Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние поверхностной структуры лиганда и длины спейсера модифицированных кремнеземных сорбентов на сорбцию протеиназ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние поверхностной структуры лиганда и длины спейсера модифицированных кремнеземных сорбентов на сорбцию протеиназ"

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ І БІОХІМІЇ ТВАРИН

На правах рукопису

Сі ♦ П іл-іч * *

9 <;^7

ОРИЩЕНКО Наталія Валентинівна

ВПЛИВ ПОВЕРХНЕВОЇ СТРУКТУРИ ТА КОНЦЕНТРАЦІЇ ЛІГАНДУ МОДИФІКОВАНИХ КРЕМНЕЗЕМНИХ СОРБЕНТІВ НА СОРБЦІЮ ПРОТЕЇНАЗ

03. 00. 04. — біохімія . АВТОРЕФЕРАТ

дисертації ва здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЛЬВІВ 1997

Робота виконана в Львівському філіалі Київського науково-дослідного інституту гематології та переливання крові МОЗ України. .

Наукові керівники: доктор медичних наук

М. В. Миндюк . кандидат хімічних наук А. В. Гайда

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

, Л. І. Сологуб ■

кандидат хімічних наук, доцент ,

М. В. Гончар . .

Провідна установа: Львівський державний університет ім. І. Франка

Захист відбудеться « _1997 р. о. їй. ход.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 020. 14. 01 в Українському НДІ фізіології і біохімії тварин (290038, м. Львів, вул. Стуса, 38).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Львівського філіалу Київського НДІ гематології та переливання крові.

Автореферат розісланий « _І997 р.

' Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук (/ Чаркін В. А.

Вступ

Актуальні ста теми. В останній час різко виріс інтерес дослідників до афінної хроматографії як до облого з найбільш перспективних та простих в виконанні методів розділення сумішей природних сполук.

Широке використання метода афінної хроматографії стззі^і жорсткі вимоги до відтворов-яності властивостей сорбентів і визначає необхідність - розробки методів направленого синтезу сорбентів з прогнозованими характеристиками.

Одним з перспективних носіїв для приготування змінних сорбентів є кремнезем. Цей носій дешевий, володів високою механічне» стійкістю, не насукав та не піддається мікробіологічній атаці. . . .

' Модифіковані кремнеземні сорбенти успішно використовувався в афінній хроматографії прогеїназ різних класів. Отримані за допомоги цього метода високоочицені препарати протеолітичних ферментів придатні для подальшого застосування у ріе-них галузях,, а саме:, в клінічних та діагностичних лабораторіях, в наукових та учбових закладах,, на виробництві. Зокрема препарати тромбіну ( серинова протеїназа плазми крові ) використовуються для визначення троибінового часу, концентрації Фібриногену та ін.

Тим не менше, широке застосування кремнеземних сорбентів для очистки білків (особливо білків плазми крені) поки шо обмежене. Основна причина цього - недостатній набір модифікованих кремнеземів, які відповідали б вимогам іонообмінної та афінної хроматографії, відсутність, розроблених методичних підходів, меншша неспецифічна сорбція на немздпїішззяк:; ск-лансльних група-: .

Тому вивчення і встановлення закономірностей зв’язування протеіназ з афінними сорбентами на основі силохрому, а також розробка нових методів добування препаратіЕ протєїназ є актуальним завданням.

Мета і завдання дослідження. Мате® даної роботи 5 вивчення сорбції' серинових протєїназ, а саме тромб і ну, трипсину і суСтидіаину, на силохромах, модифікованих інгібіторами про-теїназ бащгграадшои і граміцидином С, встановлення можливості використання очидакого препарату тромбіну людини в коагуло- • логічних дослідженнях. Для досягнення цієї мети в роботі були ■ заставлені конкретні завдання:

1. Еквчити закономірності сорбції субтилізину, трипсину та

трембіну на вказаних сорбентах в залежності від концентрації ліганду, довжини спексэра та додаткової силааїзації повеохні, визначити найбільш оптимальну концентрацію ліганду та довжину гп-псера для добування субтилізину, трипсішу та тромбіну, з також експериментально обгрунтувати можливість використання змінне і хрсіїатографії для очистки трембіку, трипсину та суб-гилізину. .

2. Отримати препаративну кількість тромбіну людини, необхід-

ну для створення діагностичних наборів для тестування зсідавшої системи крові. Перевірити умови зберігання отриманого препарату та діагностичних наборів. . ' '

3. Здійснити доклінічне вивчення створених наборів та передати їх зразка для апробації в клініку. . • ‘

Наукова новизна дослідження. . • .

Вперше проведено, систематичне'вивчення нових бацитрацин- та граміцидин-вмісних сорбентів по їх здатності зв'язувати субти-лізин, триазин та трембін. • ■ (

Показано, шо у випадку трипсину і,тромбіну використання довгих поліметиленових (п>3) спейсерів приводить до погіршення характеристик сорбентів - зниження питомої активності та зменшення загальної сорбції протєїназ. Додаткова силанізація сорбентів практично не впливає на сорбціЕ трипсину, дешр покращує сорбцію субтилізину та робись неможливо» сорбцію тром-

І1ЯУ.

:ча нових сорбентах отримано препарат трембін людини з питс-моп активністю понад £000 од.МІН/мг білка, який придатная .іля використання в коагулологічних. наукових дослідженнях та лк електрофоретичний стандарт. На осноеі ііьго препарату «комплектовані. набори для визначення концентрації фібриногену з плазмі крові, концентоації антитромбіну III,

тгаогромбінового, тромбінового чзсу -га часу рекальцифікаці;. вмісту ранн їх. продукті в деградації фібрину (фібриногену; та розчинник фібрин-мономерних комплексів. Показано., по нзСср;:. виявили коропу відтворсЕанність та можуть застосовуватись у

КЛІНІІЛ.І .

Практичне значення роботи. Робота містить лані про оптимадг-ні значення таких характеристик сорбентів, лк концентрація приєднаних лігандів, довжина спейсера, що зв'язує лігакд і матрицеи, а також про вплив додаткової силаяізації на сорбцію субтилізину. трипсину та тромбіну. '

Створено нормативно-технічну документацію ( .лабораторні регламенти, технічні умови, інструкції по використанню ) на набори дія визначення основних факторів зсідашої системі:, які можуть бути впроваджені у серійне виробництво.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідалися на III-«у скмпозиумі "Химия протеолитичэских ферментов" (Москва, 1993), Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Суші, 1994), 11-й Всеросійській конференції, присвяченій патології гемокоагуляції (тромбози, - геморраргії, ДВЗ - сучасник стан проблеми), (Москва, 1995), на XII з'їзді гематологів (Стамбул, 1935), яа симпозіумі, присвяченому 40-річчю спілки дослідників тромбозів та гемостазу (Інтерлейкєн, 1996), на конференції присвяченій 25-річчв лікарні швидкої медичної допомоги (Львів 1997) та на І західноукраїнському симпозіумі с-адсорбції та хроматографії (Львів 1997).

На захист виносяться основні.положення:

1. Умови зв'язування тромбіну, трипсину та субтилізину з ба-цитрациковими та граміцидиновши сорбентами, визначення найкращого сорбента для очистки тромбіну, трипсину та субтилізину.

2. Метод препаративного отримання препарату тромбіну' людини

ка силохроишо: сорбентах. ■

4, Результати лабораторного вивчення діагностичних наборів для визначення протромбіяового. тромбінового часу та часу ре-кальцифікатї, фібриногену, ранніх продуктів деградації фібрину/фібриногену та розчинних фібрин-иономерних комплексів ь плазмі крові. .

Структура і об'єм дисертації.. Дисертація складається іе вступу', 5 частин, списка літератури та додатків. Вона містить 214 сторінок, вклечахт 11 таблиць та 41 малюнок. Бібліогра-

фія - 158 зсилок. Е^додзгках представлені акти про впровадження отриманих а роботі результатів , регламенти та технічні умови на виготовлення наборів. Дубдінації. За результатами досліджень опубліковано 10 робіт.

' МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДССЛІД2ЕНЬ .

Об'єктом дослідження служили:

- афінні сорбенти на основі силохрсма з різнею концентрацією ліганду та довжиною спейсера;

- лубтидізин, трипсин та тромОін;

- зразки плазми донорів та хворих.

З якості сировини для отримання тромбіну людини викерис-ховувади фракцію ІІ+ЗІІ за Коном Львівської станції переливання крові.

В роботі використовували загальноприйняті біохімічні , біофізичні, хімічні методи, в тому числі хроматографічні, спектрофотометричні, колориметричні-

Кількість білку . з пробах визначали за - методом ЗгайГогсі. • '

Активність субтилізшу еизначали -за гемоглобіном людини. За 1 одинипр активності приймали таку кількість субпшізину, щз давала приріст Егво за і хв. '

Акгнвнють трипсину визначали за хромогенним .субстратом !Іа-В2І-01-АгЕ-рМА НС1 по приросту оптичної густини в розрахунку иа 1 мг за 1 хв. ' , •

' Активність тромбіну визначали за допомогою стан-, дартного (0,1Х) розчину фібриногену, фіксуючи час утворення ниток фібрину. За одинице активності приймали таку кількість тромбіну, що перетворювала 1 мл стандартного розчину фібриногену у фібрин аа 15 с.

\ Яіггсау активність всіх ферментів виражали в одиницях протеолітичної актішності^на 1 мг білка.

Основний зміст роботи

і Стоуктура використаних сорбентів '

Закономірності оербції пратеїназ - тромбіну крові людини, тг'лпсину велико і рогатоі худоби та субтилізину вивчали за’до-. 7.смс-гсп бзівпрашш - та граміцидин - силохрошв, ш містили

'ліганд, ішоСіаізаваяий через "ніяку" 1, 3, 6, 7 1 11.вуглецевих атоми, в концентрації від 0,1 до ЗО мг ьа і г сорбенту (від 0,03 до' 7 мМ). Частину сорбентів додатково обробляли триметилхдорсиланом з метою видалення можливої неспецифічної сорбції на яемодифікованих силаяольних групах силохрома. структура ліганду позначення сорбенту

в тексті

#|-ССНг)п-2с ■ п-З вз

П—11 ВИ

# І - (снг) з-о-снг-снонснг-ын-вс

В7

#|-ГСН2)п-Вс

#|-СНз

п-З' ВЗ' п-б' В0'

#|-(СН2)п~і

«І І ОТ

П-1 И П-З БЗ П-б 66

п—її 611

»І - (СН2)п-0-ет2СН0НСН2-НН-,

#| ' • і ег

#1 - (СН2)п-0-СН2СН0НСН2-№Н

*КСН£)п-1

«І І ег. «|-(СН2)Г1-#!

«І-СНз

п-1 п-З ' п-б

51'

БЗ’

(36'

де: - кремнеземна катрищі, Вс - залишок бацнтра-

цину А, Б - заливок граміцидину С.

Рис. 1 Структура використаних сорбентів. . Характеристики сорбентів подані в таблицях 1-6.

- б -

2 Хроматографія субтидізину на бащтрацивовзк сорбентах Субтидізин - протеїназа, ир прадукувться бактеріями ВасШиз.ЗиЫШз, мав широку специфічність, гідродізує .білки по гідрофобних задишках.

При навчанні залежності сорбції субтидізину від' концентрації ліганду для сорбентів ВЗ спостерігається абідь-зеккя сорбції від 20 до 84 одиниць при підвищенні концентрації бадитрадаву від і до 18,7 иг/г сорбента (тзбл.1).

Питома активність субтидізину не залежить від концентраті ліганду і знаходиться в мелах 19 - 21 сд./мг. при зміні концентрації бацктрацину від ОД до 18,7 иг/г сорбента.

Для сорбентів Вб питома активність субтидізину була видав і практично не змінювалась із ростом концентрації бацит-рацину і ледала б межах 43 - 50 од./ыг. •

Загальна ссрбована активність ферменту досягала максимуму (72 -73 од.) при концентрації ліганду в межах 1-10 ыг/г сорбента. . ' ■ -

У випадку сорбентів В7 та ВИ ’спостерігається збільшення сорбції ферменту від 51 до 117 та від 45 до 285 оди- . ниць із збільшенням концентрації ліганду від 0,1 до 10,3 та 18,7 иг/г сорбента відповідно. •

. ■ ■ Питома активність для цю? сорбентів, як і в попередніх

■ випадках, практична мддп змінювалася із ростом концентрації ліганду і становила 20 - 30 од./мг білку. . ' .

, Таким чиром, з ростом концентрації ліганду для вріх сорбентів ( від ВЗ до Вії ) зростає кількість сорбованого субтидізину, тоді як питома активність для кожного-сорбенту залишається практично незмінною. • ■

Отже, для виділення та очистки субтидізину доцільно використовувати бацитрацинові сорбенти з високою концентрат цією ліганду ( до 1? 1 20 иг/г сорбента ) (табл:і).

Залежність сорбції - субтидізину від довяинн спейсера вивчали для концентрацій ліганду 1 та 10 мг/г сорбента.

Показано, що віддалення ліганду від. матриці приводить до збільшення сорбції суотилізину ири обох концентраціях ШГЗК

Таалкая.і

Результати хроматографії сувтигізину (Ладмгаяський завод ферментативних препаратів) на бацятрзцинових сорбентах

Сорбент Вміст ліганду» ■ мг/г кількість сорбова-Іної речовини Питома активність, сд./кг Мйа

1 Фериевт од.акт. шл ■

ВЗ 0,1 1,0 8,8 18,7 • *53,2+0,30 *20,5+0,30 ' 70.Ji0.25 В4,0±0,20 19,о±о,го 19,010,17 21,310,13 19,010,12

В6 0,3 1.0 10,0 30,0 55,0±0,10 72,0±0,15 73,ОН),10 60,010,25 43,0+0,15 50,010,20 50,010,15 50,0±0,10

В7 °'І . 1,0 ■ 5,8 10,3 51,8±0,25 94,ОЙ) ,.15 98,0±0,13 117,0±0,20 34.110.10 •. 25,0+0,10 24.510.10 .31,010,16

ВІЇ ■ 0,1 1,0 8,7 • 18,7 ' 45,0+0,20 118,0±0,17 143,010,23. 285,0±0,2В ' 2І,0±0,10 32,0+0,20 *23, ЗЮ,17 31,0+0,10

ВЗ’ ’ °'1 1.0 7,0 12, В . 50,0+0,15 . 60,0+0,12 . 58,0+0,15 52,0+0,10 25,0+0,10 27,040,10 27,0±0,10 2б,0±0,15

ВЗ' " 0,1 1,0 10,0 , 23,2 69,0+0,10 86,0+0,10 ’ 18Є,0і0,10 158,0+0,20 34,1±0,-10 33,6±0,20 31,3+0,25 34,0+0,15

* -Р>0,05

- а -

ду. Для кснцвнтрагЗї 1 иг/г вона зростає від 20 до 118 од. а для 10 иг/г - від 70 до НО од.

Оскільки максимальний ступінь очистки субтилізину досягається ігри давленні спенсера б атомів вутлецр, то такий спєи-сер е■ оптимальним для добування субтилізину на бадитрацин-си-лохремах. ; • '

- Частину Сащгхралинових сорбентів було додатково оброблено триметялхларешанои для усунення можливої неспецифічної сорбції яа кемедифікованих сшанодьних групах.

Як виявилося, така обробка сорбенту ВЗ ( сорбент ВЗ' ) дргаела до збільшення сорбції субтилізину приблизно у 2 рази порівняно із сорбентом ВЗ, питома активність при цьому аросла у 1,5 рази (тзСл.1). •

іір:: аналогічній обробці сорбента ,В6 ( сорбент В5'}

спостерігається незначне зниження загальної сорбції субти-лізину ( 72 од.- В6,^ 60 од.- Вб' ) та зниження питомої активності у 1*5 - 2 рази в залежності від концентрації ліганду ( 50 од./мг- ВЗ, 27 0Д./ИГ-. Вб'). ■ '

Імовірно, шр у випадку сорбентів ВЗ' додаткова силані-зація приводить до сильнішого збільшення' гідрофобності поверхні, яка, напевно; підсилює взаємодію субтилізину з бацитрацином, щр приводить де 2-х кратного підвищення- кількості сорбованого .ферменту та 1,5 кратному збільшенню питомої активності. . .

Отже, для очистки субтилізину на сорбентах з іфротким спейсером доцільно додатково обробляти їх гриметилхлорсила-ном, оскільки це приводить до покращення сорбції та очистки ферменту. . . . _ •

У випадку ..сорбентів Вб' додаткова силанізація, напевно, не. так різко змінює гідрофобність, шр практично не впливає на сорбціЮ'субтщіізину, але приводить до сорбції домішкових білків. ’

З Хроматографія субтилізину на граміпидиновях сопбенгах

Загалом сорбція субтилізину на граміцидинових сорбентах була дещо вищою, ніж на бацитрашн-силохромах.

Збільшення концентрації граміцидину на сорбентах И приводило до зниження сорбції субгадізину ВІД 168 ДО 146 од.

Питома активність мала максимальне значення при кон- . центрації ліганду 1 мг/г сорбента і становила 114 -од./мг ' (табл.2). ;

Для сорбентів 03 збільшення концентрації граміцидину від 0,1 до 9,2 иг/г сорбента приводило .до збіднення зв'язування ферменту з лігандом (-52 - 128 од.). Питома активність субтилізину при цьому також вростала ( від 26 до 80 од./мг). ■

Можна зробити висновок, цз при довдині спейсера 3 атоми вуглеідо ліганди граміцидин-силохрому стають більш доступними для молекули субтилізину, що приводить до покращення зв'язування ферменту та підвищення ного питомої активності. ' ■

Спхе, для вивчених нами сорбентів, ■ для добування суб-тилізину доцільно використовувати граміпядинові .сорбенти 33 э концентрацією ліганду 6-9 мг/г сорбента.

Додаткова силанізація сорбентів (31 ( 01' ) і БЗ ( 03') приводила в обох випадках до погірзення сорбції. Так, у випадку Б1* 'це привело до вниження сорбції субтилігину приблизно в 1,7 - 2,2 рази порівняно з несиланізованим сорбентам ( 164 од.- 70 ад. відповідно ). Такі ж зміни. характерні і для питомої активності (114 од./мт - 01, 59 од./мг -01’). Щодо сорбенту 33', то для нього ці зміни виражені ще різкіше (табл.2). Загалом на. сорбентах ЄЗ' досягалася краща сорбція та отаегка ферменту при низьких концентраціях ліганДУ- . ' .

На сорбентах І35’ при концентрації ліганду 10 мг/г сорбента спостерігалося максимальне значення сумзрної сор-бованої активності субтиліаину ( 144'од. ), а також досягалася його максимальна очистка ( 80 од./мг.), Зміна концентрації ї граміцидину у будь-який бік приводила до зниження сорбції та питомої активності субтилізину. .

Отже, з додатково сиданізовавих граміцидин - силохро-мів найбільш придатним для добування субтилізину. виявилися сорбенти (33' з концентрацією ліганду 1 мг/г сорбента та (36* з концентрацією ліганду 10 мг/г сорбента. . .

, Залежність впливу довжини спейоера додатково ейланізо-

-10- ; .

Таблиця 2

Результати хроматографії субтилізину (Ладаяинський завод ферментативних препаратів) на граміішдинових сорбентах

—г Сорбент | ; і Еміст ліганду, 1ДГ/Г кілікісті сорбсяа-ііоі речовини 1 Питома активність, од./мг . Мйі

Ф0РМОНТ од. ект.1 ' М±т

ОД . 168,010,25 76,010,10

Б1 1,0 164,0±0Д0 114,010,10

3,3. 1ЄЗ,0±0,15 109,010,10

3.4 14б,0±0610 82,010,15

і од 52,510 ДО 26,210,15

<33 1,0 95,010,10 ЗО.ОЮДО

1 5,7 - 142,010,15 89,0+0,25

.9,2 128.0ЮД5 • . 80,0Ю,Ю

ОД • . 97,510,20. ■ в5,0ЮД5

61' 1,0 *70,010,15 59,010.10

4,2 75,010,10 *55,510,15

5,0 56,010,15 • 50,0ЮД5

од 170,ОЮ, 15 63,010 ДО

Ш' 1,0 140,0±0Д5' 5а ,0ЮД5

3,8 ІОО.ОЮДО 50,0ЮД5

.5,4 ■ 29,0±0,15 24,5ЮД0

од ' 37,Ой,20 • 50,0ЮД5

. 06' 1,0 73;ОіОД5 59,010,10 •

10,0 * 144,010 ДО 80,010,15

•• 30,0 ( 42,010,15 41.0ЮД0

* Р>0,05

ваних граміцидин - сштромів яз зв’язування субгилізину вивчали лите для концентрації ліганду 1 мг/г сорбента.

Як виявилося, сумарна сорбована та питома активності . субтиіізину від д оешіни спейсера Суди максимальними при довиині "ніякії" З вуглецевих атоми.

Таким чинои, -гідрофобний сорбент 63' так само як : бацитрацин-сшгахрок ВЗ’, вкязився найбільш дридатнкы для отрзмалня субгклізину. '

Після аналізу всіх вищевказаних сорбентів могла зробити висновок, ер для отршанвя препарату субгилізину з изк-сіг.:зльвоз пптоїхяо активністю пзйбіліп придатними виявилися граміцидин - сидохрсіі й з концентраціє!} ліганду 1,0 -

3,6 цг/г сорбента. Для препаративного отрицания ферменту найкраще використовувати бацитрацга - сялохром Вії з концентрацією ліганду 8,7 - 18,7' иг/г сорбента , т&чси коте бути використаний сорбент ВЗ' з концентрацією Сацитрацику Ю мг/г (табл. 1,2). ■

. 4 Хроматографія трипсину на бацптрзцйнозих сорбентах

Трипсізт - фермент підшгункозої залози великої рогатої худоби. Він є більш специфічний порівняно з субтилізияом І Е основному, гідролізув пептидні зв’язки, утворені карбоксильними групами аргініну і лізину. ■ ,

Як виявилося, криві залежності загальної сорбовачзї та питомої активності трипсину,від концентрації бацитрацияу на сорбентах ВЗ проходять через максимум ( БЗ од. та 23,3 од./мг відповідно) при концентрації ліганду 1 иг/г сорбента.

У випадку сорбентів В6 крива сумарної сорбованої активності трипсину виходить на плато при концентрації ліганду 0,5

- 10 мг/г сорбента і знижується при рості концентрації бацит-рацину до 30 мг/г. Питома активність трипсину мав максимум е межах концентрацій ліганду 1-10 мг/г та становить 14 од/мг (табл.З).

На бацитрацинових сорбентах з довжкнов спейсера 7 атомів вугхещ ( В7 ) ріст концентрації ліганду від 0,1 до 5,8 мг/г сорбента приводять до збільшення сорбції трипсину. Але при дальшому підвищенні концентрації бацитрацину ( до 10,3 мг/г

сорбента), зв'язувзгня фермент/ з лігандом виходить на плато і становить 2в од. Шггома активність трипсину у даному випадку знижується від 14 до 9 од./мг.

Максимальна сорбція .трипсину на сорбентах 511 досяга-зтьсяпри концентрації,лігааду 8,7 мг/г сорбента. ■

Питома активність трипсину не змінювалася при рості концентрації бацитрацину . від 0,1 до 8,7 мг/г і становила 7

- а од.лс. Збільшення концентрації ліганду до 13,7 мг/г приводить до підвищення очистки фермента .

Тзким чеком, • найбільш ' придатним для виділення та очистки трипсину виявися бащгградкн - силохром ВЗ з кон-центрасієи ліганду' 1 мг/г сорбента.

Залежність сорбції трипсину від довжини спейсера бат щгсрацкБ - сидохроиїв вивчали для двох концентрацій ліганду ~ 1,0 та 10 мг/г сорбента.

Вітвилоса, Ер дай обох концентрацій ліганду збільшення довжини спейсера приводило до зниження сорбції трипсину від 25 до 12 ад. ( 1 иг/г ) та від 21- до 14- од. ( 10 мг/г ) .

Віддалення ліганду від матриці приводило,' такт, до погіршення ступеня очистка .ризскку. А саме, питома активність знижувалася від 23‘до 8 од./мг для концентрації ліганду 1 мг/г та від 13 до 7 сд./мг для концентрації ліганду 10 мг/г сорбента (табл.З). " ,

Як виявилося, питома активність трипсину знижується як з ростом конгентрації ліганду, "так і а віддаленням йрго від Матриці. Можливо, в дакоьу випадку з ростом концентрації ліганду та довжини "ніжка" зменшується специфічність взаємодії трипсину в бацитрацинм. Причино» цього мохе бути і збільшення неспецифічної взазмодії ліганду ■ ( спейсера ) а ' іншими білками. . .

- 0ТХ8# ДІЦД ДСбуВоНКЯ ТржЩСїІНу ДОДІЛЬНО ВККирКС?05УВЗ.ТК

5аштращга - сшшхроыи з короткий спейсером, а саме 3 атоми зугдеве. ’

. Як виявилося, підвищення гідрофобності сорбентів БЗ ВЗ' і та 35 ( В8’ ) практично не впливав на сорбцію трил-сину та його очистку порівняно а несиланіаованиші сорбентами, шр вкавує на те, ш сорбція гідрофільної молекули трипсин^ на метиаьних групах практично відсутня.

Для досягнення максимальної очистки найкращим виявився

ТаСлиіЩ’ З

Результати хроматографії трипсину ("Бр^а") на Сацктрадкнових сорбентах ’

г Сорбент Вміст ліганду, мг/г кількість сортованої речозкни ■ я Питома активність, од./мг М±зп

• Фермент од. акт.1 М±П)

0,1 7,7+0,12 7,0+0,10

1,0 * 35,410,16 23,3+0,30

ВЗ а,а 21,4+0,10- 13,7+0,30

18,7 27,0+0,20 13,8+0,20

0,3 17,0+0,10 8,0+0,15

В6 1.0 18,0+0,15 ' 14,0+0,20

10,0 17,5+0,10 *13,7+0,15

30,0 12,4+0,25 9,0+0,10

0,1 8,4+0,25 14,0+0,30

1,0 13,6+0,10 14,0+0,25

В7 5,а 23,0+0,10 9,8+0,30

10,3 26,9+0,20 9,8+0,10

0,1 7,9±0,30 ‘ *7,0+0,20

1,0 12,6+0,25 8,0+0,25

ВІЇ 8,7 . 14,0±0,25 7,9+0,25

18,7 *2,8±0,10 ' 11,0+0,20

0,1 . 5,0+0,20 8,3+0,10

1.0 17,3+0,20 14,0+0,20

8Є'- 7,0 15,3±0,30 14,5+0,25

12,а 15,3±0,20 10,0+0,20

0,1 9,8+0,10 14,0+0,20

1,0 33,4+0,20 18,2±0,10

ВЗ' 10,0 25,4+0,20 17,8±0,20

23,2 7,4+0,20 8,7+0,20

* Р>0,05

- 14 - .

сорбент ЕЗ а концентрацією ліганду 1 иг/г сорбента, а для стримзння високого екходу фермента - ВЗ ( 1,'Э - 18,7 мг/г ) та ЕЗ' (1,0-10 иг/г ).

Е Хроматографія трипсину ка граміцэдлнових сорбентах

Зв'язування трипсину з граіпццдквовиьаі сорбентам: праетичко не відріеняється від кого сорбції на бацитращш -снлохромах. •

3 ростом концентрації ліганду для сорбентів 01 спостерігається зниження сорбції трипсину від 13 до 4,5 од. питоьа атгкЕність аюаувалгта~від 14 до 9 од./мг (табл. 4).

Таку залеяністі кожна пояснити тим, во підвищення концентрації ліганду при дуне короткому спейсері ( 1 атом вуглецю ) приводить до зниження -його доступності для молекули трипсину.

У'випадку сорбентів БЗ - спостерігаться изхсЕхуи сорбції ( 31 од. ) та хгаксииуи питомої агстивності ( 22 од./иг ) при концентрації ліганду 5,7 ыг/г сорбента. ’ -

Текіш чином, для добування трипсину' найкрзце використовувати граміцидин - силохроші в концентрацію ліганду

5,7 иг/г сорбента та доаяинсш спейсера 3 атоми вуглецс, ■оскільки у цьому випадку відбуваєтеся найбільше вв'язування ферменту з лігандом та досягається його иайкраца очистка. ■

При -вивченні залежності сорбції трипсину на додатково стилізованих сорбентах 61', ВЗ' та (35' виявилося, цо збільшення концентрації -граміцидину приводило до незначного зниження сорбції трипсину у всіх трьох вкладка?:.

Тата х залежність спостерігається і для питомої зїтиб-ності у випадку сорбентів Бі' та 63'. '

На сорбенті Б6' питома активність трипсину після підвищення від 7 ( 0,1 мг/г сорбента ) до 12 од./мг ( 1 иг/г сорбента ) виходила -на плгто і становила 12 од. для концентрацій ліганду від 1 до ЗО иг/т сорбента (табл. 4). Мод-лшп. що таке збілісення гідрофобності поверхні граміцкди-■ноеих сар*ектів приводить до того, . що гідрофільна молекула трипсину не^йоже взаємодіяти г лігандом, який зв'язаний з матрицею спенсером в 1, 3 або 6 атоми вуглеца.

- 15 - ■

З граміцидин - сигахроиіа кайбільа ітридзхнш для виді- . лзннз та очистки трипсину виявися граміцидин - сижохрсм О з концентраціє!) ліганду 5,7 иг/г ссрбента, оскільки на ньому дослгазтася максимальна сорбція та очистка трипсину.

0 Хроматографія гршОілу на бацитрацпн - сзшхромах.

Трокбін - найбільш специфічний а дослідаених ферментів. Подібно до грішсшгу нін гідроліаув зв'язки, утворені кзрбок-сигрупами Ь-Агб і І_-!_уз. Проте, його взаємодія з бацктраци-яовими сорбентами суттєво відрізняється від взаємодії- трипсину з цими д сорбентами. -

При вивченні сорбції трсагбіну на ссрСентач ВЗ виявилося, 50 збільшення концентрації ліганду від 0,1 до 18,7 мг/г сорбента приводило до покращення сорбції тромбіну. від 162^ од.НІН до 2593 од.МІН,, так само зростала і питома активність ферменту ( 1875 - 2100 од.МН/мг ) . .

Дія сорбентів Вв максимальна сорбція ( 2250 од.КІН ) спостерігалася в медах концентрацій ліганду 1 - 10 мг/г сорбента. В цьому діапазоні спостерігалася і максимальна, очистка тромбіну - 2500 од.ЯІН/мг (табл.5).

Концентрація ліганду 1 иг/г сорбента виявилася найбідьп оптимальної) для. добування грокйіну на сорбентах В7. У цій точці сумарна сорбована активність ■ тромбіну дорівнювала 1804 од. МІН, а питома <- 2584 од.їІІН/мг.

Практично такі я результати були адердані на сорбентах. ВИ. Тобто, максимум сорбції та питомої активності спостерігався при концентрації Сацитрацину 1 мг/г сорбента і становив 1799 од.N14 та 2825 од.НІН відповідно.

Іншими словами-, оптимальної концентрації ліганду, яка приводила б до максимальної, очистки ферменту не виявлено і ' тому, моле бути використаний будь-який із запропонованих ба-цитрацнн - силохромів. ‘ .

Залежність сорбції тромбіну від довжини спейсера еив-чали для концентр "'(їй ліганду 1,0 та 10 мг/г сорбента.

Виявилося, що із віддаленням ліганду від матриці, сорбція тромбіну знижується для концентрації Оацктрацину

10 мг/г сорбента. Для концентрації ліганду і мг/г сорбента спостерігається невеликий пік у точці С6, після чога сорб- '

-16-

• . ТаСжця 4

'Результати, хрсшагографії трипсину ("БроГа") на грамі щздизюеих сорбентах

Сорбент Вміст ліганду. иг/г кількість сореовв-ноі речовини 1 ■ Питома активність, од./мг Шт

1 сетент од. акт.* М±ш

0,3 11,0±0,10 11,0±0,10

01 1,0 13,7±0,15 14,0і0,20

3,£ 13,4±0,10 ' 10,8±0,20

■ 5,4 4,5±0,10 9,2±0,10

.0,1 ' ■ 14,2±0,15 21,0*0,10

ВЗ 1,0 25,0±0,20 • • *15,0*0,25

5,7 ■ -21,0*0,10 22,0*0,20

9,2 10,9±0,10 11,6±Р,10

0,1 12,0±0,25 18,0±0,10

131' 1.0 13,5і0,20 . 18,3*0,25

4,2 8,4±0,15 . * 7,0±0;20

6,0 6,4±0,10 11,5*0,20

0,1 17,2±0,25 гі,Б±о,ю

• ВЗ'. 1,0 18,0±0,20 23,В±0,15

3/8 5,5±0,10 11,0±0,15

5,4 5,2*0,10 10,0*0,15

0,1 •- 17,8±0,15 7,7±0,10

. 06' . 1,0 14,0±0,15 12,5+0,10

10,0 І1,0±0,10 іг,о±о,ю

. 30,0 10,6±0,10 • 1£,5*0,10

* Р>0,05

ція ферменту виходить на плато. ’

Питома активність, після невеликого аідзишення для спейсерів СЗ - Сб виходить на плато ая до віддалення ліганду від матриці на 11 атомів вутлецс і становить біля 1800 од.МІН С концентрації бацитрацину 1,0 мг/г ).

Для 10 мг/г сорбента - після незначного зростання спостерігається йлато питомої 'активності для спейсеріз С8 -С7, але при збільшенні відстані мі* лігандом і матрицею до

11 вуглецевих атомів спостерігається погіршення очистки тром-біну. '

Таким чином, для счистки тромбіну краще виксрисгсвува- . ти бацитрацкнові сорбенти з коротким спейсерш, а саме 3 -

б атомів вуглецо.

Різко відрізняється відношення тромбіну до'силанізова-них сорбентів ВЗ*. (табл.5).' На відміну від попередніх'ферментів, трсмбін з додатково сялазізсванкші бацитрациновими сорбентами не взаємодіє. Можливо, причина» цього є тонкі відмінності в просто; овій . структурі тромбіну та трипсину/ або субтилізину. Ці відмінності, імовірно, 5 результатом значно більшого експонування гідрофільних амінокислотних залишків на поверхні молекули тромбіну» що робить неможливим його ваємодіп з сорбентом ВЗ*, який є більш гідрофобним, ніх ВЗ. ... .

7 Хроматографія тромбіну на граміцидин - силохромах

Тромб і н зв’язується з граміцидин - силохршами приблизно у 4 - 6 разів слабше, нід з бацятрациновими сорбентами

Збільшення концентрації- ліганду сорбентів 61 приводи- ' ло до зниження сумарної активності тромбіну. від 420 до 180 од.ыш. Питома активність була максимальною при концентрації ліганду 3,8 мг/г сорбента і становила 391 од. МІН/мг (табл.5).'

На сорбентах (33 спостерігалася прямопропорційна залежність між концентрацією ліганду тз сорбцієп ферменту. Тобто збільшення концентрації граміцидину від од до 9,2 мг/г приводила до покращення сорбції тромбіну від 213

- іе -

до ?ю од.МІН та підвищення -його питомої активності-від 730 до 890 од.КІН/іт. ' ‘

Загалом сорбція тромбіну на додатково оиланівованих граміцидин - силохромах практично не відрізнялася від його зв'язування з необробленими сорбентами. .

На сорбентах Єї* звільнення концентрації ліганду приводило до зниження очистки тромбіну ( 500 - .385 рд.ШН/мг .), црдо загальної сорбції ферменту, то спостерігалося її різке підведення при збільшенні концентрації граміцидину від 4,2 до 6 мг/г сорбента. .

Зниження загальної сорбції тромбіну, а такс* погіршення його очистки з ростом концентрації ліганду від 0,1 до 5,4 мг/г сорбента спостерігалося на граміцидин - силохромах 03’ . Сумарна активність знижувалася від 235 до 38 од.ШН. Питома активність була делр вищос і змінивалася від 780 до 422 од.МШ/мг (тайн.6). ' • ' ' ' •

На сорбентах 06’ різке збільшення концентрації граміцидину від 10 до ЗО мг/г сорбента приводить до росту сорбції тромбіну від 300 до 1250 од.ШН. Питома активність дри цьому знижується від 3000 .до 200 од.ШН/мг. ’ •

Таким чином, не виявлено оптимальної концентрації ліганду гідрофобних граміцидинових сорбентів, дри якій би досягалася .максимально висока сорбція та очистка тромбіну.

Залежність впливу довжини спексера додатково Ьияавіао-ваяих граміцидинових сорбентів на зв'язування тромбіну вивчали для концентрації ліганду 1 мг/г сорбента.

Виявилося, ж> ■ збільшення довжини вуглецевого дднщтга ’ приводить до-росту сорбції тромбіну від 107 до 326 од.КІН.

Така к залежність характерна і для очистки фермента, а саме, збільшення питомої активності від. 621 до 1000 од.ЛІН/мг. Можливо, віддалення ліганду від матриці ■приводить до вшкення впливу додаткової силанівації ( гідрофобної матриці ) на взаємодію ліганду з гідрофільною иавеку-жю тромбіну. Тешу з грамідидшгових сорбентів краще використовувати додатково сил дні заданий ££’.

‘8 .Створення ,діагностичних наборів за основі . ■ очищеного ■ препарату тромбіну дадини 1 .

Табдиця 5

Результати хроматографії грсмбіну'на • бацитращшових сорбентах

Сорбент Вміст ліганду, мг/г • кількість соресаа-воі речовини 1 Питома активність, од.їЛН/мг М±я

1 фермент од. МІН “ М±т

вз 0,1 1,0 3,3 18,7 1В2240.15 1857*0,20 2292+0,18 2В93±0,10 1870+0,10 ■ 2000+0,12. 2190±О,2О 2100±0,10

ве 0,3 1.0 ' 10,0 30,0 1500±0,10 2200±0,15 2250±0,10 1100±0,25 1500±0,15 2бСа±0,20 *2500±0,15 1400±0,10

37 0,1 1,0 5,а 10,3 1444+0,30 . 1804±0,20 • *1135±0,17. 1802+0,13 1200±0,30 256410,20 *187б±0,14 • 2500+0,12

ВИ 0,1 ■■8,7 18,7 850+0,20 1799±0,20 . *1635+0,25 '. 1316±0,30 1206+0,30 2625*0,20 *1Є85±0,20 212В±0,20

В6* 0,1 ■ 1,0 7,0 12,6 Сорбція ‘ ВІД! г/тбя '

вз- 0,1 1,0 10,0 23,2 Сорбція ВІД( ;утня

* Р>0,05

'Таблиця 6

Результати хроматографії трамбіку на граміцидинових сорбентах

Сорбент Вміст ліганду, ШУГ кількість сорбаво-кої рєчовоюі Питома активність, од/мг Шт

* ФЄШЄЕТ ОД. НІН ІІИП '

•о,а 42010,15 68010,10

Єї - 1,0 *216+0,10 *39610,10

--3,8 250+0,20 63110,15

5,4 " 160±0,20 ' 22110,20

0,1 213+0,10 ' 73010,20

•<зз І.о 33510,10 *62110,10

5,7 • 382+0,25 89010,10

9,2 710+0,20 ■ 87210,15

0,1 37510,15 ■ 50010,15

031' 1,0 19710,10 ' 62110,10

4,2 18010,10 . *32510,15

6,0 725+0,15 38510,15

0,1 *23БЮ,20 78010,20

ВЗ’ . 1,0 324+0,10 78810,20

В,8 162+0,20 45010,20

5,4 . * заЮ,20 42210,20

0,1 100010,10 952+0,15

£35' 1,0 32ВЮ.15 ' 100010,15

10,0 *275+0,10 41740,10

ао,о 125010,10 . - 20010,10

* Р> 0,05

З основі методів функціонального зазначення факторів зсідання, інтерес до якій- значно зріс з останні роки, лежить відтворення in vitro процесів ЗСІДЗНБЯ, зо мають М1СЦ9 в плазмі крові, аа допомогою очищених білкових факторів. Для здійснення таких досліджень у діагностичній практиці використовують, поряд з 1НПИМИ, очищенні препарати тромбіну, які з ключовими реактивами при визначенні рівня фібриногену та продуктів його деградації, протрсмб інсвого та тромбінового часу плазми, часу рєкальиифікації і т.п.

Нами Суло розроблено технологів виділення считанного тромбіну людини з використанням сорбенту ВЗ з концентрат єп ліганду і мг/г , ка якому досягалася найвияа. сорбція тромбіну серед усіх вивчених сорбентів. •

Очищений препарат тромбіну стабілізували альбуміном, ліофільно зисуигвали тз використовували для-приготування наборів для аизначення концентрції Фібриногену в плазмі крові, прот-ромбінового, тромбінового та. часу ..рекадьцифікації, вмісту антитромбіну И та ранніх гродукгіз деградації фібрину та розчинних фібрин-мономерних комплексів.

З допомогою створених нами наборів проведена визначення деяких показників зсідання в плазмі 31 хворого, шр мали різні діагнози, а саме, у хворих на гемофілію А і В, гіпертояіп, оперований з приводу аденоми простати,, вагітних жінок, з варикозним розширеним вен, з іпемічною хворобою серця, інсультом, нирковою колькою, ходіциститом, хронічним бронхітом, бронхітом. і т. ч. ■ При цьому визначення показників зсідання у плазмі частини хворих проводилися паралельна: нами - з допо-

могою розроблених у даному дослідженні наборів реактивів, та співробітниками консультативної гематологічної поліклініки Львівського філіалу КНДІ ГПК - з допомогою комерційних реактивів та наборів. Виявилося-, щр створені наді набори дають хорошу відтворюваність ■ результатів .(35*), з також відповідність отриманих результатів іншим діагностичним показникам.

Очікується, ас впровадження таких наборів у практичну роботу діагностичних лабораторій України значно розширить можливості діагностики та лікування різних грсмОо-емболічяих га онкологічних захворювань, по. в свою чергу, допоможе скоротити кількість летальних випадків внаслідок тромбо-ембслій

та глонкісшк новоутворень. •

Результати дослідження можуть бути використанні прк створенні іникх діагностичних наборів, до складу яких повинні входити препараті; очищеного фібриногену і тромбіну, наприклад, для визначення трансглутамінагк (фактор ХШ) , абс при створенні так званих біологічних клеїв (на основі очищеного тромбіну і фібриноген'/).

ВИСНОВКИ -

1. Вперше проведено систематичне вивчення нових бацит-рздан - та граміцидин - вмісних сорбентів ( всього 44 зраг-кк ' в рівнок концентрацією .ліганду '( 0,1 ; ЗО мг/г ) та р’ 5Н0Е довхіяою спейсера ( від 1 до 11 атомів вуглецо ) по їх здатності вв'язувати субтклізин,' трипсин та тромбін.

2. Встановлено,що найкрада сорбція субтилізину спостерігається на на сорбентах з високою концентрацією ліганду

( біля" 20 нг/г сорбента ) та довжинов спейсера 6 вуглецевих атоми, трипсину на сорбенті з концентрацією ліганду 1 мг/г сорбента та довжиною спейсера 3 атоми вугленр, тромбіну на сорбентах з концентрацією ліганду 1 мг/г сорбента та спейсе-ром довжиною 3-5 атомів вуглецю. .

■ £. Виявилося, по додаткова силанігацік бацитрацик - ск-

лохромів покрацує сорбцію та очистку субтилізину, практично не впливає на добування трипсину і робить неможливо® сорбцію тромбіну. Податкова силанізація граміцидин - силохроміь практично не' впливає на-сорбцію субтилізину, дещо логіршує сорбцію трипсину та тромбіну*. 1

4. Вивчені сорбенти дозволили отримати очииені' препарати тромбі^ двдини з питомою активністю ■2000 -2500 сд.КІН/мг білка, які ггрилагні для використання в лабораторіях клінічної діагностики. На основі очищеного препарату тромбіну людини створено діагностичні набори для тестування всідаючої системи іфові, які вияв::ли хорошу відтворювані сть та 5 зручними в користуванні.

Основний зміст роботи викладено в слідуючи?: публікаціях:

1. Гайда А.В., Срицеяко Н.З., Гайда Г.З., Вус М..М., Лс-гінська З.В. Виділення очищеного препарату трсмбіну та створення діагностчних наборіз на його основі // Міжнароднім науковий журнал "Вісник наукових досліджень".Тернопіль:- 1934-. N2.- С.20-31.

2. Гайда А.В., Оришенко Н.В. Очистка прстекназ на бацат-

гзшш-силохромах * с различной концентрацией лиганда и длиной спейсера // Прикладная биохимия и микробиология.- 1997.-N4.- С. 15-23.- -

3. Гайда А.В., Орщенко Н.В., Логинская 3.3., Вус М.М.,

Гайда Г.З. Диагностические препараты и наборы для изучения системы свертывания крсал У/ (Дат. Всерос. конф. (11-ой) посз. патологии гэмокоагуляции (тромбозы, геморраргии. ЛЕС - ссвре-менное состояние проблемы), !.Юсква, 3-8 дек. 1Э95.-М.: Б.и., 1935.- С.52-53. . ■ . '

4. Дзісь Є. I., Гайда А.В;, Бернар О.В., ЕовкГ.П., Срп--

щенко Н.В., Логінська З.В., Гайда Г.З. Особливості стану системи. зсідання ■ крові т_ фібринолізу в дітей з гострсв лидїоб-ластноо лейкемієв з умовах сучасного лікування /.' Мат. конф. присв. 25-річчю лікарні ивидкої медичної допомоги, Львів 23 грудня 1997.--Л.': Б.а., 1997.- С. 42-43. '

5. Орищенхо Н.В. Очистка тромбіну на бацитрзцин- та гра-

міцидин- .сішзхромах, шр відрізняються концентрацією ліганду та довлшвоп спейсера // Мат. І Західноукраїнського симпозіум-/

з адсорбції та хроматографії, Львів 12-15 травня 1997.- Л:. Б.В., 1997.- П. Е8-42. -

3. ОрищенкоН.В., Гайда А.В. Очистка тромбіну людини на бацитрацинових сорбентах - вплив структури поверхневого зару та концентрації ліганду // Тез. доп. III Укр. з'їзду гематологів і трансфузіологів.- Суш, 23-25 травня 1995.- К:

Б.в.- 1995.- С. 152. • • '

7. Гайда А.В., Монастирський В.А., ОрищенкоН.В., Логінська З.В. Набери реактивів для.визначення основних показників зсідання // Там же.- С. 35. .

9. Гайда А.В., Орикенко Н.З., Фадеев А.Ю., Кйшгалев П.Г. Различное хроматографическое поведение тромбина и трип-сота на бацитрациновых ссрбэнтах // П-й Симп. Химия протео-лит. ферментов. -Тез. докл. М: В.и.- 1993.- С.43.

G. toftnsks 2.Gayda A., Qayda S., Oryshcnenko’ K.

. Thrombin £• Antithranbin III purification on 'heparin-modified soroents /7 40th Annual Meeting of the GTH (Sesellschaft fur throroose-uno Harastaseforschung) 14-17 Februar 1995, Interlaken, Schweiz.- Ann. Hematol.- 1996.-"72,-Suppl.l.- P.

Д£,-' ,

ID. Gaida A., Gaida G., Vous k‘.., Oryshchenko N.., Loginska Z., Vovk G. Kew applications of stapnylococcal clamping test; express-diagnostic of oncological and connective tissue diseases // XII th meeting of the informational Society of Haematology (European and African division). Septembei 3-S.-1995, Istanbul, Turkiye.- P. 25.

SUMARY .

Orishtchenko l.’.Y. Surface structure and ligand concentration influence of- modified silica sorbents on proteinases sorption (manuskript). .

Thesis for a master's degree in biology in speciality 03.00.04 - biochemistry,Institute for research in animal physiology and biochemistry, Lviv,1997.

The subtilisiri, bovine "trypsin and human thrombin sorption an new silica based bacitracin and 'gramicidin ■ sorbents with different .ligand's concentrations and spacer's lengths were studied. Optimal conditions for purification of this proteinases were developed.

The quantitative isolation of thrombin was fulfilled and the kits for testing1 of hesostase factors based on the human highly purified thrombin, fibrinogen and salt solutions were composed. This diagnostic kits - for determination of recaloifioation time, prothrombin and throrbin time, concentration of fibrinogen and fibrin'fibnnogsn degradation products and soluble fibrin-moncaner .complexes - were used for testing more than 60 blood samples of donors -and patients. It -was ^-.shown that diagnostic kits are high effective and informative and- may be useful in coagulative hemostasis investigation.'

-Е5-

РЕЗШЕ

Орищенко Н.В..Влияние поверхностной структуры лиганда и длины спейсера модифицированных кремнеземных сорбентов на сорб--цив. протеиназ (рукопись). .

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия* Львовский институт физиологии и биохимии животных, Львов, 1997.

Изучали закономерности - сорбции субтилизина, трипсина крупного рогатого скота и тромбина человека на новых бацитра-цин- к грзмшдаяин-сшгахрсмах, которые отличались концентрацией лиганда и длиной спейсера. Подобрали оптимальные условия для очистки этж протейная.

Было проведено количественное выделение тромбина. Из полученных нами тромбина, фибриногена • и растворов солей скомплектованы наборы для изучения факторов гемостаза. С по- . урщмз наборов для определения протрсмОинового. тромбинового времени и времени регеддъцификации, концентрации фибриногена, ранних продуктов деградация фибрин аУ фибриногена и раствор:шых фибрин-мономерных комплексов.было протестировано Оолее ВО образцов крови доноров и пациентов. Было показана, что наборы является высокоинфорыагивными для диагностики нарушений системы гемостаза. '

Ключові слова: громбін, трипсин, субтидізга, афінна хроматографія, спейсер, ліганд. .