Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Филогенетическое разнообразие и активность микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Филогенетическое разнообразие и активность микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов"

На правах рукописи

ШЕСТАКОВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

□□305В050

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫХ НЕФТЯНЫХ

ПЛАСТОВ

(03.00.07 - микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003056050

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Т.Н. Назина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

В.М. Горленко В.Н. Акимов

Ведущая организация:

Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова, г. Москва.

Защита диссертации состоится " 23 " апреля 2007 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат диссертации разослан ¿>3 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических паук

Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Присутствие микроорганизмов в нефтяных пластах было установлено около 100 лет назад. Опубликован ряд обзорных материалов по нефтяной микробиологии с подробным описанием микроорганизмов основных физиологических групп (Розанова, Кузнецов, 1974; Magot et al., 2000; Назина, Беляев, 2004). Из нефтяных пластов выделены анаэробные микроорганизмы, восстанавливающие сульфат, тиосульфат, Fe(3+) и элементную серу, бродильные бактерии, ацетогены и метаногены (Magot et al., 2000; Stetter et al., 1993; Takahata et al., 2000; Orphan et al., 2000, 2003; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Аэробные бактерии, обитающие в нефтяных пластах, считаются контаминантами, поступившими в пласт с поверхности земли при бурении или с нагнетаемой водой. Для выяснения биоразнообразия и активности микроорганизмов нефтяных пластов были использованы микробиологические, радиоизотопные, молекулярно-биологические и биогеохимические методы. В большинстве работ эти методы применялись раздельно, что не позволяло расшифровать структуру микробного сообщества в целом и оценить его геохимическую деятельность.

Имеется обширная' информация о микроорганизмах нефтяных пластов с температурой 20-45°С. Процессы метаногенеза и состав микробных сообществ высокотемпературных нефтяных пластов оставались мало изученными.

Первые чистые культуры метаногенов из нефтяных пластов были выделены С.С. Беляевым и соавторами (1986; Belyaev et al., 1983; Образцова и соавт., 1987; Давыдова-Чарахчьян и соавт., 1992; Davidova et al., 1997). Метаногены, окисляющие водород с одновременным восстановлением углекислоты в метан, являются обычными обитателями нефтяных пластов с температурой от 20 до 80°С. Термофильные метаногены, выделенные из нефтяных пластов, были представлены водород-использующими организмами видов Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter thermoaggregans и Methanococcus thermolithotrophicus (Давыдова-Чарахчьян и соавт., 1992а; Ng et al., 1989; Nilsen, Torsvik, 1996). Органотрофные метаногены, использующие ацетат, метанол и метилированные амины, часто растущие также и на Н2+С02, пока изолированы из нефтяных пластов, температура которых не превышает 50°С (Magot et al., 2000; Назина, Беляев, 2004). Тем не менее, образование метана из NaH14C03 и из 14CH3-COONa, зарегистрировано радиоизотопными методами в пластах с температурой 60-80°С, что указывает на существование термофильных прокариот, осуществляющих эти процессы в нефтяных пластах (Belyaev, Borzenkov, 1993; Розанова и

соавт., 1995, 1997;Nazinaetal., 1995; Bonch-Osmolovskaya étal., 2003).

Методы молекулярной экологии, основанные на анализе генов 16S рРНК, начали использоваться для изучения разнообразия микроорганизмов нефтяных пластов сравнительно недавно. Подобные исследования проведены на высокотемпературных нефтяных месторождениях Калифорнии (Orphan et al., 2000, 2003), Западной Сибири (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003) и Китая (Li et al., 2006). В пластовой воде были обнаружены гены 16S рРНК известных термофильных (Thermococcus, Thermotoga, Petrotoga, Thermoanaerobacter; Methanothermobacter, Methanococcus и Methanoculleus) и мезофильных микроорганизмов, a также некультивируемых архей и бактерий. В нефтяных пластах Калифорнии был обнаружен ген 16S рРНК нового, вероятно, ацетокластического метаногена, формирующего отдельную ветвь внутри порядка Methanosarcinales. Однако чистые культуры термофильных ацетокластических метаногенов пока не выделены.

Анализ имеющихся публикаций свидетельствует о том, что применение лишь одного из методов не достаточно для описания микробного сообщества нефтяных пластов. Проведение комплексных исследований микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов актуально как с теоретической точки зрения, так и для решения практических задач по созданию биотехнологий повышения нефтеизвлечения и получения метана из остаточной нефти.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение филогенетической структуры, численности и активности микробного сообщества высокотемпературных нефтяных пластов (на примере нефтяного месторождения Даган) с использованием микробиологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов.

Для достижения цели было, необходимо решить следующие задачи.

1. Определить численность микроорганизмов основных метаболических групп и оценить скорости процессов сульфатредукции и метаиогенеза в пластовых водах нефтяного месторождения Даган.

2. Выяснить филогенетическое разнообразие микроорганизмов в накопительных культурах метаногенов и в микробном сообществе пластовой воды молекулярно-биологическим методом анализа генов 16S рРНК.

3. Выделить чистые культуры метаногенов из нефтяного пласта и определить их физиолого-биохимические признаки и таксономическое положение.

4. Исследовать взаимоотношения микроорганизмов при разрушении ацетата с образованием метана.

Научная новизна работы. Впервые применен комплексный подход к описанию микробного сообщества высокотемпературного нефтяного месторождения. С использованием радиоизотопных методов дана количественная оценка скоростей сульфатредукции и метаногенеза. Методом анализа генов 16S рРНК пластовой воды. показано, что анаэробные микроорганизмы нефтяного пласта были представлены в основном термофильными бактериями и археями с бродильным типом метаболизма, сульфатредуцирующими, метанобразующими и синтрофными микроорганизмами. На основании результатов изучения филогенетического разнообразия микроорганизмов в накопительных метаногенных культурах и в сообществе пластовой воды установлено, что разрушение ацетата с выходом метана осуществляет синтрофная ассоциация микроорганизмов Methanothermobacter-Thermoanaerobacter. Из ассоциации выделены чистые культуры метаногенов СMethanothermobacter thermautotrophicus) и анаэробных органотрофных бактерий (Thermoanaerobacter ethanolicus), не способные расти на ацетате по отдельности. Разрушение ацетата с образованием метана становилось возможным при совместном росте бактерий рода Thermoanaerobacter, окисляющих ацетат до Н2 и СОг, и Н2-использующих метаногенов рода Methanothermobacter. Участие бактерий родов Thermoanaerobacter-Caldanaerobacter в терминальных процессах разрушения органического вещества нефти совместно с метаногенами расширяет представления об их роли в функционировании микробного сообщества высокотемпературных нефтяных пластов.

Научно-практическая значимость работы. Результаты изучения микроорганизмов нефтяного пласта подтверждают возможность применения биотехнологии увеличения нефтеизвлечения, основанной на внесении кислорода воздуха и минеральных солей азота и фосфора, для активации микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов. Установленные закономерности функционирования термофильного микробного сообщества могут быть использованы для создания новых биотехнологий получения метана из остаточной нефти в пласте.

Соискателем усовершенствован метод отбора и фиксации пластовой воды для проведения молекулярно-биологических исследований и оптимизированы условия выделения ДНК с последующей амплификацией генов 16S рРНК. Созданы праймеры для детекции представителей родов Methanothermobacter, Sphingomonas и Pseudomonas в накопительных культурах и природных образцах.

Исследования выполнялись в 2002-2007 гг. при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 01-04-49250, 02-04-39002, 05-04-39029, 0604-58722-3, 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании

(КНР, контракт № ОРТ04-122-1М-18-201Ш), Американского фонда гражданских исследований и развития (гранты СБШР, ЯВО-1364-МО и Ив0-1364-М0-02) и Миннауки РФ (Ведущие научные школы, руководитель академик РАН М.В. Иванов, грант № 02.445.11.7409).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 3-м Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005); на объединенном международном симпозиуме по микробиологии подземных экосистем (188М 2005) и биогеохимии окружающей среды (1БЕВ XVII) (Джексон Холл, США, 2005); на 11-ом международном симпозиуме по микробной экологии (18МЕ-11, Австрия, Вена, 2006) и на 2-ой Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, включая 6 статей и 5 тезисов докладов.

Место проведения работы. Работа проводилась в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (лаборатория нефтяной микробиологии) под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной и в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (лаборатория структурно-функциональной геномики, ЦКП «Геном») под руководством к.б.н. А.Б. Полтарауса.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Т.Н. Назиной, профессору, д.б.н. С.С. Беляеву, к.б.н. А.Б. Полтараусу и к.б.н. Т.П. Туровой за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор приносит благодарность всем участникам работы, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 183 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок и 29 таблиц. Диссертация состоит их разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», включающая главы «Объекты и методы исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит 74 отечественных и 179 зарубежных наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика нефтяного месторождения Даган. Объектом исследования служило микробное сообщество залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган, расположенного в провинции Хэбэй (КНР).

Песчаные нефтеносные горизонты залежи Кондиан располагаются на глубине 1206-1435 м и имеют температуру около 60°С. Пластовые воды гидрокарбонатно-натриевого типа были низко минерализованными (5.6-6.7 г/л), слабо-щелочными (рН от 7.1 до 7.6), содержали от 433 до 670 мг/л гидрокарбоната и до 5 мг/л ацетата. Залежь Кондиан эксплуатировалась с применением заводнения попутно-добываемой водой той же залежи, отделенной от нефти.

Обор проб. Для микробиологических исследований использовали пробы пластовой воды и нефти из добывающих скважин и воду из остановленных нагнетательных скважин, переведенных на режим самоизлива. Пробы отбирали в стерильные герметично закрывающиеся бутыли. Посевы производили в день отбора проб. Для определения химического состава пластовой воды пробы хранили при 6°С.

Состав сред и условия культивирования микроорганизмов. Численность микроорганизмов основных физиологических групп определяли путем посева пластовой воды в жидкие среды методом десятикратных разведений в двух повторностях. Результаты рассчитывали методом наиболее вероятного числа по таблице Мак-Креди.

Аэробные бактерии культивировали в пеншдаллиновых флаконах с воздушной газовой . фазой. Для определения численности углеводородокисляющих бактерий и их выделения использовали модифицированные среды Раймонда (Raymond et al., 1967), Розенберга (Rosenberg et al, 1989) и Адкинса (Adkins et al., 1992) со смесью C10-C22 н-алканов (0.5-1 об. %). В среды вносили микроэлементы (10 мл/л) (Pfennig, Lippert, 1966). Аэробные гетеротрофы определяли в среде, содержащей (г/л): бакто-триптон - 5.0, дрожжевой экстракт - 2.5 и глюкозу -1.0, рН 7.07.2. Посевы инкубировали при температуре 60°С в течение 15 суток.

Среды для анаэробных бактерий готовили, используя анаэробную технику Хангейта (Hungate, 1969). Минеральную основу готовили и стерилизовали отдельно. Дополнительные компоненты вносили в виде стерильных растворов в охлажденную среду, которую восстанавливали сульфидом натрия (0.2-0.5 г/л) или тиогликолятом натрия (0.4 г/л).

В качестве газовой фазы использовали очищенный от кислорода аргон или смесь Н2+С02 для литоавтотрофных метаногенов. Все среды инокулировали пробами пластовой воды, используя шприцы.

Численность анаэробных бактерий с бродильным типом метаболизма оценивали микроскопированием посевов пластовой воды в среду с бакто-пептоном (4 г/л) и глюкозой (10 г/л) (Postgate, 1984). Сульфатредуцирующие бактерии анализировали по увеличению H2S в конечных разведениях в среде В Постгейта (Postgate, 1984) с лактатом натрия (4 г/л), восстановленной Na2S»9H20 (0.2 г/л). Метаногенов

учитывали по образованию СН4 в конечных разведениях в средах (Zeikus et al., 1975) с ацетатом (3.2 г/л) или Н2+С02, дополненных микроэлементами (Wolin et al., 1963), дрожжевым экстрактом (0.5 г/л) и Na2S«9H20 (0.5 г/л).

Микроскопические методы. Морфологию бактерий изучали с помощью светового микроскопа Olympus с фазово-контрастным устройством, при увеличении 100x10.

Аналитические методы. Прирост биомассы в жидкой среде оценивали по величине оптической плотности с помощью прибора Ultrospec 2100 pro (Amersham Biosciences) при длине волны 600 нм. Содержание белка в микробной биомассе определяли колориметрическим методом Лоури (Lowry et al, 1951). Метан, водород, углекислоту и летучие жирные кислоты определяли газохроматографическим методом. Сероводород определяли колориметрическим методом Пахмайра с N,N-диметил-/7-фенилендиамином в модификации (Trtlper, Scblegel, 1964).

Методы оценки интенсивности анаэробных микробных процессов. Скорости сульфатредукции и метаногенеза в пластовых водах определяли радиоизотопными методами, используя меченые Na235S04, uCH3-COONa и NaH14C03. Опыты ставили в двух повторностях. Количество метана, образовавшегося из меченых бикарбоната и ацетата, определяли методами, описанными ранее (Беляев, Иванов, 1975; Лауринавичус, Беляев, 1978). Скорость сульфатредукции рассчитывали по формуле (Романенко, Кузнецов, 1974). Радиоизотопные измерения выполняли на сцинтилляционном счетчике RackBeta (LKB, Финляндия).

Молекулярно-биологические методы. Выделение тотальной ДНК проводили по методу Мармура (Marmur, 1961) и с использованием набора «Diatom'mDNAprep» (Биоком, Москва). Содержание гуанина и цитозина в выделенных препаратах ДНК определяли с помощью кривых плавления, используя ДНК Escherichia coli К-12 в качестве стандарта. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989).

Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием универсальных архейных (A8F, A109f, A517R, A800f, А1041 г) (Gro(3kopf et al., 1998; Колганова и соавт, 2002) и бактериальных (8-27f, 519г, 1492г) (Edwards et al., 1989) праймеров. Температура отжига праймеров и время элонгации ДНК зависели от выбранных праймеров; число циклов варьировали в зависимости от концентрации тотальной ДНК. Анализ фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, проводили в агарозном геле и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Выделение и очистку ПЦР-продуктов проводили с помощью набора для экстракции ДНК из геля (V-gene DNA Gel Extraction Kit; China) или путем прямого переосаждения ДНК спиртом с ацетатом аммония.

Фрагменты гена 16S рРНК архей и бактерий клонировали в

плазмидный вектор pGEM-T (Promega) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Трансформацию ДНК в клетки Е. coli проводили с помощью электропоратора фирмы "Bio-Rad". Для скрининга клонов использовали ПЦР с универсальными плазмидными праймерами. Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе «ABI 3100 Avant Genetic Analyser», используя набор для секвенирования (Dyenamic Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit, Amersham).

Нуклеотидные последовательности анализировали с помощью программы Blast в базе данных NCBI GenBank, редактора BioEdit и алгоритма CLUSTALW. Построение бескорневых филогенетических деревьев производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECONW, и референтных последовательностей из Ribosomal Database Project Chttp.7/rdp.cme.msu.edu). Полученные в работе последовательности гена 16S рРНК были депонированы в GenBank под следующими номерами: DQ097666-DQ097681 hDQ657903-DQ657906.

В ходе выполнения работы были сконструированы праймеры для детекции представителей родов Methanothermobacter (М400г), Pseudomonas (Ps258f) и Sphingomonas (Sphl96r). Специфичность выбранных зондов анализировали, используя программу BLASTN NCBI, а тенденцию к образованию петель и димеров и температуру отжига праймеров - с помощью программ Oligo v.6.0 и PrSelect v. 5.06. Для скрининга клонов применяли ПЦР в реальном времени (ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems), родо-специфичные праймеры и SYBR Green в качестве красителя.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Микробиологические процессы в пластовых водах залежи Кондиан

В 2000-2005 гг. микробиологический метод повышения нефтеизвлечения, разработанный российскими специалистами, был испытан на высокотемпературной залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган (КНР).

На опытном участке, гидродинамически изолированном от других зон пласта, находилось 22 добывающих и 11 нагнетательных скважин. Биотехнологическое воздействие заключалось в нагнетании в пласт водо-воздушной смеси и минеральных солей азота и фосфора через нагнетательные скважины для активации жизнедеятельности пластовой микрофлоры (25 циклов за 5 лет испытаний).

Биотехнологическое воздействие наиболее существенно стимулировало рост микроорганизмов в призабойной зоне нагнетательных скважин. В ходе испытаний биотехнологии численность аэробных органотрофных и углеводородокисляющих бактерий (УОБ) была наибольшей в призабойной зоне нагнетательной скважины 1098 и возрастала с 0-103 кл/мл до 105 кл/мл и более. Численность бродильных (Бр) бактерий увеличивалась с 103-105 кл/мл до >107 кл/мл, сульфатредуцируюших (СВБ) бактерий - с 0-103 до 105 кл/мл, метаногенов (М-Н2 и М-Ац) - с 0-103 до 106 кл/мл.

В зоне расположения эксплуатационных скважин наибольший эффект от воздействия был отмечен в 14-ти скважинах, характеризующихся хорошей гидродинамической связью с нагнетательными скважинами (рис. 1). В 8-и скважинах пределы варьирования численности микроорганизмов всех исследованных метаболических групп, скорости метаногенеза и содержания бикарбоната в пластовой воде незначительно отличались от величин, предшествующих эксперименту. Нагнетаемый кислород воздуха аналитически не обнаруживался в воде из добывающих скважин, тем не менее, клетки аэробных бактерий из призабойной зоны с нагнетаемой водой распространялись по пласту. Численность аэробных органотрофов достигала 105 кл/мл и даже 106 кл/мл (скважины 1012-1 и 1017-7) (рис. 1).

В результате поступления продуктов окисления нефти, образованных аэробными бактериями, в зону добывающих скважин возрастала численность бактерий с бродильным типом метаболизма с 102—105 кл/мл (до испытания) до 10б—108 кл/мл (до 109 кл/мл в скв. 1017-3). Увеличение популяции бродильных бактерий на два-четыре порядка свидетельствовало об активации всего подземного микробного сообщества в ходе биотехнологического воздействия.

Численность термофильных сульфатредуцирующих бактерий в водах большинства добывающих скважин не превышала 103 кл/мл и возрастала в 4-х скважинах (1002-1, 1050-1, 1050-3 и 1094-1). Скорость сульфатредукции была максимальной в призабойной зоне нагнетательных скважин как до биотехнологического воздействия (19.9 мкг/Б2" л"1 сут'1), так и в ходе испытаний (200-3365 мкг/82" л"1 сут'1). В большинстве добывающих скважин скорость сульфатредукции не изменялась, и только в нескольких скважинах она возрастала в 7-15 раз (147-297 мкг/Б2" л"1 сут" 1). Сульфатредуцирующие бактерии были отмечены нами в первичных посевах бродильных бактерий, а также в метаногенных культурах, растущих на среде с ацетатом без сульфата. Это может свидетельствовать о метабиотических и синтрофных взаимоотношениях между

~ 1015-1

¡ОУОБ вСВБ □ М-Н2 аМ-Аи. в Бр

Рис. 1. Численность микроорганизмов в пластовой воде из добывающей скважины 103 5-] в процессе испытаний биотехнологии в 2000-2005 гг.

сул ьфатр едуцирую ш и м и, бродильными и метанобразующими

м икроорганизмам и.

Основным терминальным процессом биодеградации нефти в

практически бессульфатных водах залежи Кондиан являлся метаногенез

(рис. 2). Численность термофильных метаногенов возрастала с 102-!О3 до

104-106 кл/мл (1002-1, 1017-2, 1017-3, 1017-7, 1050-2, 1050-3, 1094-1). Процесс метаногенеза, как и сульфатредукции, был высоким в призабойной зоне нагнетательной скважины и достигал 229.36 мкг СН4 л"'

сут"1. Предпочтительным субстратом для метаногенеза был ацетат, что

может быть объяснено появлением большого количества летучих кислот в ходе биотрансформации нефти (рис. 3). Максимальные скорости метаногенеза из 14СН3-СООЫа были в интервале значений от 6.9 до 1543 мкг СН< л"1 сут1 (скв. 1002-1, 1008-1, 1017-4, 1017-5 и 1094-1) (рис. 2а).

Исключительно высокий метаногенез (1155 мкг СН4 л"'сут'1) наблюдали в

скважине 1094-1 (рис. 26).

вглЗ

25 тЗ

■ МаН1«Х» В14СКЗ-СООМ1

1094-1

Рис. 2. Максимальные скорости образования метана из и СНг

COONa в пластовых водах добывающих скважин (А), а также в

призабойной зоне нагнетательной скважины (пробы 8 и 25 м3) и в добывающей скважине 1094-1 (Б), в мкг СН4 л"'сут"'

2.2. Физико-химические параметры пластовой воды и газа залежи

Конднан

Нагнетание водо-воздушной смеси и минеральных солей обусловило активный процесс биотрансформации нефти, что привело к изменениям состава пластовой воды и газа залежи Кондиан. В воде большинства добывающих скважин было отмечено возрастание концентрации растворимых карбонатов (от 0.4-0.6 до 0.7-] .8 г/л) и летучих кислот. Количество ацетата достигало 160.7 мг/л, формиата - 67.4 мг/л, изо-бутирата - 98.2 мг/л (рис. 3).

В составе газа содержание углекислоты возрастало на 2-4%, а метана - на 3-5%. Отмечено изменение состава стабильных изотопов углерода минеральных карбонатов (5' 3С/УС02+НС03~+С032"). В водах ю добывающих скважин 1008-1, 1017-2 и 1094-1 карбонаты становились изотопно более тяжелыми, что может быть объяснено предпочтительным использованием изотопно легких карбонатов метан оге нам и. Величина 6|3С метана попутного газа в ходе испытания биотехнологии существенно не изменялась (от -40.5 до -44.4%о).

Рис. 3, Содержание ацетата в пластовых водах из добывающих скважин залежи Кондиан в процессе испытаний биотехнологии

2.3. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в первичных посевах метаногенов из нефтяного месторождения Даган

Первичные посевы пластовой воды на средах Зейкуса с Н2+С02 и ацетатом, показавшие максимальную численность и скорость образования метана, были использованы для клонирования генов 16Б рРНК. Для этого из накопительных культур выделяли тотальную ДНК, которую использовали в качестве матрицы для ПЦР с универсальными архейными и бактериальными праймерами. Практически полноразмерный ген 16Б рРНК бактерий (1490 нуклеотидов) и фрагмент длиной около 1000 нуклеотидов архей были клонированы в вектор рвЕМ-Т. Полученная библиотека клонов состояла из 102 и 20 клонов со вставками генов 168 рРНК архей и бактерий соответственно (сообщество №1).

Филогенетический анализ созданной библиотеки клонов архей показал, что последовательности 165 рДНК архей относились к Н2-использующим метаногенам рода МеШапо^егтоЬаМег (вид МеЖапоЖегтоЬааег /ЬегтаиШгорЫсю) и 1 клон - к ТИегтососсш ¿¡Ыпсш (рис. 4). Филотипы ацетат-использующих метаногенов в исследуемых культурах метаногенов не были обнаружены.

Гены 16Б рРНК бактериальных клонов относились к порядкам ТЬегтоапаегоЬас1епа1ез (роды ТкегтоапаегоЬаШг, ТНегто\епаЪи1ит, ТИегтасе^ептт и Сорго1кеппоЪас1ег), Therraotogales, Шгшргакз (род ТИегтос1ези1/оу1Ьгю) и Р1апсШтусе1а1ез (рис. 5). Впервые в нефтяных пластах был обнаружен филотип бактерии Ткегтасе^епшт рЬаеит. Известно, что этот организм способен вступать в ассоциации с Н2-использующими метаногенами и разрушать ацетат до метана по синтрофному механизму. Процесс образования метана в такой бинарной ассоциации состоит из двух реакций: при участии ацетат-окисляющего организма Т. ркаеит ацетат разрушается до Н2 и С02, которые затем используются литоавтотрофным метаногеном. Термофильное синтрофное разрушение ацетата с образованием метана первыми обнаружили Давыдова-Чарахчьян и соавт. (1991). Из Мыхпайского нефтяного месторождения на среде с ацетатом была выделена бинарная ассоциация, терминальным компонентом которой являлся литоавтотрофный метаноген М. Легтоа1саИрЫ1ит. Однако бактериальный компонент, окисляющий ацетат до С02 и Н2, не был авторами выделен.

На основании полученных нами результатов было сделано предположение, что ацетат в высокотемпературном нефтяном пласте разрушается синтрофно при участии ацетат-использующего организма, возможно, близкого к Т. ркаеит, и Н2-использующих метаногенов рода МеЖапоЖегтоЬааег.

0.0?

10®

ш

156

»

109

100

I А8т, ОТГ 2, БСШ97667 ■ МеЯмпойегтеЬаеКг сЦфпИ УШ 2-1952* Х?9045 М. &еттвз1п>рЫаа СС-1, АУ196661 4£ АегторЫЬв \'КМ В-178ЙТ, Х99С48 М. ФетаЯта УКМ В-19вЗт, Х99047 М. ЯттяиШгоШет ёеНа Нт. АУ1Рббб0 IМ. и>оШ 05М 2970т. АВ104858 'д/. &етаяМгерЫс1а КНТ-2, АВЭМ530 А5ш. ОН? 1. ВО09"?бб6

X

таЛт^етН МагЬш'? , АН}95262 Нигт^авърШсш 2И-3,237156

МгЙыво-Ьас(епакз

Г А4ш, ОТ1Т 4, Б0097<569 вТ|г иасв1яаед агсЬаеоя сЗопе 1.СА, АВ034243

ш» А1ш. ОТ1" 3. Б0097ббЗ А10ш. ОТО 5. В0097670

М*гк<твЬге\%Ъасгег АУ196656

Ш2Г"

166

I

100

55

ШФокеЬлсШит/ЬтМсш 05М1312, М3«508 ШкапоЫиГегШ Ш и074т,Х99044 МегЬ.акососаа гат1еШ ЕУЗЗ, М36507

Гпегтососсш «/егВБМ 2476*, Ш1529 ТЬгтосоеж: аеМамЬюголвти СШ11905% АЛ91807 ТЬеппасосси;акаЬрЫЬя В&М 10322% АЛ9Ш2 Петссасаи ЫагаЗЬ ЬШ 3474, АУ099150 Ъягтесосав явхаавЪЗМ 12767, АУ099171 I "ТЫгтососст ямейевКг"<ЗТ 869,АУ099181 ЛТкегтососааИЪтеи: ММ739, АДЗЕ9Й АИбт, ОТи 6, Бд097671

НвЬЬасМл'ит каЫпт Р.1, М11553 — ТкетврШжв асИерЫЬт 122-1В2, М38637

ТЬегтпо-сяссаЫ

Рис. 4. Филогенетическое дерево генов 16Б рРНК архей, обнаруженных в накопительных культурах метаногенов из залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью "Ьоо1з№ар"-анализа 100 альтернативных деревьев (значащими признаются значения больше 90%)

Вб.оти 7, ю<2097672

Ьок СЬС (лат-р<ийте Ьайгпши 5А-5, АУ695536 Лттатеготопаз гоуоЬсии ТоВЕТ, АВ062280 Атпнтфх degar.sH КС4Т, 1134973 В11, оти 13, 0(2097678 ТЪеппасс^еъгит р'юеыт РБТ. АВ020336 Г""» ГпегтоапаегоЬааегеЛалоИсш ТО'-200Т, 109262 I г ТЬтпоапаегоЪасГег Ъго&Н 05М 1457т, 1.09165 1(Д. В20, оти 8,00097673

| ........ ПвтоггпаЬиЬая/етогуялотогат г-9801Т, АУ033493

100 I

-НооГ"В5, оти 10, БО097б75

||--В14, ОТи 11,1><20Э7676 юо»— В8, ОТС 12,00097677

СоргоЛегтеЬас/ег ргогво'уПаи АТСС 35245т, Х69335 1001 Ь_В9. оти 9,00097674

Сорго&сгтоЪаямрЫ«в»5 ЗЛТ, У08935 Шсп11игс<1 ТЬегшмогз!« с!опе АУ770968 В17, ОТО 14,00097679 100 | 1 Сеаго^а1.10658 1001 * ....................111 РеП-о1о2аяюйвтю 42-6*. Ы0657

г« Сорт аП_В9,< Сорт

у и «-]

ТЬегтоапаего-ЬлгГрил!«".

—— МатИоца сатт МУ1075, А3250439 СаЫоЮ£я/опНта В4, А1237665

РепШЬаатнт повозит АТСС 35602\ М59177

- ТЬтто*1рЬо а/Неапш ОВ7т, М83140 Шпяомга тагййт М5ВЕТ, АЕ001703

¡лриврМВит/еткШага DS.N1 270:т. Х86776 ' ■ КИгснтп тагта КЬ-295,1-3 5501 Тквгвах/еяй/аяЬгюуеЦокиопп УР£?7, Ы4619 ТкятгЫаиУЬтМо ЫатКсш Я1ЬаЗт, Х96726 Ткелпо^втЦогйто ¡р. ТСЕ-Р1, АВ021302 В19, оти 15,00097680 —— ветпипа оЫснгфоЪиз 0<2М 224бт, Х56305 100 с УоносоШд Лтасо/вШ Всп222, АГ244749 ......... ЬофЬаетраШа 963СГ. АЛ31195

О

* РЬтсйтусю 1ттарЫ!ш ШАМ 1008т, Х62911 — ГЧгеПи!а в/мПВМ бОбБ*. Х81946 иша«й£«1 Р1апсютус;Ыс5 0Р86, АГ027058

4

Т

984.

^ЩУпаШи! РЬпсишусмаЬ» ОРВ17, АР027057 981В21, ОТО 16, 00097681

Рис. 5. Филогенетическое дерево генов 16Б рРНК бактерий, обнаруженных в накопительных культурах метаногенов из залежи Кондиан. Масштаб - 2 замены на каждые 100 нуклеотидов

2.4. Филогенетическое разнообразие архей в пластовой воде из скважины 1066-1 залежи Кондиан

Для уточнения полученных результатов о биоразнообразии метаногенов в нефтяной залежи Кондиан, мы исследовали пробу пластовой воды из скважины 1066-1, расположенной на участке, гидродинамически изолированном от зоны испытания биотехнологии.

Был разработан метод отбора пробы пластовой воды для проведения молекулярно-биологических работ. Отбор пластовой жидкости (около 2 л) производили непосредственно на месторождении, добавляли Тритон XI00 (конечная концентрация 0.1%) и выдерживали в термостате при 60°С в течение 20-30 мин, что способствовало разделению фаз нефть-вода. Затем нефть из водной фракции экстрагировали гексаном. Водную фракцию собирали и фиксировали этиловым спиртом (1:1). Клеточную биомассу отделяли путем центрифугирования и использовали для выделения тотальной ДНК.

Созданная библиотека клонов включала 460 клонов со вставками 16S рДНК архей размером около 1000 п.н. Анализ клонов проводили путем секвенирования ДНК и ПЦР в реальном времени с праймером М400г, специфичным для рода Methanothermobacter. Секвенированные последовательности 16S рДНК распределились на две группы: первая группа из 26 клонов была близка М thermantotrophicus штамм GC-1, а вторая группа из 27 клонов - к штамму ZH3, который вместе со штаммом Marburg выделен в другой вид М marburgensis. ПЦР-анализ 397 клонов с использованием праймеров A109f и М400г для детекции вида А/. thermautotrophicus показал, что большая часть клонов имела положительный сигнал с данными праймерами.

Таким образом, молекулярно-биологический анализ пластовой воды залежи Кондиан подтвердил результаты изучения накопительных культур метаногенов и выявил абсолютное доминирование генов Н2-использующих метаногенов рода Methanothermobacter среди архейных клонов.

2.5. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в пластовой воде залежи Кондиан в ходе испытаний биотехнологии

Северный блок залежи Кондиан был основным объектом биотехнологического воздействия. На этом участке отмечали высокую численность термофильных метаногенов (104-105 кл/мл), максимальную скорость метаногенеза из NaHI4C03 и 14CH3-COONa и возрастание содержания растворимых карбонатов и летучих кислот (см. пп. 2.1. и 2.2).

Пластовые воды из скважин 1008-1, 1094-1 и 1017-3 были выбраны для молекулярно-биологического исследования с целью поиска в них ацетокластических метаногенов, а также изучения бактериального компонента этого сообщества.

Были созданы библиотеки клонов архей (212 клонов) и бактерий (503 клона) с использованием универсальных праймеров A109f-1041r и 8-27f-519г (сообщество №3). Секвенирование первой группы клонов выявило наличие доминантных последовательностей 16S рДНК в каждой библиотеке. Клонированные фрагменты 16S рДНК архей относились к виду М. thermautotrophicus Delta Н. Гены 16S рРНК бактерий были близки представителям рода Sphingomonas. Для упрощения процедуры идентификации клонов нами были использованы родо-специфичные праймеры: М400г, специфичный для Methanothermobacter sp., и праймер Sphl96r - для скрининга клонов, относящихся к роду Sphingomonas.

Анализ 181 клона со вставками 16S рДНК архей позволил установить доминирование филотипов Н2-использующих метаногенов семейства Methanobacteriaceae (164 клона); 5 клонов содержали вставки 16S рДНК метаногенов пЬрядка Methanosarcinales (Methanosaeta thermophila, Methanomethylovorans thermophila), 2 клона несли вставки некультивируемых представителей порядка Methanomicrobiales и 10 клонов относились к группам, в которых нет культивируемых представителей (рис. 6).

В библиотеке клонов 16S рДНК бактерий 333 клона из 464 проанализированных с помощью специфичного праймера Sphl96r относились к роду Sphingomonas. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 124 клонов выявил представителей следующих классов и филогенетических групп бактерий (число клонов): а-протеобактерии (40), ß-протеобактерии (17), у-протеобактерии (28) и 8-протеобактерии (1), Clostridia (13), Thermotogae (8), Dictyoglomi (5), Bacteroidetes (3), Actinobacteria (1) и Nitrospirae (1) (рис. 7).

Протеобактерии доминировали в составе сообщества и были представлены родами мезофильных аэробных органотрофных бактерий. Следующей по представленности была группа клостридий, которая включала термофильных бактерий родов: Desulfotomaculum, Thermoanaerobacter, Thermoterrabacterium, Thermacetogenium,

Thermovenabulum. В составе микробного сообщества были выявлены также термофильные бактерии с бродильным типом метаболизма (Fervidobacterium, Thermotoga, Dictyoglomus, Pedobacter и Dysgonomonas) и синтрофных бактерий, близких Т. phaeum и Thermovirga lienii (сем. Syntrophomonadaceae).

Рис. 6. Филогенетическое разнообразие генов 165 рРНК архей в пластовой воде Северного блока залежи Кондиан. 1 - М. ¡ИегтаиШгорЫсиз, 1 -М&ИапояаеШ /ЬегторИНа, 5 - Ш(Ьапоте\ку1очогат МегторИНа, 4 -М еЛ а п о гшсгоЬ ¡а! е5, 5 - не культивируемые археи

□ AI phap i oteo bacter i a 0BeUproteobactena

j

düarmriaproteebactera IE Deila proteohacteria

i

□ Clostridia

□ Thermotogae El Dictyogloirti S Bactcroidctes

□ Actinobücteria ■ N'itrospirae

Рис. 7. Распределение по филогенетическим группам 168 рДНК бактерий из сообщества пластовой воды Северного блока залежи Кондиан

2.6. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в накопительной культуре, образующей метан из ацетата

Проведен филогенетический анализ накопительной культуры, устойчиво образующей метан на среде с ацетатом. Архейный компонент данной культуры был представлен одним филотипом - M thermautotrophicus (95 клонов). 16S рДНК бактерий относились к 2 родам бактерий - Thermoanaerobacter (новый род Caldanaerobacter, Fardeau et al., 2004) (45 клонов) и Thermotoga (1 клон). Филотипы ацетат-использующих архей на среде с ацетатом не были обнаружены.

2.7. Выделение чистых культур анаэробных микроорганизмов из нефтяного месторождения Даган

Выделены две чистые культуры Н2-использующих метаногенов -штаммы KZ3 и KZ24a. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК выделенных культур показал, что штамм KZ3 имеет 99% сходства с видом M. thermoautotrophicus Delta Нт, а штамм KZ24a - с Meîhanothermobacter wolfeii DSM 2970т.

Выделенные штаммы росли в интервале температуры от 37 до 65°С. Оптимальная температура для роста штамма KZ3 составляла 60°С, а для штамма KZ24a - 65°С. Оптимальное значение солености среды для обоих штаммов составляло 0-0.5% NaCl. Оба штамма использовали Н2+С02 в качестве источника углерода и энергии; не использовали ацетат, пируват, пропионат, метанол, этанол и 3-этиламин.

Из накопительных метаногенных культур на ацетате были выделены 10 штаммов анаэробных бактерий, имеющих сходную с T. phaeum морфологию клеток. В качестве субстрата для выделения был использован пируват натрия (Li, Zinder, 1988; Hattori et al., 2000). Выделенные культуры были идентифицированы путем секвенирования гена 16S рРНК и оказались близкими (99.6%) бактерии Thermoanaerobacter ethanolicus. Более детально были охарактеризованы два штамма 1017-7Ь и 1017-7d.

Бактерии росли в интервале температур от 40 до 70°С, с оптимумом около 60°С. Рост отсутствовал при 35 и 75°С. Оба штамма росли при содержании от 0 до 2% NaCl в среде с оптимумом 0.5% NaCl. Штаммы использовали глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, рибозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, крахмал и пируват; не использовали арабинозу, раффинозу, рамнозу, трегалозу, метанол, этанол, ацетат, лактат, глицерин и маннит. Оба штамма росли в среде с глюкозой в присутствии тиосульфата как акцептора электронов, восстанавливая его при этом до сульфида. Сульфат, нитрат и нитрит не восстанавливали.

2.8. Взаимоотношения термофильных микроорганизмов при разрушении ацетата с образованием мегана

Для реконструкции синтрофного роста на среде с ацетатом чистые культуры метаногена МеОшпоМегтоЬаШг и ТИегтоапаегоЬааег были объединены. Было обнаружено, что бинарная культура МеОгапоЖегтоЪас(ег-ТИегтоапаегоЬаШг превращает ацетат в метан. Образование метана наблюдали только в случае бинарных культур, в отдельности каждая культура метан не образовывала. Подобный эксперимент, проведенный с использованием радиоизотопно меченого ацетата, подтвердил, что метан из меченого ацетата образовывался только в случае бинарной культуры (рис. 8).

Рис. 8. Образование метана из |4СН3-С00№ накопительной культурой (24Ас), чистыми и бинарными культурами метаногена МегИагиЛНегтоЬШег К23 со штаммами ТИегтоапаегоЬааег 1017-7Ь (ТЬ) и Оет1/оЮтаси1ит кшгШасми 17т (О.к) за 1 сут. инкубации при 60°С; К -контроль (среда с посевом и меченым ацетатом, фиксированная раствором КОН)

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования биоразнообразия, численности и активности микроорганизмов высокотемпературных горизонтов залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган с использованием микробиологических, радиоизотопных и молекулярно-биологических методов позволили выявить разнообразное и геохимически активное микробное сообщество. В составе сообщества обнаружены аэробные

органотрофы, анаэробные бактерии и археи с бродильным типом метаболизма, сульфатредуцирующие и синтрофные бактерии и метаногенные археи.

В ходе испытаний биотехнологии повышения нефтеотдачи отмечено увеличение численности микроорганизмов основных физиологических групп. Наибольший эффект наблюдался в призабойной зоне нагнетательных скважин. В результате поступления образованных аэробными бактериями продуктов окисления нефти в зону добывающих скважин происходила стимуляция анаэробной микрофлоры пласта. Основным терминальным процессом в практически бессульфатных водах месторождения Даган являлся метаногенез. В ряде добывающих скважин значительно возрастала численность метаногенов и скорость процесса метаногенеза. При этом предпочтительным субстратом для метаногенеза был ацетат.

Проведено исследование филогенетического разнообразия микроорганизмов путем клонирования генов 16S рРНК из накопительных метаногенных культур и пластовой воды внутри и вне зоны биотехнологического воздействия. Анализ более 800 архейных клонов позволил установить доминирование в изучаемых сообществах филотшхов метаногенов порядка Methanobacteriales, для которых основным субстратом метаногенеза является Н2+С02. Филотипы ацетат-использующих метаногенов не были обнаружены в первичных посевах метаногенов и в исходной пластовой воде. Только при увеличении концентрации ацетата (до 160 мг/л) в ходе биотехнологического воздействия в водах Северного блока залежи нами было обнаружено 5 филотипов ацетат-использующих метаногенов (из 800 исследованных).

Анализ генов 16S рРНК бактерий из накопительных метаногенных культур показал их принадлежность к порядкам Thermoanaerobacteriales (роды Thermoanaerobacter; Thermovenabulum, Coprothermobacter и Thermacetogenium), Thermotogales, Nitrospirales (род Thermodesulfovibrio) и Planctomycetales. Впервые в высокотемпературном нефтяном месторождении нами был выявлен ген 16S рРНК бактерии, близкой к Thermacetogenium phaeum, способной окислять ацетат при синтрофном росте с литоавтотрофными метаногенами.

В бактериальном сообществе пластовой воды Северного блока было обнаружено 30 филогенетических групп термофильных и мезофильных бактерий. Репрезентативные филотипы относились к классам a-, ß-, у- и 6-протеобактерий, Clostridia, Thermotogae, Dictyoglomi, Bacteroidetes, Actinobacteria и Nitrospirae. Были обнаружены также филотипы синтрофных бактерий, близких к Т. phaeum и Thermovirga lienii (сем. Syntrqphomonadaceae).

Основываясь на результатах филогенетических исследований, нами было высказано предположение о существовании синтрофных ассоциаций между метаногенами и ацетат-окисляющими организмами, которые совместно разрушают ацетат до метана в условиях пласта.

Из накопительных метаногенных культур на среде с ацетатом были выделены чистые культуры Н2-использующих метаногенов (М гкегтаиШгорЫст') и анаэробных органотрофных бактерий (ТИегтоапаегоЬас(ег е&апоИст). Предпринимавшиеся попытки выделения ацетат-использующих метаногенов оказались безуспешными. Для реконструкции синтрофного роста на среде с ацетатом были объединены чистые культуры метаногена и ТИегтоапаегоЬас1ег. Было обнаружено, что бинарная культура МеШапмкегтоЬааег-ТкегтоапаегоЬаМег разрушает ацетат до метана.

Экологическая функция бактерий группы Т ИегтоапаегоЬа^ег-СаМапаегоЬаМег ранее была не ясна, хотя эти бактерии являются обычными обитателями подземных нефтеносных горизонтов. В нашей работе мы показали, что бактерии родов ТНегтоапаегоЪасгег-Са1с1апаегоЬас!ег в присутствии метаногенов способны участвовать в синтрофном окислении ацетата до Н2 и С02, который затем восстанавливается в метан.

Таким образом, проведенные исследования позволили уточнить состав микробной трофической цепи, оценить геохимическую деятельность микроорганизмов и получить качественно новую информацию о терминальных этапах биодеградации нефти в высокотемпературных нефтяных пластах.

ВЫВОДЫ

1. Микробиологическими методами установлено, что в высокотемпературном нефтяном месторождении Даган обитают аэробные нефтеокисляющие бактерии и анаэробные органотрофы с бродильным типом метаболизма, сульфатредуцирующие бактерии, а также метанобразующие микроорганизмы, растущие на Н2+С02 и ацетате. Радиоизотопными методами в нефтяном пласте зарегистрированы процессы современного образования метана за счет восстановления водородом растворенных карбонатов и разрушения ацетата.

2. Методом анализа генов 16Б рРНК пластовой воды показано, что анаэробные микроорганизмы нефтяного пласта были представлены термофильными бактериями и археями с бродильным типом метаболизма {ТкегтоапаегоЬас1ег, ТкегтогеггаЬа^егшт, ТкегтоуепаЬиЫт,

Fervidobacterium и Thermoîoga), сульфатредуцирующими (Thermodesulfovibrio, Thermacetogenium и Desiilfotomaculum) и синтрофными (Thermovirga) бактериями и метанобразующими археями (Methanothermobacter). Филотипы аэробных бактерий были близки мезофильным представителям родов Sphingomonas, Pseudomonas, Rhodococcus, Thauera и др., известных способностью к окислению нефти.

3. Установлено доминирование в нефтяном пласте вида Methanothermobacter thermautotrophicus, для которого основным субстратом метаногенеза является Н2+С02. Гены 16S рРНК ацетат-использующих метаногенов не обнаруживались в исходной пластовой воде и были выявлены при увеличении концентрации ацетата в ходе биотехнологического воздействия.

4. Из накопительных культур, образующих метан из ацетата, выделены чистые культуры метаногенов, относящиеся к видам Methanothermobacter thermautotrophicus и Methanothermobacter wolfeii, и анаэробных органотрофных бактерий вида Thermoanaerobacter ethanolicus. Метаногены росли в широком интервале температуры (от 40 до 70°С) и использовали водород-углекислотную смесь.

5. Показано, что разрушение ацетата с образованием метана в высокотемпературных нефтяных пластах осуществляется за счет синтрофного роста ацетат-окисляющих микроорганизмов и Н2-использующих метаногенов. Окисление ацетата до Н2 и С02 осуществляют представители группы Thermoanaerobacter-Caldanaerobacter, реакция разрушения ацетата становится возможной в присутствии метаногенов рода Methanothermobacter, использующих молекулярный водород.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи

1. Nazina T.N., Sokolova D.Sh., Grigoryan A.A., Shestakova N.M., Mikhailova E.M., Poltaraus A.B., Tourova T.P., Lysenko A.M., Osipov G.A., Belyaev S.S. Geobacillus jurassicus sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated firom a high-temperature petroleum reservoir and the validation of the Geobacillus species. // System. Appl. Microbiol. 2005. V. 28. P. 43-53.

2. , Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Шестакова H.M., Григорьян А.А., Михайлова Е.М., Бабич Т.Л., Лысенко А.М., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Циньсян Фенг, Фангтиан Ни, Беляев С.С. Филогенетическое разнообразие аэробных органотрофных бактерий из высокотемпературного нефтяного месторождения Даган. // Микробиология. 2005. Т. 74. № 3. С. 401-409.

3. Назина Т.Н., Шестакова Н.М., Григорьян А.А., Михайлова Е.М., Турова Т.П., Полтараус А. Б., Циньсян Фен, Фангтиан Ни, С.С. Беляев. Филогенетическое разнообразие и активность анаэробных микроорганизмов высокотемпературных горизонтов нефтяного месторождения Даган (КНР). // Микробиология. 2006. Т. 75. № 1. С. 70-81.

4. Shestakova N.M., Grigoryan А.А., Qingxian Feng, Fangtian Ni, Belyaev S.S., Poltaraus A.B., Nazina T.N. Characterization of the methanogenic community from the high-temperature Dagang oil field (P.R. China). // In: New Research on the Environment and Biotechnology. A.E. Kuznetsov and G.E. Zaikov (editors). Nova Science Publishers, Inc., New York. 2006. P. 159-174.

5. Назина Т.Н., Григорьян А.А., Шестакова H.M., Бабич Т.JI., Ивойлов B.C., Фенг Ц., Ни Ф., Ванг Д., Ше У., Сиан Т., Луо Ж., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологические исследования высокотемпературных нефтяных пластов залежи Кондиан в связи с испытанием биотехнологии повышения нефтеизвлечения. // Микробиология. 2007. Т. 76. № 3.

6. Назина Т.Н., Григорьян А.А., Шестакова Н.М., Бабич Т.Л., Павлова Н. К., Ивойлов B.C., Фенг Ц., Ни Ф., Ванг Д., Ше У., Сиан Т., Мей Б., Луо Ж., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологические и продукционные характеристики высокотемпературной нефтяной залежи Кондиан в процессе испытания биотехнологии повышения нефтеотдачи. // Микробиология. 2007. Т. 76. № 3.

Тезисы

1. Шестакова Н.М., Григорьян А.А., Турова Т.П., Назина Т.Н., Беляев С.С., Полтараус А.Б. Характеристика метаногенного сообщества высокотемпературного нефтяного месторождения Даган (КНР). // Материалы Третьего Московского Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, Россия, 1418 марта 2005 г. ч.2. С. 253.

2. Nazina T.N., Grigoryan А.А., Shestakova N.M., Sokolova D.S., Babich T.L., Mikhailova E.M., Feng Q., Ni F., Poltaraus A.B., Belyaev S.S., Ivanov M.V. From microbial ecology to the microbial enhancement of oil recovery (MEOR) of high-temperature petroleum reservoirs. 1. Characterization of a microbial community from the Dagang high-temperature oil field (P.R. China) by culture-based, radioisotopic and molecular methods. // Abstracts of the Joint International Symposia for Subsurface Microbiology (ISSM 2005) and Environmental Biogeochemistry (ISEB XVII). P. 121. Jackson Hole, Wyoming, August 14-19,2005. P. 121.

3. Nazina T.N., Grigoryan A.A., Wang J., Feng Q., Ni F., Xiang Т., She Y., Yao H., Belyaev S.S., Ivanov M.V. From microbial ecology to the microbial

enhancement of oil recovery (MEOR) of high-temperature petroleum reservoirs. 2. Biogeochemical changes in the Dagang high-temperature oil field in the course of application of a biotechnology of enhancement of oil recovery. // Там

4. Shestakova N.M., Feng Q., Ni F., Belyaev S.S., Poltaraus A.B., Nazina T.N. Syntrophic acetate degradation in the high-temperature petroleum reservoir. // In abstracts of 11 Int. Symp. On Microbial Ecology - ISME-11. Vienna, Austria, August 20-25,2006. P. A112.

5. Шестакова H.M., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Беляев С.С., Назина Т.Н. Роль синтрофных процессов в разрушении ацетата с образованием метана в высокотемпературных нефтяных пластах. // Тезисы II Международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии". 1-3 ноября 2006 г., г. Москва. Изд. Макс-Пресс. С. 42-43.

же. Р. 98.

Принято кисполненшо 21/03/2007 Исполнено 22/03/2007

Заказ №213 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шестакова, Наталья Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИ I ЕРА ГУРЫ

1.1. Физико-химическая характеристика нефтяных пластов как среды обитания микрооринизмов

1.2. Распространение и геохимическая деятельность микроорганизмов в высокотемперат>рных нефтяных пластах

1 3. Биорашообразие термофильных микроорганизмов и* нефтяных пластов

1.3 1. Сульфатредуцирующие бактерии

1.3.2. Меганобразующие микроорганизмы

1.3 3 Бактерии и археи с бродильным типом метабопизма

1.3.4. А пробные ор1 анотрофные и нефтеокисляющие бактерии

1.4 Результаты молекулярно-биологических исследовании микробных сообществ высокотемпературных нефтяных пластов

1.5. Синтрофные взаимоотношения микроорганизмов в термофильных мстаногенных сообществах

Введение Диссертация по биологии, на тему "Филогенетическое разнообразие и активность микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов"

Присутствие микроорганизмов в нефтяных пластах было устаиовтено около 100 лег наш Опубпикован ряд обзорных материалов по нефтяной микробиологии с подробным описанием микроор1анизмов основных физиологических групп (Розанова, Кузнецов, 1974; Magot et al., 2000, Назина, Беляев, 2004). И$ нефтяных пластов выделены анаэробные микроорганизмы, восстанавливающие сульфат, тиосульфат, Fe(3+) и элементную серу, бродильные бактерии, ацетшены и метано! ены (Magot et al., 2000, Steuer et al., 1993; Takahata et al., 2000; Orphan et al., 2000, 2003; Bonch-Osmolovbkaya et al, 2003). Для выяснения бактериального разнообразия и активности микроор1анизмов, обитающих в нефтяных пластах, были использованы культуральные, радиоизотопные, молекулярно-биоло! ические и бжмеохимические методы. В большинстве работ эти методы применялись раздельно, что не пош>ляло расшифровать структуру микробного сообщества в целом и оценить его геохимическую деятельность

Мотекулярно-биологические методы, основанные на выделении тотальной ДНК из природного образца с последующей амплификацией фрагментов ichob 16S рРНК и детальным анализом нуклеотидных последовательностей, начали исполыоваться для исследования микробных сообществ нефтяных пластов сравнительно недавно. Изучению разнообразия ieiiOB 16S рРНК в высокотемпературных нефтяных месторождениях посвящены тотько три работы (Orphan et al., 2000, 2003, Bonch-Osmolovskaya et al., 2003, Li et al., 2006). Например, в нефтяных пластах Калифорнии с температурой 50-125°С были обнаружены i сны 16S рРНК известных термофильных (ihermococcus, Petrotoga, Thermoanaerobacter, Methanothermobacter, Methcmococcus и Methanoculleus) и мезофильных микроорганизмов (Desulfothiovibrio, Aminobacterium, Acidammococcus, Pseudomonas, Halomonus, Acinelobacter, Sphmgomonas, Methylobacterium, Desulfomicrobium и Methanosarcina) и новых архей и бактерий (Orphan et al., 2000, 2003). Культуральными методами были выделены водород-использующие меганогены родов Methanothermobacter (растущие при 60-70°С), Methanococcus (60-80°С) и Methanoculleus (60-70°С). В нефтяной формации Монтереи был обнаружен также ген 16S рРНК нового, вероятно, ацетокластическою метано!ена, формирующего отдельную вегвь внутри порядка Methanobarcinales.

Радиоизотопными методами japei истрировано образование метана из ЫаН,4СОз и мСНз-СО(Жа в пластах с температурой до 60-80°С, что укашвает на существование термофильных прокариот, осуществляющих эти процессы в нефтяных пластах (Beljaev, Bor/enko\, 1993; Розанова и соавт., 1995, 1997; Nazina et al., 1995, 2000, Bonch

Osmolovskaya et al, 2003)

Метанобразующие микроорганизмы нефтяных пластов являются наименее исследованном группой прокариот. Первые чистые культуры метано! енов из нефтяных пластов были выделены С С Беляевым и соавторами (1986; Belyaev et al., 1983; Образцова и соавт., 1987; Давыдова-Чарахчьян и соавт., 1992; Davidova et al., 1997) Метаногены, окисляющие водород с одновременным восстановлением у1лекислоты в метан, являются обычными обитателями нефтяных пластов, имеющих температуру от 20 до 80°С (Magot et al., 2000). Мезофильные водород-исполыующие метаногены принадлежат к видам Methanobciclerium bryantii, Methanobacterium ivanovu, Methanoplanus petrolearim. Хотя в настоящее время известны гипертермофильные метаногены, растущие при 110°С (Kurr et al., 1991), подобные орынизмы в нефтяных пластах пока не обнаружены. Из высокотемпературных нефтяных пластов США, Северною моря и Западной Сибири выделены водород-использующие метано1ены, принадлежащие к видам MethanothermobaUer ihermaut atrophias (=\fethanobacternim thermoalcaliphilum), Methanothermobacter thermoaggregam и Methanococcus thermolithotrophicus (Давыдова-Чарахчьян и соавт., 1992 a; Ng et al., 1989; Nilsen, Torsvik, 1996).

Органотрофные метаногены, иснолыующие ацетат, метанол и метилированные амины, часто растущие также и на Н1+СО2, пока изолированы и 5 нефтяных пластов, температура которых не превышаег 50°С (Назина, Беляев, 2004).

Анализ имеющихся публикации свидетельствуег о том, что применение лишь одною из методов не достаточно для описания микробного сообщества нефтяных пластов. Комплексный подход с использованием микробиоло1Нческих методов (определение численности бактерий, выделение чистых культур), молекулярно-биолог ических методов анализа i енов 16S рРНК, а также радиоизотопных меюдов оценки скоростей биогенных процессов позволяет описать разнообразие микроорганизмов, установить метаболические связи в природных сообществах и оценить роль микроорганизмов в биогеохимических циклах. Таким образом, проведение комплексных исследований высокотемпературных нефтяных пластов представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явпяется выяснение филогенетической стр)ктуры, численности и активности микробною сообщества высокотемперат)рных нефтяных пластов (на примере нефтяного месторождения Даган) с использованием микробио ioiических, молек>лярно-биологических и радиоизотопных методов.

Для достижения цели было необходимо решить след)ющие задачи.

1. Определить численность микроорганизмов основных метаболических гр>пп и оценить скорости процессов сульфатредукции и меганогенеза в пластовых водах нефтяного месторождения Даган.

2. Выяснить филогенетическое разнообразие микроорганизмов в накопительных культурах метаногенов и в микробном сообществе пластовой воды мопекулярно-биологическим методом анализа генов 16Б рРНК.

3. Выделить чистые культуры метано1енов из нефтяного пласта и определить их физиолого-биохимические признаки и таксономическое положение.

4. Исследовать взаимоотношения микроор1анизмов при разрушении ацетата с образованием метана.

Научная новизна работы. Впервые применен комплексный подход к описанию микробною сообщества высокотемпературного нефтяного месторождения С использованием радиоизотопных методов дана количественная оценка скоростей сульфатредукции и метано1енеза. Методом анализа 1енов 16Я рРНК пластовой воды показано, что анаэробные микроорганизмы нефтяною пласта были представлены в основном термофильными бактериями и археями с бродильным типом метаболизма, сульфатредуцирующими, метанобразующими и синтрофными микроорганизмами. На основании результатов изучения фило1енегического разнообразия микроорганизмов в накопительных метаногенных культурах и в сообществе пластовой воды установлено, что разрушение ацетата с выходом метана при 60°С осуществляет синтрофная ассоциация микроор1анизмов Ме1Иапо1ЬегтоЬас1ег-ТИегтоапаегоЬас(ег. Из ассоциации выделены чистые культуры метаногенов и анаэробных оргапотрофпых бактерий, относящиеся к видам \tethimoihermobaLter (кегтаиингорЫст и '/ ИегтоипиегоЬасЧег еМапоИсш соответственно. Эти микроорганизмы не росли на ацетате по отдельности. Реакция разрушения ацетата с образованием метана становилась возможной при совместном росте бактерии рода 7НегтоапаегоЬаМег, окисляющих ацетат до Нт и ССЬ, и Нг-использующих метаногенов рода МмИатнкегтоЬааег Участие бактерий родов ТИеппаапаегоЬасЧег-СаЫапаегоЬаиег в терминальных процессах разрушения органического вещества нефти совместно с метаногенами расширяет представления об их роли в функционировании микробною сообщества высокотемпературных нефтяных пластов

Научно-практическая значимоаь раб(>1ы. Результаты из)чения микроорганизмов нефтяною пласта подтверждают возможность применения биотехночо1ии увеличения нефгеизв ючения, основанной на внесении кислорода воздуха и минеральных солей азота и фосфора, для активации микроор1анизмов высокотсмперат)рных нефтяных пластов. Установленные закономерности функционирования термофильною микробного сообщества мо1ут быть использованы для создания новых биотехнологии иол>чения метана и i остаточной нефти и пласте.

Соискателем усовершенствован метод отбора и фиксации пластовой воды для проведения молекулярно-биологических исследований и оптимизированы условия выделения ДНК с последующей амплификацией генов 16S рРНК. Созданы праимеры для детекции представителей родов Meihanothermobacter, Sphingoinonus и Pseudomonas в накопительных культурах и природных образцах.

Исследования выполнялись в 2002-2007 п. при финансовой поддержке i-рантов РФФИ (№№ 01-04-49250, 02-04-39002, 05-04-39029, 06-04-58722-3, 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании (КНР, контракт № DFT04-122-IM-18-20RU), грантов Американскою фонда гражданских исследовании и развития (CRDF, RBO-1364-МО и RBÜ-I364-MÜ-02), Миннауки РФ (Ведущие научные школы, руководитель академик РАН М.В. Иванов, грант № 02.445.11.7409).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 3-м Международном конгрессе "Ниотехнолог ия: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), на объединенном международном симпозиуме по микробиологии подземных экосистем (1SSM 2005) и биогеохимии (ISEB XVII) (Джексон Холл, США, 2005), на 11-ом международном симпозиуме по микробной экологии (ISME-11, Австрия, Вена, 2006) и 2-ой II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробио.'книи» (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, включая 6 статей и 5 тезисов докладов.

Место проведения работы. Работа проводилась в Институге микробиологии им. С.Н. Винофадского РАН (лаборатория нефтяной микробиологии) под руководством д б н Г.И. Иамной и в Институте молекулярной биологии им. В.А. Эшельгардта РАН (лаборатория структурно-функциональной геномики, ЦКП «Геном») иод руководством к.б.н. А.Б. Полтарауса В отдельных этапах работы принимали участие B.C. Ивойлов, A.A. Григорьян, ЬМ. Михайлова, И.К. Павлова, 'I.JI. Бабич и Д.Ш. Соколова. В полевых исследованиях на нефтяном месторождении Китая участвовали Фет Циньсян, Лию Мин, Ни Фанггиан (Даинская нефтяная компания, КНР). Геносистсматические работы проводили совместно с к.б н. Г.П. 'Гуровой.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Г.П. Нашной, профессору, д.б.н. С.С. Беляеву, к.б.н. А.Б. Полтараусу и к б н Г.П. Туровой $а постоянное внимание, потезные советы и помощь при выполнении работы и обсуждении ре$ультатов. Автор приносит благодарность всем участникам работы, а также коллегам и дру и,ям за содействие и поддержку.

Объём и (мруктура диссертации. Материалы диссертации изложены на 183 страницах машинописною текста и включают 31 рисунок и 29 таблиц Диссертация состоит их разделов «Введение», «Обюр литературы», «Экспериментальная часть», включающая иывы «Объекты и меюды исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит 74 отечественные и 179 зарубежных наименовании.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шестакова, Наталья Михайловна

выводы

• г

1. Микробиологическими методами установлено, чго в высокотемпературном нефтяном месторождении Даган обитают аэробные нефтеокисляющие бактерии и анаэробные органотрофы с бродильным типом метаболизма, сульфатредуцирующие бактерии, а также метаиобразующие микроорганизмы, растущие на Н2+СО2 и ацетате. Радиоизотопными методами в нефтяном пласте зарегистрированы процессы современною образования метана за счет восстановчения водородом растворенных карбонатов и разрушения ацетата.

2. Методом анализа генов 16S pPIIK пластовой воды показано, что анаэробные микроорганизмы нефтяного пласта были представлены термофильными бактериями и археями с бродильным тИпом метаболизма (/hermoanaerobacter, Thermoterrabacterium,

Thermovenabulum, Fervidobacterium и Thermotoga), сульфатредуцирующими

Thermodesulfovtbrio, Thermacetogenium и Desulfotomaculum) и синтрофными

Thermovirga), бактериями и метанобразующими археями (Methanothermobacter).

Филотипы аэробных бактерий были близки мезофильным представителям родов 1

Sphingomonas, Pseudomonas, Rhodococcus, Ihauera и др., известных способностью к окислению нефти.

3. Установлено доминирование в нефтяном пласте вида Methanothermobacter thermautotrophicus, для которою основным субстратом метаногенеза является Н2+СО2. Гены 16S рРНК ацегаг-иснользующих метаногенов не обнаруживались в исходной пчастовой воде и были выявлены при увеличении концентрации ацетата в ходе биотехнологического воздействия.

4. Из накопительных культур, образующих метан из ацетата, выделены чистые I культуры метаногенов, относящиеся к видам Methanothermobacter thermautotrophicus и Methanothermobactet Wolfen, и анаэробных органотрофных бактерий вида Thermoanaerobacter ethanolicus. Мстаногены росли в широком интервале температуры (от 40 до 70°С) и использовали водород-углекислотную смесь.

5. Показано, что разрушение ацетата с образованием метана в высокотемпературных нефтяных пластах, осуществляется за счет синтрофного роста ацетат-окисляющих микроорганизмов -и Нг-использующих метаногенов. Окисление ацетата до 1Ь и СО2 осуществляют представители группы 7hermoanaerobacter-Caldanaerobacter; реакция разрушения ацетат'а становится возможной в присутствии метаногенов рода Methanothermobacter, исиочьзующих молекулярный водород.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования биоразнообразия, численности и активности микроорганизмов высокотемпературных горизонтов залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган с использованием микробиологических, радиоизотопных и молекулярно-биологических методов позволили выявить разнообразное и геохимически активное микробное сообщество. В составе сообщества обнаружены аэробные органотрофы и анаэробные бактерии и археи с бродильным типом метаболизма, « сульфатредуцирующие и синтрофные бактерии и меганобразующие археи. На основании полученных результатов мы уточнили предложенную ранее схему развигия микробиологических процессов в высокотемпературном заводняемом нефтяном пласте (Розанова, Иазина, 1982; Розанова и соавт., 1985; Назина, Беляев, 2004) (Рис. 31). Согласно современным представлениям, микробиологические процессы протекают в несколько стадий и связаны со степенью проникновения нагнетаемой в пласт воды. Па первом этапе аэробные-бактерии в иризабойной зоне нагнетательных скважин, куда проникает растворенный в нагнетаемой воде кислород, окисляют углеводороды нефти до более простых соединений. Образующиеся продукты (жирные и ароматические кислоты, а также низшие спирты) на следующем этане используются бродильными, метанобразующими, сульфатвосстанавливагощими и другими анаэробными микроорганизмами.

Нагнетание в нефтяной пласт зачежи Кондиан искусственно аэрированной воды, содержащей минеральные соли азота и фосфора, приводило к активации пластовой микрофлоры. Стимуляция была наибольшей в иризабойной зоне нагнетательных скважин.

В пластовых водах были обнаружены мезофильные и термофильные микроорганизмы, » возросла численность аэробных opi анотрофных и в том числе углеводородокисляющих * бактерий, а~ также анаэробных бактерий с бродильным типом метаболизма, сульфатвосстанавливающих и метанобразующих микроорганизмов.

Вопрос'о происхождении и распространении аэробных организмов в подземных нефтеносных горизонтах является дискуссионным. Мезофильные аэробные бактерии, встречающиеся . в высокотемпературном нефтяном пласте, вероятно, являются аллохтонными организмами. В нефтяные пласты они попадают вместе с закачиваемыми поверхностными видами. Очаг развития аэробных микроорганизмов ограничивается иризабойной зоной нагнетательных скважин. В зоне добывающих скважин, лишенной кислорода, аэробные бактерии лишаются основного акцептора электронов. Известно, что некоторые аэробные бактерии, выделенные из нефтяных месторождений, способны

Аэробные условия

Нефть

Углеводородокисляющие бактерии

Рис.31. 1рофическая цепь использовать нитраты как акцептор электронов, но нитраты, как правило, огсугсгвуюг в пластовых водах. Возможность сохранения жизнеспособности в течение длительного времени присуща спорообразу&щим бактериям. Бактерии рода СеоЬасШт выделены из нефтяных месторождений Узень (Казахстан), Ляохе и Да!ан (Китай), Самотлор и Мыхпайское (Западная Сибирь) и сверхглубоких горизонтов золотоносных пород (Южная Африка) (Ыагша е1 а!., 1995; №лпа е! а1., 2001; Назина и соавт., 2000, 2003, 2005; ПеПаип е! а1., 2006). Все эти термальные и географически удаленные местообитания относятся к Юрской 1еоло1ичеекой формации. Существование метаболически и генетически близких микрооринизмов в географически удаленных глубинных горизонтах одного геологического периода, может являться косвенным свидетельством автохтонной) происхождении таких микроорганизмов.

В зоне расположения эксплуатационных скважин наибольшии эффекг биотехнологического воздействия был отмечен в скважинах, характеризующихся хорошей I идродинамической связью с на1 нетательными скважинами. В результате проникновения образованных аэробными бактериями продуктов окисления нефти в зону добывающих скважин возросла численность бактерий с бродильным типом метаболизма (особенно в скважинах 1015-1, 1050-2, 1017-3), что отражает активацию всею подземного микробного сообщества.

Численность сульфатцедуцирующих бактерий в водах большинства исследованных добывающих скважин сохранялась на первоначальном уровне и возрастала лишь в чегырех скважинах (1002-1, 1050-1, 1050-3 и 1094-1). Скорость сульфатредукции была максимальной в при забойной зоне нагнетательных скважин как до биотехноло1 ического воздействия (19.9 мкг/Я2' л"1 сут"1), так и в ходе испытаний (200 - 3365 мм/Я2" л'1 сут') В большинстве-добывающих'скважин скорость сульфатредукции не изменялась, и только в » нескольких ^важинах она возрастала в 7-15 раз (147 - 297 мкг/Я2" л1 сут1). Сульфатредуцирующие бактерии и процесс образования сероводорода были отмечены нами в первичных посевах бродильных бактерии, а также в меганогенных культурах, растущих на среде с ацетатом без сульфата. Эго может свидетельствовать о метабиотических и, возможно, синтрофных взаимоотношениях между сульфатредуцирующими, бродильными и метанобразующими микроор1анизмами. Ранее сообщалось о оинтрофном разрушении ацетата мезофильной бинарной культурой, состоящей из ацстат-окисляющей бактерии и сульфатредуцирующей бактерии штамм 1105 (позднее отнесенной к-новому роду и виду йечШ/откгоЬшт ар\Иегопит) (Розанова, Назина, 1985; Розанова и соавт., 1988).

Основным терминальным процессом биодеградации нефти в практически бессульфатн^гх водах Кондиана являлся метаногенез. Метаногены были выявлены в средах с ацетатом и водород-углекислотной смесью. В процессе испытаний численность метаногенов возрастала с 102-103 до 104-106 кл/мл. Радиоизотопными методами метаногенез был зарегистрирован также на обоих субстратах (l4CIb-COONa и NaII14C03). >

Предпочтительным субстратом для метаногенеза был ацетат. Максимальные скорости образования метана из ацетата были отмечены в пластовых водах из нескольких добывающих' скважин (1002-1, 1008-1, 1017-4, 1017-5 и особенно 1094-1). Скорость метаногенеза, определенная в пластовых водах месторождения Даган до испытаний биотехнологий, была близка таковой в Мыхпайском и Талинском высокотемпературных нефтяных пластах Западной ¿ибири и нефтяных пластах Ляохе в КНР, которые также эксплуатируются с применением заводнения (Nazina et al., 1995, 2000; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003).

В ходе биотехнологического воздействия возрастало содержание бикарбоната и летучих жирных кислот. Так, концентрация ацетата в большинстве скважин до эксперимента составляла менее 5 мг/л. Биотрансформация нефти привела к увеличению концентрации ацетата в некоторых скважинах до 160 мг (рис. 3). При одновременном повышении содержания бикарбоната и ацетата в пласте процесс метаногенеза наблюдался, тем не менее, преимущественно за счет ацетата. Данное явление может быть объяснено конкуренцией за бикарбонат между мстаногенами и другими литоавтотрофными -организмами. Например, Нг-использующие сульфатредуцирующие бактерии поручают р этой борьбе преимущество, так как обладают большим сродством к субстрату. Более то^о, водород в функционирующей микробной системе, как правило, имеет связанную форму и участвует в различных межвидовых переносах. При высокой 1 « концентрации ацетата метаногены родов Methanosarcina и Methanoweta способны к прямой реакции .'образования метана путем отщепления метильной группы. Однако большинство представителей этих родов бактерий являются мезофильными организмами. Известно два термофильных ацетокластических метаногена Methanosarcina thermophila и Methanosaeta thermophila Однако чистые культуры таких метаногенов пока не выделены из высокотемпературных нефтяных пластов.

Возможен второй путь образования метана из ацетата - за счет синтрофных ассоциаций между ацетаг-окисляющим организмом и Нг-использующим меганогеном. Механизм такой реакции, предложенный Баркером и Ван Пилем в 1936 г., включает 2 стадии (Barker, 1936). На первом этапе происходит «окисление» ацетата до COi и Hi, на втором этапе СОг восстанавливается водородом до метана. При низкой концентрации ацетата в пласте реализуются предпочтительнее синтрофные процессы образования метана, а. не- ацегокластичеекого метаногенеза. Более тою, процесс синтрофною окисления'ацетата при высокой температуре является более энергетически выгодным по сравнению с ацетокластическим метаногенезом, и таким же процессом при низкой температуре (Schink and Stams, 2006).

Численность Нг-использующих метаногенов в реальных условиях пласта выше таковой на ацетате. Об'этом свидетельствуют посевы пластовой воды на селективные среды с водород-углекислотной смесыо или ацетатом в качестве субстрата. Поскольку в лабораторных экспериментах дается заведомо избыточное количество субстрата, то вырастают все жизнеспособные микроортанизмы.

Такое противоречие между численностью и активностью процессов меганогенеза в высокотемпературном месторождении Даган не оставило нас равнодушными Какой механизм образования метана реализуется в условиях высокотемпературного нефтяною

1 < пласта? Дальнейший эган исследований был связан с изучением филогенетическою разнообразия микроорганизмов путем клонирования 1ена 16S рРНК. С использованием универсальных архейных и бактериальных праймеров были созданы библиотеки клонов накопительных метаногенных культур (сообщество №1), пластовой воды скважины 10661 (№2), расположенной вне зоны биотехнологического воздействия, пластовой воды Северного блока залежи Кондиан (№3) в период испытаний биотехнологии и из накопительной культуры 24а, длительно растущей на ацетате (№4).

Анализ более 800 "архейных клонов путем секвенирования и использования Methanothermbbacter- специфичною праймера, позволил установить практически полное доминирование в изучаемых сообществах филотипов меганогенов порядка Methanobacteriales (вид Methanothermobacter thermautotrophicus). Основным субстратом метано1 енеза для представителей этого порядка является Н2+СО2. Филотипы метаног енов, способных использовать ацетат, не были обнаружены в первичных посевах метанотенов и в пластовой воде. Как отмечали выше, испытание биотехнологии повышения нефтеотдачи привело к значительному, увеличению содержания ацетата в водах опытною участка Северного блока залежи Кондиан. Анализ генов 16S рРНК архей из пластовой воды Северного блока действительно выявил ггесколько филотипов, относящихся к ацетат-использующим метаног енам, Были обнаружены 3 последовательности 16S рДНК, относящиеся к Methanosaeta thermophila и 2 - к некультивируемым представителям порядка Methanomwrobiales. 16S рДНК двух клонов принадлежали к метилотрофному метаногену Methanomethylovorans thermophila Среди архейных клонов обнаружен также ген 16S рРНК гипертермофилыгой археи с бродильным типом метаболизма

Thermococcus sihiricus. Из 802 проанализированных последовательностей 16S рДПК археи • »

762 отнесидйЕь к Н2-исиользующим метаногенам рода Methanothermobacter, 1 последовательность - к, 7hermococcus sibiricm, 5 последовательностей к представителям порядка Methanosarcinales и 2 - к некультивируемой архее порядка Mcthanomicrobiales. Таким образом, гены 16S рРНК термофильных ацетат-использующих метаногенов детектировались только при повышении концентрации ацегата в пласте в результате биотехноло! ическо! о воздействия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шестакова, Наталья Михайловна, Москва

1. Беляев С-С'., Иванов* М.В. Радиоизотопный меюд определения интенсивности бактериальною метанобраювания. // Микробиология. 1975. Т. 44. С. 166-168.

2. Беляев С.С., Лауринавичус К.С., Образцова А.Я., Горлатов С.Н., Иванов М.В. Микробиологические процессы в призабойной зоне нагнетательных скважин нефтяных месторождений. // Микробиология. 1982 а. Т. 51. С. 997-1001.

3. Беляев С.С., Образцова А.Я., Лауринавичус К.С., Иванов М.В. Би0л01ическиеособенности метанобразующих бактерий, выделенных из нефтяною месторождения. //Доклады'Академии наук СССР. 1982 б. Т. 266. С. 1483-1485.

4. Беляев С.С.,1 Образцова А.Я., Лауринавичус К.С., Безрукова Л.В. Характеристика палочковидных метаног енов нефтяною месторождения и описание МмкапоЬаМтит мйпот эр. поу. // Микробиология. 1986. Т. 55. N. 6. С. 1014-1020.

5. Беляев С.С., Роз'анова Е.П., Борзенков И.А., Чарахчьян И.А., Миллер Ю.М., Соколов М.Ю., Иванов М.В. Особенности микробиологических процессов в заводняемом нефтяном месторождении Среднего Приобья. // Микробиоло!ия. 1990 а. Т. 59. С.

6. Беляев С'.С., Борзенков И.А., Милехина К.И., Чарахчьян И.А., Иванов М.В. Развитие микробиолошческих процессов в разрабатываемых пластах Ромашкинского нефтяного месторождения.//Микробиоло1Ня. 1990 6. Г. 59. С. 1119-1125.

7. Беляев С С., Борзенков И.А., Назина Т.Н., Розанова Е.П., Глумов И.Ф., Ибатуллин

8. Р Р., Иванов М.В. Использование микроорганизмов в биотехноло1 ии повышения нефтеизвлечения. // Микробиология. 2004. Т. 73. С. 687-697.1075-1081.

9. Белякова Е.В. Таксономия и метаболизм новых термофильных и галофильной сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенных из месторождений углеводородов; // Автореф. дис. канд. биол. наук. М. ИНМИ РАН. 2006.

10. Бердичевская М.В. Влияние длительною заводнения нефтяной залежи на развитие биоценоза и активность пластовой микрофлоры. II Микробиология. 1982. I. 51. С. 146-151.'

11. Бердичевская М.В. Особенности физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей. // Микробиология. 1989. Т. 58. С. 60-65.

12. Бирштехер Э., Нефтяная микробиология. II Я. Гостоптехиздат. 1957. С. 314.

13. Борзенков И.'А-, Беляев С.С., Миллер Ю.М., Давыдова И.А., Иванов М.В.

14. Метаногенез в высокоминерализованных пластовых водах Бондюжского нефтяноюместорождения. // Микробиология. 1997. Т. 66. С. 122-129. 13. Гинзбург-Карагичева Т.Л. Микробиологическое исследование серно-соленых вод1.

15. Аийгерона-. // Азерб. нефт'.'хоз-во. 1926. № 3. С. 30-55.

16. Горленко В.М. -Кузнецова В.А. Бактериальное восстановление сульфатов при совместном культивировании Desulfovibrio desulfuricans и yi леводородокисляющих бактерий на минеральной среде с нефтью. // Прикл. биохимия и микробиол. 1966. Т. 2. С. 264-270.

17. Давыдова* Чарахчьян И.А., Кузнецова В.Г., Митюшина JIJI., Беляев С.С. Меганобр^зующие палочковидные бактерии из нефтяных месторождений 1атарии и Западной Сибири. //Микробиология. 1992 а. Т. 61. С. 299-305.

18. Давыдова-Чарахчьян И.А., Милеева А.Н., Митюшина JI.J1., Беляев С.С. Ацегогенные бактерии из нефтяных месторождений Татарии и Западной Сибири. // Микробиология. 1992 б. Т. 61. С. 306-315.

19. Добрянскии А.Ф. Геохимия нефти. // М. Гостоптехиздат. 1948.

20. Звягинцева И.С., Беляев С.С., Борзенков H.A., Кострикина H.A., Милехина H.H., Иванов М.В. Галофил^ные архебактерии из нефтяного месторождения Каламкасс. // Микробиология. 1995, Т. 64. С. 83-87.

21. Иванов М.„ В. Применение изотопов для изучения активности процесса редукции сульфатов в озере Беловодь. // Микробиология. 1966. Г. 25. С. 12.

22. Иванов М.В.,", Беляев С.С., Зякун А.М., Бондарь В.А., Лауринавичус К.С. Микробиологическое образование метана в разрабатываемом нефтяном месторождении. // Геохимия. 1983. Т. 11. С. 1647-1654.

23. Иванов М.В,, Беляев-С.С., Лауринавичус К.С., Образцова А.Я., Горлатов С.Н. Распространение и геохимическая деятельность микроорганизмов в заводняемом нефтяном месторождении. // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 336-341.

24. Колганова Т.В., .Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. Подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов 16S рРНК архей. // Микробиология. 2002. Т. 71. С. 283-285.

25. Кузнецов С.И. Изучение возможности современного образования метана в газонефтеносных фациях района Саратова и Бугуруслана. // Микробиология. 1950. Т. 19. С. 193-202. .

26. Кузнецова В А., Ли А Д. Закономерности развития сульфатвосстанавливающих бактерий в нефтяных пластах Д. Ромашкинског о месторождения при их заводнении. // Микробиология. 1964. Т. 33. С. 314-320.

27. Кузнецова, В.А., Ли 'А.Д., Тифорова H.H. Определение источников заражения сульфатвосстанавтивающими бактериями нефтеносных пластов Д. Ромашкинског о месторождения. // Микробиология. 1963. Т. 32. С. 683-688.

28. Кузнецова В.А., Горленко В.М. Влияние температуры на развитие микроорганизмов из .заводняемых пластов Ромашкинскою нефтяного месторождения. // Микробиология. 1965. Т. 34. С. 329-334.

29. Кузнецова З.И. Распространение бактерий в подземных водах и использование микробиологических данных для оценки нефтеносности. // М. ВСЕГИНГЕО. 1963. 44 С.

30. Кузнецова ЗИ., Швец В М. Органические вещества и микрофлора в подземных водах Фергану. // В сб. «Органические вещества и микрофлора подземных вод и их нефтепоисковое значение». 1970 а. Груды ВСЕГИНГЕО. Вып. 26. С. 70.

31. Куличевская И.С., Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Беляев С.С. Окисление углеводородов нефти экстремально галофильными архебактериями. // Микробиология. 1991. Т. 60. С. 860-866.

32. Лауринавичус К. С., Котельникова С. В., Образцова А. Я. Новые виды термофильных метанобразующих бактерий. Описание МаИапоЬааепит IИегторНИцт //Микробиология. 1988. Т. 57 С. 1035-1041.

33. Лауринавичус К.С. Беляев С.С. Определение интенсивности микробиологического образования метцна радиоактивным методом. // Микробиология. 1978. Г. 47. С. 11151117.

34. Методы исследования нуклеиновых кислот. // М. Мир. Ред. Гроссман Л., Молдейв К 1970.280 С.

35. Милехина Е.Й., Борзенков И.А., Миллер Ю.М., Беляев С.С., Иванов М.В. Углеводородокисляющая микрофлора заводняемых нефтяных месторожденииI

36. Татарии с различной минерализацией пластовых вод. // Микробиология. 1991. Г. 60. С. 747-756. ;

37. Назина Т.Н., Розанова Е.П., К&чининская Т.А. Фиксация молекулярного азота сульфатвосстацавливаюгцими бактериями из нефтяных пластов. // Микробиология. 1979. Т. 48! С. 133-136.

38. Назина Т.Н.'Образование молекулярного водорода под воздействием пластовой микрофлоры на нефть. // Микробиология. 1981. Т. 50. С. 163-166.

39. Назина 7.1,1. Сообщества метанобразующих бактерий из нефтяных пластов

40. Апшеронд. // Микробиология. 1984. Г. 53. С. 149-155.• • I

41. Назина Г.Н., Иванова А.Е.", Канчавели Л.П., Розанова E.II. Новая спорообразующая термофильная "метилотрофная сульфатвосстанавливающая бактерияI

42. Desulfotonlaculunikuznetsovu sp. nov. // Микробиология. 1988. Т. 57. С. 823-827.

43. Назина Т.Н.,' Иванова А.Е., Голубева О.В., Ибатуллин P.P., Беляев С.С., Иванов М.В. Распространение сульфат- и железоредуцируюгцих бактерий в пластовых водах Ромашкинского нефтяного месторождения. // Микробиология. 1995. Т. 64. С. 245251. .

44. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Ивойлов B.C., Миллер Ю.М., Ибатуллин P.P., Беляев• I

45. С.С., Иванов М.В. ' Микробиоло1ическая и 1сохимическая характеристикакарбонатных нефтяных коллекторов Татарии. // Микробиология. 1998. Т. 67. С. 694700.

46. Назина Г.Н., Иванова А.Е., Ивойлов B.C., Миллер Ю.М., Кандаурова Г.Ф.,•

47. Назина 1.Н*., Туррва Т.П., Полтараус А.Б., Новикова Е.В., Иванова А.Е., Григорьян

48. A.A., Лысенко A.M., Беляев С.С. Физиологическое и филогенетическое разнообразие термофильных спорообразующих углеводородокисляющих бактерии из нефгяных пластов. // Микробиология. 2000. Г. 69. С. 113-119.

49. Назина Т.Н. Микроорганизмы нефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи. // Дис. на соискание степени докт. биол. паук. М. 2000.67 с.

50. Назина Т.Н., 'СбкОлова Д.Ш., Григорьян A.A., Сюэ Я.-Ф , Беляев С.С., Иванов М.В. Образование нефтевытесняюгцих соединений микроорганизмами из нефтяною месторождения Дацин (КНР). // Микробиология 2003. Т. 72. С. 206-211.

51. Назина Т.Н„ Беляев С.С. Микроорганизмы нефтяных месторождений и использование их в биотехнологиях повышения нефтеизвлечения. // Сб. трудом Инта микробиологии. 2Ö04. С. 289-316.

52. Назина Т.Н., Шестакова Н.М., Григорьян A.A., Михайлова Е.М., Турова Т.П.,

53. Полтараус А. Б., 'Циньсян Фен, Фангтиан Ни, С.С. Беляев. Филогенетическоеразнообразие и активность анаэробных микроорганизмов высокотемпературныхfгоризонтов нефтяною месторождения Даган (КНР). // Микробиология. 2006. Т. 75. С. 70-81. '

54. Назина Г.Н., Григорьян A.A., Шестакова Н.М., Бабич Т.Л., Ивойлов B.C., Циньсян■

55. Фенг, Фащгтиан Ни, Джинциан Ванг, Уехие Ше, Тингшен Сиан, Жибин Jlyo, Беляев

56. С.С., Иванов М В.'- Микробиологические исследования высокотемпературных «нефтяных пластов залежи Кондиан в связи с испытанием биотехнологии повышения нефтеизвлечения. // Микробиология. 2007. Т. 76. С.

57. Образцова А.Я., Шипин О.В, Безрукова Л.В., Беляев С.С. Характеристика кокковидного метилотррфного метаногена Methanocuccoides euhalobius sp. nov. //

58. Микробиология. 1987. Т. 56. С. 661-665.t

59. Попова H.Äv, Николаев Ю.А., Турова Т.П., Лысенко A.M., Осипов Г.А., Верховцева Н.В., Паников Н.С. Geobacillus uralicus sp. nov. новый вид термофильных бацилл. // Микробиология. 2002. Т. 71. С. 335-342.

60. Розанова Е.П., Мехтиева H.A., Алиева II.I1I. Микробиологические процессы и коррозия металлического оборудования в заводняемом нефтяном пласте. // Микробиология. 1969.Т. 38. С. 860-867.

61. Розанова Е.П., Кузнецов С.И. Микрофлора нефтяных месторождений. // М. Наука. 1974. С. 198.

62. Романенко В.И., Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. // Л.t1. Наука. 1*774,, 196 С. ^•'г

63. Розайова E.II.j Худякова А.И. Новый бессиоровый термофильный организм,»восстанавливающий сульфаты, Desulfovibrio themophilus nov. ьр. II Микробиология. 1974. Т. 43, С. 1069-1073.

64. Розанова В.П., Назина Т.Н. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных нуасгах./7Микробиоло1ия. 1982. Г. 51. С. 342-348.

65. Розанова Е П., Назина Г.Н. Разложение ацетата бинарной сиитрофной ассоциацией,Iвключающей сульфатвосстанавливающие бактерии. // Микробиология. 1985. Т. 54.1. N. 3. С. 497-499.1

66. Розанова E.H., Назина Т.Н, Кулик Е.С., Сомов Ю.П. Микробиологическоеобразование метана цз 1ексадекана. // Микробиоло1ия. 1985. Г. 54. С. 555-559.

67. Розанов^ . Е.П.; Назина Т.Н., Галушко A.C. Выделение новою рода сульфатвосстанавливающих бактерий и описание новою вида этого рода DesulfomicrQbium apsheronum gen. nov., sp. nov. II Микробиология. 1988. Т. 57. С. 634-641.

68. Розанова E.II., ^Пивоварова Т.А. Реклассификация Desulfovibrio thermophilic (Розанова,. Худякову 1974). // Микробиоло1ия. 1988. Т. 57. С. 102-106.

69. Розанова -. Е.П., Галушко A.C., Иванова А.Е. Распространение сульфатвосстанавливающих бактерий, использующих лактат и жирные кислоты, в анаэробных экотопах заводняемых нефтяных коллекторов. // Микробиология. 1991. Т. 60. С. 360-367. . '

70. Розанова E.H., Савичев A.C., Каравайко С.Г., Миллер Ю.М. Микробиологическая• Iобстановка в нефтяном месторождении Приобья. // Микробиология. 1995. Т. 64. С. 104-111.

71. Розанова Е.П.,- Савичев A.C., Миллер Ю.М., Иванов М.В. Микробиологические процессы *в нефтяном месторождении Западной Сибири, заводняемом с применением комплекса орынических веществ. // Микробиология. 1997. Т. 66. С. 852-859. ' • ''

72. Розанова Е.П., Бо'рзенков И.А., Тарасов A.J1., Сунцова JI.A., Дош 4.JI., Беляев С.С., Иванов. М.В. Микробиблогические процессы в высокотемпературном нефтяном месторождении, // Микробиология. 2001 а. Т. 70. С. 118-127.

73. СвехлйчнЬгй В.Л., Светличная Г.П. Dictioglomus turgidm sp. nov. новая экстремально термофильная эубактерия, выделенная из юрячих источников кальдеры вулкана Узон. // Микробиология. 1988. Т. 57. С. 435-441.

74. Слободкин А.И., Заварзина Д.Г., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. Диссимиляционное восстановление неоранических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами. // Микробиология. 1999. Т. 68. С. 600622. • ,*

75. Тарасов A.JL, Борзенков И.А., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Динамика микробных процессов в пластовых водах Ромашкинскою нефтяного месторождения. // Микробиология.'2002. Т. 71. С. 849-857.

76. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Новикова Е.В., Полтараус А.Б., Начина Г.И. Гетерогенность нуклеотидных последовательностей генов 16S рибосомной РНК типовою штамма Desulfotomaculum kuznetwvii. II Микробиология. 2001. T. 70. С. 788-795. ;

77. Гурова Г.П. Мультикопииность рибосомных оиеронов прокариот и ее влияние на проведений филогенетического анализа. // Микробиология. 2003. Т. 72 С. 437-452.

78. Шейко В. Орыт бактериологического исследования ггефти. // Нефтяное дело. 1901. С. 401.

79. Шипин О. В., Образцова А. Я., Беляев С. С., Иванов М. В. Methanosarcina mazei гит 47 //Докл. АН СССР. 1983. Т. 273. С. 482-485.

80. Экзерцев В.А., ( Кузнецов С.И. Исследования микрофлоры нефтеносных месторождений Второю Баку. // Микробиология. 1954. Г. 23. С. 3-14.

81. Adkins J.P., Tanner R.S., Udegbunam Е.О., Mclnerney M.J., Knapp R.M. Microbially enhanced oil recovery from unconsolidated limestone cores. // Gcomicrobiol. J. 1992. V. 10. P. 77-86/

82. Aeskersberg P., Bak F., Widdel F. Anaerobic oxidation of saturated hydrocarbons to CO2 by a new type of sulfate-reducing bacterium. // Arch. Microbiol. 1991. V. 156. P. 5-14.

83. Andrews K.^ Patél В/ Fervidobacterium gondwarteme sp. nov., a new thermophilic anaerobic bacterium isolated from nonvolcanically heated geothermal waters of the Great Artesian Basin of Australia. // Int. J. Syst. Bactcriol. 1996. V. 46. P. 265-269.

84. Balch W., Fox G., Magrum L., Woese C., Wolfe R. Methanogens: réévaluation of a unique biological group. // Microbiological Reviews. 1979. V. 43. P. 260-296.

85. Barker H. A. On the biochemistry of the methane fermentation. // Arch. Microbiol. 1936. V. 7. P. 404-419. I

86. Barker H. A. Studies upon the methane fermentation. IV. 'I he isolation and culture of

87. Methanobcicterium omeliamkii. II Antonic Leeuwenhoek. 1940. V. 6. P. 201-220.

88. Barth T. OrganicacidS and inorganic ions in waters from petroleum reservoir, Norvegiantcontinental shelf: a multivariate statistical analysis and comparison with American reservoir formation water. // Appl. Geochem. 1991. V. 6. P. 1 15.

89. Barth I'., Riis M. Interaction between organic acid anions in formation waters and reservoir mineral phases. // Org. Geochem. 1992. V. 19. P. 455 482.

90. Bastin E.S. The presence of sulfate-reducing bactcria in oilfield waters // Scicnce. 1926 V. 63. P. 21-24. •

91. Beeder J., Nilsen R.K., Rosnes J.T., Torsvik T., Lien 1". Archaeglobus fulgidm isolated from hot North Sea oil field water //Appl. Environ Microbiol. 1994. V. 60. P. 1227-1231.

92. Beeder J., l'orsvik T., Lien 1'. Ihermodesulforhabdus norvegicus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic sulfate-reducing bacterium from oil field water. // Arch. Microbiol. 1995. V. 164. P. 3,31-336.

93. Belyaev S S., Ivanov M,V. Bacterial methanogenesis in underground waters. // Ecol. Bull. 1983. V.35/P. 273-280.

94. Belyaev S.S.; Borzenkov I.A. Microbial transformation of low-molecular-weight carbon compounds in the deep subsurface. // In: Biogeochemistry of global change. Chapman &

95. Hall. NY-London. 1993. P. 825-838. *

96. Ben-Bassat A., Lamed R., Zeikus J. G. Ethanol production by thermophilic bacteria: metabolic control of end product formation in Thermoanaerobium brockii. II J. Bacteriol. 1981. V. 146. P, 192-192.

97. Bernard F.P., Connan J., Magot M. Indigenous microorganisms in connate water of many oil fields: a new tool in exploration and production techniques. // In: SPE 24811. Proceedings of the Society of Petroleum Engineers. 1992. V. II. P. 467-475.

98. Birnboim H.C. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. //

99. Meth. Enzymol. 1983. V. 100. P. 225-243. * . #

100. Blotevogel K.H., Fischer U. Isolation and charactcrization of a new thermophilic and autotrophic methaneproducing bacterium: Methanobacterium thermoaggregans sp. nov. // Arch. Microbiol! 1985. V. 142. P. 218-222.

101. Bonch-Osmo)ovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., Lebedinsky A.V., Chernyh N.A., Na/ina I'.N., Ivoilov V.S., Bel>aev S.S., Boulygina E.S., Lysov Yu.P., Perov A.N.,

102. Boone D. R., Maestrojuan G. M. The methanogens. // In: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ed. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T. Baltimore: Williams & Wilkins.1993. P. 719-736.

103. Boone D. R., Whitman W. B., Rouviere P. Diversity and taxonomy of methanogens. // In Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry & Genetics. Ed. Ferry J.G. New York: Chapman & Hall. 1993. P. 35-80.

104. Brunk C.F., Avaniss-Aghajani E., Brunk C.A. A computer analysis of primer and probe hybridization potential, with bacterial small-subunit rRNA sequences. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 61. P. 872-879.

105. Bryant M. P-r The microbiology of anaerobic degradation and methanogenesis with special reference to' sewage, // In: Microbial energy conversion. Ed. Schlegel H.G., Barnea J. Gottingen. 1976. P. 107.

106. Bryant M. P., Wolin E, A., Wolin M. J., Wolfe R. S. Methanobacillus omehaniku, a symbiotic association of two species of bacteria. // Arch. Mikrobiol. 1967. V. 59. P. 20-31.

107. Bryant M. p., Campbell. L. L, Reddy C. A, Crabill M. R. Growth of Desulfovibrio in lactate or ethanol media low in sulfate in association with ^-utilizing methanogenic bacteria. //Appl: Environ. Microbiol. 1977. V. 33. P. 1162-1169.

108. Bryant, R.Sl, Stepp, A.K., Bertus, K.M., Burchfield, I'.E., Dennis, M. Microbial-enhanced waterflooding field pilots. // Dev. Petrol. Sci. 1993. V. 39. P. 289-306.

109. Cowen DA. The upper temperature of life-where do we draw the line? // Trends Microbiol. 2004. V.12.'P! 58-60.

110. Dagher F., De/icl E., Lirette P., Paquette G., Bisaillon J., Villemur R. Comparative study of five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from• rcontaminated soil. // Cpn/J. Microbiol. 1997. V. 43. P. 368-377.

111. Dahle II., Birkeland N.K. Thermovirga lienii gen. nov., sp. nov., a novel moderatelythermophilic, anaerobic, amino-acid-degrading bacterium isolated from a North Sea oil well, //lnt" J. Syst. Evoh Microbiol. 2006. V. 56. P. 1539-45.

112. Davey M.E., Wood W.A:, Key R., Nakamura K., Stahl D.A. Isolation of three species of»

113. Geotoga arid Petrotoga: two new genera, representing a new lineage in the bacterial line of *descent distantly related to the " 1 hermotogales". // Syst. Appl. Microbiol 1993. V. 16. P. 191-200, .

114. Davis J.B. Petroleum Microbiology. // Elsevier Publ. Co. Amsterdam-London-NY. 1967. 604 p.

115. De Ley J., Cat'toir H., "Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates.// Eur. J. Biochem. 1970. V. 12. P. 133-142.

116. Dubois M., Gyllis K.A., Hamilton J.K., et al. Calorimetric method for determination of suj4and related substances. I I Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

117. Edwards U., Rogall T., Blocker II., Endc M. D., Boeettge E. C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA'. // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 7843-7853.

118. Eichler B., Schink B. Fermentation of primary alcohols and diols, and pure culture of syntrophically ajcohol-oxidizing anaerobes. // Arch. Microbiol. 1986. V. 143. P. 60-66.

119. Fardeau M.-L., Cayol. J.-L., Magot M., Ollivier B. H2 oxidation in the presence of thiosulfate by a Thermoanaerobacter strain isolated from an oil-producing well. // FEMS Microbiol. Let{. 1993/V. 113. P. 327-332.

120. Faudon C., Fardeau M.-L., Ileim J., Patel B.K.C., Magot M., Ollivier B. Peptide and amino acid oxidation in . the presence of thiosulfate by members of the genus Thermoanderobacter. //Curr. Microbiol. 1995. V. 30. P. 1-6.

121. Fardeau M.-L., OlfivjerB., Patel B.K.C, Magot M., Thomas P., Rimbault A., Rocchiccioli

122. F., Gait'ia J.'-L. Thermqùiga hypogea sp. nov., a xylanolytic, thermophilic bacterium from an oil-producing'well. //flnt J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. F. 1013-1019.

123. Fardeau M.-L, Magot M., Fatel B.K.C., Ihomas P., Garcia J.-L., Ollivier B. Thermôanaerobactèr subterraneus sp nov., a novel thermophile isolated from an oil field water.*// Int.J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 2141-2149.

124. Fardeau M.-L., Salinas. M.B., L'IIaridon, S., Jeanthon C., Verhe F., Cayol J.-L., Patel

125. Ferry J. G. Methane from acetate. // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5489-5495.

126. Fisher J.B.E.- Distribution and occurrence of aliphatic acid anions in deep subsurface waters. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1987. V. 51. P. 2459-2468.

127. Fredrickson J.' K., BalkwiH D. L., Drake G. R., Romine M. F, Ringelberg D. B., White D.C. Aromatic-dcgradjng Sphingomonas isolates from the deep subsurface. // Appl. Environ. Microbiol. 19&5. V. 61. P. 1917-1922.

128. Giovannoni S. J., Godchauh W., Schabtach E. and Castenholz R. W. Cell Wall and lipid composition of Isosphaera pallida, a budding eubactcrium from hot springs. // Journal of Bacteriology. 1987. V. P. 2702-2707.

129. Grabowski A., Nercessian O., Fayolle F., Blanchet D., Jeanthon C. Microbial diversity in production water of a low-temperature oil reservoir. // FEMS Microbiol. Ecology. 2005. V. 54. P. 427-443.

130. Grassia G.C., McLean K.M., Glénat P., Bauld J., Sheehy A. A systematic survey for thermophilic fermentative bacteria and archaea in high temperature petroleum reservoirs. // FEMS Microbial. Ecol". 1996. V. 21. P. 47-58.

131. Greene A. .C.', Patel B. K. C., Sheehy A. J. Deferribacter thermophilus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic manganeseand iron-reducing bacterium isolated from a petroleumreservoir. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 505-509.t

132. Hattori S., Kamagata V., Hanada S., Shoun H. 7hermacetogemum phaeum gen. nov., sp. nov., a strictly anaerobic, thermophilic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium. // Int. J.

133. Heider J., Spormann A.M., Beller H.R., Widdel F. Anaerobic bacterial metabolism of hydrocarbons. // FE'KlS Microbiol. Rev. 1999. V. 22. P. 459-473.

134. Heyer J., Schwartz W. Untersuchungen zur Erdölmikrobiologie V. Leben in nicht wassrigen medien. 1 // Verhalten von Mikroorganismen im Kontakt mit Mineralöl. Z. allgem. Mikrobiol. 1970. V. 10. P. 545.

135. Hirsch P., Muller M. Phnctomyces limnophilus sp.nov., a stalked and budding bacterium from fresh water. // Syst/Appl. Microbiol. 1985. V. 6. P. 276-280.

136. Hungate R.E.A roll tube method for the cultivation of strict anaerobes. // Methods in Microbiology. EH. Norris J.L., Ribbons D.W. Academic Press, New York. 1969. V. 3b, P 117-132.

137. Ivanov M.V., Belyacy S.S. Microbial activity in waterfloodcd oil fields and its possible regulation. // Procced. of the 1982 Int. Conf. on Microbial enhancement of oil recovery.

138. Oklahoma. Shangri La, Alton. 1982. P. 48-57. »

139. Janssen P. H. Selective enrichment and purification of cultures of Methanosaeta spp. // J. Microbiol. Methods. 2003. V. 52. P. 239- 244

140. Jeanthon C,; Reysenbach A.-L., L'IIaridon S., Gambacorta A., Pace N. R., Glenat P., and Prieur D. Thermotoga subterranea sp. nov., a new thermophilic bacterium isolated from a continental oil reservoir. //Arch. Microbiol. 1995. V. 164. P. 91-97.

141. Jetten M., Schmid M. van de pas Schoonen K., Damste J.S., Strous M. Anammox Organisms; Enrichment, Cultivation, and Environmental Analysis. // Methods in Enzymology. 2005. V. 397. P. 34 57.

142. Kasai Y., Takahata Y., Hoaki T., Watanabc K. Physiological and molecular characterization of a microbial community established in unsaturated, petroleumcontaminated soil. // Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 806-818.

143. Kato T., H&ruki M., Imanaka T., Morikawa M., Kanaya S. Isolation and characterization of• ilong-chain-alkane degrading Bacillus thermoleovoram from deep subterranean petroleum reservoirs. // J. Biosci. Bioeng. 2001 a. V. 91. P. 64-70.

144. Lane D. J. 16S/23S rRNA sequencing. // In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics.Ed. Stackebrandt E., Goodfellow. M. New York: John Wiley& Sons. 1991. P.115.175. :

145. La/ar I., Dobrota S., Stefanescu M.C., Sandulescu L., Paduraru R., Stefanescu M. MEOR,irecent field trials in Romania: reservoir selection, type of inoculum, protocol for well treatment and line mopitoring. // Dev. Petrol. Sci. 1993. V. 39. P. 265.

146. Lee M. J., Zinder S, H. Isolation and characterization of a thermophilic bacterium which oxidizes acetate in syntrophic association with a methanogen and which grows acctogenically on,fi2-C02. // Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 124-129.

147. Leys N. M., Ryngaert-A., Bastiaens L., Verstraete W., Top E. M., Springael D. Occurrence and phylogenetic diversity of Sphingomonas strains in soils contaminated with polycychc aromatic hydrocarbons.*// Appl. Environ. Microbiol. 2004. P. 1944-1955.

148. L'Haridon S., Reysenbach A. -L., Glenat P., Prieur D., Jeanthon C. Hot subterranean biosphere in a continental oil reservoir. //Nature. 1995. V. 337. P. 223-224.

149. L'Haridon S., Miroshnichenko M.L., Hippe H., Fardeau M.-L., Bonch-Osmolovskaya

150. H.A., Stackcbrandt H., Jeanthon C. Petrotoga olearui sp. nov. and Petrotoga sibirica sp. nov., two thermophilic bacteria isolated from a continental petroleum reservoir in Western Siberia! // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1715-1722.

151. Li H., Yang S., Mu B., Rong Z., Zhang J. Molecular analysis of the bacterial community in a continental high-temperature and water-flooded petroleum reservoir. // FEMS Microbial. Lett. 2006.'P. 92-98.

152. Lien T., T.Madsen M., Rainey F., Birkeland N.-K. Petrotoga mobih\ sp.nov., from a North Sea oil-producing well.// Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1007-1013.

153. Liu W., Marsh T.L., 'Cheng H., Forney L.J Terminal Restriction Fragment Length

154. Polymorphisms of Genes Characterization of Microbial. Diversity by Determining i

155. Encoding 16S rRNA. II,Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 4516-4522.

156. Liu Y., Zhang J., Zhang Z. Isolation and characterization of polycyclic hydrocarbon-degrading Sphmgomonas sp., strain ZL5. // Biodégradation. 2004. V. 15. P. 205-212.

157. Love C., Patel B., Ludwig W., Stackcbrandt E. The phylogenetic position of Dyctioglomus thermophiluni based, on 16S rRNA sequence analysis. // FEMS Microbiol. Letters. 1993. V. 107. P. 3J 7-320." .

158. Lowry O.H., Rosenbou'gh N.J., Farr A.L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent.//J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

159. Lueders T.,.Friedrich M.W. Archaeal population dynamics during sequential reduction processes in rice field soil. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 2732-2742.

160. Lueders I1., Pommererike B., Friedrich M. W. Stable-Isotope Probing of Microorganisms

161. Thriving at 'Iherftiodynamic Limits: Syntrophic Propionate Oxidation in Flooded Soil. //

162. Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 5778-5786 t •

163. Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogeny of bacteria beyond the 16S rRNA standard. // ASM News. 1999/V.65. P. 752-757.

164. Ludwig W., Strunk O., Klugbauer S., Klugbauer N., Weizenegger M., Neumaier J., Bachleitner'M.,' Schleifer K.-H. Bacterial phylogeny based on comparative sequence analysis. // Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 554-568.

165. Mackie R. I*., Bryant M. P. Metabolic activity of fatty acid-oxidizing bacteria and the contribution of acetate, propionate, butyrate, and CO2 to methanogenesis in cattle waste at 40 and 60°C, // Appl Environ Microbiol. 1981. V. 41. P. 1363-1373.

166. Mdgot M.,'011ivier B.,Vatel B.K.C. Microbiology of petroleum reservoirs. // Ant. van Leeuwenhoekv 200D. V. 11. P. 103-116.

167. Mclnerney M. J., Bryant M. P., Pfennig N. Anaerobic bacterium that degrades fatty acids in syntrophiq association with methanogens.//Arch. Microbiol. 1979. V. 122. 129-135.

168. Miller J., Katyu/hnaya M., Noyes E., Lara J., Lidstrom M., Chistoserdova L. Labrys methilamimphtlm sp. .nov., a novel facultatively methylotrophic bacterium from a freshwater lake sediment.// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1247-1253

169. Nazina T.N:, Rozrfnov^ E.P., Kuznetsov S.I. Microbial oil transformation processes accompanied by methane and hydrogen-sulfide formation. // Geomicrobiol. J. 1985. V. 4. P. 103-130.t

170. Na/ina T.N., Ivanova A.E, Borzenkov I.A., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Occurrence and geochemical activity of microorganisms in high-temperature water-flooded oil fields of Kazakhstan .arid Western Siberia. //Geomicrobiol. J. 1995. V. 13. P. 181-192.

171. Na/ina T.N., Xue Y.-F., Wang X.-Y., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Microorganisms of the■ »high-temperature Liaohe oil field of China and their potential for MEOR. // Resource & Fnviron. Bioteehnol. 2000 a. V. 3. P. 109-120.

172. Nazina T.N.? Xue Y.-F., Wang X.-Y., Grigoriyan A.A., Ivoilov V.S., Belyaev S.S., Ivanov

173. M.V. Diversity and activity of microorganisms in the Daqing oil field of China and their fpotential for.biotechnological applications. // Resource & Environ. Biotechnol. 2000 b. V. 3. P. 121-132.''

174. Na/ina T.N., Tourova T.P., Poltaraus A.B., Novikova E.V., Grigoriyan A.A., Ivanova

175. Ng T.K., \yeimer Pv Gawel L.J. Possible nonantropogenic origin of two methanogenic isolates from dil-prodtjcing wells in San Miguelito field, Ventura County, California // Geomicrobiol. J. 1989. V. 7. P. 185-192.

176. Ni S., Boone D.R. • Isolation and characterization of a dimethyl sulfide-degrading methanogen, Methanolobus siciliae II1350, from an oil well. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 410-416.i, '

177. Ni S., WoeSe C.R., Ajdrich H.C., Boone D.R. Transfer of Methanolobus siciliae to the genus Methanosarcina naming it Methanosarcina siciliae, and emendation of the genus9

178. Methanosarcina. II Irit.J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 357-359.

179. Nilsen R. K., Torsvik T., Lien T. Desulfotomaculum thermocisternum sp. nov. a sulfate reducer isolated from a hot North Sea oil reservoir. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996 a. V. 46. P. 397-402. •

180. Nilsen RK., .Beeder Jr, Ihorstenson T., Torsvik T. Distribution of thermophilic marine• t»sulfate redücers in North sea oil field waters and oil reservoirs. // Appl. Environ.

181. Microbiol. i-99f) b. V:6£. P. 1793-1798. t • »

182. Nilsen R.K, Torsvik T. Methcinococcus thermolithotrophicus isolated from North Sea oil field reservpir water.'// Appl. Environ. Microbiol. 1996 c. V. 62. P. 728-731.

183. Nogales B:,' Moore E., Llobet-Brossa E., Rossello-Mora R., Amann R., Timmis K. N.•• t

184. Combined use of 16S ribosomal DNA and 16S rRNA to study the bacterial community ofpolychlormated biphenyi-polluted soil. //Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 18741884. .

185. Nolling J., Groffen A., de Vos W. M. UF1 and UF3, two novel virulent, archaeal phages infecting different thermophilic strains of the genus Methanobacterium. II J. Gen. Microbiol. 1993 a. V. 139. p. 2511-2516.

186. Nolling J., Hahn D., Ludwig W., de Vos W.M. Phylogenese analysis of thermophilic Methanobacterium sp.: evidence for a formate-utilizing ancestor. // Syst Appl Microbiol. 1993 b. V. 16. P. 208-215.

187. Nolling J., van Beden F.J.M., de Vos W.M. Distribution and characterization of plasmid-related sequences in the.chromosomal DNA of different thermophilic Methanobacterium strains. // Mol. Gen. Genet. 1993 c. V. 240. P. 81-91.

188. Orphan V.J., Taylor L,T., Hafenbradl D., Delong E.F. Culture-dependent and culture-independent characterization of microbial assemblages associated with high-temperature petroleum reStervo'irs. //.Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 700-711.

189. Orphan V.J./Goffredi S.K., Delong E.F., Boles J.R. Geochemical influence on diversity and microbial processes in high-temperature oil reservoirs. // Geomicrobiol. J. 2003. V. 20 P. 295-311.,."

190. Overmann J., Schubert K. Phototrophic consortia: model systems for symbiotic interrelations between prokaryotes. // Arch Microbiol. 2002. V. 177. P. 201-208.

191. Petroleum microbiology. // Ed. Atlas R.M. Macmillan Publishing Co NY. 1985.692 p.

192. Pfennig N. Syntrophic mixed cultures and symbiontic consortia with phototrophic bacteria. // In- Anaerobes and anaerobic infections Ed. Gottschalk G., Pfennig N., Werner H. Fischer Stuttgart, Germany, New York, NY. 1980. P. 127-131.

193. Pfennig N., Lippert K.D. Über das vitamin B12 Bedürfnis phototropher

194. Schweferelbaktericn. // Aich. Microbiol. 1966. V. 55. P. 245-256.i

195. Phelps C., Kerkhof L.J.? Young L.Y. Molecular characterization of sulfate-reducing consortium which mineralizes benzene. // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 269-279.

196. Philippi G.T. On the depth, time, and mechanism of origin of the heavy to medium gravity naphtenic crude oil. // Geochim. Cosmochim. Acta. 1977. V. 4L P. 33-52.

197. Plügge C.M., Balk M., Stams A.J.M. Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum subsp. nov., athermophilic, syntrophic, propionate-oxidizing, spore-forming bacterium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 391-399.

198. Postgate J.R. The sulfate-reducing bacteria. // 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press. 1984.

199. Prevot A. R: Nouvel essai de classification des bacteries methanogens. // CR Acad. Sei.1980 V. 290. P 1253-1255.

200. Ravot G., Magot M., Fardeau M.-L., Patel B.K.C., Prensier G., Egan A., Garcia J.-L, Ollivier B. 7hermologa elfii sp. nov., a novel thermophilic bacterium from an African oilproducing well. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995 a. V. 45. P. 308-314.

201. Ravot G., Ollivier B., Magot M., Patel B.K.C., Crolct J.-L., Fardeau M.-L., Garcia J.-L. Ihiosulfate reduction: an important physiological feature shared by members of the

202. Thermotogales. //Appl.'Environ. Microbiol. 1995 b. V. 61. P. 2053-2055.f

203. Rees G.N., Grassia G.S., Sheehy A.J., Dwivedi P.P., and Patel B.K.C. Desulfacmuminfernum gen. -nov., sp. nov., a thermophilic sulfate-reducing bacterium from a petroleumreservoir. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 85-89. i »

204. Rees G.N., Patel B.K.C., Grassia G.S., Sheehy A.J. Anaerobaculum thermoierrenum gen.nov., sp. noy., a nove'j. thermophilic bacterium which ferments citrate. // Int J. Syst.

205. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 150-154.t

206. Ron E.Z., Rosenberg E. Natural role of biosurfactants. // Environ. Microbiol. 2001. V. 3. P. 229-236. .t. .

207. Rosenberg "E., Rosenberg M., Shoham Y., Kaplan N., Sar N. Adhesion and desorption during the growth of Acinetobacter calcoaceticus on hydrocarbons. // In: Microbial Mats. Ed. Cohen Y., Rosenberg E. ASM Publications. Washington D.C. 1989. P. 218-226.

208. Rosenberg E'., Legmann R., Kushmaro A., laube R., Adler E., Ron E. Petroleum bioremcdiation a multiphase problem. // Biodégradation. 1992. V. 3. P. 337-350.

209. Rosnes J.T., 7,or3vik T., Lien T. Spore-forming thermophilic sulfate-reducing bacteria isolated from North Sea oil field waters. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 23022307.

210. Rossello-Mora R., Amann R. The species concept for prokaryotes. // FEMS Microbiology Reviews. 2001. V. ¿5.'P. 39-67.

211. Sabate J., Vinas M., Èayona J., Solanas A. Isolation and taxonomic and catabolic characterizatioifof a 3,6-dimethylphenanhtrene-utiIizing strain of Shingomonas sp. // Can J. Microbiol. 2003. V. 49. P. 120-129.

212. Saiki T., Kobayashi Y., Kawagoe K., Beppu T. Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp.nov., a chemoorganotrqphic, anaerobic, thermophilic bacterium. // Int. J. Syst. Bacteriol. «1985. V. 35. P. 253-259.,

213. Salinas M.B>, Fardeau M.-L, Ca>ol J.-L., Casalot L., Patel B.K.C., Thomas P., Garcia J.

214. Ollivier B. Petrobacter succinatimandens gen. nov., sp. nov., a moderate thermophilic nitrate-reducing bacterium isolated from an Australian oil well. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 645-649.

215. Sambrook K. J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning. // Cold Spring Harbor1.boratory Press. Second ed.1989. V. 1-3. »

216. Schink B. Fermentation of 2,3-butanediol by Pelobacter carbinolicus sp. nov., and Pelobacter. .propionics, sp. nov., and evidence for propionate formation from C2 compounds. // Arch. Microbiol. 1984. V. 137. P. 33-41.

217. Schink B. Fermentation of acetylene by an obligate anaerobe Pelobacter acetylenicus sp. nov. // Arch. Microbiol. 1985. V. 142. P. 295-301.• r •

218. Schink B.' Energetics of Syntrophic Cooperation in Methanogenic Degradation. // Microbial. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61. P. 262-280.

219. Schink B., Stams A. Syntrophism among prokaryotes // In: I he Prokaryotes. On-line version. 2006. httpV/141 150.157 117 8080/nrokPUB/indc\ htm

220. Schlesner H.!Planctomyces brasiliensis sp.nov., halotolerant bacterium from a salt pit. // Syst. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. P. 159-161.1 •

221. Schniirer A., .Schink B., Svensson B. H. Clostridium ultunense sp. nov., a mcsophilic bacterium oxidizing acetate in syntrophic association with a hydrogenotrophic methanogenic bacterium. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 1145-1152.

222. Stetter K.O. Archaeoglobus fulgidus gen. nov., sp. nov., a new group of extremely thermophilic archaebacteria. // Syst Appl Microbiol. 1988. V. 10. P. 172-173.

223. Stetter K.O., Hoffmann A., Huber R. Microorganisms adapted to high temperaturerenvironments. // In: Guerrero R., Pedros-Alio C. (Ed.) Trends in Microbial Ecology. Spanish Society for Microbiology. 1993 a. P. 25-28.

224. Stetter K. O.,. Huber R., Blochl E., Kurr M., Eden R.D., Fielder M., Cash H., Vance I. Hyperthermipliilic 'archaea are thriving in deep North Sea and Alaskan oil reservoirs. // Nature. 1993 b. V. 365. P. 743-745.

225. Stetter K.O. History of discovery of the first hyperthermophilcs. // Extremophiles .2006. V.10. P. 357-362.

226. Stetter K.O. Hyperthermophiles in the history of life. // Philos Trans R Soc Lond B Biol•f •«

227. Sci. 2006. V.361.P. 1837-42.

228. Tanner M., Goebel B., Dojka M., Pace N. Specific ribosomal DNA sequences from diversetenvironmental settings- correlate with experimental contaminants. // Appl. Environ Microbiol. 1998. V. 64, P. 3110-3113.

229. Tardy-Jacquenod C., Caumette P., Matheron R., Lanau C., Amauld O., Magot M. Characterization of sulfate-reducing bacteria isolated from oil-field waters. // Can. J Microbiol. 1996. V. 42. P. 259-266.

230. Truper II. ().,• Schlegel. H. G. Sulfur metabolism in Ihiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. II J. Microbiol. Serol. 1964. V. 30. P. 321-323. • '»

231. Van Hamme J.D.,, Singh A., Ward O.P. Recent advances in petroleum microbiology. // Microbiol. Mol. Biol. 2003. Rev. V. 67. P. 503-549.

232. Voordouw G., Armstrong S., Reimer M., Fouts B., Telang A., Shen Y., Gevertz D.

233. Characterization of 16S> rRNA genes from oil field microbial communities indicates the presence of a variety of sulfate-reducing, fermentative and sulfate-oxidizing bactcria. // Appl. Environ, Microbiol. 1996. V. 62. P. 1623-1629.

234. Voordouw G., Niviere V., Ferris F., Fedorak P., Westlake D. Distribution of hydrogenase genes in Desulfovibriotspp. and their use in identification of species from the oil field environment. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 3748-3754.

235. Wang J., Jenkins G., Wçbb R.I., Fuerst J.A. Isolation of Gemmata-\\ke and lsosphaera-\\kc Planctomycete bacterid from soil and freshwater. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 417-422. .

236. Weisburg W:G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.//J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 697-703.

237. Whitman W.B., Bowen T.L., Boone D.R. The mcthanogenic bacteria. // In: The Prokaryotes."Ed. Starr M.P., Stolp IL, Truper H.G., Balows A., Schlegel H.G. Springer Verlag, Berlin. 1'992. P/3352-3378.

238. Widdel F. I he genus Desulfotomaculum. H In: 'I he prokaryotes, 2nd ed. Ed. Balows A., früper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K.-H. Springer-Verlag, New York Berlin, Heidelberg. 1992. V. 2. P. 1792-1799.

239. Widdel F., Rabus R. Anaerobic biodégradation of saturated and aromatic hydrocarbons. // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. V. 12. P. 259-276.a

240. Wintzingerode F., Golbel U. B., Stackebrandt E. Determination of microbial diversity in environmental safaples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. // FEMS Microbiology Reviews. 19.97. V-. 21.213-229

241. Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. Formation of methane by bacterial extracts. // J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 2882-2886.

242. Xia Y., Min II., Rao G*., Lv Z, Liu J., Ye Y., Duan X. Isolation and characterization ofphenanthreriedegrading Sphingomonm paucimobilis strain ZX4. // Biodegradation. 2005.1. V. 16. P. 393-402.

243. Zajic J. E., Guignard'-^., Gerson D.F. Emulsifying and surface active agents from Corynebacteriumhydrocarboclastus //Biotech. Bioeng. 1977. V. 19. P. 1285-1301.

244. Zeikus J. G., Weimer P. J"., Nelson D. R., Daniels L. Bacterial methanogenesis: acetate as a methane precursor in pure culture. // Arch. Microbiol. 1975. V. 104. P. 129-134.

245. Zhang X., Young L.Y. Carboxylation as an initial reaction in the anaerobic metabolism of naphthalene and phenanthrene by sulfidogenic consortia. // Appl. Environ Microbiol. 1997. V 63. P. 4759-4764.

246. ZoBell C.E. Bacteria as geological agent with particular reference to petroleum. // Petrol. World. 1943. V. 40. P. 30.

247. ZoBell C.E/ Function of bacteria in the formation and accumulation of petroleum. // Oil Weekly. 1946.'V. L2Q. P. 30.

248. Zylstra G.J and Kim E. Aromatic hydrocarbon degradation by Sphingomonas yanoikuyae B1. // Journal of Industrial'Microbiology & Biotechnology. 1997.V. 19 P. 408-414.