Проницаемость кишечного барьера для макромолекул при некоторых патологических состояниях и воздействии различных алиментарных факторов

Гмошинский, Иван Всеволодович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Проницаемость кишечного барьера для макромолекул при некоторых патологических состояниях и воздействии различных алиментарных факторов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Проницаемость кишечного барьера для макромолекул при некоторых патологических состояниях и воздействии различных алиментарных факторов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи

ч и ^ -1

2 1 ЛПР Ю97

ГМОШИНСКИЙ Иван Всеволодович

УДК 616-056.43-02:613.2]-092:612.332.4]-07:612.386+641.563

ПРОНИЦАЕМОСТЬ КИШЕЧНОГО БАРЬЕРА ДЛЯ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ

СОСТОЯНИЯХ И ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени доктора биологических наук

Москва, 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте питания РАМН

Научные консультанты: профессор, доктор биологических наук ВЛСМаэо

профессор, доктор медицинских наук ИАЛ1ороэов

Официальные оппоненш: профессор, доктор биологических наук В.Б.Спиричев професоор, доктор медицинских наук ИНБалаболкин доктор биологических наук ТАВалуева

Ведущая организация: Инсппут физиологии им.И.П.Павлова РАН

Защита диссертации состоится " 21" апреля 1997 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.001.02.01 в Научно-исследовательском Институте питания РАМН по адресу: 109240, г.Москва 240, Устьинский проезд 2/14

С диссертацией можно ознакошлъся в библиотеке НИИ питания РАМН Автореферат разослан" ^ марта 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.мл.

ВЛиКмтчЕнко

СБШРЯ ХАЕЫСЕЕИСГИКА ЕДШШ

Актуальность проблема Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) обладает функций барьера, препятствующее поступлению во внутреннюю среду организма ыах->сыслекул пищевых белков, токсинов микрофлоры, вирусов и живых микроорга-[измов (Уголев А.М. ,1987). В настоящее время признано, что барьер ЖКТ не вляется абсолкгно непреодолиьъм (Шатерников В.А. ,1986; Мазо В.К. и р. ,1989). Данные многочисленных экспериментальных и клинических исследовали позволяют считать существование феномена проникновения макромолекул ерез кишечный барьер доказанным. В норые у животных и человека нерасщеп-енные макромолекулы преодолевают кишечный барьер в количествах, не имею-их значения для обеспечения пластических и энергетических потребностей рганизма, но иммунологически значимых. Важную роль, по-видимому, играет бсорбция иммуноглобулинов, эпидермального фактора роста и других защитных акторов из молока в раннем постнатальном периоде. Процесс абсорбции в ЖКТ пределенных количеств пищеварительных ферментов вероятно необходим для егуляции функции поджелудочной железы по механизму отрицательной обратной вязи (Коротько Г.Ф., 1990). Всасывание из полости кишки вирусных частиц акже может иметь важное адаптационное значение и находит практическое ис-эльзование в процессе пероральной вакцинации детей против полиомиелита.

Проницаемость кишечного барьера для малфсмолекул значительно повышена зи таких заболеваниях, как пищевая и гастроинтестинальная аллергия, бо-эзнь Крона, язвенный колит, целиакия, отдельные формы диабета, парази-арные инвазии, хронический алкоголизм, а также при травме и стрессе. След-гвием этого может быть развитие поливалентной пищевой сенсибилизации, а иске тяжелого системного септического состояния и полиорганной недостаточ-зсти. Важно, что в условиях клиники бывает трудно установить, является ли ¡рушенная проницаемость ЖКТ причиной или следствием развившегося патоло-гаеского процесса в стенке кишки. Вопрос о первичной патогенетической ши нарушенной проницаемости ЖКТ для макромолекул требует дополнительно) исследования. Недостаточно изученньм остается характер изменений кишеч->й проницаемости при воздействии ионизирующей радиации. Пищевые антигены, асываюшиеся в'ЖКГ ксрмящей матери, могут преодолевать барьер её молочной ¡лезы и передаваться с молоком потомству. С этим в настоящее время связы-.ется явление аллергической сенсибилизации младенцев, находящихся на

чисто грудном вскармливании. Количественные аспекты данного феномена и е возможное клиническое значение охарактеризованы в литературе недостаток полно.

Имеющиеся сведения о молекулярных механизмах нарушения проницаемое кишечного эпителия позволяет предположить, что его нормальная барьерн функция межет быть восстановлена под действием некоторых алиментарных фа торов. Их выявление могло бы послужить основанием для разработки сп цифических методов диетической профилактики и коррекции патологических с стояний, связанных с нарушениями кишечной проницаемости. Имеыциеся в л тературе данные о влиянии характера питания на проницаемость защитного б рьера ЖКГ крайне немногочисленны.

В свете вышеизложенного ЦЕПЬЮ ДАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ является выяснен значения нарушенной проницаемости кишечного барьера как одного из факт ров, привохшчк к развитию пишевой аллергии, а такие физиолог биохимическое обоснование возможностей алиментарной коррегадаи барьера функции ЖКТ.

Для реализации поставленной цели определены следукшие ЗАДАЧИ УССЛЕДШЗЮ.

1. Разработать методы количественного определения всасывания макрос лекул в кишечнике у лвдей и лабораторных животных, позволяющие дрог дить оценку изменений барьерной функции ЖКГ при развитии различных пат логических состояний и заболеваний, а также под воздействием фактора ш ния.

2. Б эксперименте на животных изучить возможную роль увеличенной пр ницаемости кишечного барьера для макромолекул как фактора риска разЕ тая пишево!-: сенсибилизации и, как следствие этого, плцеЕОй кгпевчувстг тельности.

3. Воспроизвести у лабораторных животных модели патологических с стояний, характеризупцихся нарушениями кишечной проницаемости для маку молекул.

4.Экспериментально обосновать возможность воздействия на барьер! функцию алиментарных факторов : жирнокислотного состава липидного коыг нента рациона, потребления добавочных количеств свободных аминокислс

иегкоусвояемого белка с высокой биологической ценностью, антиоксидантных факторов.

5.В клинических наблюдениях охарактеризовать диагностическое и прогностическое значение теста нарушенной проницаемости барьера ЖКТ у больных взрослых и детей, страдаших пищевой аллергией и нарушениями функции пи-цеварения.

6.Дать количественную оценку поступления антигенов пищи в грудное молоко л установить значение этого феномена в развитии пищевой гиперчувствитель-яости у детей, находящихся на 'грудном вскармливании.

Научная новизна работал. Впервые в условиях эксперимента показано, что увеличенная из-за наследственных или фенотипических особенностей проницаемость кишечного барьера для макромолекул у нормальных здоровых лабораторных животных (морских свинок) является фактором риска последующего развития у них состояния пищевой гиперчувствительности на модели орально индуцированной пищевой анафилаксии.

Доказана применимость полиэтиленгликсля (ПЭГ) -4000" как индикатора килечной проницаемости у лабораторных животных. Впервые охарактеризованы межвидовые и возрастные различия во всасывании ПЭГ-4000 в ЖКХ лабораторных животных, выявлена корреляция между проницаемостью кишки для ПЭГ и белка, установлен вклад активного транспортного механизма (эндоштоза) во всасывание ПЭГ, показана возможность использования ПЭГ для повторного тестирования кишечной проницаемости в динамике в ходе эксперимента.

Установлено, что у лабораторных животных (крыс), подвергнутых внешнему у-облучению в дозе 400 рад, наблюдается транзиторное увеличение проницаемости килечного барьера для ма!<ромолекул ПЗГ-400С и белка.

В экспериментах на крысах показано, что проницаемость кишечного барьера для макромолекул в норме и три патологии (системная анафилаксия, внешнее у-облучение, химический колит) может быть уменьшена (нормализована) под воздействием приема дополнительных количеств концентрата легкоусвояе-иого пищевого белка, мононатриевсй ссши глутаыиновой кислоты и препаратов биологически доступного селена. Выяснено, что факторами рациона, неблагоприятно влияющими на барьерную функцию ЖКГ, являются дисбаланс жирных кислот (избыток ШИК о-З ряда), избыточное потребление с рационом триптофана и неусвояемого полисахарида (пектин).

В клинических наблюдениях на больных взрослых и детях, страда гаях а лергическими и гастроэнтерологическим-! заболеваниями, показано, что тес проницаемости кишечного барьера для магфомолекул белков могут использоват ся при диагностике тастроинтестинальной пищевой аллергии и , в особенност. ее формы, сочетанной с воспалительными заболеваниями тонкой и толстой кип и дисбактериозом. Показано, что у детей раннего возраста, страдаших пищ вой аллергией, в большом проценте случаев наблюдается обращение ("инве) сия") нормальной возрастной динамики снижения кишечной проницаемости.

Количественно охарактеризовано явление поступления антигенов пищи материнское молоко и установлено, что этот показатель должен быть включ< в комплекс критериев выявления группы риска по развитию пищевой сенсибига задай на естественном вскармливании.

Практическая значимость результатов работы. Разработана модель нар! шенной проницаемости кишечного барьера лабораторных животных при внешне у-облучении, позволявшая тестировать эффективность различных новых адаптс генных и радиопротекторных фармакологических средств, пищевых продуктов добавок, предназначенные для использования лицами, входящими в грушу рис ка по воздействию ионизирующего облучения (население зоны Чернобыш персонал АЭС и атомной промышленности, летчики, врачи-рентгенологи и др.).

Показана эффективность включения в рацион лабораторных животных дс бавки концентрата структурирующего пищевого (КПП) с целью предупреждена нарушения барьерной функции ЖКТ при системной анафилаксии и внешнем! облучении. Это дает основание рекомендовать КПП для включения в соста специализированных продуктов для лодей, входящих в группу риска по радиаци онному поражению, а такке для некоторых категорий бальных с нарушение функцией органов пищеварения.

Разработаны иьмуноферыентные методики тестирования проницаемости ки шечного барьера для белковых макромолекул у больных взрослых и детей ранне го возраста. Методики могут быть использованы в клинических условиях пр выявлении нарушения барьерной функции ЖКГ среди больных, страданиях пи щевой аллергией, хроническим колитом, воспалительны®! заболеваниями тонка кишки. Положительные результаты тестирования могут явиться основанием дл назначения больным специализированных гипоашзергенньк и элиминационнц диет, а ь случае подозрения ка наличие целиакии также и показанием дл.

проведения эндоскопического исследования. Тестирование проницаемости кишечного барьера мажет использоваться при дифференциальной диагностике гастроинтестинальной формы пищевой аллергии от других форы аллергии. Метод внедрен и используется в Клинике лечебного питания РАМН, в Рязанском . медицинском университете (РМУ)" им. И. П. Павлов а (кафедра пропедевтики внутренних болезней), в Краснодарском медицинская институте, в НИИ педиатрии РАМН, в Рязанской областной детской клинической больнице.

Разработан иьмунсферментный метод выявления сенсибилизации к пищевым продуктам по наличию специфических антител в сыворотке крови детей первых лет жизни. Метод способен выявлять поливалентную пищевую сенсибилизацию в 90-92% случаев, а целиакию в 80 и более % случаев при частоте лотнополо-жительных результатов (в контрольной группе детей) не более 7%. Это позволяет использовать предложенный метод при скриннинге и экспресс-диагностике пищевой гиперчувствительности и глкэтеновой энтеропатии в широких контин-гентах больных, в том числе и при амбулаторном приеме. Метод внедрен и используется в отделе детского питания НИИ питания РАМЕ, НИИ педиатрии РАМН, в детской клинической больнице им.Н.Ф.Филатова г.Москвы, в IV городской детской клинической больнице г.Новокузнецка и др.

В совместных исследованиях с проф.Е.М.Фатеевой и к.м.н. М.В.Шошинсксй предложен комплекс критериев по выделению группы риска по развитию пищевой сенсибилизации у детей, находящихся на естественном вскармливании. В число этих критериев входит уровень поступления антигенных белков диеты матери в женское молоко. Метод внедрен и используется в работе некоммерческого медико-педагогического Центра "Страна абсолютного нового Я" , г.Москва. На основе иммунохимяческой характеристики белкового компонента большого числа молочных продуктов, поступающих в торговлю, выработаны рекомендации для включения некоторых из них в рацион питания кормящих женщин, дети которых входят в вьшеуказанную группу риска.

Разработана процедура иыыунохимической характеристики белкового компонента специализированных пищевых продуктов, предназначенных для больных пищевой аллергией и нарушенной функцией пищеварения. Процедура включает подготовку (фракционирование) образца, анализ методом двумерного иммуно-злекгрсфзреза по Кларк и Фриман, количественный учет результатов на ЭВМ с использованием математического метода ранжирования ("взвешивающей" фунх-

ции). Полученные данные использованы при разработке рецептуры ряда спаци лизированкых продуктов: "Унипит-З", "Лактанал", -"Фиталакт", "Фиталак1 Д". Технология выработки гипоаллергенных продуктов, включаших тестирова] ный по вышеуказанной процедуре белковый компонент, зашишрна АС СССР 1 1622967, 1494898, патентом РФ N 20402559. Основные положения, вываоаыз на завдггу.

1. Увеличенная проницаемость защитного барьера желудочно-кишечного трак как один из факторов риска сенсибилизации организма антигенами энтеральн< среды.

2.Модель нарушенной проницаемости кишечного барьера у взрослых крыс, по; вергнутых внешнему у-ойлучеиию в дозе 400 рад.

3.Возможность предупреждения нарушений проницаемости кишечного барьера эксперименте под действием факторов рациона(липида, белок, глутамат, селен',

4.Нарушенная проницаемость кишечного барьера у взрослых больных и дет« раннего возраста как диагностический и прогностический признак развил гастроинтестинальной аллергии .

5.Поступление антигенов пиши в женское молоко как один из критериев ве деления группы риска развития аллергии у детей на грудном вскармливании. Апробация работы. Приведенные в диссертационной работе результаты были дс лажены на V Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1986 г), на Научж практической конференции "Диагностика, патогенез и лечение пищевой алле| гии" (Рязань, 1989);на XV Всесоюзной конференции по физиологии пищевареш и всасывания (Краснодар, 1990), на научной конференции с международна участием "Питание: здоровье и болезнь" (Москва, 1990); на ежегодных (1995 1996 г) Конференциях Федерации американских обществ экспериментальной бис логии (Атланта, 1995 , 1996), на научной Конференции "Аллергия, иммунитет патология внутренних органов", посвященной 900-летию г.Рязани (Рязань 1995), на II Всероссийской гастроэнтерологической наделе (Москва, 1996), I Всероссийской научно-практической конференции "Аллергические болезни у д« тей" (Москва, 1996), на V Мездународаой конференции Института питания Хайь "Пищевая непереносимость у детей" (Москва, 1996).

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ:

Структура и оСпеи диооервасрюниэй работ. Диссертационная работа состо-; из введения, обзора литературы по вопросу проницаемости кишечного барье-1 для макромолекул в нсрые и при патологии, главы "Материалы и методы ис-:едования" , 6 глав результатов собственных исследований, обсуждения ре- . таьтатов, выводов, списка литературы ( 431 источник ) и 2 приложений. Ра-зта изложена на 400 страницах машинописного текста, включает 34 таблицы и } рисунка.

Содержание работы СБЬЕМ и мзтсда ИССЛЕДОЭЙВИЯ

Работа основана на результатах экспериментальных исследований на ла-зратсрных животных и клинических наблюдений.

Эксперименты по определению проницаемости кишечного барьера выполнены 1 взрослых крысах самцах линии Вистар массой от 150 до 300 г, взрослых гспородкых морских свинках самцах массой от 250 до 400 г, беспородных збаках (взрослые к щенки в возрасте 2-6 мес) обоих полов. В период перед кспериментами животные получали стандартные рационы НИИ питания РАМН, в эстав которых не входили белки коровьего молока и куриных яиц. Во время •сспериментов животные продолжали получать тот же рацион или палусинтеткче-■сие рационы на основе казеина_, крахмала, растительного или рыбьего жира, отаминной и минеральной смесей, составленные на основе рекомендаций НИИ тгания РАМН. Тестируемые добавки свободных аминокислот, глутатиона, кон-антратов сывороточного белка молока, препаратов селена, пектина вводили рысам внутрижглудочно (в/ж) через зонд ежедневно в течение 14-21 дня. Во :ех случаях вводимые добавки содержали не более 5 % от суточного потребле-

животными белкового азота к калорийности. Животные контрольных групп элучали при этом плацебо - гаотонический раствор КаС1. Всего е экспесимен-э использовано 810 !фыс, 420 морских свинок и 14 собак.

Щм определении проницаемости кишечного барьера для пищевых антигенов спользовали метода конкурентного радиоиьлауноанализа (КШМ) или иьлаунофер-антного анализа (ИФА). Белки вводили, гак правило, в/ж через зонд в виде а створа в 0,15 М NaCl в дозе близкой к 1-1,5 г/кг массы тела. Кровь для пределения в ней пищевых антигенов брали через 3 часа после их введения .

Определение проницаемости барьера ЖКГ лабораторных животных для ЮГ-ООО проводили по его экскреции с мочсй. В/ж (крысам, морским свинкам)

или персрально (собакам) через зонд вводили ПЗГ-4000 в 0,15 М NaCl. Доз ПЭГ составляла, как правило, 2500 мг/кг массы тела- животного. После этог животных помешали в метаболические клетки и собирали мочу для олределени экскреции ЮГ-4000 в течение 18 часов.

В работе были воспроизведены следующие модели состояний с нарушенно проницаемостью кишечного барьера крыс для макромолекул.

1.) Модель локамыюй анафклаксии ЖГ. Взрослых крыс самцов лини Вистар сенсибилизировали внутрибрппинно (в/б) искусственным антигеном до нигрофенилированным бычьим сывороточным альбумином (ДНФ-БСА) однократно : дозе 100 мкг с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. На 14-й день опыта крысы получали в/ж 20 мг ДНФ-БСА в растворе 2,5% NaHCCb вместе с инди катерами проницаемости кишечного барьера для макромолекул - ПЭГ-4000 ип овальбуминам куриного яйца (ОВА). Контролем служили несенсибилизированны ямвотные, получавшие в/ж эквивалентное количество ДНФ-БСА или раствор. NaHCOj. По аналогичной методике была предпринята попытка вызвать состоят» местной анафилаксии кишки у крыс, сенсибилизированных ОВА.. В отдельна эксперименте методика воспроизведения локальной анафилаксии была модифицирована. 1фыс в/б сенсибилизировали ОВА троекратно на 1-й, 3-й и 5-й дет эксперимента, а на 21-й день вводили по аналогичной методике 10 мкг антигена. С 28-го по 35-й день сенсибилизации крысы получали сери! '^микреразрешений" путем ежедневного в/ж введения 20 мг ОВА в 2,5% ИаНСОз. Проницаемость кишечного барьера для ПЭГ-4000 тестировали в конце сери "мшфоразрешений".

2.) Состояние системной анафилаксии с киявчныл синдромом. Для воспроизведения состояния системной анафилаксии крыс многократно сенсибилизировали в/б ОВА, адсорбированным на гидроксиде алкминия по той же схеме, чте к в эксперименте с серией "микроразрешений". На 26-й день опыта вводите внутривенно (в/в) разрешали»® дозу 10 мг или 1,25 мг ОВА в 0,5 мл физиологического раствора. В течение 15-30 мин после этого у крыс развивался системный анафилактический шок с симптомами ольптки, цианоза конечностей, атаксии, судорог. По прошествии острого периода этой реакции (через <5560 мин) у крыс тестировали проницаемость кишечного барьера для ПЭГ-4000.

Непосредственно перед разрешением у части животных брали кровь из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.

3.) Состояние мзльабсорбции желчных шслот, вызванное резекцией Яи-даального отдала тонкой кишки. Данная модель была воспроизведена нами в овместных исследованиях с д.м.н. Л.С.Василевской. У взрослых крыс самцов ;од гексеналовсй анестезией удаляли дистальную половину тонкой кишки. КОн-рольных животных подвергали только лапаротомии с последующем наложением :епрерывного шва. Оперированных крыс содержали в индивидуальных клетках ри свободном доступе к воде и рациону вивария. Тестирование проницаемости арьера кишки для ПЭГ-4000 проводили на 7,14,21 и 28 дни после операции.

4.) Состояние химического колота дистального отдела толстой кишки бы-го воспроизведено согласно Zahavi е.а. (1989). Под эфирной анестезией кры-:ам вводили ректально на 15 секунд 1 мл 10% раствора уксусной кислоты, [роницаемость ЖКТ до и через 7,14 и 21 день после индукции колита тестиро-lamt с помощью ПЗГ-4000 и , в огдельньк опытах, ОВД.

5.) Острое внешнее гаша-облучение. Состояние с нарушенной проницае-¡остыо кишечного барьера вследствие воздействия ионизирующей радиации вос-¡роизводали у взрослых крыс самцов, которых подвергали общему однократному шешнему у-облучению на установке Хизотрон (источник е= Со) в дозе 400 и '00 Рад при мощности поглощенной дозы 60,6 Рад/мин (исследование проведено :овместно с к.м.н.С.Н.Радченко!. Проницаемость кишечного барьера для мак-хзмслекул ЛЭГ-4000 тестировали непосредственно перед облучением и на 2-е, ¡-е и 15-е сутки после облучения, в ряде экспериментов на 2-е сутки пос-:е облучения определяли также проницаемость кишечного барьера для ОБА с юмощью ИФА.

Сценку проницаемости кишечного барьера для макромолекул ОБА радиоим-яуносорбентными методами и ИФА проводили у 20 здоровых добровольцев и 209 вольных пишеЕОй аллергией и функциональными заболеваниями ЖКТ, проходящих гечение в клинике ВДУ (кафедра пропедевтики внутренних болезней, рук. i.m.h., профессор А.С.Луняков) и в клинике лечебного питания КИИ питания ?АМН, ( руководитель отделения - д.м.н., профессор Е.А.Беш). Диагноз пище-5сй аллергии устанавливали на основгшии данных алпергологического анам-¡еза, кожных гроб с пищевыми антигенами , серологических тестов циркули-зуицих антител к пищевьм белкам (дехрануляция тучных клеток, илаунотер-яютсметрия). Обследования больных вьши проведены к.м.н. А.А.Низовым, с.м.н. О.Н.Григорьян и Н.Ф.Роенко.

Исследования проницаемости кишечного барьера для а-лактальбумина женского молока (АЛА) с помощью ишуноферментного метода были проведены у 172 детей первого года жизни, проходящих лечение в отделении патологии новорожденных Областной клинической больницы г.Рязани (рук. отд. к.м.н. А.В.Дмитриев) и в отделении патологии новорожденных НИИ педиатрии РАМН (рук. - д.м.н., профессор Г.В.Яцык). Из общего числа детей у 144 исследование проницаемости кишечного барьера проведено повторно (в динамике заболевания) . Обследование больных выполнено к.м.н. А. В. Дмитриевым, д.м.н. Т.э.Боровик и аспирантом С.В.Стаченковой.

Содержание пищевых антигенов было изучено в 256 пробах молока, полученных от 215 кормящих женщин на амбулаторном приеме в лаборатории по изучению питания здоровых детей НИИ питания РАМН (рук. д.м.н., проф. К.Я.Конь). Анализы выполняли без предварительной нагрузки пищевыми продуктами. Помимо этого было проведено комплексное клинико-иммунсшогическое обследование 50 штерей и их детей в период до 1 года после рождения. Обследуемые проживали в г.Москве, роды проходили в акушерском отделении 7-ой Городской клинической больницы г.Москвы (рук. отд. Н.К.Шмелева). Обследование кормяших жэншин и их детей и амбулаторное наблюдение за ними проведено д.к.к., проф. Е.М.Фатеевой и к.м.н. М.Б.Гкаданской.

Концентрации пищевых антигенов в сыворотках 1фови лабораторных животных, больных детей и взрослых определяли с использованием высокочувствительных иммунохиыических методов. В серии экспериментов был применен метод КРИК, основанный на преципитации комплексов меченый антиген-антитело б присутствии 10-6 ЛЭГ-6000. Метод использовали в собственной модификации. С помощью этого же метода быта! определена концентрат»: ОВА, {Клактоглобулина коровьего кслока (ЕЛГ: :: БСА е женски: молоке. Поп споеделэшс: нсьсывания ОЗА у больных, страдающих различными формам:: аллергик к функциональным:: заболеваниями ЖКТ, использовали двухвалентный твердофазный радиоиммуносор-бентный тест на полистироле (РадапеШ е.а., 1979), а также радиоиьадуносор-бентный метод подсчета циркулирующих иныунных комплексов пищевых белков на протеин-А сефарозе Цпдапаэ е.а., 19о1). Радиоактивность образцов определяли методами сцинтилляционнсй (V- и у- спектрометрии. В ряде клинических наблюдений у взрослых больных, при определении проницаемости кишечного барьера у детей ютя АЛА и в экспериментах на крысах с нарушенной проницаемостью

щечного барьера использовали ИФА, рекомендуемый как официальный метод ВОЗ я определения ультрамалых концентраций белковых и микробиальных антигенов tuart е.а.,1984).

Концентрацию ПЭГ-4000 в моче животных определяли методом среднеско- . ■стной гель-лроникаоцей хроматографии на колонке С гелем Toyopearl-HW50-пе в системе метанол-вода 1:1. Колонка была снабжена дифференциальным фрактометрическим детектором. Перед нанесением на колонку ПЭГ-4000 экс-агировали из аликвоаы мочи перегнаннььа хлороформом. В целях корректного 1ета выделительной функции почек экскрецию ПЭГ-4000 с мочой вьражали в »счете на 1 ммоль экскретируемого креатинина, который количественно опре-гляш колориметрическим методом Яффе в модификации А.А.Погфовского (1969).

Титры антител к пищевым белкам в сыворотках крови лабораторных животах и бальных определяли методом радаоиммунопреципиташи по Фарру в соб-геенной модификации, а также непрямым твердофазным иммуноферментным мето-зм (Helenczer Е.,1989).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием Т-ритерия Стьвдента, коэффициентов корреляции по Пирсону и по Спирмену, не-араметрических ранговых критериев Мана-Уитни, Краскалла-Уоллеса , углового реобразования Фишера и критерия медианы. Расчеты проведены на ЭВМ с ис-эльзованием самостоятельно составленных программ, а также статистического зкета "Winstat 4.3".

РЕЗУЛЬтаШ СОБСТВЕННЫХ ИХЛЕДЖЙНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Доказательства адекватности использования ПЭГ-4000 хах ивдикатера проницаемости кишечного барьера в эксперименте

5 течение длительного времен;: ГГЗГ-4С0С кспсльзовался ь птвимеской астроэнтеролоши в качестве "неабсорбируемого маркера". Впоследствии было, днако, показано, что его небольшие количества всасываются и экскретиру-ггся с мочой [Jackson е.а., 1981, Elsenhans, 1989). Представляет существенный нтерес экспериментальное обоснование корректности использования ПЭГ-

000 в качестве неыетаболизируемого зонда проницаемости кишечного барьера.

Проведенные нами исследования показали, что у взрослых крыс и морских

эзинок, получавших ПЭГ-4000 в/ж, его всасывание увеличивается дозозависимо

1 интервале доз 50-1000 мг на животное. Эти данные свидетельствуют в пользу

того, что всасывание ПЭГ-4000 является ненаадаемым процессом, т.е. не опосредуется, по всей видимости, стадией адсорбции -на апикальном гликока-ликсе. При всех дозах ПЭГ-4000 отмечалось его достоверно большее всасывание у крыс, чем у морских свинок, что качественно согласуется с результатам» определения у этих двух видов животных всасывания в тонкой кишке белковых макромолекул (Зорин С.Н., 1983). Сопоставление всасывания ПЭГ-4000 и ОВ? у одних и тех же крыс показало, что наблвдается достоверная положительная корреляция между уровнем в крови антигенного ОЕА и экскрецией ПЭГ-4000 с мочой (Ы=+0,534; N=17; Р<0,05). Таким образом, ПЭГ-4000 и ОВД сходным образом отражают индивидуальную вариабельность в проницаемости кишечного барьера у здоровых животных. У щенков собак в возрасте 2-4 месяца, когда прекращается молочное вскармливание и осуществляется переход животных к дефинитивному питанию, отмечалось систематическое снижение абсорбции ПЭГ-4000 и ее среднее значение составило 5,9+1,2% и 0,98+0,36% для возраста 2 и 4 месяца соответственно (Р<0,005). Таким образом для ПЭГ-4000 наблюдаются те же закономерности изменения кишечного всасывания в онтогенезе, что и для белковых антигенов. В возрасте 12 месяцев всасывание ПЭГ-4000 составило 0,76+0,20%, что достоверно отличается от 2-мес возраста (Р<0,05), но не отличается от 4-мес возраста.

Для того, чтобы оценить роль механизма эндоцитоза в абсорбции ПЭГ-4000 в кишечнике, нами было изучено у здоровых крыс влияние на этот процесс ингибитора сборки цитоплазматических микротрубочек колхицина (Морозов И.А.,Верина Т.Ю.,1990). Кслхицик вводили в/б в дозе 125 мкг/100 г массы тела за 3 часа до в/ж введения ПЭГ-4000. Контрольные животные получали инъекцию растворителя (0,15 М КаС1). Как следует из данных рис.1, колхицин существенно уменьшает величину экскреиик ПЗГ-4000 с мочой, хотя практически не изменяет в данной дозе экскрецив кзеатшшна. Наблюдаемый эффект, те^: самьм, определяются, по-видамсму/ только различиями ъ абсорбции индикатора в кишке. Этот результат показывает, что поступление ПЭГ-4000 через кишечный барьер у нормальных животных в значительней степени осуществляется по механизму эндоцитоза так же, как это имеет место для белковых антигенов.

Рис. 1 ЛиуР0 (а)- экскреция с мочой креатинина (б) и всасывание ПЭГ-4000 (в) - индивидуальные и средние значения у крыс, получавших инъекцию колхицина (Кол) шш физиологического раствора (ФР)

2 _

; 1 -

ФР Кол ФР Кол ФР Кол

* различие достоверно. Р<0.05

Таким образом, по ряду существенных особенностей (дозозависимость, адивидуальные, видовые, возрастные закономерности всасывания, эндоци-ззный механизм) всасывание ПЭГ-4000 в кишке макет рассматриваться как эдель всасывания белкового антигена. Всё это позволило использовать в альнейших исследованиях всасывание ПЭГ как показатель проницаемости ки-гчного барьера для макромолекул у лабораторных животных.

Увеличенная проницаемость кишечного барьера для ма^эсмолежул как фактср р^ска развития m«севсй сенсибилизации

Как известно, в условиях клиники достаточно трудно бывает ответить на зпрос о первичном или вторичном характере изменений барьерной функции ЖКГ ои пикевой аллергии к гастроэнтерологических заболеваниях. Глава 4 данной зботь: посвящена экспериментальному реаени:-: данной проблемы. Ь поегьго:;-эльных исследованиях было показано, что количество всасывающихся в кровь элковых макромоле кул зависит от их природы, дозы антигена, пути его вве-гния (в/ж или внутрикишечно), активности ферментов полостного пищеварения подвержено значительной внутривидовой вариабельности. Последнее обстоя-эльство было использовано в эксперименте, проведением на группе из 67 здо-эвых взрослых морских свинок, которых однократно сенсибилизировали в/ж зедениеы ОБА в дозе 300 мг/кг массы тела. Через 3 часа определяли всасы-1ние этого белка в кровь методом КРШ. Через 21 день у животных повторно

20 _

5 =

Я-а

Ж Г-

5 *

#10-

1,0.

s 0,5-

Ï.

rSl

брали кровь для определения антител, после чего вводили в/в разрешающая дозу 15 кг ОБА. Как следует из данных рис.2, в группе животных, не проявивших выраженной реакции анафилаксии, проницаемость барьера ЖКГ для OBJ достоверно снижена в сравнении с животными, продемонстрировавшими летальнух (4+) и тяжелую (3+) реакцию анафилаксии. Установлена также достоверная положительная корреляция между уровнем всасывания ОБА и последупцим ответов, специфических антител (R=+0,412, N=64, Р<0,01). С другой стсроны было показано, что в группе животных, характеризовавшихся высоким уровнем всасывания ОБА в кровь (>1000 нг/мл), отмечается в 3 раза более высокий уровень

Рис.2. Всасывание в кровь ОВА и гуморальный иммунный ответ на него у морских свинок с различной тяжестью активного анафилактического шока

ш 500 -

I 400 -<

0 300 -«

1 200 -

100 -

■s

ш т

5000 j—j

4000 | н

3000 1

2000 I

Ь юоо о

4+ 4+ и 3-1- менееЗ+ тяжесть анафилактического шока

Примечание; группы с разными буквенными индексами (з.б) различаются достоверно. Р<0.05 летальности в реакш-с. активного акафотактическсгс кокг. к е I оаза большая концентрация шфкуттуших специфических антител е сравнении с ям-вотныш с низким (менее 100 нг/мл) всасыванием антигена. Этот эксперимент показал, что количество пищевого антигена (ОВА), преодолевшее барьер ЖКГ у изначально здорового животного, действительно влияет на вероятность последующего развития состояния гиперчувствительности к данному белку. Таким образом, увеличенная (вследствие наследственных или приобретенных особенностей) проницаемость кишечного барьера для макромолекул является фактором, повышающим риск развития пищевой сенсибилизации ,что делает актуальной раз-

Лотку методов выявления увеличенной проницаемости кишечного барьера у шьных в клинике, а также поиск путей рациональней диетической тюофшакта-t и коррекции данных нарушений.

Нарушенная проиигу >.нхяь кишечнеего барьера для макромолекул при ряда □атсшагитесюае оэсгоявии в ыич.ч дддддчз Задача отыскания путей направленной коррекции состояний с нарушен-(й проницаемостью кишечного барьера требует наличия экспериментальных молей таких состояний у лабораторных животных. В данной работе была пред-инята попытка воспроизведения различных моделей состояний , сопровож-гщихся ослаблением защитней барьерной функции ЖКТ. В первой серии экспе-ментов состояние повызенной проницаемости кишечного барьера моделирова-: в состоянии местной анафилаксии, вводя ДНФ-БСА и ОВД в просвет ЖКГ ыс, однократно парентерально сенсибилизированных этими белками. В таких ловиях проницаемость барьера ЖКГ для ПЭГ-4000 была достоверно повышена у вотных, сенсибилизированных ДНФ-БСА, по сравнению с контрольными врысами. животных, сенсибилизированных однократным введением ОБА, эффекта уве-чения всасывания ПЭГ-4000 при внутрижелудочном разрешении выявить не уда-сь. Проницаемость барьера ЙКГ для ОВА у крыс, сенсибилизированных ДНФ-А, было значительно повышена_как по сравнению с несенсийилизированными, получавшими гаптен в/ж животными, так и с интактными контрольными крыса. Как показали результаты морфологического исследования, проведенного оф.И.А.Морозовым и к.м.н. Ю.А.Лысиковьм, у кгке, сенсибилизированных Ф-БСА, в слизистой оболочке тощей кишки возникали серьезные функциональ-е и структурные изменения. Спи выражались в повышенной реакции иммуно-ипетентных клеток, а такте в повреждении эпителия верхней половины всрси-:•;. На основании наблюдаемой морфологической картины южно предположить, о одной из причины повышенной проницаемости слизистой оболочки тонкой шки для макромолекул мажет Сыть нарушение целостности эпителиального аста на вершине ворсинок, вызванное анафилактической реакцией.

Проницаемость ЖКТ для ПЭГ-4000 у крыс, получавших после ыногократ-й парентеральной сенсибилизации серию внутрижелудочных "микроразрешений", ла достоверно повышена в сравнении с контрольной группой животных, а кже существенно превосходила проницаемость у несенсибилизированньк крыс, пучавших те азе "микроразрешения" (рис.3).

Состояние системной анафилаксии вызывали у крыс, многократно па рентерально сенсибилизированных ОНА, путем его последующего в/в введения дозе от 1,25 до 10 мг. Как показало определение в сыворотке крови уровь специфических антител, животные опытных групп были интенсивно сенсибилизи рованы. Из данных рис.3 следует, что у крыс, подвергнутых системной анафи лаксии, наблюдается резко повыпенная проницаемость кишечного барьера дл ПЭГ-4000. Данный эффект был стойким и воспроизводился в большом числе пс Еторных экспериментов. Г^зи этом морфологическая картина изменений в тонко кишке свидетельствует о возникновении значительных повреждений эпителиаль-

Рис.3. Проницаемость барьера ЖКТ для ПВГ-4000 у крыс, многократно парентерально сенсибигавдрованных ОВА. Группы 1-в/в разрешение (системная анафилаксию); 2-капрат1ь к группе 1 (ложнооен-сибилтированные):3- серия в/ж "микроразрешений"; 4- кошрешь к группе 3. Численность групп; 1,2-10 крыс;3.4-9 крыс

Группы с разными индексами (аД в) 2 -) различаются достоверно. Р<0.05

12 3 4

группы

ноге пласть пс ьсей длине ворсинок, что гае: приводить I: развита:: 12'тен сиькой пассивной (диффузионной) проницаемости для макромолекул.

Таким образом, в состоянии системной анафилаксии был получе стойкий, восгроизводиьый эффект увеличения кишечной проницаемости для мак рсыолекул . В силу этого данная модель широко использовалась нами в даль нейших экспериментах по влиянию алиментарных факторов на нарушенную прони цаемость кишечного барьера для макромолекул.

В результате резекции дисталького сегмента тонкой кишки крысы остающейся части кишки развивается состояние ыалабссрбции компонентов жал

чи, в т.ч. желчных кислот (Василевская Л.С.,1969). Последние, проявляя свойства ПАВ, способны оказывать "пермеабилизирующее" действие на кишечный эпителий. Результаты эксперимента показали, что у крыс опытной группы в первые 8-15 дней после операции резекции дистального отдела тонкой кишки наблюдается транзиторное увеличение проницаемости "остающегося сегмента для ПЭГ-4000 в сравнении с лсжнсоперированньыи животньми. В дальнейшем остающаяся часть кишки компенсирует нарушенный процесс рециркуляции компонентов желчи , концентрация желчных кислот в просвете кишки входит в норму и величина кишечной проницаемости возвращается к нормальным значениям.

Состояние химического колита у крыс было воспроизведено путем кратковременного внутриректального введения разбавленного раствора уксусной кислоты. Выраженные признаки колита (диарея с примесью крови) развивались на 3-4 сутки после введения кислоты. К 14 дню опыта диарея, как правило, исчезала. У крыс, забитых на 7-8 сутки после индукции колита, в нисходящей ободочной, сигмовидной и прямой кишке наблвдалась морфологическая картина, характерная для данного заболевания. У животных опытной группы через 1 неделю после индукции колита величина экскреции с мочой перррально введенного ПЭГ-4000 , выраженная в % от введенной дозы, резко (в 2,5 раза) возрастала, а затем испытывала немонотонные изменения: снижалась практически до уровня нормы через 14 дней и вновь возрастала в 2 раза к 21-му дню. При анализе проницаемости кишечного барьера с псмсщью показателя отношения экскреции ПЭГ-4000 и креатинина немонотонный характер этих изменений значительно ослаблялся, хотя по-прежнему получал статистическое подтверждение. Последний эффект можно, в принципе, соотнести с переходом состояния колита в хроническую фазу.

По своей простоте, воспроизводимости и выраженности наблюдаемого эффекта модель химического ксяита следует признать вполне пригодной для воспроизведения состояний, связанных с нарушениями барьерной функции толстой кишки в экспериментах, направленных на поиск путей коррекции этих нарушений.

В результате облучения в дозе 400 рад у крыс отмечалась транзитсрная потеря массы тела и значительный сдвиг в составе лейкоцитов крови. Достоверных изменений в уровне гемоглобина не было отмечено. К 15-му дню состав лейкоцитов в значительней мере (хотя и не полностью) нормализовался; живот-

ные нормально росли. Это указывает на обратимость патологических изменений вызываемых облучением в данной дозе. Определение проницаемости кишечног барьера через величину экафеции ПЭГ-4000 и через отношение экскреци ПЭГ-4000 и креатинина (рис.4} демонстрирует значительное, хотя и оранзитср ное увеличение всасывания индикатора через 1 сутки после облучения. Чере 7 дней после облучения величина экафеции ПЭГ-4000 с мочсй возвращалась нормальному уровню при обоих способах оценки, а через 14 суток наблюдалс ее новый незначительный подъем , однако только при выражении в % о скормленной дозы. Таким образом, при облучении *рыс гаи

Рис.4. Проницаемость кишечного барьера для ПЭГ-4000 у крыс до (-1) и через 1, 8 и 15 суток после гамма-облучения в дозе 400 рад. Численность группы- 10 животных

Время опыта, дни

Значения для групп с разными индексами (а.б) различаются достоверно. Р<0.05

ма лучами в дозе 400 рад наблодается значительное транзиторное увеличе ние проницаемости слизистой оболочки кишки для макромолекул ПЭГ-4000. Данная модель мсскет с успехом использоваться в экспериментах по алиментарно коррекции нарушенной зсишечнсй проницаемости.

Влияние алиментарных факторов на проницаемость барьера ИСТ доя макромолекул

В данной главе излагаются результаты экспериментов по влиянию различных алиментарных факторов на :проницаемость кишечного барьера лаборатср- . ных животных (крыс) для макромолекул ПЭГ-4000 и ОВА в норме и при различных патологических состояниях. Анализ данных литературы свидетельствует о возможности влияния липидного компонента рациона на проницаемость кишечного барьера для макромолекул. Ввиду этого нами было изучено влияние пищевых жиров, различающихся по соотношению количеств жирных кислот семейств оби саЗ, на проницаемости кишечного барьера крыс для ЮГ-4000 в норме и при системной анафилаксии, вызванной в/в введением разрешающей дозы ОВА сенсибилизированным животным .

Исследование проведено на 40 крысах, которые Сыпи разделены на 4 группы раЕной численности. Животных 1-й и 3-й групп сенсибилизировали ОВА. Врысы 2-й и 4-й групп не были сенсибилизированы. С 8-го по 29-й день опыта крысы 1-й и 2-й групп получали полу синтетический рацион, жировой компонент которого был представлен рабьим жиром (ЕЖ), а животные 3-й и 4-й групп- аналогичный рацион с подсолнечным маслом (ПМ). На 29-й день опыта 1фысам вводили в/в разрешающую дозу 10 мг ОВА и тестировали проницаемость кишечного барьера для ПЭГ-4000. По окончании сбора мочи крыс забивали и проводили гистсыорфологическое исследование слизистой оболочки тощей кишки. Из образцов слизистой оболочки тонкой кишки экстрагировали общие липиш по методу Фолча, переводили жирные кислоты в метиловые эфиры и анализировали их количественно методам газсскидкостной хроыатотрафии (анализ выполнен к.б.н. С.Н.Кулаковой). Исследование показало, что состав жирных клало: липкдов слизи.стсГ: оболочки тонко:': га гак: грыс, получавши: Е:' !1-я и 2-я группы), вьражено отличался от состава жирных кислот этой ткани у крыс, получавших ПМ (3-я к 4-я группы). Обращает на себя внимание значительно попиленное в 1-й и 2-й группах содержание ПНЖК с большей длиной цепи (20:5; 22:5 и 22:6) и пониженное содержание линслевой (18:2) и арахидоно-вой (20:4) кислот по сравнению с 3-й и 4-й 1руппами. Как показали результаты морфологического изучения тонкой кишки животных сенсибилизированных групп , в ней возникают значительные структурные и функциональные изменения. Сни выражаются в отеке всей кишечной стенки, отслойке эпителиального

пласта на значительном протяжении , резком расширении »ровеносных капилляров, уменьшении высоты кишечных ворсинок и увеличении глубины крипт, выраженной иммунной реакции. Только у крыс , получавших ЕЖ, отмечено развитие в результате реакции анафилаксии палипоподобных структур кишечного эпителия , являющихся близкими морфологическими аналогами образований, наблюдаемых у бальных с тяжелыми формами целиакии и кишечной мальабсррбцик (Ю.А.Лысиков, 1995) .

У несенсибилизированных крыс, потребляющих рацион с ЕЖ, отмечено неблагоприятное увеличение проницаемости защитного барьера ЖКГ в отношении макромолекул ПЭГ-4000 в сравнении с животными, получавшими ПМ. Аналогичная тенденция отмечалась и у сенсибилизированных животных.

Механизм влияния липидного компонента рациона на кишечную проницаемость мсжет определяться изменениями в синтезе эйкозаноидов (особенно, производных арахидоновой кислоты, таких как PGE2). В этсал плане действие рациона с ЕЖ в известной степени можно уподобить эффекту нестероидных противовоспалительных препаратов, антагонистов циклооксигеназы (Bjamason, 1989). С другой стороны, потребление Ж, богатого ПКЖК с высокой степенью ненасыщенности (5 и б двойных связей), мажет способствовать усилению пере-кисных процессов е ткани кишки.

Эксперименты по влиянию некоторых свободных аминокислот на проницаемость кишечного барьера у ксес в норме и при системной анафилаксии были проведены нами совместно с Р.А.Ермекпаевой. имевшиеся данные литературы свидетельствуют о возможном нормализующем действии глутамина (Глн) на величину кишечной проницаемости для макромолекул . Однако в большинстве исследований эту аминокислоту вводили животным в/в е составе смесей для парентерального гавани.-. Е наазк экспериментаг крксь: получали Глн в/г через зонд ь дозе 1СС кг/декь г течение 14 дней. Как следует из полученным данных, всасывание ПЭГ-4000, выраженное в % от введенной дозы, у сенсибилизированных животных, получавших добавку Глн, было незначительно (на 22%) ниже, чем в контроле, что однако не получило подтверждения при оценке экскреции ПЭГ-4000 на 1 ммоль креатинина и может быть объяснено, тем самым, за счет депрессии экафеторной функции почек. У несенсибилизированных крыс прием Глн приводил к существенному (на 35%) снижению кишечной прони-

цаемости при оценке б % от введенной дозы ПЭГ-4000. При оценке на 1 ммоль креатинина мочи данный эффект, однако, не бьш установлен.

Действие глутаыиновой кислотыи ее солей на трофический статус кишки в значительной степени аналогично действию Глн. Кроме того, Глу, будучи . нейромедиатором, способна, в "принципе, оказывать действие на функционирование периферической нервной системы ЖЕСТ, контролирующей его барьерную функцию . В наших экспериментах было изучено влияние приема крысами добавки мононатрийглутамата (МНГ) на проницаемость кишечного барьера для мзкрсмо-лекул в норме, при системной анафилаксии и в состоянии химического колита. В первой серии опытов МНГ вводили крысам в/ж в количестве 100 мг/день в течение 14 дней. У перенесших анафилаксию животных, получавших МНГ, отмечено снижете проницаемости кишечного барьера для ПЭГ-4000 по сравнению с не получавшими этой добавки. У несенсибилизированных крыс влияние МНГ на кишечную проницаемость для ПЭГ-4000 было неблагоприятным (увеличение) .

Во второй серии экспериментов вводимая доза МНГ была снижена до 50 мг/день (2500 мг/кг массы тела) . Ввиду неблагоприятного действия данного Еешества на процесс сенсибилизации, исследование было проведено нами на модели химического колита. Крысы опытной группы получали МНГ в течение 9 дней, после чего у них индуцировали химический колит и продолжали кормление препаратом еще 7 дней. На заключительной стадии эксперимента у животных тестировали проницаемость кишечного барьера для ПЭГ-4000 и ОВА. Потребление МНГ в указанной дозе привело к существенному снижению проницаемости кишечного барьера для ПЭГ-4000 как у контрольных, так и у страдающих колитом животных (Рис.5) . С другой стороны, прием МНГ вызывал снижение проницаемости кишечного барьера для ОВА только у здоровых, но не у страдахизс-: каиггся-.: животных. Причина такого расхождения мажет быть связана с тем, чтс СЕЯ является индикатором проницаемости , главным образом, в тонкой кишке, тогда как ПЭГ-4000 - также и в толстой. Нормализация трофического статуса толстой кишки, вызываемая приемом МНГ животными с колитом, сказывается, тем самьм, на проницаемости для ПЭГ-4000, но не ОВА. Полученные во 2-ой серии опытов данные показали, что прием МНГ может быть эффективен при коррекции нарушенной кишечной проницаемости в состояниях, не связанных непосредственно с явлениями аллергической сенсибилизации. Существенно, однако, что при повышении дозы МНГ с 50 до 100 мг в

Рис.5. Показатели проницаемости кишечного барьера для ПЭГ-4000 у страдающих химическим колитом и нормальных крыс, получавших рацион с добавкой мононатрийглутамата или контрольный рацион.

комг Mf мирсжъ Mf«cnv ют Mi" кнрсгъ

Группы Группы

день его влияние на кишечную проницаемость да-ке у здоровых животных мсяоет изменить знак - с позитивного на неблагоприятное . Таким образом, использование добавки МНГ для коррекции нарушенной МП в условиях клиники имеет известные перспективы, но требует дальнейшей практической прсработки.

В наших экспериментах было изучено влияние на кишечную проницаемость у крыс добавки кристаллической аминокислоты гистидина (Гис) в норме и в состоянии системной анафилаксии. При этом нами был использован препарат Гис фирьи "Кеапа1" хроыатографической степени чистоты. Данные о летальности реакции анафилаксии, ответе антител г. СБА и экскреторной функции почек свидетельствуют о резко отрицательно!/, влиянии добавки на сенсибилизированных животных. Что же касается собственно влияния Гис на проницаемость килечного барьера в данной серии опытов, то эффект, наблюдаемый у сенсибилизированных крыс, нельзя было считать достоверным из-за малого числа тестированных животных (высокая летальность), а у несенсибилизированных крыс достоверного влияния ГМс на кишечную проницаемость не удалось выявить.

Добавку триптофана в дозе 58 мг/день вводили крысам в/ж в течение 14 дней, предшествующих индукции реакции системной анафилаксии. Введение Трп в рацион приводило к значительному увеличению проницаемости слизистой

оболочки тонкой кишки для ПЭГ-4000. Показатели всасывания ПЭГ-4000 и отношение ПЭГ/креатинин Сыпи выше у крыс, получавших Трп, как в сенсибилизированной группе, так и в несенсибшмзированной, причем в последнем случае различие было высоко достоверные. (Р<0,01).

Таким образом, исследования показали далеко'-не однозначное влияние свободных аминокислот на проницаемость защитного барьера ЖКТ у крыс в норме и при патологии . Разработка аминокислотных добавок к специализированным пищевым продуктам гипоаллергенного спектра действия требует дальнейшей экспериментальной проработки с-учетам специфики конкретного продукта, типа добавки, ее происхождения и степени чистота. Особое внимание следует уделить наличию в продуктах этого ряда свободного Трп.

Значительный интерес представляет возможность коррекции нарушенной проницаемости кишечного барьера под действием белкового компонента диеты. Повышение квоты легкоусвояемого белка в рационе должно приводить к улучшению трофического статуса тканей кишки и, как следствие, к активизации репаративн^гх процессов, а также мсясет способствовать усилению синтеза ан-тиоксидантных защитных факторов. В качестве белкового компонента е наших экспериментах был использован концентрат сывороточных белков коровьего молока КСП, получаемый из экологически чистого молочного сырья по технологии пектинового фракционирования. В отдельных экспериментах был также тестирован белковый концентрат производства ВНИМИ - КСБ, вырабатываемый из подсырной сыворотки и характеризуемый близким к КСП составом и пищевой ценностью. Ранее было показано, что КСП проявляет свойства высокоэффективного адаптогена и радиопротектора (Бутров С.А. и др., 1992).

Исследование влияния КСП и его фракций на проницаемость кишечного барьера в норме провопили у крыс, которые получали данный концентрат или егс высокомолекулярную (ЕМ; и низг.омолекулярную (НМ* фракции в дозе, эквивалентной 100 мг/день нефракционированного препарата. КСП разделяли на ВМ и НМ фракции путем тангенциальной ультрафильтрации через мембрану "Míllipore" (США), которая пропускала соединения с Мг <12 кД. Влияние пектина на кишечную проницаемость было так*е тестировано у отдельной группы крыс, которые получали по вышеуказанной схеме данный полисахарид в дозе 50 мг/день. Прием несенсибилизированньали крысами НМ КПП не приводил к достовернее/ изменению проницаемости кишечного барьера для макромолекул ПЭГ-4000

при оценке в % на 1 ммоль креатинина. Потребление КСП и его ВМ фракции при водило к увеличению кишечнсй проницаемости. Эффект ВМ-КСП был более небла гоприятен, чем воздействие цельного КСП. Прием крысами чистого пектин 1файне неблагоприятно сказывался на состоянии барьерной функции кишк (проницаемость возрастала более чем в 5 раз). Последнее хорошо согласуете с данньми литературы (ЕХБепЬапз, 1989) о тем, что прием больших количест некоторых пслисахаридров, в тем числе пектина, может неблагоприятно сха заться на барьерной функции ЖКТ.

Вместе с тем, результаты определения проницаемости кишечного барьер для ПЭГ-4000 у крыс в состоянии системной анафилаксии, представленные табл.1, свидетельствуют о том, что животные, получавшие КСП и его фракции характеризуются гораздо меньшей степенью нарушения барьерной функции ЖКГ сравнении с получавшими раствор НаС1. При выражении в % экскреции :ПЭГ 4000 на 1 ммоль креатинина проницаемость снижается в 2 раза при прием НМ-КСП и в 3 и более раза - при приеме КПП и ВМ КСП. В последних двух сод чаях наблюдается практически полная нормализация проницаемости. Таю: образам, в период сенсибилизации применение препарата КСП позволяет значительной мере предупредить нарушение защитного барьера кишки. Даннь эффект определяется, по-видимому, белковой и пептидной фракцией препара та , тогда как воздействие пектина на кишечную проницаемость является не благоприятные.

Таблица

Экскреция креатинина и проницаемость барьера кишки для ПЭГ-4000 у крыс, сенсибилизированных ОВА и находящихся в состоянии системной анафилаксии, получавших КСП и его фракции

NN групп Число животных Добавка к рациону Креатинин мкмоль/18ч Экскреция ПЭГ-4000

%от введдозы 'л. на 1 ммоль креатинина

I 9 плацебо 42+4 0,72+0,04# 24,1+5,0#

2 8 КСП 70+7* 0,46+0.05* 7,2+1,2*

3 10 ВМ-КСП 63+5* 0,40+0,12* 8,2+1,5*

4 10 НМ-КСП 57+3* 0,68+0,08# 11.9+1.7*#

* Различие с группой I (плацебо) достоверно, Р<0,05

#Различие с соответствующей несен сибилюированной группой достоверно, Р<0,05

У крыс, подвергнутых внешнему гамма-облучению, было изучено влияние приема КПП и его аналога КПБ на величину проницаемости кишечного барьера для макромолекул ПЗГ-4000 и ОБА. КПП и КСБ вводили крысам в/ж в дозе 100 мг в изотоническом растворе NaCl в течение 13 дней, предшествующих облучению, в день облучения и на следусшие сутки, непосредственно перед тестировании« кишечной проницаемости. Как следует из данных, представленных на рис.6, прием КПП приводит к практически полной нормализации проницаемости кишечного барьера для ПЗГ-4000 через 1 сутки после гамма-облучения. Аналогичные образец сказывается прием КСП на проницаемости, кишечного барьера для ОБА у облученных животных. Потребление ЮЗ приводило к снижению проницае-

Рис.6. Влияние введения добавки КСП в рацион облученных в дозе 700 рад крыс на проницаемость кишечного барьера для ПЭГ-4000. Численность групп-по 10 крыс. Группы с разными индексами (а,Ь) различаются достоверно, Р<0.05

cerwm кмрп» ая*сп кояртъ

HW Г1МТЫ

меетт Ьзрьера !КС для ПЗГ-4С0С сСяучэаас' крыс, не не у зесосбы:: животных. Механизм влияния КСП на барьерную функцию ЖКГ мажет быть обоснован в свете косвенных данных о влиянии этого концентрата на гистохимический статус тканей яивотных в норме и при облучении (данные получены к.м.н. С.Н. Радченко). Прием КПП вызывал в различных тканях организма однонаправленные сдвиги метаболизма, которые могут Сыть интерпретированы как эффективное улучшение трофического статуса тканей._ Следствием таких изменений мажет Сыть ускорение репаративных процессов в период после облучения.

Как и в случае воздействия КПП на проницаемость на модели системной анафилаксии, его эффект на модели облучения мажет "быть связан с белковьы компонентом концентрата. Высокая биологическая ценность сывороточных белков (особенно АЛА коровьего молока) позволяет, вероятно, значительно улучшить снабжение тканей рядом аминокислот, важных для поддержания трофического статуса.

Сохранение барьерной функции кишки в неблагоприятных условиях в значительной степени зависит от статуса ее антиоксидантной системы, важным компонентом которой является селен-зависимая глутатионпероксидаза. В этой связи представляет интерес возможность коррекции нарушенной проницаемости кишки с помощью микроэлементной добавки Бе, вводимой в состав рациона крыс из расчета 2 мг Бе на 1 кг. В первой серии экспериментов была использована такая добавка в виде препарата дрожжей, обогащенных Бе. Определение проницаемости барьера кишки для ПЭГ-4000 показало наличие вьра-женной тенденции к снижению всасывания индикатора у крыс, получавших Бе , в сравнении с получавшими только дрожжи. Это различие, однако, не получило убедительного статистического подтверждения (Р>0,05). Причиной недостаточной выраженности эффекта, создаваемого введением добавки Бе, является неблагоприятное воздействие на кишечную проницаемость выбранного носителя (дрожжей) самого по себе в сравнении с группой животных, получавших плацебо. Ввиду этого нами был предпринят эксперимент по влиянию добавки Бе в форме обогащенной этим микроэлементом водоросли спирулины на проницаемость кишечного барьера у крыс в состоянии системной анафилаксии. С учетом наличия тесной связи биохимического механизма действия Бе пищи со статусом восстановленного глутатиона (СБН), бьшо одновременно охарактеризовано его влияние на проницаемость кишки при пероральном приеме сенскб;:лкзиро»анными ОВД крысами. Б течение 4 дней, предшествующих введению разрешающей дозы, животные 1-ой опытной группы получали в/ж по 75 мг восстановленного глутатиона (СБН), а крысы 2- й группы в добавление к этому - препарат спирулины, обогащенной Бе в выпеуказанной дозировке. Введение добавки С£Н в состав рациона приводило к достоверному увеличению его концентрации в слизистой оболочке кишки в сравнении с контроль ныли амвотньми, получавшими плацебо. Дальнейший рост концентрации КЗН отмечен у крыс, получавших дополнительно к СБН добавку Бе. В группе крыс, получавших добавку Бе, от-

мечено снижение проницаемости кишечного барьера, вьраженной в % экскреции ПЭГ-4000 на 1 ьллоль креатинина в сравнении с группой, получавшей только добавку СБН (различие достоверно, Р<0,03, критерий медианы) . В относительном выражении это снижение составило 26%, что близко к эффекту, проявлен- . ному добавкой Бе в первой серии экспериментов. Различий в проницаемости для ПЭГ-4000 между крысами, получавшими только СБН, и плацебо выявлено не было. Представленные данные указывают на перспективность дальнейших исследований по влиянию микроэлементной добавки Эе на проницаемость кишечного барьера для макромолекул при различных патологических состояниях, связанных с развитием оксидантного стресса.

Серия экспериментов была посвящена характеристикам нарушения проницаемости кишечного барьера для белковых макромолекул при отдельных формах алиментарных дефицитов. В литературе имеются косвенные данные о возможном влиянии дефицита ретинола на функциональное состояние кишки и ее проницаемость. В наших экспериментах, проведенных совместно с д.м.н. И.Я.Конем и к. к. к. С.И. Хзылей, оценивали проницаемость кишки крыс для макромолекул ОЗА в условиях глубокого дефицита ретинола. Всасывание ОБА в кровь определяли по методу КРИК. Одновременно у животных обеих сравниваемых групп проводили электронномикроскопическое исследование морфологии энтероцитов тонкой кишки с использованием трейсера-коллоишого гидрокси-да лантана. Полученные результаты свидетельствуют о значительно повышенной проницаемости кишечного барьера для ОБА у крыс, недостаточно обеспеченных ретинолом, в сравнении с нормально обеспеченными. При этом согласно морфологическим данным отмечалась очень слабая развитость апикального гликока-ликса у крыс, страдающих от дефицита ретинола. Причина данного явления, вероятно, заключается г том, что зти:. жсвстнсг-: наоушапгс.* костальные пос-цессь: постраксляционной сборки макромолекул гликопротеиное апикальной мембраны. Б свою очередь, слабая развитость или отсутствие гликокаликса приводят к ослаблению сорбции на нем пищеварительных ферментов и к выпадению стадии эндовезикулярного мембранного пищеварения.

В литературе имеется ряд данных о возможности нарушения барьерной функции ЖКТ в отношении макромолекул при различных алиментарных нарушениях, в тем числе при белково-калорийной недостаточности питания. Вместе с тем, данные о влиянии полного голодания на проницаемость кишки для макремо-

лекул в доступной нам литературе отсутствует. Этот вопрос, тем не менее, представляет большой интерес, поскольку практически полное голодание широко используется как главный лечебный прием при разгрузочно-диетической терапии (РДГ), в тем числе у больных аллергическими расстройствами. Эксперименты по влиянию полного голодания на проницаемость барьера ЖК1Г для макромолекул ОБА Сипи проведены нами совместно с к.м.н. Л.А.Михайловым на модели морской свинки . 3 группы животных голодали перед в/ж введением 300 мг ОБА в течение 12 (контроль), 48 и 96 часов соответственно. Концентрацию ОВА в сыворотке крови определяли методам КЕИМ. В результате показано, что у животных, голодавших в течение 48 ч, отмечается тенденция к повышению уровня всасывания ОВА. У морских свинок, голодавших 96 часов, отмечается значительное (более, чем двукратное) повышение проницаемости кишечного барьера для белкового антигена (Р<0,025, критерий Мана-Уитни). Средняя по группе величина всасывания ОВА практически линейно коррелировала со временем голодания №=0,997, Р<0,001). Таким образом, при полном голодании, как и при ряде других нарушений питания (белково-калорийньй дефицит, некоторые авитаминозы) наблюдается существенное ослабление барьерной функции ЖКГ.

Сиешса проницаемости барьера ЖКГ для белковых маррсмолекул в клинических условиях

В свете полученных в экспериментальных главах данных представляется актуальной задача разработки и внедрения в клиническую практику методов выявления нарушенной проницаемости барьера ЖКГ для макромолекул как для целей диагностики, так и для назначения элиминационных или гипоаллерген-ных диет, а также проведения комплексного медикаментозного и физиотерапевтического лечения. В качестве индикатора кишечной проницаемости у взрослы-: 6слъкы>: в капле-: исследования:: был использован ОВА, который принимал!: натощак в составе 2-3 сырых куриных яиц.

В первой серии исследований нами были использованы радиоиммуносср-Оентные методы выявления ОВА и ОВА-ссдержащих иммунных комплексов (ИК) в сыворотке крови больных. Наибольшие средние уровни ОВА и ИК выявлены в группах больных, страдапцих аллергическими заболеваниями, сочетаниями с поражениями ЖКТ. Повывенное содержание ОВА в крови обнаружено как у больных гастродуоденитом, так и хроническим энтеритом; особенно высокие уровни установлены у больных хроническим еюнитаы. Вместе с тем, в группе больных

ллергическими заболеваниями с преимущественным поражением респираторного ракта уровни ОЕА, ИК и частота их выявления практически не отличались от юнтрсля. Закономерности для выявляемых средних уровней ИК и свободного ОЕА ачественно совпали во всех обследованных группах, однако частота полсжи-'ельных реакций на ИК была систематически выше, чем на свободный ОВА. Дичина этого, по-видимому, состоит в тем, что практически у всех больных в 98-100% случаев) были выявлены циркулирующие антитела к ОВА.

Во втором цикле исследований нами были сопоставлены величины прони-[аемости кишечного барьера для ОВА в группе больных с имеющимися по-яжениями пищеварительного тракта в зависимости от наличия у них ал-[ергических реакций на пищу (пищевая аллергия, ПА) и нарушения микробиоце-юза ЖКГ (дисбактериоз.Д). Всасывание ОВА определяли путем ИФА. Как этедует из данных табл.2, в группе больных, страдающих ПА, отмечается достоверно большая средняя концентрация ОВА и % его выявления в сравнении с ■еми обследуемыми, у которых ПА отсутствует. В эту последнюю группу вошли свое больных, страдающих неспецифическим язвенным колитом и 1 больной

Таблица 2

Средние, крайние и медианные значения уровней ОВА и % его выявления в сыворотке крови больных через 4 ч после моральной нагрузки 2 куриными яйцами

Мп/п Группы Число Уровни ОВА в сыворотке крови нг/мл

больных больных _

(*) М+т Медиана Разброс %выяв-

значений ления

1. ПА имеется 21 11,8 +3,1а 5,0 а 0-91,2 76

!. ПА отсутствует 20 3,1 +1,36 Об 0-17.0 35

i ПА.сочетанная с Д 10 16.1 +4,9а 8.9 а 0-91.2 90

t. Д имеется 3! 8.0 ±;.Зао 3.2 аб 0-91.2 55

Д отсутствует К' 5.5±2.3ао 2.8 аб 0-23.0 6fi

Нарушенная се- 11 12.3 +5.1аб 4.6 0-91.2 46

креторная фун-

кция желудка

) Сокращения: ПА- пишевая ачлергия; ХК- хронический колит; Д-дисбактерноз

*) значения с несовпадающими буквенными индексами различаются остоверно (Р<0,05)

еязвенньм колитом и дуоденитом, у которых уровень ОВА в крови также до-ольно велик (17; 17 к 13,8 нг/мл, соответственно). У остальных больных

этой группы всасывание нераацепленного ОБА в кровь является очень низким (не выше б нг/мл) . Наиболее часто повышенные концентрации ОБА в крови встречались в группе больных с ПА, сочетаннсй с Д (группа 3) . У этих больных ОБА был выявлен в крови в 90% случаев. Показатели всасывания ОНА в группах 4,5 и б имели промежуточное значение мезду труппами 1 и 2. У бальных со сниженной секреторной функцией желудка (группа N б) наблвдалась тенденция к увеличению всасывания ОБА в сравнении с группой № 2, однако это различие не получило статистического подтверждения ввиду малочисленности группы № 6. Таким образом, при анализе данных для группы больных, страдающих функциональными нарушениями пищеварительного тракта, выявляется значительная гетерогенность по показателю величины кишечной проницаемости для ОНА, причем отмечается выраженная взаимосвязь нарушенной проницаемости с развитием сочетанных с основным заболеванием аллергических состояний .••

Выполнение теста с нагрузкой белксм куриных яиц у детей раннего возраста не представляется возможным ввиду значительного потенциального риска сенсибилизации и инфицирования. Поэтому в наших исследованиях был применен метод оценки всасывания в кровь АЛА . В 1-ом цикле исследований было проведено тестирование кишечной проницаемости для АЛА у детей в возрасте до 2 месяцев, не страдающих специфической аллергической патологией. Всего было проведено 160 индивидуальных тестирований проницаемости барьера ЖКГГ для АЛА у 94 детей, в тем числе у 66 повторно. Выявленные в сывсротке крови концентрации АЛА варьировали от 0 до 95,5 нг/мл, медиана по всей совокупности данных составила 12,3 нг/мл. В дальнейшем величины всасывания АЛА выражали в единицах, учитывавших различие в дозе молока и массе тела ребенка:

Всасывание(ед) = [АЛА] (нг/мл) * [масса тела(кг) ] / [объем молока, (мл). Результаты исследования свидетельствуют о том, что существенных различий в проницаемости для АЛА между группами детей различного гестацион-ного возраста нет. С возрастем происходит снижение проницаемости для АЛА в среднем в 2 раза. Ввиду значительного разброса индивидуальных данных эта закономерность наглядно выявляется при попарном сравнении проницаемости при 1-см и 2-ом тесте с использованием критериев Вилкоксона, Ман-на-Уитни и Стыэдента в натуральной и логарифмической форме. Определение коэффициентов корреляции по Спирыену между возрастем ребенка при тестиро-

шии и величиной проницаемости дает достоверные отрицательные знания г=-0,287 (р<0,016) и г=-0,432 (р<0,0005) при 1 и 2 тесте соответ-гвенно. Эти данные свидетельствуют о том, что проницаемость кишечного 1рьера с возрастем по мере созревания у ребенка барьерной функции ЖКГ покается, что согласуется с. многочисленными данными литературы. Верхняя >аница нормы (M+2s) проницаемости для АЛА в группе детей без специфической астроинтестинальной патологии составила 2,05 и 1,07 единиц при 1 и 2 тесте ххгветственно. Анализ проницаемости ЖГ у детей с различной патологией ¿явил, что достоверно повышенный уровень всасывания АЛА наблюдается толь> у детей с генерализованными гнойно-воспалительными заболеваниями.

На втором этапе данного исследования тестирование проницаемости ки-гчного барьера для АЛА было осуществлено у детей 1-го месяца жизни, стра-акхцих некоторым формами специфической гастроинтестинальной и аллергической ггалогии, а такке в контрольной группе условно здоровых пациентов этого ззраста. Из данных рис.7 следует, что средние величины всасывания АЛА во :ех группах при первом тестировании достоверно не различаются. Это мажет ггь связано с тем обстоятельством, что при проведении 1-го теста (5-7 дней зни) возможные патологические процессы в ЖКГ, обусловленные воздействи-1 неблагоприятных факторов внешней среды, не успевают развиться. Вместе с iM, при втором тестировании отмечаются достоверно повышенные средние личины всасывания АЛА в группах детей с аллергическими проявлениями, диа-;ей и в группе, получающей гормональную терапию, в сравнении с группой жтроля. Существенный интерес представляют данные о динамике изменения плечной проницаемости. Как следует из рис. 7, во всех группах, за ис-ючением группы детей с аллергическими проявлениями, средняя величина :асквания АЛА снижается с Еозрастом ребенка. Однако во Есех группах ¡льны: эгс ежггение существеннс. слаое- выражено, чем ь контроле. Ь гртп-! детей, страдаших аллергическими проявлениями, не происходило снижение «дней величины всасывания АЛА, а наоборот имелась тенденция к её повыше-ю. У большинства обследованных детей (70%) всасывание АЛА снижалось с 'Зрастом. Однако, на этом фоне в 30% случаях отмечалась "инверсия", е. увеличение проницаемости кишечного барьера с возрастом ребенка, и анализе случаев "инверсии" в группах детей, распределенных по сроку стации, какой-либо закономерности выявлено не было. С другой стороны,

при рассмотрении случаев "инверсии" проницаемости в группах детей, разделенных по наличию патологических состояний (рис.7),- видно, что наибольшие процент инверсий (55,6%) набявдался у детей с аллергическими проявлениями, а наименьший у детей контрольной группы (12,5%). Эти различия статистически достоверны (Р < 0,05).

РИС.7. Всасывание АЛА в кровь у детей раннего возраста

1 Кенфагъ 2Ащпя ЗДч*и

4 Ву мфцфовне 6 вупгофофсэдерея бВумфцфсвамиевдфеп Лщттгре/ноапаю» ■

Ш 1-й тест ю 2-й тест

НаНя групп

0:Ф;010!©;©ЮГ

^Различие с контролем достоверно; Р<0,05

Таким образом, иммуноферментный тест позволяет выявить существенное повышение проницаемости кишечного барьера для макромолекул АЛА при некоторых вида:-: кеонаталькой патологии. Проведение этого теста, вместе с тем, встречает на практике ряд трудностей, особенно, у бальных на амбулаторное приеме. В связи с этим, большое практическое значение продолжай; сохранять теста, позволяющие судить о величине проницаемости кишечного барьера пс косвенньы показателям, в первую очередь, по величине ответа специфические антител. Применительно к диагностике пищевсй сенсибилизации у детей первых лет жизни нами был охарактеризован метод иьллуноферментного определения специфических антител класса 1дС к белкам пищевьк продуктов. Результата оценки клинико-диагностической значимости данного теста показали его хоро-

1ую применимость при диагностики целиакии и непереносимости белков коровье-ю молока у детей первых лет жизни.

Поступление белковых анжгенсв пиар* в женское молоко

Феномен поступления антигенных белков пищи в женское молоко тесно . яязан с проблемой проницаемости кишечного барьера. Еместе с тем, количественный аспект этого явления и его клиническое значение охарактеризованы в мтературе недостаточно полно. В настоящем исследовании были количественно >ценены уровни белковых антигенов пищевых продуктов (БСА, БЛГ и ОВА) в "shckqm молоке с использованием КРИМ. Результаты определения уровней анти->енов в 256 пробах женского молока, полученных от 216 женщин на разных роках лактации, показали, что ни в одной из проанализированных проб хруд-юго молока антигены не были выявлены в концентрации выше 200 нг/мл; их редний уровень был весьма низок и варьировал от 4 нг/мл (БСА в молозиве) го 30 нг/мл (ЕПГ в переходном молоке). Сравнение среднего уровня и частоты 1ыявления БСА и ЕПГ в молоке на различных сроках лактации показывает, что ¡аиболее высокие концентрации обоих белков характерны для переходного моло-:а. Максимальный средний уровень и частота выявления в молозиве и переход-[ом молоке были характерны для БЛГ, минимальный - для ЕСА. Средний уровень г частота выявления антигенов в зрелом молоке были низкими, причем [ескслько большими для ОВА, чем для БСА и ЕЯГ. Путем анализа фактического итания анкетно-опросным методом (исследование проведено к.м.н. 1.В.Плошинской) было выявлено, что избыточное потребление коровьего молока ^ответствовало повышенному поступлению в грудное молоко только ЕПГ, но ¡е БСА. Что же касается ОВА, то взаимосвязь его уровней в молоке с числам ютреЬляемьк куриных яиц имелась, но была недостаточно четкой. Возможно, :сточником ОЗА, определяемого в женском молоке, являются как собственно :уриные яйца и блюда из них ,так и различные продукты с добавлением яичного елка. В группе матерей с наличием признаков пищевой гиперчувствительности [аблюдаюгся большие средние уровни и частоты выявления БЛГ, ОВА и БСА в юлоке по сравнению с группой клинически здоровых женщин. Для БСА это раз-ичие в обследованной популяции статистически высоко достоверно. При этом группе матерей, у детей которых были выраженные клинические сиыптсыы ищевой гиперчувствительности, наблюдалась достоверно большая частота ыявления БЛГ в молоке и более высокий его средний уровень.

В дальнейшем нами было проведено проспективное исследование в группе 50 матерей и их новорожденных . Была выделена группа риска .{26 женщин) и контрольная группа (24 женщины). Критериями для выявления 1руппы риска служили наличие наследственной аллергической предрасположенности в анамнезе и содержание общего 1дЕ в пуповинной крови выше 0,3 ед/мл. В группе риска патологическое течение беременности в виде позднего токсикоза, угрозы прерывания встречалось в 2 раза чаще. ОБА в грудном молоке бьга выявлен у матерей группы риска с частотой вдвое большей, чем в контрольной группе. Впоследствии у 7 детей группы риска (27%) и 2 детей контрольной группы (8%) отмечались аллергические проявления при естественном вскармливании. При этом были проанализированы клинико-иммунологические данные от 7 детей и их матерей с наличием выраженных аллергических проявлений на естественном вскармливании (1-я группа; все они входили в 1руппу риска) и 22 здоровых детей и их матерей без аллергических проявлений на грудном вскармливании (2-я труппа) (рис.В). Остальные пациенты после 1-го этапа исследования были исключены из рассмотрения виду перевода детей частично

Рис.8.7. Содержание ^Е. гистамина и антигенного ОБА в грудном молоке женщин 1-й и 2-й групп. * -различие достоверно. Р<0.01

Группа 1

Группа 2

^Е, % выявления

ОВД в грудном молоке

40 -30 -

5 20 -I

О 10.

-5-

1-ая 2-ая

Группы

400300200 100-1 0

Уровеаь гнсташша ягУмл

Грчтша 1 ©

ОВА, % выявления

Группа 2

«ли полностью на искусственное вскармливание. Как следует из данных рис.8, токазатель выявления ОБА в женсксм молоке был достоверно выие в группе 1 в сравнении с группой 2. В группе 1 отмечалась также более высокая частота зыявления обших 1дЕ и более высокий уровень гистамина в молоке в сравнении : группой 1. Полученный результат свидетельствует О тем, что при выделении группы риска по развитию аллергических реакций при грудном вскармливании наряду с 1фитериями наследственной предрасположенности, ослсяменного течения беременности, повыпенных уровней 1дЕ в пуповинной крови и копрофильтра-гах новорожденных следует включать также и показатель уровня пищевых антигенов и , в частности, ОВА в грудном молоке.

внведа

I. Полиэтиленгликсль (ПЭГ) -4000 при внутрижелудочном введении лабораторным кивотным позволяет тестировать проницаемость барьера их желудочно-кишечного гракта для макромолекул по величине экскреции этого соединения с мочой. Зсасывание ПЭГ в кишке в значительной мере опосредуется активным механизмом : участием цитоплазматических микротрубочек энтероиитов. Проницаемость ки-печного барьера для полиэтиленгликсля (ПЭГ)-4000 по ряду своих характеристик (зависимость от вводимой дозы, возраста, вида животного, индивидуаль-1ых особенностей организма) воспроизводит проницаемость для макромолекул Зелка.

I. У морских свинок с увеличенньм (свыше 1000 нг/мл) всасыванием антигенного овальбумина в кровь отмечается в 3 раза более высокий уровень леталь-■юсти в реакции активного анафилактического шока и в 3 раза большая концентрация циркулирующих специфических антител в сравнении с животными, сарактеризуемлди низким (менее 100 нг/мл) всасыванием антигена. 3. В экспериментах на гоысах воспроизведены модели патологических состояла, сопровождающихся увеличенной проницаемостью кишечного барьера для ааюрсмолекул ПЭГ-4000 и (или) белков: местная анафилаксия кишки при сенсибилизации динитрофенилированным белксы, системная анафилаксия, состояние мальабссрбции желчных кислот после резекции сегмента тонкой кит-си, химический колит.

1 .Изучены изменения проницаемости кишечного барьера для макромолекул овальбумина и ПЭГ-4000 у крыс, подвергнутых внешнему ^-облучению при поглощенной юзе 400 рад. Через 1 сутки после облучения всасывание ПЭГ-4000 возрастает

в 2 раза в сравнении- с необлученными животными. В последуйте 7 сут отмечается самопроизвольная нормализация кишечной проницаемости.

5.У крыс, потребляющих в течение 3 недель полусинтетический рацион, с держащий 20% по калорийности рыбьего жира с соотношением ПНЖК о)6/( равным 0,6, отмечается достоверное увеличение проницаемости кишечного б рьера для макромолекул ПЭГ-4000 в сравнении с животными, получающими э; Бивалентное количество подсолнечного масла с соотношением ПНЖК об/шЗ ра ным 64. Возрастание проницаемости коррелировало со снижением уровня арах доновой кислоты в липидах слизистой оболочки тонкой кишки.

6.При введении в рацион сенсибилизированных крыс в течение 14 ней добав! глутамина и гистидина не выявлено достоверной нормализации проницаемое кишечного барьера при системной анафилаксии. Потребление крысами добав] аминокислоты триптофана в дозе 230 г/кг в течение 14 дней приводило значительному увеличению проницаемости кишечного барьера для макромалек: ГЭГ-4000 как в норме, так и в состоянии системной анафилаксии. При< мононатрийглутамата в дозе 200 мг/кг массы тела вызывал достоверное сш жению проницаемости барьера ЖКГ для ПЭГ-4000 у нормальных и у стр; даших химическим колитом крыс в 1,7 и 2 раза соответственно.

7. Введение в рацион сенсибилизированных овальбумином крыс добавки koj центрата белков коровьего молока КСП в квоте до 5% "от общей калорийности а также эквивалентных количеств его высокомолекулярной и низкомалекулярнс фракции приводило к снижению проницаемости кишечного барьера для ПЭГ-40( на 71;66 и 51% соответственно. Потребление КСП и его аналога КСБ, полз чаемого из подсьрной молочной сыворотки, снижало в 1,6-2 раза нарушение проницаемость кишечного барьера для ПЭГ-4000 и овальбумина у крыс, под вергнутых внешнему у-облучению.

8.Потребление крысами добавки биологически доступного селена в количеси 2 мг/кг рациона приводило к частичной нормализации проницаемости кишечно1 барьера для 1ВГ-4000 в состоянии системной анафилаксии.

9.Проницаемость кишечного барьера лабораторных животных для макромолек^ овальбумина достоверно увеличивается в результате длительного nornioi голодания, а таксе при дефиците витамина А. Механизм нарушения кишечног барьера в последнем случае мажет быть связан с дефектом гликозилировани апикальных мембран энтероцитов.

10.Проницаемость кишечного барьера для белковых макромолекул повышена у ззрослых больных, страдающих воспалительными заболеваниями тонкого и толстого кишечника, гастроинтестинальной аллергией, а также при некоторых аз этих состояний, сочетанных.с дисбактериозом кишки. При аллергических заболеваниях иной локализации" (бронхиальная астма, атопический бронхит л др.) проницаемость кишки для нерасщепленного овальбумина не отличается зт нормы.

LI.У детей 1-го года жизни всасывание нерасшепленного а-лактальбумина по-зышено при генерализованной инфекции, атопическом дерматите, диарее и состоянии, связанном с приемом гормональных препаратов.

12.У 70% обследованных детей проницаемость кишки для а-лактальбумина сни-кается на протяжении 1-го месяца жзгани в среднем в 2 и более раза. У 30% четей отмечается в этот период повышение ("инверсия") проницаемости, придам феномен "инверсии" достоверно связан с развитием у детей аллергических ;остояний.

L3.B молоке кормяших женшин могут быть выявлены с использование-! радиоимму-1алогического метода белковые антигены пищевых продуктов (бычий сывороточный альбумин, овальбумин, ß-лактоглобулин) в концентрации, не превосходящей 200 кг/мл. Средние уровни антигенов пищи в молоке варьируют от 4 до 30 нг/мл в зависимости от природы антигена и срока лактации. Повышенные сонцентрации овальбумина и ß-лактоглобулина в женском молоке отвечают уве-шченной частоте развития аллергических реакции у грудных детей, палучакщих это молоко.

Основное содержание прсееяенныас исследований изложено в следуюmat работах.

..Бекл 1.Я. ,Когаллер А.К., Казс Ь.К. ,ГмсаинскиГ: У..Ъ. .Гр^орьян С.К.,Луняксь A.C. Проницаемость кишечной стенш для белка у больных пищевой аллершей // Клиническая медицина.-1938.- Т.66, № 7.-С.96-100 ¡.Боровик Т.Э., Путинский И.В., Рославцева Е.А., Ладодо К.С., Макарова С.Г. Анта-тела к белкам пипгвых продуктов у детей, страдаших иелиакией и писквой аллергией // Педиатрия,- 1993.- № 5.- С.42-46 I.ГЬюшикская К.В., Фатеева E.H., Плошинсгата К.Е. Некоторые факторы, приводящие к развитию аллергических реакций пищевого генеза на грудном вскармливании // Педиатрия. -1991.-Уг 4.-С. 10-15

4.Гкошинская М.В., Фатеева Е.М., Шошинский И.Б., Саменкова Н.Ф. Проницаемое^ барьера молочной железы для макромолекул и развитие аллершчесю®; реакций у де тей при грудном вскармливании // Тез. докл. VIII Всес.симп. по физиологии и Оис химии лактации,- M.-I990.- С.42-43

5.Влошинский И.В.,Зорин С.Н. Иммунохиыическое определение всасивания нерасшепле! ного пипевого белка в кишечнике млекопитакших // Еиол. аспекты повышения npouyi тивности животных и растений. Тез.докл.-Рига.-1984.-С. 18-19

6. ГЬкшинский И.В. Радиоиллуноопределение пищевых антигенов // Актуальные npoQnet. науки о питании. Тез.докл. -М.-1985.-С.17

7.ГЬюшинский И.В., Мазо В.К., Шатерников В.А. Сравнение степени всасывания в xpoi у взрослых морских свинок иммунореактивного ингийтгора трипсина из сои и некотс рых глобулярных пищевых белков // Деп.ВИНИТИ.-1986.- № 3870 В.- 5 С.

8. Шошинский И.В., Хвыля С.И. ,Конь И.Я. Влияние недостаточности витамина A i проницаемость слизистой оболочки тонкой мники взрослых теыс для макромолекул / Билл.зксперим.Сноп. и мед.-1987,- Т.103, № 2.-С.161-163

Э.Гмошинский И.В., Саменкова Н.Ф., Мазо В.К. Характеристика антигенных структь пищевого Оелка, поступающих в кровь после его перорапьного введения 3KcnepnMet тальным животньм,- Деп. ВИНИТИ.- 1989.-№ 5796-В.- 12С.

Ю.Гксжмнский И.В., Круглик В.И., Марокко И.Н., Мазо В.К., Пестова М.И. Пишевг сенсиСилизадая морских свинок ферментативными гидролизатами белка молочной сывс ротки // Вопр. питания.-1989.-í' 6.-С.27-32

Н.Плсшинсюй И.В., Михайлов Л.А., Мазо В.К. Влияние повышенного всасывания пиак вых белковых антигенов из кишечника на развитие сенсибилизации у морских свинс // Вопр. питания.- 1990.-№ 1.-С.52-55.

12. Шошинский И.В., Мазо В.К., Шацкая Н.Г., Ушаков В.В. Имлунохимический анал» ферментативных гидролизатов Оелков молока, предназначенных для получения слете лизироБакньк продуктов питания // Вопр. питания.- 1990.- № 2.- С.54-58

13.ГМошинский И.В., КржечкоЕская В.В.. Зорин С.Н. Изменение иьмунохимичесю' свойств ß-лакгоглоОулина при протесшизе и некоторых физико-химических воздев ствиях // Вопр. медицинский химии.- 1990.- Т.36, № 5.- С.11-15

14.Г)лгшинскмй И.В., Михайлов Л.А. Всасывание белковых антигенов и развитие сена' Оилизадии у морских свинок при внутрижелудочнсм введении различных доз овальСъ мина П Диагностика, патогенез и лечение пищевой аллергии. Сб. научн. трудов. Рязань.- 1990.-С.18-22.

15.ГКкшинский И.В., Фатеева Е.М., ГЬюшинская М.В. №«унохимическая характеристик Оелков молочных продуктов, используеьых в питании ксрмяшх жешмн и детей pai-него возраста // Вопр. охраны материнства и детства.- 1991.- Т.36, № 8.-С.32-37

.б.ГМсшинскяй K.B.. Мззо B.K. Всасывание полиэтипенгликоля 4000 в желудочно-кишечнсм тракте экспериментальных животных // Изв.АН Таджикской ССР. Отд. Смол, наук .-1991.- № 3-4.-С.53-51

П.Тмошинскт И.В., Верина Т.Ю., Мззо В.К., Морозов И.А. Проницаемость барьера желудочно-кишечного тракта для .ма1фсыолекул пслиэтиленгликоля-4000: оценка механизма и воспроизводимости П Волл.эксперим.Сиол. и мед.-1992,- Т.114., № 11.-С.532-534

18.ГЬюшинский И.В., Мазо В.К. Нарушенная проницаемость Сервера жалудочно- кишечного тракта для макромолекул и воаюжности ее диетической коррекции в эксперименте // Оизиал. журн. им. И.М.Сеченова.- 1993.-Т.79, № 6.-С.115-127

19.ГМоаинский Г..В., Мазо В.К., Василевская Л.С. Моделирование нарушений проницаемости защитного барьера желудочно-кишечного тракта для макромолекул // Вопр. питания,- 1993.- 5.- С. -35-50

20.Шошинский К.В.. Кржечксвская В.В., Пятницкий H.H. Определение антител класса IgG у экспериментальных тавотных, сенсибилизированных перорально пишезым белком (к характеристике модели пищевой анафилаксии) // Вопр. питания.- 1994,- 1-2.-С.30-33

21.ВЖЖМНСКИЙ К.Е., Ехмекпаева P.A., Лысиков 10.А., Кулакова С.Н., Казо Е.К., Морозов H.A. Влияние жирового компонента ратона на проницаемость для ьекромзлекул защитного барьера кишки при экспериментальной анафилаксии // Вопр. питания.-

1995.-В1 1.-С.7-11

22.ГМошинский И.З.,Радченко С.Н.,Зорин С.Н.,Мазо В.К. Коррекция диетой проницаемости защитного Сарьера кишки при у-облучении // Физиол.журн. им.Я.М.Сеченова.-

1996.-Т.82, К" 3.-С.117-124

23.ГШПИНСКИЙ И.Е., Казо В.К.,Зорин С.Н. Влияние концентрата Селков молочной сыворотки и егс фракций на проницаемость для макромолекул кишечного Сарьера у крыс пои экспеоиментальной пищевой анафилаксии // Вопр.питания.-1956.-К' 1.-С.З-6.

мость кианчника для белкового антигена у новорожденных лете;; // Аллергические болезни у детей. Тез.докл.Всероссийской науч.-практ.кснф.-К.-1996.-С.23.

25.Шошинский И.В. Нарушение защитных барьеров кишечного траста и его роль в формировании пищевой непереносимости. // V Меяазунарсдный симл. Ин-та питания "ХайжГ "Пшавая непереносимость у детей" . СО.тезисов.-С.7.

26.Ермекпаева P.A.. Шаиинсгай И.В.. Казо Е.К. Влияние потребления некоторых свободных аминошслот на проницаемость заштгного Сарьера кишки для макромолекул в норме и при сенсисилизадаи //' Вопр. питания.- 19Э4.- № 4.-С. 17-20

27.Мазо В.К., . 1Мошинский К.В. О возможности алиментарной коррекции проницаемое1! защитного барьера желудочно-кишечного тракяа для макромолекул // Вопр. питания. 1993.- № 5.- С.10-17

28.Михайлов Л.А., Шатерников В.А., Шэшинский И.В., Мазо В.К. Влияние алиментарнс го голодания на всасывание куриного овальОумина у взрослых морских свинок / аалл.эксперим.Сиол. и мед.- 1985.-Т.99. № 6.-С.656-658

29.Низов А.А.,Шэшинский И.В.,Луняков А.С.,Роенко Н.Ф.,Ногаллер A.M.,Мазо В.К Проницаемость барьера жзлудочно-кишечного тракта для белкового антигена у боль ных пишевой - аллергией и некоторый! сопутствукшими заболеваниями органов пишева рения // Российский журн.гастроэнтерологии, гепатслоши, калопроктолотми.-1996. № 3.-С.26-30.

30.Порядков Л.Ф., Костылева М.Г., Мазо В.К. ,1Мошинскда И.В.,Василевская Л.С. Вса давание и иммунный ответ на свальОумин при различных способах его поступления организм собак // Вопр. питания.- 1986.- № 6.-С.37-40

31.Садыкова Р.Е.,Шатерников В.А.,Шэшинский И.Б.,Мазо В.К. Влияние белковых инги Ситоров протеиназ на расщепление и всасывание иммунореаютивного куриного оваль Сумина в кишечнике взрослых ipuc./VBccin. эксперим.Оисл. и мед.-1984.-Т.97,№ 8. С.194-196

32.Фатеева Е.М., Гкошинский К.В., 1\кшшская М.В. Определение пищевых белковы антигенов е .грудном молоке // Вопр. охраны материнства и детства.- 1989.- Т.34 № 6.- С.41-45

33.Фатеева Е.М., ГМсшинский И.В.,ТЫошинская М.В. Поступление антигенов пиши ; грудное молоко // Вопр. литания.-1989,- № 5.- С.10-16

34 .Mazo V.K. Qnoshinski I.V. Disturbed gastrointestinal barrier macrcrrolecula. permeability and it's dietery correction possibilities in experiment // EASE! J.- 1995.- V.9, № 3.-P.A367

35.Mazo V.K., Emitriev A.V., Groshinski I.V., Cmitrieva K.V. Absorption o: antigenic human a-lactalo'jrrin in neonates: influence of age and diet // EASE: J.-1996.-V.10, № 3.-P.A229.

36.Nizov A.A.,Gmoshinski I.V., Mazo V.K., Lunjakov A.S., Roenko N.F., Nogalle; A.M. Intestinal macrcmolecular pemeability in patients with food allergy anc related diseases // EASEB J.- 1996.-V.10, № З.Г-Р.А124

37.Nogaller A.M., Lunjakov A.S., Mazo V.K., Qrcshinski I.V., Nizov A.A.,Roenkc N.F. intestinal absorption in patients with food allergy arid chronic enteriti; // 3-rd United European Gastroenterology Week. Abstracts.- Oslo.- 1994.-P.s.a.201. ;

Информация о работе

Гмошинский, Иван Всеволодович
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.04

Автореферат

Проницаемость кишечного барьера для макромолекул при некоторых патологических состояниях и воздействии различных алиментарных факторов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы