Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние R-плазмид на биологические свойства холерных эмбрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние R-плазмид на биологические свойства холерных эмбрионов"

Гд-?. 9-2

гмсакепидн-щзор ? с ? с р

всесоюзный ордена трудового красного 8наузни

иаучно-исследов&шьси;й щроивсчушша кнстатут

•а И X Р О Б "

На правах рукописи

ТОЗДЕйВА Галина Алексеевна

УДК 579.843.1-252.5

ВЛИЯНИЕ. К-ЛЛАЗМЭД НА ШШитчШЯБ СВОаиШ " ХОЛЕРНЫХ РЛЕРЛОНОВ

03.00.07 - микробиология

А 3 Т О I1 и О Е Р А Т

на основание ученой степени кандидат биологг.чааких лау.ч

С аратаи, 19ЭС

■ Pfiöois вм.олнзга Ii lîpi,/teKoa ордепа 1рудоього Красного Зишдош пучю-лсследозатокьокои прошьочумвои шогихуге Сябиде и Дпшмго Потока.

Каучниз ¡)укот.!од;.чрлк; 'доигор медицкиоких наук, профессор УОДНШН i5.II., :ш.дидаг издг.цавских ra сюряий ьпучвнй

сотрудник ГГ.ЖГйН А.£>.

Офлдепшпм omom;:;ïu: доктор б»ояогйчес.:;1*.. :'")'> огарш.й научна!' согруднп;: Сш.'.РП0ВА Н.'Л., /оюсер кйдидичекг.х нау.<,

проассор пьидгнко и.г.

Ведуцзп организации - Кйучнэ-uc „лодоеыэ^ьскпл прогкгс,-чушшй-г.нотигуг Казкгва и Закавказья

Реферат разослан - 1Ж г. •

чосоз ля аазодании специядизировадиого сотого Д 07*;-.32.01 по присуждении ученой cienoui; доктора асук при Воосопиок ордена Трудового Крзоиого Вгакэии каучЛо-квсяадогатсдшюк ярогвво-•lyinoK института "Ипкроб" (4I0C7I г.Саратов, Унасероит'ская,

оосгоигся

i Ï300

ул., ЧС).

С днеооргацкой мо»ю озкшсоцигься в паузой с'лбккогоке

lUICÏKïysa "ыШфОб" ■

ïnciiuû секрегарл сгоцшшЕкчоаааяого совета доктор биологически/. паук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Седьмая пандемия холеры, основный этиологическим агентом которой является холерный вибрион о'иати-па эльтор, характеризуйся быстрым и пгардким распространением d мире. В последние годы ветвши холеры и отдельные случаи заболевания имели место в Евроле, Аястрами, Clwt, Японии,. Африке и 'других регионах мира (Бол. ВОЗ, I98S; Shahid N.s. et al., 1984; Gerald К. et al.,1988).

Растущее загрязнение водоемов сточными ворами и хозяйствен-но-фэналькымн стоками способствует более длительной циркуляции холерных вибрионов. Поверхносстше водоемы оказались иифицироз-ш-нши хо.'.ертит вибрионами различной вирулентности дане в местностях, где заболевания холерой на .регистрировались 'Бичуль К.Г., 1973; Стогога Л.Г. и др., 1973; Гайлонская H.A. и др., IS84).

Исследования ряда авторов (Дрожевкпка U.C. и др., 1981; Сергиев В.П. и др., 1У81; Сергиев В.П. и др., 1988) свадегель-стзупт о том, что вода открытых водоемов может быть благоприятной средой для накопления, сохранения и обитания холерных вибрионов, Норадко из воды с скрытых водоемов на различных у<;ррито-риях СССР яцреляэтся культуры холерных вибрионов с измененнши морфологическими, фаголизабельнши, агглютин&бельнычк свойетьй-ми и со сшквккыни холерогекностью (Семяотрачео В.И. и др. ,1978; Дроягевкчна М.С. и др., 1978).

иреп'лолагается, что изменение биологических свойств холерных вибрионов, з том -меле и патогенных, является результатом адаптации их к условиям существования, вне организма (Адамос А.К. и пр., 198-1; «ликов З.Д. и др., 1986,1287). Но существует и

DD'/гая течка этгчия, согласно которой прнсутстг.ио экзогенных

с

пгр.яг.глд к'.ст.:ет r.esr.i к иа:<анеч:ш биологических споЯстэ, иые-ицих аагчюе vsuKOua.sK.-.axcs значение (Шагшин И.Л. л др., 1978;

Hamood Н.П. et al., 1986).

Вполне гозможно, что изменение некоторых oboücvb возбудители холеры, в том чкслэ и гнруленткоети, возникает в результате ко«гызгационной передачи ему вкехромооошого материала, так aar. з окружающей срздэ ко гут создаваться благоприятные для подобной передав! услогая «Рлуу холерными вибрионами к другими преде тазитал.таи ликрофноры. Тем не мэкее, роль вяехромосомних факторов наследственности у в о ас/удит ел я холеры и Еозможное алияние на фенотип является недостаточно изученными.

Цель настоящей работ!: заключалась в изучении виия. и я зкзо-генных й-плазшуз на биологические свойства холерных вибрионов.

Поставленную цель предполагалось достичь решением следующих задач:

1. Установить реципиентныэ еозкояности штампов холерных вибрионов 01 и не 01 групп в отношении R -плаэщя кишечной палочки.

2. Выяснять ошжальиш условия коньюг&ционной • зредачи холерньм вибриснаы акзогеннух ше^ромссоиных факторов различных групп несовместимости.

3. Определить уровень экспрессии плазмдной устойчивости к антибактериальным препаратам в новом хозяине. .

.. Л, Исследовать .влияние гетерологцчных R-плазмид на экспрессию основных факторов пэтогенкосги реципиента.

Научная новизна. . Вперше. устаноэаено, что штаммы холерных нийриоков. 01 л не.01.групп,.выделенные на различных территориях СССР,. могут, использоваться .в качестве аффектишк реципиентов для экзогенных' R-плаг.мид "килечной', палочки. Проведенные оаспери-кенты позволила определять оцтималыше условия яогшзгационной передачи зкзогенннх Е-шазигр..холерный вибрионом.. Впервые' показано, что пяазшда кишечной палочки pGA6oi2 С группы несовме-

. - 4

тимости цояэт стабильно наследоваться холерными.вибрионам клас-«ческого и зльтор биотипов, существенно'влияя при этом на обновив патогенные свойства новых хозяев. Ередлозен гипотетический еханизн, объясняющий транзнторноо ингибируюцео влияние плазыиди СА6012 на вирулентность Холерного вибриона.

Практическая псиность. В ходе выполнения работы установле-и оптимальные усяосяя проведения коигюгационной передачи зкзо-енных пяазшд холерным вибрионам 01 и не 01 групп. Эксперимек-алыгае данные легли в основу методических рекомендаций по Коньпгационной передаче й-плазшд кишечной палочки холернш вврноши", которые рассмотрены и одобрены на заседании ученого овета 10.04.198^ года директором Иркутского научно-исслядова-ельского противочумного института.

В процессе выполнения работа получены трансконьигонты с ис-¡ененинми агглятинабелышш, фаголизабельнташ, адгезиг.чыии свой-твами, со сниженным уровнем синтеза нёйрйашидазы, токсина и [ДИ8. На основе экспериментальных данн'тс представлена в Го с ко м-зобретение СССР заявка на изобретете "Способ получения нехоле-югенных, цАМФ-негативных холерных вибрионов", на которую подушно положительное решение (4888422/13/116398).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Холерные вибрионы 01 и не 01 групп могут воспринимать и .ффективно эк.спрессировать экзогенную генетическую информацию, сходящуюся в составе плаэмид различных групп не .^вместимости.

2. Подбор условий проведения конъюгации позволяет оглимизи-ювать частоту передачи плазмид яри использовании в качестве ре-¡ипие"та холерного вибриона.

3. Холерные вибрионы 01 группы могут стабильно наследовать 1-илизикду С группы несовместимости, детерминирующую устойчивость : большой группе антибактериальных химиопрепаратов (канамицику, ■етрациялину, стрептомицину, хяорамфениколу и норсульфазолу).

4. Плазмида кишечной палочки ролбогг, оказывающая гранзи-торкпе онижениз вирулентных свойств у вибрионов,-.может использоваться в качестве модели ¿ля изучения причин появления холерных вибрионов со сниженными патотпздж езойстьаш.

5. Механизм снижения вирулентные свойств холерных.вибрионов в присутствии плазмиды рСЛб012 предполагает координированное изменение ряда патогенных свойств у тррлсконъюгантов холерных вибрионов. , ,

Апробация работы. Материалы диссертационной работы долоаз-ны на конференции молодых ученых противочумной системы '1982,7984)( на Всесоюзной конференции специалистов противочумных учреждений (1984), на Всесоюзной конференции по холере (1986) и на научных конференциях Иркутского противочумного институте.

Публикации. По материалам опубликована девять работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзоре литературы, собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы 354, вклпчяоцего 157 работ отечественных и 197 - аарубе шх авторов. Материалы изложены на 144 страницах, иллюстрированы 12 рисунками и 14 таблицами.

; СОДЕИШйЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служилидва итаммаклассического, семь штаммов вльтор биоваров, одиннадцать вибрионов не 01 группы, а также четырнадцать зташю» кишечной палочки.

Для вырлщнвания микроорганизмов использовали пепгоннус воду, злаетивко-дифференцкальную среду, бульон из перевара сердечной мышцы лрН 7,8), бульон и агар Мартена (рй 7,6-7,8), кясс-пептонный бульон и агар ЧрН 7,2), в которые при необходимости, добавляли соответстйушие антибиотики э сл едущих концентрациях:

тотрагрзкЛЕИ - 20 икгЛ-л, ампициллин - 50 мкг/мл, канамицим -50 ыпг/ыл, стрептомицян - Э мят/мл, рнфашшцин - 100 мкг/мл.

D качество декиыальнов среды применяли сред/ K.Bhaskaron (1974), а для изучения токсшообразоваиия применяли среду М. Iwatiaga et al. (1987)."

Способность клеток продуцировать протеазу выявляли на агаре Нартзна с коровьего молока, е. лецктиназу - на корсаковпкоы агаре с яалточной эмульсии или на элективно-дифференциальной с {Теде (Докарадский И. В н др., 1972). Типы протеаз определяли методом ингибиции (Your,g D.N. et al.,1982).

Плазиидную ДОС вцвеляли по методу r.s. Birnboim et al. (1979) я т. Kisser (1981). Визуализацию Л® после электрофореза в 0,7^ агарозном геле осуществляли с помощью бромистого зтидия.

Передачу конъкгатипных гг-плазмкд холерным внбрионам осуществляли скрещиванием в аидкой и на плотных средах.

В качестве элиминирующих агентов использосаяи бромистый эти-дий. Элиминацию осуществляли во общепршятой методипэ б жидкой среде (Кудлай Д.П., 1977).

Для выявления вибриоциногеккой активности холерных вибрионов использозади метод отсроченного антагонизма по i.Predericq (1952). Проверку' биологической активности проводили двуслойным методом с помощью чувствительного к вибриоцинаы штамма холерного вибриона не 01 группы M-296/I.

Определение ц/Ш к цГМФ проводили по методу R.3. Tovey et al. (1974), основанного на конкуренции менялу немеченым цАМФ с неизменным количеством ^Н-мечеиого нуклеотида за связывание бзлка протеин-кинап из мышц кролика.

Нейраминидазную активность определяли тиобарбитуровкм методом (.tarren l..1959). Спектрометрии проводили против "пулевой" пробы при длине волны 549 ни. Активность фермента выражали в ней-

рашнидазных единицах.

Определение адгезивнчх свойств вибрионов проводили с использованием кишечных дисков (Гадин B.C. и др., 1986). Коэффициент адгезии (КА) выражали в процентах.

Изучение агглютинабгяьности, фаг ми заб ел ь hoqth и постановку тестов для определения принадлежности культур к роду, vibrio проводили согласно инструктивно-методическим рекомендациям по лабораторной диагностике (1984).

Определение в геноме культур холерных вибрионов гена тояси-нообрасования проводили согласно "Методическим рекомендац' тм по определению гена токсина у штаьмов холерного вибриона методом да-даК гибридизации" (1987).

Вирулентность культур оценивали в соответствии с "Методическими рекомендациями по определения вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков" (1987).

Реакцию преципитации в геле с антитоксической и антивибрио-циновой сывороткой ставили по методу 0. Oucaterlony (19л9).

Результаты исследований

Внимание.исследователей к изучению факторов лекарственной устойчивости обусловлено не только наличием детерминант резистентности, но их.способность© к передаче . при клеточном контакте. До настоящего времени условия оптимальной передачи вкзогенных пл г. эмидхолеряым. вибрионам разработана слабо. Общеизвестно, что передача внехромосомных маркеров их тахсономичэски отделенных групп происходит с НЛ8КОЙ оффективностьо, а в связи с тем, что холерный вибрион относится, в числу подыдаак.микроорг&ниамэв, его -роцкпиентные..воацохности огратгченн. С цельв выявления оптимальных условия передачи R -празмид при использовании в качестве реципиентов штаммов холерных вибрионов было предпринято изучение

шяния различных значений рН, соотношение донора и реципиента, эемеки контакта на частоту образования на селективных средах эаноконъагантов холерных вибрионов.

В качестве донора использовали штамм килечной палочки 053 плазмидой рслб012, детерминирующей устойчивость к канауицину, грестоиицину, тетрациклину, хлорамфениколу и норсульфазолу, а зцилиентом служил рифампицинустойчивый мутант классического био-ара 0Г-75(1-2). В результате проведенных экспериментов установ-зЯо, что при проведен"'л конъюгации в жидкой среде, наибольшая «тота передачя соблюдалась в течение первых трех часов инкуба-га при соотношении донора и реципиента 1:10 и рН среды, равным ,8. Такое значение рН среды, зидиио, способствует более интен-1вному размнояенио холерных вибрионов^ которое приводит к сдви-/ соотношения донор:реципиент в пользу последнего

При изучении возмояности кокьвгационнзй передачи 12 аиткбио-1корезистентных плазмид килечной палочки, относящихся к 9 раз-1чным группам несовместимости, в итак и холерных вибрионов клас-»чоского биотипа ОГ-75 и 569В оказалось, что первый воспринимает зсять внокромосомных факторов из двенадцати, а второй - семь, ри этом показано, что частота передачи значительно повышалась ри проведении конъюгации на плотных средах, вероятно, в реэуль-1те возникновения благоприятных условий как для донора, так и 1я реципиента.

Исследование реципиентных свойств шташ/оз холерных вибрио-)в биотипа эльтор, выделенных на различных территориях СССР, жазало, -гео они могут быть использованы в качестве эф<$е:стив-лх р ципиентов для экзогенных й-плазмид. Рецкпиентные ктаммы )лерных вибрноноз биотипа эльтор с наибольшей .частотой передались такие ннехромосоуны* факторы кишечной галочки, как ¡'(¿.16012,

Юя. а' НХ-4.

Полигостальная плазмида н„4 передавалась во асе семь исполь-

зованних в наших исследованиях штаымоп холераых вибрионов. Вне-

хромосомный фактор.рСАбо12 наследовался четырьмя из секи штампе -5

МОЕ с довольно высокой частотой 10 и одним штаммом - с

частотой 10"^.

Изучение реципиентьой способности вибрионов не 01 группы показало, что частота пер-=рачи плазмвд различных групп несовместимости клетками использованного набора штаммов была неодинаковой. Наибольшую частоту передачи наблюдали при коньюг&циокной передаче плаомид Н15 и ¡(245. Перенос гаазмвды ДР4 . .с ширс"им спектром хозяев проходил с частотой п^-л проведении конъюгации на плотной среде со всеми рециниентныыи штаммами, за ис:шо-чением одного. Плазмида УЧао передавалась В пдть из девяти

использованных штаммов. Передача происходила с довольно низкой

9 -Я

частотой, которая колебалась от 10 до 10"" и только в одном

п

случае в - 10 . , . ■

Нааими эксперимзнт&льньми данными установлено, что вибрионы 01 и не ОТ групп могут использоватьс в качестве реципиентов для гетерологичных плаэмид, а частота передачи внехромосоыных элементов зависит от индивидуальных особенностей как штамма-донора, так и птамма-реципиента.

В результате коныэгациоцкой передачи плазшды кишечной палочки рСАб012, детерминирующей, устойчивость.к тетрациклину, стрептомицину, канамицину, норсульфазолу, и .хлорамфеникслу, были получены транскоакэганты. В качестве.реципиентов использовали спонтанные ыутантц.вкрулентных штаммов классического 0Г-75(1-2) и 4 ел.ьтор биотипов. Приобретение клетками холерных вибрионов плазмидной ДНК подтвер^аено.в-зкспериментах по реципрокной передаче, а также результатами электрофореза в агарозном геле.

ю

Методом случайно!, выборки было отобрано по 4 трансконыоган-та каждого штамма» из которых воздействием бромистого этидия были получены бесплазмидные варианты.

При изучении биологических свойств трансконъюгантов установлено, что у них наблюдалась снижение способности агглютинироваться видоспецийической 0-сывороткой и тнпоспецифическими Сгава и Ин;ба. Изменение агглютинабельных свойств у трансконъюгантов холерных вибрионов в большинстве случаев коррелировало со снижением фаголизабельиых с-ойетв. Ферментация углеводов и декарбокси-пирование аминокислот у всех использованных в данной работе трансконъюгантов холерных Еибрионов были типичными для данного вида еткроорганизмоз.

При проверке на онтеропатогенность на модели кроликов-сосунков показано, что трансЕ01гыоганты со сниненными агглютииабельны-

Л1 и фаголизабельными свойствами не вызывали холероге;-.лого зффяк-7 й

га дшке в дозе 10 -10° Ш. Все спонтанные рифамлицннустойчивые лутантн и бесплазмндные варианты эльтс;- биотипа давали холероген-шй эффект в дозе 10^, а классического - 10^.

Плазиида кишечной палочки рСАб012, обладающая маркерами ус-гойчивосхи к тетрациклину, стрептомицину, канамицину, норсульфазолу и умрачфеииколу, экспрессировяла все свои маркеры ь холер-юм вибрионе. Наиболее эффективно в новом хозяине экспрессирова-шсь детерминанты устойчивости к канамицину, хлорамфёниколу и ;трептом;!цину..При этом нельзя не обратить внимыме на тот факт, 1ТО минимальная ингибиругащая концентрация тетрациклина для транс-еоныогантоо была в 2 раза визе, чем у родительского штамма, что [Еляе.ся примером влияния нового генетического окружения на экс-фессию гена Тс?

Стабильное сохранение «ллазмиды рйАб015; ь клетках нового хо-шина мокно рассматривать г, качестве свидетельства достаточной

корреляции процессов ее реп..лкации с аналогичными процессами собственной хромосомы Еозбудктеля холеры. Небезынтересно отметить, что плазмида рЗАбо:г относится к А группе несовместимости, которая тождественна С. Согласно литературным данным (Ней-БвЕ П.«. е! а1. ,1977; Киу.'аЬага К. ,1978; Ш а о а Л.З. е1 а1.,1980), плазмиды С группы несовместимости наиболее часто встречаются у природных штаммов холернь-х вибрионов.

При сравнительном изучении динамики размножения популяции трансконгв^антов, родительских штаммов и эксконъюгантоэ проявилось ингибирующее влияние плазмидн рОАбспг на ...ост клеток холе]; кого вибриона. Для тралсконгпганюв обо,./ оиогипоз были характе| ны более удлиненные стадии адаптации и экспоненциального роста, а также стационарная фаза.

В литературе имеются многочисленные данные (Петровскш» В.Г 1934,1У85; Дсыарадский И.В,, 1935,1987) о влиянии внехромосомных паркеров факторов на патогенные свойства клетки-хозяина. Поскольку патсгснность холерного.вибриона.является комплексным признаком, который предполагает е спрес'сш клеткой продуктов многих генов, нами проведено изучение целого ряда свойств транс-конъюгантов.

При изучении лецитиназной.активности найдено, чта.всь трап-ко1гьвганты холерных, вибрионов сохраняли способность расщеплять лектин на средс с добавлением желтка и образовывали вокруг кола ний характерные .зоны просветления с металлическим блеском, аналогичные по интенсивности и размерам зонам, образуемым родитель скими итш.ма'Д! н. С'есплазг.шдншж вариантами.

При исследовании способности.трансконъюгантов продуцироват протеазу на. 2$ агаре-Мартена, с добавлением 1С® обезжиренного мо лона, оказалось, .что. все.{преобладали .высоким' и..средним уровням: протеолитической активности, не отличаясь от своих родительски?

и бесгшап!.. .дных вариантов. При определении типа протеаз методом ингибиции удалось установить, что почти у всех трансконъюгантов обоих биотипов, в отличие от родительских штаммов и зксконъюган-тов, присутствует лишь одна протеаэа тиолового типа, за исключение г,) двух, у которых 1фоме протеазы тиолового типа, обнаружена металлозависимая форма фермента.

Г!_ здукциа зибриоцяна выявляли методом отсроченного антагонизма по p. Predericq. Все культуры родительских штаммов, экс-контюгантов и трансконъюгантов были стабильна по признаку вибрио-цикогении. Негативных вариантов среди трансконъюгантов по данному признаку не удалось обнаругить. -Злектрофоретическое исследование лизатов клеток трансконъюгантов, родительских штаммов и ревертантов показало присутствие плазмиды с небольшим молекулярным весом, по своей электрсфоретической подвютюстн аналогичной pVib, которая, по мнению U.M. Еодаловой (1989), контролирует синтез протеолитичесяого комплекса, лецитиназную, протеазную активности и продукция вибриоцина.

По своей нейраминидазкой активности лее исследованные культуры холерного вибриона делились на штаммы с высокой активностью -17,1-45,7 НЕ и низкой - 1,4-6,3 НЕ. Установлено, что приобретение плазмиды оказывало ингнбирувдее действие на уровень активности кейрамшидазы у вибрионов: у трансктгъюгантов штаммов классического биовара отмечалось снижение активности фермента в семь и более раз. Аналогичная картина била выявлена и у всех вариантов культур. холерных вибрионов биотипа ольтор с плазмидой. Среди трансконъюгантов не было выявлено ни одного с чысокой продукцией данного фермента.

. В последние .годы установлено. (Король B.C. и др., 1983; Лобанова Л.Н. и др., I9E3), что существенным, звоном в разэитик патогенеза я тяется способность холерных вибрионов пр/греплять-

ся к слизистой тонкого кишечника. В результате проведенных исследований на модели кишечных дисков крсликов установлено, что родительские штаммы и зксконызганть обоих биотипов обладали достаточно высокими адгезивными сг->йствами. Коэффициент адгезивной активности у них находился в пределах от 12,0 до 27,з то время как у трансконъюгантов индекс адгезии колебался от 0,5 до 10/5. Элиминация плазыиды у транскотаюгантов приводила к восстановлению адгезивных свойств до уровня родительского штамма.

Йризнано, что ведущим фактором патогенкости холерных вибрио- - • нов является знтеротоксин. В настоящее время наиболее достоверным методам определения потенциальной способность холерных вибрионов к продукции токсина является метод молекулярного зондирования генов, контролирующих данный признак. Полученные в результате конъюгационной передачи плазмиды р0А6012 холерным вибрионам трансконмоганты со сниженными холерогенннми свойствами были испытаны на наличие.vet-генов. Оказалось, что все культуры холерных вибрионов.(рифампициноустоячивые мутанты, бесплазмидные варианты и трансконыэганты) всех исследованных штаммов давали по-лояительный радиоавтографический, ответ на нитроцеллшознмх фильт-

оо

pax с меченным Р зондом структурных генов холерного токсина. Это свидетельствовало о том, что у трансконыогантов с измененными холерогенными свойствами, присутствовали копии структурных генов. Однако наличие копий токсинообразования могло только указывать ка потенциальную способность клеток синтезировать токсин, который по каким-то причинам может не экспортироваться из клеток или ке в результате структурных изменений синтезироваться в недостаточном- для его обнаружения количестве.

При изучении биологической активности токсина в кожной пробе Kjvflra ({актор сосудистой проницаемости) установлено, что все куль-ур; родительских отхогов к беоапаямиикке варианты давали

г.оложитель: уа пробу в разведениях 1/8-1/16. В отличие от них подавляющее большинство трансконыогантов штаммов холерного вибриона, за исключением двух трансконьюгантов биотипа зльтор, давали положительный эффект в пробе Крейга только в разведении 1/2.

При постановке реакции преципитации по Оухтерлони были выявлена существенные разиличия между трансконысгантами, родительскими штаг :ами и бесплазмидными вариантами по их способности продуцировать токсин: нам не удалось выявить прилуночных зон преципитатов ни у одного из трансконыогантов пяти штаммов в реакции преципитации с антитоксической сывороткой, что могло свидетельствовать об отсутствии или резком уменьшении количества синтезируемого токсина. Все культуры рифампицинустойчлвых мутантов и ревертанты образовывали линия преципитации с антитоксической сывороткой.

Особое внимание.заслунивапт данные по изучению уровня цАМЗ . у трансконъюгантов,. так как, согласно литературным данным (си!<1о-«1 А. ег в1., 1972; НаиасЬка вЬ в!., 1972), этот нуклеотид мояет обеспечивать реализацию патогенных свойств бактериальной клетки через непосредственное участие в процессах транскрипции-трансляции.

.. -При определении внутриклеточного содержания цАМЗ у культур холерных вибрионов с плазмидой. рСАб012. данного нуклеотида ис-. пользованным методом обнаружено не било. В то яе время родительский и бесплазмидные варианты.имели практичеезш одинаковое количество. цАМФ. С30-30,7 пмоль/мг)..

При изучении динамики содержания. цАМ* в течение семичасового культивирования .оказалось, что родительский итанм - споктанньй рифампицинустолчивый мутант, и. бесплазмидкый вариант имели одинаковый профиль накопления, внутриклеточного нуклеотида. У транс-конъвганта кс со скиженниши холерогенными, агглютинабельными,

фаголиэательными, адгезивными свойствами, сниженным уровнем ней-раыинидазы и не продуцирующего токсин количество цАЫЗ резко отличалось от первых двух. В течение ..ервых трех часов количество продуцируемого цШ> было в 3-10 раз меньше, чем у исходного варианта и ревертанта, а к четвертому часу оно падало до куля и в дальнейшем (с пятого по седьмой час) больше не регистрировалось.

Уровень другого циклонуклеотида - тдГМЙ в процессе культивирования равномерно увеличивался как у родительского штамма, ре-вертанта, так и у транскокюганта.

Таким образом, удалось показать, что при введении и-плазмиды рСАб012 у холершлс вибрионов происходило изменение ряда признаков, обусловливающих вирулентность у возбудителя холеры (нейраш-нидазы, продукции токсина, адгезии), выявлено существование прямой корреляции мевду уровнем цАМФ и эффективностью экспрессии данных признаков. Обнаруженный факт можно объяснить способностью гохй гена холерного вибриона осуществлять контроль уровня транскрипции генов пагогенности: продукты данного гена необходимы для синтеза фактора колонизации, белков наружной мембраны, энтероток-сина и ряда других, экспрессия которых происходит координировакно. Так как элиминация плазмиды ведет к восстановлению утраченных клеткой свойств, можно предположить, что происходящие изменения носят регуляторный характер и, вероятно, влияние самой плазмиды р0Аб012 осуществляется через экспрессию продуктов ее генов, оказывающих трэнзиторное репрессирующее действие на функцию ъолЛ гена.

выводы

1. Штаммы вибрионов 01 и не 01 групп, выделенные на территории Сибири и Дальнего Востока, являются эффективными реципиентами для экзогенных и -плазипд знтеробактерий,

2. Установлено, что при использования в качестве реципиен-• тов вибрионов 01 и не 01 групп,,оптимальными условиями прй проведении конъюгация в кндкой срцпо является рН среды (7,8), соотношение донора и рэцяпиента (1:10) и продолжительность контакта (три часа).

3. Обиарувено, что у трансконъюгантов холерных вибрионов из пяти триеров аятибиотикоустойчмвости плазг-яуш рОЛбекг эффективнее згспрвссируется резистентность к канамодшу, хлораифзкаколу

и стрептомицину. Маркеры резистентности к тетрацятгату, вгиЕМяця-ну, етрзптогящкну, хлорамфеггаколу и норсульфазолу плазкцш петеч-ной палочки рСА.6013 наследуются отаммани холерных вибрионов стабильно.

4. Установлено, что под влиянием пяазмиды рС!Аб012 у холерных вибрионов изменяются вакнеВзие днффаргнциально-диагноствче-ские признаки, такие как агпготииабельность, фаголнвабельность н снижаются их вирулентные свойства,

5. Доказано, что координированное"траиэяторноо аа»енвние у траисконъпгантоэ некоторых свойств, обусловливающих вирулентность возбудителя холеры (продукция токсина, адгезия я нейраиинидазная активность), носит регуляторшЗ характер, что позволяет рассматривать явление конызгацаонного восприятия н-гтакпды ролботг как одну и» возможных причзн возникновения пвирулентных или слабови-рулеитиых атамуов.

6. Устанбвлено существование связи нему внутриклеточным со-дервгниеы цАЫД й вирулентностью возбудителя холери, что свидетельствует об участии нуклоотчда в развитии инфекционного процесса.

СПИСОК РЛЕОТ, ОПУШИКОВАНННХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белобородов D.B., Поздеева Г,А. Изменение биологических свойств у транскокьюгантов V.cholerae üraaa-75(I-2) //Молекул, бисл. к гспвгкка возбуд. особо опасн.инф. - Саратов, 1982. - С.7-9.

2. Поздеева Г,Д., Еелобородов Ю.В. Биологические свойства к-трансшгьюгангов вибрионов зльтор // Молекул, биол., генетика и имыунол. воабуд. особо опасн. кнф. - Ростов-на-Дону, 1984. -С. 43-50.

3. Белобородое Ю.В., Поздеева Г.А., Набкев Э.Г., Ганин B.C. Биологические свойства R -трансконьюгьнтов v. jhoierae Огава-75 (1-2 // Современные аспэкта профилактики «основных инфекций. -Иркутск, 1Ш. - С. 103-104.

4. Нараыович A.C., Пинигин A.S., Ганки B.C., Осауленко О.В., Набиев О.Г., Поздеева Г.А., Урбанович Л.Я., Саппо С.Г. Биологические свойства и экология вибрионов в Сибири и Дальнем Востоке / Иркутский научн.-исслед. противочумн. ин-т Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1976. - 246 с. - fr гос.регистрации 76084755.

5. Пинигин А.Ф., Марамович A.C., Колесник B.C., Ганин B.C., Набиев Э.Г., Поздеева Г.А., Урбанович Д.Я. Оценка вирулентности вибрионов зльтор, циркулирующих на территории Сибири и Дальнего Востока в период эпидемического благополучия по холере / Иркутский научн.-исслед. противочумн. ин-т Сибири и Дальнего Вос-тоха. - Ирхутск, 1984. - 98 с. - » гос.регистрации 01840022751.

6. Домарадский И.В., Голубинский £.11., Белобородое Ю.В., Танин B.C., Набиев 8.Г., Поздеева Г.А. Влияние плазмид на биологические свойства холерных и НАГ-вибрионов / Иркутский научн.-исслед. противочумн. ик-т Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1985. - 00 с. - » гос. регистрации 9I004I86.