли также на н-алканах (Cio-Ci6) и сырой нефти.

2.1.3. Образование поверхностно-активных веществ (ПАВ) аэробными бактериями, выделенными из нефтяного месторождения Дацин, при росте на н-алканах и других субстратах.

Способность бактерий продуцировать ПАВ из органических веществ разных классов представляется важной в условиях нефтяного пласта, где основным источником углерода служит нефть, являющаяся многокомпонентным веществом. Микроорганизмы, снижающие поверхностное натяжение культуральной среды более чем на 10 мН/м, считаются перспективными продуцентами ПАВ (Francy et al., 1991). Закономерности образования био-ПАВ одними и теми же микроорганизмами на водорастворимых и нерастворимых субстратах существенно различаются (Abdel-Mawgoud et al., 2010).

У штамма Rhodococcus ruber 14H, выращенного на этаноле, сахарозе и н-алканах, бесклеточный супернатант эмульсии не образовывал, тогда как индекс эмульгирования культуральной среды с клетками и собственно биомассы был высоким (25-50%), что может свидетельствовать об образовании родококками био-ПАВ, ассоциированных с клеточной стенкой (эндо-тип) (табл. 3). Высокий индекс эмульгирования показали клетки родококков, выращенные на гексадекане (50%), что коррелировало с наименьшей величиной межфазного натяжения - 1 мН/м.

Клеточная суспензия и супернатант бактерии В. licheniformis 421, выращенной на сахарозе, вызывали эмульгирование гексадекана, что свидетельствовало о синтезе биосурфактантов эндо- и экзо-типов. Бактерии Р. aeruginosa Kl и Р. putida К12 также продуцировали био-ПАВ экзо- и эндо-типов. Кроме того, штамм К1 продуцировал экзополисахариды как из Сахаров, так и из нефти.

Таблица 3. Индекс эмульгирования (Е24), поверхностное натяжение (ПН) и межфазное натяжение (МН) культуральной среды с клетками (кс), культуральной жидкости без клеток (кж) и биомассы (бм) аэробных бактерий, выделенных из пластовой воды месторождения Дацин

Штамм, ПН МН кс, Е24 КС, ПН кж, МН кж, Е24 ПН бм, МН бм, Е24

субстрат кс, мН/м мН/м % мН/м мН/м кж, % мН/м мН/м бм, %

Rhodococcus ruber 14Н

Сахароза 55.4 20.1 25 45.0 19.2 0 55.2 17.2 50

Этанол 51.5 17.9 10 48.1 20.3 0 49.1 15.8 8

н-алканы 16.0 3.0 40 45.6 20.4 0 25.0 1.0 50

Pseudomonas putida К12

Сахароза 52.8 8.3 50 50.1 21.0 60 54.1 11.5 50

Этанол 44.5 25.1 0 59.5 31.2 0 62.4 34.0 0

н-алканы 46.3 24.3 2 54.3 28.2 0 56.9 29.2 3

Bacillus licheniformis 421

Сахароза 41.1 16.2 50 43.5 24.1 10 40.2 15.1 30

Этанол 51.8 32.1 0 61.2 34.2 0 52.0 22.3 0

н-алканы 48.0 30.1 10 50.0 21.9 0 41.0 18.1 5

ПН/МН (мН/м) в контрольной среде с сахарозой - 64.3/42.1, с этанолом - 60.0/32.0, с н-алканами -53.5/24.0, Е24 = 0.

2.1.4. Выделение поверхностно-активных веществ и определение их химической природы.

Бактерии R. ruber 14Н и В. licheniformis 421 продуцировали биосурфактанты, эффективные при наибольшем разведении культуральной среды (табл. 2). Бактерии инкубировали в среде оптимизированного состава, содержащей сахарозу и аммонийный азот, при соотношении C:N - 10:1. Биосурфактанты выделяли из культуральной жидкости и из биомассы В. licheniformis 421, а также из биомассы R. ruber 14Н. Биосурфактанты, выделенные из биомассы обоих штаммов, имели гликолипидную природу. Неочищенный биоэмульгатор из культуральной жидкости штамма 421 был представлен гликопептидным комплексом, содержащим также более 32% неидентифицированных соединений, вероятно, жирных кислот.

Бактерии R. ruber 14Н и В. licheniformis 421 накапливали био-ПАВ в количестве 0.54 и 1.36 г/л среды соответственно, расход глюкозы составил 10 г/л.

Показано, что внесение даже небольшого количества (10% от объема жидкой фазы) культуральной среды R. ruber 14Н и В. licheniformis 421, содержащей биомассу, поверхностно-активные вещества, экзополисахариды и другие метаболиты, способствовало большему отмыванию нефти с песка по сравнению с внесением стерильной среды. Биоэмульгатор, образуемый R. ruber, отмывал нефть более эффективно, чем таковой В. licheniformis.

Расход химически синтезированных ПАВ для заводнения нефтяного пласта составляет 0.2-2.0 г/л нагнетаемой воды (Розанова, 1987). Как было отмечено ранее, значения ККМ химически синтезированных ПАВ выше значений ККМ био-ПАВ на несколько порядков. По эффективности био-ПАВ сравнимы или превосходят химически синтезированные ПАВ. Таким образом, культуральные среды бактерий R. ruber шт. 14Н и В. licheniformis шт. 421 можно использовать в качестве био-ПАВ для нагнетания в нефтяной пласт.

Проведенные микробиологические исследования нефтяного месторождения Дацин показали, что в пласте обитает многокомпонентное микробное сообщество, включающее аэробных бактерий и анаэробных бродильных и метанобразующих микроорганизмов. Аэробные органотрофные бактерии приспособлены к экологическим условиям среды обитания и способны образовывать биосурфактанты из широкого круга органических субстратов, н-алканов и сырой нефти. Полученные результаты позволяют рекомендовать применение биотехнологии активации пластовой микрофлоры для повышения нефтеизвлечения на исследованном нефтяном пласте месторождения Дацин.

2.2.1. Микроорганизмы в пластовой воде залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган, характеризующейся температурой 56-60°С, и образование биосурфактантов в ходе биотехнологического воздействия.

Физико-химические условия, численность микроорганизмов и образование биосурфактантов в пластовой воде залежи Кондиан в ходе биотехнологического воздействия. Залежь Кондиан высокотемпературного нефтяного месторождения Даган находится в провинции Хэбэй (КНР). Для поддержания давления в пласт нагнетают оставшуюся после отделения нефти воду этого же месторождения. Температура пласта составляет 56-60°С, пластовые воды имеют минерализацию 5.8— 6.6 г/л.

В 2001-2007 гг. на залежи Кондиан применяли технологию повышения нефтеизвлечения, основанную на нагнетании водно-воздушной смеси и минеральных солей азота и фосфора для стимуляции роста пластовых микроорганизмов. В течение 7 лет проводился мониторинг физико-химических, микробиологических и продукционных характеристик залежи Кондиан. Результаты мониторинга за 20002003 г. приведены ранее (Назина и соавт., 2007). Соискатель принимал непосредственное участие в отдельных этапах работы на нефтяном месторождении и участвовал в лабораторной обработке проб пластовой воды.

Поступление кислорода и биогенных элементов способствовало созданию условий, благоприятных для биотрансформации нефти. В ходе испытаний биотехнологии численность аэробных органотрофных и углеводородокисляющих

бактерий была наибольшей в призабойной зоне нагнетательных скважин и возрастала в водах 14-ти из 22-х добывающих скважин опытного участка (табл. 4, 5). Окисление нефти сопровождалось накоплением растворимых карбонатов, летучих жирных кислот и биосурфактантов в пластовой воде, СН4 и СОг - в газовой фазе.

В настоящей работе особое внимание уделяли выделению аэробных продуцентов биосурфактантов из залежи и анализу изменения реологических характеристик пластовой воды в результате биотехнологического воздействия.

В ходе испытаний биотехнологии отмечено снижение средней величины поверхностного натяжения пластовой воды по участку с 48.0 до 33.3 мН/м, межфазного натяжения против смеси С10-С22 парафинов - с 25.0 до 13.7 мН/м; вязкости - с 0.70 до 0.76 мПа • сек. Минимальные значения поверхностного натяжения составляли 29.3-33.0 мН/м, а межфазного натяжения пластовой воды против смеси Скг-Сн парафинов - 5.6-9.0 мН/м. Величина межфазного натяжения на границе пластовая вода/нефть составляла 2.0-7.0 мН/м и была ниже, чем против Сю-С22 парафинов. Это может объясняться амфифильной природой биосурфактантов, которые располагаются на границе вода-нефть, и в большей степени присутствуют в водо-нефтяной эмульсии, чем в пластовой воде.

Наибольшая вязкость 0.82-0.91 мПа • сек была зафиксирована в пробах воды из призабойной зоны нагнетательной скважины, а в воде из добывающих скважин она не превышала 0.80-0.83 мПа • сек.

Таким образом, получены прямые доказательства образования биосурфактантов из нефти в пласте в ходе применения биотехнологии активации пластовой микрофлоры.

2.2.2. Выделение аэробных бактерий из пластовой воды месторождения Даган и определение их таксономического положения и физиологических характеристик.

С использованием сред с н-алканами и богатой среды РСА из пластовой воды месторождения Даган было выделено 20 чистых культур. Мезофильные бактерии (12 штаммов) принадлежали к известным видам - Pseudomonas putida (8 штаммов, 100% сходства), В. mojavensis 2эт2 (99% сходства), Shewanella putrefaciens (2 штамма, 99.8% сходства) и Pannonibacter phragmitetus (99% сходства). В чистой культуре максимальная температура роста штаммов Р. putida составляла 37°С, S. putrefaciens -39°С, a Pannonibacter phragmitetus - 44°С. Такой температурный режим может создаваться в призабойной зоне нагнетательных скважин, заводняемых охлажденной водой с поверхности.

Все выделенные из пластовой воды залежи Кондиан термофильные штаммы росли при температуре 60°С и были представлены спорообразующими бактериями.

Таблица 4. Пределы варьирования численности термофильных микроорганизмов (кл/мл) в пластовой воде из добывающих скважин залежи Кондиан в результате биотехнологического воздействия (2000-2007 гг.)

Номер скважины, проба Аэробные органотрофы Аэробные углеводород-окисляющие Бродильные прокариоты Сульфат-редуцирующие Метаногены

Н2 + СО2 Ацетат

Перед воздействием, 2000 г. 0-Ю3 0-Ю3 Ю2-Ю5 0-Ю3 0-Ю3 0-Ю2

Во время биотехнологического воздействия в 2001-2007 гг.

Нагнетаемая вода 102-107 10—107 Ю3-108 0->Ю5 <Ю->105 <10-Ю4

Добывающие скважины:

1002-1 <10-104 0-1 о2 <10-Ю7 Ю->105 0-Ю6 0-Ю4

1008-1 <10-105 0-Ю4 10-Ю8 <10->105 <10->Ю4 <Ю-103

1015-1 <10—105 0-Ю4 <10-108 <10->Ю5 <10-Ю4 <10-103

1017-2 <10-103 0-10 10-104 10-Ю4 <Ю->105 10-1 о4

1017-3 <10-105 0-Ю5 <Ю-Ю9 <Ю-103 <10->105 <10-Ю2

1017-7 0-Ю6 0-Ю4 10-Ю7 0-Ю6 <10->105 <10->Ю3

1032-1 0-Ю3 0-Ю4 10->104 <10-Ю5 <10-Ю4 <Ю-102

1050-3 <10-105 0-Ю3 <Ю-108 0-Ю4 10-Ю4 <10-ю3

1094-1 10-Ю5 0-Ю4 10-Ю7 <Ю-105 <ю-ю6 Ю2-103

1092 <10-Ю3 0-Ю3 <ю-ю7 <10-105 <10-Ю4 0-Ю3

1017-4 <10-Ю3 0-Ю2 10-Ю4 0->105 <10->Ю4 <Ю-103

1012 <10-Ю4 0-Ю3 <Ю-106 <10->Ю5 <10->Ю4 0-Ю2

1012-1 0-Ю5 0-Ю6 10-Ю7 0-Ю3 <10-ю3 0-Ю3

1017-5 <Ю-102 0-102 <10-Ю7 <10-106 <10->Ю5 <10-Ю2

1050-1 СІ0-103 0-Ю2 <10-Ю4 0->Ю5 <ю-ю4 <10-ю3

1050-2 <10-Ю5 0-Ю2 <10-108 0->105 <10-Ю4 <10-Ю3

Таблица 5. Пределы варьирования содержания карбонатов, ацетатов и сульфатов, скоростей сульфатредукции и метаногенеза, состава стабильных изотопов углерода минеральных карбонатов (5 13С/ХС02+ НСОз"+ СОз2\ °!т РОВ) и реологических параметров в пластовой воде залежи Кондиан в ходе биотехнологического воздействия (2000-2007 гг.)

Номер скважины, Содержание, мг/л Скорость метаногенеза, мкг СН4 л"1 сут"1 Скорость сульфатре- 513С/ЕС02 + НСОз"+ ПН, мН/м МН, мН/м Вязкость, мПа • с

проба НСОз" + СОз2- СНзСОО" ЗС>42- Из КаН,4СОз Из |4СН3-СОСЖа дукции, мкг Б^л'сут"1 СОз2\ 7«, РОВ

Перед воздействием, 2000 г. 350-642 0-5 0 0-1.59 0-5.61 0.002-19.90 -1.5-6.4 56.0 30.0

Во время биотехнологического воздействия, 2001-2007 гг.

Нагнетаемая вода 351-808 0-1.6 0-162 И.о. И.о. Н.о. 6.9...-9.0 52.2-32.1 23.9-8.5 0.68-0.77

Добывающие скважины:

1002-1 419-823 0-74.4 0-35 0-0.880 0.001-20.550 0.002-64.75 5.2...-2.2 54.5-31.6 22.4-8.9 0.71-0.77

1008-1 558-907 0-160.7 0-59 0-11.850 0.011-39.680 0-215.63 8.1...-4.9 55.6-29.3 23.3-8.2 0.67-0.79

1015-1 419-638 0-52.2 0-48 0-5.762 0-1.760 0-18.95 6.1...-11.1 48.8-30.9 24.2-8.9 0.67-0.77

1017-2 549-2049 0-5.0 0-24 0-0.198 0-0.036 0.001-408.25 10.6...-3.6 43.1-31.6 18.8-7.0 Н.о.

1017-3 517-1020 0.6-86.6 0-24 0-0.873 0-1.768 0.02-45.94 5.9...-2.1 51.0-32.1 25.3-8.1 0.68-0.80

1017-7 549-869 0-13.0 0-47 0-26.230 0.021-3.160 0-17.25 5.1...-1.4 54.9-29.4 26.6-8.1 0.68-0.76

1032-1 396-672 0-33.2 0-29 0-0.091 0-5.610 0.044-4.20 6.9...-1.2 49.5-32.2 19.0-8.3 0.70-0.79

1050-3 433-756 0-29.1 0-47 0-0.319 0-0.050 0-87.29 4.4...-2.5 54.3-33.9 24.9-9.0 0.69-0.77

1094-1 610-1243 0-53.4 0-48 0-12.066 0-1143.479 0.009-29.97 1.4...10.1 46.8-31.0 25.8-8.2 0.70-0.74

1092 379-605 0.6-65.5 0-35 0-15.668 0-1.960 0-159.69 5.5...0.4 48.9-36.9 27.9-9.7 0.69-0.75

1017-4 424-549 0.7-64.2 0-18 0-5.116 0-42.255 0.02-147.13 8.0...-3.2 49.8-33.2 23.4-15.9 0.70-0.79

1012 402-610 0.5-70.8 12-71 0-0.250 0-1.184 0-22.22 6.3...-10.3 48.7-34.5 27.2-8.1 0.68-0.7 6

1012-1 441-610 0.8-70.8 0-35 0-0.750 0.008-14.054 0.014-4.62 6.1...-5.6 54.5-31.9 26.8-6.2 0.71-0.74

1050-1 419-621 0-70.6 0-59 0-1.470 0-0.236 0-51.33 5.1...-1.5 51.1-34.7 27.4-7.5 0.69-0.73

1050-2 365-518 0-55.6 0-42 0-0.295 0-0.192 0-4.69 3.0...-12.1 54.3-33.9 29.7-6.2 0.70-0.76

Штамм G8m был близок к виду Aeribacillus pallidus DSM 3670т (99% сходства генов 16S рРНК). Род Aeribacillus описан на основании изучения одного штамма DSM 3670т (Minana-Galbis et al., 2009). Изучение нового штамма из нефтяных пластов позволит полнее охарактеризовать фенотипическое разнообразие бактерий рода Aeribacillus.

Остальные термофильные изоляты принадлежали к роду Geobacillus - G. stearothermophilus (G1017_C12, G1017_C14, K10), G. thermoglucosidasius 3Feng и G. toebii В1024 (99.0% сходства генов 16S рРНК).

Два штамма, DS1T и DS2, относились к отдельному филогенетическому кластеру внутри рода Geobacillus. Штаммы были охарактеризованы с использованием подходов полифазной таксономии и выделены в новый вид Geobacillus jurassicus sp. nov. Фенотипические признаки, спектр используемых субстратов, результаты ДНК-ДНК гибридизации, состав жирных кислот и анализ генов 16S рРНК, подтверждающие выделение этих штаммов в новый вид рода Geobacillus, приведены в диссертации и в статье (Nazina et al., 2005).

В 2012 году была выполнена ревизия рода Geobacillus (Coorevits et al., 2012). В новой классификации вид Geobacillus jurassicus сохранил свой таксономический статус.

2.2.3. Образование поверхностно-активных веществ термофильными и мезофильными бактериями, выделенными из месторождения Даган, на средах с н-алканами и другими субстратами.

Результаты определения реологических характеристик культуральных сред бактерий из месторождения Даган при росте на разных субстратах приведены в таблице 6.

Показано, что у ряда мезофильных бактерий биосурфактанты присутствуют в микробной биомассе. У термофильных бацилл G. jurassicus DS2, G. stearothermophilus G1017_C12 и A. pallidus G8m биосурфактанты образуются при росте на разных субстратах и присутствуют в биомассе и в культуральной среде. Наибольшее снижение межфазного натяжения отмечено в культуральной среде штамма G. jurassicus DS2, выращенного на нефти. Ранее была показана способность геобацилл окислять н-алканы и сырую нефть и их доминирование в высокотемпературных нефтяных пластах (Назина и соавт., 2005; Михайлова, 2012). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при использовании биотехнологии активации пластовой микрофлоры геобациллы являются наиболее важными биогеохимическими агентами, ответственными за образование биосурфактантов из нефти в высокотемпературном пласте.

Таблица 6. Индекс эмульгирования (Е24), поверхностное натяжение (ПН) и межфазное натяжение (МН) культуральной среды с клетками (ке), культуральной жидкости без клеток (кж) и биомассы (бм) аэробных бактерий из залежи Кондиан

Штамм, субстрат ПН кс, мН/м МН кс, мН/м Е24 ПН кж, кс, % мН/м МН кж, мН/м Е24 кж, % ПН бм, мН/м МН бм, мН/м Е24 бм, %

Васіїїиз тоїспетіь 2эт2*

Сахароза 47.1 19.1 10 57 23.9 20 26 10.1 0

Этанол 37.5 18.3 5 45 6.2 0 59 22.3 0

н-алканы 31.0 21.3 0 50.9 20.1 0 41.9 22.0 0

ЗИемапеИа ри/ге/асіею М-8т-3

Сахароза 48.3 28.1 50 50.0 29.0 0 45.4 28.0 50

Этанол 68.3 27.1 10 68.0 37.1 0 67.2 35.4 30

н-алканы 61.0 22.0 0 59.0 30.1 0 65.0 25.1 0

АегіЬасіїїшраїїісіш 08т

Сахароза 47.2 24.3 50 59.3 25.4 10 49.0 26.9 50

Этанол 70.1 31.1 0 59.3 24.0 5 70.0 41.0 0

н-алканы 47.3 22.0 50 42.1 21.0 0 56.3 28.3 50

ОеоЬасШт іЬегто^Іисозіїкчіш ЗИя^

Сахароза 50.1 22.3 0 49.3 21.0 0 65.9 31.2 0

Этанол 59.8 27.4 0 57.6 25.4 0 60.0 31.2 0

СеоЬасШиз)игазїісиз ОБ2

Сахароза 52.4 27.3 10 51.0 28.0 20 58.3 26.3 0

Этанол 49.8 20.0 50 66.0 36.2 50 60.1 19.8 50

н-алканы 48.3 27.0 20 59.5 29.0 20 49.5 22.3 50

Нефть 41.9 12.5 30

СеоЬасШш зІеагоікегторИіїиз 01017 С12

Сахароза 46.3 23.4 50 44.8 20.0 50 52.3 25.3 10

Этанол 56.0 20.0 50 52.6 19.8 50 55.8 25.0 0

н-алканы 51.1 20.6 50 51.2 20.7 50 54.3 25.0 50

ПН/МН (мН/м) в контрольной среде с сахарозой - 64.3/42.1, с этанолом - 60.0/32.0, с н-алканами -53.5/24.0, Е24 = 0.

2.3. Статистический анализ результатов испытаний биотехнологии повышения нефтеизвлечения на нефтяном месторождении Даган и оценка влияния биосурфактантов и других микробных метаболитов на вытеснение нефти.

Влияние микробных метаболитов на вытеснение нефти определяли на основании статистической обработки анализов пластовой воды из добывающих скважин нефтяного месторождения Даган в ходе применения биотехнологии активации пластовой микрофлоры в 2000-2007 годах (табл. 4, 5). Величины изменения того или иного параметра ранжировали в порядке убывания и строили

график зависимости изменения параметра от его ранга в ранжированном ряду, используя критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. В результате применения биотехнологии из 9 скважин было получено 36002 т дополнительной нефти по сравнению с предысторией. Скважины также были ранжированы в порядке убывания дополнительной добычи нефти. Последовательно применяя ранговую классификацию, получили зависимость отношений «аномальных» величин параметров (п) к общему числу проанализированных параметров (N).

Как видно из рисунка 2, все 22 скважины чётко разделяются на группы. Группа 1 имеет n/N 1 и включает скважины 1008-1 и 1094-1, наиболее реагирующие на микробиологическое воздействие. Эти скважины прореагировали не только изменением всех исследованных параметров, но и из них была получена дополнительная нефть. Группа 2 включает скважины, для которых n/N имеет значение 0.9; к этой группе относятся скважины 1002-1, 1015-1, 1017-7, 1092, 1017-4.

Эти скважины прореагировали слабее группы 1. Причём скважины 1092 и 10174 к моменту завершения проекта не дали дополнительной нефти. Возможно, эти скважины находились в зоне пласта с низким остаточным содержанием нефти.

-е-

8000 7000 6000 5000 4000 -3000 2000 1000

t^ гч

о о о о о

— огч-нсч (ЧГ^-Г^МОГ^-О®

— .— ч. .— Ч, if.

оооооооо

Номер скважины

" 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 ■ 0,2 0,1 - 0

Рис. 2. Ранжирование добывающих скважин на основе анализа 14 микробиологических, физико-химических и биогеохимических параметров и дополнительно добытая нефть (■) из скважин нефтяного месторождения Даган в результате биотехнологического воздействия в 2000-2007 гг.

Для оценки влияния численности микроорганизмов, скоростей анаэробных процессов, биосурфактантов и других микробных метаболитов на вытеснение нефти строили зависимость количества дополнительной нефти от изменения анализируемого параметра (рис. 3). При оценке влияния того или иного параметра на дополнительно добытую нефть, учитывали угол наклона а усреднённой прямой

10000 -8000 -6000 -4000 -2000 -0 -

2 3 4 5 АОБ, 1§(число кл/мл)

с 10000 ¡2 8000 -\ 6000 3! 4000 2000 -0

14 16 18 20 22 24 26 28 ПН, мН/м

10000 -

н 8000 -

— н 6000 -

■&

и X 4000 ;

2000 -

0 30 60 90 120 150 180

УК, мг/л

10000 -

н 8000 -

■а 6000 -

4000 ^

а 2000 -

О 10 20 30 40 МГ Ас, мкгСН4/(л сут)

Рис. 3. Ранжирование добывающих скважин по приросту численности аэробных органотрофных бактерий АОБ) (а) в пластовой воде, и влияние изменения поверхностного натяжения (б), содержания уксусной кислоты (в) и скорости метаногенеза из ацетата (г) (♦) на дополнительную добычу нефти в ходе биотехнологического воздействия на нефтяном месторождении Даган в 20002007 гг.

относительно ОХ оси координат. Анализ влияния разных параметров на добычу нефти (в порядке уменьшения угла а) показывает, что основное воздействие на вытеснение нефти оказывают образуемые аэробными органотрофами биосурфактанты, которые снижают поверхностное натяжение пластовой воды, и уксусная и масляная кислоты, а также численность метаногенов. Скорость метаногенеза оказывала меньшее воздействие на получение дополнительной нефти.

Приведенные результаты демонстрируют высокую эффективность применения биотехнологии повышения нефтеотдачи, основанной на активации пластовой микрофлоры, в высокотемпературном нефтяном месторождении и важную роль биосурфактантов и других продуктов микробного окисления нефти в вытеснении нефти.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биотехнологии увеличения нефтеизвлечения пластов, основанные на активации пластовой микрофлоры, являются эффективными и не требуют высоких экономических затрат. Поверхностно-активные вещества микробного происхождения снижают поверхностное натяжение и межфазное натяжение между нефтяной и водной фазой, увеличивая эффективность применения биотехнологии. Наиболее эффективными продуцентами био-ПАВ являются аэробные углеводородокисляющие бактерии, которые, как правило, попадают в пласт с нагнетаемой водой.

В ходе настоящей работы на примере двух нефтяных месторождений Китая (Дацин и Даган), различающихся температурными условиями нефтяных пластов, исследован состав и активность подземных микробных сообществ и распространение микроорганизмов, образующих био-ПАВ в нефтяном пласте.

С использованием микробиологических, молекулярно-биологических, физико-химических и радиоизотопных методов показано, что исследованные нефтяные пласты содержат метаболически разнообразное и геохимически активные микробные сообщества. С целью выявления известных продуцентов био-ПАВ был выполнен филогенетический анализ пробы пластовой воды из добывающей скважины месторождения Дацин, что позволило обнаружить последовательности генов 16S рРНК аэробных бактерий родов Pseudomonas и Thermaerobacter - возможных продуцентов биосурфактантов.

В результате настоящей работы из нефтяных пластов с различными температурными условиями были выделены микроорганизмы, способные продуцировать ПАВ при росте на н-алканах нефти и других органических субстратах. Из пластовой жидкости нефтяного месторождения Дацин (КНР), характеризующегося температурой 42-46°С, были выделены аэробные мезофильные бактерии, принадлежащие к родам Bacillus, Brevibacillus, Cellulomonas, Clavibacter, Dietzia, Gordonia, Kocuria, Pannonibacter, Pseudomonas, Rhodococcus, Shewanella, Azospirillum, и термотолерантные бактерии родов Tepidiphilus и Bacillus. Выделенные микроорганизмы были приспособлены к среде обитания и росли на широком спектре органических субстратов и сырой нефти. Бактерии родов Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas и Dietzia продуцировали ПАВ при росте на н-алканах нефти и сахарах. Бактерии R. ruber 14Н и В. licheniformis 421 накапливали эффективные био-ПАВ в количестве 0.54 и 1.36 г/л культуральной среды соответственно, расход глюкозы составил 10 г/л.

Из пластовой воды залежи Кондиан месторождения Даган, характеризующейся температурой 56-60°С, были выделены мезофильные и термофильные бактерии.

Термофильные бактерии были представлены в основном известными

представителями родов Geobacillus и Aeribacillus. Среди выделенных геобацилл выявлены штаммы DS1T и DS2, принадлежащие к отдельному филогенетическому кластеру генов 16S рРНК внутри рода Geobacillus. На основании анализа фенотипических и генотипических признаков и филогенетического анализа генов 16S рРНК оба штамма отнесены к новому виду Geobacillus jurassicus sp. nov. Особенностью геобацилл и, в том числе, новых штаммов, была способность продуцировать био-ПАВ и снижать поверхностное и межфазное натяжение культуральной среды при росте на сырой нефти.

В 2000-2007 годах на залежи Кондиан месторождения Даган сотрудники ИНМИ РАН и китайские специалисты проводили испытания биотехнологии повышения нефтеизвлечения. Посредством нагнетания водно-воздушной смеси и солей азота и фосфора активировали жизнедеятельность пластовой микрофлоры. В результате применения биотехнологии было получено 36002 т дополнительной нефти. При участии соискателя выполнен многолетний мониторинг численности микроорганизмов различных физиологических групп, концентрации микробных метаболитов в пласте и изменения реологических характеристик пластовых флюидов в ходе испытаний биотехнологии. Впервые проведены систематические исследования образования био-ПАВ из нефти в пласте. Показано, что при использовании биотехнологии активации пластовой микрофлоры на высокотемпературном нефтяном пласте наблюдается снижение поверхностного натяжения вследствие образования биосурфактантов и накопление летучих кислот, образуемых аэробными бактериями при окислении нефти. Методом статистического анализа подтверждено, что названные параметры имеют первостепенное влияние на вытеснение нефти.

4. ВЫВОДЫ

1. В пластовых водах нефтяного месторождения Дацин обитают мезофильные аэробные органотрофные, и в том числе углеводородокисляющие, бактерии, приспособленные к экологическим условиям среды обитания. Выделенные из пластов бактерии родов Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas и Dietzia образуют био-ПАВ из широкого ряда органических субстратов и н-алканов нефти. Численность продуцентов ПАВ в большинстве проб была в 10-100 раз ниже численности аэробных органотрофных бактерий.

2. Бактерии Rhodococcus ruber 14Н и Bacillus licheniformis 421 образуют эффективные биоэмульгаторы гликолипидной природы. Культуральные среды этих бактерий снижают межфазное натяжение на границе с углеводородами при разведении в 100—1000 раз, способствуют отмыванию нефти с пористого песчаного

матрикса, что позволяет рекомендовать их нагнетание в нефтяной пласт в качестве био-ПАВ.

3. Из пластовой воды высокотемпературного нефтяного месторождения Даган выделены аэробные термофильные спорообразующие бактерии родов Geobacillus и Aeribacillus, образующие био-ПАВ при окислении нефти.

4. Бактерии, отнесенные к новому виду Geobacillus jurassicus sp. nov., образуют био-ПАВ при росте на сахарах, спиртах и н-алканах нефти. Геобациллы являются наиболее важными биогеохимическими агентами, ответственными за образование биосурфактантов из нефти в высокотемпературном пласте при использовании биотехнологии активации пластовой микрофлоры.

5. Впервые проведен статистический анализ результатов, полученных в ходе применения биотехнологии активации пластовой микрофлоры на высокотемпературном нефтяном пласте. Показано, что биосурфактанты и летучие кислоты, образуемые аэробными бактериями при окислении нефти, имеют первостепенное влияние на вытеснение нефти.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи

1. Назина Т.Н., Григорьян A.A., Сюэ Я.-Ф., Соколова Д.Ш., Новикова Е.В., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Беляев С.С, Иванов М.В. Филогенетическое разнообразие аэробных сапротрофных бактерий из нефтяного месторождения Дацин // Микробиология. 2002. Т. 71, № 1. С. 103-110.

2. Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Григорьян A.A., Сюэ Ян Фен, Беляев С.С., Иванов М.В. Образование нефтевытесняющих соединений микроорганизмами из нефтяного месторождения Дацин (КНР) // Микробиология. 2003. Т. 72, № 2, С. 206-211.

3. Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Шестакова Н.М., Григорьян A.A., Михайлова Е.М., Бабич Т.Л., Лысенко A.M., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Циньсян Фенг, Фангтиан Ни, Беляев С.С. Филогенетическое разнообразие аэробных органотрофных бактерий из высокотемпературного нефтяного месторождения Даган // Микробиология. 2005. Т. 74, № 3. С. 401-409.

4. Nazina T.N., Sokolova D.S., Grigoryan A.A., Shestakova N.M., Mikhailova E.M., Poltaraus A.B., Tourova T.P., Lysenko A.M., Osipov G.A., Belyaev S.S. Geobacillus jurassicus sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated from a high-temperature petroleum reservoir, and the validation of the Geobacillus species // Syst. Appl. Microbiol. 2005. V. 28(1). P. 43-53.

5. Шестакова H.M., Коршунова A.B., Михайлова Е.М., Соколова Д.Ш., Турова Т.П., Беляев С.С., Полтараус А.Б., Назина Т.Н. Сравнение библиотек клонов, полученных на основе ДНК и РНК из накопительных культур аэробных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературного нефтяного пласта // Микробиология. 2011. Т. 80. № 1. С. 63-73.

6. Назина Т.Н., Михайлова Е.М., Шестакова Н.М., Соколова Д.Ш., Ивойлов B.C., Коршунова A.B., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Беляев С.С., Иванов М.В. Биодеградация нефти и гены alkB аэробных термофильных бактерий из нефтяных пластов. Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН. Вып. 16. Термофильные микроорганизмы // Ин-т микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Отв. редактор В.Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 2011. С. 193-216.

Тезисы конференций

7. Nazina T.N., Grigoryan А.А., Shestakova N.M., Sokolova D.S., Babich T.L., Mikhailova E.M., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Characterization of a microbial community from the Dagang high-temperature oil field (P.R. China) by culture-based, radioisotopic and molecular methods. Abstracts: The Joint International Symposia for Subsurface Microbiology (ISSM 2005) and Environmental Biogeochemistry (ISEB XVII). Jackson Hole, Wyoming, USA, August 14-19,2005. P. 121.

8. Nazina T.N., Grigorian A.A., Shestakova N.M., Sokolova D.Sh., Babich T.L., Mikhailova E.M., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. From microbial ecology to the microbial enhancement of oil recovery (MEOR) of high-temperature petroleum reservoirs. Abstracts: The Joint Int. Symp. for ISSM and ISEB. Jackson Hole, Wyoming, USA, August 14-19,2005. P. 121.

9. Михайлова E.M., Соколова Д.Ш., Григории A.A., Гавура М.А., Павлова Н.К., Ивойлов B.C., Божонг My, Назина Т.Н. Биодегралация нефти и образование биосурфактантов термофильными аэробными бактериями. Материалы третьего московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". М., Россия, 14-18 марта 2005 г. Ч. 2. С. 239.

10. Nazina T.N., Shestakova N.M., Pavlova N.K., Mikhailova E.M., Sokolova D.Sh., Babich T.L., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Microbial ecology of the high-temperature petroleum reservoir and results of MEOR technology application. 2nd International Conference on Applied Microbiology and Molecular Biology in Oil Systems. 17—19th June 2009, Aarhus, Denmark. ISMOS2 Abstract book. P. 28.

11. Соколова Д.Ш., Шестакова H.M., Павлова H.K., Татаркин Ю.В., Бабич T.JI., Ивойлов B.C., Хисаметдинов М.Р., Ибатуллин P.P., Полтараус А.Б., Назина Т.Н., Беляев С.С., Иванов М.В. Микроорганизмы нефтяных месторождений с карбонатными коллекторами. Материалы VI Молодёжной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, октябрь 2010. С. 116.

12. Shestakova N.M., Babich T.L., Sokolova D.Sh., Huang Lixin, Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Nazina T.N. Diversity and activity of microorganisms in the Daqing oilfield (China). ISSM 2011 - microbial life below our feet. 8th International Symposium of Subsurface Microbiology (ISSM 2011), September 11-16, 2011. Garmisch-Partenkirchen, Germany. Final Programme and Abstracts. P. 75.

13. Соколова Д.Ш., Бабич T.JI. Образование поверхностно-активных веществ аэробными бактериями, выделенными из нефтяных пластов. Актуальные аспекты современной микробиологии: VIII молодежная школа-конференция с международным участием. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Москва, 29-31 октября 2012 г.: Тезисы. - М.: МАКС Пресс, 2012. С. 160-163.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Т.Н. Назиной, а также зав. лабораторией профессору, д.б.н. С.С. Беляеву за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор благодарит к.б.н. Т.Л. Бабич, к.б.н. Н.М. Шестакову, B.C. Ивойлова, к.б.н. Е.М. Михайлову, Н.К. Павлову, д.б.н. Т.П. Турову и Н.А. Кострикину (ИНМИ РАН), Ц. Фенга и Ф. Ни (CNPC), к.б.н. И.В. Ботвинко (РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина) - за участие в отдельных этапах работы, а также к.б.н. А.Б. Полтарауса (ИМБ РАН) и д.б.н. Г.А. Осипова (ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова) - за помощь при выполнении молекулярно-биологических и хемотаксономических исследований. Автор благодарит всех коллег, друзей и семью за полезные советы, помощь, терпение и поддержку.

Формат 60x90/16. Заказ 1742. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Дияна Шамилевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

На правах рукописи

П/.'ЭГ>4 /. С?1С7 «чьи I "ГI

Соколова Дияна Шамилевна

ОБРАЗОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ АЭРОБНЫМИ ОРГАНОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ

Специальность 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Т.Н. Назина

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Поверхностно-активные вещества микробного происхождения 10

1.2. Перспективы использования биосурфактантов в нефтедобывающей промышленности 20

1.3. Метаболическое разнообразие прокариот в нефтяных пластах 28

1.4. Заключение по обзору литературы 31

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 32

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 32

2.1. Объект исследования 32

2.2. Отбор проб пластовой воды 32

2.3. Состав питательных сред; условия культивирования и учёта микроорганизмов 32

2.4. Микроскопические методы 34

2.5. Аналитические методы 34

2.6. Методы обнаружения поверхностно-активных веществ в культуральных средах и в пластовых водах 35

2.7. Методы выделения поверхностно-активных веществ 36

2.8. Анализ клеточных жирных кислот 37

2.9. Радиоизотопные методы оценки скоростей сульфатредукции и метаногенеза в пластовых водах 37

2.10. Молекулярно-биологические методы 38

2.11. Статистические методы 40

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41

3.1. Распространение и численность аэробных органотрофных микроорганизмов, образующих биосурфактанты, в пластовых водах нефтяных месторождений с разными физико-химическими условиями 42

3.1.1. Биоразнообразие и численность микроорганизмов в пластовых водах нефтяного месторождения Дацин, характеризующихся температурой 40-46°С 41

3.1.1.1. Физико-химические условия и численность микроорганизмов в 41

пластовых водах нефтяного месторождения Дацин

3.1.1.2. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в пластовой воде нефтяного месторождения Дацин 42

3.1.1.3. Выделение продуцентов биосурфактантов из пластовой воды нефтяного месторождения Дацин и определение их таксономического положения и физиологических характеристик 49

3.1.1.4. Образование поверхностно-активных веществ аэробными бактериями, выделенными из нефтяного месторождения Дацин, при росте на н-алканах и других субстратах 58

3.1.1.5. Выделение поверхностно-активных веществ и определение их химической природы 69

3.1.2. Микроорганизмы в пластовой воде залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган, характеризующейся температурой 56-60°С, и образование биосурфактантов в ходе биотехнологического воздействия 73

3.1.2.1. Физико-химические условия, численность микроорганизмов и образование микробных метаболитов в пластовой воде залежи Кондиан в ходе биотехнологического воздействия 73

3.1.2.2. Выделение аэробных бактерий из пластовой воды залежи Кондиан и определение их таксономического положения и физиологических характеристик 89

3.1.2.3. Образование поверхностно-активных веществ термофильными и мезофильными бактериями, выделенными из месторождения Даган, на средах с н-алканами и другими субстратами 97

3.1.3. Статистический анализ результатов испытаний биотехнологии повышения нефтеизвлечения на нефтяном месторождении Даган, и оценка влияния биосурфактантов и других микробных метаболитов на вытеснение нефти 100

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 112

5. ВЫВОДЫ 115

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОМ ЛИТЕРАТУРЫ 116

7. ПРИЛОЖЕНИЕ 133

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 134

ВВЕДЕНИЕ

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение распространения и разнообразия микроорганизмов — продуцентов поверхностно-активных веществ в заводняемых нефтяных пластах, образования биосурфактантов и других микробных метаболитов в пласте в ходе применения биотехнологии повышения нефтеизвлечения и оценка их воздействия на вытеснение нефти.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.

3. Исследовать образование поверхностно-активных веществ (ПАВ), способствующих наибольшему снижению поверхностного и межфазного натяжения, при росте микробного сообщества пластовой воды и выделенных чистых культур на н-алканах и других субстратах.

В нефтяных пластах Дацина, длительно заводняемых поверхностными водами, разнообразие аэробных мезофильных бактерий было велико; среди них выявлены бактерии родов Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas и Dietzia, образующие био-ПАВ из широкого ряда субстратов и w-алканов нефти. Выделены штаммы Rhodococcus ruber 14Н и Bacillus licheniformis 421, образующие высокоэффективные био-ПАВ гликолипидной природы, связанные с клеточной стенкой. В высокотемпературном нефтяном месторождении Даган основными продуцентами био-ПАВ были представители рода Geobacillus, в том числе бактерии, выделенные в новый вид Geobacillus jurassicus sp. nov. Впервые проведены систематические исследования образования био-ПАВ из нефти в нефтяном пласте. Выполнен статистический анализ результатов испытаний биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на нагнетании аэрированной воды и солей азота и фосфора, на месторождении

Даган, и определено влияние различных микробных метаболитов на вытеснение нефти. Показано, что снижение поверхностного натяжения пластовой воды вследствие образования биосурфактантов, и накопление летучих кислот, образуемых аэробными бактериями при окислении нефти, оказывает основное влияние на вытеснение нефти.

Практическая значимость работы. Показано, что в пластовых водах нефтяного месторождения Дацин обитает многокомпонентное микробное сообщество, включающее мезофильные аэробные бактерии, анаэробные бродильные и метанобразующие микроорганизмы. Полученные результаты изучения микроорганизмов-продуцентов ПАВ, выделенных из этого месторождения, позволяют рекомендовать применение биотехнологии активации пластовой микрофлоры для повышения нефтеизвлечения на исследованных нефтяных пластах месторождения Дацин. Выделенные бактерии Rhodococcus ruber 14Н, Bacillus licheniformis 421 и Bacillus subtilis 32a образуют биосурфактанты, эффективные при разведении культуральной среды в 100-1000 раз, что позволяет рекомендовать нагнетание культуральных сред этих бактерий в нефтяной пласт в качестве био-ПАВ, а культуры включать в состав биопрепаратов для очистки от нефтяных загрязнений. Метод Вилкоксона-Манна-Уитни, используемый для статистической обработки результатов испытаний биотехнологии активации пластовой микрофлоры, позволяет идентифицировать добывающие скважины, реагирующие на биотехнологическое воздействие, и может быть использован для доказательства эффективности применения микробных биотехнологий повышения нефтеизвлечения.

Место проведения работы. Работа проводилась под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной в лаборатории нефтяной микробиологии в рамках плана научно-исследовательских работ ИНМИ РАН по теме: «Биоразнообразие, метаболизм и геохимическая деятельность микроорганизмов нефтяных месторождений и других подземных экосистем и возможность совершенствования природоохранных и энергосберегающих биотехнологий» (Госрегистрация № 01200950961), а также при поддержке РФФИ (гранты № 02-04-39002, 0504-39029 и 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании (CNPC, контракт DFT04-122-IM-18-20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, RBO-1364-MO, RBO-1364-M0-02, RUB1-30028-M0-12) и Миннауки РФ (Ведущая научная школа академика РАН М.В. Иванова, 2006-РИ-112.0/001/367 и НШ-1189.2012.4).

Апробация работы. Материалы диссертации были неоднократно представлены на международном симпозиуме по подземной микробиологии (Symposium for Subsurface Microbiology, Джексон-Холл, США, 2005; Шизуока, Япония, 2008; Гармиш-Партенкирхен, Германия, 2011); на Второй международной конференции по прикладной микробиологии и молекулярной биологии нефтяных систем (2nd International Conference on Applied

Microbiology and Molecular Biology in Oil Systems, Орхус, Дания, 2009); на 3-м Московском Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), на VI и VIII Международной молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2010,2012).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит их введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 136 страницах и включают 33 рисунка и 27 таблиц. Список литературы включает 39 отечественных и 182 зарубежных наименований.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Т.Н. Назиной, а также зав. лабораторией профессору, д.б.н. С.С. Беляеву за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор благодарит к.б.н. Н.М. Шестакову, B.C. Ивойлова, к.б.н. Е.М. Михайлову, Н.К. Павлову, к.б.н. T.JI. Бабич, д.б.н. Т.П. Турову и H.A. Кострикину (ИНМИ РАН), Ц. Фенга и Ф. Ни (CNPC) - за участие в отдельных этапах работы, а также к.б.н. А.Б. Полтарауса (ИМБ РАН) и д.б.н. Г.А. Осипова (ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова) - за помощь при выполнении молекулярно-биологических и хемотаксономических исследований. Автор благодарит всех коллег, друзей и свою семью за полезные советы, помощь и поддержку.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 статей и 7 тезисов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи

6. Назина Т.Н., Михайлова Е.М., Шестакова Н.М., Соколова Д.Ш., Ивойлов B.C., Коршунова

A.B., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Беляев С.С., Иванов М.В. Биодеградация нефти и гены alkВ аэробных термофильных бактерий из нефтяных пластов. Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН. Вып. 16. Термофильные микроорганизмы // Ин-т микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Отв. редактор В.Ф. Гальченко. М.: МАКС Пресс, 2011.С. 193-216.

Тезисы конференций

1. Nazina T.N., Grigoryan A.A., Shestakova N.M., Sokolova D.S., Babich T.L., Mikhailova E.M., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Characterization of a microbial community from the Dagang high-temperature oil field (P.R. China) by culture-based, radioisotopic and molecular methods. Abstracts: The Joint International Symposia for Subsurface Microbiology (ISSM 2005) and Environmental Biogeochemistry (ISEB XVII). Jackson Hole, Wyoming, USA, August 1419, 2005. P. 121.

2. Nazina T.N., Grigorian A.A., Shestakova N.M., Sokolova D.Sh., Babich T.L., Mikhailova E.M., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. From microbial ecology to the microbial enhancement of oil recovery (MEOR) of high-temperature petroleum reservoirs. Abstracts: The Joint Int. Symp. for ISSM and ISEB. Jackson Hole, Wyoming, USA, August 14-19,2005. P. 121.

3. Михайлова E.M., Соколова Д.Ш., Григорьян A.A., Гавура M.A., Павлова Н.К., Ивойлов

B.C., Божонг My, Назина Т.Н. Биодеградация нефти и образование биосурфактантов термофильными аэробными бактериями. Материалы третьего московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, Россия, 14—18 марта 2005 г. ч. 2. с. 239.

4. Nazina T.N., Shestakova N.M., Pavlova N.K., Mikhailova E.M., Sokolova D.Sh., Babich T.L., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Microbial ecology of the high-temperature petroleum reservoir and results of MEOR technology application. 2nd International Conference on

Applied Microbiology and Molecular Biology in Oil Systems. 17-19th June 2009, Aarhus, Denmark. ISMOS2 Abstract book. P. 28.

5. Соколова Д.Ш., Шестакова H.M., Павлова H.K., Татаркин Ю.В., Бабич Т.Н., Ивойлов B.C., Хисаметдинов М.Р., Ибатуллин P.P., Полтараус А.Б., Назина Т.Н., Беляев С.С., Иванов М.В. Микроорганизмы нефтяных месторождений с карбонатными коллекторами. Материалы VI Молодёжной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, октябрь 2010, С. 116.

6. Shestakova N.M., Babich T.L., Sokolova D.Sh., Huang Lixin, Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Nazina T.N. Diversity and activity of microorganisms in the Daqing oilfield (China). ISSM 2011 — microbial life below our feet. 8th International Symposium of Subsurface Microbiology (ISSM 2011), September 11-16,2011. Garmisch-Partenkirchen, Germany. Final Programme and Abstracts. P. 75.

7. Соколова Д.Ш., Бабич Т.Н. Образование поверхностно-активных веществ аэробными бактериями, выделенными из нефтяных пластов. Актуальные аспекты современной микробиологии: VIII молодежная школа-конференция с международным участием. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Москва, 29-31 октября 2012 г.: Тезисы. - М.: МАКС Пресс, 2012. С

Информация о работе

Соколова, Дияна Шамилевна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Образование поверхностно-активных веществ аэробными органотрофными бактериями нефтяных пластов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы