Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние полного голодания на некоторые биохимические и иммунологические показатели у сенсибилизированных крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние полного голодания на некоторые биохимические и иммунологические показатели у сенсибилизированных крыс"

?Г5 ОД

о / поп шз

Российская Академия Медицинских Наук Институт питания

На правах рукописи УДК 612.391: 577.1: 616-05.3

КСЩРАШОВ СЕРГЕЯ ЮРЬЕВИЧ

Влияние полного голодания на некоторые биохимические и иммунологические показатели у сенсибилизированных крыс.

03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертационной работы на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в Институте питания Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук В. К Мазо.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук И. Е Марокко.

доктор медицинских наук К. А. Коровников.

Ведущая организация - Российский Государственный Медицинский Университет

Зашита состоится '¿.О^^^р^ 1993 года в " "часов на заседании специализированного совета Д 001.02.01 при Институте питания РАМН (109240,Москва,Устьинский проезд,2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН.

Автореферат разослан "2 " ИОЯЬр\ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета,кандидат медицинских наук

Жминченко К М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Принципиальная возможность повышать устойчивость организма к аллергизирующим воздействиям с помощью алиментарного фактора показана в исследованиях,выполненных . в кашей стране и за рубежом (Марокко И.Е и др. 1990,Chandra R. et al. 1983).

Как показывает клиническая практика .применение режимов полного голодания позволяет в ряде случаев повысить эффективность лечения некоторых аллергических состояний ( Григорьян 0. Н. и др. 1988, Кокосов А. Е 1986). При проведении лечебного голодания у больных аллергией отмечается положительная динамика клинико-био-химических,иммунологических и функциональных показателей (Король О. И. 1978, Fahrner H. 1985, Kerndt P. R. et al. 1982).

Научное обоснование применения метода разгрузочно-диетической терапии при лечении и профилактике ряда аллергических состояний предполагает наряду с клиническими наблюдениями проведение экспериментальных исследований,направленных на изучение различных аспектов воздействия голодания на организм лабораторных животных. Для объяснения положительного эффекта голодания в клинических условиях и эксперименте в научной литературе приводятся данные об ускоренной элиминации антигенов (Немцов Е И. 1978) и угнетении выработки антител (Михайлов JL А. 1992 , Nohr C.V. et. al. 1985), Однако эти данные весьма немногочисленны и недостаточны для понимания механизма терапевтического эффекта лечебного голодания.

В этой связи представлялось целесообразным изучить влияние полного голодания на протекание патохимической стадии аллергической реакции,которая,в свою очередь,в значительной степени определяется состоянием клеток-мишеней аллергии первого порядка - тучными клетками (ТК) и базофилами (Гущин И.О. и др. 1976,1987). При IgE-опосредованном ответе на антигенное воздействие эти клетки участвуют в секреции биогенных аминов и,следовательно,определяют степень выраженности клинических проявлений аллергии (Йегер Л. 1986). Отмечается,что различные пищевые факторы способны изменять функциональную активность ТК в условиях in vivo и in vitro (Калинина M. С. 1968, Rose Л. et al. 1978, Sullivan M. J. et al. 1976).однако,сведения о воздействии полного голодания на ТК в

- г -

доступной литературе практически отсутствуют. Вместе с тем,ряд фактов,установленных в исследованиях in vitro,таких как зависимость секреции медиаторов ТК от уровня АТФ в клетках (Johansseп T. et al. 1975) .присутствия глюкозы (Diamant В. et al. 1974),соотношения уровней цАМФ/цГМФ (Проценко R А. и др. 1987).предполагает возможность ингибирования функциональной активности ТК в условиях полного голодания с характерными для него метаболическими и гормональными перестройками организма (Васильева Е.Д. 1977,Levenson S. M. et al. 1982).

С учётом роли ТК в проявлении реакций гиперчувствительности целью данного экспериментального исследования явилось изучение влияния полного голодания на выраженность реакций анафилаксии и функциональное состояние ТК у крыс.

Выбор крыс при изучении действия голодания на сенсибилизированный организм был связан с тем обстоятельством, что при характеристике патохимической стадии аллергической реакции немедленного типа в условиях in vitro наиболее удобным объектом изучения являются ТК,выделяемые из брюшной и плевральной полостей крысы (Паркер Ч.В.- 1989, Sullivan M. J. et al. 1976).

В соответствии с поставленной целью были определены следующие основные задачи исследования:

1. Исследовать влияние различных режимов полного голодания на проявления системной анафилаксии у крыс.

2. Оценить функциональную активность ТК у нормальных и сенсибилизированных крыс при голоданий.

3. Изучить влияние полного голодания на уровень специфических антител,циркулирующих в крови и связанных с ТК крыс.

Научная новизна

Получено экспериментальное доказательство снижения тяжести проявлений системной анафилаксии у крыс в условиях полного голодания. Установлен факт снижения величины антиген-зависимой секреции гистамина ТК крыс при различных режимах полного голодания, отмечаемый параллельно уменьшению тяжести проявлений системной анафилаксии. Получены данные о содержании АТФ в ТК крыс в условиях голодания и последующего питания. У крыс,сенсибилизированных модельным белковым антигеном - овальбумином,проведены параллельные исследования влияния голодания на содержание антител к этому белку в крови и количество антител,связанных с перитонеальными ТК.

Практическая значимость работы.

Полученные экспериментальные данные о снижении показателей аллергической реактивности организма (ослабление тяжести проявлений системной анафилаксии,уменьшение антиген-зависимой секреции гистамина ТК) при полном голодании могут быть использованы для патогенетического обоснования применения метода разгрузочно-дие-тической терапии больных аллергий. Представленные результаты позволяют рекомендовать применение теста определения антиген-зависимой секреции гистамина 1К крыс при экспериментальной оценке гипо-аллергенного действия различных факторов питания и рационов.

Эффективность схемы полного голодания с последующим переводом животных ка обычное питание позволяет использовать её в качестве экспериментальной модели для оценки специализированных ги-поаллергенных продуктов,предназначенных для "восстановительного" питания.

Апробация диссертационного материала.

Результаты исследований докладывались на конференциях молодых учёных и специалистов Института питания РАМН,проведённых в октябре 1990 года и в апреле 1992 года.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ.

Структура диссертации и ее объём.

Диссертация состоит из введения , обзора литературы,описания материалов и методов исследования,изложения полученных результатов и их обсуждения,заключения,выводов и списка цитируемой литературы, содержащей т. источников,из них ж на русском и на иностранных языках.

Диссертация изложена на страницах,включая 12 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследованиях использовали крыс-самцов Вистар массой 200-250 г и 250-300 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария с использованием натуральных кормов и свободного доступа к воде.

Модель воспроизведения системной анафилаксии у крыс.

В качестве аллергена использовали модельный пищевой белок -куриный.оваль бумин (ОВА).

Сенсибилизацию животных вызывали введением 20 мкг ОВД в 0,5 мл физиологического раствора,содержащего 2x10""^микробных тел коклюшной вакцины в качестве адъюванта,подкожно в область шеи согласно методу (Gushchin I.S. et al. 1989). В зависимости от целей эксперимента сенсибилизацию проводили однократно или двукратно (1-й и 5-й дни эксперимента или 1-й и 14-й дни эксперимента). Анафилаксию у крыс вызывали внутривенным введением (в хвостовую вену) 20 мг ОВД а 0,5 и физиологического раствора на 14,18 или 21 день экспериментов, соответственно.

Для оценки выраженности проявлений активного анафилактического шока (ААШ) использовали метод (Weigle V.О. et al. 1960) в нашей модификации. Тяжесть системной анафилаксии у животных выражали в баллах в соответствии со следующей шкалой: отсутствие видимых изменений - 0 баллов; одышка,взъерошенная шерсть - 1 балл; выраженная одышка, цианоз,отёк конечностей, заторможенность - 2 балла; прострация,обездвиженность - 3 балла; смертельный исход -4 балла.

На основании полученных данных строили частотные гистограммы распределения проявлений анафилаксии (в баллах) в соответствии с количеством животных по группам,а также определяли величину анафилактического индекса - усреднённого показателя группы (в баллах).

Методы исследования тучных клеток крыс.

По стандартной методике (Fredholm В. В. et al. 1976) получали клеточную взвесь из брюшной и плевральной полостей крыс. Подсчёт количества ТК проводили в камере Горяева при окрашивании нейтральным красным. Продолжительность работы в условиях in vitro с ТК не превышала 3-4 часов. Жизнеспособность ТК при хранении их при 20° С в течение 4 часов поставляла не менее 92% (суправиталь-ное окрашивание этидий бромидом (Добрецов Г. Е. 1989).

Постановку реакции секреции гистамина ТК осуществляли согласно методу (Fredholm В.В. et а1.19?6). В качестве стимуляторов секреции использовали вещество 48/80 в концентрации 1 мкг/мл у интактных животных или специфический антиген - ОВД в концентрации 200 мкг/мл у сенсибилизированных животных.

Количественное определение гистамина в пробах проводили спектрофлуориметрическим методом (Shore P. A. et al. 1953) с использованием ортофталевого альдегида. Образцы флуориметрировали при Двозб. =388 нм и Дисп. =486 нм на спектрофлуориметре Hitachi

MPF 2k (Япония). Величину секреции гистамина выражали в процентах к его общему содержанию в ТК с учётом величины спонтанной секреции (без действия стимулятора). Содержание гистамина в ТК рассчитывали на основании величин содержания гистамина в пробе и концентрации в ней ТК

Выделение ТК из клеточной взвеси,полученной из брюшной ' и плевральной полостей крысы,проводили центрифугированием в градиенте плотности, фикола (Fredholm В. В. et al. 1976). После процедуры выделения клеточная суспензия содержала не менее 90 7. ТК с незначительной примесью лейкоцитов. Жизнеспособность ТК в таких образцах составляла не менее 92

Содержание АТФ в перитонеальных и плевральных ТК определяли в очищенных препаратах (не менее 90% ТК) биолюминесцентным методом согласно работе (Бровко JL Ю. и др. 1991). При определении АТФ использовался биолюминесцентный АТФ-реагент "Иммолюм" на основе иммобилизованной люциферазы светляков. Количественное содержание АТФ в клетках выражали в пмоль/105 ТК.

Определение антител против ОБА,связанных с перитонеальными ТК сенсибилизированных крыс, проводили,осуществляя предварительную диссоциацию антител с поверхности ТК в кислой среде согласно исследованию (Van Toorenenbergen А. V. et al. 1983). Антитела против ОБА определяли методом аффинной хроматографии на микроколонках (150 мкл) с иммобилизованным на агарозе ОБА с последующим спектрофлуориметрическим определением связавшегося на иммуносор-бенте белка с использованием флуорескамина. Содержание связанных с ТК антител против ОВА выражали в мкг белка в пересчёте на Ю*5" ТК. Из-за низкого содержания антител в индивидуальных пробах через иммуносорбенг пропускали объединённые образцы от трёх животных, что к сожалению не позволило провести индивидуальный корреляционный анализ между уровнем свободно циркулирующих специфических антител и количеством антител на ТК

Определение уровня антител против овальбумина в сыворотке крови сенсибилиз ированных крыс.

Общий уровень антител к овальбумину определяли методом аффинной хроматографии на колонках с ОВА-агарозой,описанным ранее. IgG-антитела против ОВА в сыворотке крови крыс определяли непрямым твердофазным ИФА с использованием вторичных антител кролика против IgG крысы,конъюгированных с пероксидазой. Содержание антител выражали в мкг/мл сыворотки крови.

Экспериментальное воспроизведение различных схем полного голодания ^ интактных и сенсибилизированных крыс.

Исследования влияния полного голодания на проявления системной анафилаксии и состояния ТК проводили с использованием трёх схем экспериментов,в которых воздействие голодания проявлялось на различных стадиях сенсибилизации организма (в начальный период сенсибилизации - схема 1; непосредственно перед введением разрешающей дозы аллергена - схема 2; в середине периода сенсибилизации с последующим периодом нормального питания - схема 3).

Е экспериментах с использованием I схемы сенсибилизация проводилась однократно и одновременно с ней начиналось голодание. В последующем животные переводились на общевиварный рацион. На 14 день эксперимента исследовали выраженность проявлений ААШ, состояние ТК,забирали кровь для определения уровня антител против ОБА.

Согласно схеме 2 сенсибилизация проводилась двукратно (для усиления иммунного ответа) на 1-й и 14-й дни эксперимента. Воспроизведение ААШ, изучение состояния ТК и антительного ответа проводили на 21-й день эксперимента. Период голодания непосредственно предшествовал разрешению и проводился с 17 по 20-й дни эксперимента.

По схеме 3 сенсибилизация была двукратной (1-й и 5-й дни эксперимента) ,а изучение выраженности ААШ и секреторного ответа ТК проводилось на 18-й день эксперимента С 8 по 11 дни включительно животные голодали,а с 12 дня переводились на общевиварный рацион.

Животные опытных и контрольных групп до начала проведения экспериментов содержались на стандартном рационе вивария не менее 14 дней. Во время проведения голодания крыс полностью лишали пищи и помещали в отдельные клетки. Доступ к воде не ограничивали. Продолжительность голодания во всех экспериментах с сенсибилизированными крысами составляла 4 суток. Животные контрольных групп в течение всех экспериментов содержались на стандартном рационе вивария.

Также количественно определяли антитела против ОБА,связанные с ТК.у сенсибилизированных крыс после 4-суточного голодания. При этом для усиления антительного ответе сенсибилизация проводилась трёхкратно на 1-й, 14-й и 21-й дни эксперимента. Выделение ТК осуществлялось на 28-й день. Период голодания непосредственно предшествовал выделению клеток и проводился с 24 по 27 дни эксперимента.

В отдельной серии экспериментов проведены исследования содержания гистамина и АТФ в ТК,а также секреции гистамина ТК под действием вещества 48/80 у интактных (несенсибилизированных) крыс после 2- и 4-суточного голодания.

Статистичес[сая обработка экспериментальных данных проводилась с использованием критерия Стьюдента, а также непараметрических критериев Еилкоксона,К&нна-Уитни,метода углового преобразования £ишера,критерия медианы; проводилась оценка коэффициентов вариации (Гублер Е. Е 1978, Зайцев Г. Н. 1984, Пэллард Д. 1982).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Влияние полного голодания на некоторые биохимические

показатели функциональной активности тучных клеток интактных

крыс..

В таблице 1 суммированы результаты исследований воздействия двух сроков полного голодания на ГК интактных крыс,т.е. в отсутствии антигенного воздействия на организм. Продолжительность голодания составляла 48 и 96 часов. При этом средние потери массы тела животных составили соответственно 12 % и 18

Результаты исследований показывают,что у крыс,голодавших в течение 96 часов,отмечается снижение общего содержания ТК в брюшной полости по сравнению с животными,содержавшимися в условиях общевиварного рациона.

Уровень гистамина в ТК из объединённой клеточной взвеси брюшной и плевральной полостей для крыс контрольной группы (табл.1) составил величину, соответствущую данным,описанным в литературе иоЬапзБеп Т. еЬ а1,1975). У животных опытных групп после полного голодания в течение 48 или 96 часов величина содержания гистамина в ТК достоверно не ^отличалась от контрольных значений. Таким образом,голодание в течение 2 и 4 суток существенно не влияло на содержание гистамина в ТК крыс.

Полученные результаты и данные литературы (Гекате! А. Ь. а1,1989, Уап ТоогепепЬеге&п А,еЬ а1,1983) свидетельствуют об относительной стабильности уровня гистамина в ТК грызунов при полном голодании,состоянии белковой недостаточности,а также при сенсибилизации организма.

Под действием Еещества 48/80 секреция гистамина из ТК у животных контрольной группы была относительно высока,что наиболее вероятно связано с особенностями выделения клеток и постановкой

Таблица 1. Влияние полного голодания на некоторые биохимические показатели перитонеальных и плевральных тучных клеток крыс.

Показатель : Контрольная : Голодание : Голодание

группа, общеви-: 48 часов : 96 часов

варный рацион : :

Количество ТК,выде-: 4,8±0,7х105 : - - : 3,0±0,4х105

ляемых из брюшной : N=15 : : N=14

полости : : : Р<0,05

Содержание гисга- : 19,6±1,0 19,8±0,9 : 21,4±0,7

мина в ТК : N=12 N=12 : N=12

(мкг/106 ТК) N.S. : N. S.

Секреция гистамина : 83,6±0,5 : 82,2±1,2 : 80,7±1,4

под действием ве- : N=12 N=12 N=12

шества 48/80 (X от : N. S. : 0,05<Р<0,1

общего содержания в: : :

ТК : : :

Содержание АТФ в ТК: 0,295±0,018 : 0Л38±0,017 : 0,151±0,024

(пмоль/10 3 ТК) : N=12 N=12 : N=12

: : Р<0,001 : Р<0,001

эксперимента. У крыс,голодавших в течение 48 часов,секреция гис-тамина достоверно не отличалась от контрольных значений. При продолжении голодания до 96 часов наблюдалась определённая тенденция к снижению (0,05<Р<0,1) уровня стимулированной веществом 48/80 секреции гистамина ТК.

Среднее содержание АТФ в ТК животных,находившихся на общеви-варном рационе, составило величину несколько меньшую (см. таблицу), чем значения,приводящиеся в литературе иоЬагшБеп Т. е1 а1. ,1990) .что,по всей видимости, связано с особенностями постановки наших экспериментов (при выделении ТК использовался градиент плотности фиколла.а не ЧСА; для обнаружения эффекта голодания во всех клеточных средах,используемых при выделении и очистке ТК, отсутствовала глюкоза). Лишение крыс пищи в течение 48 часов сопровождалось более,чем двукратным снижением уровня АТФ в ТК (Р<0,001). При продолжении голодания у животных до 96 часов данный показатель достоверно не изменялся (по сравнению с 48-часовым голоданием).

Таким образом,в настоящем разделе работы было установлено, что функциональная активность ТК крыс,оцениваемая с помощью либерагора гистамина - вещества 48/80,существенно не изменялась после 48 часов полного голодания. При продолжении голодания до 96 часов отмечалась тенденция к снижению секреторной активности ТК С другой стороны было показано,что после 48-96 часов голодания наблюдалось снижение знергообеслеченности изолированных ТК крыс, выражавшееся в высокодостоверном уменьшении содержания в них АТФ.

В отдельной серии экспериментов дополнительно было изучено влияние голодания и последующего восстановления на содержание АТФ в изолированных ТК крыс. Продолжительность голодания составила 4 суток, затем в течение б суток крысы содержались на рационе вивария.

В условиях нормального кормления средняя величина уровня АТФ в изолированных перитонеальных ТК составила 0,68±0,09 пмоль/103ТК (N=7). При лишении животных пищи в течение 4 суток с последующим 6-дневным периодом нормального питания содержание АТФ в изолированных ТК достоверно не отличалось'от контрольных значений,при зтом средний уровень АТФ составил 0,5б£0,07 пмоль/Ю'ТК (N=7).

Таким образом,полученные результаты показали,что восстановительный период нормального питания продолжительностью 6 дней после 4-суточного полного голодания достаточен для нормализации

- 10 -

уровня АТФ в перитонеальных ТК крыс.

2.2. Влияние голодания на гуморальный иммунный ответ крыс,сенсибилизированных овальбумином.

В данном разделе представлены результаты определения уровня антител к ОВА в сыворотке крови и на перитонеальных ТК сенсибилизированных крыс,содержавшихся в условиях нормального питания и после 4-суточного голодания.

Сенсибилизация животных проводилась трёхкратно (1,14 и 21 дни),а антитела к ОВА определялись на 28 день эксперимента 4-су-точное голодание проводилось непосредственно перед взятием крови и выделением ТК.

Определение уровня антител к ОВА в сыворотке крови,характеризующего сенсибилизацию организма,было осуществлено двумя различными способами.

При использовании метода аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованным на агарозе ОБА с последующим спектрофлуориметрическим определением связавшегося белка (антител).средняя величина уровня антител против ОВА в сыворотке крови крыс,содержавшихся на общевиварном рационе составила 218±34 мкг/мл (N=15). При лишении животных пищи в течение 4 суток этот показатель несколько снижался и составил 185±21 (N=12). Однако,наблюдаемое уменьшение не было статистически значимым,а индивидуальные колебания были весьма существенными.

При проведении ИФА уровень Геб-антител к ОВА в сыворотке крови крыс,содержавшихся на общевиварном рационе,составил 2б2±17 мкг/мл (N-15),что несколько выше значений,определяемых методом аффинной хроматографии. После 4-суточного голодания содержание антител к ОВА в сыворотке крови животных составило 199±15 мкг/мл (N=12). Данное снижение было статистически достоверным (Р<0,05).

Таким образом,в условиях 4-суточного полного голодания у крыс,сенсибилизированных ОВА,отмечается снижение уровня ^-антител против ОВА в сыворотке крови,что согласуется результатам исследования (Михайлов Л. А. 1992).

Для характеристики процесса сенсибилизации клеток-мишеней аллергии в условиях нормального питания и при голодании было проведено количественное определение специфических антител, связанных с перитонеальными ТК крыс, сенсибилизированных ОВА.

У животных контрольной группы уровень антител к ОВА,связан-

ных с перитонеальными ТК крыс,значительно варьировал в диапазоне от О до 6,5 мкг/10 ТК. Средняя величина уровня антител на ТК составила 2,2110,64- мкг/105ТК (N=10)*. В условиях 4-суточного полного голодания в опытной группе животных было отмечено высокодостоверное увеличение (Р<0,01) уровня специфических антител к ОМ на ТК. Средняя величина при этом составила 6,52±0,75 мкг/105" ТК (N=10),что в 2,9 раза выше контрольных значений. Полученный результат явился в достаточной мере неожиданным.

В связи с обнаруженным ранее уменьшением количества выделяемых из брюшной полости ТК в условиях голодания (см. таблицу 1) одним из возможных объяснений увеличения количества антител к ОБА на перитонеальных ТК крыс при голодании представляется дополнительное связывание этих антител в условиях снижения общего содержания ТК в брюшной полости.

Полученные результаты свидетельствуют о разнонаправленных сдвигах гуморального иммунного ответа в сыворотке крови и на перитонеальных ТК клетках крыс в условиях 4-суточного голодания: на фоне снижения содержания IgG-антител против ОВА в сыворотке крови сенсибилизированных крыс общий уровень антител против ОВА,связанных с перитонеальными ТК,значительно возрастает.

2.3. Влияние полного голодания,проводимого на различных этапах сенсибилизации крыс,на показатели анафилактической чувствительности и секреторной активности тучных клеток. Исходя из дачных литературы о противоаллергическом действии режимов полного голодания (Горынь М. А. 1979, Кокосов А. Е 1986).указаниях на возможность угнетения антиген-зависимой секреции медиаторов аллергии из ТК при некоторых экспериментальных состояниях,моделирующих действие голодания (Проценко 3. А. и др. 1987, Johanssen Т. et al. 1975), а также собственных данных об уменьшении секреторной активности ТК у интактных крыс при голодании, представленных ранее,были проведены исследования влияния голодания на показатели аллергической реактивности у крыс в условиях сенсибилизации организма.

Воздействие голодания оценивалоср в трёх различных .схемах экспериментов. Продолжительность периода голодания во всех иссле-. дованиях составила 4 суток,а потери массы тела крыс не превышали во всех случаях 20% от исходной.

В качестве основного параметра изучалась антиген-зависимая

секреция гистамина ТК в условиях in vitro,характеризующая патохи-мичеекую фазу аллергической реакции немедленного типа (Гущин И. С. и др. 1987). Параллельно этому во всех экспериментах была проведена оценка выраженности проявлений ААШ у животных в условиях in vivo,как интегрального показателя аллергической реактивности организма (Адо А. Д. 1978).

2.3.1. Изменение выраженности проявлений анафилаксии и антиген-зависимой секреции гистамина тучными клетками при проведении голодания в начальный период сенсибилизации. В соответствии со схемой 1,описанной ранее,в данном разделе было изучено воздействие голодания на самые начальные этапы продуктивной фазы иммуногенеза.

Перевод животных на общевиварный рацион после 4-суточного голодания сопровождался быстрым приростом массы. На 14-й день зк-сперимекта (на момент разрешения) вес крыс опытной и контрольной групп практически не различался.

Результаты оценки проявлений ААШ у животных двух групп представлены на рисунке Л. В контрольной группе на 14-й день сенсибилизации были выявлены крысы как с высокой,так и с низкой реакцией на введение разрешающей дозы аллергена: в 25% случаев наблюдались летальные исходы,а у 20% животных видимые проявления анафилаксии отсутствовали. Анафилактический индекс (усреднённый балл) для контрольной группы (N=20) составил величину 2,1.

Лишение крыс пищи в течение 4 суток,начиная с момента сенсибилизации, с последующим переходом к общевиварному кормлению сопровождалось статистически достоверным (Р<0,025) снижением тяжести проявлений ААШ. 3 опытной группе анафилактический индекс почти двукратно снизился и составил величину 1,1 (N=20). Число животных, погибших от ААШ,в этой группе составило только 5% от общего количества по сравнению с 25Z в контроле. С другой стороны количество животных,не прореагировавших на введение разрешающей дозы аллергена (ОБА),было в 2,5 раза выше ,чем в контроле и составило 50% от общего числа

Стимулированная ОВА секреция гистамина ТК крыс,находившихся на общевиварном рационе,значительно варьировала (рисунок 1),что по-видимому связано с различной индивидуальной чувствительностью животных к применённому способу сенсибилизации. Средняя величина секреции гистамина в контрольной группе составила 9,53±2,81% от его общего количества в ТК

Рисунок 1. Влияние голодания,проводимого в начальный период сенсибилизации, на показатели анафилактической чувствительности крыс.

АКТИВНЫЙ АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ШОК

§ о

5040 30 20 10

КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА (N=20)

Шт ■

фШй 111

ОПЫТНАЯ ГРУППА (N=20) |(Р<0,025)

ШтФШшШят

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

Тяжесть проявлений анафилаксии (баллы)

<5 «

э «

Е-1 (Я

ё I

Й1 й ы о

о.

а> р=с о о

о §

о о

н о

25] 20 15 10 5

I 0-1

АНТИГЕН-ЗАВИСИМАЯ (АНАФИЛАКТИЧЕСКАЯ) СЕКРЕЦИЯ ГИСТАМИНА ТУЧНЫМИ КЛЕТКАМИ

Я

■

/

4-суточное голодание в начальный период сенсибилизации сопровождалось статистически достоверным снижением (Р<0,05) величины ОБА-зависимой секреции гистамина ТК. Ери этом средний показатель секреции гистамина в опытной группе снижался более чем в 4 раза по сравнению с контрольной величиной и составил значение 2,31 ±1,01.

Таким образом, у крыс,которые лишались пищи в течение 4 суток в начальный период сенсибилизации,в последующем отмечалось снижение тяжести анафилактических проявлений в ответ на введение разрешающей дозы антигена (ОНА),что согласуется с данными исследования (Михайлов Л. А. 1992),выполненного на морских свинках.

Обнаруженное снижение величины антиген-зависимой секреции гистамина ТК крыс,голодавших в течение 4 суток в начале периода сенсибилизации, является доказательством воздействия голодания на состояние клеток-мишеней аллергической реакции путем ингибирова-ния процессов секреции медиаторов аллергии.

2.3. 2. Исследование выраженности проявлений анафилаксии и секреции гистамина тучными клетками в условиях полного голодания, проводимого перед введением разрешающей дозы антигена.

В соответствии со схемой 2 период лишения животных пищи непосредственно предшествовал введению разрешающей дозы антигена При этом были изучены эффекты голодания,проявляющиеся преимущественно в эффекторной фазе иммуногенеза. Для усиления иммунного ответа сенсибилизация животных проводилась двукратно.

На рисунке 2 представлены результаты оценки тяжести проявлений ААШ в двух группах животных. При двукратной сенсибилизации ОБА тяжесть ААШ у крыс контрольной группы была достаточно высока. У 54% животных были выявлены сублетальные к летальные проявления ААШ (3 и 4 балла). При этом в 100% случаев наблюдались хотя бы минимальные (1 балл) проявления анафилаксии. - Анафилактический индекс для контрольной группы составил величину 2,69 (N=13).

Лишение животных пищи в течение 4 суток перед введением разрешающей дозы антигена сопровождалось статистически достоверным (?<0,01) снижением выраженности ААШ. Доля животных с летальными исходами анафилаксии (4 балла),составлявшая в контрольной группе 23,1%,уменьшилась в опытной группе до 9,1%. Особого внимания заслуживает тот факт,что у голодавших крыс в 36,4% случаев видимые провления анафилаксии вообще отсутствовали (0 баллов). Средний

Рисунок 2. Влияние голодания, проводимого перед введением антигена,на показатели анафилактической чувствительности крыс.

г*?

а

§ о

АКТИВНЫЙ АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ТОК КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА (N=13)

46 п 30 20 10

0

Ш .Ш

ОПЫТНАЯ ГРУППА (N=11) (Р<0,01)

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

Тяжесть проявлений анафилаксии (баллы)

Я Е-1

§ «

с

ь- к

ё I

Рн Я

ш

40 30 20 10 0

АНТЮ'ЕН-ЗАВИСИМАЯ (АНАФИЛАКТИЧЕСКАЯ) СЕКРЕЦИЯ ГИСТАМИНА ТУЧНЫМИ КЛЕТКАМИ

■ я

я я

■ 1С

■

В > ■ в и _ ■ И -я я

анафилактический индекс у животных опытной группы снизился более, чем в 2 раза по сравнению с контрольными значениями и составил величину 1,27 (N=11).

Результаты определения ОБА-зависимой секреции гистамина ТК у нормально питавшихся и голодавших крыс представлены на рисунке 2. Средняя величина секреции для животных контрольной группы составила 16,0±3,3%. Голодание в течение 4 суток сопровождалось статистически высокодостоверным (Р<0,01) снижением ОБА-стимулированной секреции гистамина ТК Максимальное значение величины секреции в опытной группе составило 5,1%,а среднее значение равнялось 2,2±0,5Х,т.е. было более,чем в 7 раз ниже контрольных значений.

Приведённые результаты исследований подтверждают противоана-филактическую эффективность полного голодания в эффекторной фазе иммуногенеза (Горынь М. А. 1979). Выявленный факт подавления анафилактической секреции гистамина ТК свидетельствует в пользу возможности воздействия голодания на состояние клеток-мишеней аллергии первого порядка и, соответственно, на протекание патохимичес-кой стадии аллергической реакции. Выявленный ранее феномен снижения уровня АТФ в ТК в условиях голодания представляется одним из наиболее вероятных механизмов угнетения секреции медиаторов, являющейся , как известно (ЛоЬапзэеп Т. et а1. 1975).энергозависимым процессом.

2. 3.3. Изменение выраженности проявлений анафилаксии и состояния тучных клеток при проведении голодания в процессе сенсибилизации с последующим периодом нормального питания. Ниже приведены результаты исследования показателей аллергической реактивности крыс спустя определённый период нормального кормления после воздействия голодания на сенсибилизированных животных. Данная постановка эксперимента,выполненная в соответствии со схемой 3 позволяет (разумеется в определённой степени приближения) моделировать метод разгрузочно-диетической терапии,воздействие которой рассчитано на снижение аллергической реактивности организма человека не только непосредственно после проведения лечебного голодания,но и в течение определённого срока после него, характеризующегося как период ремиссии.

После 4-суточного голодания перевод животных на общевиварный рацион приводил к быстрому приросту массы тела. Через 6 дней восстановительного питания потери в весе составляли только 8%.

Результаты оценки влияния голодания на тяжесть проявлений

АЛШ у крыс двух групп представлены на рисунке 3. Анализ полученных данных не выявил достоверных различий по выраженности анафилактических проявлений в контрольной и опытной группах животных. Вместе с тем,наблюдалась определенная тенденция к снижению тяжести ААШ у голодавших крыс. Так, величина анафилактического индекса в опытной группе составила 1,94 (N=16) по сравнению с 2,58 (N=12) в контроле. У животных,получавших общевиварный рацион,количество летальных исходов анафилаксии составило 17%,в то время,как у голодавших крыс летальных исходов не было отмечено. Анализ различий количества смертельных исходов ААШ по группам в соответствии с и-критерием Фишера (Гублер Е. К 1978) показал, что такие отличия являются статистически значимыми (Р<0,05).

Таким образом,при лишении сенсибилизированных крыс пиши в течение 4 суток с последующим 6-дневным периодом содержания животных на обычном питании снижение тяжести проявлений анафилаксии было менее выражено,чем при проведении голодания на начальных и конечных этапах сенсибилизации. Вместе с тем,голодание с последующим нормальным кормлением вызывало статистически достоверное снижение количества летальных исходов анафилактического шока,что подтверждает противоаллергическое действие голода.

Результаты исследований анафилактической секреции гистамина ТК под действием ОБА,проведённых параллельно изучению проявлений анафилаксии,представлены на рисунке 3. У крыс контрольной группы средний показатель ОБА-стимулированной секреции гистамина при значительных индивидуальных колебаниях составил величину 5,4±1,6%,что несколько ниже данных, представленных ранее. Наиболее вероятным объяснением отмеченного явления представляется сезонная зависимость секреторной активности ТК (последний эксперимент проводился в зимние месяцы в отличие от двух предшествующих, поставленных летом).

В опытной группе животных,которые лишались пищи в течение 4 суток с последующим 6-дневным периодом восстановительного питания, анафилактическая секреция гистамина под действием ОВА была достоверно снижена (Р<0,05) по сравнению с контрольными значениями и составила величину 1,5±0,5%. >

Представленные результаты указывают на то, что прекращение голодания и переход к обычному рациону питания не отменяет (по крайней мере на заданный период времени) эффекта подавления аллергической реактивности животных и , в том числе,снижение секре-

Рисунок 3. Елкяние голодания,проводимого в процессе сенсибилизации, с последующим периодом нормального питания на показатели анафилактической чувствительности крыс.

АКТИВНЫЙ АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ШОК

КОНТРОЛЬНАЯ ГРУША (N=12)

ОПЫТНАЯ ГРУППА (N=16)

ш » Й Я

_ж

ж

ш

щ

щ

щ

т ЙМ

0 1 2 3 4 0 1 2

Тяжесть проявлений анафилаксии (баллы)

АНТИГЕН-ЗАВИСИМАЯ (АНАФИЛАКТИЧЕСКАЯ) СЕКРЕЦИЯ ГИСТАМИНА ТУЧНЫМИ КЛЕТКАМИ

3 й

е-< в:

к

ы &

ы о

15т 12,5 18 7.5 5 ) 2.5] 0^

ции гистамина ТК.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что полное голодание,проводимое на различных стадиях сенсибилизации организма (в начале,середине или непосредственно перед введением разрешающей дозы антигена) .вызывает значимое снижение тяжести проявлений системной анафилаксии у крыс. Параллельно этому во всех сериях экспериментов отмечается выраженное уменьшение величины антиген-зависимой (анафилактической) секреции гистамина ТК крыс,что указывает на непосредственное воздействии голодания на состояние клеток-мишеней аллергии первого порядка и протекание патохимической стадии аллергической реакции немедленного типа путем ингибирования процесса высвобождения медиаторов аллергии.

ВЫВОДЫ.

1. Полное голодание вызывает выраженные морфофункциональные изменения в тучных клетках крыс: после 4 дней голодания в 1,6 раза снижается общее количество тучных клеток в брюшной полости; уменьшается секреция гистамина плевральными и перитонеальными тучными клетками под действием модельного гистаминолибератора -вещества 48/80, при этом содержание гистамина в тучных клетках не изменяется. Полное 2-4 суточное голодание у крыс сопровождается двукратным снижением уровня АГФ в тучных клетках из брюшной и плевральной полостей.

2. Полное 4-суточное голодание,проводимое у предварительно сенсибилизированных овальбумином крыс, влияет разнонаправленно на уровень антител к этому белку,циркулирующих в крови, и количество антител,связанных с клетками-мишенями аллергической реакции: в сыворотке крови концентрация 1дБ-антител против овальбумина снижается на 24£, а количество антител,связанных с перитонеальными тучными клетками возрастает в 2,9 раза.

3. Применение различных схем полного 4-суточного голодания у крыс ( в начале периода сенсибилизации, в процессе сенсибилизации с последующим 6-суточным нормальным питанием и непосредственно перед введением разрешающей дозы аллергена) сопровождается снижением тяжести проявлений у них системной анафилаксии. При этом имеет место снижение антиген-зависимой секреции гистамина перитонеальными и плевральными тучными клетками сенсибилизирован-

- 20 -

ньи животных соответственно в 4,2 ; 3,6 и 7,3 раза.

4. Параллельное снижение тяжести проявлений системной анафилаксии и величины антиген-зависимой секреции гистамина тучными клетками,отмечаемое при всех исследованных режимах полного голодания, свидетельствует о непосредственном воздействии голодания на протекание патохимической стадии реакции системной анафилаксии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Функциональное состояние иммунной системы в условиях полного голодания // В сб. науч. тр. ВНИЖЬ Опыт лечения бронхиальной астмы методом разгрузочно-диетической терапии. Л 1986, С. 13-15 / Соавт. Шатерников В. А., Михайлов Л. А., Казакова О. Ю.

2. Влияние полного голодания на процессы экспериментальной пищевой сенсибилизации и анафилаксии // В сб.: Иммунодефициты и аллергия. Тез. докл. симпоз. с междун. участием. М. ,1986,0. 263 / Соавт. Михайлов Л. А. , Казакова О. Ю.

3. Возможности физиолого-биохимической и иммунологической оценки качества пищевых продуктов в эксперименте // В сб. Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов и добавок. Использование вторичного сырья пищевых ресурсов. Всесоюз. научно-техн. конференция. Киев, 1991, ч. 1,0. 268-269 / Соавт. Мазо К К , Ширина Л. И. , Кржечковская ЕЕ

4. Ечияние голодания на функциональную активность тучных клеток и содержание микросомальных цитохромов в печени // Вопр. питания, 1992, N 5-6, С. 45-47 /Соавт. Ширина Л. И. .Кржечковская В. Е .Бровко Л Ю. .Туровецкий Е Б. ,Мазо Е К.

5. Влияние голодания на проявления анафилаксии у сенсибилизированных крыс //Вопр. питания, 1993,N 1, С.48-50 / Соавт. Ширина Л. И. , Садыкова Р. Е. , Михайлов Л. А. , Мазо Е К

6. Особенности проявлений анафилаксии у крыс при голодании //Соавт. Ширина Л. И. .Кржечковская В. Е .Гмошинский И. К ,Мазо В. К / Вопр. питания, 1993, N 3, С. 39-41.