Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние R-плазмид на биологические свойства холерных вибрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние R-плазмид на биологические свойства холерных вибрионов"

ГОССАЕБПИДВДЗОР Р С О О Р

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО 8НШШ1 НАУЧН041ССЩ03АШЬС!ШЙ провдаданыа ИЙСТИОТ "1! И К Р О Б "

На правах рукописи.

ПОЗДЕЕВА Гаяянз Алексеева

№ 579.№3.1-252-5

ВЛИЯНИЕ Н-ПЛАЗШД НА ЕШЗОШЧЕСйШ СВОЙСТВА ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

ОЗ.ОО.О? - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ .

на осисиание учекой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1931

■ Работа вшояяекл в При/кокон ордена Трудоього Красного 2ка;«ни нзучио-иоолодонагальзком противочумном института Сибирь ь Дольнего Волока.

Каучныа руководители: 'контор медицински;: наук, профессор МИАНЬК'Ш Б.Н., кандидат1медицинских няук, старший научный сотрудник ЮШ1Ш А.Ф.

Официальные оппонитн: доктор биологических на,у::, огармкЧ научниР сотрудник СЖИЮЗА Н.У... додюр кздвцшюккх ноу.«, профессор ШВИДЕНКО И.Г.

Ведущая организация - Каучно-ис ..яедова'геяьскйа врокиъь-чушшй'институт Кавказа к Ваказкапья

Реферат разослан "¿¿Р1992 г. •

Зацкаа состоится "/Ф^ ____г. в 1300

часов аа ааооданаи специализированного соьога Д 07'+.32.0.1 ко присуждению учояой озелени доктора наук лри Воосопно!.: ордопз Трудового йрзоиого Вгаиэнк каучло-иосладозохсльском лрош>о-чуизо.ч институте "Никроб" (410071 г.Саратоз, УниЕерсияогокан, ул.', 46).

С диссертация?! козио ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб" ■ • '

Ученый секретарь' ■ • сгациализкчоваииого соботп.

дсктэр биологических наук Норлсег ¡'.А.

с

ШВДШЙЕ

Актуальность проблемы. Седьмая пандемия холеры, основным этиологическим агентом которой является холерный вибрион биотипа эльтор, характеризуйся быстрым и широким распространением в мире. В последние годы вегшшки холеры и отдельные случаи заболевания имели место в Егроле, Австралии, CLa, Японии,. Африке и'других регионах мира (йол. ВОЗ, 1985; Shahid U.S. at al.,J984; Geoald К. et al.,1988).

Растущее загрязнение водоемов сточными водамк и хозяйзтвен-но-фекальндаи стоками способствует более длительной циркуляции холерных вибрионов. Поверхностные водоемы оказались инфицированными холерными вибрионами различной вирулентности даяе в местностях, где заболевания холерой не .регистрировались 'Бичуль К.Г.. 1973; Стогова А.Г. и др., 1973; Гайдонская й.А. и др. IS84).

Исследования ряда авторов (Дрожевкика М.С. и др., 1981; Сергиев В.П. и др., 1Э81; Сергиев В.П. и др., 1988) свидетельствуют о том, что вода открытых водоемов может быть благоприятной средой для накопления, сохранения и обитания холерных вибрионов. Нередко из воды сокрытых водоемов на различных территориях СССР зиделяятоя культуры холерных вибрионов с измененными морфологическими, фаголизабельнши, агглютянабельничи свойствами и со сниженными холерогенностью (Семиотрочев B.II. и др.,1978; Дрожевстна М.С. и др., 1978).

ирецполэ.гается» что изменение биологических свойств холерных вибрионов, з том -теле и патогенных, является результатом адаптации их к условиям существования.вне организма (Адэмое А.К. и др., 198-1; Беляноз З.Д. и др.1986,1387). Но существует и пругая течка зрзния, согласно которой присутствие экзогенных ют.зкид кчжет юеети к изменении биологичесжх свойстэ, иыевцих застое,таксономическое значение (Шагинян й.А'. и др., 1978;

Hamood U.E. et al., 1986).

Вполне возмоено, что изменение некоторых, свойств возбудителя холеры, в том числе и гирулентноси:, возникают s результате коныогационной передачи, ему вкехромоооыного материала, так aar з окружающей срздэ могут создаваться благоприятные для порочной передата условия «вед* хэлернами оибриэнвыя к другими предстазителями -¿икрофлоры. Там hs ыэкее, роль внехромэсомных факторов наследственности у возбудителя холеры и возможное злиянив на фенотип является недостаточно изученными.

Цель настоящей рабой: заключалась в изучении влияния экзогенных й--плазмид на биологические свойства холерних вибрионов.

Поставленную цель предполагалось достичь ршением следующих задач:

1. Установить реципиентные возыокности штаммов холерных вибрионов 01 к не 01 групп в отношении R -плаэыид кишечной палочки.

2. Выяснить оптимальные условия коньшгациокной ' зредачи холерньм вибрионам вязогеилых ше^ромссомных факторов различных групп несовместимолти.:

3. Определить уровень вкспрессии плазг чдной устойчивости к антибактериальный препаратам в новом хозяине.

.. .4. Исследовать. влияние гетерологцчных R-плазашд на экспрессия» основных факторов п^тогенкости реципиента. '... Научная новизна. Впервые установлено, что штаммы холерных »ибряоков 01 и ни 01 групп,. вцкеяенныс на различных территориях СССР,.могут, использоваться .в качестве аффективных реципиентов длЕ.эхзсгенкых'к-плагмид 'килечной палочки.'Провзденкые .мссяери-мзнтн позволите определить оптимальные условия ¡сонъюгацлонной передачи экзогенных й-ш».змгд .холерным-вибрионом.. Впервые'показано, что пдазиида кишечной палочки pGA60i2 С группы кесовме-

стиыости могда стабильно наследоваться холерными, вибрионами классического и зльтор биотипов, существенно'влияя при этом на основные патогенные свойства новых хозяев. Предложен гипотетический механизм, объясняющий т'ранзиторнсе ингибирушцее влияние плазм,вы РСА6012 на вирулентность Холерного вибриона.

Практическая ценность. В ходе выполнения работы установлены оптимальные условия проведения коныогационной передачи экзогенных плазмид холерным вибрионам 01 и не 01 групп. Экспериментальные данные легли в основу методических рекомендаций по "Коныогационной передаче н-плазмид кяаечнОй палочки холерным вибрионсм", которые рассмотрены и одобрены на заседании ученого совета 10.04.1986 года директором Иркутского Научно-исследовательского противочумного института.

В процессе выполнения работы получены трансконъиганты с иб-мененяыми агглвтинабельнши, фаголизабельндаи, адгезигпыми свойствами, со сниженным уровнем синтеза нёйрйжнядазы, токсина и цАМФ. На основе экспериментальных данН"х предстаслена в Госком-изобретение СССР заявка на изобретение "Способ получения нехоле-рогенных, цАМФ-кегативных холерных вибрионов", на которую получено положительное решение (4888422/13/116358).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Холерные вибрионы 01 и не 01 групп могут воспринимать и аффективно экспрессировать экзогенную генетическую информацию, находот(уюся в составе плаэмид различных групп несовместимости.

2, Подбор условия проведения конъюгации позволяет оптимизировать частоту передачи плазмид при использовании в качестве ре-ципие-та холерного вибриона.

3. Холерный вибрионы 01 группы могут стабильно наследовать Я-плазмнду С группы несовместимости, детерминирующую устойчивость к большой группе антибактериальных химиопрепаратов (канамицину, тетрациклину, стрептомицину, хлорамфениколу и норсульфазолу).

4. Дяазкида кшечной палочки род6012, , оказывающая трзнзи-торное снижение вирулентных свойств у вибрионов,• может использоваться в качестве модели ¿.ля изучения причин появлений холерных ьибрионоа со сниженными патогонкнш свойствами.

5. Механизм снижения вирулентных свойств,холерных.вибрионов в присутствии плазмиды рШ.бсп'г предполагает координированное изменение ряда патогенных свойств у трлнекоиъгагантов холерных вибрионов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы долонз-кы на конференции молодых ученых противостой с^тыш '1982,7984), на Всесоюзной конференции специалистов противочумных учреждений (1984), на Всесоюзной конференции по холере (1988.) « на научных конференциях Иркутского противочумного института.

Цубллкации.По материалам опубликовано девять работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литература 354, включающего 157 работ отечественных и 197 - зарубе, шх авторов. Материалы изложены на 144 страницах, иллюстрированы 12 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЕ/МЕ РАБОТЫ Объекты и метод» исследования

Ойъектами исследования слудади два штамма классического, семь штаммов вльтор биов&ров, одиннадцать вибрионов не 01 группы, а также четырнадцать атаммо» кишечной палочки.

Для вырлщивания микроорганиамов использовали пептонкув воду,, олеадиеко-дифференциальную среду, бульон из-перевара сердечной ммвцы СрН 7,8) , бульон и агар Мартена (рН 7,6-7,8), мясс-пептонный бульон и агар (рН 7,2), в которые, при необходимости . добавляли соответствующие антибиотики в следующих концентрациях:

тетрациклин - 30 мят/л, ампициллин - 50 мкг/мл, канамицин -50 мкг/мл, стрептомицин - Э икг/мл, рифашнцин - ZOO ыкг/мл.

В качестве минимальной среды применяли среду к.вьавкагвп <1974), а для изучения токсинообразования применяли среду M. Iwanaga et el. (1987); .

Способность клеток продуцировать протейоу выявляли на агаре Мартзна с 10£ коровьего молоха, а лециаиназу - на корсаковском агаре с Ш> желточной эмульсии или на элоктивно-дифференцкальной с|$еде (Доыарадский И.В и др., 1972). Типы протеаз определяли методом ингибиции (Your,g d.k. et al.,1982).

Плазниднув ДЙК вцпеляли по катоду R.S. airnboin et al. (1979) и т. Kiaeer (1981). Визуализации ДНК после электрофореза в 0,756 агарознои геле осуществляли с помощью бромистого втидия.

Передачу коньюгативных Н-йлазмид холерным вибрионам осуществляли скрещиванием в жидкой и на плотных средах.

В качестве алиыикируодих агентов использовали бромистый эти-дий. Элиминацию осуществляли но общепршятой методике б жидкой среде (Кудлай Д.Л., 1977),

Для выявления вибрноцяногенной активности холерных вибрионов использозата метод отсрсчежого антагонизма по P.Prederioq (1952). Проверку' биологической активности, проводили двуслойным методом с помощью чувствительного к вибриоцинам атамма холерного вибриона не 01 группы М-296Л.

Определение цАМФ и цГМФ проводили по методу R.3. Tovey et al. (1974), основанного на конкуренции между немеченым цАМФ с неизменным количеством ^--меченого нуялеотида за связывание белка протеин-кина? ' из мышц кролика.

Нейраминидаэную активность.определяли тиобарбитуровым методом (v/arren L. ,1959). Спег урометрио проворит против "нулевая" пробы при длине волну 549 нм. Активность фермента выражали в ней-

рыашидаэных единицах.

Определение адгезивных свойств вибрионов проводили с использованием кишечных дисков (Галин B.C. и др., 1986). Коэффициент адгезии (КА) выражали в процентах. • .

Изучение агглютинябгльности, фаголизабельнос;ти и постановку тестов для определения принадлежности культур к роду. Vibrio проводили согласно инструктивно-методическим рекомендациям по лабораторной диагностике (1984).

Определение в геноме культур холерных вибрионов гена тоаси-нообрагования проводили согласно "Методическим рекомендац* тм по определению гена токсина у штаммов холерного вибриона методом ДНК-ДНК гибридизации" (1987). -

Вирулентность культур оценивали в соответствии с "Методическими рекомендациями по определению вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков" (1937),

Реакции преципитации в rene с антитоксической и антквчбрио-циновой сывороткой ставили по методу о. Oucutei-lony (19^9).

Результаты исследований

Вништие исследователей к изучению факторов лекарственной устойчивости обусловлено не только наличием ретерминант резистентности,. но их способность» к передаче . при клеточном контакте. До настоящего времени условие оптимальной передачи экзогенных пле.эмнп холерным вибрионам разработаны слабо. Общеизвестно, что передача внехроиосомных маркеров их таксокомичвски отделенных групп происходит с низкой эффективность», а в свяеи с «ем, что холерный вибрион относится к числу .подвижных микроорганизмов, его рецкпиентныв-воаможноста ограничены, С целы» выявления оптимальных условий передачи Е -пуазмид прииспольаовании в качестве реципиентов штаммов холерных вибрионов Сто предпринято изучение

влияния различных значений рН, соотношение донора и реципиента, времени контакта на частоту образования на селективных средах траноконъпгантов холерных вибрионов.

В качества донора использовали штамм килечной палочки 053 с плазшцгой раАб012, детерминирушей устойчивость к канамицяну, стрептомицину, тетрациклину., хлоракфекиколу и норсульфазолу, а реципиентом служил рифаыпицинустойчивый мутант классического биовара 0Г-75(1-2). В результате проведенных экспериментов установлено, что при проведвн-и конъюгации в жилкой среде, наибольшая частота передачи соблюдалась в течение первых трех часов инкубации при соотношении донора и реципиента 1:10 и рН среды, равным 7,8. Такое значе-ие рН среды, видимо, способствует более интенсивному размножении холерных вибрионов, которое приводит к сдвигу соотношения донор:реципиент в пользу последнего

При изучении возможности коныогационнзй передачи 12 аиткбио-тикорезистентных плазмид кишечной палочки, относящихся к 9 различным группам несовместимости, в штам п холерных вибрионов классического биотипа ОГ-75 и 569В оказалось,, что первый воспринимает десять внехромосокных факторов из двенадцати, а второй - семь. При этом показано, что частота передачи значительно повышалась при проведении конъюгации ча плотных средах, вероятно, в результате возникновения благоприятных условий как для донора, так и для реципиента.

Исследование реципиентных свойств штаммов холерных вибрионов биотипа зльтор, вдавленных на различных территориях СССР, показало, что они могут быть использованы в качестве аффективных р -дипиентсв для экзогенных Н-плазмид. Рецкпиентные штампы холерных вибрионов биотипа эльтор с наибольшей.частотой передавались такие внехромосоульигфакторы кишечной рз.чочки, как р0А5012, Р.40а ¡1 Л£4.

Полигостальная плазмида и.4 передавалась во все семь исполь-аованнгос в наших исследоьаниях штаммоь холерных вибрионов. Вне-хромоаомный фактор рвАбо12 наследовался четырьмя из секи штаммов с довольно высокой частотой и одним штаммом - с частотой 10 .

Изучение реципиентьой способности вибрионов не 01 группы показало, что частота перзрачи плаайид различных групп несовместимости клетками использованного набора штаммов била неодинаковой. Наибольшую частоту передачи наблюдали при конъагьцколной передача плаомид и ¡1245. Перенос плазмиды ПР4 .с широтам спектром хозяев проходил с частотой 10"°. проведении конъюгации на плотной среде со всеми рецшгаентными штаммами, за кс:шо-чением одного. Плазмида Р'!ао передавалась Б пять из девяти использованных штаммов. Передача происходила с довольно низкой

частотой, которая колебалась от 10"® до 10"® и только в одном 7

случае в ~ 10 .

Нашими экспериментальными данными установлено, что вибрионы 01 и не 01 групп могут использоватьс в качестве реципиентов для гетерологичных плазмид, а частота передачи внехромосомных элементов зависит от индивидуальных особенностей как штамма-донори, так и штамма-реципиента.

В результате конвагациоцкой. передачи.плазмиды ттшечной па- . лочки рОАбо12, детермишфующей. устойчивость к тетрациклин^', стрептомицину, .канамицину, норсульфазолу, и хлоракфоникслу, .были получены трансконъаганты. В качестве.реципиентов использовали спонтанные мутант.вирулентных штаммов классического ОГ-75(1-2) и 4 ельтор биотицо.в. Приобретение, клетками холерньгс вибрионов плазмирной ДНК подтверждено;в.экспериментах .по. реципрокной передаче, а также результатами электрофореза в агарозноы геле.

ю

Методом случайной выборки было отобрано по 4 траисконъюган-та каждого штамма, из которых воздействием бромистого зтидия были получены бесплазм-лдныа варианты.

При изучении биологических свойств трансконъюгангов установлено, что у них наблэдадгось снижение способности агглютинироваться видоспецийической 0-сывороткой и типоспецифическима Огава н йпба. Изменение агглютинабельяых свойств у трансконяогантов холерных вибрионов в большинстве случаев коррелировало со снижением фаголизабелышх с-ойств. Ферментация углеводов и декарбокси-лироЕаний ензгаокис.гот у всех использованных в данной работе транс-конгюгаитов холерных Еибрионов были типичными для данного сила микроорганизмов.

При проверке на гнтэропатогенность на модели кроликов-сосунков показано, «то транскотгъиганты со сниненнымн агглютинабельны-

ш и фаголизабгльнимл свойствами не вызывали холероге.-.ного зффек-7 8

та деяе в дозе 10-10° КК. Вса спонтанные рифампжршустойчмвые мутанты и бесплая:л1дныэ варианты эльтс^ биотипа давали холероген-ный эффект в дозе 10", а классического - 10°.

Пяасмида китачной палочки р0Аб012, обладающая маркерами устойчивости к тетрациклину, стрептомицину, канамицпну, норсульфазолу и упорачаенаколу, експрессировала все свои маркеры б холерном вибрионе. Наиболее эффективно в новом хозяине экспрессирова-лись детерминанты устойчивости к канамицпну, хлоргшфёниколу и стрептомицину..При этом нельзя не обратить енимы-шо на тот факт, что минимальная ингиЗирушая концентрация тетрациклина для транс-коныогантоо была в 2 раза визе, чем у родительского штамма, что якляе.ся примером влияния нового генетического окружения на экспрессию гена Тс?

Стабильное сохранение ¿-плазмиды рСА6012 в клетках нового .хозяина чокно рассматривать в качестве свидетельства достаточной

корреляции процессов ее реп..лкации с аналогичными процессами собственной хромосомы возбудителя холеры. Небезынтересно отметить, что шгазмида рЗАбо.'г относится к А группе несовместимости, которая тождественна С. Согласно литературным данным (Ней-668 ПЛ. е! а1. ,197?; КичнЖага а.,1978; СЗавв Н.З. е1 а1.,1980), плазмиды С группы несовместимости наиболее часто встречаются у природных штаммов холерных вибрионов.

При сравнительной изучении динамики размножения популяции трансконъюгантов, родительских штаммов и зксконьюгонтов проявилось ингибирующее влияние плазмиды р0Аб012 на гост клеток холерного вибриона. Для трансконъига'лтов обо>.х биотиг.оз были характерны более удлиненные стадии адаптации и экспоненциального роста, а также стационарная фаза,

В литературе имеются многочисленные данные (Петровская В.Г., 1984,1У85; Дстарадскйй И.В., 1935,1987) о влиянии внехромосом-ьых маркеров факторов на патогенные свойства клетки-хозяина. Поскольку патсгснность холерного вибриона.является комплексным признаком, который предполагает е спрессига клеткой продуктов . многих генов, нами проведено изучение целого ряда свойств транс-кснъагантов.•.

При изучении лецитиназной.активности найдено, что.все траис-ко!гыоганты холерных, вибрионов сохраняли способность расщеплять лектин на среде с добавлением желтка и образовывали вокруг колоний характерные .зоны, просветления с. металличссгам. блеском, аналогичные по интенсивности и размерам зонам, образуемым родительскими штаъводш бесплазмидньоди вариантами.

.. При исследований способности- трансконьягантов продуцировать протеазу.-на-2$ агаре-Мартена.с добавлением 10$ обезжиренного молока, оказалось, .что. асе .он'<и обладали .высоким и.средним уровнями протеолитической активности, не отличаясь о? своих родительских

м бесплаз!., .дных вариантов. При определении типа протеаз методом ингибиции удалось установить, что почти у всех тренсконъвгантов обоих биотипов, в отличие от родительских штаммов и эксконьюган-тов, присутствует лишь одна протеаза тислового типа, за исключением двух, у которых кроме протеазы тиолового типа, обнаружена металлсзависимая форма фермента,

одукцию гибриоцина выявляли методом отсроченного антагонизма по P. Prederioq. Все культуры родительских штаммов, экс-конгюгактов и трансконъюгантов были стабильны по признаку вибрио-цикогегаи. Негативных вариантов среди трансшпяогантов по данному признаку не удалось обнаруяить. Ллейтрофоретическое исследование лизатоа клеток трансконъюгантов, родительских штаммов и резертантов показало присутствие плазмлды с небольшим молекулярным весом, по своей злектрофоретической подвижности аналогичной pVib, которая, по мнению И.М. Бададовой (1969), контролирует синтез протеолитического комплекса, лецитинаеную, протеазную активности и продукцию вибриоцина.

По своей нейраьинщггзиой активности лее наследованные культуры холерного вибриона делились на шгаьао! с высокой активностью -17,1-45,7 НЕ и низкой - 1,4-6,3 НЕ. Установлено, чте приобретение плазглиди .оказывало икгибирущее действие на уровень активно-с-ги кейраминидазы у вибрионов: у трансконъюгантов штаммов классического Сиовара отмечалось снинение активности фермента в семь и более раз. Аналогичная картина была выявлена и у всех вариантов культур холернж Еибриочов биотипа зльтор с плазмидой. Среди транс-, коггаогантов не была выявлено ни одного с чысокой продукцией данного фермента. .

. В последние .годы установлено. (Король B.C. и др., 1983; Лобанова Я.И. и.др., 19S8), что существенным звоном в развитии патогенеза ягяется способность холерных вибрионов лркгфеплять-

ся к слизистой тонкого кишечника. В результате проведенных исследований на модели кишечных дисков кроликов установлено, что родительские штаммы и акскоггеаганть обоих биотипов обладали достаточно высокими адгезивными сг Яствами. Коэффициент адгезивной активности у них находился в пределах от 12,0 до 27,8%,з то время как у трансконъюгантов индекс адгезии колебался от 0,5 до 10 2лиминац;ш плазмиды у транскотаагантов приводгта к восстановлению адгезивных свойств до уровня родительского штамма.

Признано, что ведущим фактором патогенности холерных вябрио- - • нов лпллотся вптеротохсип. В настоящее время наиболее достоверны:.! методом определения повдшдгаяьной способности холерных вибрионоа к продукции токсина является истод молекулярного зондирования rc;iOD, контролирующих дмшй! признак. Полученные в результате кониогаццошюй передачи нлазмиды рСЛб012 холорнш вибрионам '.•paiicsoitt-arantu со сниженными холерогеннши сеойствк.гл были ис-umv-mu на наличию.vct-гбнов. Сказалось, что все культура холерных ыо'рнснов {рифашицшгоусясЗчашз .мутанты, бесплазмидние варианты и транскошаганты) иссх исследованных штаммов давали положительный радиоавтографичьский. ответ на нитроцеллилозт.« фидьт-v,

pax с меченным Р зондом структурных генов холерного токсина. Ь-ю свидетельствовало о тон, что у трансконъюгантов с измененными холорогеинши свойстваш, присутствовали копии структурных генов. Однако наличие копий токспнообразования могло только укапывать на потенциальную способность клеток синтезировать токсин, который по каким-то причинам может не экспортироваться из клеток nr.ii us в результате структурных изменений синтезироваться в недостаточном, для его обнаружения количестве.

При изучении биологической активности токсина в кожной пробе Кр>ъйга (fa-cop сосудистой проницаемости) установлено, что все купь"'урь' родительских штцжиз и бесплаямиикне варнэнтк девали

р.олояетель: уа пробу в разведениях 1/8-1/16. В отличие от них подавляющее большинство трансконвдгантов штаммов холерного вибриона, за исключением двух трансконъагантов биотипа зльтор, давали положительный - эффект в пробе Крейга только в разведении 1/2.

При постановке реакции преципитации по Оухтерлони были выявлены существенные раэиличня иеяду транско нгкгантами, родительскими шта!. ими и бесплазмидныки вариантами по их способности продуцировать токсин: нам не удалось выявить прилуночных зон преципитатов ни у одного из трансконъагантов пяти штаммов в реакции преципитации с антитоксической сывороткой, что могло свидетельствовать об отсутствии или резком уменьшении количества синтезируемого токсина, Все культуры рифампицинустойчивых мутантов и ревертанты образовывали линии преципитации с антитоксической сывороткой.

Особое внимание.заслуживал? данные по изучении уровня цМ© . у трансконъвгантов, так как, согласно литературным данным (Си!Йоги А. е* а1., 1972; НаиасЬка Р.У. еЬ е1., 1972), этот нуклеотнд монет обеспечивать реализацию патогенных свойств бактериальной клетки через непосредственное участие в процессах транскрипции-трансляции.

.. . При определении внутриклеточного содержания цАМй у культур холерных вибрионов с плазмндой.рСА6012. данного нуклеотяда использовании;,! методом обнаружено не было. В то же время родительский и бесплазмидные варианты.имели практически одинаковое количество. цАЬЭ. (30-30,7 годоль/мг)..

При изучении дииакики содержания цЛМ'л в течение семичасового культивирования оказалось, что родительский штамм - спонтанный рифампицинустоичивый мутант, и. бесплазмидный вариант имели одинаковый профиль накопления- внутриклеточного яуклеотида. У транс-конъюгзнта же со снихеннымми холерогеиными, агглютинабельными,

фаголизательными, адгезивными свойствами, сниженным урознем ней-раминидазы и не продуцирующего токсин количество цШФ резко отличалось от первых двух. В течение ..ервых трех часов количество продуцируемого цАМ® было в 3-10 раз меньше, чем у исходного варианта и ревертанта, а к четвертому часу оно падало до куля и в дальнейшем (с пятого по седьмой час) больше не регистрировалось.

Уровень другого циклонуклеотида - цГЫ$ в гфоцессе культивирования равномерно увеличивался как у родительского штамма, ре-вертанта, так и у трансшшзганта.

Таким образом, удалось показать, что при введении Я-плазмиды рСА.6012 у холернцх вибрионов происходило изменение ряда признаков, обусловливающих вирулентность у возбудителя холеры (нейрами-нидазы, продукции токсина, адгезии), выявлено существование прямой корреляции ыезду уровнем цАМФ и эффективностью экспрессии данных признаков. Обнаруженный факт можно объяснить способностью 1;охй гена холерного вибриона осуществлять контроль уровня транскрипции генов патогенности: продукты данного гена необходимы для синтеза фактора колонизации, белков наружной мембраны, знтероток-сина и ряда других, экспрессия которых происходит координирование. Так как элиминация плаэмиды ведет к восстановлению утраченных клеткой свойств, можно предположить, что происходящие изменения носят регулятсрный характер и, вероятно, влияние самой плазмиды рОАбс>12 осуществляется через экспрессии продуктов ее генов, оказывающих транзиторное репрессирующее действие на функцию гена.

выводы

1. Штаммы вибрионов 01 и не 01 групп, выделенные на территории Сибири и Дальнего Востока, являются эффективными реципиентами для экзогенных н -плаамид энтеробактерий.

2. Установлено, что при использовании в качестве рециниен-• тов вибрионов 01 и не 01 групп,,оптимальными условиями прй проведении конъюгации в жидкой срцпв является pH среди (7,6), соотношение донора и реципиента (1:10) я продолжительность контакта (три часа).

3. Обнаружено, что у трвнсконъюгантов холерных вибрионов ks пяти маркеров антибиотикоустойчиаости плаедауш pG\60i2 эффективнее экспрессируется резистентность к канамицнну, хлорвмфвкиколу

и стрептомицину. Маркеры резистентности к тетрациклину, кангюнци-ну, стрептомжртну, хлорамфеииколу и норсульфазолу плазмцпы кишечной палочки pGA.6oiüj наследуются штаммами холерных вибрионов стабильно.

4. Установлено, что под влиянием плазкиды рСАботг у холерных вибрионов изменяются важнейшие дифференциально-диагностические признаки, такие как агглютинабелькость, фаголиаабельность и снижаются их вирулентные свойства,

5. Доказано, что координированное транэиторнов ва<«вяенив у трансконгвгантов некоторых свойств, обусловливающих вирулентность возбудителя холеры (продукция токсина, адгезия и найраминидавная активность), носит регуляториый характер, что позволяет рассматривать явление кожьягациониого восприятия lt-плпзмиды pUA6oi2 как одну из возможных причин возникновения авирулентнъгх или слабовирулентных штамма.

6. Устанбвлено существований связи между внутриклеточным содержанием цАМй й вирулентностью возбудителя холеры, что свидетельствует об участии нуклоотида в развитии инфекционного процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белобородое Ю.В., Поздбева Г.А. Изменение биологических свойств у трансконьюгантов v.cho'îerae 0rasa-75(I-H) // Молекул, биол. н генетика возбуд. особо опасн.инф. - Саратов,1982. - С.7-9.

2. Поадеева Г.А., Белобородое D.B. Биологические свойства к-транскоююгантов вибрионов зльтор Ц Ыолакул. биол., генетика и иммунол. возбуд. особо опасн. кн$. - Ростов-на-Дону, 1984, -С. 48-50.

3. Белобородое Ю.В., Поэдеева Г.А., Набиев Э.Г., Ганин B.C. Биологические свойства R -трансконгигантов v. jhaierae Огава-75 (1-2 // Современные аспекты профилактики аооноаных инфекций. -Иркутск, 1984. - С» ЮЗ-104.

4. Мараыович A.C., Пинигин A.S., Ганнн B.C., Осдуленко О.В., Набиев 8.Р., Поадеева Г.А., Урб&нович Л.Н., Саппо С.Г. Биологические свойства и экология вибрионов в Сибири я Дальнем Востоке / Иркутский научн.-исслед. противочуын. ян-т Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1976. - 246 с. - 9 гос.регистрации 76084755.

5. Пинигин А.Ф., Марамовач A.C., Колесник B.C., Ганин B.C., Набиев Э.Г., Поадеева Г.А,, Урбанович Л.Я. Оценка вирулентности вибрионов аяътор, циркулирующих на территории Сибири и Дальнего Востока в период эпидемического благополучия по холере / Иркутский научн.-исслед. противочумк. ин-т Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1984. - 98 с. - 1* гос.регистрации 0Ï84002275I.

6. Домарадский И.В., Голубинский ЕЛ., Белобородое D.B., Ганнн B.C., Набиев Э.Г., Гюздеева Г.А. Влияние плаэыид на биологические свойства холерных и НАГ-вибрионов / Иркутский научн.-исслед. протиьочумн. ик-т Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1985. - ÔO с. - » гос. регистрации 81004166.

7. Поз; эева Г.А., Белобородое Ю.В. Методические рекомендации по коиьвгациокной передаче к-плазмид от к. coll холерному вибриону. - Иркутск, 1986. - 2 с.

8. Поздеева Г.А., Ганин B.C., Белобородов Ю.В,, Поросиннико-ва Л.С., Монахова Е.В., Михась Н.К. Влияние плазмиды pga6012

s. гоз.1 на вирулентные свойства холерного вибриона // Актуальн. вопр. »'чкробиол., лаб. диагност, и профилакт. холэры. - Ростов-на-Дону, 1988. - С. 57-59.

9. Поздэева Г.А., Пикигин А.Ф., Ганин B.C. Сравнительное изучение вирулентных свойств холерных вибрионов и их трансконъюган-тов // Актуальн. вопр. эпидемиол., лрофилакт. и диагност, особо опасн. инф. - Ставрополь, 1989. - С. 25-27.