Влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства углеводородокисляющих актинобактерий

Волченко, Никита Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства углеводородокисляющих актинобактерий
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства углеводородокисляющих актинобактерий"

На правах рукописи

Волченко Никита Николаевич

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

НА ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ АКТИНОБАКТЕРИЙ

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ставрополь 2006

Работа выполнена в Кубанском государственном университете

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, доцент Эмма Викторовна Карасёва

доктор медицинских наук, профессор Евгений Николаевич Афанасьев доктор химических наук, профессор Анатолий Валерьевич Брыкалов

Кубанский государственный аграрный университет

Защита состоится " С^ " июля 2006 г. в часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009 г. Ставрополь, ул. Пушкина 1, корп. 2, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан " "?/1/7 " 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук ^ ^^ Джандарова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из острых экологических проблем на сегодняшний день является загрязнение экосистем нефтепродуктами. Компоненты нефти обладают токсическим действием по отношению к животным, растениям, микроорганизмам, нарушают водо- и воздухообмен в воде и почве. Перспективным направлением ликвидации нефтезагрязнений являются методы биоремедиации, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов углеводородов. Однако естественным лимитирующим фактором микробного разложения служит водонерастворимый характер нефтепродуктов. Углеводороды нефти имеют гидрофобную природу, что затрудняет их поглощение гидрофильными клетками бактерий. Вариантом устранения этого противоречия является применение нефтеокисляющих бактерий, способных к синтезу биологических поверхностно-активных веществ —биосурфактантов (биоПАВ). БиоПАВ, в отличие от своих синтетических аналогов, нетоксичны и биодеградабельны, могут синтезироваться микробами из дешёвого сырья, активны в широком диапазоне условий. Всё это делает актуальным поиск культур-продуцентов биосурфактантов, исследование их свойств в целях повышения активности.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлся поиск углеводородокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов, изучение факторов, влияющих на поверхностно-активные свойства культур-продуцентов, экспериментальная проверка эффективности отобранных штаммов. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) определить критерии отбора бактерий-продуцентов биосурфактантов;

2) провести скрининг потенциальных продуцентов среди коллекции нефтеокисляющих бактерий Кубанского государственного университета, отобрать наиболее активные штаммы;

3) исследовать влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства культур-продуцентов биоПАВ, определить направления оптимизации, способствующие получению культур с повышенными сурфак-тантными свойствами;

4) выделить микробные биосурфактанты наиболее активных штаммов, охарактеризовать их свойства;

5) экспериментально проверить эффективность биоремедиации нефте-загрязнённых субстратов с применением отобранных углеводородокисляющих бактерий-продуцентов биоПАВ. .

Научная новизна. Охарактеризованы по поверхностно-активным свойствам ряд бактерий-деструкторов нефтепродуктов. Впервые показано, что культу-

ры нефтеокисляющих бактерий, длительно поддерживающиеся на питательном агаре, способны синтезировать биосурфакганты при культивировании на этой среде, а эмульгирующая активность, показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний могут служить критериями отбора штаммов — продуцентов биосурфактантов. Впервые выявлена важная роль гидрофобности клеток в формировании поверхностно-активных свойств жидких бактериальных культур - эмульгирующей активности и способности снижать поверхностное натяжение среды. Показано, что наибольшее влияние на поверхностно-активные свойства жидких культур исследованных штаммов оказывает концентрация углерода в среде. Часть исследований проведена в рамках работы по грантам INTAS 01-2150, CAF "Экологичные технологии".

Практическая значимость. Отобранные штаммы-продуценты биосурфактантов могут быть использованы для создания нового бактериального биопрепарата для очистки загрязнённых нефтепродуктами субстратов. Полученные в ходе диссертационного исследования результаты используются в деятельности центра "Биотехнология" Кубанского государственного университета по биологической рекультивации нефтезагрязнённых почв и фунтов, детоксикации нефтешламов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Скрининг штаммов-продуцентов клегочно-связанных и экстрацеллю-лярных биосурфактантов.

2. Роль гидрофобности клеток в формировании поверхностно-активных свойств жидких бактериальных культур.

3. Критерии отбора бактерий - продуцентов биосурфактантов при культивировании на питательном агаре.

4. Результаты влияния условий культивирования на поверхностно-активные свойства жидких бактериальных культур.

5. Результаты лабораторных испытаний бактерий - продуцентов биосурфактантов в ликвидации нефтяного загрязнения в почве, нефтешламе, на поверхности воды.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Международная школа-конференция "Биология—наука ХХГ века" (г. Пущино, 2001 и 2006 гг.); 1st European microbiological congress. (Slovenia, Lubljana 2003 г.); 2-й съезд общества биотехнологов России (Москва, 2004 г.); "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005 г.); 2-я международная конференция "Микробное разнообразие 2005" (Пермь-Казань, 2005 г.); 2-я Всероссийская научная конференция молодых учёных и студентов. (Краснодар, 2005 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа изложена на 148 листах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 13 таблиц. Список литературы включает 178 наименований, в том числе 70 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

- Объесты исследования. В работе исследованы свойства 39 иггаммов коллекции нефтеокисляющих бактерий кафедры генетики и микробиологии Кубанского государственного университета. Штаммы выделялись на протяжении более 20 лет сотрудниками кафедры из нефтезагрязнённых почв, грунтов, вод, нефгешламов Краснодарского края и других регионов. Большая часть исследованных бактерий принадлежит к группе нокардиоморфных актиномицетов -родам Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, Dietzia, Kocuria, присутствуют отдельные штаммы родов Micrococcus, Pseudomonas, Arthrobacter, Planococcus.

Питательные среды и субстраты, условия культивирования бактерий. Бактерии культивировали на питательном агаре, мясо-пептонном бульоне, жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): KN03 — 4; Na2HP04-12НгО -1,4; КЦРО^-О.6; MgS04-7H20-0,8. В отдельных экспериментах использовали отличающиеся варианты этой среды. В качестве гидрофобного источника углерода вносили гексадекан или дизельное топливо в количестве 1-3 %(об), н-алканы, растительное масло, сырую нефть. Культивирование проводили в течение 4-7 суток при комнатной температуре в условиях аэрации на орбитальных качалках.

Измерение поверхностно-активных свойств. Величину поверхностного натяжения (ПН) образцов жидких культур, их супернатантов, ресус-пендированных клеток, химически выделенных биосурфактантов определяли методом отрыва пластинки от поверхности жидкости. Эмульгирующую активность определяли методом встряхивания исследуемого образца с дизельным топливом с расчётом индекса эмульгации (ИЭ) по формуле H3=(Vi/V1)-100 (%), где: Уэ —объём образовавшейся эмульсии (мл), Vs - суммарный объём жидкости в пробирке (мл). Показатель гидрофобное™ (ПГ) клеток определяли модифицированным методом Розенберга.

Химическое выделение биосурфактантов. Клегочно-связанные биоПАВ липидной природы выделяли из биомассы клеток, выращенных на Питательном агаре или минеральной среде с гексадеканом, по методу Блая и Дайера. Внеклеточные биоПАВ выделяли из купьтуральной жидкости осаждением этанолом или экстракцией диэтиловым эфиром.

Оценка эффективности биоремедиации нефтезагрязнённых субстратов с использованием бактерий-продуцентов биосурфактантов. В модельных экспериментах определяли содержание микрофлоры, убыль нефтепродуктов, фитотоксичность нефтезагрязнённой почвы, нефтешлама, воды как показатели, свидетельствующие о протекании процесса биоремедиации. Содержание нефтеокисляющей и гетеротрофной микрофлоры, концентрацию нефтепродуктов определяли стандартными методами. Фитотоксичность шлама и нефтезагрязнённой почвы оценивали по всхожести и длине ростков или корней семян пшеницы, кукурузы или редиса, помещённых в нефтезагрязнённый субстрат.

Математическая обработка результатов. Статистическая обработку данных осуществляли средствам программ Microsoft Office Excel 2003 и STATISTICA 7.0. На отдельных этапах работы использовали метод полного факторного эксперимента по планам ПФЭ-23 и ПФЭ-24.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Скрининг культур-продуцентов биосурфактантов

Оценку способности бактерий продуцировать биосурфактанты, как правило, проводят при культивировании на жидких средах, реже - на специальных плотных средах с нефтепродуктами. Мы оценивали поверхностно-активные свойства нефтеокисляющих культур, выращенных на стандартной плотной среде — питательном агаре (как среде хранения культур) и жидкой минеральной среде с углеводородом (как основной среде культивирования). Первичному скринингу на питательном агаре (ПА) подверглись 39 штаммов, измерение поверхностно-активных свойств проводили в суспензиях клеток, смытых минеральной средой с питательного агара. Клетки, суспендированные в жидкой среде, не снижали её поверхностное натяжения, однако 16 из 39 штаммов эмульгировали углеводороды. Пятнадцать из 16 культур, проявивших эмульгирующую активность на ПА, обладают таковой и на жидкой среде с гексадеканом (МС-С16) (табл. 1). Таким образом, измерение индекса эмульгации бактерий, выращенных на питательном агаре, может служить в качестве несложного теста для первичного отбора культур - биоэмульгаторов, регистрация уровня ПН нецелесообразна.

Таблица 1 - Поверхностно-активные свойства нефтеокисляющих бактерий, выращенных на питательном агаре'

, .. Штамм Поверхностно-активные свойства суспёадирован-ных бактерий, выращенных на питательном агаре Наличие эмульгирующей активности при росте на среде МС-С16

Показатель гидрофобное™ клеток, % Поверхностное натяжение, мН/м ■ Индекс эмульгации, %

Dietzia maris J1 38 59,1 4 + ■

Rhodococcus sp. J2 21 52,2 0 +

Rhodococcus sp. J 6 18 52,9 ' 0 -

Kocuriasp. J7 24- 52,7 0 -

Rhodococcvs sp. J 8 88 51,7 14 +

Rhodococccus sp. J10 19 49,3 0 -

Dietzia maris J11 26 54,6 6 +

Rhodococcus sp. J 12 19 53,8 0 - +

Rhodococcus sp. i 13 21 54,7 0 +

J14 6 н.д. 0 -

J15 15 55,9 0

Nocardia sp. Z1 21 н.д. 0 -

Rhodococcus sp. 7.1 6 н.д. 7 +

Gordoniasp. Z4 29 60,5 0 -

Rhodococcus sp. Z5 13 55,5 0 -

Rhodococcus sp. Z6 26 59,1 0 -

Gordonia sp. Z8 21 55,6 0 +

Nocardia sp. K5 35 56,7 25 +

Gordonia amicalis K8 24 58,4 6 +

G. amicalis K14 37 62,3 15 +

Kocuriasp. K15 32 н.д. 0 -

Rhodococcus sp. ВI 19 57,3 0 ' ■ ■ -

R. erythropolis В 2 22 56,8 3 +

Rhodococcus sp. B3 36 54,7 7 -

Rhodococcus sp. B4 43 н.д. 10 +

B5 34 57,5 0

Dietzia maris B6 41 н.д. 20

B8 42 н.д. 15 +

S2 20 51,9 0 -

Rhodococcus sp. S4 30 н.д 16 +

Rhodococcus sp. S5 20 58,0 0 ■ -

Planococcus sp. S6 18 59,1 0 -

A' erythropolis F1 24 55,9 4 +

Rhodococcus sp. F2 25 57,6 6 +

Micrococcus sp. F3 42 55,4 0 -

Rhodococcus sp. F5 6 56,3 0 +

Arthrobacter sp. F6 8 н.д. 0 +

Micrococcus sp. HI 26 59,0 6 +

D1 23 53,4 0 -

Примечание: "н.д."—нет данных,"+"- признак присутствует,признак отсутствует

Для трёх штаммов было зафиксировано ПН ниже 50 мН/м (Л. егупИгороИз ^осагеНайр. К5, СоЫота Z8),для трёх—ниже 40 мН/м(/?Аос1ососсш 5/7. ¥2, Я. егуГИгороНяВ2, Ююс1ососсшзр. 18), для одного—ниже30 мН/м (С. аткаИ.ч К8). Максимальной эмульгирующей активностью (45-57 %) обладали штаммы В2,18, Р2. Для них характерна и высокая устойчивость эмульсий.

Таблица 2 — Поверхностно-активные свойства жидких культур, их супернатантов и клеток при культивировании на среде МС-С16

Поверхностное натяжение (мН/м) Индекс эмульгации (%) Показатель гидрофобно-сти клеток

жидкая культура суперна-тант жидкая культура суперна-тант

Rhodococcus sp. J8 35.5 57.5 52 0 96

Rhodococcussp. F2 34.5 57.1 45 0 90

Rhodococcussp. Z5 -53.0 60.6 0 0 13

R. ervthropolis F1 44.6 55.5 15 0 73

R. erythropolis B2 30.8 52.1 57 0 87

Nocar&a sp. K5 42.0 43.3 26 5 42

Gordonia sp. Z8 40.6 48.2 9 6 57

G. amicalis K8 29.5 51.7 28 0 71

Micrococcus sp. HI 57.8 58.2 23 0 70

Planococcus sp. S6 58.6 60.1 0 0 4

Важной характеристикой микробных биоПАВ является тип локализации — связанный с клеточной стенкой или экскретируемый в окружающую среду. Известно, что локализация биоПАВ указывает на физиологию взаимодействия бактерий с углеводородами и помогает выбрать направление биотехнологического производства культур-продуцентов сурфактантов. Сравнивали сурфактантные свойства нативных жидких культур и их супернатантов. У последних они отсутствовали, за исключением штаммов К5 и Z8, проявивших снижение ПН до 40-42 мН/м и слабую эмульгирующую активность. Это свидетельствует о клеточно-связанном характере локализации биосурфактантов большинства штаммов.

Таким образом, в результате скрининга отобраны штаммы-продуценты клеточно-связанных биоПАВ КИос1ососси$ яр. Р2, Я. егуЛгороШ В2, ИНо(1ососсиз яр. .18 и внеклеточных биоПАВ МосагеИа яр. К5, Сойота зр.

2. Гидрофобпость клеток как фактор, определяющий поверхностно-активные свойства бактериальных культур

В случае продукции бактериями экстрацеллюлярных биоПАВ, величины ПН и Э А жидких культур или их супернатантов можно в определённой мере

считать показателем концентрации сурфактантов в жидкой среде. В случае же синтеза бактериями клеточно-связанных биоПАВ, прямая химическая аналогия невозможна, поскольку поверхностное натяжение и индекс эмуль-гации такой микробной культуры опосредованы поверхностно-активными свойствами биомассы клеток. Скрининг бактерий-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ методом химического выделения сурфактантов из биомассы клеток трудоёмок и дорогостоящ. Поэтому важен поиск параметра, отражающего сурфактантные свойства бактерий-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ. В качестве такового мы использовали показатель гид-рофобности клеток. При исследовании сурфакгантных свойств 10 штаммов (см. табл. 2) установлено, что жидкие культуры с более гидрофобными клетками, обладают большими сурфактантными свойствами. Коэффициент корреляции Пирсона между эмульгирующей активностью жидких культур и гидрофобностью суспендированных в них клеток составляет ^=0,74 при р=0,000, между поверхностным натяжением жидких культур и гидрофобностью суспендированных в них клеток составляет г —0,61 при/7=0,000. Данная зависимость позволяет оптимизировать биотехнологическое производство бактерий-продуцентов клеточно-связанных сурфактантов: для получения жидких культур с поверхностно-активными свойствами необходимо ориентировать условия культивирования в направлении повышения липо-фильности клеток и увеличения выхода биомассы.

Оценили возможность использования показателя гидрофобности бактерий для экспресс-отбора поверхностно-активных штаммов при культивировании на плотной среде. Естественная гидрофобность 38 из 39 коллекционных штаммов нефтеокисляющих бактерий, выращенных на плотном питательном агаре в условиях отсутствия контакта с гидрофобным углеводородным субстратом, находилась в пределах 0-49 %. В каждом интервале гидрофобности определили долю штаммов, культуры которых обладали эмульгирующей активностью при росте на жидкой среде с углеводородом (рис. 1). Наблюдалось увеличение доли биоэмульгаторов от ПГ 10-19%кПГ 40-49 %. Столь же высока доля эмульгаторов в интервале ПГ 0-9 %. Оценка морфотипа культур показала, что большинство штаммов с ПГ 0-9 % являлись М-формами, а с ПГ 10-49 % - Я-, Б-формами. Оценка доли штаммов, способных к деструкции гексадекана в жидкой минеральной среде, продемонстрировала аналогичную картину.

80 гг

¿■* 60 о „

5 О

2 Й-со о

§ й 40

£ I §=20

- 16

т О

за

о а>

0-9% 10-19% 20-29% 30-39% 40-49% показатель гидрофобное™

Рисунок 1 - Распределение выборки из 39 штаммов по естественной гид-рофобности клеток (б) и доля штаммов-эмульгаторов в каждом интервале гидрофобности (а)

По нашему мнению, это связано с принципом взаимодействия нефте-окисляющих бактерий с углеводородным субстратом — клетки 8- и Л-форм, имеющие ПГ 10-49 %, способны к непосредственному контакту с углеводородом за счёт гидрофобной клеточной поверхности, обусловленной наличием в ней липидных компонентов. Чем большей "естественной" гидро-фобностью обладают бактерии, тем более вероятно, что культура способна к эмульгировании и усвоению углеводорода. Клетки М-форм обладают низким уровнем ПГ и активно продуцируют в среду внеклеточные слизи. Вероятно, их эмульгирующая активность и способность к деструкции парафинов обусловлена продукцией экстрацеллюлярных биоПАВ, диспергирующих углеводороды в водной среде. Штаммы М-форм — Шю(1ососсш 5р. 22, Шос1ососси5 5/7. Р5, АпИгоЬаМег яр. Гб, проявляли на среде МС-С16 интенсивный рост, а супернатанты их культур обладали эмульгирующей активностью. Полученные результаты можно использовать как основу для нового метода отбора бактерий-продуцентов биосурфактантов. „ . .

3. Поверхностно-активные свойства химически выделенных микробных сурфактантов

В результате скрининга были отобраны штаммы, культуры которых проявляли поверхностно-активные свойства. Это свидетельствует о продукции клетками экстрацеллюлярных (штамм К5) или клеточно-связанных (штаммы В2, Р2,18) сурфактантов. С целью проверки этого факта и подтверждения результатов скрининга, осуществили химическое выделение поверхностно-активных соединений бактериальных культур, выросших на питательном агаре и жидкой минеральной среде с гексадеканом. Из биомассы клеток гидрофобных штаммов Я. егуМгороШ В2, ЯИоЫососсих яр. Р2, ЯИо(1ососсих ар. Л8, выращенных на среде МС-С16, выделили суммарные липиды. Последние были способны как эмульгировать углеводороды (до 31 %), так и снижать поверхностное натяжение жидкой среды (до 27,3 мН/м), что позволяет считать их биосурфактантами. Полученные соединения слабо растворялись в воде и полностью растворялись в дизельном топливе, образовывали эмульсии типа "масло в воде". Устойчивость эмульсий, образованных биосурфактантами штаммов В2 и Г2 составляла более 120 ч. Из культуральной жидкости штамма ЫосапНа зр. К5 получены поверхностно-активные соединения, эмульгирующие углеводороды (ИЭ 20 %) и снижающие поверхностное натяжение воды (до 41 мН/м).

На питательном агаре исследовали 7 штаммов (Б1, В2, Л8, Б2, К8, К5, Н1), обладающих эмульгирующей активностью и 7 штаммов (К 14,7.5, Б6,12,16, г8), не проявивших таковой (контрольная группа). Липиды из клеток шести штаммов-эмульгаторов показали ИЭ 23-55 %, в то время как липиды шести из семи штаммов контрольной группы обладали гораздо более низкими значениями индекса эмульгации 0-5 %. Таким образом, исследуемые бактерии способны к продукции биоПАВ на стандартной плотной среде—питательном агаре, а применяемый тест на индекс эмульгации отражает поверхностно-активные свойства продуцируемых клетками биосурфактантов.

Из представленных результатов видно, что штаммы Б1, В2,18, Б2, К8, К5, отобранные в скрининге, способны к синтезу биоПАВ. Среди исследованной выборки преобладают продуценты клеточно-связанных сурфактантов липидной природы, что характерно для актинобактерий. Обнаружено явление экстракции биоПАВ из биомассы родококков нефтепродуктами (смесь С7-С17), которые в результате эмульгировались. Переход клеточно-связанных биосурфактантов из клеток в углеводородную среду свидетельствует о возможности применения в качестве поверхностно-активного агента в био-ремедиации непосредственно биомассы бактерий-продуцентов.

4. Влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства бактерий-продуцентов биоПАВ

4.1 Поверхностно-активные свойства культур при росте на различных типах сред Общепринятой средой для культивирования бактерий, синтезирующих биоПАВ, является жидкая минимальная среда с гидрофобным источником углерода, биоПАВ могут продуцироваться бактериями при росте в жидкой среде с водорастворимыми источниками углерода, известны отдельные факты синтеза микроорганизмами сурфактантов при росте на различных плотных средах.

Таблица 3 - Поверхностно-активные свойства продуцентов клеточно-связанных биосурфактантов при культивировании на разных средах

Штаммы-продуценты кле-точно-с вязанных биоПАВ Показатель гидрофобности клеток (%) Эмульгирующая активность жидких культур (%) Поверхностное натяжение жидких культур , (мН/м)

ПА МПБ МС-16 ПА {ИПБ МС-16 ПА МПБ МС-16

Я ег)1ИгороН$ В2 22 29 87 3 39 57 56.8 46.9 30.8

ЮюЫосоагт зр. Р2 21 82 90 5 45 45 54.1 47.3 34.5

КИос1ососсш 5/>. Л 8 88 90 96 14 40 ■ 52 54 1 52 .35.5

МосагсНа яр. К5 27 74 42 25 0 26 56.7 48.7 42

Исследовали свойства штаммов-продуцентов биоПАВ при культивировании на жидкой минеральной среде (МС-С16), жидкой богатой среде (МПБ), плотной богатой среде (ПА). В целом, поверхностно-активные свойства культур увеличивались в ряду сред ПА—МПБ—МС-С16 при наличии штам-моспецифических отличий (табл. 3). Сравнение значений ПН, ИЭ, ПГ подтверждает отмеченную тенденцию повышения сурфактантных свойств культур при увеличении гидрофобности суспендированных клеток. У трёх культур (В2, .18, К5) на МПБ более активно продуцируются внеклеточные эмульгаторы. В целом, оптимальным типом среды для получения культур с поверхностно-активными свойствами является жидкая минеральная среда с углеводородом, хотя возможно применение и ПА, МПБ.

4.2 Зависимость поверхностно-активных свойств жидких культур от соотношения углерода, азота и фосфора в среде Исследовали меру влияния на поверхностно-активные свойства культур концентрации и соотношения углерода (С), азота (>1) и фосфора (Р) в среде

МС-С16 методом полного факторного эксперимента ПФЭ-23 (ПФЭ-24). Зависимость сурфактантных свойств культур от минерального состава среды носит сложный характер — имеет место положительное и отрицательное влияние концентрации отдельных элементов и их совместный эффект. Наибольшее влияние для всех культур оказывала концентрация углерода в среде. Так влияние С:№Р на снижение поверхностного натяжения ¡Уюс1ососси$ хр. Д8 отражается уравнением: У=34.52-7.02x7-1.83x3, гдеУ-уровейь ПН,дг 1 — содержание углерода, хЗ -содержание фосфора. Оптимальные для снижения ПН культур соотношения С:№Р штаммоспецифичны, но для всех штаммов характерно превышение содержания азота над фосфором — от двух до десяти раз. Исследовали зависимость гидрофобности клеток от концентрации С, N. Р в среде на примере штамма Л егуМгороИэ И1. При увеличении соотношения С:И гидрофобность клеток увеличивается, а поверхностное натяжение жидкой культуры (или ресуспендированных в чистой среде клеток) при этом уменьшается.

. 4.3 Поверхностно-активные свойства культур при росте на различных гидрофобных источниках углерода Исследовали зависимость поверхностно-активных свойств жидких культур и их супернатантов от источника углерода, как наиболее значимого фактора, на минеральной жидкой среде. В качестве С-субстратов сравнивали ряд н-алканов с С7 по С, 7 и два сложных гидрофобных источника углерода—дизельное топливо и растительное масло. Для всех четырёх штаммов минимальные уровни поверхностного натяжения в жидких культурах отмечены при росте на тридекане, максимальные—на гептане и октане (на этих алканах практически отсутствовал рост бактерий). Максимальная эмульгирующая активность культур трёх штаммов (за исключением 18) отмечена при росте на гексадекане, минимальная - на гептане, октане, декане. Высокий уровень поверхностно-активных свойств отмечен и при культивировании на дешёвых гидрофобных источниках углерода - дизельном топливе и растительном масле.

4.4 Зависимость поверхностно-активных свойств жидких культур от продолжительности культивирования Продукция биоПАВ может быть связана с различными фазами роста бактериальной культуры. Измерение сурфактантных свойств жидких культур демонстрирует резкое их возрастание в течение первых-вторых суток роста (рис. 2 и 3), с дальнейшей стабилизацией на протяжении стационарной фазы

роста. Аналогичную динамику имеет гидрофобность бактерий-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ (рис. 4), что согласуется с выводом о зависимости поверхностно-активных свойств культур от ПГ клеток. Характер динамики сурфактантных свойств свидетельствует о рост-связанном типе продукции биосурфактантов исследуемыми штаммами. У штамма-продуцента внеклеточного биоПАВ ЫосагШа ар. К5 наблюдалась более сложная картина изменения свойств, активность внеклеточного сурфактанта была максимальной на 3-4 сутки роста.

Рисунок 2 - Динамика уровня поверхностного натяжения жидких культур штаммов-продуцентов биоПАВ на среде МС-С16

продолжительность культивирования

Рисунок 3 - Динамика эмульгирующей активности жидких культур штаммов-продуцентов биоПАВ на среде МС-С 16

О сут

1 сут, 2 сут 3 сут 4 сут

продолжительность культивирования

Рисунок 4 - Динамика гидрофобности клеток штаммов-продуцентов био-ПАВ на среде МС-С16 1

Практическим выводом является определение оптимальной продолжительности культивирования в пределах 4 суток— к этому времени культуры уже достигают высокого уровня поверхностно-активных свойств, переходят в стационарную фазу роста, дальнейшее ферментирование Экономически нецелесообразно. Среди четырёх исследованных штаммов относительно наиболее активным является Л. егуЧкгороИз В2, как проявивший максимальную эмульгирующую активность.

5. Моделирование бноремедиацни нефтезагрязнённых субстратов с использованием бактерий-продуцентов

биоПАВ

В модельном эксперименте проведено сравнительное исследование влияния отобранных штаммов-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ (Р2, В2, 38), коммерческих сурфактантов, минеральной добавки на деструкцию нефти, микрофлору и фитотоксичность загрязнённого кубанского чернозёма.

Внесение бактерий в стерильную почву полностью компенсировало её углеводородокисляющий потенциал. При сравнительно равном уровне снижения концентрации нефтепродуктов, конечная фитотоксичность почвы различается при разных методах обработки (табл. 4), будучи максимальной при обработке СПАВ. Оптимальные показатели зафиксированы при внесении жидкой культуры /?. егуЧкгороНь В2, оказавшей стимулирующее воздействие на рост пшеницы, при снижении концентрации нефти на 61 %. Фитостимулирующий эффект данного штамма обусловлен активной про-

Таблица 4 - Микрофлора нефтезагрязнённого чернозёма и уровень деградации нефти в модельном эксперименте при обработке различными агентами

Вносимый агент Содержание микрофлоры, КОЕ/г Фитотоксичность Деградация нефти, %

Гетеротрофные бактерии Нефтеоккс-ляющие бактерии Всхожесть семян, % Длина ростов, мм

Гидробрейк 7,4 • 10 ' 8,85 • 10' 24 9,6 57

БОК-3 1,8 • 10 ' 2,3 • 10 8 16 9,0 56

(NH4)3S2Os 5,0« 10 ' 4,66 • 10 ' 44 17,3 55

Rhodococcus sp. F2 2,6 • 10' 1,0- J0S 42 21,7 61

R. erythropolis B2 .... 3,0-10" 2,43 • 10 " 58 19 61

Rhodococcus sp. J8 1,8 • 10" 1,21 • 10" 36 12,2 63

Контроль 1,1 • 10" 5,06 • 10 " 40 ид 58

дукцией клетками экзометаболитов в процессе деструкции нефтепродуктов. В опыте по обработке семян пшеницы, помещённых в нефтезагрязнён-ную почву, культуральной жидкостью R. erythropolis В2 и водой, всхожесть составила 64 и 32 % соответственно.

Успешный эксперимент с биоремедиацией загрязнённой почвы позволил перейти к опыту с нефтешламом, как более сложным для биодеградации субстратом. Нефтешлам инокулировали коллекционными штаммами-продуцентами клеточно-связанных и экстрацеллюлярных биосурфактантов и аборигенными культурами шлама, предварительно выделенными и активированными in vitro. В результате обработки достигнуто снижение содержания нефтепродуктов в шламе на 39-44 % и уменьшение фитоток-сичности шлама. Степень деструкции углеводородов по истечении месяца была практически одинакова (рис. 5).

Более эффективная детоксикация достигнута при обработке коллекционными культурами (рис. 6), концентрация нефтеокисляющей (3,9* 106 КОЕ/г) и гетеротрофной (1,3 • 10я КОЕ/г) микрофлоры превышала на порядок таковые в варианте с внесением аборигенных культур. Снижение токсичности, увеличение концентрации и разнообразия микрофлоры свидетельствует о появлении у нефтешлама биологических свойств и позволяет применять к нему методы фиторемедиации.

обработка коллекционными обработка аборигенными

культурами культурами

Рисунок 5 - Концентрация нефтепродуктов в шламе при различных вариантах биообработки

Рисунок 6 - Сравнительная фитотоксичность нефтешлама по отношению к редису посевному до обработки и после биообработки разными способами

Сравнили влияние штаммов ШюсЬсоссш яр. 18 и ШгоЫососсиз Бр. 22. на деградацию слоя нефти на поверхности воды. Первый был отобран как имеющий липофильные клетки, обладающие положительной плавучестью в воде, продуцент клеточно-связанньгх биоПАВ; второй—как имеющий гидрофильные клетки, хорошо суспендирующиеся в воде, продуцент внеклеточных биоПАВ. За 10 суток обе культуры полностью диспергировали слой нефти, с исходной толщиной 3 мм, и утилизировали её на 50 %. Однако в случае с внесением штамма 18, процесс прироста биомассы й разрушения гтёнки происходил быстрее, на 5-е$утки концентрация клеток составляла 3,7$ 106 КОЕ/мл, в то время как - 5,7$ 104КОЕ/мл. Биомасса 18 с сорбированной нефтью всплывала,^2- равномерно распределялась в водной фазе. Данное явление обусловлено как положительной плавуШ^Йыэ, лучшей адгезивной способностью на нефтепродуктах гидрофобных клеток, так и продукцией ими углеводород-растворимых липидных биоПАВ, экстрагируемых нефтепродуктами из биомассы клеток. Штаммы с такими свойствами могут быть перспективны в качестве деструкторов и биодисперга-торов нефти на поверхности акваторий, так как их биомасса концентрируется на поверхности раздела вода/нефть и не диффундирует в толщу водоёма.

ВЫВОДЫ

1. В результате скрининга коллекции нефгеокисляющих бактерий отобраны штаммы-продуценты клеточно-связанных (ВИодососсш егу&гороП.ч В2, Ююйососсш яр. 18, Ккос/ососсих ¡р. ¥2) иэкстрацеллюлярных (ЫосапЛа яр. К5) биосурфактантов, в культурах которых отмечено снижение поверхностного натяжения до 30,8 мН/м и эмульгирующая активность до 57 %.

2. У наиболее активных штаммов химически выделены экстрацеллюляр-ные и клеточно-связанные биоПАВ. Последние имеют липидную природу, растворимы в углеводородах и могут экстрагироваться из клеток нефтепродуктами. Это позволяет применять в биоремедиации в качестве поверхностно-активного агента непосредственно биомассу бактерий.

3. Установлено, что гидрофобность клеток играет ключевую роль в формировании поверхностно-активных свойств жидких культур бактерий-продуцентов клеточно-связанных биосурфактантов. Увеличение гидрофоб-ности суспендированных клеток приводит к снижению уровня поверхностного натяжения и росту эмульгирующей активности жидких культур.

4. Доказано, что при культивировании нефгеокисляющих бактерий на питательном агаре эмульгирующая активность, показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний могут служить критериями отбора штаммов-продуцентов биоПАВ.

5. Поверхностно-активные свойства жидких бактериальных культур определяются условиями культивирования, такими как тип питательной среды, концентрация и соотношение углерода, азота, фосфора в среде, гидрофобный источник углерода, продолжительность культивирования, гетерогенность биомассы клеток.

6. В модельных экспериментах с нефтезагрязнённым чернозёмом, неф-тешламом, нефтью на поверхности воды в результате обработки отобранными культурами-продуцентами биоПАВ достигнуто снижение концентрации углеводородов, диспергирование и частичная детоксикация загрязнённых субстратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертацяонной

работы

1. Волченко H.H. Влияние состава питательной среды на интенсивность роста и продукцию биосурфакганггов некоторыми штаммами нефтеок ивляю щих актинобактерий / В.В. Волченко // Сборник тезисов Международной школы-конференции "Биология - наука XXI века". - Пущино. —2003. - С. 155.

2. Karaseva E.V. Environmental structureand fermentation conditions influence on physiological features of the oil-oxidizing aktinobacteria / E.V. Karaseva, A A. Khudokormov, D.A. Melnikov, N.N. Volchenko // The report book of Iя European microbiological congress. - Lubljana. - 2003. - P. 334.

3. Волченко H.H. К вопросу о локализации микробных поверхностно-активных веществ углеводородокисляющей бактерии Rhodococcus erythropolis Fl / H.H. Волченко, A.A. Сам ков // Материалы научно-практической конференции "Процессы и явления в конденсированных средах". — Краснодар. — 2004.-С. 205-210.

4. Самков A.A. Продукция биомассы и показатель гидрофобности штамма Rhodococcus erythropolis Fl на средах различного состава / A.A. Самков, H.H. Волченко II Материалы 2-го съезда биотехнологов России. - Мос-ква.-2004.-С. 133-134.

5. Волченко Н.Н Скрининг штаммов нефтеокисляющих бактерий по комплексу поверхностно-активных свойств / H.H. Волченко, Д.В. Нимченко, Э.В. Карасёва // Материалы международной конференции "Проблемы биодеструкции техногенных заг рязнителей окружающей среды".—Саратов.—2005. -С. 12.

6. Волченко H.H. Детоксикация нефтешламов, длительно хранившихся в амбарах-накопителях г. Новороссийска / H.H. Волченко // Сборник научных статей победителей конкурса "Экологичные технологии". — Москва. — 2005. -С. 17-20.

19 i

7. Волченко H.H. Штаммы-продуценты биосурфактантов в коллекции уг-леводородокисляющих бактерий Кубанского государственного университета / H.H. Волченко, Э.В. Карасёва // Тезисы докладов 2-й Международной конференции "Микробное разнообразие 2005".—Пермь—Казань. - 2005. -С. 17-18.

8. Нимченко Д.В. Сравнение поверхностно-активных свойств культур уг-леводородокисляющих бактерий при росте на питательном агаре и жидкой минеральной среде с гексадеканом / Д.В. Нимченко, H.H. Волченко // Труды 2-й Всероссийской научной конференции молодых учёных и студентов. - Краснодар. - 2005. - С. 90-91. - ,. , -

9. Ситенкова Е.В. Продукция биосурфактантов углеводородокисляющи-мй бактерйями при росте на питательном агаре / Е.В. Ситенкова, H.H. Волченко // Труды 2-й Всероссийской научной конференции молодых учёных и студентов.—Краснодар. —2005.—С. 92-93,

10. Нимченко Д.В. Зависимость сурфактантных свойств жидких культур углеводороде кисляющих бактерий от источника углерода в среде и продолжительности культивирования / Д.В. Нимченко, H.H. Волченко, Э.В. Карасёва// Сборник тезисов Международной школы-конференции "Биология -наука XXI века". - Пущино. - 2006. - С. 387.

11. Волченко H.H. Скрининг у глеводородокисляющих бактерий—продуцентов поверхностно-активных веществ биологической природы и их применение в опыте по ремедиации нефтезагрязнённой почвы и нефтешлама/ H.H. Волченко, Э.В. Карасёва//Биотехнология.—2006. - №2. - С. 57-62.

Изд. лиц. серия ИД № 05975 от 03.10.2001 Подписано в печать 31.05.06

Формат60х84 1/16 Усл.печ.л. 1,22 Уч.-гад.л. 1,01

Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ 239

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волченко, Никита Николаевич

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Типы микробных сурфактантов, их физиологическая роль.

1.2 Методы оценки продукции сурфактантов микроорганизмами, скрининг культур-продуцентов.

1.3 Гидрофильно-гидрофобные свойства клеток углеводородокисляющих бактерий.

1.4 Влияние условий культивирования на продукцию биоПАВ углеводородокисляющими бактериями.

1.5 Микробная биодеградация углеводородных загрязнений, применение СПАВ и биоПАВ.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Бактериальные штаммы.

2.2 Питательные среды и субстраты.

2.3 Условия культивирования микроорганизмов, получение биомассы и куль-туральных жидкостей.

2.4 Методы регистрации поверхностно-активных свойств.

2.4.1 Измерение величин поверхностного натяжения.

2.4.2 Измерение эмульгирующей активности.

2.4.3 Измерение уровня гидрофобности поверхности клеток.

2.5 Химическое выделение биосурфактантов.

2.6 Оценка эффективности штаммов - продуцентов биосурфактантов в модельных экспериментах по биоремедиации.

2.6.1 Микробиологические методы анализа.

2.6.2 Определение концентрации нефтепродуктов, азота, фосфора.

2.6.3 Оценка фитотоксичности нефтезагрязнённых субстратов.

2.7 Методы математического планирования эксперимента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3. СКРИНИНГ КУЛЬТУР-ПРОДУЦЕНТОВ БИОСУРФАКТАНТОВ

3.1 Поверхностно-активные свойства бактерий при росте на питательном агаре

3.2 Поверхностно-активные свойства культур при росте в жидкой минеральной среде с углеводородами.

3.3 Определение локализации биосурфактантов в микробных культурах

4. ГИДРОФОБНОСТЬ КЛЕТОК КАК ФАКТОР, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЙ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ЖИДКИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР.

4.1 Естественная гидрофобность клеток и эмульгирующая активность S, R- и М-форм культур на жидкой минеральной среде с углеводородом.

4.2 Гидрофобность суспендированных клеток как фактор, определяющий уровень поверхностного натяжения и эмульгирующую активность жидких культур углеводородокисляющих бактерий.

5. ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ХИМИЧЕСКИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРОБНЫХ СУРФАКТАНТОВ.

5.1 Активность биосурфактантов углеводородокисляющих культур, выращенных на питательном агаре.

5.2 Активность биосурфактантов некоторых штаммов, выращенных на жидкой минеральной среде с углеводородом.

5.2.1 Активность клеточно-связанных биосурфактантов.

5.2.2 Активность экстрацеллюлярных биосурфактантов.

6. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ БИОСУРФАКТАНТОВ

6.1 Поверхностно-активные свойства культур при росте на различных типах сред.

6.2 Зависимость поверхностно-активных и ростовых свойств жидких культур от соотношения углерода, азота и фосфора в среде.

6.3 Поверхностно-активные свойства культур при росте на различных гидрофобных источниках углерода.

6.4 Зависимость поверхностно-активных свойств жидких культур от продолжительности культивирования.

6.5 Характер расслоения биомассы и поверхностно-активные свойства жидких культур.

7. МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННЫХ СУБСТРАТОВ ПОСРЕДСТВОМ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ БИОПАВ.

7.1 Влияние культур-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ на ремедиа-цию нефтезагрязнённого чернозёма в сравнении с другими стимулирующими агентами.

7.2 Влияние культур-продуцентов биосурфактантов на детоксикацию неф-тешлама в сравнении с активированными аборигенными штаммами.

7.3 Биодеградация нефти на поверхности воды культурами - продуцентами биосурфактантов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства углеводородокисляющих актинобактерий"

Актуальность проблемы

Крупнейшей проблемой, стоящей перед человечеством, является разрушение естественных экосистем под действием антропогенной нагрузки. Одним из основных фактором давления общепризнанно считается накопление в биосфере всевозможных поллютантов, в том числе сырой нефти и продуктов её переработки. Мощное негативное влияние нефтепродуктов на атмосферу, гидросферу, почвенный покров Земли обусловлен рядом факторов: активным и всё более возрастающим применением углеводородного сырья во всех отраслях хозяйственной деятельности человека; широким распространением нефтедобывающих, транспортирующих, перерабатывающих и потребляющих предприятий; характерными физико-химическими и токсическими свойствами углеводородов, обусловливающими их низкую биоде-градабельность в естественных экосистемах.

Для ликвидации углеводородных загрязнений в настоящее время выработан комплекс мер - применяется механическая очистка, физическая и химическая переработка контаминирующих нефтепродуктов [Бельков В.В., 1995; Панченко JI.B. и др., 2003]. Однако, единственным методом, позволяющим преобразовать углеводородные поллютанты в безвредные соединения максимально естественным путём, является биоремедиация. Ключевым звеном любой биоремедиационной технологии являются микроорганизмы-деструкторы, способные утилизировать нефтепродукты в качестве источника углерода и энергии, преобразуя их в микробную биомассу, углекислый газ и другие нетоксичные метаболиты [Андресон Р.К., 1993]. Мощным лимитирующим фактором использования микробного разложения нефтепродуктов служит гидрофобная природа углеводородов, что приводит как к сорбции их на различных поверхностях и переходу в биологически труднодоступную форму, так и к невозможности эффективного контакта с микробными клетками, имеющими, как правило, гидрофильный характер внешних поверхностей. Перспективным способом устранить это затруднение может стать применение микробных поверхностно-активных веществ - биосурфактантов [Banat I.M. et. al., 2000]. БиоПАВ способны как диспергировать углеводороды, переводя их в водную фазу и повышая биологическую доступность, так и модифицировать внешние поверхности бактерий путём гидрофобизации обеспечивая прямой контакт с молекулами углеводородов. Биосурфактанты, в отличие от своих синтетических аналогов, как правило нетоксичны и био-деградабельны, могут синтезироваться микробами из дешёвого сырья. Всё это делает актуальным поиск культур - продуцентов биоПАВ и исследование их свойств.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлся поиск углеводородокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов, изучение факторов, влияющих на поверхностно-активные свойства культур-продуцентов, экспериментальная проверка эффективности отобранных штаммов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• Определить критерии отбора бактерий - продуцентов биосурфактантов.

• Провести скрининг потенциальных продуцентов среди коллекции неф-теокисляющих бактерий Кубанского государственного университета, отобрать наиболее активные штаммы;

• Исследовать влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства культур - продуцентов биоПАВ, определить направления оптимизации, способствующие получению культур с повышенными сурфактантными свойствами;

• Выделить микробные биосурфактанты наиболее активных штаммов, охарактеризовать их свойства;

• Экспериментально проверить эффективность биоремедиации нефте-загрязнённых субстратов отобранными углеводородокисляющими бактериями - продуцентами биоПАВ.

Научная новизиа работы.

Охарактеризованы по поверхностно-активным свойствам ряд бактерий-деструкторов нефтепродуктов. Впервые показано, что культуры нефтеокис-ляющих бактерий, длительно поддерживающиеся на питательном агаре, способны синтезировать биосурфактанты при культивировании на этой среде, а эмульгирующая активность, показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний могут служить критериями отбора штаммов - продуцентов биосур-фактантов. Впервые выявлена важная роль гидрофобности клеток в формировании поверхностно-активных свойств жидких бактериальных культур — эмульгирующей активности и способности снижать поверхностное натяжение среды. Показано, что наибольшее влияние на поверхностно-активные свойства жидких культур исследованных штаммов оказывает концентрация углерода в среде.

Часть исследований проведена в рамках работы по грантам INTAS 012150, CAF "Экологичные технологии".

Практическая значимость работы

Отобранные штаммы-продуценты биосурфактантов могут быть использованы для создания нового бактериального биопрепарата для очистки загрязнённых нефтепродуктами субстратов. Полученные в ходе диссертационного исследования результаты используются в деятельности центра "Биотехнология" Кубанского государственного университета по биологической рекультивации нефтезагрязнённых почв и грунтов, детоксикации нефтешла-мов.

Основные положения диссертации., выносимые на защиту

1. Скрининг штаммов-продуцентов клеточно-связанных и экстрацеллюляр-ных биосурфактантов.

2. Роль гидрофобности клеток в формировании поверхностно-активных свойств жидких бактериальных культур.

3. Критерии отбора бактерий - продуцентов биосурфактантов при культивировании на питательном агаре.

Апробация работы

Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Международная школа-конференция "Биология - наука XXI века" (г. Пущино, 2001 и 2006 гг); 1st European microbiological congress. (Slovenia, Lubjana 2003 г); 2-й съезд общества биотехнологов России (Москва, 2004 г); "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005 г); 2-я международная конференция "Микробное разнообразие 2005" (Пермь-Казань, 2005 г); 2-я Всероссийская научная конференция молодых учёных и студентов. (Краснодар, 2005 г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, одна работа принята к печати, подана заявка на патент.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа изложена на 148 листах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 13 таблиц. Список литературы включает 178 наименований, в том числе 70 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Волченко, Никита Николаевич

выводы

1. В результате скрининга коллекции нефтеокисляющих бактерий отобраны штаммы - продуценты клеточно-связанных (Rhodococcus erythropolis В2, Rhodococcus sp. J8, Rhodococcus sp. F2) и экстрацеллюлярных (.Nocardia sp. K5) биосурфактантов, в культурах которых отмечено снижение поверхностного натяжения до 30,8 мН/м и эмульгирующая активность до 57 %. Впервые показана возможность получения поверхностно-активных культур при росте на питательном агаре.

3. Гидрофобность клеток играет ключевую роль в формировании поверхностно-активных свойств жидких культур бактерий - продуцентов клеточно-связанных биосурфактантов: увеличение гидрофобности суспендированных клеток приводит к снижению уровня поверхностного натяжения и росту эмульгирующей активности жидких культур.

4. При культивировании на питательном агаре индекс эмульгации, показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний могут служить критериями отбора штаммов-эмульгаторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из задач данной работы был поиск продуцентов поверхностно-активных веществ среди коллекции нефтеокисляющих бактерий кафедры генетики и микробиологии Кубанского государственного университета.

Первичному скринингу на питательном агаре подверглись 39 штаммов, измерение поверхностно-активных свойств проводили в суспензиях клеток, смытых минеральной средой с питательного агара. Клетки, суспендированные в жидкой среде, сообщали ей уровень поверхностного натяжения в диапазоне 50-60 мН/м, что сравнимо с ПН исходной чистой среды, эмульгирующую активность проявили 16 из 39 штаммов. Пятнадцать из .16 культур, проявивших эмульгирующую активность на ПА, обладали таковой и на жидкой среде с гексадеканом. Таким образом, измерение индекса эмульгации бактерий, выращенных на питательном агаре, может служить в качестве несложного теста для первичного отбора культур - биоэмульгаторов, регистрация уровня ПН нецелесообразна.

Для 10 штаммов, проявивших разную степень поверхностно-активных свойств определяли уровень поверхностного натяжения, индекс эмульгации жидких культур и их супернатантов, показатель гидрофобности клеток. Перспективными в качестве продуцентов биоПАВ считаются микроорганизмы, в среде культивирования которых наблюдается снижение ПН ниже 40-50 мН/м. Для трёх штаммов было зафиксировано ПН ниже 50 мН/м (R. erythropolis Fl, Nocardia sp. К5, Gordonia sp. 28), для трёх - ниже 40 мН/м (Rhodococcus sp. F2, R. erythropolis B2, Rhodococcus sp. J8), для одного - ниже 30 мН/м (G. amicalis К8). Максимальной эмульгирующей активностью (45-57 %) обладали штаммы В2, J8, F2. Для них характерна и высокая устойчивость эмульсий. Таким образом, исследуемые штаммы являются продуцентами биогенных поверхностно-активных веществ, способных как эмульгировать углеводороды, так и снижать поверхностное натяжение среды роста.

Важной характеристикой микробных биоПАВ является тип локализации -связанный с клеточной стенкой или экскретируемый в окружающую среду. Локализация биоПАВ указывает на физиологию взаимодействия бактерий с углеводородами и помогает выбрать направление биотехнологического производства культур-продуцентов сурфактантов. Сравнивали сурфактантные свойства нативйых жидких культур и их супернатантов. У последних они отсутствовали, за исключением штаммов К5 и Z8, проявивших снижение ПН до 40-42 мН/м и слабую эмульгирующую активность. Это свидетельствует о клеточно-связанном характере локализации биосурфактантов большинства штаммов.

Таким образом, в результате скрининга отобраны штаммы-продуценты клеточно-связанных биоПАВ Rhodococcus sp. F2, R. erythropolis B2, Rhodococcus sp. J8 и внеклеточных биоПАВ Nocardia sp. K5, Gordonia sp. Z8.

В случае продукции бактериями экстрацеллюлярных биоПАВ, величины ПН и ЭА жидких культур или их супернатантов можно в определённой мере считать показателем концентрации сурфактантов в жидкой среде. В случае же синтеза бактериями клеточно-связанных биоПАВ, прямая химическая аналогия невозможна, поскольку поверхностное натяжение и индекс эмульгации такой микробной культуры опосредованы поверхностно-активными свойствами биомассы клеток. Скрининг бактерий-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ методом химического выделения сурфактантов из биомассы клеток трудоёмок и дорогостоящ. Поэтому важен поиск параметра, отражающего сурфактантные свойства бактерий-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ. В качестве такового мы использовали показатель гидрофобности клеток. Сравнивали величину поверхностного натяжения образцов жидких культур R. erythropolis F1, выращенных на разных вариантах среды МС-С16 и показатель гидрофобности клеток этих культур. В образцах, где клетки имели больший ПГ, отмечено большее снижение ПН. Коэффициент корреляции Пирсона между гидрофобностью суспендированных клеток и поверхностным натяжением культур составлял r^= 0,90 при р-0,000. При исследовании сурфактантных свойств 10 штаммов отмечено, что клетки культур, проявивших максимальное снижение поверхностного натяжения и высокую эмульгирующую активность, обладали наибольшей гидрофобностью, и наоборот. Коэффициент корреляции Пирсона между эмульгирующей активностью жидких культур и гидрофобностью суспендированных в них клеток составляет ^=0,74 при /?=0,000, между поверхностным натяжением жидких культур и гидрофобностью суспендированных в них клеток составляет Гху=-0,61 при /7=0,000. Таким образом, жидкие культуры с более гидрофобными клетками, обладают большими сурфактантными свойствами. Данная зависимость может позволить оптимизировать биотехнологическое производство бактерий-продуцентов клеточно-связанных сурфактантов - для получения жидких культур с поверхностно-активными свойствами не обходимо вести оптимизацию условий культивирования в направлении повышения липофильности клеток и увеличения выхода биомассы.

Имело место нормальное распределение штаммов по показателю гидрофобности с пиком ПГ 20-29 %. В каждом интервале гидрофобности определили долю штаммов, культуры которых обладали эмульгирующей активностью при росте на жидкой среде с углеводородом. Наблюдалось увеличено ние доли биоэмульгаторов от ПГ 10-19 % к ПГ 40-49 %. Столь же высока доля эмульгаторов в интервале ПГ 0-9 %. Оценка морфотипа культур показала, что большинство штаммов с ПГ 0-9 % являлись М-формами, а с ПГ 10-49 % -R-, S-формами. Оценка доли штаммов, способных к деструкции гексадекана в жидкой минеральной среде, продемонстрировала аналогичную картину -происходит увеличение доли деструкторов по мере увеличения естественной гидрофобности клеток. Максимальное содержание среди штаммов с ПГ 0-9 % и 40-49 %. По нашему мнению, эта картина связана с принципом взаимодействия нефтеокисляющих бактерий с углеводородным субстратом - клетки S- и R-форм, имеющие ПГ 10-49 %, способны к непосредственному контакту с углеводородом за счёт гидрофобной клеточной поверхности, обусловленной наличием в ней липидных компонентов. Чем большей "естественной" гидрофобностью обладают бактерии, тем более вероятно, что культура способна к эмульгировании и усвоению углеводорода. Клетки М-форм обладают низким уровнем ПГ и активно продуцируют в среду внеклеточные слизи. Вероятно, их эмульгирующая активность и способность к деструкции парафинов обусловлена продукцией экстрацеллюлярных биоПАВ, диспергирующих углеводороды в водной среде. Штаммы М-форм - Rhodococcus sp. Z2, Rhodococcus sp. F5, Arthrobacter sp. F6, проявляли на среде MC-C16 интенсивный рост, а супернатанты их культур обладали эмульгирующей активностью. Полученные результаты можно использовать как основу для нового метода отбора бактерий-продуцентов биосурфактантов: при культивировании на питательном агаре в качестве потенциальных продуцентов следует отбирать штаммы М-форм, среди R- и S-форм - обладающие эмульгирующей активностью и показателем гидрофобности >20 %.

В результате скрининга были отобраны штаммы, культуры которых проявляли поверхностно-активные свойства. Это свидетельствует о продукции клетками экстрацеллюлярных (штамм Nocardia sp. К5) или клеточно-связанных (штаммы Rhodococcus erythropolis В2, Rhodococcus sp. F2, Rhodococcus sp. J8) сурфактантов. С целью проверки этого факта и подтвержденйя результатов скрининга, осуществили химическое выделение поверхностно-активных соединений бактериальных культур выросших на питательном агаре и жидкой минеральной среде с гексадеканом.

Из биомассы клеток гидрофобных штаммов, выращенных на среде МС-С16, выделили суммарные липиды. Последние были способны как эмульгировать углеводороды, так и снижать поверхностное натяжение жидкой среды, что позволяет считать их биосурфактантами. Полученные соединения слабо растворялись в воде и полностью растворялись в дизельном топливе, образовывали эмульсии типа "масло в воде". Устойчивость эмульсий, образованных биосурфактантами штаммов В2 и F2 составляла более 120 ч.

Из культуральной жидкости штамма Nocardia sp. К5 спиртовым осаждением получено' поверхностно-активное соединение, эмульгирующее алканы и дизтопливо (ИЭ 20 %), а экстракцией эфиром получен биоПАВ, снижающий поверхностное натяжение воды до 41 мН/м.

На питательном агаре исследовали 7 штаммов, обладающих эмульгирующей активностью и 7 штаммов, не проявивших таковой (контрольная группа). Липиды, выделенные из биомассы клеток эмульгировали дизельное топливо до 55 % и снижали поверхностное натяжение воды до 25,9 мН/м, то есть являлись биосурфактантами. БиоПАВ из клеток шести штаммов-эмульгаторов показали ИЭ 23-55 %, липиды 6 из 7 штаммов контрольной группы обладали гораздо более низкими значениями индекса эмульгации 0-5 %. Максимальной устойчивостью (до 4-5 суток) обладали эмульсии биосурфактантов, выделенных из родококков, минимальной (мене 1 часа) - из псевдомонад. Таким образом, исследуемые бактерии способны к продукции биоПАВ на стандартной плотной среде - питательном агаре, а применяемый тест на индекс эмульгации отражает поверхностно-активные свойства продуцируемых клетками биосурфактантов.

Из представленных результатов видно, что штаммы Fl, В2, J8, F2, К8, К5, отобранные в скрининге, способны к синтезу биоПАВ, что подтверждается химическим выделением. Среди исследованной выборки преобладают продуценты клеточно-связанных сурфактантов липидной природы, что характерно для актинобактерий. Обнаружено явление экстракции биоПАВ из биомассы родококков нефтепродуктами (смесь С7-С17), которые в результате эмульгировались. Возможность перехода клеточно-связанных биосурфактантов из клеток в углеводородную среду свидетельствует о возможности применения в качестве поверхностно-активного агента в биоремедиации непосредственно биомассы бактерий-продуцентов. Высокое сродство синтезируемых липидных биоПАВ к углеводородной фазе, их малая растворимость в водной среде, позволит локализовать продуцируемые сурфактанты в нефтяной фазе и избежать их потерь за счёт вымывания водой. Это свойство является наиболее перспективным в случае применения углеводородокисляющих бактерий-продуцентов биоПАВ для ликвидации нефтяных загрязнений на поверхности водоёмов.

Общепринятой средой для культивирования бактерий, синтезирующих биоПАВ, является жидкая минимальная среда с гидрофобным источником углерода, биоПАВ могут продуцироваться бактериями при росте в жидкой среде с водорастворимыми источниками углерода, известны, отдельные факты синтеза микроорганизмами сурфактантов при росте на различных плотных средах. Исследовали свойства штаммов-продуцентов биоПАВ при культивировании на жидкой минимальной среде (МС-С16), жидкой богатой среде (МПБ), плотной богатой среде (ПА).

В целом, поверхностно-активные свойства культур увеличивались в ряду сред ПА - МПБ - МС-С16, при наличии штаммоспецифических отличий. Сравнение значений ПН, ИЭ, ПГ подтверждает отмеченную тенденцию повышения сурфактантных свойств культур при увеличении гидрофобности суспендированных клеток. У трёх культур (В2, J8, К5) на МПБ более активно продуцируются внеклеточные эмульгаторы. В целом, оптимальным типом среды для получения культур с поверхностно-активными свойствами является жидкая минеральная среда с углеводородом, хотя возможно применение и ПА, МПБ.

Исследовали меру влияния на поверхностно-активные свойства культур концентрации и соотношения углерода (С), азота (N) и фосфора (Р) в среде МС-С16 методом полного факторного эксперимента ПФЭ-23 (ПФЭ-24). Зависимость сурфактантных свойств культур от минерального состава среды носит сложный характер - имеет место положительное и отрицательное влияние концентрации отдельных элементов и их совместный эффект.

Наибольшее влияние для всех культур оказывала концентрация углерода в среде. Так влияние C:N:P на снижение поверхностного натяжения Rhodococcus sp. J8 отражается уравнением: Y=34.52-7.02x7-1.83x3, где Y-уровень ПН, xl - содержание углерода, хЗ -содержание фосфора. Оптимальные для снижения ПН культур соотношения C:N:P штаммоспецифичны, но для всех штаммов характерно превышение содержания азота над фосфором -от двух до десяти раз. Исследовали зависимость гидрофобности клеток от концентрации С, N, Р в среде на примере штамма R. erythropolis F1. При увеличении соотношения C:N гидрофобность клеток увеличивается, а поверхностное натяжение жидкой культуры (или ресуспендированных в чистой среде клеток) при этом уменьшается.

Исследовали зависимость поверхностно-активных свойств жидких культур и их супернатантов от источника углерода, как наиболее значимого фактора, на минеральной жидкой среде. В качестве С-субстратов сравнивали ряд н-алканов с С7 по Сп и два сложных гидрофобных источника углерода - дизельное топливо и растительное масло. Для всех четырёх штаммов минимальные уровни поверхностного натяжения в жидких культурах отмечены при росте на тридекане, максимальные - на гептане и октане (на этих алканах практически отсутствовал рост бактерий). Максимальная эмульгирующая активность культур трёх штаммов (за исключение J8) отмечена при росте на гексадекане, минимальная - на гептане, октане, декане. Высокий уровень поверхностно-активных свойств отмечен и при культивировании на дешёвых гидрофобных источниках углерода - дизельном топливе и растительном масле.

Гидрофобность клеток штаммов-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ (F2, J8, В2) повышается по мере увеличения размеров молекулы С-субстрата от С7 до С17, для штамма-продуцента экзосурфактантов К5 таковой тенденции не наблюдается.

Продукция биоПАВ может быть связана с различными фазами роста бактериальной культуры. Измерение сурфактантных свойств жидких культур демонстрирует резкое их возрастание в течение первых-вторых суток роста: так у Rhodococcus sp. F2 ПН за первые сутки снижается с 57,3 до 30,3 мН/м, R. erythropolis В2 за первые-вторые сутки снижается с 56,8 до 32,0 мН/м, эмульгирующая активность соответственно возрастает до 53 и 59 %. После резкого увеличения сурфактантных свойств культур в течение логарифмической фазы роста, они относительно стабилизируются на протяжении стационарной фазы роста. Аналогичную динамику имеет гидрофобность бактерий-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ, что согласуется с выводом о зависимости поверхностно-активных свойств культур от ПГ клеток. У штамма-продуцента внеклеточного биоПАВ Nocardia sp. К5 наблюдалась более сложная картина изменения свойств, активность внеклеточного сурфактанта была максимальной на 3-4 сутки роста.

Характер динамики сурфактантных свойств, свидетельствует о рост-связанном типе продукции биосурфактантов исследуемыми штаммами. Практическим выводом является определение оптимальной продолжительности культивирования в пределах 4 суток - к этому времени культуры уже достигают высокого уровня поверхностно-активных свойств, переходят в стационарную фазу роста, дальнейшее ферментирование экономически нецелесообразно. Среди четырёх исследованных штаммов относительно наиболее активным является R. erythropolis В2, как проявивший максимальную эмульгирующую активность.

В модельном эксперименте проведено сравнительное исследование влияния отобранных штаммов-продуцентов клеточно-связанных биоПАВ (F2, В2, J8), коммерческих сурфактантов, минеральной добавки на деструкцию нефти, микрофлору и фитотоксичность загрязнённого кубанского чернозёма.

Внесение бактерий в стерильную почву полностью компенсировало её углеводородокисляющий потенциал. При сравнительно равном уровне снижения концентрации нефтепродуктов, конечная фитотоксичность почвы различается при разных методах обработки, будучи максимальной при обработке СПАВ. Оптимальные показатели зафиксированы при внесении жидкой культуры R. erythropolis В2, оказавшей стимулирующее воздействие на рост пшеницы, при снижении концентрации нефти на 61 %. Фитостимулирующий эффект данного штамма обусловлен активной продукцией клетками экзоме-таболитов в процессе деструкции нефтепродуктов. В опыте по обработке семян пшеницы, помещённых в нефтезагрязнённую почву, культуральной жидкостью R. erythropolis В2 и водой, всхожесть составила 64 и 32 % соответственно.

Успешный эксперимент с биоремедиацией загрязнённой почвы позволил перейти к опыту с нефтешламом, как более сложным для биодеградации субстратом. Нефтешлам инокулировали коллекционными штаммами-продуцентами клеточно-связанных и экстрацеллюлярных биосурфактантов и аборигенными культурами шлама, предварительно выделенными и активированными in vitro. В результате обработки достигнуто снижение содержания нефтепродуктов в шламе на 39-44 % и уменьшение фитотоксичности шлама. Степень деструкции углеводородов по истечении месяца была практически одинакова. Более эффективная детоксикация достигнута при обработке коллекционными культурами, концентрация нефтеокисляющей (3,9*106 о

КОЕ/г) и гетеротрофной (1,3*10 КОЕ/г) микрофлоры превышала на порядок таковые в варианте с внесением аборигенных культур. Снижение токсичности, увеличение концентрации и разнообразия микрофлоры свидетельствует о появлении у нефтешлама биологических свойств и позволяет применять к нему методы фиторемедиации.

Сравнили влияние штаммов Rhodococcus sp. J8 и Rhodococcus sp. 22 на деградацию слоя нефти (слика) на поверхности воды. Первый был отобран как имеющий липофильные клетки, обладающие положительной плавучестью в воде, продуцент клеточно-связанных биоПАВ; второй - как имеющий гидрофильные клетки, хорошо суспендирующиеся в воде, продуцент внеклеточных биоПАВ. За 10 суток обе культуры полностью диспергировали слой нефти, с исходной толщиной 3 мм, и утилизировали её на 50 %. Однако в случае с внесением штамма J8, процесс прироста биомассы и разрушения слика происходил быстрее, на 5-е сутки концентрация клеток составляла 3,7* 106 КОЕ/мл, в то время как Z2 - 5,7*104 КОЕ/мл. Биомасса J8 с сорбированной нефтью всплывала, Z2- равномерно распределялась в водной фазе. Аналогичные результаты были получены в опыте с применением гидрофобных всплывающих (ПГ 60-95 %) и гидрофильных (ПГ 30-42 %), суспендирующихся в воде, клеток Nocardia sp. К5 - лучшим диспергатором и деструктором плавающей нефти являлась гидрофобная плавучая фаза биомассы. Данное явление обусловлено как положительной плавучестью, лучшей адгезивной способностью на нефтепродуктах гидрофобных клеток, так и продукцией ими углеводород-растворимых липидных биоПАВ, экстрагируемых нефтепродуктами из биомассы клеток. Штаммы с такими свойствами могут быть перспективны в качестве деструкторов и биодиспергаторов нефти на поверхности акваторий, так как их биомасса концентрируется на поверхности раздела вода/нефть и не диффундирует в толщу водоёма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волченко, Никита Николаевич, Ставрополь

1. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества свойства и применение. Л.: Химия. 1981. 302 с.

2. Ананько Г.Г., Пугачёв В.Г., Тотменина О.Д., Репин В.Е. Устойчивость нефтеокисляющих микроорганизмов к низким температурам. // Биотехнология. 2005. № 5. С. 63-69.

3. Андресон Р.К. Биотехнологические методы ликвидации загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами. Обзор, информ. Сер. "Защита от коррозии и охрана окружающей среды". М.: ВНИИОЭНГ. 1993. 24 с.

4. Беляев С.С., Борзенков И.А., Глумов И.Ф., Ибатуллин, P.P., Милехина, Е.И., Иванов М.В. Активация современной геохимической деятельности пластовой микрофлоры как основа биогеотехнологии повышения нефтеизвлечения. // Микробиология. 1998. № 6. С. 851-858.

5. Ботвинко И.В. Егоров, Ландау, Милько, Свиридов. Синтез экзополиса-харидов и протеолитических ферментов R-, S- и М-формами Mycobacterium lacticolum.J/ Микробиология. 1979. № 3. С. 439-442.

6. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы. // Биотехнология. 1995. № 4. С. 20-27.

7. Веркман К., Вильсон П. Физиология бактерий. М.: Иностранная литература. 1954. 548 с.

8. Ганиткевич Я.В. Поверхностно-активные вещества микробного происхождения. // Биотехнология. 1988. № 5. С. 575-583.

9. Гвоздяк Р.И., Матышевская И.С., Григорьев Е.Ф., Литвинчук О.А. Микробный полисахарид ксантан. 1989. Киев: Наукова думка. 212 с.

10. ГОСТ 26488-85 Определение нитратов по методу ЦИАНО // Сборник методик и инструктивных материалов по определению вредных веществ для контроля источников загрязнения окружающей среды. Часть. VII. Краснодар. 1997. 184 с.

11. ГОСТ 26489-85 Определение обменного аммония по методу ЦИАНО // Сборник методик и инструктивных материалов по определению вредных веществ для контроля источников загрязнения окружающей среды. Часть. VII. Краснодар. 1997.184 с.

12. Градова Н.Б., Горнова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.Н. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязнённых почв. // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. № 3. С.318-321.

13. Григорьян А.А. Дисс. канд. биол. наук. Москва. 2004. 154 с.

14. Гринберг, Пирог Т.П., Полищук A.M., Краснопевцева Н.В. Биополимеры, используемые для увеличения нефтеотдачи пластов. // Микро-биол. журн. 1990. № 2. С. 100-112.

15. Егоров Н.С., Коронелли Т.В., Милько Е.С., Степанова Р.А., Розынов Б.В., Плетенко М.Г. Сравненение липидного состава R-, S- и М- вариантов Rhodococcus rubropertinctus. // Микробиология. 1986. № 2. С. 227-230.

16. Елисеев С.А., Кучер Р.В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология. Киев: Наукова думка. 1991. 115 с.

17. Загвоздкин В.К., Муляк В.В., Лукашов В.Н. Результаты испытаний технологий восстановления нефтезагрязнённых земель на опытных участках в 2001-2003 гг. // Экология и промышленность России, август 2004 с. 32-34

18. Звягинцева И.С., Поглазова М.Н., Готоева М.Т., Беляев С.С. Влияние солёности среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями. // Микробиология. 2001. № 6. С.759-764.

19. Звягинцева И.С., Суровцева Э.Г., Поглазова М.Н., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями. // Микробиология. 2001. № 3. С. 321-328.

20. Ившина И.Б. и др. Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов//М.: Наука. 1994. 164 с.

21. Ившина И.Б., Куюкина М.С. Селективное выделение пропанокисляю-щих родококков с использованием антибиотических веществ. // Микробиология. 1997. № 4. С. 494-500.

22. Илларонова В.И., Шишканова Н.В., Хафербург Д., Финогенова Т.В. Эмульгирующая активность дрожжей при росте на нормальных алка-нах. // Микробиология. 1984. № 3. С. 423-426.

23. Каменциков Ф.А., Богомольский Е.И. Нефтяные сорбенты. Москва-Ижевск. 2005. 268 с.

24. Карасёва Э.В., Гирич И.Е., Худокормов А.А., Алёшина Н.Ю., Карасёв С.Г. Биоремедиация чернозёмной почвы, загрязнённой нефтью. // Биотехнология. 2005. № 2. С. 67-72.

25. Карпенко Е.В., Шульга А.Н., Щеглова Н.С., Елисеев С.А., Вильданова-Марцишин Р.И., Туровский А.А. Поверхностно-активные соединениякультуры Pseudomonas sp. S-27. // Микробиол. журн. 1996. № 5. С. 1823.

26. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир. 1975. 322 с.

27. Киреева Н.А. Биодеструкция нефти в почве культурами углеводородо-кисляющих микроорганизмов. // Биотехнология. 1996. № 1. С. 51-54.

28. Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Онегова Т.С., Бакаева М.Д. Комплексная биоремедиация нефтезагрязнённых почв для снижения токсичности. // Биотехнология. 2004. № 6. С.63-70.

29. Кистень А.Г., Рой А.А., Курдиш И.К., Шевченко Т.В. Адгезия смешанных культур метанотрофов к твёрдым материалам. // Прикл. био-химиия и микробиология. 1998. № 4. С. 414-418.

30. Комаров Е.В., Ганин П.Г. ^-потенциал капель эмульсии н-алканов и его роль в транспорте субстрата в клетки дрожжей. // Прикл. биохими-ия и микробиология. 2004. № 3. С. 323-331.

31. Комарова Т.Н., Поршнева О.В., Коронелли Т.В. Образование трегало-зы клетками R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis. II Микробиология. 1998. №3.C.428-431.

32. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Денисов Ю.В. Липиды парафинокис-ляющего штамма Pseudomonas aeruginosa. II Микробиология. 1982. № 4. С. 673-677.

33. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Денисов Ю.В. Химический состав и роль пептидогликолипида Pseudomonas aeruginosa в процессе усвоения углеводородов // Микробиология. 1983. № 5. С. 767-770.

34. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. М.: Наука. 1984. 158 с.

35. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г. Семененко М.Н. Родококки как природный сорбент углеводородов. // Микробиология. 1986. № 4. С. 683686.

36. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов,меченных тритием. // Прикл. биохимия и микробиология. 1988. № 2. С. 203-206.

37. Коронелли Т.В., Нестерова Е.Д. Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат. // Микробиология. 1990. № 6. С. 993-997.

38. Коронелли Т.В., Комаров Т.Н., Поршнева О.В. Липиды R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis. II Микробиология. 1995. № 6. С. 769-771.

39. Коронелли Т.В Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор). // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. № 6. С. 579-585.

40. Коронелли Т.В., Комаров Т.Н., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов Н.Б., Яненко А.С. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязнённую нефтью. // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. № 2. С. 198-201.

41. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В., Дермичева С.Г. Изменение липиднрго состава R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis при длительном хранении на лабораторной среде. // Микробиология. 1998. №5. С. 718-720.

42. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В., Ткебучава Л.Ф. Внеклеточные метаболиты углеводородокисляющих бактерий как субстрат для развития сульфатредукции. // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. № 5. С. 549-533.

43. Курдиш И.К. Гордиенко А.С., Кигель Н.Ф., Кистень А.Г. Сравнительный анализ адгезии различных видов метанотрофных бактерий к твёрдым материалам. // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. № 3. С. 245-250.

44. Лесык О.Ю., Елисеев С.А., Популях О.В., Карпенко Е.В. Образование поверхностно-активного комплекса культурой каротинсинтезирующих дрожжей Phaffia rhodozima и его эмульгирующие свойства. // Микро-биол. журн. 1990. № С. 37-41.

45. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Четвериков С.П., Сили-щев Н.Н. Оценка эффективности нового биопрепарата Ленойл для ре-медиации нефтезагрязнённых почв. // Биотехнология. 2004. № 1. С. 7782.

46. Максимов В.Н. Полный факторный эксперимент в биологии. М. 1980. 279 с.

47. Мейсель М.Н., Медведев Г.А., Помощникова Н.А, Федосеева Г.Е. О переходе полициклических ароматических углеводородов из одних дрожжевых клеток в другие. // Микробиология. 1971 № 6. С. 1108-1109.

48. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхардта. Т.2. 1984. 469 с.

49. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Кострикина Н.А., Беляев С.С. Свойства углеводородокисляющей бактерии Rhodococcus erythropolis, изолированной из нефтяного месторождения. // Микробиология. 1998. № 3. С. 328-332.

50. Милько Е.С., Ботвинко И.В., Степанова Р.Д., Егоров Н.С. Сравнительное изучение химического состава и некоторых свойств полисахаридов капсул М-, S- и R-вариантов Mycobacterium lacticolum. II Микробиология. 1983. №3. С. 388-391.

51. Московченко М.В., Стабникова Е.В., Иванов В.Н., Панежда И.А. Использование биогенных поерхностно-активных веществ в микробиологической очистке почвы от углеводородов нефти.// Микробиол. журн. 1993. № 1.С. 75-78.

52. Московченко М.В., Стабникова Е.В., Москаленко Н.В. Химический состав поверхностно-активных веществ, стимулирующих микробиологическую деградацию нефти. //Микробиол. журн. 1995. № 1. С. 92-95.

53. Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич JI.M. Роль диспергирующих средств в процессах трансформации и окисления нефти в водной среде. // Водные ресурсы. 2002. № 2. С. 221-225.

54. Муратова А.Ю., Турковская О.В., Антонюк Л.П., Макаров О.Е., Позднякова Л.И., Игнатов В.В. Нефтеокисляющий потенциал ассоциативных ризобактерий рода Azospirillum. II Микробиология. 1994. № 2. С. 248-254.

55. Мурыгина В.П., Войшвилло Н.Е., Калюжный С.В. Биопрепарат "Ро-дер" для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ RU 2 174 496 С2. Приоритет 1999.

56. Назаров А.В., Иларионов С.А. Потенциал использования растительно-микробного взаимодействия для биоремедиации. // Биотехнология. 2005. № 5. С. 54-62.

57. Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Григорьян А.А., Сюэ Я.-Ф., Беляев С.С., Иванов М.В. Образование нефтевытесняющих соединений микроорганизмами из нетфяного месторождения Дацин. // Микробиология. 2003. №2. С. 206-211.

58. Нестерова М., Мочалова О., Антонова Н. Физико-химические средства диспергирующего действия // Нефтяник. 1994. N° 11-12.67; Нетрусов А.И. и др. Практикум по микробиологии. М.: Academa. 2005. 604 с.

59. Никитина Е.В., Якушева О.И., Зарипов С.А., Галлиев Р.А., Гарусов А.В., Наумова Р.П. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама отхода нефтехимического производства. // Микробиология. 2003. № 5. С. 699-706.

60. Никовская Г.Н., Гордиенко А.С., Глоба Л.И. Гидрофильно-гидрофобные свойства микроорганизмов при различных условиях культивирования. // Микробиология. 1989. № 3. с. 448-451.

61. Панченко Л.В., Муратова А.Ю., Турковская О.В., Игнатов В.В. Введение в практические занятия по экологической биотехнологии с основами микробиологии. Саратов. 2005. 56 с.

62. Панченко Л.В., Турковская О.В., Дубровская Е.В., Муратова А.Ю. Методические рекомендации по биорекультивации нефтезагрязнённых земель. Саратов. 2003. 26 с.

63. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. 1978. 332 с.

64. Петрикевич С.Б., Кобзев Е.Н., Шкидченко А.Н. Оценка углеводородо-кисляющей активности микроорганизмов. // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. № 1. С. 25-30.

65. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Биотестирование почвы и воды, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений. // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. № 6. С. 652-655.

66. Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н., Карпенко Е.В. Образование поверхностно-активных веществ при росте штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гидрофильных и гидрофобных субстратах. // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. № 5. С. 544-550.

67. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приёмы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. // Биотехнология. 2005. № 1.С. 42-50.

68. Пономарёва JI.B., Крунчак В.Г., Торгованова В.А., Цветкова Н.П., Осипов А.И. Биоремедиация нефтезагрязнеённой почвы с использованием биопрепарата "Биосэт" и пероксида кальция. // Биотехнология. 1998. № 1.С. 79-84.

69. Практикум по коллоидной химии и электронной микроскопии. Под. ред. Воюцкого С.С. и Панич P.M. М.: Химия. 1974. 224 с.

70. Практикум по микробиологии. Под. ред. Егорова Н.С. М.: Изд-во МГУ. 1976. 308 с.

71. Рахимова Э.Р., Осипова A.JL, Зарипова С.К. Очистка почвы от нефтяного загрязнения с использованием денитрифицирующих углеводородокисляющих микроорганизмов. // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. № 6. С. 649-653.

72. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах. // Микробиология. 1982. № 2. С. 342347.

73. Сафаров А.Х. Дисс. канд. техн. наук. Казань. 2004. 110 с.

74. Сваровская Л.И., Алтунина Л.К. Активность почвенной микрофлоры в условиях нефтяных загрязнений. // Биотехнология. 2004. № 3. С.63-69.

75. Серебрякова Е.В., Дармов И.В., Медведев Н.П., Алексеев С.А., Рыбак С.И. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа. // Микробиология. 2002. № 2. С. 237-239.

76. Сидоров Д.Г., Борзенков И.А., Милёхина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании препарата Деворойл. // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. №3. С. 281-286.

77. Стабникова Е.В., Селезнёва М.В., Дульгеров А.Н., Иванов В.Н. Применение биопрепарата Лестан для очистки почвы от углеводородов нефти. // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. № 2. С. 219-223.

78. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки неф-тезагрязнённых почв. // Прикл. биохимия и микробиология. 1995. № 5. С. 534-539.

79. Старостина Н.Г., Кащаев А.Г., Ратнер Е.Н., Циоменко А.Б. Характеристика гидрофобности клеточной поверхности метанотрофных бактерий по их способности к адгезии на углеводородах. // Микробиология. 1991. №2. С. 185-191.

80. Суржко Л.Ф., Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев В.И., Головлёва Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками. // Микробиология. 1995. № 3. С. 393-398.

81. Тен Хак Мун, Кириенко О.А., Имранова Е.Л. Влияние фотосинтези-рующих бактерий и компоста на деградацию нефтепродуктов в почве. // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. № 2. С. 214-219.

82. Турковская О.В., Дмитриева Т.В., Муратова А.Ю. Штамм Pseudomonas aeruginosa — продуцент биоПАВ. // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. № 1. С.80-85.

83. Фомченков В.М., Ирхина И.А., Новиков И.А., Гуров Б.Н., Чугунов

84. B.А., Холоденко В.П. Исследование интегральной токсичности водной среды, загрязнённой нефтью и нефтепродуктами, с использованием бактериальных тестов. // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. № 6.1. C. 656-660.

85. Хабибуллина Ф.М., Шубаков А.А., Арчегова И.Б., Романов Г.Г. Исследование способности нефтеокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти. // Биотехнология. 2002. № 6. С. 57-62.

86. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир. 567 с.

87. Шульга А.Н. Карпенко Е.В., Елисеев С.А., Туровский А.А. Метод определения содержания анионогенных поверхностно-активных пепти-долипидов бактериального происхождения. // Микробиол. журн. 1993. № 1. С.85-89.

88. Шульга А.Н., Елисеев С.А., Карпенко Е.В., Кирчив А.Р., Туровский А.А. Биоэмульгатор, образуемый культурой Bacillus species, и его свойства. // Микробиол. журн. 1990. № 5. С. 78-82.

89. Шульга А.Н., Карпенко Е.В., Елисеев С.А., Туровский А.А., Коронелли Т.В. Внеклеточные липиды и поверхностно-активные свойства бактерии Rhodococcus erythropolis в зависимости от источника углеродного питания. // Микробиология. 1990. № 3. С. 443-447.

90. Ягофарова Г.Г. и др. Биотехнологический способ очистки отходов бурения от нефти и полимерных реагентов. // Прикл. биохимия и микробиология. 1990. № 2. С. 178-181.

91. Ягофарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности. Уфа: Изд-во УГНТУ. 2001.214 с.

92. Ягофарова Г.Г., Скворцова И.Н. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis. II Прикл. биохимия и микробиология. 1996. №2. С. 224-227.

93. Яковлева О.В. Дисс. канд. биол. наук. Уфа. 2004. 117 с.

94. Яскович Г.А. Роль гидрофобности клеточной поверхности в адсорбционной иммобилизации штаммов бактерий. // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. № 4. С. 410-413.

95. Яскович Г.А., Елькин Г.Э. Характеристика гидрофобности поверхности клеток микроорганизмов. // Микробиология. 1995. № 1. С. 137-139.

96. Яскович Г.Д., Яковлева Е.П. Изучение гидрофобности поверхности штаммов клеток бактерий. // Микробиология. 1996. № 4. С. 569571.

97. Ascencio F., Johansson G., Wadstrom T. Cell-surface charge and cell-surface hydrophobicity of collagen-binding Aeromonas and Vibrio strans. // Arch Microbiol. 1995. № 164. P. 223-230.

98. Banat I.M., Makkar R.S., Cameotra S.S. Potential commercial application of microbial surfactants. // Appl Microbiol Biotechnol. 2000. № 53. P. 495-508.

99. Barkay Т., Nabon-Venezia S., Ron E.Z., Rosenberg E. Enhancement of solubilization and biodegradation of polyaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier Alasan. // Applied and Environmental Microbiology. 1999. V. 65. № 6. P. 2697-2702.

100. Batista S.B., Mounteer A.H., Amorim F.R., Totola M.R. Isolation and characterization of biosurfactant/bioemulsifier-producing bacteria from petroleum contaminated sites. // Bioresource Technology. 2006. № 97. P. 868875.

101. Bednarski M.A. and Bednarski W. Influence of medium composition and aeration on the synthesis of biosurfactants produced by Candida antarctica. II Biotechnology Letters. 2000. № 22. P. 313-316.

102. Bell K.S., Philp J.C., Aw D.W.J., Christophi N. The genus Rhodococcus. II Journal of Applied Microbiology. 1998. № 85. P. 195-210.

103. Benincasa M., Abalos A., Olivera I., Manresa A. Chemical structure, surface properties and biological activities of the biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa LBI from soapstock. // Antonie van Leeuwen-hoek. 2004. №85. P. 1-8.

104. Bento F. M., F.A. de Oliveira Camargo, Океке В. C., Frankenberger W. T. Jr. Diversity of biosurfactant producing microorganisms isolated from soils contaminated with diesel oil. // Microbiological Research. 2005. № 160. P. 249-255.

105. Bruheim P., Bredholt H., Eimhjellen K. Effects of surfactants mixtures, including Corexit 9527, on bacterial oxidation of acetate and alkanes in crude oil. // Applied and Environmental Microbiology. 1999. № 4. P.1658-1661.

106. Burd G., Ward O.P. Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons on agar plates: the role of biosurfactants. // Biotehnology Techniques. 1996. №5. p. 371-374.

107. Christophi N., Ivshina I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation. // Journal of Applied Microbiology. 2002. № 93. P. 915-929.

108. Cooper D.G. Biosurfactants. // Microbiological Sciences. 1986. V. 3. № 5. P. 145-149.

109. Desai J.D.,; Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1997. V. 61.№1.P. 47-64.

110. Dia Kitamoto, Toru Ikegami, Gaby Tiemi Suzuki et. al. Microbial conversion of n-alkanes into glycolipid biosurfactants, mannosylerythritol lipids, by Pseudozyma (Candida antarctica). II Biotechnology Letters. 2001. №23. P. 1709-1714.

111. Fleck L.C., Bicca F.C., Ayub M.A. Physiological aspects of hydrocarbon emulsification, metal resistance and DNA profile of biodegrading bacteria isolated from oil polluted soils. // Biotechnology Letters. 2000. № 22. P. 285-289.

112. Gartshore J., Lim Y.C., Cooper D.G. Quantitative analysis of biosurfactants using Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy. // Biotechnology Letters. 2000. № 22. P. 169-172.

113. Gutnick D.L., H.Bach. Engineering bacterial biopolymers for the bio-sorption of heavy metals; new products and novel formulations. // Appl Microbiol Biotechnol. 2000. № 54. P. 451-460.

114. Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Philp J.C., Cristophi N. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species. // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1998. №14. P. 711-717.

115. Keisuke Iwahori, Takaati Tokutomi, Naoyuki Miyata, Masanori Fu-jita. Formation of stable foam by the cell and culture supernatant of Gordonia (Nocardia) amarae. И Journal of Bioscience and Bioengineering. 2001. V. 92. № l.P. 77-79.

116. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Makarov S.O., Litvinenko L.V., Cunnin-ham C.J., Philp J.C. Effect of biosurfactants on crude oil desorption and mobilization in a soil system // Environmental International. 2005. № 131. P. 155-161.

117. Lang S., J.C. Philp. Surface-active lipids in rhodococci. // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. № 74. P. 59-70.

118. Lukondeh Т., Ashbolt N.J., Rogers P.R. Evaluation of Kluyveromyces marxianus FII 510700 grown on a lactose-based medium as a source of a natural bioemulsifier. // J. Ind. Microbio. Biotechnol. 2003. № 30. P. 715720.

119. Makkar R.S., Cameotra S.S. Biosurfactant production by thermophilic Bacillus subtilis strain. // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1997. № 19. P. 37-42.

120. Margesin R., Schinner F. Biodegradation of diesel oil by cold-adapted microorganisms in presence of sodium dodecyl sulfate. // Chemosphere. 1999. № 15. P. 3463-3472.

121. Mikkola R., M. Kolari, Andersson M.A., Helin J., Salkinoja-Salonen S. Toxic lactonic lipopeptide froom food poisoning isolates of Bacillus licheniformes. // Eur. J. Biochem. 2000. № 267. P. 4068-4074.

122. Moran A.C., Martinez M.A., Sineriz F. Quantification of surfactin in culture supernatants by hemolytic activity. // Biotechnology letters. 2002. №24. P. 177-180.

123. Mulligan C, N. Environmental applications for biosurfactants. // Environmental Pollution. 2005. № 133. P. 183-198.

124. Navon-Venezia S., Zosim Z., Gottlieb A., Legmann R., Carmeli S., Ron E.Z., Rosenberg E. Alasan, a new bioemulsifier from Acinetobacter ra~ dioresistens. //Applied and Environmental Microbiology. 1995. V. 61. № 9. P. 3240-3244.

125. Noriyuki Iwabuchi, Michio Sunairi, Hirosi Anzai, Mutsuyasu Naka-jima, Shigeaki Harayama. Relationship between colony morphotypes and oil tolerance in Rhodococcus rhodochrous. // Applied and Environmental Microbiology. 2000. V. 66. № 11. P. 5073-5077.

126. Olivera N.L., Commendatore M.G., Moran A.C., Esteves J.L. Biosur-factant-enhanced degradation of residual hydrocarbons from ship bilge wastes. // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2000. № 25. P. 70-73.

127. Otto R.T. Production of sophorolipids from whey. // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. № 52. P. 495-501.

128. Peypoux F., Bonmatin J.M., Wallach J. Recent trends in the biochemistry of Surfactin. // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. № 51. P. 553-563.

129. Philp J.C., Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Dunbar S.A., Christofi N., Lang S., Wray V. Alkanotrophic Rhodococcus rubber as a biosurfactant producer. // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. № 56. P. 318-324.

130. Plaza G.A., Zjawiony I., Banat I.M. Use of different methods for detection of thermophilic biosurfactant-producing bacteria from hydrocarbon-contaminated and bioremediated soils. // Journal of Petroleum Science and Engineering. 2006. № 50. P. 71- 77.

131. Pruthi V., Cameotra S.S. Rapid identification of biosurfactant-producing bacteria strains using a cell surface hydrophobicity technique. Biotechnology Techniques. 1997. V.l 1. № 9. P. 671-674.

132. Puntus I.F., Sakharovky V.G., Filonov A.E., Boronin A.M. Surface activity and metabolism of hydrocarbon-degrading microorganisms growingon hexadecane and naphthalene. // Process Biochemistry. 2005. № 40. P. 2643-2648.

133. Riss V., Brandt M., Miethe D., Babel W. Influence of special surfactants on the microbial degradation of mineral oils. // Chemosphere. 2000. № 41. P. 1001-1006.

134. Ron E.Z., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants. // Environmental Microbiology. 2001. № 3 (4). P. 229-236.

135. Rosenberg E., Ron E.Z. High- and low-molecular mass microbial surfactants. // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. № 52. P. 154-162.

136. Rozenberg E. Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: isolation and emulsifying properties. // Applied and Environmental Microbiology. 1979. V. 37. № 3. P. 402-408.

137. Sandrin T.R. A rhamnolipid biosurfactant reduces cadmium toxicity during naphthalene biodegradation. // Applied and Environmental Microbiology. 2000. V. 66. № 10. P. 4585-4588.

138. Sim L., Ward O.P., Li Z.-Y. Production and characterization of a biosurfactant isolated from Pseudomonas aeruginosa UW-1. // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1997. № 19. P. 232-238.

139. Stelmack P.L., Gray M.R., Pickard M.A. Bacterial adhesion to soil contaminants in the presence of surfactants. // Applied and Environmental Microbiology. 1999. V. 65. № 1. P. 163-168.

140. Stratton H.M., Brooks P.R., Griffiths, Seviour R.J. Cell surface hy-drophobicity and mycolic acid composition of Rhodococcus strains isolated from activated sludge foam. // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2002. № 28. P. 264-267.

141. Sutcliffe I.C. Characterisation of a lipomannan lipoglican from the mycolic acid containing actinomycete Dietzia maris. II Antonie van Leeu-wenhoek. 2000. № 78. P. 195-201.

142. Tenoux I., Besson F., Michel G. Studies on bacillomycin D by Bacillus subtilis. I I Microbios. 1993. № 74. P. 29-37.

143. Tiehm A. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presence of synthetic surfactants. // Applied and Environmental Microbiology. 1994. № l.P. 258-263.

144. Torben Madsen, Preben Kristensen. Effects of bacterial inoculation and nonionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. // Environmental Toxicology and Chemistry. 1997. № 4. P. 631-637.

145. Toren A., Ron E.Z., Bekerman R., Rosenberg E. Solubilization of polyaromatic hydrocarbons by recombinant bioemulsifler AlnA. // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. № 59. P. 580-584.

146. Tsitko I.V. Effect of aromatic compounds on cellular fatty acid composition of Rhodococcus opacus. II Applied and Environmental Microbiology. 1999. V. 65. № 2. P. 853-855.

147. Volkering F., Breuere A.M., Rulkens W.H. Microbial aspects of surfactant use for biological soil remediation. // Biodegradation. 1998. № 8. P. 401-417.

148. Wei O.F., Mather R.R., Fotheringham A.F. Oil removal from used sorbents using a biosurfactant. // Bioresource Technology. 2005. № 96. P. 331-334.

149. Willumsen P.A., Karlson U. Screening of bacteria, isolated from РАН-contaminated soils, for production of biosurfactants and bioemulsifi-ers. // Biodegradation. 1997. № 7. P. 415-423.

150. Yakimov M.M., Timmis K.N., Wray V., Fedrickson H.L. Characteri- . zation of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolerant andhalotolerant subsurface. // Applied and Environmental Microbiology. 1995. №5. P. 1706-1713.

151. Yateem A., Balba M.T., Al-Shayji Y., Al-Awadhi N. Isolation and characterization of biosurfactant-producing bacteria from oil-contaminated soil. // Soil and Sediment Contamination. 2002. № 11 (1). P. 41-55.

152. Youssef N.H., Duncan K.E., Nagle D.P., Savage K.N., Knapp R.M., Mclnerney M.J. Comparison of method to detect biosurfactant production by diverse microorganisms. // J. of Microbiological Methods. 2004. № 56. P. 339-347.

153. Yu-Hong Wei, Hsin-Chin Lai, Shan-Yu Chen, Mao-Song Yeh, Jo-Shu Chang. Biosurfactant production by Serratia marcescens SS-1 and its isogenic strai SMAR defective in SpnR, a quorum-sensing LuxR protein. // Biotechnology Letters. 2004. № 26. P. 799-802.

154. Yu-Hong Wei, I-Ming Chu. Mn2+ improves surfactin production by Bacillus subtilis. I/ Biotechnology Letters. 2002. № 24. P. 479^82.

155. Zhang Y., Miller R.M. Effect of a Pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell hydrophobicity and biodegradation of octadecane. // Applied and Environmental Microbiology. 1994. № 6. P. 2101 -2106. •

Информация о работе

Волченко, Никита Николаевич
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства углеводородокисляющих актинобактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы